KR100665148B1 - 플라스미드, 그의 제조 방법, 및 인터루킨-4 및인터루킨-4 뮤테인 제조시의 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 인터루킨-4 (IL-4) 및 인터루킨-4 뮤테인 제조용 발현 벡터의 제조 및 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 플라스미드는 이. 콜라이(E. coli) 파지 T5 프로모터 및 2개의 lac 오퍼레이터 서열로 구성된 조절가능 프로모터, 이. 콜라이 파지 T7 g10으로부터 유래한 리보좀 결합 부위, 번역 개시 코돈, IL-4 또는 IL-4 뮤테인의 구조 유전자 및 상기 구조 유전자 하류에 위치하는 1개의 전사 터미네이터를 작동가능한 방식으로 5'에서 3' 방향으로 포함한다.
본 발명에 따른 플라스미드는 종래의 플라스미드보다 높은 발현율 및 안정성을 갖고, 따라서 이 플라스미드로 형질전환된 세균을 사용하여 재조합 인터루킨-4 및 인터루킨-4 뮤테인을 대량생산할 수 있다.
재조합 인터루킨-4, 인터루킨-4 뮤테인, 발현 벡터, 프로모터, 오퍼레이터

Description

플라스미드, 그의 제조 방법, 및 인터루킨-4 및 인터루킨-4 뮤테인 제조시의 그의 용도{Plasmids, Their Construction and Their Use in the Manufacture of Interleukin-4 and Interleukin-4 Muteins}
도 1 내지 4는 바람직한 발현 플라스미드의 구조도 (IL-4 TM: IL-4 삼중 뮤테인, IL-4 DM: IL-4 이중 뮤테인).
도 5는 IL-4 뮤테인 발현 벡터 pRO21.1.0 및 pRO2.1.0.의 플라스미드 안정성을 나타낸 그래프.
도 6은 바람직한 IL-4 및 IL-4 뮤테인 발현 벡터의 유도 및 발현능의 유지를 나타낸 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 사진.
본 발명은 발현 플라스미드의 제조 및 그의 재조합 인터루킨-4 (IL-4) 및 인터루킨-4 뮤테인의 제조시의 용도에 관한 것이다.
성숙 인간 인터루킨-4 (IL-4)는 마우스 IL-4와 50%의 상동성을 갖는 129개의 아미노산으로 이루어진다. IL-4는 T 헬퍼 세포의 TH2 표현형으로의 분화를 지시하 는 것으로 알려진 유일한 시토킨이다 (Mosmann and Sad, Immunol. Today 17, 138 - 146, 1996). IL-4는 2개의 시토킨 수용체인 IL-4Rα 및 공통적인 γ-사슬 (γc)의 이종이량체 복합체를 통하여 임파구 및 다른 세포에 시그날을 전달한다. 길항성 IL-4 변이체는 문헌 [Kruse et al., EMBO J. 11, 3237-3244, 1992]에 기재되어 있다. C 말단에 근접한 3개의 아미노산 (R121, Y124 및 S125)은 γc-사슬에 대한 결합을 위해 중요하다. Asp (D)를 상기 위치들에 도입하면 수용체 이량체화 및 트랜스멤브레인 시그날링이 차단된다.
인터루킨-4 이중 변이체 (IL-4 DM)는 IL-4 R121D Y124D로 명명된 121 및 124 위치에서 2개의 아미노산이 변화된 IL-4 변이체이다. IL-4 DM은 IL-4 및 IL-13의 활성을 모두 차단할 수 있다. 모든 단일 부위 변이체와는 달리, 상기 뮤테인에서는 어떠한 잔류 아고니스트 활성이 발견되지 않았다. IL-4 DM의 상기 길항 활성은 TH2 발생 및(또는) IgE 생성을 수반하는 질병의 치료에 유용하다고 생각되어 왔다 (Ryan, J. Allergy Clin. Immunol. 99, 1-5, 1997).
상이한 문헌에 기재된 바와 같이, 원핵 유기체는 재조합 IL-4 및 IL-4 뮤테인 생산에 사용될 수 있다. 불행하게도, 문헌에 기재된 시스템은 IL-4 및 IL-4 뮤테인의 대량 생산을 불가능하게 만들거나 경제적으로 실시할 수 없게 만드는 많은 단점 (낮은 발현 수준, 발현 벡터의 낮은 안정성)을 갖는다.
효율적이고 안전한 발현 시스템을 위한 주요 기준은 높은 생산 수율, 조절가능한 안정한 발현 및 발현 벡터의 안정성이다.
발현 플라스미드의 여러 성분이 상기 나열한 기준을 위해 중요하고 (Hannig et al., TIBTECH. 16, 54-60, 1998), 그 예는 프로모터, 리보좀 결합 부위 (rbs), 대응하는 유전자의 코돈 사용, 전사 터미네이터, 내성 유전자, 발현 조절, 복제 기점 (ori) 등이다.
따라서, 본 발명은 종래의 플라스미드보다 높은 발현율 및 발현 안정성을 갖는 플라스미드 및 이를 사용하여 재조합 인터루킨-4 및 인터루킨-4 뮤테인을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 이와 같은 목적을 달성하기 위해서 효율적이고 안전한 발현 시스템을 위해 모든 관련 성분이 변형된 IL-4 및 IL-4 뮤테인 발현 플라스미드를 제조하여 대응하는 발현 시스템의 품질 및 적합성은 주로 하기 기준에 따라 평가하였다.
- IL-4 및 IL-4 뮤테인의 수득량,
- 플라스미드 안정성,
- 유도능의 유지력.
이와 같이, 본 발명의 목적은 발현 플라스미드의 제조 방법 및 재조합 인터루킨-4 (IL-4) 및 인터루킨-4 뮤테인의 대량 생산에서의 그의 용도를 제공하는 것이다. 또한, 새로 개발되는 숙주/벡터 시스템은 다른 단백질 (시토킨, 성장 인자, 가용성 수용체, 항체 등)의 발현에 적합하여야 한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 이. 콜라이 파지 T5 프로모터 및 2개의 lac 오퍼레이터 서열로 구성된 조절가능 프로모터, 이. 콜라이 파지 T7 g10으로부터 유래한 리보좀 결합 부위, 번역 개시 코돈, IL-4 또는 IL-4 뮤테인의 구조 유전자 및 상기 구조 유전자 하류에 위치하는 1개의 전사 터미네이터를 5'에서 3' 방향으로 작동가능하게 포함하는 본 발명에 따른 플라스미드로 형질전환된 세균이 당업계에 공지된 플라스미드로 동일한 숙주를 형질전환시킨 후에 관찰된 것보다 수배 더 높은 발현율, 플라스미드 및 발현 안정성 값을 나타냄을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 플라스미드는 이전에 공지된 모든 플라스미드보다 재조합 인터루킨-4 및 인터루킨-4 뮤테인의 제조에 훨씬 더 유용하다.
본 발명에서 신규하게 개발된 벡터 시스템은 하기 성분을 함유한다.
T5 프로모터
2개의 lac 오퍼레이터 서열과 함께 이. 콜라이(E. coli) 파지 T5 프로모터는 플라스미드의 pDS 패밀리에 속하는 pQE30 플라스미드 (Qiagen)으로부터 유래한 것이다 (Bujard et al., Methods Enzymol. 155, 416-433, 1987 및 Stueber et al., Immunological Methods, I. Lefkovits and B. Pernis, eds., Academic Press, Inc., Vol. IV, 121-152, 1990).
T7 g10 리보좀 결합 부위
리보좀 결합 부위 (rbs)는 파지 T7의 유전자 10의 상류 영역 (T7 g 20 리더)으로부터 유래한 것이다. 파지 T7의 유전자 10은 T7 감염 후에 발현되는 주요 단백질인 코트 단백질을 코딩한다. T7 g10 rbs는 벡터 pET-9a로부터 수득하였다 (Studier et al., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990). T7 g10 리더는 약 100 bp의 영역에 이른다 (Olins et al., Gene 227-235, 1988). 최종 발현 구조체에는, XbaI 부위의 상류 영역이 결실되어 있다. T7 g10 리더 서열은 이제 42 bp에 해당하고, 바람직한 플라스미드의 3638 위치에서 G로부터 A로의 염기 치환을 함유한다.
천연 IL-4 서열의 코돈 사용
동의(同意) 코돈 사용 경향의 효과적인 척도로서, 코돈 적합화 지수 (CAI)가 제시된 유전자의 발현 수준의 예측에 유용하게 사용될 수 있다 (Sharp et al., Nucleic Acids Res. 15, 1281-1295, 1987 및 Apeler et al., Eur. J. Biochem. 247, 890-895, 1997). CAI는 유전자에서 사용된 각각의 코돈에 대응하는 상대적인 동의 코돈 사용량 (RSCU)을 동일한 아미노산 조성을 갖는 유전자에 대한 최대 가능한 CAI로 나눈 기하 평균으로서 계산된다. 각각의 코돈에 대한 RSCU값은 특정 유기체, 예를 들어 이. 콜라이의 매우 높게 발현되는 유전자로부터 계산되고, 아미노산에 대한 동의 코돈이 동일하게 사용되었다는 가정 하에 예상된 빈도로 코돈의 관찰된 빈도를 나눈 값을 나타낸다. 높게 발현되는 유전자, 예를 들어 리보좀 단백질을 코딩하는 유전자는 일반적으로 0.46 이상의 높은 CAI 값을 갖는다. 이. 콜라이에서 저조하게 발현되는 lacI 및 trpR와 같은 유전자는 0.3 이하의 낮은 CAI 값을 갖는다.
천연 IL-4 서열에 대해 계산된 이. 콜라이 CAI 값은 0.733이다. 이것은 천연 유전자가 이. 콜라이에서의 높은 수준의 발현에 적합하여야 한다는 것을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 최적 이. 콜라이 코돈 사용량 (CAI 값 = 1)을 갖는 합성 유전자는 발현 수준을 보다 더 증가시키는 능력을 갖는다. 따라서, 합성 IL-4 및 IL-4 뮤테인 유전자를 고안하여 클로닝하였다.
전사 터미네이터
전사 터미네이터 Tø을 함유하는 T7 DNA 단편은 벡터 pET-9a로부터 유래한 것이다 (Studier et al., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990). 전사 터미네이터는 mRNA-RNA 폴리머라제-DNA 복합체가 분리되어 전사를 종결시키는 지점을 결정한다. 발현 수준이 높은 유전자의 끝에 전사 터미네이터가 존재하면 몇가지 잇점을 갖는데, 그것은 RNA 폴리머라제가 불필요한 전사에 참여하는 것을 최소화시키고, mRNA의 길이를 최소로 제한하여 에너지 소비를 제한하고, 강한 전사는 복제 기점을 방해하기 때문에 전사 터미네이터는 카피수 유지에 의한 플라스미드 안정성을 증가시킨다는 것이다 (Balbas and Bolivar, Methods Enzymol. 185, 14-37, 1990).
내성 유전자
kan 내성 유전자는 벡터 pET-9a로부터 유래한 것이다 (Studier et al., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990). 본래, 이 유전자는 벡터 pUC4KISS로부터의 Tn903의 kan 유전자이다 (Barany, Gene 37, 111-123, 1985). 바람직한 플라스미드에서, kan 유전자와 IL-4 및 IL-4 뮤테인 유전자는 반대 배향을 갖기 때문에, T5 프로모터로부터의 통독 (read-through) 전사에 의한 유도 후에 kan 유전자 생성물이 증가하지 않아야 한다. 카나마이신은 GMP에 대한 바람직한 항생물질이기 때문에 선택 마커로서 선택되었다. 또한, kan 유전자 기재 벡터는 암피실린 내성 (bla) 플라스미드보다 안정하다. 암피실린 선택은 분비된 β-락타마제 효소에 의 해 약물이 분해되기 때문에 배양 중에 소실되는 경향이 있다. 카나마이신에 대한 세균 내성의 방식은 항생물질을 불활성화시키는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제에 의존적이다.
발현의 조절
유전자 발현의 조절은 특히 목적 단백질이 숙주 세포에 유해한 경우에 안정한 플라스미드 시스템의 구성에 절대적으로 필요하다. 바람직한 플라스미드는 lac 리프레서 유전자 (lacI) 및 이. 콜라이 파지 T5 프로모터의 하류에 융합된 2개의 합성 lac 오퍼레이터 서열로 구성된 lac계 유도가능 시스템을 사용한다. lacIq 프로모터 및 lacI 구조 유전자는 벡터 pTrc99A로부터 단리되었다 (Amann et al., Gene 69, 301-315, 1988). Iq는 lacI 리프레서의 과생산을 야기하는 프로모터 변이이다. 야생형 lac 리프레서는 각각 360개의 아미노산으로 구성된 동일한 4개의 서브유닛을 포함하는 사량체 분자이다. lac 리프레서 테트라머는 2개의 기능성 이량체들의 이량체이다. 4개의 서브유닛은 잔기 340-360으로 형성된 4개의 헬릭스 다발에 의해 서로 유지된다. NarI 절단에 의한 벡터 pTrc99A로부터의 lacI 유전자의 단리에 의해 아미노산 331 이후의 잔기가 결실되고, lacI 유전자에서 정상적으로 코딩되지 않는 10개의 아미노산이 부가된다. 아미노산 329 이후의 lacI의 C 말단부에서 발생하는 돌연변이 또는 결실은 표현형이 야생형 리프레서와 유사한 기능성 이량체를 생성시킨다 (Pace et al., TIBS 22, 334-339, 1997).
복제 기점 (ori)
바람직한 플라스미드의 복제 기점 (ori)은 그의 ori가 pBR322로부터 유래한 벡터 pET-9a로부터 유래한 것이다. 따라서, 바람직한 플라스미드는 pMB1 (ColE1) 레플리콘을 함유한다. 상기 레플리콘을 갖는 플라스미드는 '이완된(relaxed)' 방식으로 복제하는 다중카피 플라스미드이다. 최소 15 내지 20 카피의 플라스미드가 정상 성장 조건 하에서 각각의 세균 세포에서 유지된다. 바람직한 플라스미드의 실제 수는 상기 범위 내에 있다. Co1E1형 ori의 복제는 ori 부근의 주형 DNA와 영구적인 혼성체를 형성하는 555 뉴클레오티드 RNA 전사체인 RNA II에 의해 개시된다. RNA II-DNA 혼성체는 ori에서 RNase H에 의해 분해되어 DNA 폴리머라제 I에 대한 프라이머로서 기능하는 유리 3' OH를 생성시킨다. 이러한 DNA 합성의 프라이밍은 RNA II의 5' 말단에 상보성인 108 뉴클레오티드 RNA 분자인 RNA I에 의해 음성 조절된다. 안티센스 RNA I과 RNA II의 상호작용은 RNA II의 주형 DNA에 대한 결합을 억제하여 플라스미드 DNA 합성의 개시를 억제하는 RNA II의 형태 변화를 야기한다. RNA I과 II 사이의 결합은 복제 기점으로부터 400 뉴클레오티드 하류에 위치하는 유전자에 의해 코딩되는 63개의 아미노산으로 이루어진 작은 단백질(Rop 단백질, Repressor of primer)에 의해 강화된다 (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). rop 유전자의 결실은 카피수를 증가시키고 유전자 사용량 효과에 의해 이종성 유전자를 코딩하는 플라스미드의 발현 수준을 증강시킨다. 또한, 이러한 현상은 시험된 IL-4 발현 벡터에서도 관찰되었다. 그러나, rop 플라스미드는 불안정하여 비선택 조건 하에서 발효 동안 매우 급속하게 소실됨이 입증되었다. 따라서, 바람직한 플라스미드의 레플리콘은 높은 플라스미드 안정성 을 보장하기 위해서 rop 유전자를 함유한다. 바람직한 플라스미드는 이동에 필요한 mob 유전자가 결실되어 한 세균으로부터 다른 세균으로 그 자체의 접합 이동을 지시할 수 없다.
바람직한 플라스미드에서, 플라스미드 복제, 내성 및 발현 조절에 필요하지 않은 모든 성분은 결실되었다.
본 발명의 범위 내에 포함시키기 위해서, 상기 모든 성분이 바람직한 플라스미드의 구성에 포함될 필요는 없다. 예를 들어, 최적화된 이. 콜라이 코돈 사용량을 갖는 합성 유전자 대신에 천연 인터루킨-4 또는 인터루킨-4 뮤테인 유전자가 사용될 수 있다. 바람직한 전사 터미네이터는 Tø이지만, rrnB T2 또는 aspA와 같은 다른 터미네이터도 사용할 수 있다. 이와 유사하게, 바람직한 플라스미드의 구성을 위해 본원에서 설명된 시판되는 벡터 외의 다른 벡터로부터 유래한 성분을 사용할 수 있다.
물질 및 방법
효소
제한 엔도뉴클레아제, 송아지 내장 알칼린 포스파타제, T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 T4 DNA 리가제를 Boehringer Mannheim 및 GIBCO BRL로부터 구입하여 제조자의 권고대로 사용하였다.
재조합 DNA 방법
표준 클로닝 방법은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989]에 기재되어 있다. 형질전환은 문헌 [M. Scott, Seed and Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365-3369, 1987]에 따라 수행하였다. 형질전환용 숙주로서는 이. 콜라이 균주 DH5α (GIBCO BRL) 및 W3110 (ATCC 27325)를 1차적으로 사용하였다. W3110의 유전형은 K12, F-, [N(rrnD-rrnE)]λ-이다.
플라스미드 DNA의 대규모 단리는 Qiagen-tips (Qiagen)을 사용하여 수행하였다. 아가로스겔로부터 DNA 단편의 추출은 Jetsorb(Genomed)를 제조자의 권고대로 사용하여 수행하였다.
부위 지정 돌연변이, PCR 반응 및 서열 결정용 올리고뉴클레오티드는 MWG Biotech, Pharmacia Biotech 또는 GIBCO BRL로부터 구입하였다.
돌연변이 실험은 Pharmacia Biotech사의 '특유 부이 제거 돌연변이' 시스템을 사용하여 문헌[Deng and Nickoloff, Anal. Biochem. 200, 81-88, 1992]의 방법을 사용하여 수행하였다. T7 g10 rbs의 생성을 위해 사용된 프라이머는 하기 서열을 갖는다:
5'TCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACATCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAA3' (서열 1)
모든 구조체 및 DNA 서열은 ABI 373A 서열분석기 (Applied Biosystems)로 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 사용하여 Dye Terminator Cycle Sequencing에 의해 확인하였다.
본 발명은 하기 실시예, 도면 및 서열 정보에 의해 보다 상세하게 설명된다.
<실시예 1>
플라스미드 안정성 시험
플라스미드 안정성 시험은 항상 액체 질소로 냉동시킨 배양물을 사용하여 시작하였다. 해동시킨 배양물의 OD600을 측정하고, 배양물을 PBS 완충액으로 10-4까지 희석하여 항생물질이 없는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다.
해동된 배양액 1 ml을 펩톤 배지 (리터 당 콩 펩톤 30 g, 효모 추출물 20 g, KH2PO4 5g, 글리세롤 20 g, MgSO4 x 7H2O 1 g, pH 7.0)에 접종하고 37℃에서 280 rpm에서 24시간 동안 배양하였다.
성장한 배양물의 OD600을 측정하고, PBS 완충액 중에서 10-6까지 희석하여 항생물질이 없는 LB 아가 플레이트에 플레이팅하여 잘 분리된 콜로니를 수득하였다.
성장한 배양물 100 ㎕를 펩톤 배지 100 ml에 접종하고 37℃에서 280 rpm에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 과정을 8회 반복하였다.
LB 플레이트로부터 잘 분리된 100개의 콜로니를 카나마이신 (25 ㎍/ml)을 함유하는 LB 플레이트 및 카나마이신이 없는 LB 플레이트 상에 그리딩하여 37℃에서 철야 배양하였다. 내성 콜로니의 비율을 매일 조사하였다.
1일당 세대수를 식 log[OD600 END/OD600 BEG]/log2에 따라 계산하였다.
발현 연구를 위해, 성장 배양물 1 ml을 LB 배지로 100배 희석하여 처리하였다 (실시예 2 참조).
도 5는 IL-4 뮤테인 발현 벡터 pRO21.1.0 및 pRO2.1.0.의 플라스미드 안정성 을 나타낸 그래프이다. 벡터 pRO2.1.0.은 항생물질 선택이 없는 상태에서 78 세대에 걸쳐 충분히 안정한 상태를 유지하였다. 이와 달리, 시판되는 플라스미드 pET-30a (Novagen)을 기초로 한 발현 벡터 pRO21.1.0.은 매우 급속하게 소실되었다. 16%의 콜로니만이 카나마이신 선택이 없는 상태에서 78세대 후에 플라스미드를 함유하였다.
<실시예 2>
발현
인터루킨-4 및 인터루킨-4 뮤테인의 소규모 발현을 위해 LB 배지 (리터 당 콩 Bacto 트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g, NaCl 10 g, pH 7.5)에서 OD600가 0.8 내지 1.0에 도달할 때까지 세포를 성장시켰다. 최종 농도 0.5 ml로 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고, 5시간 동안 계속 배양하였다. 세포를 원심분리에 의해 회수하였다.
SDS-PAGE 분석을 위해 세포 펠렛을 1 OD600 단위/100 ㎕의 농도까지 SDS-PAGE 로딩 완충액 중에 재현탁시켰다.
본 발명에 따른 플라스미드는 종래의 플라스미드보다 높은 발현율 및 안정성을 갖고, 따라서 이 플라스미드로 형질전환된 세균을 사용하여 재조합 인터루킨-4 및 인터루킨-4 뮤테인을 대량생산할 수 있다.
<110> Bayer AG <120> PLASMIDS, THEIR CONSTRUCTION AND THEIR USE IN THE MANUFACTURE OF INTERLEUKIN-4 AND INTERLEUKIN-4 MUTEINS <130> Plasmids for IL-4 muteins <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: primer <400> 1 tcaattgtga gcggataaca atttcacaca tctagaaata attttgttta actttaagaa 60 <210> 2 <211> 4202 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: Human <400> 2 ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat 60 accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca 120 taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc 180 tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac 240 tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca 300 gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg 360 cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga 420 atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata 480 ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc 540 atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt 600 tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa 660 caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac 720 attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg 780 cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat 840 gtaagcagac agttttattg ttcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 900 gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 960 taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 1020 aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 1080 ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 1140 catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 1200 ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 1260 ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 1320 agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 1380 taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 1440 atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 1500 cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 1560 ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 1620 accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 1680 gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 1740 tgtgcggtat ttcacaccgc aatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 1800 gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 1860 ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 1920 caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 1980 cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct 2040 gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg 2100 ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa 2160 gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata 2220 cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg 2280 gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg ctcatgagcc 2340 cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg 2400 cacctgtggc gccggtgatg ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc gagatccatt 2460 tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa 2520 gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat 2580 gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg 2640 aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg 2700 gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc 2760 ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc 2820 agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac 2880 aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat 2940 gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac 3000 cagacaccca tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag 3060 catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc 3120 tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg 3180 atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg 3240 ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc 3300 gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga 3360 tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat 3420 tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg 3480 gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggctcga 3540 gaaatcataa aaaatttatt tgctttgtga gcggataaca attataatag attcaattgt 3600 gagcggataa caatttcaca catctagaaa taattttatt taactttaag aaggagatat 3660 acatatgcac aaatgcgata tcaccctgca ggaaatcatc aaaaccctga attctctgac 3720 cgaacagaaa accctgtgca ccgaactgac cgttaccgac atcttcgctg cttcgaaaaa 3780 caccaccgaa aaagaaacct tctgccgtgc tgctaccgtt ctgcgtcagt tctactctca 3840 ccacgaaaaa gacacccgtt gcctgggtgc taccgctcag cagttccacc gtcacaaaca 3900 gctgatccgt ttcctgaaac gtctggaccg taacctgtgg ggtctggctg gtctgaacag 3960 ctgcccggtt aaagaagcta accagtctac cctggaaaac ttcctggaac gtctgaaaac 4020 catcatggac gaaaaagact ctaaatgctc ttcttaataa ggatccggct gctaacaaag 4080 cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg 4140 gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggataat 4200 tc 4202

Claims (4)

  1. 이. 콜라이(E. coli) 파지 T5 프로모터 및 2개의 lac 오퍼레이터 서열로 구성된 조절가능 프로모터, 이. 콜라이 파지 T7 g10으로부터 유래한 리보좀 결합 부위, 번역 개시 코돈, IL-4 또는 IL-4 뮤테인의 구조 유전자 및 상기 구조 유전자 하류에 위치하는 1개의 전사 터미네이터 성분들을 5'에서 3' 방향으로 작동가능하게 연결하여 포함하는, 이. 콜라이 균주에서 IL-4 및 IL-4 뮤테인을 제조하기 위한 발현 플라스미드.
  2. 제1항의 성분들을 포함하고, 서열 2의 DNA 서열을 갖는 플라스미드 pRO2.1.O.
  3. 하나 이상의 제1항 또는 2항의 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 세포.
  4. 삭제
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