JP2010284174A

JP2010284174A - プラスミド、それらの構築およびそれらのインターロイキン−４およびインターロイキン−４ムテインの製造における使用

Info

Publication number: JP2010284174A
Application number: JP2010190917A
Authority: JP
Inventors: Heiner Apeler; ハイナー・アペラー; Hermann Wehlmann; ヘルマン・ベールマン
Original assignee: Bayer Schering Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1999-01-20
Filing date: 2010-08-27
Publication date: 2010-12-24
Also published as: HU224491B1; DK1022337T3; AU772897B2; ATE334202T1; DE69929638T2; CA2294575C; SK762000A3; HU0000185D0; EP1022339B1; PT1022337E; HUP0000185A2; KR20000053523A; NO20000262D0; KR100665148B1; DE69929638D1; CZ2000214A3; NO327317B1; JP2000210091A; CA2294575A1; CZ294279B6

Abstract

【課題】５′から３′への順序で下記の機能しうるように結合した要素を含む大腸菌の菌株におけるＩＬ−４およびＩＬ−４ムテインの製造のための発現プラスミド、およびそのプラスミドで形質転換された大腸菌株を提供する。
【解決手段】大腸菌ファージＴ５プロモーターおよび２つのｌａｃオペレーター配列からなる調節可能なプロモーターと、大腸菌ファージＴ７ｇ１０からのリボソーム結合部位と、翻訳開始コドンと、ＩＬ−４のための構造遺伝子またはＩＬ−４ムテインと、この構造遺伝子の下流の一つの転写ターミネーター。
【選択図】なし

Description

本発明は組み換えインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−４ムテインの製造における発現プラスミドの構築および使用に関する。

成熟ヒトインターロイキン−４（ＩＬ−４）は１２９個のアミノ酸から成り、マウスＩＬ−４に対する相同性が５０％である。ＩＬ−４はＴヘルパー細胞の分化をＴ_H2表現型に向けることが知られている唯一のサイトカインである（非特許文献１：ＭｏｓｍａｎｎａｎｄＳａｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１７，１３８−１４６，１９９６）。ＩＬ−４はリンパ細胞および他の細胞に２種のサイトカインレセプタ、ＩＬ−４αおよび共通のγ−鎖（γｃ）、のヘテロ二量体複合体を介してシグナルを送る。拮抗的ＩＬ−４ミュータントが文献に記載されている（非特許文献２：Ｋｒｕｓｅｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．１１，３２３７−３２４４，１９９２）。Ｃ−末端に近い３個のアミノ酸（Ｒ１２１，Ｙ１２４およびＳ１２５）がγｃ−鎖に結合するために重要である。Ａｓｐ（Ｄ）をこれらの位置へ導入するとレセプタの二量化と膜を通しての（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）シグナリング（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とをブロックする。

インターロイキン−４ダブルムテイン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｄｏｕｂｌｅｍｕｔｅｉｎ）（ＩＬ−４ＤＭ）は位置１２１および１２４で２個のアミノ酸が変化したＩＬ−４変異体であり、ＩＬ−４Ｒ１２１ＤＹ１２４Ｄと呼ばれる。ＩＬ−４ＤＭはＩＬ−４活性およびＩＬ−１３活性の両方をブロックすることができる。すべての単一部位ミュータント（ｓｉｎｇｌｅｓｉｔｅｍｕｔａｎｔｓ）とは対照的に、このムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）については拮抗的活性はなんら残留していない。ＩＬ−４ＤＭのこれらの拮抗的性質はＴ_H2発現および／またはＩｇＥ産性が関係する疾病の治療に有効であると考えられる（非特許文献３：Ｒｙａｎ，Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９９，１−５，１９９７）。

種々の刊行物に記載されているように、原核生物を用いて組み換えＩＬ−４およびＩＬ−４ムテインを産性することができる。残念ながら、記載されているシステムは多くの欠点（低発現レベル、発現ベクターの低安定性）を持つためＩＬ−４およびＩＬ−４ムテインの大量生産が不可能であるかあるいは経済的に実施できない。

効率的かつ安全な発現系の主な基準としては下記がある：
・高産性収率
・調節可能な安定的発現
・発現ベクターの安定性
発現プラスミドのいくつかの特長が上記リストの基準に重要である（非特許文献４：Ｈａｎｎｉｇｅｔａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ．１６，５４−６０，１９９８）。これらは：
・プロモーター
・リボソーム結合部位（ｒｂｓ）
・相当する遺伝子のコドン使用頻度
・転写ターミネーター
・耐性遺伝子
・発現の調節
・複製起点（ｏｒｉ）
である。

ＭｏｓｍａｎｎａｎｄＳａｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１７，１３８−１４６，１９９６Ｋｒｕｓｅｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．１１，３２３７−３２４４，１９９２Ｒｙａｎ，Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９９，１−５，１９９７Ｈａｎｎｉｇｅｔａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ．１６，５４−６０，１９９８

インターロイキン−４（ＩＬ−４）および効率的かつ安全な発現系に関連する要素のすべてにおける改変を伴うインターロイキン−４ムテインに対する発現プラスミドを創製した。相当する発現系の品質と適合性を主に下記の基準に従って分類した。
・ＩＬ−４およびＩＬ−４ムテインの収率
・プラスミドの安定性
・誘導能力の維持
従って、本発明の目的は組み換えインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−４ムテインの大量生産における発現プラスミドの構築および使用方法を利用し得るようにすることである。さらに、新規に開発されたホスト／ベクター系は他のタンパク（サイトカイン、成長因子、可溶性レセプタ、抗体等）の発現によく適している必要がある。

意外にも、本発明に係るプラスミドで形質転換したバクテリアは同じ宿主を当該技術分野において知られたプラスミドで形質転換した後に観察されるものよりも幾倍も高い発現率（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｓ）、プラスミドおよび発現安定性値を与える。従って、本発明のプラスミドは組み換えインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−４ムテインの調製に対して従来知られているすべてのプラスミドよりもはるかに有効である。

すなわち、本発明に従えば、５′から３′への順序で下記の機能しうるように結合された要素：大腸菌ファージＴ５プロモーターおよび２つのｌａｃオペレーター配列からなる調節可能なプロモーターと、大腸菌ファージＴ７ｇ１０からのリボソーム結合部位と、翻訳開始コドンと、ＩＬ−４のための構造遺伝子またはＩＬ−４ムテインと、この構造遺伝子の下流の一つの転写ターミネーターとを含む大腸菌の菌株におけるＩＬ−４およびＩＬ−４の製造のためのオペロンが提供される。

好適な発現プラスミドの構築物を示す図である。（略語：ＩＬ−４ＴＭ、ＩＬ−４トリプルムテイン；ＩＬ−４ＤＭ、ＩＬ−４ダブルムテイン）好適な発現プラスミドの構築を示す図である。（略語：ＩＬ−４ＴＭ、ＩＬ−４トリプルムテイン；ＩＬ−４ＤＭ、ＩＬ−４ダブルムテイン）好適な発現プラスミドの構築を示す図である。（略語：ＩＬ−４ＴＭ、ＩＬ−４トリプルムテイン；ＩＬ−４ＤＭ、ＩＬ−４ダブルムテイン）好適な発現プラスミドの構築を示す図である。（略語：ＩＬ−４ＴＭ、ＩＬ−４トリプルムテイン；ＩＬ−４ＤＭ、ＩＬ−４ダブルムテイン）ＩＬ−４発現ベクターｐＲＯ２１．１．ＯおよびｐＲＯ２．１．Ｏのプラスミド安定性を示す図である。ベクターｐＲＯ２．１．Ｏは抗生物質選択なしでは７８世代を超えて十分に安定である。これに対して発現ベクターｐＲＯ２１．１．Ｏ（これは市販のプラスミドｐＥＴ−３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づいている）は非常に急速に失われる。カナマイシン選択なしではコロニーの１６％だけがプラスミドを含有している。好適なＩＬ−４およびＩＬ−４ムテイン発現ベクターの誘導および発現能力の維持を示す図に代わるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。より具体的には、抗生物質選択なしに異なる世代数成長した大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏからの全抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）分析結果を示す写真である。再懸濁細胞ペレット１０μｌを各スロットに適用した。ゲルを還元条件下で流し込み、クマシーブリリアントブルーで染色した。レーン１：分子量マーカー（ローレインジ（ＬｏｗＲａｎｇｅ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）レーン２：ＩＬ−４ムテイン（５μｇ）レーン３：大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（８世代）誘導前レーン４：大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（８世代）誘導後レーン５：大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（１８世代）誘導後レーン６：大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（２８世代）誘導後レーン７：大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（３８世代）誘導後レーン８：大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（４８世代）誘導後レーン９：大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（５８世代）誘導後レーン１０：大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（６８世代）誘導後レーン１１：大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（７８世代）誘導前レーン１２：大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（７８世代）誘導後レーン１３：分子量マーカー（ローレインジ（ＬｏｗＲａｎｇｅ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）レーン１４：分子量マーカー（ハイレインジ（ＨｉｇｈＲａｎｇｅ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）

新規に開発されたベクター系は下記の要素を含む。

Ｔ５プロモーター
２つのｌａｃオペレーター配列を持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ファージＴ５プロモーターは、プラスミドのｐＤＳファミリーに属するｐＱＥ３０プラスミド（Ｑｉａｇｅｎ）から導かれる（Ｂｕｊａｒｄｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５５，４１６−４３３，１９８７およびＳｔｕｅｂｅｒｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，Ｉ．ＬｅｆｋｏｖｉｔｓａｎｄＢ．Ｐｅｒｎｉｓ，ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｖｏｌ．ＩＶ，１２１−１５２，１９９０）。

Ｔ７ｇ１０リボソーム結合部位
リボソーム結合部位（ｒｂｓ）はファージＴ７（Ｔ７ｇ１０リーダー）の遺伝子１０の上流領域から導かれる。ファージＴ７の遺伝子１０はコートタンパクをコードしており、
このコートタンパクはＴ７感染後発現される主要タンパクである。Ｔ７ｇ１０ｒｂｓはベクターｐＥＴ−９ａから得られた（Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１８５，６０−８９，１９９０）。Ｔ７ｇ１０リーダーは約１００ｂｐの領域の長さにわたっている（Ｏｌｉｎｓｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ２２７−２３５，１９８８）。最終発現構築物において、ＸｂａＩ部位の上流領域が削除されている。Ｔ７ｇ１０リーダー配列はいまや４２ｂｐの長さにわたっており、好適なプラスミドの３６３８位置でＧからＡへの一塩基交換を有している。

天然ＩＬ−４配列のコドン使用頻度
同義コドン使用頻度バイアスの有効な測定法として、コドン適応指数（ＣＡＩ）は所与の遺伝子の発現レベルを予言するのに有用であり得る（Ｓｈａｒｐｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５，１２８１−１２９５，１９８７およびＡｐｅｌｅｒｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７，８９０−８９５，１９９７）。ＣＡＩは、遺伝子に用いられているコドンのそれぞれに対応する相対的同義コドン使用頻度（ＲＳＣＵ）の幾何学的意味を、同じアミノ酸組成の遺伝子の最大可能ＣＡＩで除したものとして計算される。各コドンに対するＲＳＣＵ値は特定の生物、例えば大腸菌の非常に高度に発現された遺伝子から計算され、コドンの観察された頻度をアミノ酸の同義コドンは等しい使用頻度であるという仮定の下に期待される頻度で除したものを表す。高度に発現された遺伝子、例えばリボソームタンパクをコードする遺伝子は一般に高いＣＡＩ値＞０．４６を有する。大腸菌のｌａｃ１およびｔｒｐＲのように発現の悪い遺伝子は低いＣＡＩ値＜０．３を有する。

天然ＩＬ−４配列に対して計算された大腸菌ＣＡＩ値は０．７３３である。これは、天然遺伝子は大腸菌における高レベル発現によく適合していなければならないことを意味する。それにもかかわらず、最適の大腸菌コドン使用頻度（ＣＡＩ値＝１）を有する合成遺伝子は発現レベルをさらに増加させる可能性を有する。従って、合成ＩＬ−４およびＩＬ−４ムテイン遺伝子を設計しクローニングした。

転写ターミネーター
転写ターミネーターＴφを含むＴ７ＤＮＡフラグメントはベクターｐＥＴ−９ａから導かれる（Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｌｍｏｌ．１８５，６０−８９，１９９０）。転写ターミネーターはｍＲＮＡ−ＲＮＡポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体が解離し、それにより転写を終了する点を決定する。転写ターミネーターが高度に発現された遺伝子の端部に存在することはいくつかの利点を有する：不必要な転写に関与しているかもしれないＲＮＡポリメラーゼの封鎖を最低限にし、ｍＲＮＡ長を最低限に制限してエネルギー消費を制限するが、これは強い転写は複製起点に干渉するので、転写ターミネーターがコピー数の維持によりプラスミド安定性を向上するからである（ＢａｌｂａｓａｎｄＢｏｌｉｖａｒ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１８５，１４−３７，１９９０）。

耐性遺伝子
ｋａｎ耐性遺伝子はベクターｐＥＴ−９ａから導かれる（Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｌｍｏｌ．１８５，６０−８９，１９９０）。起源的には、これはベクターｐＵＣ４ＫＩＳＳ（Ｂａｒａｎｙ，Ｇｅｎｅ３７，１１１−１２３，１９８５）からのＴｎ９０３のｋａｎ遺伝子である。好適なプラスミドにおいては、ｋａｎ遺伝子とＩＬ−４およびＩＬ−４ムテイン遺伝子とは反対の配向をしており、そのためＴ５プロモーターからのリードスルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写により誘導後ｋａｎ遺伝子産物の増加が起きないようにしている。カナマイシンを選択マーカーとして選択したが、これはＧＭＰ−目的に好適な抗生物質であるからである。さらに、ｋａｎ遺伝子に基づくベクターはアンピシリン耐性（ｂｌａ）プラスミドよりも安定である。アンピシリン選択はこの薬剤が分泌されるβ−ラクタマーゼ酵素により分解されるので培養中に失われがちである。カナマイシンに対するバクテリアの耐性の態様はこの抗生物質を不活性化するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼに依存している。

発現の調節
制御された遺伝子発現は、安定なプラスミド系の確立のために、特に注目しているタンパクがホスト細胞にとって有害であるならば、絶対必要である。好適なプラスミドは、ｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ）および２つの合成ｌａｃオペレーター配列を大腸菌ファージＴ５プロモーターの下流に融合したものからなるｌａｃに基づいた誘導可能系を用いる。ｌａｃＩ^qプロモーターおよびｌａｃＩ構造遺伝子はベクターｐＴｒｃ９９Ａから単離された（Ａｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ６９，３０１−３１５，１９８８）。Ｉ^qはｌａｃＩリプレッサーの過剰産性に導くプロモーター突然変異である。野生型ｌａｃリプレッサーはそれぞれ３６０アミノ酸の同一のサブユニット４個を含む４量体分子である。ｌａｃリプレッサーテトラマーは２つの機能的ダイマーのダイマーである。４つのサブユニットは残基３４０−３６０から形成される４−ヘリックスバンドルにより相互に保持されている。ＮａｒＩ切断によりベクターｐＴｒｃ９９ＡからｌａｃＩ遺伝子が単離することにより、アミノ酸３３１を越える残基が削除され、正常ではｌａｃＩ遺伝子にコードされていない１０アミノ酸が付加される。アミノ酸３２９を越える、ｌａｃＩのＣ−末端部分に起きる突然変異または欠失の結果、表現型が野生型リプレッサーに類似するように見える機能的ダイマーが得られる（Ｐａｃｅｅｔａｌ．，ＴＩＢＳ２２，３３４−３３９，１９９７）。

複製起点（ｏｒｉ）
好適なプラスミドの複製起点（ｏｒｉ）はベクターｐＥＴ−９ａ、ｐＢＲ３２２に由来するｏｒｉ、から導かれる。好適なプラスミドは従ってｐＭＢ１（Ｃｏ１Ｅ１）レプリコンを担持する。このレプリコンを持つプラスミドは「緩和された」様式で複製する多コピープラスミドである。正常な成長条件下では各バクテリア細胞内に最低１５−２０コピーのプラスミドが維持される。好適なプラスミドの実際の数はこの範囲内にある。Ｃｏ１Ｅ１−型ｏｒｉの複製は５５５−ヌクレオチドＲＮＡ転写産物、ＲＮＡＩＩ、により開始され、ｏｒｉ近傍にあるそのテンプレートＤＮＡと永続型ハイブリッドを形成する。ＲＮＡＩＩ−ＤＮＡハイブリッドはついでＲＮａｓｅＨによりｏｒｉで切断して、ＤＮＡポリメラーゼＩのプライマーとして役立つ遊離３′ＯＨを生じる。このＤＮＡ合成のプライミングはＲＮＡＩ、すなわちＲＮＡＩＩの５′末端に相補的な１０８−ヌクレオチドＲＮＡ分子、により負の調節を受ける。アンチセンスＲＮＡＩとＲＮＡＩＩの相互作用はＲＮＡＩＩの立体配座の変化を引き起こしてＲＮＡＩＩのテンプレートＤＮＡへの結合を阻害し、その結果プラスミドＤＮＡ合成の開始を妨げる。ＲＮＡＩとＲＮＡＩＩとの間の結合は６３アミノ酸の小さいタンパク（Ｒｏｐタンパク、Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｏｆｐｒｉｍｅｒ）により増強されるが、このタンパクは複製起点から４００ヌクレオチド下流に位置する遺伝子によってコードされている（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８９）。ｒｏｐ遺伝子の欠失はコピー数の増加を導き、遺伝子量効果によりそのプラスミドをコードする異種遺伝子の発現レベルを向上させる。この観察は試験したＩＬ−４発現ベクターについてもなされた。しかし、ｒｏｐ^-−プラスミドは不安定であり非選択的条件下での発酵中に非常に急速に失われた。従って、好適なプラスミドのレプリコンはｒｏｐ遺伝子を含有して高いプラスミド安定性を確保している。好適なプラスミドは動態化に必要とされるｍｏｂ遺伝子を欠いているため、一つの細菌から他の細菌への独自の接合移入（ｃｏｎｊｕｇａｌｔｒａｎｓｆｅｒ）を誘導することができない。

好適なプラスミドでは、プラスミド複製、耐性および調節可能な発現に不必要な要素はすべて削除されている。

本発明の範囲内にあるためには、上述の特長のすべてを好適な発現プラスミドの構築において取り込む必要はない。例えば、天然のインターロイキン−４またはインターロイキン−４ムテイン遺伝子を、最適化された大腸菌コドン使用頻度をもつ合成のものの代わりに使用することができる。好適な転写ターミネーターはＴφであるが、ｒｒｎＢＴ２またはａｓｐＡのような他のターミネーターも使用できる。同様に、好適なプラスミドの構築用の要素をここに記載した市販のベクター以外から採用することも可能である。

発現系確立の過程で用いた方法を以下に記載する。

材料と方法
酵素
制限エンドヌクレアーゼ、ウシ腸アルカリホスファターゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、およびＴ４ＤＮＡリガーゼをＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍおよびＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから購入して供給元の推奨に従って使用した。

組み換えＤＮＡ法
標準クローニング手順がＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８９）に記載されている。形質転換はＭ．Ｓｃｏｔｔ（ＳｅｅｄａｎｄＡｒｕｆｆｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，３３６５−３３６９，１９８７）に従って行った。形質転換の宿主として、大腸菌菌株ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）およびＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）を主として用いた。Ｗ３１１０の遺伝子型はＫ１２，Ｆ^-、［Ｎ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）］λ^-である。

プラスミドＤＮＡの大量単離はＱｉａｇｅｎ−チップ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの抽出はＪｅｔｓｏｒｂ（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を供給元の推奨に従って用いて行った。

部位指定突然変異誘発、ＰＣＲ反応および配列決定のためのオリゴヌクレオチドはＭＷＧＢｉｏｔｅｃｈ、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈまたはＧＩＢＣＯＢＲＬから得た。

突然変異誘発実験はＤｅｎｇａｎｄＮｉｃｋｏｌｏｆｆの方法（Ｄｅｎｇａｎｄ
Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００，８１−８８，１９９２）によりＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈからの「ユニーク部位除去突然変異誘発（ＵｎｉｑｕｅＳｉｔｅＥｌｉｍｉｎａｔｉｏｎＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」系を用いて行った。Ｔ７ｇ１０ｒｂｓの改造に用いたプライマーは下記の配列を有する：
５′ＴＣＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡ３′（配列１）

すべての構築物およびＤＮＡ配列はＡＢＩ３７３Ａシーケンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳを用いたダイターミネーターサイクルシーケンシング（ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を使用して確認した。

本発明を以下の実施例、図面および配列情報によりさらに詳細に説明する。

プラスミド安定性試験
プラスミド安定性試験は常に液体窒素中で凍結した培養物を用いて開始した。融解した培養物のＯＤ₆₀₀を決定し、この培養物をＰＢＳバッファーに１０^-4まで希釈し、抗生物質無添加ＬＢ寒天培地上にプレーティングした。

融解培養物１ｍｌをペプトン培地（１リットル当り、大豆ペプトン３０ｇ、イーストエキス２０ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄５ｇ、グリセロール２０ｇ、ＭｇＳＯ₄ｘ７Ｈ₂Ｏ１ｇ、ｐＨ７.０）１００ｍｌに移植し、３７℃、２８０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。

成長した培養物のＯＤ₆₀₀を決定し、この培養物をＰＢＳバッファーに１０^-6まで希釈し、抗生物質無添加ＬＢ寒天培地上にプレーティングしてよく分離したコロニーを得た。

成長した培養物１００μｍをペプトン培地１００ｍｌに移植し、３７℃、２８０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。この手順を８回繰り返した。

ＬＢ培地からのよく分離したコロニー１００個をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）添加ＬＢプレートおよびカナマイシン無添加ＬＢプレート上に碁盤の目状に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。耐性コロニーのパーセンテージを毎日決定した。

一日当たりの世代数を次式：
世代数／日＝ｌｏｇ［ＯＤ_600END／ＯＤ_600BEG］／ｌｏｇ２
に従って計算した。

発現検討のため、成長した培養物１ｍｌをＬＢ培地に１００倍希釈し下記（実施例２参照）のように取り扱った。

発現
小規模発現のために、インターロイキン−４およびインターロイキン−４ムテイン細胞をＬＢ培地（バクトトリプトン（Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ）１０ｇ、イーストエキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ、ｐＨ７．５）中でＯＤ₆₀₀が０．８−１．０に達するまで成長した。ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭまで添加することにより発現を誘導し、インキュベーションを５時間継続した。細胞を遠心により収穫した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ装填バッファーに１ＯＤ₆₀₀ユニット／１００μｌの濃度になるように懸濁した。

本発明の主な特徴および態様を示せば以下のとおりである。

１．５′から３′への順序で下記の操作可能に結合された要素：大腸菌ファージＴ５プロモーターおよび２つのｌａｃオペレーター配列からなる調節可能なプロモーターと、大腸菌ファージＴ７ｇ１０からのリボソーム結合部位と、翻訳開始コドンと、ＩＬ−４のための構造遺伝子またはＩＬ−４ムテインと、この構造遺伝子の下流の一つの転写ターミネーターとを含む大腸菌の菌株におけるＩＬ−４およびＩＬ−４の製造のためのオペロン。

２．大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ。

３．上記１または２のプラスミドの１種以上で形質転換された大腸菌。

４．ＩＬ−４およびＩＬ−４ムテインの調製方法における上記１または２によるプラスミドの使用。

Claims

５′から３′への順序で下記の機能するように結合された要素：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ファージＴ５プロモーターおよび２つのｌａｃオペレーター配列からなる調節可能なプロモーターと、大腸菌ファージＴ７ｇ１０からのリボソーム結合部位と、翻訳開始コドンと、ＩＬ−４またはＩＬ−４ムテインのための構造遺伝子と、この構造遺伝子の下流の一つの転写ターミネーターとを含む大腸菌の菌株におけるＩＬ−４またはＩＬ−４ムテインの製造用発現プラスミド。
プラスミドがｐＲＯ２．１．０である請求項１記載の要素を含むプラスミド。
請求項１または２の１種以上のプラスミドで形質転換された大腸菌細胞。