TW514667B

TW514667B - Methods for production of recombinant plasmids

Info

Publication number: TW514667B
Application number: TW085115998A
Authority: TW
Inventors: Mohamad A Morsey
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1995-10-17
Filing date: 1996-12-24
Publication date: 2002-12-21
Also published as: WO1997014805A2; AU7208896A; EP0856059A1; DE69629576T2; CA2232234A1; EP0856059B1; WO1997014805A3; US5922583A; JPH11513562A; DE69629576D1; ATE247713T1

Description

514667 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（！）發明背景遺傳工程處理過的細菌細胞和重組質體的組合爲工業生物技術的基礎。例如，彼樂可用來生產具有工業和醫藥重要性的蛋白質例如酵素，細胞激素，生長激素，和抗原或活細菌疫苗。DNA免疫化和基因治療技術的進展更對於遺傳工程細菌細胞及其伴同的重組質體之利用添加另一次元。對於這些技術的目的而言，在遺傳工程細菌細胞內的蛋白質表現已不再是主要目的，取而代之者爲載有外來 D N A的構造和遺傳上穩定的重組質體之複製和高水平生產。這是因爲在DNA免疫化或基因治療中，係以DNA 而非其所編碼的蛋白質爲需要用到的產物之故。因此，本發明係有關遺傳工程細菌細胞及其伴同的重組質體對於外來DNA的選殖之利用。更特定言之，本發明提出一種方法其藉此可將適合用於D N A免疫化和基因治療中的外來D N A在這些體同重組質體內大量地複製和生產。在重組DNA技術發展的早期，即了解到對該新發展技術的主要挑戰爲將重組質體穩定地維持在細菌細胞內。此外也發覺此問題大部份來自於對遺傳工程細菌細胞沒有用的蛋白質之高水平表現而對該等細胞施加之重代謝負荷〇其結果，在繁殖對維持重組質體沒有鼓勵的遺傳工程細菌細菌細胞時’時間一久’無質體細菌細胞即以遞增頻率出現。而因爲對載有質體的細菌細胞之較重代謝負荷之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ -4 - 514667 A7 B7 五、發明説明（2 ) 故，無質體細菌細胞即具有較高的生長速率。如此一來’ 在相當短時間內，細菌培養物內可能變成主要含有該無質體細菌細胞，因而導致遞減的質體產率。由於載有質體的細菌細胞幾乎總是處於相對於無質體細菌細胞的生長劣勢，所以在延長培養期內產生的任何無質體細菌細胞最後即接收醱酵生物反應器。於此方面’據估計，即使質體減損率只有1x1 〇_7 ，該無質體細菌細胞的1 0 %生長優勢會導致於1小時/升的稀釋速率下在1 5 0小時培養中即接收生物反應器。這些計算結果即強調對於防止質體減損有1 0 0%效率的質體安定化系統之需求，因爲在工業生物反應器內連續培養3 0 0小時以生長細菌細胞不是不常見的方式。這些觀察結果顯示對於將重組質體殖體維持在繁殖的遺傳工程細菌細胞內沒有選擇性壓力時會導致載有質體的細菌細胞之遞減率，且載有質體的細胞細胞之較低生長速率會進一步加重質體的損失。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 已有幾種方法被設計出來增進重組質體在細菌細胞群中的安定性。所有這些方法都具有一共同的基本原則：施加選擇性壓力以確使只有載著重組質體的細菌細胞得以生長和複製。於這一種這些方法之中，係經由在也載著一或多種對特定抗生素具有指定抗性的基因之重組質體上選殖所欲基因而對細菌細胞施加選擇性壓力。如此，在生長中的細菌細胞培養物中加入特定的抗生素即可確使只讓有載著重組本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -5 - 514667 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3 ) 質體的細胞有活下去。雖然抗生素抗性基因已非常有用且有效地提供一種重組質體安定性手段，不過彼等的使用仍然具有嚴重的缺陷。第一，在工業規模的醱酵中，於培養基內添加抗生素係昂貴者。第二，在抗生素抗拒機構係以抗生素-抑活化性化合物的分泌爲基礎之情況中，會因爲周圍的載有質體之細菌細胞分泌出足夠的抗生素-抑活化性化合物到培養基內促使載質體和無質體兩種細菌細胞都存活下來而使得某些無質體細菌細胞可能有活。第三，含有抗生素抗拒性基因的重組質體D NA對於D NA免疫化和基因治療的使用會因爲這些基因可能組合到動物基因組，或摻到內源微小植物的基因組內而顯得不利。第四，污染到質體DNA的殘留抗生素（係因彼等添加到培養基內之結果）可能引起使用彼等質體D N A治療過的某些動物產生過敏性及/或系統性過敏反應。作爲抗生素抗拒性基因使用的取代方法上，已有幾種方法被設計出以增進重組質體的安定性及過止無質體細菌細胞的蓄積。這些方法的共同脈絡爲使經遺傳工程處理過的細菌細胞依賴使用載質體基因的官能互補系統而存活下來。這些已知方法可以依所使用的基因所編碼的多肽類別而分成三組。不過，各已知方法皆可能因在工業條件下不能用來減低無質體細菌細胞的產生速率及/或因不適合用來產生可用於真核生物的重組質體，例如用於D N A免疫本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Γ -6 - 514667 A7 B7 五、發明説明（4 ) 化和基因治療中者。下面要輪流說明每一組方法。第一組方法包括產生染色體缺陷，其可導致無法產生必需養份且載有質體的基因編碼著對於一般存在於常用細菌生長培養基內的該種養份（如胺基酸）爲必要之酵素（ Dwivedi, C· Ρ· et a 1. Biotechnology and Bioengineering (1982) 24 : 1465—1668 ί Iraanaka ,T. et al· J. Gen Microbiol (1980) 118: 253—261)。這些在先前技藝中述及的方法需要在缺乏該標的胺基酸的特殊且昂貴之合成培養基內生長該載有質體的細菌細胞。此點對於工業生物反應器情況係不實用者。第二組方法包括產生染色體缺陷其促成所需終端產物之生產缺陷，且載有質體的基因編碼著合成該終端產物之酵素，但該終端產物不存在於常用的細菌生長培養基內（ Diderichsen，B. Bacillus Molecular Genetics a η H R ΐ otechnologv Applications (1986) PP. 35— 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 6 ; Ferrari, E. et al. BioTechnology ( 1 9 8 5 ) 3^1003-1007； Galan, J. E. et al. Gene ( 1990)94:29» Nakayama, K. et al. BioTech-nologyC 1 9 8 8 ) 6 : 6 9 6 » Curtiss, R. et al. ResMicrobiol(1990) 141 ·· 7 9 7) 〇到目前爲止，這種方法都集中在摻入細菌細胞壁內的胺基酸之合成上。這種作法在DNA免疫化和基因治療中的使用則基於下列諸理由而受阻。本ϋ尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ 一 7 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 514667 A7 B7 五、發明説明（5 ) 到目前爲止在這些情況中使用到的酵素（例如天冬胺酸半醛脫氫酶（a s d)或丙胺酸消旋酶（a 1 r ))會催化小型擴散性生長因子之形成（分別爲天冬胺酸半醛和 D-丙胺酸）且該等因子可能在工業生物反應器條件下於培養基內蓄積。彼等蓄積現象會因爲互餵效應（Cross-feeding effect )使載有質體的細菌細胞（產生該小型擴散性生長因子）支援無質體細菌細胞的生長而促成質體減損。因此之故，爲了避免彼等互餵效應，乃以具有低複本數（1 〇 w - c 〇 p y - n u m b e r )的質體來使用此類型基因，亦即，每細菌細胞只有1或2複本之類型。顯然地，使用低複本數重組質體對於需要可導致高複本數的質體類型之質體D N A工業量產而言是不實用者。高複本數重組質體爲每細菌細胞有約5 0至數百質體複本之類型。作爲載質體基因的a s d基因具有另一缺陷。該缺陷來自於最近的發現（Park, J. T. Molecular Microbio-logy ( 1 9 9 5 ) 1 7 : 4 2 1 — 4 2 6 )，亦即細菌細胞（如大腸桿菌（R. Coli ))事實上會降解掉細5 0 %其所含的肽聚糖層。其降解產物爲包含L -丙胺酸/D -榖胺酸/中二胺基庚二酸之三肽，其可被細菌細胞再利用而形成肽聚糖因而節省掉細菌細胞必需花費來合成新的肽聚糖所含三肽成份所需能量。有高比例的此種三肽會釋放到培養基內且被鄰近細菌細胞吸收利用而摻加到其自身的肽聚糖層內。該a s d基因編碼該三肽所含胺基酸…… 中二胺基庚二酸（dap) -生合成中的第一種酵素。不本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

一 8 一經濟部中央標準局員工消費合作社印製 514667 A7 ___B7 五、發明説明（6 ) 過，由於細菌細胞可循環利用其自身的肽聚糖，且可分泌含有該被取代的胺基酸d a p之三肽，因此對於載質體細菌細胞沒有維持其質體之選擇性壓力。第三組方法包括使載質體基因編碼一種在真核細胞中具有官能和構造對合物（Counterparts )及/或能夠作用在真核細胞成份上之蛋白質。彼等基因的使用產生一種重大的安全性顧慮，係因爲這類基因所編碼的蛋白質具有在真核細胞股內作用之潛在性及因爲該基因本身可經由同系重組而整合到真核細胞基因組內部之潛在性之故。其例子包括編碼參與DNA複製重要功能的蛋白質（單股 D N A 結合蛋白質；Porter, R. D. et al. Bio Techno-loyy ( 1 9 9 0 ) 8 : 4 7 )或t R N A —相關性功能的蛋白質（纈胺酸t RNA合成酶；Nil s son , J. and Sko-gman, G. Bio Technoloyy (1986) 4 : 901— 9 0 3 )之基因。作爲編碼丙胺酸消旋酶（al r)的基因之標記物（ marker )的用法也會因爲該酵素可在真核細胞內作用而不適用於生產供D N A免疫化和基因治療所用之重組質體 DNA。丙胺酸消旋酶會催化L 一丙胺酸變成D —丙胺酸的轉化。由於真核細胞含有L -丙胺酸作爲其生化構成的天然成份，因此使用丙胺酸消旋酶可能干擾在真核細胞內參與L -丙胺酸生合成的生化學反應且可能導致非天然存在於真核細胞內的胺基酸（D -丙胺酸）之形成。最近，世界衛生組織（WHO)舉辦一個致力於本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -1 514667 A7 ___B7 五、發明説明（7 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) DNA免疫化和基因治療問題的會議（核酸疫苗，WHO ，曰內瓦，如在 Cichutek, K. Vaccine( 1 9 9 4 ) 12:1520; Robertson, J. S. Vaccine ( 1 9 9 4 )1 2 : 1 5 2 6 ; Smith, H. Vaccine (1994) 1 2 : 1 5 1 5之中所報導者）。在這次DNA免疫化和基因治療領域中的專家，以及來自權威機構的專家所舉行的會議中，有許多事項被宣稱爲必須解決的問題以爲這些技術製造臨床可用產物之用途舖路。其中包括重組質體的構造和基因安定性，重組質體在宿主染色體內的潛在整合性，以及標記基因（如抗生素抗拒性基因）對於所欲承載質體細菌細胞的選擇和繁殖之用途等。因此，爲了將外來DNA導到真核細胞內的目的而言，例如用於DNA免疫化和基因治療者，有需要提出一種系統，其可用來使經遺傳工程處理過的細菌細胞能夠生產含質體的外來基因而不必用到本身可整合到真核細胞基因組內的遺傳物質或其終端產物可在真核細胞內作用或可作用在任何真核細胞成份上之遺傳物質。經濟部中央標準局負工消費合作社印製此外，可在細菌體內穩定且高產率地選殖之改良方法也有助於所欲DNA大量生產之簡化。發明揭示本發明提出用於所欲DNA大量生產之重組系統，且特別是用於可以安定地導到真核細胞內的DNA者。本發明的系統比先前技藝具有較優的效率和安全性。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 514667 A7 __B7 五、發明説明（8 ) 依此，在一部份中，本發明係有關經設計用來穩定，高水平地生產重組質體之培養系統及其成份。於這些培養系統中，係使用細菌細胞，其中係將細菌細胞染色體不可逆地改質以促成產生對該細菌細胞具有毒性之物質。該細菌細胞係經改質成含有重組質體，其中該重組質體包含可促成產生可中和該第一物質所具毒性的第二物質之遺傳物質，若非如此，該第一種物質在細胞培養系統條件下會對細胞產生毒性。本發明也有關該細胞培養系統所用的細菌細胞和質體，及有關使用這些物質生產高水平所欲D NA 之方法。此系統中所用的質體可更包括一外來DNA，其係操作地聯結到只在真核細胞內有作用之控制序列，由於該外來D N A係在真核細胞內表現而不會在原核細胞內表現。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於第二部份中，本發明係有關用以穩定地，高水平地生產重組質體的細胞培養系統，其中在彼等培養系統中的細菌所含細菌細胞染色體係經不可逆地改質以使該細胞不能產生必需代謝物且不能夠從培養基內吸取該代謝物。此系統所用的重組質體爲包含著可恢復合成該代謝物的能力或從培養基吸取該代謝物的能力或兩者的遺傳物質之質體。本發明此部份也包括作爲細胞培養系統所含成份的細菌細胞和質體以及使用該系統產生大量DNA之方法。該質體也可以經改質成含有外來DNA，其係經操作地聯結到只在真核細胞內有作用之控制序列，使得該外來D N A 可在真核細胞內，但不在原核細胞內表現。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -11 - 514667 Α7 Β7 五、發明説明（9 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於另一部份中，本發明提出一種用於穩定且高水平地生產供D N A免疫化和基因治療所用的重組質體之培養系統，其包括經遺傳工程處理過的細菌細胞和重組質體。於此系統中，細菌細胞染色體係經不可逆地變更過且該細菌細胞係在該細菌細胞的生存能力係依賴該重組質體的條件下繁殖的。該重組質體包含著對該染色體變更呈官能地互補之遺傳物質，但該遺傳物質在真核細胞內不具官能或構造對等物且不能夠產生會作用在任何真核細胞成份上之任何蛋白質。該互補性遺傳物質所編碼的蛋白質，或其任何產物也不能夠被該細菌細胞所分泌或以對該細菌細胞具毒性的水平產生。該重組質體也經調配成包含操作上聯結到只在真核細胞內有功能的控制序列上之外來D N A以促成該外來D N A只在真核細胞內而不在原核細胞內表現。本發明也有關在該細胞培養系統內所用的細菌細胞和高複本數質體，以及有關使用此系統以穩定地製備供真核生物服用的外來DNA之方法。經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製於另一部份中，本發明係有關提供所欲外來D N A給真核細胞或真核生物體之方法，其包括用依本發明方法所製成的DNA接觸該細胞或該生物體服用，或用含有該所欲D NA的細菌細胞給該該生物體服用。圖式之簡略說明圖1顯示出重組質體P CB 2 3 7之構造。圖2顯示出在染色體g a j E和g a j? T基因中具有本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -- 514667 .經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（l〇 ) 缺失（deletion )的經遺傳工程處理細菌株（C B 1 〇 1大腸桿菌）之構造。圖3以圖式說明mu r F基因的選殖。圖4示出重組質體P CB 2 4 3的構造。圖5顯示出在染色體mu r F基因中有缺失的經遺傳工程處理之細菌株（CB 1 0 3 1大腸桿菌）所具構造。圖6爲含有mu r F基因的質體所具構造之圖式。圖7顯示出在4 2 °C下於mu r F —缺乏型菌株內生產pMO 1 0 6所得質體產率。圖8顯示pM〇 1 0 6在TKL 一 5 0細胞內的安定性。圖9顯示出含mu r F載體（Vector )的活體外（ in uitro )轉染效率。圖1 0爲用包含具有及不具有mu I· F基因的抗原之載體所得EL I SA力價（titer )之圖解表示。圖1 1顯示出從TKL 一 46所得溫度敏感性 m u r F基因之核苷酸序列。實施本發明之方式本發明提出可用來穩定地生產所欲D N A之培養系統。於某些情況中，該所欲DNA爲外來DNA，其在真核細胞內的表現係免疫化或基因治療所需者。此處$表現" (expression ) —詞包括單純的轉錄以及多肽的產生。如此，要在真核生物體內使用的外來DNA可以用於反意 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — 一 13 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) d

、1T 罇· 514667 A7 ___B7 五、發明説明（U) (antisense )治療以及基因治療等包括治療性蛋白質或標記物的產生者之中。當該外來DNA係要給真核生物服用時，可回收經擴大複製的D N A並以使用標準調配技術調配成的醫藥組合物形式給用。供給藥DNA所用的適當調配物包含各種賦形劑，例如脂質體，樹枝體（dendrimers )，水質體（ aquasomes )，共紺合劑，等張食鹽水或P B S。也可以將DNA回收並連接到反轉錄病毒載體內。除了 DNA 本身之外，含有該複製DN A的細菌細胞自身也可以給真核生物體服用。該等細胞係經選擇或處理成具有恰當特性使彼等所含DNA安置在例如巨噬細胞，的核內以促成外來D NA的表現。因此，給用的原核生物必須能夠放出溶酶體（lysosome )，解體，並使DNA進入該核。某些細胞宿主，例如志賀氏菌（Shigella )和利斯特氏菌（ Listeroa )天賦地即能夠促成這些結果。除了可表現的 DNA之外，僅含、裸DNA〃（ naked DNA)的疫苗也被成功地使用過。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 通常，DNA的給用，不管是其本身在醫藥組合物中之形式或包含在細菌細胞內之形式，係經由注射完成的；典型地爲靜脈內，肌肉內，皮內或皮下諸方式。也可以經由鼻內或經口，或經由粒子撞撃技術來給藥。無論如何，任何種有效的系統性給藥手段都可以採用。本發明的所有培養系統都依賴質體所含遺傳物質所具效應對細菌染色體中所含破壞性特徵之補充，而該質體本本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 14 一 514667 A7 B7 五、發明説明（12 ) 身係可安定地在細菌培養物中複製者。於一實施例中’該細菌染色體可產生對細菌細胞呈毒性之物質而該物質可被質體上之遺傳物質所產生的物質所抵銷。於第二實施例中，係將細菌染色體改質以使細胞能夠產生必需代謝物且能夠從培養物中吸取該代謝物，而重組質體則保有一或兩項此種能力。於這兩種情況中的任一者之中，可在質體內加入要擴大的另一種所欲DNA序列；此外，該所欲DNA 可經操作地聯結到控制序列以唯一地在真核細胞內表現。於第三種作法中，特別是爲了生產經操作地聯結到促成唯一地在真核細胞內表現的控制序列上之外來DN A，本發明使用其天然染色體基因組經不可逆地改變過之遺傳工程處理過的細菌細胞。該改變可包括將一或多種染色體基因改質，該等基因單獨地或組合地對於細胞在細菌細胞繁殖條件下的生存能力係必需者，或可包括插入一或多種對於細菌細胞在彼等條件下的生存能力有害之外來基因。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 然後經由包涵入重組質體，較佳者爲高複本數重組質體（以相當高複本數，自5 0至數百質體細菌細胞發生之類型者），以進一步改質細菌細胞。該重組質體係經構造成包涵可補足上述染色體變更的遺傳物質者。將該重組質體導到細菌細胞內可恢復細菌細胞的生存能力並確使只有載著該重組質體的細菌細胞才能存活。若該質體係用來產生只能在真核細胞內對外來所欲 D NA操作之表現系統時，該補充性遺傳物質必須關聯到一或多種在要用質體D N A處理的真核細胞內沒有官能或本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' -15 - 514667 A7 B7 五、發明説明（13 ) 構造同等物之基因。該補充性遺傳物質所編碼的多肽（或所產生的mRNA)必須不能夠對該要用質體DNA處理的真核細胞所含任何細胞成份有作用者。再者，因該補充性遺傳物質的存在所產生的任何因子或物質必須不能夠以對該經遺傳工程處理的細菌細胞具毒性之水平被分泌出，或產生出。因此，該補充性遺傳物質係經由施加只讓載有質體的細菌細胞存活之選擇性壓力來確保經遺傳工程處理過的細菌細胞之構造和遺傳穩定性。如上所述者，該質體最好是，但不一定要爲，高複本數質體。經由將一或多種外來基因選殖在相同的重組質體上，即可用經遺傳工程處理過的細菌細胞來產生大量的含有該外來基因的質體DNA以供DNA免疫化和基因治療，包括反意治療所用。該外來基因最好是不能夠在該經遺傳工程處理過的細菌細胞內表現者以避免不必要的代謝負荷或細胞毒性。此點可以經由將每一外來基因操作地聯結到只在真核細胞內有機能的啓動基因（promotor )而完成。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 依選殖在重組質體上的外來基因而定，該質體DNA 可用於DNA免疫化及/或基因治療之中。該質體DNA 可用於活體內（in vivo )治療，將一或多種所欲外來基因輸送給真核生物宿主。例如，該外來基因可爲編碼著對於被治療的哺乳動物之健康或存活爲必需者的多肽之哺乳動物基因。或者，該外來基因可爲編碼要在被治療的動物體內對抗以誘發免疫性所需的多肽之病毒基因。另外，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ 一 16 - 514667 A7 ____B7 __ 五、發明説明（14 ) 該重組質體所含的表現系統可產生反意mRNA ( anti-sense mRNA )供治療所用。其他例子皆爲諳於此技者所明知者。至此，本發明要參考其各種較佳實施例進一步說明。不過，本發明不侷限於這些實施例，且諳於此技者都容易地了解在具有本發明特徵的說明所含範圍之內的其他實施例。一實施例係關聯於一種製造細菌細胞壁所需的胺基酸添加性酵素。肽聚糖爲細菌細胞獨具的細胞壁構造。因此，編碼著負責肽聚糖層的生合成或組合的酵素之某些基因即爲要用爲供D N A免疫化和基因治療所用重組質體中的標記基因之優良候選者。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 肽聚糖層包括幾條相鄰的鏈。每一條鏈包含交錯的N 一乙醯基胞壁酸（NAM)和N -乙醯基葡萄糖胺（NA G )殘基單位。每一鏈上的某些N A Μ殘基係接到一四肽上，該四肽的組成會依該細菌爲革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌而稍微變異。相鄰的肽聚糖鏈係經由將一個四肽的第三胺基酸，二胺基庚二酸（dap)，鍵結到相鄰鏈上的一個四肽所含第四胺基酸，D -丙胺酸，之肽鍵而鍵聯在一起的。胺基酸，D -丙胺酸，爲所有細菌所含肽聚糖的一種獨特成分。此胺基酸係從L -丙胺酸經由稱爲丙胺酸消旋酶（a 1 r )的酵素之作用而合成的。此種後述肽鏈聯的形成對於細菌細胞的生存能力具有關鍵性，因爲若沒本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -17 - 514667 A7 __B7 五、發明説明（15 ) 有此鍵聯時，細菌細胞在常用的細菌生長培養基內都會溶解之故。四肽形成需要兩不同基因組的作用，亦即編碼四肽所含個別胺基酸生合成所需酵素者（亦即，L -丙胺酸，D —榖胺酸，d a p和D -丙胺酸生合成所需的酵素）及編碼將這些胺基酸依序加成和彼此連接形成四肽所需的酵素者。後述諸酵素稱爲胺基酸加成酵素。一般而言，該四肽依N — C方向的順序爲L 一丙胺酸/D —穀胺酸/二胺基庚二酸（d a p ) /D —丙胺酸。胺基酸加成酵素系列包括將胺基酸L -丙胺酸加成到多醣鏈的L - A p a加成酵素；將胺基酸D-穀胺酸加成到多醣-鍵聯L-丙胺酸的酵素（mur D );將胺基酸dap加成的L 一丙胺酸 /D -穀胺酸二肽的酵素（mu r E )，及將D —丙胺酸加成到L 一丙胺酸/D -榖胺酸/d a p三肽的酵素（ mur F ) 〇經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 因此，在本發明一實施例中，一種製造適用於DNA 免疫化和基因治療中的質體D N A之系統可以經由遺傳工程處理過的細菌細胞使編碼一種胺基酸加成酵素的染色體基因（如mu r F基因）不能作用而構成。該經遺傳工程處理過的細菌細胞所具生存能力則經由包涵入其上選殖著官能性m u r F基因的重組質體而予以確保。溫度敏感性細菌細胞係已知在編碼一種胺基酸加成酵素（如mu r F)的基因中含有突變者。這些細胞雖然可合成四肽的個別胺基酸成份，但卻不能在不容許的溫度下本矣氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ' ' -18 - 514667 A7 B7 五、發明説明（16 ) 生長。這些突變株在不容許溫度下不能生存的現象係因爲其在這種溫度下不能組合成完整且具有功能性的四肽之故。因此，本發明細胞培養物中所用的其他適當細菌宿主細胞要包括彼等既有的在不容許溫度下培養成之菌種。在含有互補性重組質體的遺傳工程處理細菌細胞所構成的所得系統中使用m u r F基因之舉具有幾項優點。第一，mu r F酵素爲一種細胞內的不可擴散性蛋白質，且不會產生具有毒性或會被分泌出之產物。如此可以避免掉因前文所述互餵效應所致載有質體的細菌細胞之數目的減低。第二，該m u r F基因係細菌細胞所獨具者且在真菌細胞內沒有機能上或構造上的對等物，如下文針對人類細胞所特地證實者。第三，該m u r F基因在真核細胞內沒有受質。因此，即使在用質體DNA處理過的真核細菌內表現mu r F基因也不會有mu r F酵素活性的風險性。這些優點導致在工業醱酵條件下的有效重組質體安定化和生產。再者，以mu r F爲基的系統對於在DNA免疫化和基因治療中的用途具有安全性。經濟部中央標準局員工消費合作社印製上文討論過的四種胺基酸加成酵素中的任何一種都可用爲本發明所用互補系統的基礎。例如，可以變更細菌基因組以刪除編碼L -丙胺酸一加成酵素的基因而將編碼此酵素的基因安置在質體上；或將染色體改質使其不能合成 mu rD，mu r E或mu r F而使質體獲得產生對應的酵素之能力。雖然這些胺基酸加成酵素的任何一種都可選用，不過一 19 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 514667 A7 B7 五、發明説明（17 ) 仍然有一種導致mu r F>mu r E>mu rD>L — A j? a -加成酵素的優先選擇層系。這是一種以細菌分裂時發生細胞壁降解的方式爲根據的效率基考慮。降解不可避免地會從四肽的C 一端開始發生且可能不完全。因此，子細胞對mu I· F成份的需求通常比其對mur E的需求更爲嚴重，後者轉而比對m u r D或L——丙胺酸加成酵素的需求更爲嚴重。第二實施例有賴於促使編碼著負責合成天然地存在於工業配置常用的細菌培養基之中的胺基酸之酵素的染色體基因成爲無官能性。一般而言，這種染色體變更對於重組質體安定性的增進或質體D N A的高水平生產都不是一種實用的方法。不過，在摻入附加的安全性預防措施，例如下文例示者之後，此種作法即可用於工業規模的穩定質體 D N A生產之中。例如，將編碼著對於胺基酸離胺酸的合成爲必需的酯素之染色體基因（命名爲又y s A)變成不具機能性。此外也將編碼著負責從環境或培養基中吸取該胺基酸的透酶蛋白質之第二種染色體基因（命名爲P y S P)變成不具機能性。這種經遺傳工程處理過的細菌細胞本身不再能獨立存活。在用載著32 y S A或又y s P機能性基因或其同等基因的重組質體轉形過之後，彼等即可存活下來。如此，對於缺乏離胺酸吸取（因無機能染色體P y s P基因所致）和離胺酸生合成（因無機能性染色體i y s A基因所致）的經遺傳工程處理細菌細胞，在用載著5 y s A機能 l紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ~ ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 今訂 -20 - 514667 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（18 ) 性基因或同等基因的重組質體予以轉形之後即得一有效的系統以安定且高水平地生產供D N A免疫化和基因治療所用之質體D N A。在此例中爲質體所載著的互補基因爲ί y s A基因，係因已知艾y s A基因在真核細胞內沒有構造上或機能上之同等物之故。再者，被P y s A基因所編碼的P y s A 酵素在真核細胞內沒有受質，因此，即使該酵素在真核細胞內表現出來也沒有作用。又因爲離胺酸對於所有的活微生物，包括革蘭氏陽性和革蘭化陰性細菌兩者，皆爲必需胺基酸，所以此系統提供一種實用且多樣化的系統以在任何細菌細胞內穩定且高水平地生產質體DNA。於第三實施例中，係經由後分離殺傷機構（postse-gregational Killing mechanism )維持選擇性壓力。自然發生的大腸桿菌質體R1和F含有適用於此種作法的基因座位。對於R1質體，此座位爲parB ( Gerdes, K. etal· PNAS(198 6)83:3116 -3 12 0; Rasmussen, P. B. et a 1. Mol Gen Genetics (1987) 209 ; 122 - 128)。於 F 質體的例子中，此座位爲 F ( Loh, S. M. et AL·, Gene( 1988) 66 : 259 - 268)。這些座位可利用後分離殺傷機構促成有效的重組質體安定化。

p a r B和F Pm兩座位都分別含有兩個小基因，在 parB情況中稱爲hok (宿主殺傷性）和sok (宿主殺傷壓制者）基因，而在F質體的情況中稱爲f j?mA 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-tv -21 - 514667 A7 B7 五、發明説明（19 ) (宿主殺傷性）和fj^mB (宿主殺傷壓制者）。因此， h 〇 k和f j?mA兩基因在構造和功能上相類似，而該 h 〇 k和f pmB兩基因在構造和功能上相類似。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) h 〇 k和f $mA基因的產物爲強力宿主殺傷因子的小親水性蛋白質（5 2個胺基酸）。h 〇 k基因的表現係由s ok基因轉錄來的小（約1〇〇鹼對）RNA分子所調節且其係作用爲對h 〇 k基因的mRNA呈互補的反意 RNA。類似地，fpmA基因的表現係受fPmB基因轉錄所得約1 0 0 -鹼對RNA分子所調節且其作用爲對 f芡mA基因的mRNA呈互補之反意RNA。h 〇 k和 f i?mA的mRNA係高度安定者，而s ok和f 的RNA則會迅速降解掉。也就是這兩種RNA所具的相異安定性於各情況中導致細菌細胞殺傷機構。當含有載著 P a r B座位的質體之細菌細胞失去彼種質體時，h 〇 k mRNA的延續存在會導致h o k蛋白質的合成，因而確使新形成的無質體細菌細胞被迅速且選擇性地殺死。類似地，當含有載著F j? m座位的質體之細菌細胞失去該質體時，f j?mA mRNA的延績存在導致f pmA蛋白質的合成。因而確使新形成的無質體細菌細胞被迅速且選擇性地殺死。 h 〇 k與s 〇 k兩基因或f j^mA和f j?mB兩基因的組合效應可以有利地用來構成用以生產質體D N A以用於D N A免疫化和基因治療中之系統。這些系統的使用可以因爲殺死真核細胞的潛在性而受阻，例如在DNA免疫本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — -22 - 514667 A7 ____ _B7 五、發明説明（20 ) 化或基因治療中用含有h 〇 k/s 〇 k或f j^mA/f芡 mB組合的質體DNA注射哺乳動物宿主之情況。因此，在重組質體內只能包含s ok基因（1 〇〇bp)或f义 mB基因（lOObp)，而在細菌細胞染色體內則整合著hok基因或f$mA基因。對於以hok/s ok或f j2mB組合爲基礎的質體生產系統，係將細菌株予以遺傳工程處理，其中係將編碼h 〇 k或f pmA蛋白質的基因插置於細菌染色體的非必需區（例如j? a c Z基因）內。然後用重組質體轉形該遺傳工程處理過的細菌細胞其中唯一的標記者爲對應的s 〇 k或f j?mB基因。只要該重組質體保留在細菌細胞內，則該重組質體上面的s 〇 k或f i?mB基因即可用來調節h 〇 k或f j?mA基因的表現使該細菌細胞存活，而當載著s 〇 k或f imB基因的重組質體失去時，會因爲染色體h 〇 k或f j?mA基因所產生的殺傷因子使細菌細胞死亡。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此系統對於質體D N A的生產提供下列諸特定優點。第一，該系統不限用於某特殊細菌株。第二，由於在重組質體內用到的是只有1 0 Ob p編碼s 〇 k或f j?mB基因的DNA，因此可以構成遠較小且更緊密的質體。此點本身即可導致較高的質體產率並提供在重組質體上選殖多於一種的外來基因之能力。諳於此技者可了解本發明的其他經遺傳工程處理細菌株和重組質體（其用爲外來DNA的載體）之組合，其中本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ' " -23 - 514667 A7 B7 五、發明説明（21 ) 該重組質體包含著對經變更（亦即，經由改質，刪除，或抑活化而加入或促成無機能性）過的染色體D N A呈互補之D N A且其因而可用爲重組質體存在或不存在之標記，以及將該重組質體保持在該經遺傳工程處理過的細菌細胞內之選擇性壓力。本發明要在下面諸實施例中更詳細地闡述。這些實施例係爲闡明目的而提出，不可視爲係用以限制本發明者。實施例1 經染色體變更過的宿主C B 1 4 2之構成經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 肽聚糖層爲細菌細胞在一般情況下具有生存能力所絕對需要者，因其可保護脆弱的細菌質膜對抗滲壓震動之故。不過，在某些情況下，於肽聚糖合成中具有缺陷的細菌細胞仍可在某些類別的培養基，例如補充氯化鈉或蔗糖者之中存活。這些細菌細胞在這些類別的培養基內具有存活能力之理由可歸因於這些補充化合物作爲滲壓安定劑之作用或歸因於彼等所具誘導產生作爲滲壓安定劑的柯拉酸（ Col an ic acid )之能力。因此，在一較佳實施例中將細菌細胞遺傳工程處理成不論細菌細胞生長所用培養基類別爲可都絕對依賴完整肽聚糖層之存在。在一實施例中，除了導入突變或刪除導致有缺陷的肽聚糖組合之外，還將這些細菌細胞合成柯拉酸的能力完全破壞。柯拉酸爲一種包含葡萄糖，半乳糖，岩藻糖，和葡萄糖醛酸的聚合物。由於半乳糖爲柯拉酸成份之一，因此廢本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 24 - 514667 Μ Β7 五、發明説明（22 ) 除細菌細胞產生柯拉酸的能力之一種方法爲抑制細菌細胞合成和利用半乳糖之能力。於此實施例中，係經由在參與半乳糖利用中的g a $ Ε和g a Τ染色體基因內導入不可逆的刪除。然後對所得細菌細胞實施在m u r F染色體基因中的刪除而產生一菌株，其生存能力係依賴載有機能性mu r F基因的重組質體之補充，如下所述者：首先構成在g a P E和g a j? T兩基因內具有缺失的 TM1 〇 5大腸桿菌菌株。要選殖g a P E和g a PT基因時，係根據已知的g a Ε和g a j? Τ基因核苷酸序列合成兩個少核苷酸引導者（primer* )(上游和下游兩者 )。爲促成選殖，在各引導者的末端處理出一個Xbal 部位。上游引導者（命名爲g a 3 )係對應於 g a PE基因的5’端而具有下示核苷酸序列： 5'gctctagaggctaaattcttgtgtaaacga3. 下游引導者（命名爲g a j? — 4係對應於g a j? T基因的3’端且具有下示核苷酸序列：經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5fgctctagatctgccagcatttcataaccaa3·. 將引導者ga$—3和ga$-4(各1〇〇微微莫耳（pmo 1 e ))與2微升培養整個晚上的J Μ 1 〇 5細囷細胞纟η養液組合。於該混合物中加入4微升的5 ITlM去氧核苷（dMTP)溶液，1微升的lOOmM MgS04 ，5微升的1 OxVent反應緩衝液和1微升本7氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ~顯~ -25 - 514667 A7 B7 五、發明説明（23 ) 的Vent DNA聚合酶（購自NEB Biolab )。使用下述循環程序進行3 0個循環以擴大該反應混合物：熔化 94嫁C 一分鐘，冷卻配對：55絲C 一分鐘，及伸展： 7 2遂（：二分鐘。於擴大之後，用1 %瓊脂糖進行電泳分析。在將聚合酶鏈反應（P CR)反應混合物中所含 D N A以溴化乙錠染色後可看到具有預期大小的單一帶（約2仟鹼對；對應於完整的ga$E和gaj?T基因）。用GeneClean藥劑組（得自Bio(an)從瓊脂糖切下並純化上述DNA帶。如圖1中所闡示者，用T4聚核苷酸激酶（Pharmacia )處理經純化的DNA片段並接合到PTZ1 8質體的Hi nCn部位。將含有gaj?E和 g a j? T基因的pTZ 1 8質體命名爲pCB 2 3 3。如圖1進一步闡示者在g a j? E和g a 基因內構經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 成內部缺失。將pTZ 1 8質體用H i n dm酵素切割，用Klenow酵素處理，及自接合產生其中H i ndm部位不再存在之質體p C B 2 3 4。將質體p C B 2 3 3用 EcoRI和Ps t I酵素切割以復得含有整個gaj^E 和g a 5T基因的DNA片段。另外也用E c oR I和 Pst I酵素切割PCB234並接合到該前述片段。接合處理導致命名爲p CB 2 3 5因質體之分離。用 Hi ndm和Nco I酵素切割質體PCB235以刪除在g a j? E和g a j? T序列中所含核苷酸序列的內部部份，用Klenow酵素處理，並使其自接合而產生質體 PCB236。用EcoRI和Ps t I酵素切割質體本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 26 - 514667 A7 __B7 五、發明説明（24 ) PCB236以重得縮短的gaPE和gaj^T基因。將該包含經縮短的g a j? E和g a j? T基因之DNA片段用 T 4 DNA聚合酶處理。同時用Xb a I酵素切割命名爲PCVD 4 4 2的自殺載體質體（J. B. Kaper，賓士凡尼亞大學）後，用Klenow酵素處理。將包含經縮短的 g a Ρ E和g a 基因之DNA片段接合到上述 p CVD4 4 2並轉形到大腸桿菌SY3 2 7內以產生質體PCB237。接著將PCB237轉形到大腸桿菌 SM1 〇內並將含有p CB 2 3 7的後述細菌細胞選擇出以供下述後續所用。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 依圖2所示將缺失導到J Ml 0 5大腸桿菌內。使用載有質體P CB 2 3 7的SM1 0細菌細胞依Donnenbe-rg, Μ.和 Kaper, J. Infection and Immunity ( 1990) 59 : 4310-4317中所述拼合程序將不可逆地無機能性（亦即，具有內部缺失）g a j? E和 g a 基因轉移到大腸桿菌JM1 〇 5內。經由 J Ml 〇 5染色體DNA的P CR分析確定該不可逆地無機能性g a j? E和g a 基因已摻加在JM1 〇 5細菌細胞的染色體內及該後述細菌細胞所含全長度野生型 g a j? Ε和g a j? Τ基因已被該不可逆地無機能性 gaj^E和ga5T基因所置換。要在m u r F座位產生一缺失時，首先用聚合酶鏈反應（P CR)分離出來自JM1 〇 5大腸桿菌的染色體 mu r F基因。根據已知的mu r F基因序列合成兩個少本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21GX297公釐) ~~ ' - 27 - 514667 A7 _____B7 五、發明説明（25 ) 核苷酸引導者。這兩引導者分別命名爲m u r F 1和 mu r F 2且其核苷酸序列如下所述：上游引導者（murFl): 5’cgagcactgcgagagatgattagcgtaacccttagccaactt3· 及下游引導者（murF2): 5’cagcgcgtgcagcaggctgacagtggcgcga3·. mu r F基因顯然係在mu r FE啓動基因的控制下被轉錄，因此上述P CR引導者係經設計成使得mu r F 密碼序列架構內融合（inframe fusion )到m u r E啓動基因。爲此目的，使用命名爲mu r E 1和mu r E 2 的P C R引導者從J Μ 1 0 5大腸桿菌分離出包含此啓動基因元素的m u r E基因。這些引導者的核苷酸序列如下所示上游引導者（murEl) : 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 5'gccggatccgcgccggtctttggtgcca3', 及下游引導者（murE2) 5*aagggatccgctaatcatgcaatcacc3·. 如圖3所示者，在P CR擴大之後，將mu r E基因選殖到質體p BR3 2 2內產生命名爲p CB 2 3 8的質一 28 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 514667 A7 B7 五、發明説明（26 ) 體。使用引導者mu rFl和mu rF2從JM105細菌細胞擴大mu r F基因。用N r u I酵素消化質體 p CB 2 3 8以脫除mu r E基因密碼序列，留下 mu r E啓動基因序列。用N r u I酵素消化質體 p CB 2 3 8後接合到擴大後的mu r F基因並將所得質體命名爲PCB239。用適當的酵素消化質體p C B 2 3 9以截取包含融合到mu r F基因的mu r E啓動基因之DNA片段，然後將該片段選殖到質體PACYC 1 8 4而產生質體 p C B 2 4 0 ° 爲了構成在其mu r F基因內具有不可逆變更（亦即，缺失）的大腸桿菌菌株，乃構成一質體於其中選殖入經刪除處理的πι u r F基因及從上游和下游側翼序列衍生所得D N A序列。爲此目的，根據m u r E基因的已知序列設計一個少核苷酸引導者（mu r F基因的上游）且根據已知的0 r f Y基因序列設計第二個少核苷酸引導者（ murF基因的下游）。該上游引導者係命名爲 mu r E 1且具有下示核苷酸順序： 5lgccggatccgcgccggtctttggtgcca3,. 該下游引導者係命名爲〇 r f Y 一 1且具有下示核苷酸順序： 5 丨 taacgccagcgaacctacatc3 ’. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' 一 29 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1.τ f 514667 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明 (27 > 1 ! 於 P C R 反應中使用引導者 m U r Ε 1 和 0 r f Y 一 1 1 0 r f Y — 1 以 XtAt 擴大具有衍生自 m U r Ε 和 0 r f Y 基因 1 1 的側翼序列之 m U r F 基因〇如圖 4 中所示者將經擴大 1 | 的 D N A 片段選殖到質體 P B R 3 2 2 內以產生質體請先閱 1 I P C B 2 4 1 〇用恰當酵素消化質體 πϋ P C Β 2 4 1 以去除讀背面 1 I 大部份的 m U r F 基因而只留下在端側接著衍生白 m U 1 意 1 I r E 基因的序列且於另一端側接著衍生南 0 r f Y 基因的事項 1 I 序列之小部份 m U r F 基因〇於消化之後將質體 WsL. 白接合再填寫 ά 而產生質體 P C B 2 4 2 〇用恰當的酵素消化質體 /十、頁 1 I P C B 2 4 2 而從其中取得包含著衍生白 m U r F 和 1 I 〇 r f Y 基因的 m U r E 部份的序列之 D N A 片段〇然後 1 1 I 將載有後述諸序列的 D N A 片段接合到白殺載體 1 訂 1 P C V D 4 4 2 並轉形成 S Y 3 2 7 大腸桿菌細胞內〇使 1 1 用後述細菌細胞來製備含有該等側翼序列的質體 1 1 P C V D 4 4 2 並將所得質體 \isL 命名爲 P C B 2 4 3 〇然後 1 1 將 P C B 2 4 3 轉形到大腸桿菌 S Μ 1 0 細胞內以產生適 0 1 I 合用來將 m U r F 缺失轉移到大腸桿菌 C B 1 0 1 內之細菌細胞種群〇 1 1 I 如 I 圖 5 中所示者使用載著質體 luz* P C B 2 4 3 的 Ί S Μ 1 0 細菌細胞將不可逆地 /rrtL 眺機能性 ( 亦即 > 具有內部 1 Ί 缺失 ) m U r F 基因經由上述拼合程序 ( Donnenberg 1 1 and Kaper 1 9 9 0 ) 轉移到經質體 P C Β 2 4 0 轉形過 1 I 的大腸桿菌 C B 1 0 1 內〇經由 C B 1 0 1 染色體 D N A 1 I 的 Ρ C R 分析確定該經不可逆地變更過的 m U r F 基因已 1 1 1 張紙本 Μ Λ—/ s N c 準標冢國國中用適

釐公 7 9 2 X 514667 A7 B7 五、發明説明（28 ) 摻合到C B 1 0 1細菌細胞的染色體內及後述細菌細胞的全長度野生型m u r F基因已被該經不可逆地變更過的 mu r F基因所置換。將該在mu r F基因內含有內部缺失的C B 1 0 1細菌株命名爲C B 1 〇 2。接著用質體P CB 2 3 9轉形細菌株CB1 0 2以取代質體PCB240。將載著質體PCB239的細菌株 CB102命名爲CB103。實施例2 另一 mu r F缺乏型細菌宿主TK 一 4 8的構成在mu r F基因內含有突變的某些溫度敏感性細菌細胞突變株，例如TKL 一 46，可在30 °C生長，但不能在4 2 °C不容許溫度下生長。這些突變株不能在不容許溫度下生長的特性係因爲mu r F基因內的突變使彼等不能組合成完整且具機能性的細胞壁四肽之故。這些突變株可在本發明細胞培養系統內用爲細菌宿主。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 依此，經由在這些溫度敏感性細菌細胞（如大腸桿菌 TKL 一 4 6或其衍生株）內包涵入含有在42 °C有機能的mu r F基因之重組質體即可構成生產適合用於DN A 免疫化和基因治療中的重組質體之系統。經由在4 2 °C生長該細菌細胞，使得只有載著該重組質體的細胞可以存活〇於此實施例中，製備一更佳的TKL 一 4 6衍生株作爲宿主。大腸桿菌菌株TKL — 46( Lugtenberget 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -31 一 514667 A7 ___B7 五、發明説明（29 ) al·， J. Bacteriology (1972) 110 : 35 — 40 )係得自 Coli Genetic Stock Center( C G S C )。先將TKL — 4 6細菌細胞在3 0°C下於含有棻啶酮酸的 L B培養基（L B broth )中生長以選擇出抗某啶酮酸菌株，命名爲TKL/一 47。經由與（棻啶酮酸一敏感性，recA—陰性）細菌菌株JC—10240拼合使 T K L 一 4 7細胞呈r e c A —陰性以消除該細胞進行同系重組之能力。如此，彼等的染色體就不會從導入的質體 DNA取得任何遺傳物質。將TKL 一 4 7細胞衍生所得 r e cA —陰性細胞命名爲TKL — 48。將TKL 一 4 8細菌細胞置於3 0°C下生長後用來製備感受性細菌細胞。用載著機能性m u r F基因的質體 P C B 2 3 9轉形該感受性TKL 一 4 8細菌細胞而產生命名爲TKL — 49的細菌株。然後將TKL — 49置於 4 2 °C下生長作爲重組質體維持和質體DNA生產的方法〇經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 有關以CH 1 〇 2或TKL — 4 8細菌細胞作爲宿主的取代方法，可經由將具有所需天然性質的細胞所含染色體內的m u r F基因改質而構成其他的改良形式。例如，某些大腸桿菌菌株缺乏某些酵素，如可降解質體D NA的核酸內切酶。若這些宿主的染色體可經變更以提供，例如，m u r F的溫度敏感性形式時，這些宿主即可提供較優的TKL一48替代物。使用mu r F 3和mu r F4作爲引導者以P CR擴本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐) -32 - 514667 A7 B7 五、發明説明（30 ) 大恰當的序列而得到來自TKL 一 4 6的溫度敏感性 m u r F基因： murF3 (上游引導者）： 5 ’gccggatcccgatcgcgtcacggtggcgcg3 ’ murF4(下游引導者）： 5 ’ gaagatctcagcgcgtgcagcaggctgacagtggcgcga3 ’ 將擴大後的核苷酸序列選殖到p U C 1 9的 B a mA I部位並用二去氧核苷酸法測定核苷酸序列。圖 1 1示出擴大後的基因所具完整核苷酸序列，且如圖1 1 所示者在位置8 6 2和9 9 0處不同於野生型基因。在8 6 2處用A取代G導致蘇胺酸而非丙胺酸；在位置9 9 0 處加入G A C密碼子導致在肽序列中加入天冬胺酸殘基。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 然後用溫度敏感形式取代野生型m u r F基因，典型地係以同系重組方式，變更具有適當特性的宿主菌株而得改良細菌宿主。如此，經改質成含有溫度敏感性m u r F基因而在 mu r F基因中具有不可逆的染色體突變使得該基因或被編碼的m u r F蛋白質在所用的培養條件下不具機能性之 CB 1 0 2或TKL 一 4 8或其他合意細菌皆可在所導入的質體具有能在所用培養條件下有機能性之情況中用爲適當的宿主。其生產水平可與在其中具有編碼氨苄青黴素的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -33 - 514667 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明 (31 ) 1 I 標記基因之質體 P B R 3 2 2 上所用外來 D N A 的生產水 1 1 平相比較〇 1 1 I 請 1 1 I 實施例 3 kj m 1 I 含讀 1 I 另 —* m U r F 質體的構成背面 I 使用實施例 1 中所述引導者 m U r E 1 和 m U r E 2 之注意 1 I 從大腸桿菌 J Μ 1 0 5 基因組 D Ν A 以 P C R 擴大染色事項 1 丨體 m U r Ε 基因並選殖在 Ρ U C 1 8 的 B a m Η I 部位中再填寫本 ά 〇將所得質體 P Μ 0 1 0 1 用 Ν r U I 切割去除掉大部份頁 N^〆 1 1 的 m U r F 基因但留下 m U r F 啓動基因和約 3 3 0 鹼 1 1 對的 m u r E 3 9 端〇將依實施例 1 中所述擴大所得 1 I m U r F 基因接合到 Ρ Μ 〇 1 0 1 的 N r U I 部位 > 並將訂 I 接合混合物轉形到大腸桿菌 J Μ 1 0 9 內〇鑑定兩種命名 1 1 I 爲 P Μ 0 1 0 2 和 P Μ 0 1 0 6 的質體 rtXZL > 其分別含有呈相 1 1 I 反取向的 m U r F 密碼序列〇 Ρ Μ 0 1 0 6 含有以正確取 1 1 向操作地聯結到 m U r Ε 啓動基因之 m U r F 基因且可表 # 現 m U r F 蛋白質 P Μ 0 1 0 2 含有錯誤取向的 1 I m U r F 基因而不能表現該基因〇 Μ 圖 6 概示出 1 I P Μ 0 1 0 2 和 P Μ 0 1 0 6 的構造〇 Ί I 含有 m U r F 基因的其他質體可依下述構成： 1 Ί I P Η W 2 0 3 可構造成用於活體外 ( in vi t r 〇 ) 檢 1 1 職轉染到真核細胞內的效率之系統 0 將得自 Clone tech 1 1 f 含有在可於哺乳動物細胞內操作的啓動基因之控制下的 1 1 β — 半乳糖甘酶基因之 Ρ C Μ V Β 用 E C 0 R I 切割以 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )·A4規格（210X297公釐） -34 — 514667 A7 B7 五、發明説明（32 )

Klenow酵素處理，並與含有mu r F基因，經 BamHI ，切割，Klenow酵素處理過的PMO06片段相接合。將所得質體用B s t Η I切割以脫除氨笮青黴素-抗拒性基因並再接合。將接合產物轉形到TK L - 4 8並用分離出且含有質體pHW2 0 3的菌落TKL 一 5 2於該質體的大規則生產。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 構成質體P CB 2 5 3以評估mu r F基因對於在真核細胞內的DNA免疫化是否有任何影響。得自K. Bra-un的宿主質體，pSLRSVGIV、mdl含有處於羅氏肉瘤病毒啓動基因控制下的得自牛疱疹病毒之編碼糖蛋白質IV (G 1 V)的基因；因此，此質體含有可在脊椎動物內產生免疫原之表現系統。將含有受m u r E啓動基因控制的mu r F基因，得自pMO 1 〇 6的 BamHI DNA片段接合到pSLRSVGlV、m d 1的M s c部位內並將接合混合物轉形到J M l 〇 9細胞（得自 New England Biolabs )內。將成功轉形體分離出的質體用B s t Η I消化以脫除氨苄青黴素抗拒基因後，予以再接合並再轉形到TKL - 4 8內而得到產物質體PCB253。使用命名爲TKL 一 51的 p CB 2 5 3菌落於該質體的大規模製備。於前面段落中，係經由將感受性細胞與質體DN Α混合並在冰上浸置3 0分鐘以使TKL 一 4 8被pMO 1 〇 2 ，pM〇l〇6 ，PCB 253 或 pHW203 轉形。然後將該等細胞置於4 2 °C熱震動9 0秒，接著在1毫升本紙張尺度適财關家縣（CNS ) A槪格（210X297公釐) " ~ -35 - 514667 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明 (33 ) 1 L B 培養液內置於 3 0 °C 下培育 2 小時〇之後在 L B / 1 1 0 1 % 胸腺嘧 B定培養板上且於 4 2 °c 下溫浸整個晚上進 1 1 行板式培養〇所得經轉形細胞系依下文所述命名： /、 1 I P Μ 〇 1 0 2 — T K L — 4 9 A 9 請閱 1 1 | P Μ 〇 1 0 6 — T K L — 5 0 > 讀背 1 I P C B 2 5 3 — T K L — 5 1 9 之注 1 意 1 I P Η W 2 0 3 — T K L — 5 2 〇事項 I 再填寫本 4 I 當然 T K L 一 4 9 A 細胞只在 3 0 °c 產生 m U r F 頁 '〆 1 1 基因產物且其可用爲對照樣以評估在作爲可選擇性標記 1 | 物的氣苄青黴素之存在中在 3 0 °C 下的質體產率〇對於其 1 I 餘細胞系可以在 4 2 °c 不添加氨笮青黴素之下評估質體 1 訂 I 產率 0 1 1 1 I 實施例 4 1 1 I 質體產率舞在 4 2 °C 下不添加氨苄青黴素之下生長細胞時使用 1 1 T K L — 5 0 5 1 和 5 2 細胞評估質 JHA 體產率 y 而以 1 T K L — 4 9 A 細胞作爲對照 0 挑取出得白 L B / 胸腺嘧 1 1 I 啶培養板的單一菌落並接種在 2 毫升的 T B / 胸腺嘧 D定培 1 I 養液中並在 4 2 °C 下培育 6 小時 ( 對於 T K L — 4 9 A 則 1 1 1 在 3 0 °C 於氣苄青黴素存在中進行 ) 〇然後將細胞接種在 1 1 1 0 毫升 T B / 胸腺嘧 B定培養液中再生長四小時後接 1 1 種在 2 5 0 毫升的 T B / 胸腺嘧 B定培養液中並續予生長 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -36 - 514667 A7 _ B7___ 五、發明説明（34 ) 1 2小時。依製造商所建議者，用Quiagen管柱從細胞萃取質體，並經由計算◦. D· 260和280而測定質體產率。經由在瓊脂糖凝膠上分析質體分樣測定質體的純度。另外也在14 一升NBS Microferm裝備內’於補充0· 01%胸腺嘧啶物的TB培養液中，在200rp m攪動速度，〇. 6VVM通氣流速（6升/分，5ps i g )和保持在7 · 2的P Η值諸條件下，以1 〇 -升培養一批料富氧醱酵方式測定質體產率。在用Qniagen管柱法從培養液分樣萃取質體D N A後測定質體產率。表1列出振盪瓶（3製備樣）或1 〇一升醱酵器內生長細胞所得產率。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -37 - 514667 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（

表 1 在振盪燒瓶和10-升醱酵器內生長細胞所得質體產率菌株/質體組合選擇壓力絕對質體產率 (毫克/升）a 振盪燒瓶醱酵器比質體產率（毫克/克乾重产 TKL- 49/ρΜ0102 30°C/氨苄青黴素 2· 67±0. 16 43.85 3.3 TKL- 50/ρΜ0106 42〇C /murF 6. 13±0·71 144 6.788 TKL- 51/pCB253 42〇C /murF 8. 61±0· 51 107 N/Dd TKL- 52/pHW203 42〇C /murF 6· 14±2·2 N/D N/D (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 514667 A7 -----___B7 五、發明説明（36 ) a·從製備質體DNA所用培養液體積（5，10，和 2 5毫升）的分樣外插所得振盪燒瓶和醱酵器之質體流率 b _用下面的方程式測定所得克乾重/升培養液（克/ 升）：克 / 升=0· 08 + 0. 63 ( 0. D. 660) c.產率爲pM〇l〇2和pM〇l〇6兩醱酵的平均值。P CB 2 5 3的產率係得自一次醱酵作業。 d .未測定。圖7示出對TKL 一 5 0菌株中所產的質體 Ρ Μ Ο 1 〇 6測定所得絕對質體產率和比質體產率。實施例5 質體安定件依下文所述在不同的用於質體維持之選擇壓力下進行 1 7 0代生長以評估質體ΡΜΟ 1 〇 6在TKL — 5 0菌株內的安定性。細胞係在Τ Β / 〇 . 1 %胸腺嘧啶培養液中於3 0°C或4 2 °C下生長。在相關溫度的不同代數之後採取樣品，稀釋並在TB/胸腺嘧啶培養板上培養並在 3 0°C下培育。然後在TB/胸腺嘧啶/氨苄青黴素培養板上且在3 0°C或4 2 °C培育以複製諸菌落。經由比較在有和無氨笮青黴素和在3 0°C或4 2 °C下生長所得菌落數目測定含質體細胞的百分比°經由對質體製備物進行小規本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2ίοX 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -.

、1T -39 - 514667 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7 五、發明説明（37 ) 模鹼解以進一步驗證質體的存在。在3 0°C下生長的細胞會漸漸地失去質體 PMO106，但在42°C下生長的細胞於170代生長後，仍保留在1 0 0%的細胞內，如圖8中所示者，經由限制分析確定質體pMO 1 0 6的完整性。另外也經由在氨笮青黴素存在中於3 0°C下生長以檢驗TKL 一 49A細胞；質體pMOl 02可在1 00% 細胞中保留1 2 0代。實施例6 活體外轉染的效率於此檢定中使用上文所述質體P CMVB和 PHW203。取2微克的各質體分別與不同量的lipo-fectamine( Gibco/BRL )並根據製造商的建議轉染到小鼠纖維母細胞L — 9 2 9內。以X-g a $比色分析經由計數表現出θ -半乳糖苷酶的細胞數相對於每洞必含總細胞數而測定轉染率。如圖9所示者兩種質體測定類似的轉染效率。實施例7 m u r F某因對免疫化的影響用各爲100微克的質體PCB235，PSLRS VGlV、mdl (上文所述者）或無載體者經由肌肉內注射將數組1 0隻一組的小鼠免疫化二次（相隔兩星期） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

X 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 514667 A7 B7 五、發明説明（38 ) 。在第二次注射的一和三星期後，將小鼠放血並用 E L 1 SA檢定分析其血清中是否含有對G 1 V糖蛋白具特定免疫反應性的抗體。如圖1 0中所示者，在兩種情況中都測得相似的抗體力價。實施例8 相對於人類序列的m u r F同系性之缺乏情況對核苷酸和胺基酸序列數據庫的調查顯示與m u r F 基因/蛋白質相關聯的序列相對於任何已知的人類基因/ 蛋白質序列不具同系性。爲確定這種同系性缺乏情況，將購自 Promega Corporation的人類基因組D N A用 E c 〇 R I和B a m Η I消化並添加經B a m Η I切割過的ΡΜΟ106。將該基因組DNA與得自ρΜΟ106 含mu r F基因的B amH I片段，mu r F基因密碼序列本身，和經E c 〇 R I線型化的質體PM0 10 6 —起在0 . 7 %瓊脂糖凝膠中電泳分離。在用毛細管轉移到耐綸膜之後，根據製造商的說明以紫外光交聯固定DNA s 。將該等膜置於6XSSC，0· 5%十二烷硫酸鈉中，在5 0°C下預雜合8小時後，與32PdCTP標示全長度m u r F D N A探測核酸（probe )雜合1 2小時。將諸著斑（blot)置於2xSSC，〇. 5%SDS中在22°C下洗兩次，接著在ixsSC，〇. 5 % S D S 中於5 0°C下洗3 0分鐘兩次。在乾燥並暴光到X -射線底片1 6小時- 2星期之後，皆未測得與人類基因組本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -41 - 514667 A7 B7五、發明説明（39 )DNA的雜合訊號。

In- ·ϋ m 1 1_ϋ— Bn m .1_11 1 am— ι_ιϋ mu «ll_— TJ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -42 -

Claims

六、申請專利範圍修正; 龙補充^ 附件（A):第85115998號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國91年3月修正 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1. 一種製備用於穩定且高水平地產製重組質體之系統的方法，該方法包含導入重組質體至細菌細胞中，該細菌細胞係經不可逆地改造以達成產製第一種對該細胞具毒性之物質，其中該重組質體包括達成產製在該培養系統之培養條件下可有效中和該第一種物質所具之毒性的第二種物質之遺傳物質，其中該第一種物質爲h 〇 k基因之產物且該第二種物質爲s 〇 k基因之產物或其中該第一種物質爲f i mA基因之產物且該第二種物質爲fi?mB基因之產物，且經濟部智慧財產局員工消費合作社印製其中該質體缺少編碼該第一種物質之官能性遺傳物質，且該質體可選擇地進一步包括操作性連結至真核細胞控制序列之外來D N A，使得該外來D N A不於該細菌細胞中表現。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該重組質體進一步包括操作性連結至真核細胞控制序列之外來D N A ，使得該外來D N A不於該細菌細胞中表現。 3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該細胞之存活係取決於該細胞中存有該質體。 ^紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一一 1 一 514667 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 4.如申請專利範圍第1或2項之方法，其進一步包含回收該細菌細胞。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 .如申請專利範圍第4項之方法，其進一步包含培養該細胞（於其中該細胞之存活係取決於該細胞中存有該質體之條件下培養），及自該細胞回收質體DNA。 6. —種製備用於穩定且高水平地產製重組質體之系統的方法，該方法包含導入重組質體至細菌細胞中，該細菌細胞係經不可逆地改造以使該細胞不能產製一種必需代謝物且亦不能启培養基中吸收該代謝物，其中該必需代謝物爲離胺酸，且其中達成該不能合成離胺酸係經由y s A基因內之突變且達成該不能自培養基中吸收離胺酸係經由破壞又y s P基因，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製其中該重組質體包括恢復合成該代謝物之能力或自培養基中吸收該代謝物的能力或該兩者之遺傳物質，且該遺傳物質可選擇地進一步包括操作性連結至真核細胞控制序列之外來D N A，使得該外來D N A不於該細菌細胞中表現，其中該遺傳物質於動物細胞中不具有官能性或結構性對等物，且其中該遺傳物質所表現之任一蛋白質係不能作用於任何動物細胞成份，且其中該遺傳物質所表現之任一蛋白質或因存在該蛋白質所產生之產物不被該細菌細胞所分泌或本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 2 - 514667 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍對該細菌細胞不具毒性。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 7.如申請專利範圍第6項之方法，其中該重組質體進一步包括操作性連結至真核細胞控制序列之外來D N A ，使得該外來D N A不於該細菌細胞中表現。 8 .如申請專利範圍第6或7項之方法，其中該細胞之存活係取決於該細胞中存有該質體。 9.如申請專利範圍第6或7項之方法，其進一步包含回收該細菌細胞。 1 〇 .如申請專利範圍第9項之方法，其進一步包含培養該細胞（於其中該細胞之存活係取決於該細胞中存有該質體之條件下培養），及自該細胞回收質體DNA。 1 1 . 一種製備用於穩定且高水平地產製重組質體之系統的方法，該方法包含導入重組質體至細菌細胞中，該細菌細胞係經不可逆地改變以導致該細菌細胞不能合成催化細胞壁生合成中一步驟之酶，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製其中該酶係催化選自下列之反應：L -丙胺酸加成至細胞壁多醣（L 一 A j a -加成性酶）；D -穀胺酸加成至連接多醣鏈之L —丙胺酸上（mu r D) ; d a p加成至L —丙胺酸 /D -穀胺酸二肽（mu rE);及0-丙胺酸加成至細菌細胞壁之L -丙胺酸/ D -榖胺酸/ dap 三肽（murF)上，其中該遺傳物質包含編碼該酶之核苷酸序列，其中該遺傳物質於動物細胞中不具有官能性或結構性對等物，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -3 - 514667 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍其中該遺傳物質所表現之任一蛋白質係不能作用於任何動物細胞成份， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其中該遺傳物質所表現之任一蛋白質或因該蛋白質之存在所導致的產物不被該細菌細胞所分泌或對該細菌細胞不具毒性；且其中該質體進一步包括操作性連結至真核細胞控制序列之外來DNA，使得該外來DNA藉由遞送該質體不於該細菌細胞中表現，但於動物細胞中表現。 1 2 .如申請專利範圍第’ 1 1項之方法，其中該酶係催化D -丙胺酸加成至細菌細胞壁之L -丙胺酸/D —穀胺酸/dap三肽（murF)上。 13.如申請專利範圍第11或12項之方法，其中該細胞之存活係取決於該細胞中存有該質體。 1 4 .如申請專利範圍第1 1或1 2項之方法，其進一步包含回收該細菌細胞。 1 5 .如申請專利範圍第1 4項之方法，其進一步包含培養該細胞（於其中該細胞之存活係取決於該細胞中存經濟部智慧財產局員工消費合作社印製培下件條之體質該有 A N D 體質收回胞細該自及本紙張又度逋用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐）