KR100443570B1

KR100443570B1 - 재조합 인간 인터루킨-4의 제조방법

Info

Publication number: KR100443570B1
Application number: KR10-2001-0046115A
Authority: KR
Inventors: 배용수; 김정환; 전춘주; 이윤; 김기태
Original assignee: 크레아젠 주식회사
Priority date: 2001-07-31
Filing date: 2001-07-31
Publication date: 2004-08-09
Also published as: KR20030012197A

Abstract

본 발명은 재조합 인간 인터루킨-4의 제조방법에 관한 것으로서 좀 더 상세하게는 인간 인터루킨-4 유전자의 ORF(open reading frame)로부터 프라이머를 제조하고 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후 PCR 산물을 발현 벡터에 삽입하고 균주에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 인터루킨-4의 대량 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면 인간 인터루킨-4를 간편하고 경제적으로 생산할 수 있다.

Description

재조합 인간 인터루킨-4의 제조방법{The preparation method of recombinant human Interleukin-4}

본 발명은 재조합 인간 인터루킨-4의 제조방법에 관한 것으로서 좀 더 상세하게는 인간 인터루킨-4 유전자의 ORF(open reading frame)로부터 프라이머를 제조하고 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후 PCR 산물을 발현 벡터에 삽입하고 균주에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 인터루킨-4의 대량 제조방법에 관한 것이다.

인터루킨-4(IL-4)는 B 세포 자극인자 1(B cell stimulatory factor 1; BSF-1)으로도 알려져 있으며 조혈 세포 및 비조혈 세포에서 광범위한 스펙트럼의 세포 기능을 조절하는 활성화된 T 세포, 마스트 세포(mast cell) 및 호염기구(basophil) 등에 의해 분비되는 15 kDa 당단백질이다(Howard et al.,J. Exp. Med.1982, 155, 914; Brown et al.,Cell,1987, 50, 809; Seder et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1991, 88, 2835). IL-4는 또한 T 세포 유래 성장인자(T cell-derived growth factor)로서 정상 생쥐 B 임파구의 증식(proliferation)을 유지시켜 최대 4개월까지의 장기 배양(long-term culture)을 가능하게 해 준다. 한편, IL-4가 휴지기의 설치류(murine) T 임파구로부터 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)로 분화하는 것을 자극한다는 보고도 있다(Perchel, C., et al.,J. Immunol.,1989, 142, 1558-1568; Trenn, G., et al.,J. Immunol.,1988, 140, 1101-1106).

IL-4의 시험관내(in vitro)에서의 부가적인 활성에 대해 인간 및 설치류의 세포 시스템을 이용한 많은 연구결과 IL-4가 IgE의 합성을 유도하고 조절하는데 중요한 역할을 담당하고 있으며(Romagnani, S., et al.,Clin. Immunol. Immunopathol.,1989, 50, 513-523), 조직배양에서 정상 인간 B 세포상의 Fc-입실론 수용체의 발현을 유도하고(DeFrance, T., et al.,J. Exp. Med.,1987, 165, 1459-1457), 다른 림포카인(lymphokine)-주로 인터페론 감마(interferon-γ)-들과 상호작용하여 B 세포의 성장과 분화에 중요한 역할을 하고(Coffman, R. L., et al.,Immunol. Res.,1988, 102, 5-27; Widmer, M. D., et al.,Nature,1987, 326, 795-798), 휴지기 B 세포 상의 유형 Ⅱ-1a 항원의 발현을 증가시킨다(Noelle,R., et al.,Pros. Natl. Acad. Sci. USA,1984, 81, 6149-6153)는 것 등이 밝혀졌다. 이 외에도 IL-4는 IL-1, TNF-α, PGE2 등의 생성을 억제하고(Hart, P. E., et al.,Pros. Natl. Acad. Sci. USA,1989, 86, 3803-3807), 인간 단핵구(monocyte)에 대한 글루코코르티코이드(glucocorticoid)의 효과를 증가시키며(Hart, P. E., et al.,Lymphokine research,1990, 9, 147-153), 인간 폐포(alvelor)의 대식세포(macrophage)에서 콜라게나제(collagenase)와 92 kD 젤라티나제 (gelatinase)의 생합성을 억제하고(Lacraz, S., et al.,J. Clin. Invest.,1992, 90, 382-388), 골흡수(bone resorption)를 저해(Watanabe, K., et al.,Biochem. Biophys. Res. Comm.,1990, 172, 1035-1041)한다는 것이 밝혀졌다.

이러한 IL-4를 클로닝하여 발현시키는 많은 연구들이 인간과 설치류-특히 생쥐-의 세포 시스템에서 이루어져 왔다. 생쥐 IL-4 유전자가 COS-7 세포에서 클로닝되어 발현되었으며(Otsuka, T., et al.,Nuc. Acid. Res.,1987, 15, 333-334), 인간 IL-4 유전자에 대한 클로닝 및 발현에 관한 연구도 많이 보고되어 있다(Arai, N., et al.,J. Immunol.,1989, 142, 274-282; Yokota, T., et al.,Pros. Natl. Acad. Sci. USA,1986, 83, 5844-5848). 염기서열이나 구조도 또한 알려져 있는데 생쥐 IL-4는 120개, 인간 IL-4는 129개의 아미노산으로 이루어져 있으며 생쥐나 인간 IL-4 모두 2개의 당사슬 결합부위(sugar chain-binding site)를 가지고 있다(Yokota, T., et al.,Pros. Natl. Acad. Sci. USA,1986, 83, 5844-5848).

IL-4의 cDNA 역시 클로닝되어 염기서열이 분석되었고, 일반적인 재조합 DNA방법(recombinant DNA method)에 의한 인간 및 생쥐 IL-4의 제조가 여러 연구진에 의해 시도되었으며(Yokoto, et al.,Pros. Natl. Acad. Sci. USA,1986, 83, 5894-5898(인간); Lee, et al.,Pros. Natl. Acad. Sci. USA,1986, 83, 2061-2065(생쥐); Noma, et al.,Nature,1986, 319, 640-646(생쥐); Genzyme Corporation, Boston, Mass, USA(인간 및 생쥐)), 재조합 형태가 아닌 IL-4도 여러 배양 상등액으로부터 분리, 정제된 바 있다(Sanderson, et al.,Pros. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 437-440(생쥐); Grabstein, et al.,J. Exp. Med.,1985, 163, 1405-1413(생쥐); Ohara, et al.,J. Immunol.,1985, 135, 2518-2523(생쥐); Butler, et al.,J. Immunol.,1984, 133, 251-255(인간); Farrar, et al.,J. Immunol.,1983, 131, 1838-1842(생쥐)).

인간에게 사용되어지는 IL-4는 인간 유래의 것이 바람직하며, 가장 바람직한 것은 Yokoto 등에 의해 밝혀진(Yokoto, et al.,Pros. Natl. Acad. Sci. USA,1986, 83, 5894-5898) 서열을 이용하여 유전자재조합에 의해 대장균으로부터 생산(U. S. Pat. No. 4,958,007; PCT International Application No. PCT/US89/04788; PCT International Application No. PCT/US87/02990; U.S. patent application Ser. No. 429,588, filed Oct. 31, 1989)하는 것으로 알려져 있으며, 이 외에도 CHO 세포주로부터 생산하는 방법(U.S. patent application Ser. No. 386,937, filed Jul. 28, 1989)도 알려져 있다. 이러한 재조합 인간 IL-4는 겐자임사(Genzyme Corporation, Boston, Mass, USA)나 쉐링-플라우사(Schering-PloughCorporation, Union, NJ, USA)로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 그러나 상기의 방법들은 시간이 많이 걸릴뿐 아니라 제조단가도 상당히 높은 단점이 있어 좀 더 간편하고 경제적인 인간 IL-4의 제조방법이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 재조합 인간 IL-4를 생산하는 신규한 방법을 개발하고, 본 발명의 방법이 인간 IL-4를 간편하고 경제적으로 생산할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 재조합 인간 IL-4를 간편하고 경제적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은서열번호 2및서열번호 3로 기재되는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타내는 전기영동 사진이고,

M : 사이즈 마커(size marker), 1 : PCR 산물

도 2는 본 발명에서 이용한 클로닝 벡터 pCR-BluntⅡ TOPO에 인간 IL-4 DNA가 삽입된 구조를 보여주는 모식도이고,

도 3은도 3의 벡터를 수용성 세포(competent cell)에 형질전환 시킨 후 이 세포에 재조합 IL-4가 삽입되어 있음을 나타내는 전기영동 사진이고,

M : 사이즈 마커, 1-6 : 형질전환 세포주의 각 클론

도 4는 본 발명에서 이용한 또 다른 클로닝 벡터인 pET-29a(+)에 인간 IL-4 DNA가 삽입된 구조를 보여주는 모식도이고,

도 5는도 4의 벡터를 수용성 세포에 형질전환 시킨 후 이 세포에 재조합 IL-4가 삽입되어 있음을 나타내는 전기영동 사진이고,

M : 사이즈 마커, 1-6 : 형질전환 세포주의 각 클론

도 6은 형질전환 세포주에서 인간 IL-4가 발현된다는 것을 나타내는 전기영동 사진이고,

도 7은 인간 IL-4의 발현이 불용성 분획(insoluble fraction)의 형태로 발현된다는 것을 나타내는 전기영동 사진이고,

M : 사이즈 마커, 1 : 유도되지 않은 세포 파쇄액,

2 : 0.6 mM의 IPTF로 유도된 총 세포 파쇄액,

3 : 수용성 분획(soluble fraction), 4 : 불용성 분획,

5 : 트리톤(Triton) X-100으로 세척한 불용성 분획

도 8은 상기 불용성 분획을 우레아(Urea)를 이용하여 용출한 분획들을 전기영동한 결과를 보여주는 전기영동 사진이고,

M : 사이즈 마커,

F.T(Flow Through) : 불용성 분획중 Ni-NTA 레진에 결합하지 않은 분획,

W(Wash) : 우레아 완충액으로 세척한 분획

도 9는도 8의 분획을 이용, 구조회복(refolding/reconstitution) 과정을 수행하고 정제한 결과를 보여주는 전기영동 사진이고,

M : 사이즈 마커, 1 : 대조군,

2 : 0.6 mM IPTG로 발현이 유도된 세포 파쇄액,

3 : 수용성 분획, 4 : 불용성 분획,

5 : 구조회복 과정 후 정제된 IL-4

도 10은 본 발명의 IL-4(Creagene)와 엔도젠(Endogen)사의 IL-4가 인간 단핵구(monocyte)로부터 수지상 세포(deneritic cell)로의 분화에 미치는 영향을 유세포 분석(FACS)을 통하여 확인한 결과를 보여주는 사진이고,

도 11은 본 발명의 IL-4와 엔도젠사의 IL-4를 사용하여 분화를 유도한 수지상 세포가 신제닉(syngeneic) T 세포의 증식에 미치는 영향을 MLR(mixed leukocyte reaction) 분석법을 통하여 확인한 결과를 나타내는 그래프이고,

도 12는 모노사이트로부터 분화된 수지상 세포(Mo-DC)를 MCM(monocyte conditioned medium)으로 성숙시킨 형태를 보여주는 현미경 사진이고,

도 13은 Mo-DC가 세포사멸(apoptosis)로 죽은 세포를 흡입(uptake)하는 모습을 나타내는 현미경 사진이고,

도 14는 Mo-DC의 세포 흡입 능력을 유세포 분석법을 통하여 확인한 결과를 나타내는 사진이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 인간 IL-4를 간편하고 경제적으로 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 재조합 인간 IL-4를 간편하고 경제적으로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 재조합 인간 IL-4 유전자를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여 인간 IL-4의 염기서열을 토대로 하여 프라이머를 제조하였다. 인간 IL-4는서열번호 1로 기재되는 염기서열 중 66-527 뉴클레오타이드의 462 염기쌍(base pair)을 ORF(open reading frame)로 가지며 실제 단백질로 발현되는 부위는 양쪽 끝의 신호 펩타이드(signal peptide)를 뺀 135-527의 뉴클레오타이드에 해당하는 390 염기쌍이다. 상기의 성숙된 펩타이드의 염기서열을 토대로 하여서열번호 2및서열번호 3으로 표기되는 2개의 프라이머를 제조하였다. 본 발명자들은 융합단백질이 IL-4의 구조적인 변화를 일으키지 못하도록 3개의 GGA(Gly) 서열을서열번호 2의 프라이머 서열에 삽입하였다.

또한, 본 발명자들은 인간 T 세포에서 얻은 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고 상기에서 제조한 프라이머를 이용, PCR을 수행하여 PCR 산물을 얻어 클로닝 벡터에 삽입하였다(도 1및도 2참조). 상기의 클로닝 벡터를 유전자 전달 대상세포(competent cell)에 형질전환시킨 후 클론(clone)들을 골라 제한효소를 처리하여 인서트(insert)인 IL-4의 삽입여부를 확인하였다(도 3참조).

본 발명자들은 인서트인 IL-4 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하고 이를 “pET-29a(+)/IL-4”라 명명하였다.

또한, 본 발명자들은 pET 시스템을 이용하여 재조합 인간 IL-4 단백질을 발현시킨 결과, IL-4의 발현이 잘 일어남을 확인할 수 있었으며, 예상했던 단백질의 크기인 14-15 kDa에 S-태그(tag)와 His-태그가 붙어 22 kDa 정도로 약간 크게 발현이 되는 것을 확인하였다(도 6참조).

본 발명자들은 재조합 인간 IL-4 단백질을 발현하는 본 발명의 형질전환 세포주 BL-21(DE3)을 2001년 7월 27일부로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC18096P).

또한, 본 발명자들은 인간 IL-4 단백질을 대량으로 발현시키기 위하여 형질전환된 세포주를 대량 배양하였으며 배양 후 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄시키고 원심분리하여 수용성(soluble)과 불용성(insoluble) 분획(fraction)을 분리하였다. IL-4 단백질의 발현이 수용성인지 아니면 불용성인지를 확인하기 위하여 상기 분획 중 일부를 이용하여 전기영동을 수행하였다.

그 결과, 인간 IL-4 단백질이 성공적으로 대량 발현되는 것을 확인하였으며, 특히 수용성보다는 불용성 단백질의 형태로 발현되는 것을 확인하였다(도 7참조).

또한, 본 발명자들은 상기에서 대량으로 발현된 인간 IL-4 단백질을 세척과 용출(elution), 구조회복(refolding/reconstitution) 과정을 통하여 정제한 결과, 순수한 재조합의 인간 IL-4 단백질이 얻어졌음을 전기영동을 통하여 확인할 수 있었으며 단백질의 분해(degradation) 및 변형(transformation) 등과 같은 물리적인변화는 유도되지 않은 것을 확인하였다(도 9참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 IL-4의 활성을 현재 상용화되어 있는 IL-4와 비교하기 위하여 이들이 단핵구(monocyte)에서 수지상세포(dendritic cell)로 분화하는 과정에 미치는 영향을 유세포 분석(FACS), 신제닉 MLR(syngeneic mixed leukocyte reaction) 분석 그리고 세포사멸체 흡수(apoptotic body uptake) 분석을 통하여 분석하였다.

IL-4를 처리하여 수지상 세포로 분화시 표면에 발현되는 CD80, CD86, CD40 등의 보조자극분자(costimulatory molecule)들이나 MHC 클래스Ⅰ(HLA-A,B,C) 및 MHC 클래스Ⅱ(HLA-DR)의 정도를 조사한 바 이들의 발현이 비슷한 수준임(표 1,표 2,표 3및도 10참조)으로 미루어 볼 때 본 발명의 IL-4는 기존의 상품화되어 있는 IL-4와 비교하여 효능 면에서 전혀 뒤지지 않음을 알 수 있었으며, T 세포의 증식에 미치는 영향(도 11참조), 분화된 수지상 세포의 항원 흡입 능력(표 4및도 14참조) 등에서는 본 발명의 IL-4가 더욱 뛰어난 효과를 보인다는 것을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 인간 IL-4에 특이적인 프라이머의 제조

본 발명자들은 재조합 인간 IL-4의 발현을 위해서열번호 1로 기재되는 인간 IL-4의 염기서열을 토대로 하여 프라이머를 제조하였다. 인간 IL-4는서열번호 1로 기재되는 염기서열 중 66-527 뉴클레오타이드의 462 염기쌍(base pair)을 ORF(open reading frame)로 가지며 실제 단백질로 발현되는 부위는 양쪽 끝의 신호 펩타이드(signal peptide)를 뺀 135-527 뉴클레오타이드에 해당하는 390 염기쌍이다. 상기의 성숙된 펩타이드의 염기서열을 토대로 하여서열번호 2및서열번호 3으로 기재되는 2개의 프라이머를 제조하였다.

<실시예 2> 재조합 인간 IL-4 발현벡터의 클로닝

인간 T 세포에서 얻은 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고 상기실시예 1에서 제조한 프라이머를 이용, PCR을 수행하여 390 bp의 PCR 산물을 얻었다(도 1). 이 때 중합효소(polymerase)를 사용하여 PCR 산물에 평활 말단(blunt end)을 형성하도록 하여 평활 말단 PCR 산물 클로닝 벡터인 pCR-BluntⅡ TOPO 벡터(Invitrogen)에 삽입이 가능하도록 하였다(도 2).

인비트로젠사의 매뉴얼에 따라 라이게이션(ligation)을 수행하고 TOP-10F' 수용성 세포(competent cell)에 형질전환시킨 후 6개의 클론(clone)을 골라 제한효소를 처리하여 인서트(insert)인 IL-4의 삽입여부를 확인하였다(도 3). pCR-BluntⅡ TOPO/IL-4 프라스미드에 제한효소를 처리하여 얻은 DNA 단편들을 겔 일루션(gel ilution)하여 정제하고, 발현용 벡터인 pET-29a(+) 벡터의 동일 부위에 라이게이션시켰다(도 4). 플라스미드 증폭용 세포인 DH5-α 세포주에 형질전환시킨 후 여기서 다시 6개의 클론을 얻어 IL-4의 삽입여부를 확인하였다.

그 결과,도 5에서 알 수 있는 바와 같이 IL-4가 벡터 내에 올바르게 삽입되어 있음을 확인하였으며 본 발명자들은 상기 발현벡터를 “pET-29a(+)/IL-4”라 명명하였다.

<실시예 3> 재조합 인간 IL-4의 발현

본 발명자들은 pET 시스템을 이용하여 재조합 인간 IL-4 단백질을 발현시켰다. 구체적으로, 상기실시예 2에서 제조된 pET-29a(+)/IL-4 클론 중 하나를 선택하여 단백질 발현용 수용성 세포인 BL-21(DE3) 세포주(Pharmacia Biotech)에 형질전환시켰다. 형질전환된 세포 중 가나마이신(kanamycin)에 저항성을 보이는 콜로니(colony) 2개를 선별하여 3 ㎖ 배양 스케일로 배양하면서 0.3, 0.6 및 1 mM 농도의 IPTG로 발현을 유도(induction)하고 15% SDS-PAGE 젤 상에서 IL-4의 발현여부를 확인하였다.

그 결과, IPTG의 농도와는 크게 상관없이 IL-4의 발현이 잘 일어남을 확인할 수 있었으며, 예상했던 단백질의 크기인 14-15 kDa에 S-태그(tag)와 His-태그가 붙어 22 kDa 크기의 재조합 IL-4 융합 단백이 발현되는 것을 확인하였다(도 6).

본 발명자들은 재조합 인간 IL-4 단백질을 발현하는 상기 BL-21(DE3) 세포주를 2001년 7월 27일부로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호:KCTC18096P).

<실시예 4> 재조합 인간 IL-4의 대량 발현과 정제

본 발명자들은 인간 IL-4 단백질을 대량으로 발현시켰다. 구체적으로,실시예 3의 형질전환된 BL-21(DE3) 세포주 5 ㎖을 250 ㎖의 LB-가나마이신 배지에 첨가하여 600 nm 파장에서 흡광도가 0.8이 넘어가지 않도록 배양하고 0.6 mM의 IPTG를 첨가하여 IL-4 단백질의 대량발현을 유도하였다. 배양액 15 ㎖당 250 ㎖의 라이시스 완충액(lysis buffer; 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)을 혼합하여 재현탁(resuspend)하고 여기에 0.1 g/㎖의 라이소자임(lysozyme) 150 ㎕와 100 mM의 PMSF 150 ㎕를 첨가하여 30분 동안 4℃에서 배양하였다. 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 4℃에서 10분 동안 3회에 걸쳐 세포를 파쇄시키고 원심분리하여 수용성(soluble)과 불용성(insoluble) 분획(fraction)을 분리하였다. IL-4 단백질의 발현이 수용성인지 아니면 불용성인지를 확인하기 위하여 상기 분획 중 일부를 이용하여 15% SDS-PAGE 전기영동을 수행하였다.

그 결과, 인간 IL-4 단백질이 성공적으로 대량 발현되는 것을 확인하였으며, 특히 수용성보다는 불용성 단백질의 형태로 발현되는 것을 확인하였다(도 7).

또한, 본 발명자들은 상기에서 대량으로 발현된 인간 IL-4 단백질을 세척과 용출(elution), 구조회복(refolding/reconstitution) 과정을 통하여 정제하였다. 구체적으로, 상기에서 얻어진 불용성 분획을 0.1% 트리톤(Triton) X-100으로 2-3회세척하여 세균 단백질(bacterial protein)을 제거한 후 8 M 우레아 완충액(urea buffer; 8 M urea, 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris, pH 8.0)으로 재현탁하였다. 미리 8 M 우레아 완충액으로 평형(equillibration)이 수행된 Ni⁺-NTA 칼럼에 시료를 로딩(loading)하고 8 M 우레아 완충액으로 수 회 세척한 후 다시 pH 6.4의 우레아 완충액으로 세척하였다. 세척 후 용출액(elution buffer; 8 M urea buffer, pH 4.2)으로 용출하여 여러개의 분획을 얻었다. 이 분획들을 SDS-PAGE에 전기영동하고 그 결과를도 8에 나타내었다. 상기의 분획들은 8 M 우레아에 들어있어 단백질이 완전히 변성(denature)되어 있는 상태이므로 하기와 같이 구조회복 (refolding/reconstitution) 과정을 수행하였다. 먼저, 3 M 우레아 완충액으로부터 2 M, 1.5 M, 1 M, 0.7 M, 0.5 M, 0.3 M 우레아 완충액으로 단계별로 희석시켜 우레아를 제거하였으며 1.5 M 에서부터는 단백질의 안정적 구조회복(folding)을 유도하기 위하여 0.02 mM 산화형(oxidized) GSH와 0.2 mM 환원형(reduced) GSH를 첨가하였다. 구조회복 과정이 끝난 단백질은 pH 7.4의 PBS로 완충액을 교환해 주고 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 불순물을 제거한 후 브래드포드 어세이(Bradford assay)를 수행하여 정량하였다.

그 결과, 15% SDS-PAGE 젤상에서 순수한 인간 IL-4 단백질이 얻어졌음을 확인할 수 있었으며 단백질의 분해(degradation) 변형(trnsformation) 등과 같은 물리적인 변화는 유도되지 않은 것을 확인하였다(도 9).

<실험예 1> IL-4에 의한 단핵구의 수지상세포로의 분화 유도

본 발명자들은 본 발명의 IL-4의 활성을 현재 상품화되어있는 IL-4(Endogene)와 비교하기 위하여 이들이 단핵구(monocyte)에서 수지상세포(dendritic cell)로 분화하는 과정에 미치는 영향을 분석하였다. 구체적으로, 1x10⁷단핵구를 10% 사람 혈청이 첨가된 RPMI 1640배지(Gibco BRL)가 들어있는 6-웰 플레이트에서 2시간 동안 배양한 후 동일한 배지로 세척하여 임파구(lymphocyte)를 제거하고 다시 1시간 동안 배양하였다. 바닥에 붙지 않은 세포를 제거하고 본 발명의 IL-4(1 ㎍/㎖ 및 2 ㎍/㎖) 또는 엔도젠사의 IL-4(1 ㎍/㎖ 및 GM-CSF(LG)/1000 U/㎖ IL-4)가 첨가되어 있는 배지에서 7일간 배양하였으며 3일째와 5일째에 새로운 배지로 교환해 주었다. 7일간의 배양 후 50% MCM(monocyte conditioned medium)으로 2일 동안 배양하여 수지상 세포의 성숙을 유도하였다. 또한, 항원으로 50 ㎍/㎖의 KLH(Keyhole limpet hemocyanin, Calbiochem)가 첨가된 100% MCM에서 하루동안 배양하여 수지상세포의 성숙과 KLH의 흡수를 유도하였다. 단핵구에서 분화된 수지상세포를 수확하여 FACS 분석과 신제닉 MLR(syngeneic mixed leukocyte reaction) 분석 그리고 세포사멸체 흡수(apoptotic body uptake) 분석을 수행하였다.

<1-1> FACS 분석

상기에서 50% MCM으로 성숙화(maturation)를 유도하기 전과 후의 결과를 분석한 결과, 유도 전에는 엔도젠사의 IL-4는 HLA-DR과 CD80, 본 발명의 IL-4는 CD86의 발현이 더 많았으며 CD40, CD83 그리고 CD1a의 발현에는 차이가 없었다(표 1).

양성세포(%)	CD86	DR	CD40	CD80	CD1a
엔도젠 IL-4(1 ㎍/ml)	77	92	8.6	12	0.6
크레아젠 IL-4(1 ㎍/ml)	82	86	7.3	5.5	1.4
크레아젠 IL-4(2 ㎍/ml)	83	84	5.4	6.0	1.2

MCM을 통해 수지상세포의 성숙을 유도한 경우에는 본 발명의 IL-4가 엔도젠사의 IL-4보다 더 효과적으로 CD86, CD40, CD80의 발현을 유도하였다(표 2). 상기의 결과를 통해 본 발명의 IL-4는 단핵구로부터 수지상세포로의 분화과정에 효과적으로 작용함을 확인하였다.

양성세포(%)	CD86	DR	CD40	CD80	CD1a
엔도젠 IL-4(1 ㎍/ml)	94	96	63.7	56	1.8
크레아젠 IL-4(1 ㎍/ml)	98	96	81	70	1.0
크레아젠 IL-4(2 ㎍/ml)	97	96	31	50	0.6

100% MCM과 항원으로 50 ㎍/㎖의 KLH를 사용하여 하루동안 수지상세포의 성숙을 유도한 경우에도 CD80, CD86, CD40 등의 보조자극분자(costimulatory molecule)들이나 MHC 클래스Ⅰ(HLA-A,B,C), MHC 클래스Ⅱ(HLA-DR)의 발현 정도에 있어 엔도젠사의 IL-4와 본 발명의 IL-4(크레아젠 IL-4) 사이에 큰 차이가 없음을 확인하였다(표 3및도 10).

양성세포(%)	HLA-DR	CD80	CD86	CD40	CD1a	HLA-A,B,C
크레아젠	225	32.8	247	29.7	7.3	209
크레아젠+KLH	175	30.9	246	23.9	9.4	196
엔도젠+KLH	158	15.1	248	19.5	5.7	204

<1-2> 신제닉 MLR 분석

상기에서 KLH를 처리한 Mo-DC(단핵구로부터 분화된 수지상세포)를 이용하여 신제닉 T 세포의 증식 정도를 비교 분석하였다. 구체적으로, 말초혈액 단핵구(PBMC)에서 나일론-울 섬유(nylon-wool fiber)를 이용하여 T 세포를 분리한 후 1x10⁵T 세포와 KLH 처리된 Mo-DC를 1:3, 1:10, 1:30 그리고 1:100의 비율로 혼합하여 5일 동안 MLR(mixed leukocyte reaction)을 유도하였다. 5일 후 [³H]를 처리하고 18시간 동안 배양한 후 방사성 동위원소 측정기로 cpm 값을 측정하였다.

그 결과, 엔도젠사의 IL-4를 사용하여 유도된 Mo-DC에 KLH를 처리한 MLR과 본 발명의 IL-4를 사용하여 유도된, 항원을 처리하지 않은 Mo-DC의 MLR 결과는 거의 동일한 수준으로 나타났으며, 본 발명의 IL-4를 사용하여 유도된 Mo-DC에 KLH를처리한 MLR의 결과는 상당히 높게 나타났다(도 11). 따라서 본 발명의 IL-4로 유도된 Mo-DC 및 이를 이용한 MLR 실험 결과로부터, 본 발명의 IL-4가 엔도젠사의 IL-4를 사용했을 때보다 더 효율적으로 T 세포 활성을 유도하는 것이 증명되었다.

<1-3> Mo-DC의 항원 흡입능력 분석

본 발명자들은 또한 본 발명의 IL-4에 의해 분화가 유도된 Mo-DC의 항원 흡입능력을 암세포주를 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 암세포주인 절캣 세포(Jurkat cell)에 UV를 조사하여 세포사멸(apoptosis)을 유발시킨 후 Mo-DC와 12시간 동안 공동 배양하였다. 유도된 사멸세포에 7-AAD(aminoactinomycin D; 20 ㎍/㎖/6x10⁶세포)를 4℃에서 30분 동안 처리하여 표지하였다. 표지된 세포를 MCM을 통하여 성숙이 유도된 Mo-DC 또는 MCM이 없는 상태에서 배양된 미성숙 Mo-DC(FITC와 결합되어 있는 HLA-DR로 표지)와 5:1의 비율로 혼합하여 60분 혹은 150분 동안 배양하였다. 배양 후 FACS와 콘포칼(confocal) 현미경을 통해 Mo-DC의 항원 흡입능력을 분석하였다.

그 결과, Mo-DC가 사멸된 세포를 흡입하였을 때의 세포를 의미하는 이중-양성 세포(double-positive cell; 7-AAD+, HLA-DR+)를 FACS를 통해 확인하였으며 미성숙 Mo-DC 세포 표면과 세포 내부에서 붉은 형광으로 표지된 사멸세포 조각의 존재를 확인하였다(표 4및도 14). 따라서, 본 발명의 IL-4에 의해 유도된 Mo-DC는 항원에 대한 흡입능력 또한 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

반응 조성사멸세포 비율	Mo-DC 단독	Mo-DC + 사멸세포 물질
7-AAD+/HLA-DR+ (%)	7.95	19.10

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 IL-4의 제조방법은 간편하고 경제적이며 본 발명의 제조방법에 의해 생산된 IL-4는 기존의 상품화되어 있는 IL-4에 비해서 뛰어난 활성을 가지고 있으므로 IL-4의 효율적인 제조방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> CreaGene <120> The preparation method of recombinant human Intereukin-4 <130> 1p-06-23B <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 618 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (66)..(527) <223> ORF(open reading frame) of human IL-4 <400> 1 tgcatcgtta gcttctcctg ataaactaat tgcctcacat tgtcactgca aatcgacacc 60 tattaatggg tctcacctcc caactgcttc cccctctgtt cttcctgcta gcatgtgccg 120 gcaactttgt ccacggacac aagtgcgata tcaccttaca ggagatcatc aaaactttga 180 acagcctcac agagcagaag actctgtgca ccgagttgac cgtaacagac atctttgctg 240 cctccaagaa cacaactgag aaggaaacct tctgcagggc tgcgactgtg ctccggcagt 300 tctacagcca ccatgagaag gacactcgct gcctgggtgc gactgcacag cagttccaca 360 ggcacaagca gctgatccga ttcctgaaac ggctcgacag gaacctctgg ggcctggcgg 420 gcttgaattc ctgtcctgtg aaggaagcca accagagtac gttggaaaac ttcttggaaa 480 ggctaaagac gatcatgaga gagaaatatt caaagtgttc gagctgaata ttttaattta 540 tgagtttttg atagctttat tttttaagta tttatatatt tataactcat cataaaataa 600 agtatatata gaatctaa 618 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 Up primer <400> 2 ataggatccg gaggaggagg tctcacctcc caactgctt 39 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 Down primer <400> 3 atagtcgacg ctcgaacact ttgaatattt gaa 33

Claims

서열번호 1로 기재되는 인간 IL-4(인터루킨-4) 유전자를 포함하는도 4로 나타낸 재조합 발현벡터 pET-29a(+)/IL-4.
제 1항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 BL-21(DE3) 형질전환 세포주(수탁번호: KCTC18096P).
재조합 인간 IL-4를 발현하는 제 2항의 BL-21(DE3) 형질전환 세포주로부터 불용성 상태의 인간 IL-4를 용출, 정제하는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 IL-4의 제조방법.
제 3항에 있어서, IL-4는 불용성 상태의 펠렛으로부터 용출되는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 IL-4의 제조방법.