JPH0576376A - 修飾されたトランスポゾンによるｄｎａの挿入 - Google Patents

修飾されたトランスポゾンによるｄｎａの挿入

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JPH0576376A
JPH0576376A JP3274964A JP27496491A JPH0576376A JP H0576376 A JPH0576376 A JP H0576376A JP 3274964 A JP3274964 A JP 3274964A JP 27496491 A JP27496491 A JP 27496491A JP H0576376 A JPH0576376 A JP H0576376A
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Robert Newton Brey Iii
ロバート・ニユートン・ブリイ・ザサード
Robert Allen Deich
ロバート・アレン・デイチ
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 原核生物の構成ＤＮＡの中へＤＮＡ配列構成
体を導入するためのＤＮＡ構成体、および使用方法。Ｄ
ＮＡ構成体は、転移可能なカセットに対してシスにおい
て連鎖した、トランスポゼースタンパク質をエンコード
する発現可能な遺伝子を包含する。転移可能なカセット
は、ＤＮＡ配列をフランキングする１対のトランスポゼ
ース認識配列を含む。トランスポゼースタンパク質をエ
ンコードする遺伝子は、トランスポゼース認識配列によ
りフランキングされていない。 【効果】 本発明によれば、例えば発明可能な遺伝子の
単一のまたは多数のコピーを原核生物の宿主の染色体中
に相に有することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】原核生物の転移可能な因子は、原核生物の
ゲノム内の単一のまたは多数の部位に挿入することがで
きる明確なＤＮＡ配列である［例えば、概観について、
参照Ｄ．Ｅ．ベルグ（Ｂｅｒｇ）編、（１９８９）モー
ビル（Ｍｏｂｉｌｅ）ＤＮＡ、ＡＳＭパブリケイション
（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）、ワシントンＤ．Ｃ．］。
歴史的には、これらの転移可能な因子は３つのクラスに
分割された。
【０００２】第１クラスは小さい、一般に２，０００塩
基対より小さい長さの、転移可能な因子からなる。これ
らの因子は挿入配列またはＩＳ配列と呼ばれ、そしてそ
れらの自身のトランスポジションに関連する抗原決定基
のみをエンコードする；詳しくは、トランスポゼースタ
ンパク質。この第１クラスは、また、挿入配列の２つの
コピーによりフランキングされたＤＮＡのセグメントで
ある。すべてのＩＳ配列の末端部分は逆向き反復配列か
らなる。トランスポゼースタンパク質は、これらの末端
配列を認識し、そして配列と相互作用させてゲノム内で
トランスポジションを行うことによって機能する。
【０００３】トランスポゾンの第２クラスは、トランス
ポゾンのＴｎ３族である。これらのトランスポゾンは、
２つの段階のトランスポジションのプロセスに関係す
る；トランスポゼースおよびリゾルバーゼ。この第２ク
ラスに属するトランスポゾンは、ほぼ３５〜４０塩基対
の逆向き末端反復配列を有する。
【０００４】第３クラスはバクテリオファージのＭｕお
よび関係するファージを包含する。バクテリオファージ
Ｍｕは、３６，０００塩基対のゲノムをもつ他のトラン
スポゾンに関して大きい。Ｍｕは、トランスポジション
のプロセスに関係する２つの遺伝子産生物、７０，００
０ダルトンのトランスポゼースおよびほぼ３３，０００
ダルトンのアクセサリータンパク質をエンコードする。
他のトランスポゾンと異なるＭｕの異常な特徴は、その
末端が逆向き反復配列でないことである。しかしなが
ら、Ｍｕトランスポゼースは、試験管内結合アッセイに
おいて両者の末端に結合することが示された。
【０００５】宿主細胞の染色体の中に外来ＤＮＡの導入
のためのベヒクルとしてトランスポゾンの使用は従来記
載されてきている［例えば、ウェイ（Ｗａｙ）ら、遺伝
子（Ｇｅｎｅ）３２：３６９−３７９（１９８４）］。
また、グリンター（Ｇｒｉｎｔｅｒ）（米国特許第４，
７８４，９５６号）は、転移可能なクローニングベクタ
ーをレシピエント細胞の染色体の中に挿入する２ベクタ
ーの方法を記載している。最初のプラスミドは、レシピ
エント細胞の染色体の中に挿入すべき外来ＤＮＡと置換
された、そのトランスポゼースの機能をエンコードする
遺伝子を有するトランスポゾン支持する。第２プラスミ
ドは発現可能なトランスポゼース遺伝子を有する。した
がって、トランスポゼース機能はトランスに与えられ
る。
【０００６】ナラング（Ｎａｒａｎｇ）ら（米国特許第
４，８３０，９５６号）は、転移可能なリンカーと呼ぶ
構成体を記載している。リンカーは極端の末端、または
トランスポゾンのトランスポゼース認識配列からなる。
天然に産出するトランスポゾン中のトランスポゼース認
識配列によりフランキングされる遺伝子材料を、制限酵
素認識配列を含有するＤＮＡ配列で置換して、外来ＤＮ
Ａ配列の挿入を促進してきた。グリンター（Ｇｒｉｎｔ
ｅｒ）の方法の場合におけるように、ナラング（Ｎａｒ
ａｎｇ）らは別々のプラスミドベクター上のトランスポ
ゼースタンパク質をエンコードする遺伝子をトランスで
導入することを教示している。
【０００７】本発明は、ＤＮＡ配列を原核生物の細胞の
構成体のＤＮＡの中に導入するためのＤＮＡ構成体に関
する。ＤＮＡ構成体は、転移可能なカセットに対してシ
スにおいて連鎖したトランスポゼースタンパク質をエン
コードする遺伝子からなる。転移可能なカセットは、原
核生物の細胞の構成体のＤＮＡの中に導入すべきＤＮＡ
配列の挿入のためのクローニング部位をフランキングす
る、１対のトランスポゼース認識部位（通常逆向き反復
配列）からなる。
【０００８】本発明を使用して、例えば、発現可能な遺
伝子の単一のまたは多数のコピーを原核生物の宿主の染
色体の中に挿入することができる。これはワクチンの応
用のための抗原性物質の効率よい産生を可能とする。さ
らに、原核生物の宿主は弱毒化腸侵入性バクテリアであ
る場合、本発明は生ワクチンの配合において有用な菌株
の構成に有用である。
【０００９】シスにおけるトランスポゼース機能（すな
わち、連続のＤＮＡ上に連鎖した）得られると、その機
能がトランスで与えられる既知の技術を越えた多数の利
点が得られる。例えば、導入すべきＤＮＡ配列がトラン
スポゼースタンパク質をエンコードする遺伝子から別の
ベクター上に支持される場合、両者のベクターをもつ細
胞の同時形質転換は所望の結果を達成するために必要で
ある。本発明の構成は、細胞を単一のベクターで形質転
換することによって転移可能な配列の導入を可能とす
る。これはより効率よくかつ便利な方法である。なぜな
ら、それは所望の性質を有するクローンを同定するため
にスクリーニングしなくてはならない細胞の数を減少す
るからである。
【００１０】他の利点はＩＳトランスポゾンに特別に関
する。ＩＳトランスポゾンは、トランスで導入されると
き、不十分であることが示された。欠陥のあるトランス
ポゼースをもつＩＳトランスポゾンのトランスにおける
相補性は約１％以下の効率で起こる［参照、例えば、モ
リサトら、細胞（Ｃｅｌｌ）３２：７９９−８０７（１
９８３）］。この現象に提唱された１つの説明は、合成
したばかりのトランスポゼース遺伝子に物理学的に密接
するＤＮＡ配列に対してＩＳが非特異的に結合すること
である。次いで、これらの非特異的に結合した分子は、
ＤＮＡに沿った１次元の拡散により、トランスポゼース
認識配列のサーチにおいてＤＮＡを走査する［ベルグ
（Ｂｅｒｇ）ら、（１９８１）バイオケミストリー（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２０：６９２９−６９４
８］。対照的に、本発明のＤＮＡ構成体は、シスにおい
てトランスポゼース遺伝子およびトランスポゼース認識
配列をエンコーして、効率よいトランスポジション系を
生ずる。
【００１１】本発明は、原核生物の細胞の構成体のＤＮ
Ａの中にＤＮＡ配列を導入するＤＮＡ構成体、およびそ
れらを使用する方法に関する。原核生物の細胞の構成体
のＤＮＡは、例えば、染色体およびエピソームを包含す
る細胞内のすべての自律的に複製するＤＮＡを包含す
る。トランスポジションは原核生物の細胞の構成体のＤ
ＮＡ配列に対してしばしば独立であり、したがってトラ
ンスポジションは一般にランダム位置において起こる。
しかしながら、トランスポゾンは、また、高い頻度で、
トランスポゼース認識配列の間のトランスポジションま
たは二重組み換えを経て、同一の型の他のトランスポゾ
ンと交換することができる。後述するように、この交換
のメカニズムは、例えば、宿主細胞の構成体のＤＮＡ中
の特別の位置に問題の遺伝子を有するトランスポゾンの
挿入を促進する。
【００１２】本発明は、任意の機能を有するか、あるい
はエンコードするＤＮＡ配列の導入に使用することがで
きる。例えば、ＤＮＡ配列は、構造または調節のタンパ
ク質をエンコードする配列からなるか、あるいは調節配
列、例えば、プロモーターからなることができる。ある
いは、挿入した配列は、例えば、必須の遺伝子内にそれ
自体を挿入し、これにより遺伝子の機能を妨害すること
によって、細胞の機能を妨害するために使用できる、い
ずれかの生物学的機能を有することが知られていないも
のであることができる。
【００１３】好ましい実施態様において、原核生物の細
胞の構成体のＤＮＡの中に導入すべきＤＮＡ配列は発現
可能な遺伝子である。発現可能な遺伝子は、例えば、原
核生物のプロモーター、リボソーム結合部位などを包含
する、すべての必要な調節配列を包含する。
【００１４】本発明は、遺伝子の単一のまたは多数のコ
ピーを種々のスペーサーの染色体の中に挿入する基本的
方法を記載する。発現可能な遺伝子は、真核生物から誘
導することができ、そして病原性寄生体、ヒトの免疫活
性タンパク質およびペプチド、ホルモン、成長因子、ア
レルゲン、腫瘍関連抗原および他のタンパク質からの遺
伝子成分をエンコードすることができる。このような遺
伝子は、ウイルス源から誘導することができ、そして抗
原性タンパク質、構造成分、またはウイルスの複製また
は付着に関係する酵素をエンコードすることができる。
相同性遺伝子ならびに異種遺伝子をバクテリア、ウイル
ス、寄生体、菌類または哺乳動物の源から誘導すること
ができ、そして毒素、保護的免疫原性タンパク質を包含
する病原性のビルレンス因子をエンコードする遺伝子、
か、あるいは抗原性多糖物質の調節または合成に関係す
るタンパク質をエンコードする遺伝子を包含することが
でき、そしてさらに宿主バクテリアに対して外来の酵素
であることができる。
【００１５】問題のバクテリアの抗原の中には、例え
ば、次のものを包含するヒトのバクテリアの病原体に関
連するものが存在する：型別が可能なおよび不可能なイ
ンフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕ
ｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇ
ｉｔｉｄｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カタル
球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉ
ｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、
ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉ
ｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌ
ａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅ
ｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈａｅａｅ）、百日咳菌
（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、緑膿
菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、および破傷風菌
（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）。問題の特
定のバクテリアの抗原の例はバクテリアのタンパク質を
包含し、それらのとくに有用な例は次の通りである：外
膜タンパク質［例えば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、カタル球菌
（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）
または髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔ
ｉｄｉｓ）］、バクテリアの毒素、（例えば、百日咳の
毒素、ジフテリアの毒素、破傷風の毒素、およびシュー
ドモナス属の外毒素Ａ）、およびバクテリアの表面タン
パク質（例えば、フラゲリン、血球凝集素および化膿連
鎖球菌からのＭタンパク質）。
【００１６】病原性ウイルスからのウイルスの抗原は次
のものを包含するが、これらに限定されない：ヒト免疫
欠損ウイルス（ＩおよびＩＩ型）、ヒトＴリンパ球ウイ
ルス（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）、ＲＳウイルス、Ａ型肝
炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａおよび非Ｂ型肝炎のウイ
ルス、単純ヘルペスウイルス（ＩおよびＩＩ型）、サイ
トメガロウイルス、インフルエンザウイルス、パライン
フルエンザウイルス、ポリオウイルス、レトロウイル
ス、コロナウイルス、ルベラウイルス、麻疹ウイルス、
水痘、エプタイン−バーウイルス、アデノウイルス、乳
頭腫ウイルスおよび黄熱病ウイルス。
【００１７】これらの病原性ウイルスのいくつかの特別
のウイルス抗原は、次のものを包含する：ＲＳウイルス
（ＲＳＶ）のＦ（ペプチド２８３−３１５）Ｇタンパク
質、ロタウイルスのＶＰ４ポリペプチド、ロタウイルス
のＶＰ７ポリペプチド、ヒト免疫欠損ウイルスのエンベ
ロープ糖タンパク質およびＢ型肝炎のＳおよびｐｒｅ−
Ｓ抗原。
【００１８】寄生体および菌類の抗原をエンコードする
遺伝子は、また、本発明において使用することができ
る。問題の寄生体の抗原は、例えば、次のものを包含す
る：プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、トキ
ソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）種、レイシュマニ
ア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、トリパノソマ（Ｔｒｙ
ｐａｎｏｓｏｍａ）種、シルトソマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓ
ｏｍａ）種、トキソカラ（Ｔｏｘｏｃａｒａ）種、アス
カリス（Ａｓｃａｒｉｓ）種、およびファシオラ（Ｆａ
ｓｃｉｏｌａ）種。菌類の抗原は、次のものを包含す
る：カンジド・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄ ａｌｂｉ
ｃａｎｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃ
ｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）およ
びコシジオデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｏｄｅｓ ｉｍ
ｍｉｔｉｓ）。
【００１９】次の抗原は、また、ことにワクチンおよび
治療学的因子における使用に、重要である：自己免疫
病、例えば、慢性関節リウマチおよびエリテマトーデス
に関連する種々の抗原、腫瘍抗原、癌抗原およびホルモ
ン、生物活性ペプチド、サイトカイニン、リンホカイン
および成長因子、ならびに原核生物または真核生物由来
の酵素および構造タンパク質をエンコードする遺伝子の
単一のまたは多数のコピー。
【００２０】新規なワクチン配合物を調製するために、
保護的抗原をエンコードする遺伝子を弱毒化バクテリア
の染色体の中に導入することができ、このバクテリアは
発現された遺伝子を誘導した病原体に対する免疫応答の
刺激のための受け渡しベヒクルとして作用する。参照、
ドウガン（Ｄｏｕｇａｎ）およびタイト（Ｔｉｔｅ）、
セミナーズ・イン・ビロロジー（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉ
ｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１：２９（１９９０）。病原性
バクテリア、ウイルス、または寄生体の源から誘導され
た抗原をエンコードする遺伝子は、ヒトにおいて使用す
るための生ワクチンとして使用するために（例えば、腸
チフス、下痢の病気、およびエイズを包含する性的に伝
染する病気に対して保護するために）、弱毒化チフス菌
（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）の染色体の中に導入することができ
る。あるいは、このような遺伝子は動物の種を感染する
ことができる他のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ）、例えば、弱毒化畜牛のワクチンとして使用するサ
ルモネラ・ズブリン（Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ）（例えば、船
積熱に対して）、ブタの生弱毒化ワクチンとして使用す
るための豚コレラ菌（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉ
ｓ）、および家禽について生弱毒化ワクチンとして使用
するためのトリチフス菌（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）
またはサルモネラ・プロルム（Ｓ．ｐｕｌｌｏｒｕｍ）
の染色体の中に導入することができる。特定の実施態様
において、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）寄生体を弱毒
化トリチフス菌（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）の染色体
の中に挿入して、コクシジア病のための経口的ワクチン
を生成することができる。あるいは、抗原をエンコード
する遺伝子は生ワクチンとして使用すべき他のバクテリ
アの染色体の中に挿入することができる。このような例
は、エルジニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ
ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、フレクスナー赤痢
菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、志賀赤痢
菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、カンピロバクテリ
ウム・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｊｅｊｕｎｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌ
ｅｒａｅ）、およびカルメット−ゲラン杆菌（Ｂａｃｉ
ｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、ウシ型結
核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）の無
毒性突然変異を包含するすることができる。
【００２１】さらに、このような遺伝子は単一のまたは
多数のコピーとしてバクテリアの染色体の中に挿入し
て、ワクチン産生のために抗原物質を効率よく産生する
ことができる。バクテリアの病原体から誘導した自然の
または突然変異した遺伝子を染色体の中に挿入して、抗
原の産生を増大しかつ効率よくすることができる。例え
ば、突然変異の毒素をエンコードする遺伝子、ビルレン
ス因子をエンコードする遺伝子、または他の自然または
突然変異の保護的免疫原を相同性または異種のバクテリ
アの株の染色体の中に導入することができる。多くの場
合において、ビルレンスまたは保護的免疫原は、特定の
宿主バクテリア中でのみ効率よく産生することができ
る。バクテリアの表面多糖または莢膜の産生に導く複合
体の生合成に関係する産生物をエンコードする遺伝子
は、多き過ぎて、ワクチンの使用するための抗原性物質
を産生する目的で他のバクテリア中でクローニングおよ
び発現することができない。このような例は、効率よい
百日咳のワクチンの製造のための毒素欠乏有機体の染色
体の中に百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ）の交差反応性突然変異毒素分子挿入、および
突然変異毒素遺伝子の産生を増強する変更された調節シ
グナルの挿入を包含する。
【００２２】インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型から誘導された抗原性
莢膜物質を、バクテリアの発酵から得ることができる。
莢膜の合成の調節に影響を与える変更遺伝子の挿入は、
インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）中の莢
膜物質の産生を増強することができる。インフルエンザ
菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の免疫原性外膜タンパ
ク質の効率よい産生は、野生型の外膜タンパク質の活性
を欠く遺伝子のバックグラウンドにおいて新規な融合タ
ンパク質をエンコードする遺伝子の挿入により増強する
ことができる。発現可能な遺伝子を染色体の中に挿入し
て、単一の遺伝子のコピーからタンパク質産生物を高い
レベルで産生することができる組み換え有機体を生ずる
ことができる。遺伝子を染色体の座の中に不規則的に挿
入することによって、遺伝子産生物を高いレベルで発現
するバクテリアを分離することができる。不規則的な局
在は、遺伝子の発現を増強する位置の作用を検出するこ
とができる分離物にに導く。増強された遺伝子の発現は
安定な組み換え体を生ずることができ、これらの組み換
え体は多数のコピーのプラスミドのベヒクル上に支持さ
れる同様な遺伝子構成体を越えるレベルでタンパク質を
発現する。
【００２３】発現可能な遺伝子を染色体の中に挿入する
ことができるので、挿入された遺伝子の遺伝は安定な方
法で無限に維持することができる。外来産生物の発現に
普通に使用される染色体外のプラスミドのベクターは、
不安定であって、外来遺伝子の発現の損失に導くことが
ある。バクテリア内のランダムまたは特定の位置の中に
遺伝子を挿入すると、発現の発現は安定に遺伝されかつ
保持される。
【００２４】バクテリアの株の染色体中の同一遺伝子の
多数のコピーの安定な挿入を濃縮しそしてそれについて
スクリーニングすることができる。本発明は、宿主有機
体の染色体中の同一遺伝子の多数のコピーまたは異なる
遺伝子の１〜数個のコピーの導入を提供する。
【００２５】本発明のＤＮＡ構成体は、単一の連続的Ｄ
ＮＡ分子として転移可能な遺伝子カセットに対してシス
において連鎖したトランスポゼースタンパク質をエンコ
ードする遺伝子からなる。カセットは、原核生物の細胞
の構成体のＤＮＡの中に導入すべきＤＮＡ配列の挿入の
ためのクローニング部位をフランキングするが、トラン
スポゼースタンパク質をエンコードする遺伝子をフラン
キングしない、１対のトランスポゼース認識部位（通
常、逆向き反復配列）からなる。
【００２６】天然に存在する転移可能な因子は、それら
の５’および３’末端に存在するトランスポゼース認識
部位を有する。これらの末端および内部のＤＮＡ配列
は、細胞の構成体のＤＮＡを通して転移することができ
る。この内部の配列は、ＩＳ配列の場合におけるほぼ
１，５００塩基対からファージＭｕの場合において非常
に長い配列まで長さが大きく変化することができる。す
べてのトランスポゾンにおけるこの内部の配列の共通の
特徴は、その一部分がそれを含有する特定の認識配列
の、５’および３’末端の配列を特異的に認識するトラ
ンスポゼース、またはトランスポゼース認識配列をエン
コードするということである。
【００２７】前述の天然に存在する場合と対照的に、本
発明の構成体はトランスポゼース認識配列を有する転移
可能なカセットを有するが、これらの認識配列はトラン
スポゼース遺伝子をフランキングしない。トランスポゼ
ース遺伝子は本発明の構成体中の他の位置に挿入され
た。転移された配列はトランスポゼース遺伝子を含ま
ず、こうして、外部のトランスポゼース遺伝子の不存在
下に安定に組み込まれる。本発明の方法は、その構成体
のＤＮＡ内の特定の位置に転移可能なカセット含有して
有する、特定のクローニングされた原核生物の細胞の安
定化を可能とする。トランスポゼース認識配列および対
応するトランスポゼースをエンコードする遺伝子の任意
の組を使用して、本発明を実施することができる。好ま
しい実施態様において、トランスポゼース認識配列は逆
向き反復配列からなる。逆向き反復配列を有する天然に
存在するトランスポゾンは、例えば、次のものを包含す
る：ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３、ＩＳ４およびＩＳ５；Ｔ
ｎ因子、例えば、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔ
ｎ９、Ｔｎ１０およびＴｎ９０３。バクテリオファージ
Ｍｕのトランスポゼース認識配列および関係するトラン
スポゾンは、また、本発明の実施に有用である。ファー
ジＭｕのトランスポゼース認識配列および関係するトラ
ンスポゾンは逆向き反復配列ではない。このような配列
および対応するトランスポゼースタンパク質をエンコー
ドする配列は、標準の技術を使用して天然に存在するト
ランスポゾンから分離することができる。あるいは、こ
のような配列、または機能的に同等のかつ実質的に相同
性の配列は、化学的に合成することができる。
【００２８】本発明の構成体は、当業者に知られている
方法および酵素を使用する１系列の遺伝子操作により合
成する。２つの必須の因子は、転移可能なカセットおよ
び発現可能なトランスポゼース遺伝子である。これらの
因子はシスにおいて連鎖して、単一の連続的ＤＮＡ分子
を形成する。好ましくは、図１に示すように、この単一
の連続的分子は構成体の条件的増殖を少なくとも１つの
型の原核生物の細胞中で可能とする複製の由来、および
選択可能なマーカー、例えば、選択可能なマーカーはト
ランスポゼース認識配列によりフランキングされる。
【００２９】抗生物質抵抗性に導く選択可能なマーカー
は前述の修飾した転移可能な因子の構成に使用すること
ができるが、薬物抵抗性有機体は、薬物抵抗性のアレル
の他の腸フローラへの播殖（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏ
ｎ）が可能であるすべての目的に、ことに生バクテリア
ワクチンの適用に適当ではない。組み換えタンパク質、
酵素および他の産生物の産生のための発酵の間に、生長
培地への抗生物質の添加は、ポリマーまたは修飾された
転移可能な因子を含有する細胞についての選択を可能と
するが、コストおよび終点の可能な汚染のために、多く
の場合において許容されえない。ここに記載する修飾さ
れたトランスポゾンについて、抗生物質抵抗性を使用し
て挿入について選択し、そして因子の固有の安定性のた
めに、引き続く工程の間に排除することができる。
【００３０】環境中の有機体の播殖が可能である場合、
使用することができる選択可能なマーカーと、抗生物質
抵抗性の決定因子と置換するために、応用することがで
きる多数の方法が存在する。修飾されたトランスポゾン
は、宿主染色体の突然変異の相補性により、選択しそし
てレシピエント細胞の中に導入することができる。相補
性の系は特定の宿主染色体の突然変異の構成に頼るが、
培地への抗生物質の包含を回避するために信頼性をもっ
て使用することができる。ある場合において発酵の間に
バクテリアの培養においてプラスミドを選択しかつ維持
するために使用されてきている選択可能なマーカーを使
用して、トランスポジションの事象を選択することがで
きる。例えば、各々が不完全な細胞壁の生合成および細
胞の溶解に導く、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）においてアスパラギン酸
セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）またはＤ−
アラニンラセマーゼ突然変異（ｄａｌ）についての染色
体の突然変異の相補性は、培養のすべての生存能力をも
つ細胞において選択の不存在下に安定なプラスミドの遺
伝を生ずる。ａｓｄおよびｄａｌの両者の突然変異は栄
養添加物を補充することができる。こうして、機能的ｄ
ａｌまたはａｓｄ遺伝子でマーキングしたトランスポゾ
ンはそれらの突然変異を含有するバクテリアの宿主にお
いて選択することができる。他方において、栄養の補充
により提供することができない、宿主の必須遺伝子の相
補性は、また、安定なプラスミドの維持に導くことがで
きる。Ｅ．ｃｏｌｉの遺伝子、ｓｓｂ、はＤＮＡの複製
および細胞の生存能力に要求され、プラスミド上に配置
するとき、バイオリアクターにおける発酵の間にプラス
ミド不含の細胞の蓄積を防止する。同様に、バリルｔＲ
ＮＡシンセターゼのプラスミドを有するコピーは、染色
体の温度抵抗性バリルｔＲＮＡシンセターゼを含有する
Ｅ．ｃｏｌｉ中でプラスミドを安定化する。プラスミド
は、また、バクテリオファージリプレッサー遺伝子の包
含により安定化することができ、その遺伝子の損失は宿
主のプロファージおよび細胞の死に導く。それゆえ、機
能的にそれらの選択系のいずれをも前述の転移可能な因
子に適用することができる。さらに、転移可能な因子は
選択可能なマーカーを含有するように修飾することがで
き、これらの選択可能なマーカーはマーカーを受け取る
ように突然変異により修飾してはならないバクテリア細
胞のレシピエントにおいて使用することができる。例え
ば、ヒトの治療において使用されない重金属に対して抵
抗性の遺伝子［シルバー（Ｓｉｌｖｅｒ）、Ｓ．および
ミスラ（Ｍｉｓｒａ）、Ｔ．Ｋ．、アナルス・オブ・リ
ビュード・マイクロバイオロジー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、１９８８、４２：７１７−７４
３。プラスミド仲介重金属抵抗性］を、転移可能な因子
の中に導入することができる。これらのマーカーは、ア
ーゼナイトまたはアーゼネート、アンチモン、カドミウ
ムまたは有機水銀化合物に対する抵抗性をエンコードす
るする遺伝子を包含するであろう。特定の実施態様にお
いて、アーゼナイトに対する抵抗性にのみ関係するａｒ
ｓＡおよびａｒｓＢ遺伝子は、修飾した転移可能な因子
に容易に適合させることができる。
【００３１】除草剤に対する抵抗性をエンコードする遺
伝子は、また、選択可能なマーカーとして有用である。
ある数のこのような遺伝子が記載されてきており、各々
は制限された範囲の除草剤、例えば、イミダゾリノン、
スルホニル尿素［ヤダブ（Ｙａｄａｖ）ａｌ、ＰＮＡＳ
ＵＳＡ ８３：４４１８−２２、１９８６］、グリホ
セート［コマイ（Ｃｏｍａｉ）ら、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、２６０：４７２４−４７２８、１９８５］；お
よびホスホトリニシンおよびビアロホス［トンプソン
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ ６：２５１９
−２５２３、１９８７；ダスサルマ（ＤａｓＳａｒｍ
ａ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３２：１２
４２−１２４４、１９８６］に対する抵抗性を付与す
る。
【００３２】弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ）生ワクチンの応用に対して特定の適用のために、修
飾したトランスポゾンは、二次弱毒化座に対して相補的
である遺伝子でマーキングして、抗原発現性有機体によ
る宿主哺乳動物のワクチン接種を保証することができ
る。例えば、ｐｕｒＡ遺伝子によりをエンコードするさ
れる、アデニルスクシネートシンセターゼの遺伝子を、
発現された抗原をまた含有する修飾されたトランスポゾ
ンの中に導入することができる。トランスポジションの
事象は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ワクチ
ンの株において、ｐｕｒＡ遺伝子のバックグラウンドに
おいてアデニン依存性について選択することによって選
択することができる。ｐｕｒＡ突然変異が他の弱毒化突
然変異、例えば、ａｒｏＡと組み合わせて存在すると
き、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）細胞は本質
的に超高弱毒化され、そして哺乳動物の宿主中で複製し
ない。こうして、ｐｕｒＡ相補的トランスポゾンを含有
するワクチンの株は完全に免疫原性である。
【００３３】当業者は、よく知られている分子クローニ
ング技術を使用して、ここに記載するように遺伝子構成
体を合成することができる。さらに、必要な出発成分の
各々の源は一般に入手可能である。例えば、選択可能な
マーカー、例えば、ＫａｎRをエンコードする遺伝子
は、ある数の共通の源（例えば、Ｔｎ５）の任意のもの
から、適当な制限酵素で消化することによって切除する
ことができる。トランスポゼース認識配列および対応す
るトランスポゾン遺伝子の源は前述した。
【００３４】図３ＡはＴｎ１０の右末端の極端な３１塩
基対を特定する合成オリゴヌクレオチドを表す；Ｔｎ１
０のほぼ２７塩基対はＴｎ１０トランスポゼースによる
認識のために十分である［ウェイ（Ｗａｙ）およびクレ
ッカー（ｋｌｅｃｋｅｒ）、プロシーディングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８１：
３４５２−３４５６（１９８６）］。ＤＮＡ配列の挿入
のためのクローニング部位（好ましくはいくつかの独特
制限酵素認識配列を含有する多数のクローニング部位）
は、また、広く入手可能であるか、あるいは化学的に合
成することができる。図３Ｂは、例えば、図２に示すよ
うに、ｐＰＸ１５６９の中に挿入してｐＰＸ１５７２を
発生した、合成のクローニングリンカーを表す。成分の
順序および配置は図１および図２に明瞭に示されてい
る。当業者は認識するように、ＤＮＡ構成体中のトラン
スポゼースの位置は、それが発現可能なであり、そして
トランスポゼース認識配列（一般に、逆向き反復配列）
の外側（すなわち、それによりフランキングされていな
い）かぎり、臨界的ではない。同様に、選択可能なマー
カーおよび挿入されたＤＮＡ配列の順序は図１に示され
ているものの逆向きであることができ、ただし両者はト
ランスポゼース認識配列によりフランキングされてい
る。好ましい実施態様において、上に同定した成分の各
々はベクターのＤＮＡ分子を含有するレプリコンの中に
位置する。前述したように修飾したクローニングベクタ
ーは適当である。
【００３５】前述の構成体は、レプリコンがその中で機
能的である原核生物の細胞を形質転換することによっ
て、増殖することができる。次いで、複製した構成体を
遺伝子操作のそれ以上の工程において使用することがで
きる。例えば、よく知られている技術を使用して、任意
の配列（例えば、問題の遺伝子）を転移可能なカセット
のクローニング部位の中に挿入し、そして新しい構成体
を使用して原核生物の細胞を形質転換することができ
る。
【００３６】形質転換された細胞において、トランスポ
ゼース遺伝子は、必要な調節配列（例えば、プロモータ
ー、リボソーム結合部位）のすべてを有するので、転写
されるであろう。トランスポゼースタンパク質は転移可
能なカセットの末端を認識し、これにより細胞の構成体
のＤＮＡの中へのそのトランスポジションを誘発する。
また、必要な調節シグナルを有する遺伝子のカセット内
に運ばれた遺伝子は、また、発現されるであろう。
【００３７】好ましい実施態様において、レプリコンは
条件的である。条件的レプリコンは許容的条件下に複製
するが、制限的条件下にでは複製しない。条件的レプリ
コンの使用は、そのＤＮＡ構成体内の特定の位置に含有
される転移可能なカセットを有する、特定のクローニン
グした原核生物の細胞の安定化を可能とする。この安定
化は、クローニングした細胞から、トランスポゼース遺
伝子、究極的にトランスポゼースタンパク質、を除去ま
たは効果的に不活性化する（細胞を制限的条件下に生長
させる）ことによって達成される。
【００３８】例えば、あるプラスミドは条件的欠陥、例
えば、温度感受性のレプリコンを有する。このようなプ
ラスミドから誘導される本発明の構成体は、許容温度に
おいて複製する能力を有するが、制限的温度において複
製することができない。しかしながら、プラスミドを有
する細胞は両者の温度において生長および分割すること
ができる。その構成体のＤＮＡ内の特定の位置において
含有された転移可能なカセットを有する細胞が同定され
た後、インキュベーション温度を制限的温度にシフトす
る。細胞は生長および分割し続けるが、構成体は複製し
ない。トランスポゼース遺伝子、および結局トランスポ
ゼースタンパク質を有する遺伝子構成体は、これによ
り、組み込まれた転移可能なカセットが構成体のＤＮＡ
内で安定化される程度に希釈される。このようなキュア
ー可能なプラスミドの１例は、温度感受性Ｅ．ｃｏｌｉ
のＦ因子である。このような条件的欠陥を有するレプリ
コンは、本発明の実施において有用である。
【００３９】限定された範囲のプラスミドは条件的であ
り、そしてまた、所望の組み込み体の安定化を可能とす
るために使用することができる。プラスミドのこのグル
ープのよく知られている例は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｏｌＥ
ｌプラスミドベクターｐＢＲ３２２の誘導体である。こ
れらのプラスミドは小さく、そして試験管内のクローニ
ング工程のために大量に調製することが容易である。そ
れらは宿主範囲がＥ．ｃｏｌｉおよび密接に関係するエ
ンテロバクテリアに限定され、そしてＥ．ｃｏｌｉのＤ
ＮＡポリメラーゼＩ機能が与えられないかぎり、他の種
において無力の複製である。この依存性は、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ様ＤＮＡポリメラーゼＩ機能についての複製のｃｏｌ
Ｅｌ由来が要求されるためである。それゆえ、これらの
プラスミドは他のバクテリアのための自殺受け渡しベク
ター（ｓｕｉｃｉｄｅｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｃｔｏ
ｒ）として使用することができる。自殺受け渡しは、こ
こで使用するとき、宿主中で複製することができない遺
伝子構成体を経る、トランスポゾンの導入を呼ぶ。プラ
スミドは形質転換のときのトランスポゼースタンパク質
の合成を指令し、これは構成体のＤＮＡの中への転移可
能なカセットの組み込みを生ずる。しかしながら、レプ
リコンは選択した原核生物の細胞において無力の複製で
あるので、トランスポゼースタンパク質はトランスポジ
ションがもはや起こらない点に急速に希釈される。
【００４０】宿主範囲が限定されたプラスミドベクター
は、前述の修飾されたトランスポゼースのための受け渡
しベヒクルであることができる。例えば、ｐＰＸ１５７
５の構成およびその誘導体において使用する、ｐＢＲ３
２７の由来は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびサルモネラ属（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ）中で自由に複製するが、インフルエ
ンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）または百日咳菌
（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）中で複製することができな
い。こうして、ｐＰＸ１５７５は修飾されたトランスポ
ゾンをそれらのバクテリア細胞へ受け渡すための自殺プ
ラスミドである。腸内バクテリアの宿主への修飾された
トランスポゾンの受け渡しのための条件的レプリコン
は、バクテリオファージ、例えば、前述のラムダまたは
温度感受性Ｆ因子中で受け渡すために代替物として構成
することができる。プラスミドＲ６Ｋの由来は、複製の
ためにトランスで因子する、機能的πタンパク質を必要
とする。Ｒ６Ｋレプリコンを含有する自殺ベクターは構
成された［例えば、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｖ．Ｌ．
およびメカラノス（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ）、Ｊ．Ｊ．、
１９８８、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．
Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１７０：２５７５−２５８
３］。トランスでπタンパク質を含有するＥ．ｃｏｌｉ
宿主を使用して、修飾された転移可能な因子を有する自
殺プラスミドを分離することができる。これらの自殺プ
ラスミドは、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、
赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、および他の密接に関係
する腸内バクテリアのようなバクテリアに、形質転換ま
たは接合により、転移可能な因子を受け渡す作用をする
であろう。さらに、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）中で本来分離される、グ
ラム陽性有機体、例えば、ｐＵＢ１０から誘導されたレ
プリコンは、グラム陰性バクテリア、例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉまたはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）中で
複製することができず、こうして修飾されたトランスポ
ゾンのための自殺プラスミドベクターの構成において使
用することができる。
【００４１】原核生物の染色体中の転移可能なカセット
の受け渡しのためのＤＮＡ構成体の第３型は、バクテリ
オファージの誘導体である。好ましい実施態様におい
て、バクテリオファージはバクテリオファージλであ
る。図５および図６に示すように、原核生物の宿主細胞
中で複製することができないファージ（すなわち、条件
的レプリコン）を使用して転移可能なカセットを受け渡
す。この系は生体内で自発的に交換するという存在する
性質の利点を利用する。それゆえ、所望の特別のトラン
スポゾンの構成を第１選択可能なマーカーを有するプラ
スミド上で実施し、第２選択可能なマーカーをフランキ
ングする適当なトランスポゼース認識配列を含有するλ
ファージで溶原化したＥ．ｃｏｌｉ細胞の中に導入する
場合、プラスミドのトランスポゾンは高い頻度でプロフ
ァージのトランスポゾンと交換することができる。この
ような交換は、存在するプロファージの誘発しそしてリ
ゼイトを第１選択可能なマーカーを形質導入することが
できるファージについてスクリーニングすることによっ
て、容易に検出することができる。次いで、これらのリ
ソゲンを誘発して、転移可能な遺伝子カセットを有する
形質導入性ファージの純粋な集団を生じさせる。特定の
染色体の挿入を安定化する他の方法は、調節可能なプロ
モーターを使用してトランスポゼースタンパク質の発現
をコントロールすることを包含する。当業者には多数の
調節可能なプロモーターが知られており、ｔａｃ、ｌａ
ｃ、ｒｅｃＡ、ＰL、およびＴ７を包含する。このよう
なプロモーターは、規定した条件下にで活性であるが、
他の条件下に不活性である。
【００４２】前の論考は主としてＤＮＡ配列のランダム
挿入に関する。しかしながら、前以て決定した遺伝子座
に存在するトランスポゾンを含有する宿主細胞を使用す
ることによって、ＤＮＡ配列の挿入をその前以て決定し
た座に向けることができる。これはトランスポゼース認
識配列（一般に、逆向き反復配列）の間の特定のトラン
スポジションおよび相同性の組み換えのためである。
【００４３】存在するトランスポゾン、あるいは本発明
の方法により導入されたＤＮＡ配列を決定することは、
比較的簡単なことであり、制限酵素の消化およびゲルの
分析により達成することができる。複雑な場合におい
て、サザンハイブリダイゼーションを必要とすることが
ある。存在するトランスポゾンが所望の位置において同
定されるとき、本発明の遺伝子構成体は任意の適当な方
法を使用して導入される。相同的組み換えはある頻度で
起こり、そして組み換えが起こった細胞は、例えば、サ
ザンハイブリダイゼーションにより検出することができ
る。
【００４４】次の実施例によって、本発明をさらに説明
する。
【００４５】
【実施例】
（ａ）バクテリアの株およびバクテリオファージ 薬物
抵抗性について言及するとき、次の略号をこの出願を通
じて使用する： カナマイシン抵抗 ＫａｎR カナマイシン抵抗性 ＫａｎR カナマイシン感受性 ＫａｎS アンピシリン抵抗 ＡｍｐR アンピシリン抵抗性 ＡｍｐR クロランフェニコール抵抗 ＣｍR クロランフェニコール抵抗性 ＣｍR クロランフェニコール感受性 ＣｍS テトラサイクリン抵抗 ＴｅｔR テトラサイクリン抵抗性 ＴｅｔR テトラサイクリン感受性 ＴｅｔS 次の菌株は、ＮＲＲＬ、イリノイ州ペオリア、に１９９
０年７月１２日に、ブダベスト条約の規定に従い受託さ
れた： Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０３／ｐＰＸ１５７
５．．．．．．．．受け入れ番号ＮＲＲＲ Ｂ−１８６
７２ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１／ｐＭＣ９、λＰＢ１０
０．．．．受け入れ番号ＮＲＲＲ Ｂ−１８６７３ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１／ｐＭＣ９、λＰＢ１０
３．．．．受け入れ番号ＮＲＲＲ Ｂ−１８６７４ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００／Ｆ’tsｌａｃ：：Ｔｎ１
０．．．．．受け入れ番号ＮＲＲＲ Ｂ−１８６７５ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＣ１５５３／Ｆ１１２は、Ｂ．バッチ
マン（Ｂａｃｈｍａｎｎ）博士［コリ・ジェネティック
・ストック・センター（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓ
ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、イエール大学］から入手
し、そして遺伝子型：ａｒｔＧ６、ｍｅｔＢ１、ｈｉｓ
−１、ｌｅｕ６、ｒｅｃＡ７、ｍｔ１２、ｘｙ１７、ｇ
ａ１７、ｌａｃＹ１、ｒｐｓＬ１０４、ｔｏｎＡ２、ｔ
ｓｘ、λR、λ-、ｓｕｐＦ４４を有する。Ｆ１１２は完
全なλレセプター（ｌａｍＢ）およびマルトースの利用
（Ｍａｌ+）の遺伝子を有する。
【００４６】プラスミドおよび組み換えλファージの構
成において使用した他のＥ．ｃｏｌｉ株は、次の通りで
ある：（△ｌａｃＵ１６９ ｓｕｐＥ ｓｕｐＦｈｓｄ
ＲｈｓｄＭ+ ｍｅｔＢ ｔｒｐＢ ｔｒｐＲ ｔｏｎ
Ａ２１ｐｒｏ：：Ｔｎ５（ｐＭＣ９）［ＡＴＣＣ ３７
１９５］）を組み換え体λリソゲンの回収において宿主
株として使用した［ヤング（Ｙｏｎｇ）およびデイビス
（Ｄａｖｉｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２
２：７７８（１９８３）］；ＭＣ１０６１［ＡＴＣＣ
５３３３８］（△ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７△（ｌａｃ
ＰＯＺＹ）Ｘ７４ ｈｓｄＲ ｈｓｄＭ+ ａｒａＤ１
３９ ｇａｌＥ１５ ｇａｌＫｉ６ ｒｐｓＬ）を、ま
た、組み換え体λファージのあるものについてそしてλ
ストックの力価決定のために宿主として使用した［メイ
スナー（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ）ら、プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、
８４：４１７１（１９８７）］；ＪＭ１０３［ＡＴＣＣ
３９４０３］（Ｆ’ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ+1 ｌ
ａｃｉQ △Ｍ１５／△（ｐｒｏ−ｌａｃ）ｓｕｐＥ
ｈｓｄＲ ｓｂｃＢ１５ ｔｈｉ−１ ｅｎｄＡ１ λ
-）を、ｔａｃまたはｌａｃ−プロモーター調節された
遺伝子を含有するプラスミドの構成のために宿主株とし
て使用した［メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、核酸の
研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）９：３
０９（１９８１）］；Ｎ９９ｃＩ+（Ｆ-ｇａｌＫ２ ｒ
ｐｓＬ λ- ｃＩ+）は、野生型ｃＩリプレッサー遺伝
子を含有するが、他のλ機能について高度に欠失され
た、宿主株である［ゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａ
ｎ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１４０：５７（１９８
０）］；Ｃ６００［Ａ４７０２４］（Ｆ-ｔｈｉれうＢ
６ ｌａｃＹ１ ｔｈｒ−１ ｈｓｄＲ ｓｕｐＥ４４
ｔｏｎＡ２１λ-）を、温度感受性Ｆ因子、Ｆtsｌａ
ｃ Ｔｎ１０のための宿主株として使用した；そしてＫ
ＢＴ００１（ｐｕｒＥ ｌａｃＹ ｌｅｕＡ、ｐｒｏＣ
ｍｅｔＥ ａｒｇＨ ｒｐｓＬ λ-）を実施例に記
載するように使用した［カドナー（Ｋａｄｎｅｒ）およ
びリッギンス（Ｌｉｇｇｉｎｓ）、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔ.）、１１５：５１４
−５２１（１９７３）］。
【００４７】バクテリオファージλクローニングベヒク
ルλｇｔ１１［ＡＴＣＣ３７１９４］（ｃＩ８７５ ｎ
ｉｎ５ ｌａｃ５ Ｓａｍ １００ △ｓｈｎｄ１１１
λ２−３ ｓｒＩλ３° ｓｒＩλ４° ｓｒＩλ５
°）をＹ１０８９中で維持した［ヤング（Ｙｏｕｇ）お
よびデイビス（Ｄａｖｉｓ）、プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８
０：１１９４（１９８３）］。λクローニングベヒクル
λＮＭ８１６（ｉｍｍ21 ｃＩｔｓ ｎｉｎ５ｌａ５）
をλ１０８９中のリソゲンとして維持した［ムレイ（Ｍ
ｕｒｒａｙ）、Ｎ．、ＬＡＭＢＤＡＩＩ（１９８３）、
ヘンドリックス（Ｈｅｎｄｒｉｘ）ら編、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニュ
ーヨーク、ｐ．３９５］。
【００４８】使用した弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ）ワクチンは、次の通りであった：Ｔｙ５２
３（ａｒｏＡ △４０７ ｈｉｓＧ４６）、チフス菌
（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）ＣＤＣ１０８０の誘導体［米国特許
第４，７３５，８０１号］；ＳＬ３２６１（ａｒｏＡ５
５４：：Ｔｎ１０Ｔｃ5 ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）から誘導された安定な非復帰性ａｒ
ｏＡ欠失、バイオタイプＷｒａｙ；およびＳＬ１４３８
［ＡＴＣＣ３９１８４］（ｈｉｓＧ４６ ａｒｏＡ ５
５４ Ｔｎ１０ ＴｃS］、サルモネラ・ズブリン
（Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ）のａｒｏＡ欠失突然変異。
【００４９】ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍ） ＬＢ５０１０は、ＬＢ５０００から誘導された
ｇａｌＥ突然変異である［ブラス（Ｂｕｌｌａｓ）＆リ
ュー（Ｒｙｕ）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．）、１５６：４７１（１９８
３）］。Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｍＢレセプターは、Ｆ１１
２ｄＴｎ１０（ｃｍ）を含有するＥ．ｃｏｌｉ ＫＬ１
８８と接合（ｍａｔｉｎｇ）すＣｍRについて選択する
ことによって，ＬＢ５０１０中に導入した。ＣｍRは、
Ｆ１１２／ＪＣ１５５３をｐＮＫ１２１０［ワイ（Ｗａ
ｙ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）３２：３６９−３７９（１
９８４）で形質転換し、そしてλに対して感受性であっ
たＰＲ１３のＣｍRエキソコンジュガント［ｅｘｏｃｏ
ｎｊｕｇａｎｔ）（ｐｎｐ１３、ｒｎａ１９、ｔｈｒ
１、ｌｅｕＢ６、ｔｈｉ１、ｌａｃＹ１、ｘｙ１７、ｍ
ｔｌ２、ｍａｌＡ、ｒｐｓＬ、ｍａｌＢ：ハウタラ（Ｈ
ａｕｔａｌａ）らにより記載された（プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳ
Ａ、７６：５７７４−５７７８（１９７９））］を選択
することによって得た。マーキングしたｌａｍＢ+プラ
イム因子は多重栄養要求変異種のＥ．ｃｏｌｉ株（ＫＬ
１８８（ｔｈｉ１、ｐｙｒＤ３４、ｈｉｓ６８、ｔｒｐ
９５、ｍｔｌ２、ｘｙｌ７、ｍａｌＡ１、ｇａｌＫ３
５、ｒｐｓＬ１１８、λR、λ-）［これらはＢ．バッチ
マン（Ｂａｃｈｍａｎｎ）、コリ・ジェネティック・ス
トック・センター（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏ
ｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、イエール大学、から入手した］
の中に動き、これをＬＢ５０１０の生長を支持する最小
培地からヒスチジン、ウラシルおよびチミジンを排除す
ることによって、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ）ＬＢ５０１０との引き続く接合においてカウ
ンターセレクションした（ｃｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔ
ｅｄ）。ｌａｍＢ+プライム因子をサルモネラ属（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ）の弱毒化ワクチンの株の中に、ＬＢ
５０１０と接合し、イソロイシン、バリン、メチオニン
およびロイシンを除外したすべてのアミノ酸を含有する
規定した培地中のドナー株をカウンターセレクションす
ることによって動かした。
【００５０】インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＲＤ株ＨＤＧ８５［デイチ
（Ｄｅｃｈ）およびグリーン（Ｇｒｅｅｎ）、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌｏ
ｇｙ）、１７０：４８９−４９８（１９８８）］を、下
の実施例に記載するように使用した。
【００５１】百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ）、株ＢＰ３７０、実施例６において後述
する、は、スタンレー・フォーコウ（Ｓｔａｎｌｅｙ
Ｆａｌｋｏｗ）博士、スタンフォード大学、カリフォル
ニア州、パロアルト、から入手し、野生型の百日咳の毒
素およびヘモリシンの産生を有する百日咳菌（Ｂ．ｐｅ
ｒｔｕｓｓｉｓ）のＦＨＡ-分離物である。
【００５２】（ｂ）バクテリアの生長培地 Ｅ．ｃｏｌｉ、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ）、サルモネラ・ズブリン（Ｓ．ｄｕｂｌｉ
ｎ）、およびチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）株は、Ｌブロ
ス中で培養した。インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）細胞は、１０μｇ／ｍ
ｌのヘミンおよび２μｇ／ｍｌのＮＡＤを含有する脳心
臓浸出ブロス中で生長させた。適当ならば、アンピシリ
ンを１００μｇ／ｍｌで存在させ、そしてカナマイシン
を５０μｇ／ｍｌで存在させた。百日咳株ＢＰ３７０
（ＦＨＡ-ＴＯＸ+）を半固体のボーデット−ゲンゴウ
（Ｂｏｄｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ）（ＢＧ）血液寒天上のフ
リーザーストック上で増殖させた［キムラ、Ａ．ら、イ
ンフェクション・アンド・イミュニイー（Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．）５８：７−１６（１９９０）］。寒
天培地からのバクテリアの塊を液体培養のためのＣＬ培
地の中に接種した。［イマイズミら、インフェクション
・アンド・イミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．）４１：１１３８−１１４３（１９８３）］。
【００５３】生ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＳＬ３２６１誘導体でマウ
スを接種するために、バクテリアを１リットル当たり次
の成分を含有する規定した培地中で生長させた：６ｇの
Ｎａ2ＨＰＯ4、３ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇのＮａＣ
ｌ、１ｇのＮＨ4Ｃｌ、ｐＨ７．０の調節した、および
さらに次の成分を含有した：２ｇのＤ−グルコース、
０．２ｇのＭｇＳＯ４、１ミリモルのクエン酸ナトリウ
ム、５ｇのビタミン不含カサミノ酸、５ｍｇの２０ニコ
チン酸、１０ｍｇのジヒドロキシ安息香酸、１０ｍｇの
パラ−アミノ安息香酸、および３５ｍｇの各フェニルア
ラニン、トリプシン、およびチロシン。
【００５４】マウスは１０10までのバクテリアで、胃の
中に平滑末端の針で直接挿管することによって、経口的
に接種した。上のようにして生長したバクテリアを遠心
し、洗浄し、そして１．５％の重炭酸ナトリウムの中に
再懸濁した。
【００５５】（ｃ）遺伝的方法 プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株またはネズミチフス菌
（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＢ５０１０の中にＣ
ａＣｌ2法により形質転換した［デイガート（Ｄａｇｅ
ｒｔ）およびエールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）、遺伝子
（Ｇｅｎｅ）６：２３−２８（１９７９）］。
【００５６】バクテリオファージＰ22ＨＴ ｉｎｔ１０
５を、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
ＬＢ５０１０からの遺伝子の一般化した形質導入のため
に使用した。対数期の培養物の生長培地の中にＤ−ガク
トースを１時間含め、次いでファージリゼイトの産生の
ためにファージ感染させることによってＬＰＳ合成を誘
発して、ＬＢ５０１０をファージＰ22に対して増感し
た。ＬＢ５０１０上で調製されたＰ22ファージを１の感
染の多重度においてＳＬ３２６１、ＳＬ１４３８または
Ｔｙ５２３と混合し、そして形質導入体を適当な培地上
で選択した。
【００５７】（ｄ）オリゴヌクレオチドの合成 アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）（カリフォルニア州フォスターシテ
ィー）３８０ＢＤＮＡ合成装置で、β−シアノエチルホ
スホルアミダイト化学を使用して、オリゴヌクレオチド
を合成した。
【００５８】（ｅ）遺伝子の発現 ＬＴ−Ｂはエンテロトキシン発生性Ｅ．ｃｏｌｉの不安
定な毒素（ＬＴ）であり、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０３においてｐＵＣ８中で、５９０百日咳菌（Ｂ．ｐｅ
ｒｔｕｓｓｉｓ）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を
ｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位の中に形質
転換することによって発現した。全長のプラスモディウ
ム・ベルグヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅ
ｉ）ＣＳタンパク質をＰLプロモーターの発現ベクター
中で発現し、そしてこれは全体の解読配列＋アミノ末端
における８アミノ酸（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）から成っていた
（図６）。最初の７アミノ酸は発現ベクターおよびリン
カーから誘導し、そしてリジンをＣＳタンパク質解読領
域から１コドン上流に位置するＤｒａＩ部位から誘導す
る。
【００５９】（ｆ）抗原検出のエレクトロトランスファ
ー法 異種の組み換えタンパク質の合成を、Ｅ．ｃｏｌｉまた
はサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の細胞中で、
ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分離したタン
パク質の試料をニトロセルロース膜上でトランスブロッ
ティングし、ＰＢＳ中の０．５％のツイーン−２０でブ
ロッキングし、次いで０．１％のツイーン−２０中で抗
体結合することによって検出した。結合した抗体をセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼ標識したプロテインＡ［カ
ーケガード・アンド・ペリー（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ
ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）、マリイランド州ガイサースバー
グ］で検出した。ＬＴ−Ｂ抗原の検出のために、一次抗
体はセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂプロテイ
ンＡ親和性カラムから結合した物質を溶離することによ
って部分的に精製したヤギα−ＬＴ−Ｂポリクローナル
反復配列であった。
【００６０】（ｇ）インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のエレクトロトラン
スフォーメイション インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａｅ）の細胞をＢＨＩｘｖ培地中で対数中期
（ＣＤ６００＝０．３）に３７℃において生長させた。
細胞を沈澱させ、１０ミリモルのヘペス、ｐＨ７．０、
２０％ｗ／ｖのグリセロールで２回洗浄し、そして１／
１００体積の１０ミリモルのヘペスｐＨ７．０／２０％
（ｖ／ｖ）のグリセロールの中に再懸濁させた。プラス
ミド（ｐＰＸ１５７５）ＤＮＡを約１０μｇ／ｍｌに添
加し、そして細胞をＢＴＸトランスフェクター（Ｔｒａ
ｎｓｆｅｃｔｏｒ）１００エレクトロポレーターでエレ
クトロポレーションした。細胞懸濁液（約５０μｌ）を
１ｍｌのＢＨＩｘｖ培地の中に希釈し、そして２時間３
７℃において生長させて形質導入したマーカーの発現を
可能とした。次いで、培養物を系統的に希釈し、そして
ＢＨＩｘｖ−カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）選択的寒
天上でプレイティングし、そして３７℃においてインキ
ュベーションした。
【００６１】ｈ）百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ）のエレクトロトランスフォーメイシ
ョン ＣＬ培地中のＢＰ３７０のスターター培養物を３５〜３
７℃において一夜インキュベーションし、次いで１．３
リットルのＣＬ培地の中に接種し、そして震盪しながら
１８〜２４時間インキュベーションした。培養物をソー
バル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＧＳ３ローター中で５００×ｇ
で３０分間遠心することによって収穫した。細胞の沈澱
を２００ｍｌの０．００１モルのヘペス緩衝液ｐＨ７．
２の中に再懸濁し、そして０．００１モルヘペス緩衝液
中のでさらに２ラウンド洗浄した。最後に、細胞を２０
ｍｌの１２％ｎｏグリセロールを含有する０．００１モ
ルのヘペス緩衝液の中に再懸濁した。細胞を凍結し、そ
して−７０℃に保持した。洗浄の間、細胞を０℃に維持
した。ＤＮＡのエレクトポレイションのために、適当な
量のＤＮＡ（１０μｇまでの）を４５０μｌの融解した
細胞の懸濁液に添加し、そして混合物を３３．６キロボ
ルト／ｃｍの電気パルスに３８０マイクロセカンドの期
間の間暴露した。エレクトポレイション直後に、細胞を
１ｍｌの非補充ＣＬ培地中で希釈し、そして３７℃にお
いて１時間インキュベーションした後、２５μｇ／ｍｌ
のカナマイシンまたは５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含有するＢＧ血液寒天プレート上にプレイティングし
た。
【００６２】ｉ）ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ）の染色体ＤＮＡのサザンブロッティング ６００μｌの０．５％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ
のプロテイナーゼＫを含有するＴＥ中でバクテリアを溶
解することによって、候補のクローンの５ｍｌの一夜の
培養物から染色体のＤＮＡを調製した。０．７モルのＮ
ａＣｌ中の１％のセチルトリメチルアンモニウムブロミ
ド（ＣＴＡＢ）を添加し、次いでクロロホルム／イソア
ミルアルコールで抽出することによって、細胞壁の破片
および多糖類を除去した。染色体のＤＮＡをイソアミル
ルコールで沈澱させ、沈澱させ、乾燥し、そしてＴＥ中
に溶解した。染色体のＤＮＡを適当な制限酵素で消化
し、そして制限したＤＮＡを０．６％のアガロース上の
電気泳動にかけ、そしてナイロン膜に移した。
【００６３】ＤＮＡのプローブを、ＣｓＣｌ精製したプ
ラスミドの調製物から、ジゴキシゲニン標識したデオキ
シウリジントリホスフェートのランダムプライムド組み
込みにより標識することによって調製した。ハイブリダ
イゼーションの条件的は、モレキュラー・クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）［マニアチス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．ら、コールド・スプリング・
ハーバー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、１
９８２］に記載されている手順に従い開発した。ジゴキ
シゲニン標識し、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡの
検出は、供給者［ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］に従った。
【００６４】実施例１ 修飾したトランスポジションの機能を含有するプラスミ
ドベクターの構成 図２に示すように、ｐＮＫ１２１０を構成体の構成にお
いて親プラスミドベクターとして使用して、ＤＮＡ配列
（例えば、発現遺伝子）をグラム陰性バクテリアの染色
体の中に安定に挿入した。ｐＮＫ１２１０はｔａｃプロ
モーターコントロールしたトランスポゼース、Ｔｎ１０
の逆向き反復配列およびクロランフェニコールアセチル
トランスフェラーゼをエンコードする遺伝子を含有す
る。ｐＮＫ１２１０は、ｐＮＫ８６１［ワイ（Ｗａｙ）
ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）３２３６９−３７９（１９８
４）］から、ＫａｎR決定因子をＴｎ９からのＣｍR遺伝
子を有する１３７５ｂｐ断片と置換することによって、
誘導した。Ｔｎ１０の自然の逆向き反復配列を除去し、
そして単一のクローニング部位をフランキングするＴｎ
１０の右末端の末端の３１塩基対からなる逆向き反復配
列を特定するオリゴヌクレオチドでそれらを置換して、
プラスミドｐＰＸ１５６９を生成することによって、こ
の構成体を修飾した（図３Ａ）。第２オリゴヌクレオチ
ドのリンカー（図３Ｂ）を挿入して、いくつかのクロー
ニング部位をもつプラスミド（ｐＰＸ１５７２）を生成
し、これをさらにＴｎ５のＫａｎR決定因子をｐＰＸ１
５７２のＸｈｏＩ部位の中に挿入することによって修飾
した。この立体配置において、逆向き反復配列によりフ
ランキングされたクローニング部位の中に遺伝子は活性
トランスポゼースの存在下に転移することができる。
【００６５】接合のアッセイを実施して、ｐＰＸ１５７
５の３１５塩基対の合成オリゴヌクレオチド誘導逆向き
反復配列がトランスポゼースの基質として作用し、そし
てトランスポジションの事象を生ずることを評価した。
ｐＰＸ１５７５をＦ１１２／Ｃ６００の中に形質転換
し、引き続いてこれをＩＲＴＧによるトランスポゼース
機能の誘発に従いＥ．ｃｏｌｉ ＫＢＴ００１と接合し
た。ＫＢＴ００１のＭａｌ+またはＫａｎRのエキソコン
ジュガント（ｅｘｏｃｏｎｊｕｇａｎｔ）の選択は、ほ
ぼ１０-3のＭａｌ+エキソコンジュガントが、また、Ｋ
ａｎRおよびＡｍｐSであり、そして１００／１００Ｋａ
ｎRエキソコンジュガントがＭａｌ+であることを明らか
にした。逆向き反復配列を欠如する同様なベクターで形
質転換したＦ１１２／Ｃ６００を使用して実施した同様
な実験は、Ｍａｌ+を生じたが、ＫａｎRエキソコンジュ
ガントを生じなかった。これらの結果が示すように、Ｋ
ａｎR決定因子はＦ因子上に転移されており、そして３
１塩基対の逆向き反復配列は、期待するように、トラン
スポゼースのための基質である。
【００６６】実施例２ サルモネラ属におけるトランスポジションのバクテリオ
ファージλ自殺ベクター 自殺受け渡し（ｓｕｉｃｉｄｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）
は、ここで使用するとき、レシピエント中で複製するこ
とができないＤＮＡ構成体を経るトランスポゾンの導入
を意味する。ＣｏｌＥ１−、ｐ１５ａ−およびｐＳＣ１
０１−に基づくプラスミドベクターは、ネズミチフス菌
（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびほとんどの他の
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種中で自由に複
製する。それ自体として、これらのベクターはサルモネ
ラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）中の修飾されたトランス
ポゾンの自殺受け渡しに適当ではない。他方において、
ラムダＤＮＡの転写のλＮタンパク質依存性抗ターミネ
ーションに要求されるｎｕｓＡ、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ宿
主機能、およびλファージのアタッチメントに要求され
る、ｌａｍＢが存在しないかぎり、バクテリオファージ
λは溶解的生長（ｌｙｔｉｃ ｇｒｏｗｔｈ）を行わな
いであろう。さらに、λファージは、ｎｕｓＡ遺伝子産
生物を必要とするために、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）を溶原化したん［ハルッキ（Ｈａｒ
ｋｋｉ）、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）２０９：
６０７−６１１（１９８７）］。こうして、λファージ
ベヒクルはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）中で
増殖せず、そしてｌａｍＢ遺伝子産生物（ファージλの
ための外膜レセプター）が準備される場合、この宿主の
トランスポゾン突然変異誘発のための自殺受け渡しベヒ
クルとして使用することができる。表Ｉに下に示すよう
に、広く研究したλｇ１１株またはλＮＭ８１６のいず
れから誘導された、１系列のバクテリオファージλ株
を、Ｆ１１２ｄＴｎ１０（ｃｍ）接合的プラスミドを有
する、いくつかのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ）株上でプラークを形成する（すなわち、溶解的生長
を行う）能力について試験した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１
０６１上でプラークを形成することができるが、ファー
ジはいずれも種々のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ）株上でプラークを形成することができない。ファー
ジ（それらのすべてはｎｉｎ5欠失を有する）はｌａｍ
Ｂ+サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）［ハルッキ
（Ｈａｒｋｋｉ）、モレキュラー・アンド・ジェネラル
・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）
２０９：６０７−６１１（１９８７）］上でプラークを
形成しない理由は理解されない。トランスポゼース認識
配列およびトランスポゼース機能を有する、これらのバ
クテリオファージの修飾された変異型を、自殺受け渡し
系として使用することができる。
【００６７】
【表１】 表１ サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびＥ．ｃｏｌｉ上のバクテリオファ ージλのプレイティング効率 S. S. S. typhimurium typhimurium typhi E.Coli F112cm/ F112cm/ F112cm/ MC1061 LB5010 SL3261 Ty523 λgt11 1×1010 ＜20 ＜20 ＜20 λNM816 1×1010 ＜20 ＜20 ＜20 λPB1003 5×109 ＜20 ＜20 ＜20 λPB1031 7×109 ＜20 ＜20 ＜20 λPB1053'4 3×109 ＜20 ＜20 ＜20 λPB1071,2 1×109 ＜20 ＜20 ＜20 注：1 λＮＭ８１６の誘導体2 プラスモディウム・ベルグヘイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅ
ｉ）ＣＳタンパク質のための特殊化された転移性および
形質導入性ファージ3 λｇ１１の誘導体4 ＬＴ−Ｂのための特殊化された形質導入性ファージ 図４に記載する両者のλファージを修飾して、トランス
ポゼース機能および選択可能なマーカーをフランキング
するＴｎ１０逆向き反復配列を含有させた。ｔａｃプロ
モーターでコントロールされたトランスポゼース遺伝
子、Ｔｎ１０の逆向き反復配列およびクロランフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼを含有するｐＮＫ１２
１０からのＤＮＡの５．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、λ
ｇ１１のＥｃｏＲＩ部位の中にクローニングすることに
よって、λＰＢ１００を構成した。ＣｍRリソゲンを
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０８８中で選択し、ここでトランス
ポゼースはプラスミドｐＭＣ９上に含有されるｌａｃｉ
遺伝子産生物により抑制することができる。λＰＢ１０
０は２ｋｂまでの外部のＤＮＡの挿入を収容することが
できる。
【００６８】類似の方法必要に応じて、ｔａｃコントロ
ールされたトランスポゼース、Ｔｎ５からのＫａｎR決
定因子をフランキングするＴｎ１０から誘導された３１
塩基対の逆向き反復配列および多重クローニング部位を
含有するｐＰＸ１５７５の５．２ｋｇのＥｃｏＲＩ断片
を、λＮＭ８１６の中にサブクローニングして、ｌａｃ
ＵＶ５スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）断片を生ずる
させることによって、λＰＢ１０３を構成した。ＭＣ１
０６１（ｐＭＣ９）のＫａｎRリソゲンを選択した。λ
ＰＢ１０３は７ｋｂまでの外部のＤＮＡを収容すること
ができる。
【００６９】このようなλファージのベクターは、部位
特異的組み換えおよびトランスポジションのための基質
である逆向き反復配列の外側にトランスポゼース遺伝子
を含有し、Ｅ．ｃｏｌｉ中のファージ粒子を形質導入す
る鋳型として作用するばかりでなく、かつまた逆向き反
復配列内に含有されるＤＮＡ（例えば、発現可能な遺伝
子）のトランスポジションを触媒するであろう。トラン
スポゼース遺伝子は逆向き反復配列の外側に存在するの
で、挿入は安定化されることができる。このようなファ
ージはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｌａｍＢ
+または他のｌａｍＢ+のレシピエント中で、溶解的にま
たはリソゲンとして、増殖することができないので、フ
ァージおよび結局トランスポゼースタンパク質は細胞分
割のプロセスを通して希釈される。トランスポゼースタ
ンパク質の濃度が減少するにつれて、ファージからバク
テリアの染色体へ転移したトランスポゾンは安定化され
るであろう。
【００７０】ＤＮＡ配列（例えば、発現可能な遺伝子）
は、バクテリオファージのベクター、例えば、図４に示
すベクターの逆向き反復配列の間に導入することができ
る。これを達成することができる１つの方法は、図５に
概略的に示すように、プラスミド−ファージのトランス
ポゾンの交換による。ＤＮＡ配列（例えば、発現可能な
遺伝子）は、選択可能なマーカーおよび発現可能な遺伝
子が逆向き反復配列によりフランキングされるように、
プラスミドのベヒクル（例えば、ｐＰＸ１５７５）の中
にクローニングされる。図４に描写される型のファージ
について溶原的である、宿主細胞において、プラスミド
およびリソゲン的ファージの逆向き反復配列の間の部位
特異的組み換えまたはトランスポジションは、発現可能
な遺伝子およびプラスミドからの選択可能なマーカーを
含有するリソゲンをある比率で生ずるであろう。交換の
事象を有する、小さい比率のファージは、本来プラスミ
ドに関連する選択可能なマーカーを有するリソゲンにつ
いて選択することによって、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主中で選択
することができる。選択されない発現可能な遺伝子はこ
のマーカーと連鎖する。
【００７１】実施例３ トランスポゼース認識配列によりフランキングされた発
現可能なＥ．ｃｏｌｉ遺伝子のプラスミド／ファージの
交換 ＬＴ−Ｂはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種中
で発現することができ、そしてサルモネラ属（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ）の生弱毒化ワクチン株中で発現しそして
投与するとき、マウスにおいて免疫原性であることが証
明された。
【００７２】図７は、エンテロトキシン発生性Ｅ．ｃｏ
ｌｉの熱不安定性毒素（ＬＴ−Ｂ）の１１，０００ダル
トンのＢサブユニットをエンコードするＤＮＡ配列を有
する、転移可能な遺伝子のカセットの構成を示す。無毒
のサブユニットを特定する遺伝子は、ＰＸ１００中の６
００塩基対のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片上に局在
化し、ここでＬＴ−Ｂの発現はｌａｃプロモーターによ
りコントロールされ、遺伝子の配列はレオン（Ｌｅｏｎ
ｇ）ら［インフェクション・アンド・イミュニイー（Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）４８：７３−７７（１９８
５）のデータに対応した。ＬＴ−Ｂ解読配列およびｌａ
ｃプロモーターを含有する８００塩基対のＨａｅＩＩ断
片を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片の作用によ
り平滑末端とされた、ｐＰＸ１５７５のＢａｍＨＩ部位
の中にサブクローニングした。λＰＢ１０３をｌｔｐト
ランスポジションプラスミドｐＰＸ１５７９を含有する
ＪＭ１０３の中に組み込んだ。生ずるリソゲンをＩＰＴ
Ｇの添加により誘発して転移させ、そしてファージ手順
の産生を温度ショックにより誘発させた。ＪＭ１０３の
ＫａｎR、ＣｍS、リソゲンを選択した。
【００７３】ＫａｎR形質導入体のクローンのほぼ２５
％はまたＣｍRであり、これにより示唆されるように、
それらは二重のリソゲンであるか、あるいは両者を収容
する単一のリソゲンを含有した。ＫａｎR、ＣｍRのクロ
ーンは、逆向き反復配列によりフランキングされた遺伝
子とλＰＢ１００リソゲンの逆向き反復配列との交換に
より発生したと考えられる。ＫａｎR決定因子を使用し
て推定上の交換について選択したが、ＫａｎRクローン
のすべては、また、ＩＰＴＧおよび温度の誘発後、コロ
ニーブロットの分析によりＬＴ−Ｂを発現した。この結
果が示唆するように、選択されない遺伝子の発現カセッ
ト（ＬＴ−Ｂ）は、薬物抵抗性マーカーで予測されるよ
うに、同時転移された。生ずるＫａｎRリソゲンの１つ
を選択し、そして４２℃におけるファージのストック
（λＰＢ１０５）を使用して、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈ
ｉ）を感染させた。前述したように、このような構成体
は自殺受け渡し系として働く。λＰＢ１０５構成体は、
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）中で、溶解的
に、あるいはリソゲンとして、増殖することができな
い。しかしながら、トランスポゼース遺伝子は発現可能
であり、そして実施例４に記載するように、ＬＴ−Ｂ遺
伝子は遺伝子のカセットでサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ）染色体に転移することができる。
【００７４】実施例４ サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のトランスポジ
ション ａ）ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）お
よびチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）中のトランスポジショ
ンの事象の選択 図８に示す一般的反応の概要に従い、いくつかの特殊化
された形質導入性ファージを使用して、ネズミチフス菌
（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）Ｆ１１２ｄＴｎ１０
（ｃｍ）／ＬＢ５０１０（ｌａｍＢ+）またはチフス菌
（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）Ｆ１１２ｄＴｎ１０（ｃｍ）／Ｔｙ
５２３を薬物抵抗性に形質導入した。表ＩＩはλＰＢ１
０５を使用して得られた結果を示す。形質導入性λファ
ージで感染後、ＫａｎRサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ）コロニーを数えることによって、トランスポジ
ションの頻度を決定した。０．５％のマルトースの存在
下に対数中期に生長させてバクテリオファージλレセプ
ターを誘発した、２×１０8レシピエントサルモネラ属
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の細胞と、示したｍ．ｏ．
ｉ．において、λＰＢ１０５を混合した。感染した細胞
を３７℃において１．５時間インキュベーションして、
ＫａｎRを発現させた後、プレイティングした。
【００７５】表ＩＩに示すように、薬物抵抗性ネズミチ
フス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）はｌａｍＢ+中
でのみ得られたが、ｌａｍＢ-のネズミチフス菌（Ｓ．
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）中で得られなかった。λファ
ージの各々について、薬物抵抗性はネズミチフス菌
（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）Ｆ１１２ｄＴｎ１０
（ｃｍ）／ＬＢ５０１０中で０．２の活性ファージ粒子
のｍ．ｏ．ｉ．において１０-4までの頻度で発生し、そ
してチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）Ｆ１１２ｄＴｎ１０
（ｃｍ）／Ｔｙ５２３中では頻度が低かった。
【００７６】
【表２】 表ＩＩ 異種遺伝子の発現カセットを有する特殊化された転移性ファージを 使用するサルモネラ属(Salmonella)中のトランスポジション ドナーバクテリオファージ レシピエントサルモネラ属株＊ F112cm/ F112cm/λPB105 LB5010 LB5010 Ty523 Ty523 m.o.i.＝2 4.0×10-6 ＜1×10-8 5.2×10-7 ＜1×10-8 m.o.i.＝2 1.0×10-4 ＜1×10-8 4.0×10-7 ＜1×10-8 m.o.i.＝2 1.2×10-6 ＜1×10-8 1.0×10-8 ＜1×10-8 ファージなし 1.0×10-4 ＜1×10-8 1.0×10-8 ＜1×10-8 ｂ）染色体のインサートの特性決定 λＰＢ１０５で感染後生ずるネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＢ５０１０（ｌａｍＢ+）のＫ
ａｎRクローンを、サザンブロット分析により、選択さ
れなかったマーカーの発現および染色体の位置について
特性決定した。ビオチニル化ｐＰＸ１５７９ＤＮＡでプ
ロービングしたＫｐｎＩ消化染色体ＤＮＡのサザンブロ
ットにおいて、各クローンはネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）染色体中のランダム座にトランス
ポゾンの単一のコピーを有するので、ＫａｎRクローン
の各々は別々のトランスポジションの事象から生ずるこ
とが明らかにされた。ＬＴ−Ｂ抗原の発現はｌａｃＵＶ
５プロモーターによりコントロールされ、このプロモー
ターは、ラクトース代謝遺伝子を欠くサルモネラ属（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ）の中に導入されるとき、コントロ
ールされない。１つのクローンはとくに残りの９つの分
析したクローンより多くの抗原を発現し、これにより示
唆されるように、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ）の染色体の中にランダムに組み込まれた外来遺伝子
の発現に対して位置の効果が存在し得る。 ｃ）組み込まれた遺伝子を発現する弱毒化サルモネラ属
のワクチン株 ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２
誘導体ＬＢ５０１０は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ）中の遺伝子の操作のために便利ないくつかの特
徴を有する。ＬＢ５０１０はプラスミドＤＮＡで高い頻
度で形質転換することができそして、その制限の欠乏の
ために、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増殖したＤＮＡを受け入れる
ことができる。しかしながら、それはそれ自体ワクチン
の候補の株ではない。生弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ）のワクチンの候補をつくるために、ファ
ージＰ２２ ＨＴ ｉｎｔ１０５を、ＬＴ−Ｂを発現す
る修飾されたトランスポゾンを含有するＦ１１２ｄＴｎ
１０（ｃｍ）／ＬＢ５０１０誘導体上で増殖させ、そし
てａｒｏＡ欠乏サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）
のいくつかの種をＫａｎRに形質導入するために使用し
た。チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ５２３、サルモネ
ラ・ズブリン（Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ１４３８、およ
びネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＳＬ
３２６１が得られた。異なる種の形質導入体の各々は、
ＬＴ−Ｂを発現することが実証されそして、さらに、Ｌ
Ｔ−ＢがＬＢ５０１０組み込まれる位置が抗原の増大し
た発現を生ずる場合、増大された抗原の発現が、また、
形質導入体において観測された。これが示すように、相
同性の組み換えに依存する、挿入されたＬＴ−Ｂの発現
カセットが、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の
他の種中の同一座の中に形質導入される可能性が存在す
る。
【００７７】別の受け渡し系として、ＬＴ−Ｂトランス
ポゾンを、温度感受性Ｆ’因子を使用して、いくつかの
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種の中に組み込
んだ。温度感受性Ｆ’因子は、サルモネラ属（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ）を包含する、制限された数のグラム陰性
バクテリアの種中で、低温において、複製するが、高温
において複製することができない。トランスポゼース機
能を供給するために完全なＴｎ１０、ラクトースのオペ
ロン、およびＫａｎRＬＴ−Ｂトランスポゾンを含有す
る温度感受性Ｆ’因子を、Ｅ．ｃｏｌｉから分離し、次
いでＥ．ｃｏｌｉからの接合およびＴｅｔRについての
選択および低温におけるラクトースの利用により、ネズ
ミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＢ５０１
０の中に導入した。ＫａｎRＬＴ−Ｂトランスポゾン
を、まず、Ｅ．ｃｏｌｉ中で、Ｆ’tsｌａｃＴｎ１０株
をプラスミドｐＰＸ１５７９で形質転換することによっ
て構成した。Ｆ’因子へのＬＴ−Ｂのトランスポジショ
ンをＩＰＴＧで誘発し、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＫＢＴ０
０１との接合において、ＫａｎR、ＴｅｔR、Ｌａｃ+の
エキソコンジュガントを選択した。引き続いて、欠陥の
あるＬＴ−Ｂを有するＦ’tsｌａｃＴｎ１０を、接合に
より、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
ＬＢ５０１０の中に導入した。次いで、ネズミチフス菌
（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＢ５０１０中のＦ’
因子を、接合により、チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ
５２３［サルモネラ・ズブリン（Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ）Ｓ
Ｌ１４３８］およびネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）ＳＬ３２６１の中に導入し、ＫａｎRＴｅ
ｔRＬａｃ+エキソコンジュガントについて選択しそして
ＬＢ５０１０ドナー株に対してカウンターセレクション
した。ＬＴ−Ｂトランスポジション事象を、高温（４２
℃）において薬物の選択を欠くブロスの４０世代後、Ｌ
ａｃ-、ＫａｎR、ＴｅｔRクローンを選択することによ
って、これらの株の各々において選択した。分離により
Ｆ’因子を損失したと推定される、ＫａｎRＴｅｔS、Ｌ
ａｃ-因子のすべては、ＬＴ−Ｂ抗原についてコロニー
のブロットにより決定して、ＬＴ−Ｂを発現した。温度
感受性Ｆ’因子からの修飾されたトランスポゾンのトラ
ンスポジションは、Ｆ’因子上にまた位置するＴｎ１０
により供給されるトランスポゼースに依存する。
【００７８】ｄ）トランスポジションの安定性 Ｔｎ１０の右の逆向き反復配列内で通常エンコードされ
るトランスポゼース因子は存在しないので、修飾された
トランスポゾンは他の座に再転移しない。さらに、サル
モネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）中のトランスポジシ
ョンは安定である。なぜなら、多数のＥ．ｃｏｌｉ株に
おいて検出された、ＩＳ１０因子（すなわち、構成体の
トランスポゼース遺伝子でない）はネズミチフス菌（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）におい
てこれまで検出されてきてないからである［クレックナ
ー（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ）ら、モウバイル（Ｍｏｂｉｌ
ｅ）ＤＮＡ、ＡＳＭパブリケイション、ワシントンＤＣ
（１９８９）］。さらに、安定なトランスポジションの
事象は遺伝子の発現を生じ、この遺伝子の発現は、同一
の遺伝子のコピーを有するプラスミドと比較して、固有
に安定であり、前記コピーは、プラスミドの自然の分離
のために、あるいは遺伝子の発現の悪影響によるプラス
ミドの損失についての選択のために、陽性の選択の不存
在下に損失されることがある。
【００７９】トランスポゾンを発現するＬＴ−Ｂの安定
性を試験するために、１つのＳＬ３２６１分離物、Ｆ１
１２ｄＴｎ１０（ｃｍ）／ＬＢ５０１０（λ３）からの
ＫａｎR分離体のＰ２２形質導入により分離されたλ３
を、表ＩＩＩに示すように、４０世代のためのカナマイ
シンを欠如するＬブロス中で生長させた。比較するため
に、ｐＰＸ１００／ＳＬ３２６１（ＬＴ−Ｂを発現する
ｐＵＣ８プラスミド誘導体）およびｐＵＣ８／ＳＬ３２
６１を、また、ＬＢ中の４０世代のためのアンピシリン
選択なしで生長させた。第１実施例において、ＳＬ３２
６１（λ３）の培養物から、ＬＢ寒天培地上で生ずるコ
ロニーの１００％はＫａｎRであり、そしてＬＴ−Ｂ抗
原を発現した；同様に、カナマイシンを含有するか、あ
るいはそれを欠如するＬＢ上で直接プレイティングする
ことによって、回収することができるクローンの数の差
は存在しなかった。他方において、薬物の選択なしの生
長の４０世代後、ＬＢ培地上で生ずるｐＰＸ１００／Ｓ
Ｌ３２６１培養物からのコロニーのわずかに３％、およ
び直接プレイティングにより、ＬＢ寒天上で生長するこ
とができるコロニーのわずかに３％が、アンピシリンを
含有するＬＢ寒天上で回収可能であった。さらに、ｐＰ
Ｘ１００／ＳＬ３２６１に関して、λ３の培養物中のＬ
Ｔ−Ｂの遺伝子の発現の明らかな減少は存在しなかっ
た。これが示すように、トランスポジションの事象は、
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の弱毒化ワクチ
ン中の培養条件下に、選択なしに、安定な発現を生じ
た。
【００８０】
【表３】 表ＩＩＩ ＬＴ−Ｂ発現プラスミド対染色体的に組み込まれたＬＴ−Ｂの安定性 ４０世代の継代培養後の培養条件下にの保持％ バクテリアの株 （ＬＴ−Ｂの発現の％） 規定された培地 規定された培地＋薬物 pUC8/SL3261 95％(N/A) 100％ pPX100/SL3261 3％(3％) 100％ SL3261λ3 100％(100％) 100％ ｅ）ＬＴ−Ｂを含有するサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ）のワクチン株の遺伝子の発現の安定性 １０9バクテリア／ｏｓ（経口的）の１回の投与でＢａ
ｌｂ／ｃマウスを免疫化した後、ＳＬ３２６１、ネズミ
チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のａｒｏＡワ
クチン株の分離した形質導入体をＬＴ−Ｂの発現の保持
について検査した。対照として、マウスの別の群を１０
9のｐＵＣ８／ＳＬ３２６１または１０9のｐＰＸ１００
／ＳＬ３２６１で経口的に免疫化した。免疫化したマウ
スから得られた、分離した肝臓、脾臓またはリンパ節か
らサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を培養し、そ
してプラスミドを含有する有機体または安定なトランス
ポゾンを含有する有機体の個体数を決定した。
【００８１】表ＩＶに示すように、ｐＵＣ８／ＳＬ３２
６１またはｐＰＸ１００／ＳＬ３２６１で免疫化したマ
ウスの組織のホモジネートから、非常にわずかのサルモ
ネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）が得られ、そしてそれ
のうちで、小さい百分率はもとのワクチン接種投与量の
プラスミドを含有することが実証された。腸を取り囲む
いくつかのリンパ節を、Ｂａｌｂ／ｃマウスを１０9バ
クテリアで経口的にワクチン接種後１０日または１５日
に、ワクチン接種した動物の各々から切除した。リンパ
節の試料をホモジネーションし、そして二重反復試験の
試料をＬＢまたはＬＢ+選択的薬物培地上でプレイティ
ングした。さらに、非選択的培地上で生ずるレプリカの
プレイティングコロニーにより、薬物抵抗性のコロニー
の比率を決定した。他方において、１０9のＳＬ３２６
１（λ３）で経口的に免疫化したマウスは、ワクチン接
種後３日、１０日および１５日にＫａｎR有機体を含有
した。さらに、非選択的培地上で器官の試料をプレイテ
ィングすることによって得られたバクテリアのコロニー
の１００％はＫａｎRであり、そして２０のＫａｎR分離
物のランダム試験はＬＴ−Ｂ抗原の発現を示した。これ
らの結果が示すように、抗原をエンコードする発現カセ
ットの単一のコピーの組み込みは、同一の発現カセット
のプラスミドを有するコピーに関して、サルモネラ属
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の生ワクチンの株において、
発現を安定化することができる。
【００８２】
【表４】 表ＩＩＩ マウスの経口的ワクチン接種後の組み込まれた形態のＬＴ−Ｂの安定性 １０日 １５日 生ワクチンの株 動物 合計 薬物R ％ 合計 薬物R ％ pCU8/SL3261 1 2 2 100 1 1 100 2 0 0 - 0 0 - 3 1 1 100 158 3 2 pPX100/SL3261 1 3 3 100 59 0 0 2 36 0 0 44 0 0 3 360 0 0 0 0 - SL3261λ3 1 612 612 100 0 0 - 2 360 360 100 103 103 100 3 456 456 100 102 102 100 ｆ）別のプロモーターおよび遺伝子の調節シグナルを含
有する発現カセットのトランスポジション ＬＴ−Ｂ抗原の安定な組み込みについて上に表した実施
例において使用した方法を他のタンパク質に一般に適用
することができ、前記タンパク質の発現は、遺伝子の発
現のレベルを増強することができる、種々の遺伝子の調
節シグナルによりコントロールすることができる。タン
パク質の発現またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ）の生ワクチンの株中の使用のために遺伝子の挿入を
つくるこの方法の実用性のいくつかの実施例を提供する
ために、バクテリオファージλの強い左側のプロモータ
ー（ＰL）を含有する遺伝子の発現のカセットをｐＰＸ
１５７５の中に組み込み、そしてλＰＢ１０４をプラス
ミド−ファージＴｎ交換により得られた。
【００８３】同様に、図６に示すように、ネズミのマラ
リアの寄生体、プラスモディウム・ベルグヘイ（Ｐｌａ
ｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ）からの保護的表面抗
原（ＣＳタンパク質）をＰL発現ベクター中で発現し
た。１系列のプラスミドの構成を実施し、ここでプラス
モディウム・ベルグヘイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）ＣＳ遺
伝子をＰLプロモーターの発現ベクターｐＰＸ１６００
の中に挿入した。プラスモディウム・ベルグヘイ（Ｐ．
ｂｅｒｇｈｅｉ）ＣＳタンパク質のための遺伝子の配列
は、エイチンガー（Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒ）ら［モレキュ
ラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．）６：３９６５−３９７２（１９８
６）］。ＣＳ遺伝子の発現のためのカセットは、２．３
ｋｂのＢａｍＨＩ制限断片上に含有され、この断片をト
ランスポジションベクターｐＰＸ１５７５のＢａｍＨＩ
部位の中にサブクローニングした。生ずるプラスミドを
λＰＢ１０４について溶解的な宿主株の中に形質転換し
た。λＰＢ１０４はλＰＢ１０３からＰＮＫ１２１０の
ＣｍRとの交換により誘導した。プラスミドが位置する
ＫａｎR決定因子を交換したファージの粒子を、発現さ
れたＣＳ遺伝子を有するＫａｎR、ＣｍRリソゲンとして
選択した。ｐＰＸ１５７５の中に組み込まれたＣＳタン
パク質はλＰＢ１０７を生じた。
【００８４】ＰＬプロモーターおよびｌａｃ ＵＶ５プ
ロモーターが表される、宿主Ｅ．ｃｏｌｉ株を得るため
に、ｐＢＲ３２２プラスミドの中にｌａｃｉ遺伝子を含
有する、プラスミドｐＭｃ９をＥ．ｃｏｌｉ Ｎ９９ｃ
Ｉ+の中に形質転換するか、あるいはλｇ１１をＪＭ１
０３またはＪＭ１０９の中に溶原化した。ｐＰＸ１５７
５中のプラスモディウム・ベルグヘイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈ
ｅｉ）ＣＳの発現のための初期のプラスミドの構成体を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０３（λｇ１１）中で回収して、
ｔａｃプロモーターによるトランスポジションの機能の
発現およびＥ．ｃｏｌｉ中のＣＳタンパク質のＰＬ−促
進された発現の可能な悪影響の両者をコントロールし
た。ＣＳタンパク質の発現カセットを収容するｐＰＸ１
５７５を、λＰＢ１０３で溶原化して、交換反応のため
のλｇ１１およびλＰＢ１０３について二重に溶原性の
株をつくる。ＪＭ１０３のλＰＢ１０３リソゲンは、λ
ＰＢ１０３はファージ２１免疫性領域を含有するので、
ＰＬプロモーターによりコントロールされた遺伝子の発
現を抑制するために適当な宿主ではないであろう。二重
のリソゲンは候補の培養物の温度のシフトによるファー
ジの機能のために誘発され、そしてＫａｎRリソゲンは
Ｎ９９ｃＩ+（ｐＭＣ９）において選択した。ＫａｎRお
よびＣｍRであるリソゲンは候補として保持され、そし
てプラスミドを有するＰL発現カセット、および合成逆
向き反復配列によりフランキングされる選択可能なマー
カーをλＰＢ１０３の逆向き反復領域と交換することに
よって、生じたと推定された。
【００８５】ｇ）特殊化された転移ファージ系統を直接
発生するためのバクテリオファージλクローニングベヒ
クル リソゲン−プラスミドトランスポゾンの交換よりむしろ
標準のスプライシング技術を使用して、発現された遺伝
子を他の有機体の染色体の中に直接挿入するために、直
接使用できるλファージの発生に適当なクローニングベ
クターである、λｇ１１およびλＮＭ８１６をつくる。
これは次のようにして達成される。ｐＵＣ１８のｌａｃ
α領域をｐＰＸ１５７５のＢａｍＨＩ部位の中にサブク
ローニングし、次いでｐＵＣ１８ポリリンカー領域のＸ
ｂａＩ部位の中にリンカーをクローニングする。このよ
うなリンカーは、ｌａｃαペプチドのインフレームリー
ドスルーおよび、例えば、そうでなければバクテリオフ
ァージλの中に存在しないＮｏｔＩ、ＳｆｉＩおよびＳ
ｐｅＩのいずれかまたはすべてをエンコードすることが
できる。修飾したｐＵＣ１８ポリリンカー領域は、４０
０ｂｐのＨａｅＩＩ断片として、ｐＰＸ１５７５のフィ
ルドアウト（ｆｉｌｌｅｄ ｏｕｔ）ＢａｍＨＩ部位の
中にサブクローニングすることができる。この修飾した
ｐＵＣ１８領域をλＰＢ１００（λｇ１１誘導体）また
はλＰＢ１０３（λＮＭ８１６誘導体）の交換により、
λクローニングベヒクルを発生し、こうして高い頻度の
溶原化を可能とするｆｈｌ突然変異が存在するかぎり、
タンパク質の発現についてスクリーニングするか、ある
いはＪＭ１０３またはＪＭ１０９の遺伝的バックグラウ
ンド中のｌａｃα機能の妨害によるクローニングされた
ＤＮＡの挿入についてスクリーニングすることによっ
て、抗原またはタンパク質は３つの独特クローニング部
位の任意のものの中に適当なアダプターまたはリンカー
を使用してクローニングすることができる。生ずるファ
ージは、別の発現工程を必要としないで、独特の生ワク
チンの株の構成に直接使用することができる。
【００８６】前述のものに類似するバクテリオファージ
ラムダを分離し、そして特性決定した。バクテリオファ
ージλＰＢ１１３を、前述したようにプラスミド−リソ
ゲンの交換により、プラスミドベヒクルとしてｐＰＸ１
５９１およびリソゲンとしてλＰＢ１０４を使用して分
離した。バクテリオファージλＰＢ１０４はλＰＢ１０
３から、カナマイシン抵抗性をクロランフェニコール抵
抗性と交換することによって誘導した。こうして、λＰ
Ｂ１０４は、クロランフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子をフランキングするＴｎ１０の逆向き反
復配列の外側に位置するｔａｃプロモーターによりコン
トロールされる、Ｔｎ１０トランスポゼースを含有する
λＮＭ８１６の誘導体である。ｐＰＸ１５９１は次のよ
うにして分離した。Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端とした
ｐＵＣ１８から分離した、４００ｂｐのＨａｅＩＩ断片
を、ｐＰＸ１５７５のクレノー酵素処理したＢａｍＨＩ
部位の中にクローニングした。この中間体のベクター、
ｐＰＸ１５７７と呼ぶ、は、ｌａｃαペプチドおよび、
Ｔｎ１０の合成３１塩基対の逆向き反復配列によりフラ
ンキングされた、ｐＵＣ１８の多重クローニング部位、
カナマイシン抵抗性決定因子を含有した。このプラスミ
ドをＸｂａＩで消化し、そして、図９に示す、二本鎖の
オリゴヌクレオチドのリンカーを挿入した。
【００８７】このオリゴヌクレオチドは、ｐＰＸ１５７
７のＸｂａＩ部位に図９に示す向きで挿入すると、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＪＭ１０３のｌａｃＺ（Ｍ１５）と相補的で
ある、機能的に活性なｌａｃαペプチドを含有するプラ
スミドを生じた。反対向きにオリゴヌクレオチドのリン
カーを有するコロニーは、非機能的なｌａｃαペプチド
を生じた。生ずるプラスミド、ｐＰＸ１５９１と呼ぶ、
は、独特ＮｏｔＩおよびＳｆｉＩ制限酵素部位を含有し
そして、さらに、リンカーの３’末端において独特Ｘｂ
ａＩ部位を再生した。標準のＭ１３プライマーを使用す
るＤＮＡの配列決定は、挿入されたオリゴヌクレオチド
が示しすように存在したことを明らかにした。λＰＢ１
１３を分離するために、ｐＰＸ１５９１を含有するＥ．
ｃｏｌｉＪＭ１０３を、０．２％のマルトースを含めて
ラムダレセプターについて誘発した対数期のブロス培養
物中で３０℃において、クロランフェニコール抵抗性λ
ＰＢ１０４で感染させた。培養物が後期の対数期に到達
したとき、培養物を４２℃において温度ショックにより
誘発して溶菌した。生ずるファージのリゼイトを使用し
てＪＭ１０３の新鮮な培養物を感染し、引き続いてこれ
をカナマイシン抵抗性リソゲンについて選択し、これは
２００μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天の培
地上でブルーのコロニーを形成した。高い頻度でカナマ
イシン抵抗性を形質導入したリソゲンをλＰＢ１１３と
呼んだ。このバクテリオファージから分離したＤＮＡ
は、バクテリオファージラムダに対して独特であるＮｏ
ｔＩおよびＳｆｉＩ部位を含有する。こうして、λＰＢ
１１３は７ｋｂ程度に大きいＤＮＡ断片を独特ＮｏｔＩ
およびＳｆｉＩ部位の中へのクローニングを可能とする
性質を有し、これはｌａｃα欠失を有するＥ．ｃｏｌｉ
宿主を使用して、Ｘ−ｇａｌを含有する培地上で白色コ
ロニーとして、カナマイシン抵抗性リソゲン中でスクリ
ーニングすることができる。さらに、挿入されたＤＮＡ
がｌａｃαペプチドに関して正しいリーディングフレー
ムの中に存在しかつ適当な開始シグナルを有する場合、
ｌａｃプロモーターはクローニングされ挿入されたＤＮ
Ａの発現を促進する。ファージは追加の性質を有し、ク
ローニングされたＤＮＡインサートは本質的に転移可能
な要素であり、こうして発現されたＤＮＡインサートは
バクテリアの宿主の染色体中の安定な組み込みにより検
査することができる。
【００８８】バクテリオファージλＰＢ１１３を有する
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０３リソゲンは、ナショナル・リ
ージョナル・リサーチ・ラボラトリー（Ｎａｔｉｏｎａ
ｌＲｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）（ＮＲＲＬ）カルチャー・コレクションに受
託され、そして受け入れ番号Ｂ−１８８７１を与えられ
た。
【００８９】実施例５ インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａｅ）のトランスポジション ｐＰＸ１５７５からのＫａｎRのトランスポジションを
インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｒｄ株
ＨＤＧ８５中で試験した。このプラスミドはインフルエ
ンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）において自殺受け
渡し系として作用するであろう。なぜなら、ｃｏｌＥＩ
誘導プラスミドはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ）細胞中で複製しないこと示されたからである
［ダンナー（Ｄａｎｎｅｒ）およびパイファー（Ｐｉｆ
ｅｒ）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１８：１０１−１０５（１
９８２）］。プラスミドＤＮＡをインフルエンザ菌
（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）細胞の中にエレクトポレ
イションを経て導入し、そしてＫａｎR組み換え体を記
録した。図１０において要約するように、ｐＰＸ１５７
５（約１０μｇ）をインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕ
ｅｎｚａｅ）ＨＧＤ８５細胞に添加し、これらを示した
電圧のエレクトポレイションにかけた。エレクトポレイ
ション混合物の１ｍｌ当たりのＫａｎRマイクロコロニ
ーの合計の数をエレクトポレイション電圧に対してプロ
ットした。使用した条件下に、ＨＧＤ８５のＫａｎR誘
導体は約３０キロボルト／ｃｍにおいてＫａｎRへの最
適な形質導入で得られた。
【００９０】インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚ
ａｅ）およびｐＰＸ１５７５のエレクトポレイション混
合物を選択的培地上にプレイティングしたとき、２４時
間後に、多数のマイクロコロニーを見ることができた。
しかしながら、これらのコロニーの大部分はそれ以上の
生長することができず、そしてカナマイシンのプレート
上で二次培養物したとき、再生長しなかった。７２時間
後、これらのマイクロコロニーの１〜２％は明らかに正
常のインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）コ
ロニーに発育した。これらのコロニーから取った細胞は
カナマイシンの選択下で再生長した。細胞をベクターＤ
ＮＡとともにエレクトポレイションしたとき、あるいは
細胞およびｐＰＸ１５７５を混合するが、エレクトポレ
イションにかけなかったとき、マイクロコロニーは観察
されず、そして安定なＫａｎR組み換え体は得られなか
った。
【００９１】実施例６ 百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）におけるトランスポジション ｐＰＸ１５７５の３１塩基対の逆向き反復配列内に含有
されるＫａｎRのトランスポジションは、百日咳菌
（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）株ＢＰ３７０において実証
された。プラスミドＤＮＡはエレクトポレイションによ
りＢＰ３７０の中に導入した。トランスポジションの事
象は、カナマイシンを含有する選択的培地上で、エレク
トポレイションした細胞をプレイティングすることによ
って選択した。ＫａｎRマイクロコロニーは１０5の生存
能力の細胞当たり１より大きい頻度で生じ、そしてプレ
イティング後４８時間以内に選択プレート上で見ること
ができた。これらのコロニーをさらに生長させ、そして
カナマイシンのプレートおよびアンピシリンを含有する
プレート上で再生長について個々に試験して、プラスミ
ドのベヒクルの遺伝について検査した。７５の試験した
ＫａｎRの溶血性コロニーのうちで、いずれもまたＡｍ
ｐRではなかった。同様に、エレクトポレイションした
細胞をアンピシリンを含有する培地上でプレイティング
して、プラスミドベヒクルの一時的遺伝を検査した。選
択プレート上で生ずるＫａｎRコロニーの数は、アンピ
シリンを含有する培地上で生ずるコロニーの数より１０
００倍大きかった。ＡｍｐR形質転換体の低い頻度は、
レシピエント細胞中のプラスミドベヒクルの不安定な遺
伝から生ずる：ＡｍｐRクローンのほぼ１５％は同時に
ＫａｎRであり、レシピエント細胞中のプラスミドの再
配置がＴｎ１０トランスポゼースの発現の結果であるこ
とを示唆する。これらのデータが示すように、ＤＮＡに
よる百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の高い頻度
は、レシピエント細胞内で安定に複製することができな
いが、Ｔｎ１０の３１塩基対内に選択可能な遺伝子物質
が含有されると、逆向き反復ＤＮＡは特異的トランスポ
ジションから生ずる。
【００９２】クローニングベクターのｐＰＸ１５７５ま
たは適当に修飾したその誘導体を使用して、追加の独特
制限酵素部位および前述の他の選択可能なマーカーを含
有させて、修飾された百日咳の毒素のＤＮＡを百日咳菌
（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の染色体の中に直接ランダ
ムに挿入することができる。この考えの理想的応用にお
いて、絶対最小値に遺伝子的に減少するように設計し
た、百日咳毒素のオペロンのＳ１サブユニット中の、特
別に操作した欠失、点、または挿入の突然変異を、その
自然のプロモーターと一緒に、トランスポジションベク
ターの適当なクローニング部位の中にクローニングする
ことができる。すべての宿主の毒素のオペロンの配列を
本質的に欠失した宿主の百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ）の中に、このようなＤＮＡをエレクトポレイショ
ンし、そして同時に遺伝したマーカーについて選択する
ことによって、修飾したオペロンの１または２以上のラ
ンダム挿入を得ることができる。
【００９３】同等の実施態様 当業者は、ここに記載した発明の特定の実施態様と同等
の多くの実施態様を認識するか、あるいは日常の実験を
越えない実験を使用して確証することができるであろ
う。このような同等の実施態様は特許請求の範囲により
包含されることを意図する。
【００９４】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。
【００９５】１、転移可能なカセットに対してシスにお
いて連鎖しているトランスポゼースタンパク質をエンコ
ードする遺伝子からなり、前記カセットはＤＮＡ配列の
挿入のためのクローニング部位をフランキングするが、
トランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝子を
フランキングしない、１対のトランスポゼース認識部位
からなる、原核生物の細胞の構成体のＤＮＡの中にＤＮ
Ａ配列を導入するためのＤＮＡ構成体。
【００９６】２、転移可能なカセットは、さらに、選択
可能なマーカーおよびＤＮＡ配列からなり、両者の選択
可能なマーカーおよびＤＮＡ配列はトランスポゼース認
識部位によりフランキングされている、上記第１項記載
のＤＮＡ構成体。
【００９７】３、ＤＮＡ配列は、バクテリア、ウイル
ス、寄生体、菌類および哺乳動物の源から成る群より選
択される源からの発現可能な遺伝子である、上記第１ま
たは２項記載のＤＮＡ構成体。
【００９８】４、前記対のトランスポゼース認識部位
は、原核生物のトランスポゾンのトランスポゼース認識
配列と同一であるか、あるいはそれに対して実質的に相
同性でありかつ機能的に同等である、上記第１〜３項の
いずれかに記載のＤＮＡ構成体。
【００９９】５、原核生物の細胞はバクテリアであり、
そしてＤＮＡ配列は免疫応答を刺激することができる抗
原をエンコードする、上記第１〜４項のいずれかに記載
のＤＮＡ構成体。
【０１００】６、バクテリアは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エルジニア・エンテロコリチ
カ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃ
ａ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅ
ｘｎｅｒｉ）、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ
ｅ）、カンピロバクテリウム・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙ
ｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｊｕｎｉ）、コレラ菌
（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）、カルメット−ゲラ
ン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒ
ｉｎ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｂｏｖｉｓ）の無毒性突然変異、チフス菌（Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ズブリン（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ）、ネズミチフス菌
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、
トリチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａ
ｒｕｍ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａ
ｒａｔｙｐｈｉ）および豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅ ｓｕｉｓ）から成る群より選
択される弱毒化した腸侵入性バクテリアである、上記第
５項記載のＤＮＡ構成体。
【０１０１】７、エピソームは、 ａ）トランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝
子、 ｂ）トランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝
子に対してシスにおいて連鎖している転移可能なカセッ
ト、前記転移可能なカセットは、多重のクローニング部
位および選択可能なマーカーをフランキングするが、ト
ランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝子をフ
ランキングしない、１対の逆向き反復配列からなる、お
よび ｃ）複製の原核生物の由来に対して実質的に相同性であ
りかつ機能的に同等である、複製の由来を有するレプリ
コン、からなる、原核生物の細胞の構成体のＤＮＡの中
にＤＮＡを導入するためのエピソーム。
【０１０２】８、バクテリオファージ誘導体は、 ａ）トランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝
子、 ｂ）トランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝
子に対してシスにおいて連鎖している転移可能なカセッ
ト、前記転移可能なカセットは、多重のクローニング部
位および選択可能なマーカーをフランキングするが、ト
ランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝子をフ
ランキングしない、１対の逆向き反復配列からなる、お
よび ｃ）複製のバクテリオファージの由来に対して実質的に
相同性でありかつ機能的に同等である、複製の由来を有
するレプリコン、からなる、バクテリオファージの細胞
の構成体のＤＮＡの中にＤＮＡを導入するためのバクテ
リオファージ誘導体。
【０１０３】９、その構成体のＤＮＡの中に、問題の抗
原をエンコードする遺伝子を含有する転移可能なカセッ
ト組み込んで有する、弱毒化されたバクテリアからなる
生ワクチン。
【０１０４】１０、バクテリアは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エルジニア・エンテロコリ
チカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃ
ａ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅ
ｘｎｅｒｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓ
ｅｎｔｅｒｉａｅ）、カンピロバクテリウム・ジェジュ
ニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｊｕｎ
ｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、
カルメット−ゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅ
ｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、およびウシ型結核菌（Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）の無毒性突然変
異、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、
サルモネラ・ズブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂ
ｌｉｎ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、トリチフス菌（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、パラチフス菌（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）および豚コ
レラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｃｈｏｌｅｒａｅ ｓｕ
ｉｓ）から成る群より選択される弱毒化した腸侵入性バ
クテリアである、ヒトに投与するための、上記第９項記
載の生ワクチン。
【０１０５】１１、工程： ａ）ＤＮＡ構成体をトランスポジションに適当な条件下
に原核生物の細胞の中に導入し、前記ＤＮＡ構成体は転
移可能なカセットに対してシスにおいて連鎖したトラン
スポゼースタンパク質をエンコードする遺伝子からな
り、前記カセットはＤＮＡ配列をフランキングする１対
のトランスポゼース認識部位を有し、そして ｂ）構成体のＤＮＡの中に挿入されたＤＮＡ配列を有す
るレシピエント細胞を同定する、 からなる、原核生物の細胞の構成体のＤＮＡの中にＤＮ
Ａ配列を導入する方法。 １２、工程： ａ）ＤＮＡ構成体を原核生物の細胞の中に導入し、前記
ＤＮＡ構成体は、 ｉ）選択可能なマーカーおよびＤＮＡ配列をフランキン
グする１対のトランスポゼース認識部位を有する転移可
能な遺伝子のカセット、 ｉｉ）トランスポゼースカセットに対してシスにおいて
連鎖したトランスポゼースタンパク質をエンコードする
遺伝子、エンコードされたタンパク質はトランスポゼー
ス認識部位を有するベクターおよびレジデントトランス
ポゾンのトランスポゼース認識部位の両者を認識する、 からなり、 ｂ）原核生物の細胞の構成体のＤＮＡの中に前以て決定
した遺伝子座において挿入されたＤＮＡ配列を有する原
核生物の細胞を同定する、からなる、前以て決定した遺
伝子座にレジデントトランスポゾンを含有する原核生物
の細胞の構成体のＤＮＡの中に前以て決定した遺伝子座
においてＤＮＡ配列を導入する方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＤＮＡ構成体の線図的表示である。
【図２】本発明のＤＮＡ構成体の構成における工程を表
す線図である。
【図３】（Ａ）原核生物のトランスポゾンＴｎ１０の左
末端を特定する合成オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列お
よび（Ｂ）合成トランスポゼース認識配列とともに使用
する合成クローニングリンカーのＤＮＡ配列を表す線図
である。
【図４】バクテリオファージλから誘導された本発明の
２つのＤＮＡ構成体を表す線図である。
【図５】プラスミドとバクテリオファージの間のトラン
スポゾン交換反応を表す線図である。
【図６】発現可能なプラスモディウム・ベルグヘイ（Ｐ
ｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ）のサーカムスポ
ロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）遺伝子
を有する、本発明のバクテリオファージに基づくＤＮＡ
構成体の構成における工程を表す線図である。
【図７】発現可能なＬＴ−Ｂ遺伝子を有する、本発明の
プラスミドに基づく遺伝子構成体の構成における工程を
表す線図である。
【図８】サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）におけ
る染色体のトランスポゾンの挿入を概略的に表す線図で
ある。
【図９】バクテリオファージλにおいて独特の制限部位
を特定する、合成オリゴヌクレオチドのリンカー表す線
図である。
【図１０】インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ）ＨＤＧ８５中のｐＰＸ１５７５のエレクトポレイシ
ョンの結果を表す線図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/108 8413−4Ｃ 39/112 8413−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 7/01 15/11 15/70 15/74 // Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:21） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 転移可能なカセットに対してシスにおい
    て連鎖しているトランスポゼースタンパク質をエンコー
    ドする遺伝子からなり、前記カセットはＤＮＡ配列の挿
    入のためのクローニング部位をフランキングするが、ト
    ランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝子をフ
    ランキングしない、１対のトランスポゼース認識部位か
    らなる、原核生物の細胞の構成体のＤＮＡの中にＤＮＡ
    配列を導入するためのＤＮＡ構成体。
  2. 【請求項２】 エピソームは、 ａ）トランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝
    子、 ｂ）トランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝
    子に対してシスにおいて連鎖している転移可能なカセッ
    ト、前記転移可能なカセットは、多重のクローニング部
    位および選択可能なマーカーをフランキングするが、ト
    ランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝子をフ
    ランキングしない、１対の逆向き反復配列からなる、お
    よび ｃ）複製の原核生物の由来に対して実質的に相同性であ
    りかつ機能的に同等である、複製の由来を有するレプリ
    コン、 からなる、原核生物の細胞の構成体のＤＮＡの中にＤＮ
    Ａを導入するためのエピソーム。
  3. 【請求項３】 バクテリオファージ誘導体は、 ａ）トランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝
    子、 ｂ）トランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝
    子に対してシスにおいて連鎖している転移可能なカセッ
    ト、前記転移可能なカセットは、多重のクローニング部
    位および選択可能なマーカーをフランキングするが、ト
    ランスポゼースタンパク質をエンコードする遺伝子をフ
    ランキングしない、１対の逆向き反復配列からなる、お
    よび ｃ）複製のバクテリオファージの由来に対して実質的に
    相同性でありかつ機能的に同等である、複製の由来を有
    するレプリコン、からなる、バクテリオファージの細胞
    の構成体のＤＮＡの中にＤＮＡを導入するためのバクテ
    リオファージ誘導体。
  4. 【請求項４】 その構成体のＤＮＡの中に、問題の抗原
    をエンコードする遺伝子を含有する転移可能なカセット
    組み込んで有する、弱毒化されたバクテリアからなる生
    ワクチン。
  5. 【請求項５】 工程： ａ）ＤＮＡ構成体をトランスポジションに適当な条件下
    に原核生物の細胞の中に導入し、前記ＤＮＡ構成体は転
    移可能なカセットに対してシスにおいて連鎖したトラン
    スポゼースタンパク質をエンコードする遺伝子からな
    り、前記カセットはＤＮＡ配列をフランキングする１対
    のトランスポゼース認識部位を有し、そして ｂ）構成体のＤＮＡの中に挿入されたＤＮＡ配列を有す
    るレシピエント細胞を同定する、からなる、原核生物の
    細胞の構成体のＤＮＡの中にＤＮＡ配列を導入する方
    法。
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