DE3650759T2

DE3650759T2 - Von Parasit gewonnener Widerstand

Info

Publication number: DE3650759T2
Application number: DE3650759T
Authority: DE
Inventors: Stephen A. Johnston; John C. Sanford
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1985-03-21
Filing date: 1986-03-17
Publication date: 2002-05-08
Anticipated expiration: 2006-03-18
Also published as: ATE201444T1; JP2000300254A; WO1986005516A1; JPS62502863A; DE3650756D1; ATE202139T1; EP0477994A1; DE3650756T2; EP0215907A1; EP0477994B1; EP0215907A4; DE3650759D1; EP0215907B1; EP1213348A2

Description

Gebiet der Technik

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Verleihen einer Resistenz gegenüber Parasiten, wie Viren, Bakterien und höheren Parasiten, den Wirten des Parasiten. Diese Erfindung betrifft insbesondere eine Parasitenresistenz, welche durch Gentechnik am Wirtsorganismus erhalten wird.

Fachlicher Hintergrund

Eine potentiell bedeutende Anwendung der Gentechnologie liegt auf dem Gebiet der Erzeugung einer Resistenz gegenüber Parasiten. Die Vorschläge auf dem Gebiet der Technik, welche systematisch und in breitem Maße anwendbar waren, konzentrierten sich auf das Auffinden eines Gens, welches eine Resistenz verleiht, innerhalb eines Stamms der Wirtsspezies oder innerhalb einer verwandten Spezies und Transformieren des Gens in das Genom eines anfälligen Wirts. Dieser Ansatz mag sich als wirksam erweisen, besitzt jedoch einige deutliche Nachteile. Es kann sein, daß für jede neu auftretende Rasse eines Parasiten resistente Formen des Wirts nicht existieren oder sehr schwierig aufzufinden sind. Eine solche Resistenz kann polygen sein, was das Klonen und den Transfer der Resistenzgene schwierig macht. Wo eine Resistenz mittels eines Gens codiert ist, gibt es für gewöhnlich bereits Stämme des Parasiten, welche Virulenzgene entwickelt haben, um solche vom Wirt abgeleitete Resistenzen auf eine Gen-für-Gen-Weise (Flor, 1971) zu überwinden. Schließlich bleibt das Problem der Identifizierung und Isolierung des Resistenzgens aus dem großen Genom des Wirts im allgemeinen sehr schwierig. Es ist daher eine alternative Strategie im Hinblick auf diese Probleme notwendig.
Es gab auch Vorschläge und einige Arbeiten im Hinblick auf die Verwendung von Genen von Organismen, welche weder mit dem Wirt noch dem Parasiten verwandt sind, welche zufällig Genprodukte besitzen, die sich nachteilig auf einen spezifischen Parasiten auswirken. Die Gencodierung für das Endotoxin von Bacillus thuringiensis (welches für lepidopterus-Insekten toxisch ist) wäre ein Beispiel dafür (Held et al., 1982). Während ein derartiger Ansatz sich in einigen speziellen Fällen als brauchbar erweisen mag, stellt er eindeutig ein opportunistisches Vorgehen gegen das Problem dar, wie im Gegensatz zu einer systematischen Methodik, welche in sehr breitem Maße angewendet werden kann.
Es existieren bereits einige Beispiele von Genen, Genderivaten oder Genprodukten eines Parasiten, welche eine negative Wechselwirkung mit sich selbst oder einen verwandten Genotyp erzeugen können. Studien hinsichtlich der Empfänglichkeit von Pflanzen gegenüber einer Infektion durch Viren haben dargelegt, daß nahverwandte Pflanzenviren von verschiedenen Stämmen desselben Virus einen Wirtsorganismus gegenseitig (kreuzweise) schützen werden (Hamilton, 1980). Mit anderen Worten, eine Pflanze, welche durch einen ersten Virus infiziert ist, unterliegt oft keiner Infektion durch einen zweiten Stamm des Virus oder durch einen verwandten Virus. Ein ähnliches Phänomen wurde bei Tierviren beobachtet und als intrinsische Interferenz bezeichnet (Marcus und Carrier, 1967). Im Hinblick auf eine Parasitenresistenz von dem hierin diskutierten Typ sind die Schlüsselproteine, die in dem Phänomen der intrinsischen Interferenz beteiligt sind, die Virusreplicaseproteine (Marcus und Zuckerbraun, 1970). Dieselben Autoren schlugen vor, daß die Replicaseproteine des zuerst infizierenden Virus die Replikation des zweiten Virus verhindern durch ein Binden an dessen Replicaseanheftungsstellen (Marcus und Zuckerbraun, 1969). Ein ähnlicher Vorschlag wurde vorgebracht, um den gegenseitigen Schutz bei Pflanzen zu erklären (Gibbs, 1969). Auf eine ähnliche Weise haben Experimentatoren, welche mit einem E. coli, welches mit Bakteriophage 434 infiziert war, arbeiteten, herausgefunden, daß infizierte Bakterien gegenüber anderen Phagen immun sind (Lauer et al., 1981; Flashman, 1973; Roberts et al., 1979). Andere Forscher haben festgestellt, daß endogen ebenso wie experimentell eingeführte komplementäre Oligonukleotide auf eine potentiell schädliche Weise mit mRNA wechselwirken können. Simons und Mitarbeiter (1983) haben vermutet, daß eine Hybridisierung eines kleinen anti-sense-Transkripts zu E. coli Tn10 mRNA zu der Regulierung der Transposition des Elements beiträgt. Stephenson und Zamecnik (1978) und Zamecnik und Stephenson (1978) haben aufgezeigt, daß synthetische Oligodesoxynukleotide, welche komplementär zu Terminal-Repeats von Rous sarcoma-Virus sind, eine normale Virusinfektion abschwächen können und eine Virus-RNA- Translation in vitro inhibieren können. Diese Entdeckungen wurden jedoch nicht auf die Erzeugung einer Wirtsresistenz gegenüber einem Parasiten angewendet.
Trotz dieses bruchstückartigen Wissens auf dem Fachgebiet bleibt dennoch eine Notwendigkeit für eine vollständig entwickelte Technik zur Erzeugung einer Resistenz gegenüber Parasiten, welche nicht auf den traditionellen Verfahren der Verwendung eines Resistenzgens aus einem immunen Stamm des Wirts basiert.

Offenbarung der Erfindung

Es ist folglich eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zum Verleihen einer Resistenz gegenüber einem Parasiten dem Wirt des Parasiten zur Verfügung zu stellen, welches nicht auf die Notwendigkeit der Identifizierung und Isolierung eines Resistenzgens aus einem immunen Stamm des Wirts angewiesen ist.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung, welche nachfolgend offensichtlicher werden, wurden gelöst durch das Zur-Verfügung-Stellen eines Verfahrens zum Verleihen einer Resistenz einem Wirt gegenüber einem Parasiten davon, welches umfaßt:
(a) Isolieren eines Genfragments aus dem Parasit, und
(b) Einfügen des Genfragments oder eines DNA- oder RNA- Segments, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA- Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalent ist, homolog ist, in den Wirt auf eine Weise, so daß ein vererbbares charakteristisches Merkmal zur Verfügung gestellt wird,
wobei das Genfragment oder das DNA- oder RNA-Segment in dem Wirt in einer anti-sense-Richtung transkribiert wird und das Transkriptionsprodukt des Genfragments oder des DNA- oder RNA-Segments die Funktionen und die Reproduktion des Parasiten beeinflußt.
Diese Anmeldung ist eine Teilanmeldung aus unserer gleichzeitig anhängigen Anmeldung Nr. 86902165.9 - 2105, welche am 10. November 1986 eingereicht wurde.

Beste Weise zur Durchführung der Erfindung

Das Konzept der aus dem Parasiten abgeleiteten Resistenz ist es, daß eine Wirtsresistenz gegenüber einem speziellen Parasiten wirksam hergeleitet werden kann durch Einführen eines Gens, Genfragments oder eines modifizierten Gens oder Genfragments des Pathogens in den Wirt. Diese Vorgehensweise basiert auf der Tatsache, daß bei jeder Parasit/Wirt-Wechselwirkung bestimmte parasitencodierte Zellfunktionen (Aktivitäten) vorkommen, welche wesentlich für den Parasiten; aber nicht für den Wirt sind. Eine wesentliche Funktion ist eine solche, die funktionieren muß, wenn der Parasit überleben oder sich fortpflanzen will. Diese Funktionen stellen die Achillesferse des Parasiten dar. Wenn eine dieser Funktionen unterbrochen bzw. gestört wird, wird der parasitäre Prozeß gestoppt. Eine "Unterbrechung" oder "Störung" bezeichnet irgendeine Änderung, welche sich nachteilig auf das Überleben, die Fortpflanzung oder die Infektiosität des Parasiten auswirkt. Solche wesentlichen Funktionen, welche der Kontrolle der Parasitengene unterliegen, können unterbrochen werden durch das Vorkommen eines entsprechenden Genprodukts in dem Wirt, welches (1) funktionsstörend ist, (2) im Überschuß vorkommt oder (3) im falschen Kontext oder im falschen Entwicklungsstadium im Lebenszyklus des Parasiten vorkommt. Wenn solche falschen Signale speziell für die Zellfunktionen des Parasiten entworfen werden, werden sie einen geringen Einfluß auf den Wirt haben. Daher kann eine Resistenz gegenüber einem speziellen Pathogen erreicht werden durch Klonen des geeigneten Parasitengens, falls notwendig Modifizieren dessen Expression, und sein Transformieren in das Wirtsgenom. Mit Resistenz ist jegliche Verringerung der Virulenz der Parasiteninfektion oder jegliche Verringerung der Empfänglichkeit des Wirts gegenüber dem Parasiten gemeint.
Diese Vorgehensweise zur Erzeugung einer Resistenz besitzt bedeutende Vorteile:
1) Die Quelle des Resistenzgens würde nie in Frage stehen, da jeder Parasit die für das Entwickeln einer Resistenz notwendigen Gene mit sich bringen würde.
2) Die Stabilität der aus dem Parasiten abgeleiteten Resistenz wird im allgemeinen größer sein als die Stabilität von einfach ererbten Formen der Wirtsresistenz, aus Gründen, welche später ausführlicher diskutiert werden.
3) Die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit dem Klonen von Genen aus dem Wirtsorganismus, welcher im allgemeinen relativ zu seinen Pathogenen größere Genome besitzt, werden verringert.
4) Eine aus dem Parasiten entwickelte Resistenz wird einen minimalen Effekt auf den Wirt besitzen und sollte keine für den Menschen schädliche Substanzen erzeugen.
Das allgemeine Konzept einer aus einem Parasiten entwickelten Resistenz wurde trotz des zuvor diskutierten Stands der Technik bis jetzt noch nicht entwickelt. Dafür gibt es einige Gründe. Erstens waren die Beispiele einer negativen Wechselwirkung im allgemeinen zufällige Beobachtungen eines natürlichen Effekts und wurden in Isolation als spezielle Fälle angesehen. Zweitens wurden negative Wechselwirkungen im allgemeinen aus akademischer Sicht betrachtet, ohne größere Überlegungen im Hinblick auf praktische Anwendungen. Dies wird am deutlichsten sichtbar in den oben erwähnten Veröffentlichungen auf komplementäre Oligonukleotide, wo keiner der Autoren irgendwelche Verbindungen mit ihrer eigenen Arbeit und Wirt/Parasit-Wechselwirkungen oder einer potentiellen Erzeugung einer Resistenz machen. Auch in einem kürzlichen Überblick über ein Symposium über die Verwendung von anti-sense-Strängen wurde die Anwendung dieser Vorgehensweise auf Wirt/Parasit-Systeme nicht erwähnt (Science, 1984, 223: 819). Drittens basiert das allgemeine Konzept einer aus einem Parasiten abgeleiteten Resistenz auf einer von dem herkömmlichen Wissen verschiedenen Sichtweise. Dem Wissen der Erfinder nach hat niemand bewußt eine von einem Parasiten abgeleitete Resistenz irgendeiner Art erzeugt. Die bewußte Vorgehensweise ist ein Teil der beanspruchten Erfindung, was angezeigt wird durch die sprachlichen Ausdrücke für "Isolieren" und "Einfügen" von Genfragmenten.
Zusätzlich hat eine Durchsicht der Literatur das Fehlen von jeglichem Stand der Technik auf den folgenden spezifischen Gebieten erbracht.
1) Verwendung von Virusgenen, welche Regulatorproteine wie Hüllproteine codieren, im Wirt, um mit der Reproduktion des Virus wechselzuwirken.
2) Verwendung von Derivaten eines Virusreplicasegens oder eines Virusgens der reversen Transkriptase im Wirt zum Zweck einer Wechselwirkung mit der Reproduktion des Virus.
3) Verwendung von spezifischen Bindungsstellen des Virusgenoms im Wirt zum Zweck einer Wechselwirkung mit der Reproduktion des Virus.
4) Verwendung von Lysisgenen, welche aus einem Parasiten gewonnen wurden, zur Verwendung als induzierbare "selbstzerstörende" Gene für die Erzeugung einer Hypersensitivität im Wirt.
5) Verwendung von anti-sense-Nukleinsäuresequenzen, welche von einem Parasiten gewonnen wurden, im Wirt zum Zweck einer Wechselwirkung mit Parasitenfunktion und Reproduktion.
6) Verwendung von Avirulenzgenen aus einem Parasiten im Wirt zum Zweck des Außer-Kraft-Setzens der Virulenzgene in virulenten Stämmen des Parasiten.
7) Verwendung von Parasitengenen, welche an der Biosynthese von Schlüsselregulatormolekülen beteiligt sind, für den spezifischen Zweck einer Erzeugung derselben biosynthetischen Fähigkeiten im Wirt, so daß der Wirt Homone, Neurotransmitter, Pheromone oder ähnliche Moleküle erzeugt, welche für den Parasiten störend wirken.
Als ein Beispiel, wie eine Krankheitsresistenz durch diese Vorgehensweise erzeugt werden kann, legt die nachfolgende Diskussion ausführlich dar, wie die Gene des Bakteriophagen Qß verwendet werden können, um E. coli gegenüber einer Infektion mit Qß resistent zu machen. Dieses Beispiel ist nicht als für die Erfindung einschränkend gedacht, sondern ist ein Beispiel der Einfachheit, mit welcher die Erfindung, da nun offenbart, in der Praxis angewendet werden kann.
Die Biologie von Qß- und anderen RNA-Phagen wurde ausführlich dokumentiert (Zinder, 1975), und es wurde die cDNA-Sequenz seines Genoms bestimmt. Das Qß-Genom besitzt drei Hauptcistrone. Diese codieren ein Reifungsprotein (beteiligt an der Lysis und Phagenbindung an Wirtspili), ein Hüllprotein und eine Untereinheit des Replicaseenzyms. (Ein viertes Genprodukt ist ein niederes Hüllprotein, welches ein Produkt eines überlesens des Hüllcistrons ist.)
Grundlegend ist der Lebenszyklus von Qß wie folgt. Der Phage beginnt mit einer Bindung an die Sexualpili von F' E. coli, durch welche er in die Zelle eintritt, und beginnt mit der Translation seiner Replicaseuntereinheit. Seine Replicaseuntereinheit polymerisiert mit drei Wirtsuntereinheiten, welche normalerweise an der Wirtsproteintranslation beteiligt sind. Das resultierende tetramere Hybridenzym besitzt eine RNA-Replicaseaktivität, welche spezifisch für Qß ist. Diese Spezifität rührt von der Affinität zwischen der Qß-Untereinheit der tetrameren Replicase und einem kurzen Segment des Qß-Genoms innerhalb des Replicasecistrons her. Die Replicase haftet an dieser Bindungsstelle an das das Qß-RNA an und repliziert die Virus-RNA. Im Lebenszyklus von Qß sammeln sich später Hüllprotein und Reifungsprotein im Wirt an. Das Hüllprotein bindet dann an das Replicasecistron und reprimiert dadurch die Translation der Replicaseuntereinheit. Eine Terminierung der Replikation ermöglicht eine Virusansammlung und eventuell die Reifungsproteinlyse des Wirts, was eine neue Population an infektiösem Qß freisetzt.
Aus einer herkömmlichen Sichtweise (nach dem Stand der Technik) schlägt der Lebenszyklus von Qß zwei potentielle Mechanismen für die Entwicklung einer Resistenz vor. Eine vom Wirt abgeleiteten Resistenz könnte entwickelt werden durch (1) Blockieren der Qß-Bindung an die Sexualpili oder (2) Erzeugen von verschiedenen Wirtsuntereinheiten, denen eine Affinität für die Qß-Replicaseuntereinheit fehlt. Eine Blockierung der Qß-Bindung ist in der Tat ein bekannter Mechanismus zur Erzeugung einer Qß-Resistenz, da Nicht-F'-Mutanten, welchen eine Pili fehlt, gegenüber einer Infektion immun sind (Silverman, Rosenthal, Mobach und Valentine, 1968). Diese Strategie unterbricht jedoch eindeutig einen Mechanismus, der für den Gesundheitszustand des Wirts als einer Spezies relevant ist. Die Selektion von varianten Formen der Wirtsuntereinheiten, welche den Aufbau des Replicaseenzyms unterstützen, kann auch ein natürlich auftretender Mechanismus zur Verleihung einer Resistenz sein. Da der Wirt 3 der 4 Untereinheiten der Virusreplicase liefert, könnte man Mutationen innerhalb dieser Gene erwarten, um eine Resistenz zu verleihen. Das Ausmaß, bis zu dem diese Wirtsuntereinheiten verändert werden können, ist jedoch eindeutig beschränkt, da diese Untereinheiten essentiell sind für die Wirtsproteinsynthese und für das Überleben des Wirts. Die meisten der Varianten dieser Wirtsuntereinheiten wären für den Wirt wahrscheinlich letal oder subletal. Auch nichtletale Varianten sind wahrscheinlich für eine Proteintranslationseffizienz suboptimal. Daher würden beide der durch den Qß-Lebenszyklus vorgeschlagenen im Wirt erzeugten Resistenzmechanismen auf Kosten einer Störung entscheidender Wirtsfunktionen erhalten werden.
Die Aussicht der Möglichkeit zur Übertragung von Genen aus einem Parasiten auf einen Wirt stellt einen neuen Ansatz für eine Resistenz zur Verfügung. Aus dieser Perspektive betrachtet, schlägt der Lebenszyklus von Qß mindestens so viele Mechanismen einer von dem Pathogen abgeleiteten Resistenz vor wie eine vom Wirt abgeleitete Resistenz. Es erscheinen mehrere Strategien erfolgversprechend: (1) Ableiten einer Resistenz aus dem Qß-Hüllprotein; (2) Ableiten einer Resistenz aus einer modifizierten Qß-Replicase; (3) Ableiten einer Resistenz durch Klonen der Qß-Replicasebindungsstellen und (4) Ableiten einer Resistenz aus einer Expression von anti-sense-Strang- RNA-Sequenzen. Eine andere Strategie, welche das Reifungsprotein einschließt, erscheint ebenfalls durchführbar.
Unter den oben erwähnten verschiedenen Strategien bildet die der Ableitung der Resistenz aus den antisense-Strang-RNA-Sequenzen den Gegenstand dieser Teilanmeldung.

Anti-sense-Strang-Interferenz

Das Vorkommen einer RNA, welche komplementär zur Qß- RNA ist, würde eine Bildung eines RNA-RNA-Duplex ermöglichen, welches eine Qß-Infektion blockieren würde. Dies kann erreicht werden durch z. B. Transkribieren eines cDNA-Klons eines Abschnitts von Qß in der umgekehrten Orientierung in dem E. coli-Wirt. Die erzeugte antisense-Strang-RNA wird dann zu dem infektiösen Qß hybridisiert und interferiert mit seiner geeigneten Translation oder Verpackung. Die Vorteile dieser Vorgehensweise sind, daß potentiell jedes Fragment des Virusgenoms ohne eine Modifikation verwendet werden könnte, und es würde extrem schwierig für den Virus sein, diese Form der Resistenz zu überwinden.
EP-A 140.308 beschreibt eine Regulierung und Inhibierung einer genetischen Expression eines Organismus durch Einbringen in das genetische Material des Organismus einer DNA oder eines anderen genetischen Materials, welches zu einer RNA transkribiert, welche zu der RNA des genetischen Materials des Organismus komplementär ist und in der Lage ist, daran zu binden.
Weintraub et al., TIG-Januar 1985, Bd. 1(1), 22-25 beschreibt Experimente, welche aufzeigen, daß ein endogenes Gen durch eine anti-sense-RNA inhibiert wird, und deuten darauf hin, daß viele Fragen über die Verwendung einer Geninhibierung durch die Verwendung einer antisense-RNA unbeantwortet bleiben.
Obwohl die beiden Referenzen ein gewisses Potential einer Verwendung von anti-sense-RNA anzeigen, gibt es keine Lehre aus dem obigen Stand der Technik, welcher eine Verwendung einer anti-sense-Methodik zur Verleihung einer Resistenz einem Wirt gegenüber einem eintretenden Parasiten vorschlägt.
Obwohl die oben dargelegten Beispiele, welche Verfahren beschreiben, durch welche Bakterien gegen den Bakteriophagen Qß geschützt werden können, sich insbesondere auf ein spezifisches Wirt/Parasit-System beziehen, ist die Technik auf einfache Weise auf andere Systeme anwendbar, wie den Schutz von anderen Organismen vor sowohl einer Virusinfektion als auch einer Nichtvirusinfektion. Techniken zum Erreichen dieser Ergebnisse werden in den folgenden Absätzen ausführlicher dargelegt.

Virusresistenz

Die wahrscheinlich früheste Anwendung des Konzepts einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz ist die Erzeugung einer Virusresistenz. Dies ist so, da das Virusgenom klein ist, und da Viren lediglich im Wirt propagieren, ist der Großteil des Genoms an der Pathogenität beteiligt. Es können Abschnitte des Virusgenoms geklont und deren Potential zum Verleihen einer Resistenz geeignet bestimmt werden. Alternativ dazu können resistenzverleihende Gene durch Testen der biologischen Wirkung von verschiedenen DNA-Restriktionsfragmenten auf das Virusgenom empirisch entdeckt werden. Die meisten der vom Virus abgeleiteten Resistenzen schließen gerne einen Block in der Replikation mit ein. Die beschriebenen Verfahren zum Erzeugen einer Resistenz gegenüber Qß sind direkt anwendbar auf jeden Virus, welcher a) ein Protein codiert, welches die Regulierung der Reproduktion des Virus unterstützt; b) spezifische Bindungsstellen in seinem Genom besitzt; c) seine eigene Replicase oder reverse Transkriptase synthetisiert oder d) durch komplementäre reverse Strangsequenzen von Nukleinsäure gebunden ist. Mit anderen Worten, diese Verfahren wären auf im wesentlichen alle Viren anwendbar.
Während es einige Kontroversen unter Biochemikern gegeben hat im Hinblick darauf, ob Pflanzenviren ihre eigene Replicase codieren, erscheint es nun wahrscheinlich, daß die meisten Pflanzenviren alle oder einen Teil ihrer Replicasen codieren (Hall, Miller und Bujarski, 1982; Dorssers, Van der Meer, Kamen, Zabel, 1983). Der erste Pflanzenvirus, dessen Replikationsmechanismus charakterisiert worden ist, Wasserrübengelbmosaikvirus, erwies sich als analog zu Qß (Mouches, Candresse und Bove, 1984). Dieser Virus zeigte, daß er eine Hybridreplicase besitzt, mit ihrer eigenen Untereinheit, welche eine spezifische Bindung zu seinem Genom verleiht. Dies zeigt an, daß die Vorgehensweise, wie sie für Qß-Replicase beschrieben wurde, auch auf diesen Virus anwendbar wäre. Es ist wahrscheinlich, daß die meisten oder alle RNA-Pflanzenviren entweder ihre eigene Replicase, eine Untereinheit der Replicase oder ein Protein, welches die Spezifität der RNA- Polymerase des Wirts modifiziert, codieren. Dies bedeutet, daß die von der Replicase abgeleitete Resistenzstrategie, welche für Qß aufgezeigt wurde, direkt auf einen großen Bereich von Pflanzenviren anwendbar sein wird. Bis jetzt wurden noch nicht viele Viren im Hinblick auf diese genetische Struktur analysiert. Jedoch zeigen die sehr geringe Größe des Virusgenoms und die Diversität potentieller Resistenzmechanismen eindeutig an, daß ein vom Virus abgeleitetes Resistenzgen von jedem Virus abgeleitet werden kann, indem einfach standardmäßige Shotgun- Klonierungsverfahren und ein direktes Screening für eine nachfolgende Resistenz gegenüber dem Virus angewendet wird.

Nichtvirusresistenz

Die Anwendung einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz auf extrazelluläre Parasiten ist komplexer als bei Virenparasiten. Da durch den Wirt falsch codierte Signale durch den Parasiten erkannt werden müssen, wird eine vom Parasiten abgeleitete Resistenz lediglich dort nützlich sein, wo Mechanismen existieren, welche eine Erkennung oder einen Einbau von nichtdegradierten Makromolekülen von dem Wirt durch den Parasiten erlauben. Van der Plank (1978) hat überzeugende theoretische Argumente vorgebracht, welche anzeigen, daß ein solcher Austausch von Makromolekülen zwischen dem Wirt und dem Parasiten oft stattfindet. Es existiert zumindest ein Fall, wo ein solcher Einbau dokumentiert wurde. In dem Malaria- Wirt/Parasit-System zeigte der Parasit einen Einbau und eine Verwendung eines Dismutaseenzyms des Wirts, was das Vorkommen eines Proteinaustauschmechanismus anzeigt (Fairfield, Meshnick und Eaton, 1983). Insoweit solche Mechanismen in anderen Nichtvirus-Wirt/Parasit-Beziehungen existieren, können die hierin beschriebenen Techniken ohne signifikante Veränderungen angewendet werden. Die Existenz von Proteinaustauschmechanismen kann bestimmt werden unter Verwendung von monoklonalen Antikörpersonden, um subzellulare Komponenten zu lokalisieren, in Zusammenhang mit elektrophoretischen 2-D-Studien, welche nach Wirt/Parasit-Hybridproteinen suchen.
In Bezug auf einen gegebenen makromolekularen Austauschmechanismus existieren eine Vielzahl von Vorgehensweisen für das Erzeugen einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz gegenüber sowohl Virusparasiten als auch Nichtvirusparasiten. Zum Beispiel zeigte es sich im allgemeinen in Gen-für-Gen-Wirt/Parasit-Systemen (Flor, 1971; üblich in Virus-, Pilz- und bakteriellen Pathogenen), daß die Avirulenzallele der Parasiten dominant gegenüber Virulenzallelen sind (zusammengefaßt in Van der Plank, 1978). Dies legt nahe, daß die Avirulenzgenprodukte die Aktivität der Virulenzgenprodukte überlesen oder blockieren - wodurch eine Infektion verhindert wird. Somit kann ein von einem avirulenten Stamm des Parasiten geklontes Avirulenzallel, wenn es in einen transformierten Wirt eingebracht und wesentlich exprimiert wird, in den Parasiten eintreten oder an der Schnittstelle Wirt/Parasit wirken und die infektiöse Kapazität des ansonsten virulenten Pathogens übergehen. Avirulenzallele können durch eine Vielzahl von Methoden identifiziert werden. Zum Beispiel kann in Bakterien der Virulenz-Avirulenz-Locus geklont werden durch Verwenden einer Insertionsmutation (Anwenden von transposiblen Elementen) des Virusstamms und Screenen auf nichtvirulente Mutanten oder durch Screenen einer Genombibliothek auf eine Komplementation des Virulenzallels. Das Virulenzgen kann dann in den Wirt eingebracht werden, um eine Resistenz zu verleihen. Vor kurzem wurde ein Avirulenzgen aus dem bakteriellen Pathogen Pseudomonas syringae geklont. Die vorgebrachte Absicht dieser Arbeiter war es jedoch, das Resistenzgen aus dem Wirt zu klonen, und es wurde in keinster Weise das Parasitengen in den Wirt eingebracht (Staskawicz et al., 1984). Die hier vorgeschlagene Technik führt eine vollkommen neue Dimension in das klassische Modell der Genfür-Gen-Wirt/Parasit-Wechselwirkungen ein.

Resistenz aus den Requlatorgenen des Parasiten

Eine allgemeinere Strategie zur Erzeugung einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz (anwendbar mit oder ohne Gen-für-Gen-Wechselwirkungen) verwendet spezifische Regulatorgene des Parasiten. Zum Beispiel können Pilzgene, welche die Haustorialentwicklung oder Sporenbildung regulieren, in einen Wirt eingebracht werden, wodurch der normale Lebenszyklus des Pilzpathogens zerstört wird, wobei etablierte Techniken der Identifizierung des Regulatorproteins und der Suche einer Genombibliothek mit einer Antikörpersonde verwendet werden. Einmal kloniert, können solche Gene in einen Wirt eingebracht werden, wo sie den normalen Lebenszyklus des Pilzpathogens unterbrechen. Dieser Typ einer regulierenden Vorgehensweise erscheint besonders nützlich bei der Erzeugung einer Insektenresistenz. Zum Beispiel sind alle Insekten abhängig von der geregelten Biosynthese von Juvenil- und Häutungshormonen für ein präzises Timing der Häutung, Metamorphose und Fortpflanzung. Unter Verwendung der Techniken dieser Erfindung ist es möglich, in den Wirt Gene des Schadinsekts einzubringen, welche die Aktivitäten codieren, die notwendig sind, um die Insektenhormone, -pheromone oder -neurotransmitter zu erzeugen. In dem Fall von Neurotransmittern sind diese Polypeptide typischerweise extrem kurz (weniger als 20 Aminosäuren) und sind daher einfach sequenziert, und es können natürliche Gene, welche diese Sequenzen codieren, de novo synthetisiert werden. Im Fall von Nichtpeptidhormonen oder Pheromonen ist das Problem schwieriger, kann jedoch überwunden werden. Es werden typischerweise mehrere enzymatische Schritte vom Ausgangspunkt eines üblichen Vorläufers in sowohl dem Wirt als auch dem Parasiten bis zu dem biologisch aktiven sekundären Metaboliten erforderlich sein. Dies bedeutet, daß mehrere Gene in dem Parasiten idenfiziert, geklont und auf den Wirt übertragen werden müssen. Während diese Vorgehensweise nicht die Einfachheit oder Direktheit von anderen von Parasiten abgeleiteten Vorgehensweisen besitzt, ist sie potentiell eine der signifikanteren und breitbandigeren Anwendungen einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz und wird im allgemeinen die Zeit und den Aufwand des Durchführens des letzteren Teils eines Biosynthesewegs Wert sein. Der Wirt, der solche Insektenwachstumsregulatoren oder Transmitter erzeugt, würde aufgrund der Störung des Verhaltens oder des Lebenszyklus des Insektenpathogens resistent sein, wodurch eine Infektion des primären Wirts eliminiert wäre. Es gibt Beispiele in der Natur, wo Pflanzen scheinbar eine ähnliche Strategie für eine Resistenz ausgenutzt haben, indem Gene entwickelt wurden, welche Analoge zu oder biosynthetische Antagonisten von Insektenhormonen erzeugen (Bowers, 1980).
Eine andere Anwendung einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz ist dort verfügbar, wo ein Insekt oder ein anderer Organismus als ein Zwischenwirt dient, so daß der Krankheitszyklus unterbrochen werden kann, indem der Zwischenwirt resistent gegenüber dem Pathogen gemacht wird, wodurch eine Infektion des primären Wirts beseitigt wird.
Zum Beispiel haben sich Anstrengungen zur Bekämpfung von Malaria früher auf die Ausrottung des Zwischenwirts, des Anopheles-Moskitos, fokussiert. Wenn jedoch Gene des Plasmodium-Pathogens auf eine Weise in das Moskito eingebracht werden, um eine Resistenz zu verleihen durch ein Unterbrechung des Lebenszyklus des Parasiten, wird der Krankheitszyklus durchbrochen werden. Diese Vorgehensweise ist am einfachsten durchzuführen, wenn die Resistenzgene selektiv vorteilhaft sind für den Zwischenwirt, was es den Resistenzgenen ermöglicht, nach einer Einbringung von modifizierten Individuen in den natürlichen Populationen beibehalten und propagiert zu werden. Dies kann zum Beispiel durchgeführt werden durch ein gleichzeitiges Einbringen in den Zwischenwirt einer Resistenz gegenüber einem Pestizid.

Vorteile und Grenzen einer vom Pathogen abgeleiteten Resistenz

Eine vom Parasiten abgeleitete Resistenz stellt eine systematische und im großen Umfang bedeutende Vorgehensweise im Hinblick auf das Problem dar, wie gentechnisch eine Resistenz gegenüber Insekten und Krankheiten erzeugt werden kann. Die umfangreichen Möglichkeiten dieser Vorgehensweise werden veranschaulicht durch die Tatsache, daß drei verschiedene Strategien zum Ableiten einer Resistenz aus dem Qß-Bakteriophagen existieren, in einem Parasiten, der lediglich drei Gene enthält. Es gibt mehrere bedeutende Vorteile der vom Parasiten abgeleiteten Resistenz.
Eines der am meisten attraktiven Merkmale einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz ist es, daß jeder neue Parasit oder jede neue Rasse an Parasit, welche zu einem Problem wird, gleichzeitig mit sich die spezifischen Gene mitbringt, welche notwendig sind, um eine Resistenz gegenüber sich selbst zu erzeugen. Diese Gene können systematisch innerhalb des Genoms des Parasiten identifiziert werden. Wenn einmal solche Gene identifiziert wurden, werden durch DNA-Hybridisierungstechniken homologe Gene in anderen Parasitenrassen oder in verwandten Parasiten einfach identifizierbar sein. Dies eliminiert die Notwendigkeit für wiederholte und erschöpfende Suchen durch die Genpoole, um seltene Wirtresistenzgene zu suchen.
Ein anderer bedeutender Vorteil dieser Strategie ist es, daß sie im allgemeinen für die Funktionen des Wirts nicht störend sein sollte. Van der Plank (1978), welcher evolutionäre Argumente und populationsgenetische Daten verwendet hat, argumentierte, daß eine Empfänglichkeit steuernde Wirtsgene existieren, da sie wesentliche Wirtsfunktionen mit einbeziehen. Die meisten Wirte sind genetisch empfänglich, da das empfängliche Allel bezüglich seiner natürlichen Funktion optimal ist. Vom Wirt abgeleitete Resistenzallele neigen daher zu einer Störung der optimalen Funktion des Wirts. Insofern dies wahr ist, greifen die meisten vom Wirt abgeleiteten Resistenzen das Pathogen indirekt an durch ein Ersetzen eines optimalen Wirtsgenprodukts mit einem nichtoptimalen Wirtsgenprodukt, welches zufällig mit dem Parasiten nicht kompatibel ist. Dies ist in dem Qß-System ersichtlich, wo eine vom Wirt abgeleitete Resistenz einfach erreicht wird, entweder durch Störung der Bildung der Sexualpili oder durch Beeinflussen der Proteinsynthesemaschinerie des Wirts. Eine ähnliche Situation existiert bei der Sichelzellenanämie, welche, wenn sie ausgeprägt ist, für den Menschen schädlich ist, welche jedoch eine Resistenz gegenüber Malaria verleiht bei Personen, welche sowohl ein rezessives Sichelzellengen als auch ein normales Hämoglobingen besitzen. Die Schönheit des Konzepts der vom Pathogen abgeleiteten Resistenz ist es, daß lediglich pathogene Zellfunktionen angegriffen werden und direkt angegriffen werden, was einen minimalen Folgeeffekt für den Wirt besitzt. Die Spezifität der vom Parasiten abgeleiteten Resistenz ist nicht nur dahingehend wünschenswert, daß sie für den Wirt nicht störend ist, sondern auch, daß sie für den Menschen nicht schädlich ist. Eine Resistenz, welche auf der Erzeugung von allgemeinen Giften basiert, wie den natürlichen Pestiziden von vielen resistenten Pflanzentaxa, haben gezeigt, daß sie potentiell schädlich für den Menschen sind, wenn sie gegessen werden (Ames, 1983). Die Spezifität einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz sollte in großem Maße jegliche solche Schädigung für den Menschen ausschließen.
Es gibt Gründe, die vermuten lassen, daß eine vom Parasiten abgeleitete Resistenz im Vergleich mit einer vom Wirt abgeleiteten Resistenz relativ dauerhaft sein sollte. Die Fähigkeit von Parasiten, vom Wirt erzeugte allgemeine Giftstoffe zu überlisten, ist gut bekannt. Zusätzlich werden spezifische vom Wirt abgeleitete Resistenzgene häufig überwunden durch Anpassen von Gen-für-Gen- Mutationen zur Virulenz im Parasiten (Flor, 1971). Im Fall einer vom Wirt abgeleiteten Qß-Resistenz werden Veränderungen in den Replicaseuntereinheiten des Wirts (welche diese mit der Virusuntereinheit inkompatibel macht, wodurch eine Resistenz verliehen wird) einfach angepaßt durch Mutationen in der Qß-Replicaseuntereinheit, was eine Kompatibilität der Untereinheit wiederherstellt, was eine Mutation zur Virulenz darstellt. Jedoch sollte eine solche durch Gen-für-Gen-Mutationen zu überlistende Resistenz im Fall von einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz relativ selten sein. In diesem Fall würde der Parasit für gewöhnlich einer neuen Form der Resistenz gegenüberstehen, welche er in seiner Evolution bis dahin noch nicht angetroffen hat. Diese Resistenztypen sind für den Parasiten für gewöhnlich sehr schwer zu überwinden, insbesondere wenn Regulatorgene beteiligt sind. Wenn zum Beispiel eine Resistenz gegenüber Qß aus dem Qß-Hüllproteingen abgeleitet wurde, könnte ein neuer virulenter Qß- Stamm nur auftreten, indem zuerst durch Mutation in dem Replicasecistron eine neue Bindungsstelle entwickelt wird (ohne eine Replicasefunktion zu unterbrechen), welche das natürliche Hüllprotein nicht binden würde. Gleichzeitig müßte durch Mutation ein neues Hüllprotein auftreten (ohne die Hüllproteinfunktion zu unterbrechen), welches an die neue Bindungsstelle binden würde. Ein derartiges simultanes und komplementäres Set an Mutationen (welche sowohl die Hüll- als auch Replicasefunktionen erhalten) sollte extrem selten sein.
Zuletzt sollte das Erzeugen einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz auf dem molekularen Niveau erreichbarer sein als die Erzeugung einer vom Wirt abgeleiteten Resistenz. Dafür gibt es zahlreiche Gründe: (1) Diese Strategie würde sich allgemein auf die Molekularbiologie von relativ einfachen Organismen mit kurzen Lebenszyklen konzentrieren; (2) sie würde im allgemeinen lediglich die Identifikation und Isolierung von einzelnen Genen aus kleinen Genomen erfordern; (3) eine unregulierte konstitutive Expression der vom Parasiten abgeleiteten Resistenzgene wäre für gewöhnlich wirksam; und (4) sie würde die komplexen Multigen-Biosynthesewege vermeiden, welche die wahrscheinliche Basis für viele existierende vom Wirt abgeleitete Resistenzen sind.
Es scheint keinerlei offensichtlicher Nachteil hinsichtlich der Vorgehensweise für die vom Parasiten abgeleitete Resistenz vorzuliegen, mit der Ausnahme, daß ein Anwendung der Strategie auf Nichtvirusparasiten lediglich möglich ist, wo ein Mechanismus für einen makromolekularen Austausch zwischen Wirt und Parasit existiert. Viele Formen des Parasitismus, insbesondere solche Formen, welche eine Gen-für-Gen-Resistenz aufzeigen, erlauben umfassende Möglichkeiten für Genproduktwechselwirkungen und werden geeignet sein für eine Erzeugung einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz.

Techniken zur Erzeugung eines resistenten Wirts

Es ist selbstverständlich, daß der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Gentechnik Standardtechniken der Gentechnik auf einfache Weise anwenden kann, um die hierin dargestellten Ziele zu erreichen. Ein Schutz eines Wirts gegenüber zum Beispiel eines Virus kann leicht erreicht werden. Aufgrund der oben dargelegten Gründe ist es nicht notwendig, das Gen zu identifizieren, welches in den Wirt eingebracht wird, obwohl eine Identifikation des Gens es einfacher macht, die Methode durchzuführen. Im allgemeinen wird eine genetische Information (DNA oder RNA) von einem beliebigen Virus unter Verwendung von Standardverfahren isoliert und in Stücke von variierenden Längen gespalten, welche vorzugsweise mindestens 20 Nukleotide enthalten, wenn die DNA in einer anti-sense- Richtung transkribiert werden soll, oder in zumindest einem funktionellen Abschnitt und vorzugsweise einem gesamten Gen, wenn das Gen exprimiert werden soll. DNA-Fragmente werden typischerweise erhalten unter Verwendung von Restriktionsendonukleaseenzymen. Dasselbe Enzym wird (oder dieselben Enzyme werden) dann zur Spaltung eines Vektors verwendet, welcher zur Replizierung im Wirt oder Einfügen in ein Wirtschromosom in der Lage ist. Der Vektor kann ein natürliches Plasmid oder Transposon oder ein beliebiger Teil davon sein, welcher zur Replikation im Wirt und, falls erwünscht, Erzeugung eines Genprodukts aus dem exogenen Parasitengenfragment in der Lage ist. Vektoren, welche von Plasmiden oder anderen normalerweise im Wirt vorkommenden Vektoren stammen, sind bevorzugt. Die Virus-DNA wird unter Verwendung von Standardtechniken in entweder einer sense-Richtung (wenn eine Expression eines Genprodukts gewünscht ist) oder einer anti-sense- Richtung in den Vektor eingefügt. Ein geeignetes Maßschneidern des Genfragments im Vektor (z. B. Verwenden von geeigneten 5'- und 3'-Flankierungssequenzen, um eine wie gewünschte Regulierung, Transkription und Translation sicherzustellen) wird unter Verwendung von Standardtechniken auf einfache Weise erreicht, insbesondere wenn eine einfache konstitutive Expression gewünscht ist, wie es in den meisten Fällen einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz geeignet ist. Wie in dieser Anmeldung verwendet, umfaßt der Ausdruck "Genfragment" sowohl ganze Gene, DNA-Segmente, welche ein ganzes Gen oder einen Abschnitt davon enthalten, und Segmente der DNA, welche unvollständige Teile eines einzelnen Gens sind. Das Wort "Gen" umfaßt sowohl DNA-Sequenzen, welche ein Peptidgenprodukt codieren, als auch andere DNA-Sequenzen, welche einen funktionellen Teil eines Chromosoms oder Plasmids bilden.
Obwohl sich diese Spezifikation im allgemeinen auf eine DNA allein bezieht, wenn eine genetische Information, Vektoren oder dergleichen beschrieben werden, wurde dies lediglich zum Zweck einer einfachen Expression getan. Jeglicher Verweis auf eine DNA, solange er nicht eindeutig auf eine DNA und nicht auf eine RNA beschränkt ist, ist gleichermaßen auf eine RNA anwendbar. Zum Beispiel können pathogene RNA-Viren die Quelle des Parasitengenfragments sein und können nichtvirulente RNA-Viren als Vektoren fungieren. In vielen Fällen ist es jedoch einfacher, mit einer DNA als mit einer RNA zu arbeiten (es sind zum Beispiel mehr DNA-Restriktionsendonukleaseenzyme bekannt), und eine Verwendung einer cDNA, welche aus RNA hergestellt wurde, ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, wenn eine Resistenz gegenüber einem RNA-Virus erzeugt wird.
Nachdem ein Genfragment isoliert worden ist, kann die DNA-Sequenz bestimmt und, falls gewünscht, modifiziert werden, um ähnliche DNA-Segmente herzustellen, welche in der Lage sind, als dieselben oder ähnliche Genprodukte exprimiert zu werden. Zum Beispiel können ein oder mehrere Codone ersetzt werden durch äquivalente Codone, um künstliche DNA-Segmente herzustellen, welche das identische Genprodukt codieren. Alternativ dazu kann ein Codon ersetzt werden durch ein Codon, welches eine ähnliche Aminosäure codiert (z. B. ein Codon für Leucin wird ersetzt durch ein Codon für Isoleucin, oder ein Codon für Glutaminsäure wird ersetzt durch ein Codon für Asparaginsäure). Bei einer Verwendung als ein anti-sense-Strang oder -bindungsstelle sind weniger als 10% an nichtidentischen Nukleotiden bevorzugt, wobei nichtmodifizierte Genfragmente am meisten bevorzugt sind. Eine größere Modifikation des Genfragments ist möglich, wenn ein Genprodukt des Parasitengens hergestellt wird. Zum Beispiel werden künstliche DNA-Sequenzen, welche eine Reihe von Codonen enthalten, die funktionell äquivalent (d. h. welche dieselben Aminosäuren codieren) zu der Codonsequenz in dem Parasitengenfragment sind, als vollständig äquivalent zu dem Parasitengenfragment angesehen, da sie dasselbe Genprodukt herstellen werden, sogar obwohl die DNA-Sequenz wesentlich verschieden sein kann. Genprodukte, welche zu dem natürlichen Genprodukt nicht identisch sind, jedoch die Fähigkeit zur Herstellung eines Genprodukts beibehalten, welches in der Lage ist, eine essentielle Aktivität des Parasiten zu stören, können durch systematische Modifikation von Codonen (und somit den exprimierten Genprodukten), gefolgt von einem Testen auf eine Parasitenresistenz, hergestellt werden. Solche modifizierten DNA-Segmente müssen im wesentlichen homolog zu mindestens einem Teil des isolierten Genfragments oder einer dazu funktionell äquivalenten DNA-Sequenz sein, um als Anzeige für eine vom Parasiten abgeleitete Resistenz angesehen zu werden. Mit "im wesentlichen homolog" ist eine zumindest 80%ige, vorzugsweise mindestens 90%ige und am meisten bevorzugt mindestens 95%ige Identität zwischen der betrachteten DNA-Sequenz und der Sequenz, mit welcher diese verglichen wird, gemeint. Identische Sequenzen werden auch mit demselben Ausdruck bedacht. Vergleiche zum Zweck einer Bestimmung der Homologie werden vorzugsweise über eine Sequenz von mindestens 15 und weiter bevorzugt mindestens 21 Nukleotiden gemacht.
Der Ausdruck "Isolieren eines Genfragments", wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, bezeichnet das Verfahren zum Erhalten eines Genfragments in einer brauchbaren Form, um bei der Herstellung einer Resistenz verwendet zu werden. Das Genfragment muß nicht gereinigt oder anderweitig von anderen Zellbestandteilen getrennt werden, obwohl dies in vielen Verfahren stattfinden wird. Statt dessen wird das Wort "isoliert" verwendet, um anzuzeigen, daß ein Gen durch ein beabsichtigtes Verfahren in einer brauchbaren Form erhalten wurde. Zum Beispiel kann ein "isoliertes Genfragment" in einer Mischung aus Fragmenten der DNA eines Parasiten existieren, welches für eine Verwendung in einem Shotgun-Klonierungsverfahren gedacht ist. Ein Genfragment ist auch dann noch "isoliert", wenn es in der Form eines rekombinanten Plasmids vorkommt, welches in einem Bakterium vorhanden ist, welches in einem Shotgun-Klonierungsverfahren verwendet wird, um Erzeuger von gewünschten Parasitengenprodukten zu identifizieren (wie durch eine Verwendung von monoklonalen Antikörpern). Gleichermaßen umfaßt durch diesen Ausdruck wird ein Segment einer gereinigten DNA, welches ein Parasitengensegment und Termini von einem Klonvektor umfaßt (z. B. erhalten durch Klonen eines Parasitengenfragments in einem Bakterienplasmid vor einer Einfügung in den endgültigen Wirt). Andere brauchbare Formen von Genfragmenten werden dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Gentechnik eindeutig offensichtlich erscheinen.
Eine Einfügung des Parasitengenfragments in einen Wirt wird auf einfache Weise erreicht, wenn der Wirt ein Bakterium oder ein anderer einzelliger Organismus ist, da die Hauptvortschritte, welche vor kurzem in der Gentechnik aufgetreten sind, im allgemeinen das Einfügen von Vektoren, welche exogene Gene enthalten, in einzellige Wirte (insbesondere Bakterien und Hefen) betreffen und direkt auf das vorliegende Verfahren anwendbar sind. "Einfügen" umfaßt jegliche Mittel des Einführens einer genetischen Information in einen kompatiblen Wirtsorganismus mit den in dieser Beschreibung diskutierten Einschränkungen. Jedoch ist ein Einfügen auf eine Weise bevorzugt, welche eine vererbbare Charakteristik zur Verfügung stellt. In einzelligen Organismen kann dies auf einfache Weise erreicht werden unter Verwendung von vererbbaren Plasmiden oder durch Einfügen des Parasitengenfragments in das Wirtschromosom. Diese Beispiele sind nicht einschränkend, und es sind bei der praktischen Durchführung dieser Erfindung andere Verfahren des Einlügens von vererbbarer genetischer Information, ob in einzellige oder höhere Organismen, gleichermaßen anwendbar.
Bewährte Verfahren zum Einfügen von neuen Genen in höhere Organismen können nun in großem Umfang in der derzeitigen Literatur gefunden werden. Es existieren vier grundlegende Verfahren, dies zu bewerkstelligen (Baserga, Crose und Povera, Herausg., 1980): (1) direkte Aufnahme einer DNA oder von DNA-haltigen Teilchen in die Zelle, (2) Zellfusion mit anderen Zellen oder Geisterzellen, (3) Mikroinjektion und (4) infektiöse Transformation. Es wurde ein fünftes Verfahren entwickelt, welches die Verwendung von beschleunigten Hochgeschwindigkeitsteilchen mit der Größe von 1 um zum Zweck des Tragens von DNA in Zellen und Geweben beinhaltet.
Aufnahmemechanismen schließen die folgenden ein: (1) Induktion einer verstärkten Membranpermeabilität durch Verwendung von Ca&spplus;&spplus; und einem Temperaturschock (Mandel und Higa, 1970; Dityakin et al., 1972); (2) Verwendung von Oberflächenbindungsmitteln wie PEG (Chang und Cohen, 1979; Krens et al., 1982) oder Ca(PO&sub4;)&sub2; (Graham und von der Eb, 1973; Wigler et al., 1979); und (3) Phagocytose von Teilchen wie Liposomen (Uchimaya et al., 1982), Organellen (Potrykus, 1973) oder Bakterien (Cocking, 1972) in die Zelle. Diese Aufnahmemechanismen beinhalten im allgemeinen Suspensionen von einzelnen Zellen, wo jegliche existierende Zellwandmaterialien enzymatisch entfernt wurden. Aufnahmeprotokolle sind im allgemeinen relativ einfach und erlauben eine Behandlung einer großen Anzahl an Zellen auf einmal. In solchen Systemen sind die meisten Zellen unbeeinflußt, es sind jedoch Zellselektionsverfahren verfügbar, um die seltenen Zellen, welche transformiert wurden, rückzugewinnen (Powers und Cocking, 1977).
Fusionsmechanismen bringen neues genetisches Material in eine Zelle ein, indem ihr ermöglicht wird, mit einer anderen Zelle zu verschmelzen. Eine Variation auf diesem Gebiet beinhaltet Geisterzellen. Es wird den Membranen von getöteten Zellen ermöglicht, sich mit einer gegebenen DNA-Lösung zu füllen, so daß eine Zellverschmelzung die DNA von der "Trägerzelle" in die lebende Zelle einbringt. Eine Fusion Zelle-mit-Zelle kann induziert werden mit der Hilfe von solchen Mitteln wie PEG (Bajaj, 1982) und Sendai-Virusteilchen (Uchida et al., 1980). Ebenso wie Aufnahmemechanismen basieren Fusionstechniken auf der Verwendung von Einzelzellsuspensionen, wo Zellen enzymatisch von jeglichem Zellwandmaterial abgelöst worden sind. Während Fusionstechniken relativ gute Effektivitäten im Hinblick auf die Anzahl von behandelten Zellen aufweisen können, können die Probleme der Zellselektion komplexer sein, und die resultierenden Zellen haben typischerweise eine erhöhte Ploidie.
Mikroinjektionstechniken verwenden extrem feine, ausgezogene Kapillarröhrchen, welche Mikroelektroden genannt werden. Diese können ausreichend klein hergestellt werden, so daß sie als Injektionsnadeln für die direkte Injektion von biologischen Substanzen in bestimmte Typen von einzelnen Zellen verwendet werden können (Diacumakos, 1973; Graessmann und Graessmann, 1983). Eine Modifikation der Mikroinjektion beinhaltet das Anstechen mit einer aus solidem Glas gezogenen Nadel, welche biologische Lösungen einbringt, welche die Zelle baden (Yamomoto et al., 1981). Eine andere Modifikation wird Ionophorese genannt (Purres, 1981; Ocho et al., 1981), welche eine Elektrophorese von Substanzen aus der Mikroelektrode und in die Zelle als eine Alternative zu einer Hochdruck-Pfropfenströmung verwendet. Mikroinjektionsverfahren können eine extrem hohe Effektivität in Bezug auf die Zuführung in die Zelle ergeben. Aus diesem Grund wurde die Mikroinjektion erfolgreich bei der Transformation von einzelnen Eizellen verwendet.
In einem anderen Beispiel wurde Fremd-DNA erfolgreich in Baumwollpollenröhren injiziert, ohne daß der Pollen beschädigt oder seine Keimung behindert wurde. Obwohl dies ein Resistenzgen von einer anderen Pflanze anstelle von einem Parasitengen betrifft, kann dieselbe Technik bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. DNA wurde in den Kern von Baumwollpollenkörnern injiziert, welche auf Cellophan keimen, wobei Mikromanipulatoren und ein Mikroinjektionssystem verwendet wurde. Dieser Arbeitsschritt wurde auf dem fixierten Objekttisch eines invertierten Forschungsmikroskops durchgeführt, welches mit Nomarski-Differentialinterferenzoptiken ausgestattet war. Nach der Einbringung eines Fluoreszenzmarkers in das injizierte Material wurde Fremd-DNA in einem Empfängernukleus durch Epifluoreszenz detektiert. Die DNA wurde unter Verwendung von "Quickfill"-Röhren, welche auf einen Durchmesser der Spitze von 0,5 um gezogen wurden, eingeführt, und die DNA wurde iontophoretisch in den Nukleus injiziert. Der keimende Pollen wurde auf den Griffel zurückgebracht, wo er fortfuhr zu wachsen und das Ovarium befruchtete. Es konnten ungefähr 20 Injektionen pro Tag durchgeführt werden.
Es wurden Samen der mikroinjizierten Pflanzen eingepflanzt, und es wurden Sämlinge aufgezogen und gescreent. Ein Screenen kann durchgeführt werden durch Testen auf das Vorhandensein des Fremdgens mittels Southern-Blotting oder auf das Vorhandensein des Genprodukts mittels eines Enzyminhibierungsassays. Wenn Baumwolle der Wirt ist, kann zusätzlich ein Screenen auf eine Insektenresistenz der entwickelten "square" (die drei die Baumwollblüte einhüllenden Deckblätter) und Samenkapsel verwendet werden. Andere Pflanzen können auf dieselbe Weise behandelt werden.
Eine infektiöse Transformation verwendet nichtschädliche Infektionsmittel des Wirts, wie Viren, welche auf natürliche Weise einen Teil ihres Genoms in den Wirt übertragen. In Pflanzen ist das Hauptverfahren der nun praktizierten Transformation die Verwendung des Infektionsmittels Agrobacterium tumefaciens. Dieses Bakterium wird auf natürliche Weise Zellen einer beliebigen zweikeimblättrigen Pflanze kolonisieren und einen spezifischen "T-Bereich" seines Ti-Plasmids in das Pflanzenchromosom übertragen. Es können andere Pflanzenvektoren, welche für die Transformation von Pflanzen nützlich sind, gleichermaßen verwendet werden. Es können nun spezielle Gene routinemäßig in den T-Bereich eingebracht werden und können mittels des Bakteriums auf die Pflanzen übertragen werden (siehe Fraley et al., 1983). Eine einfache Coinkubation (gleichzeitiges Wachsen von Pflanzenzellen und Bakterienzellen) erwies sich als äußerst wirksam bei der Transformierung von Pflanzenprotoplasten und Blattscheiben, und es wurden nun vollständig transformierte Pflanzen in zahlreichen Pflanzenspezies regeneriert (siehe Horsch et al., 1984). In Säugetieren wurden natürliche infektiöse Retroviren verwendet, um natürliche Transformierungsvektoren zu erzeugen, welche gentechnisch erzeugte DNA in das Chromosom des Säugetiers einführen, auf eine Weise, die ähnlich zu Agrobacterium tumefaciens ist.
Dieser Transformationsmechanismus wird als äußerst erfolgversprechend für eine Gentherapie am Tier und Menschen angesehen (siehe Anderson, 1984).
Für ein Beispiel einer Säugetiertransformation siehe US-Patent 4,396,601 von Salser et al., welches eine Technik beschreibt, in welcher Zellen aus einem regenerativen Körperteil eines Säugetiers oder einem syngenetischen Äquivalent isoliert werden, um Mutterzellen zur Verfügung zu stellen. Die Mutterzellen werden kombiniert mit DNA des Parasiten und mit zusätzlicher DNA, welche einen Selektionsvorteil gegenüber den Mutterzellen erzeugt, wenn die Zellen einer Mitosehemmung unterzogen werden. Die modifizierten Zellen werden dann auf eine Weise in den Wirt eingeführt, so daß die modifizierten Zellen zu dem Körperteil, aus welchem die Mutterzellen erhalten wurden, zurückkehren. Dem Wirt wird dann ein Mitosehemmer verabreicht, um einen selektiven Vorteil für die modifizierten Zellen gegenüber den Mutterzellen zur Verfügung zu stellen, wodurch die modifizierten Zellen im Wirt regeneriert werden. Weitere Details dieses Verfahrens können durch Verweis auf das US-Patent 4,396,601 erhalten werden.
Das Verfahren der Erfindung ist im allgemeinen anwendbar auf den Schutz eines beliebigen Wirts gegenüber einem Parasiten des Wirts. Wie hierin verwendet, bezeichnet "Wirt" einen beliebigen Organismus, welcher durch einen beliebigen Parasiten oder symbiotische Organismen infiziert werden kann. Der Begriff "Parasit" bezeichnet einen beliebigen Organismus, der Substanzen oder Mittel für eine Reproduktion aus einem Organismus erhält, wenn er entweder mit dem Organismus in einem parasitären oder einem symbiotischen Verhältnis lebt. Der Parasit muß nicht auf einen besonderen Wirt spezialisiert sein, sondern kann ein Parasit für viele Wirt sein, wie die Raupen von zahlreichen Motten und Schmetterlingen. Obwohl ein bevorzugter Parasit für eine Verwendung in dieser Erfindung ein Virus ist, egal ob der Virus ein DNA- oder RNA-Virus ist, sind von diesem Ausdruck auch andere Parasiten umfaßt. Beispiele von anderen Parasiten schließen Bakterien, Protozoen, Pilze, Nematoden, Insekten und Arachnide ein.
Da ein Wirt normalerweise in der Evolution höher steht als der Parasit, umfaßt der Begriff "Wirt" nicht einen Virus, welcher auf der unteren Eben des Evolutionsschemas steht. Es ist jedoch jeder höhere Organismus in der Lage, durch einen Parasiten infiziert zu werden. Die Erfindung ist auf einfache Weise anwendbar auf zum Beispiel ein Bakterienwachstum in Kulturen, welches einen Schutz gegenüber einer Infektion von Bakteriophagen benötigt. Darüber hinaus können Pflanzen und andere höhere Organismen wie Säugetiere ebenfalls auf einfache Weise unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung vor Viren geschützt werden. Es können sowohl Pflanzen als auch Tiere vor höherparasitären Wirten geschützt werden, wie Insekten und Protozoen, unter Berücksichtigung der bereits diskutierten Einschränkungen. Beispiele von Wirten umfassen Bakterien, Hefen, Pilze (z. B. Ständerpilze), zu den Leguminosen gehörende Pflanzen (z. B. Sojabohnen), Getreide- und Futterpflanzen (z. B. Mais, Weizen, Reis und Luzerne), Nahrungspflanzen (z. B. Tomaten, Kartoffeln, Salat und Zwiebeln), Zierpflanzen (z. B. Rosen, Wacholder (junipers) und Orchideen), Bäume (z. B. Pinie, Fichte und Walnuß), Protozoen, Amphibien, Reptilien, Vögel (z. B. Hühnchen und Truthähne) und Säugetiere (z. B. Katzen, Hunde, Pferde, Rinder, Schafe, Ziegen, Schweine und Primaten).
Beispiele von Wirt/Parasit-Systemen, in welchen entweder der Wirt oder der Parasit ein einzelliger Organismus ist (die häufigsten Situationen), können in zahlreichen Mikrobiologielehrbüchern und Standardwerken gefunden werden, wie dem CRC Handbook of Microbiology, Gekürzte Ausgabe, Laskin und Lechevalier (Herausg.), CRC Press, Cleveland, Ohio, 1974. Andere Beispiele von Wirt/Parasit- Systemen werden nachfolgend gegeben, zusammen mit Beispielen, wie eine Resistenz gegenüber dem Parasiten dem Wirt in diesem System gegeben werden kann. Diese Beispiele sind nicht einschränkend, und es sind für jedes aufgelistete System viele andere Verfahren zum Erreichen einer Resistenz möglich.
1) Es gibt eine Vielzahl an Bakterien, welche in industriellen Fermentationsverfahren wichtig sind, wie Streptococcus Iactis, Streptococens cremoris und Lactobacillus species. Während einer Fermentation wird eine Infektion durch verschiedene Bakteriophagen im allgemeinen ein Mißlingen der Fermentation verursachen. Eine Bakterienresistenz gegenüber einer solchen Bakteriophageninfektion kann durch Verfahren erzeugt werden, welche exakt analog zu den Verfahren sind, welche oben für das Erzeugen einer Resistenz gegenüber dem Qß-Bakteriophagen in E, coli beschrieben wird.
2) Es gibt Hunderte von signifikanten Pflanzen-RNA-Viren, und es werden im wesentlichen alle Nutzpflanzenspezies von einem oder mehreren derartigen Viren befallen. Eine Resistenz gegenüber solchen Viren kann auf eine Weise erhalten werden, die sehr analog zu der Qß-Resistenz in Bakterien ist, durch Klonen von Fragmenten des Virus in Pflanzentransformierungsvektoren, wie einem modifizierten Ti-Plasmid und Transformieren der geeigneten Pflanzen. Durch verschiedene Genfragmente transformierte Pflanzen können dann im Hinblick auf eine Resistenz gescreent werden, wobei etablierte Pflanzenaufzuchttechniken verwendet werden. Einige wenige der relevanten Viren umfassen Luzernmosaikvirus, Brommosaikvirus, "barley yellow dwarf virus", "beet yellows virus", Gurkenmosaikvirus, "lettuce necrotic yellows virus", "maize chlorotic dwarf virus", "pea enation virus", Kartof-. felviren S, X und Y, "southern bean mosaic virus", "tomato ringspot virus", "tobacco ringspot virus", Tabakmosaikvirus, "tobacco streak virus", Wasserrubengelbmosaikvirus und Wundtumorenvirus.
3) Es gibt bestimmte Tier- und Humanpathogene, wie die Grippe- und üblichen Erkältungsviren, welche Mechanismen entwickelt haben zur Überlistung der Wirksamkeit des tierischen Immunsystems. Wo ein solcher Virus ein chronisches Problem darstellt, wie bei Grippe und Erkältungen, wird eine vom Parasiten abgeleitete Resistenz ein mächtiges Werkzeug zum Verleihen einer Immunität gegenüber allen Stämmen des Pathogens sein. Eine Resistenz kann erzeugt werden durch Klonen von Fragmenten des Virusgenoms, Einbringen der Genfragmente in die tierischen Zellen in vitro durch Verwenden von Retrovirusvektoren, Testen von verschiedenen transformierten Zellzeiten, um zu bestimmen, welchen eine Resistenz gegenüber einer Infektion durch den Virus verliehen wurde, und dann Verwenden dieser Fragmente, welche eine Resistenz verleihen zur Erzeugung von gutartigen nichtinfektiösen Retrovirusvektoren zum Zweck des Einführens von Resistenzgenen in die einzelnen Lebewesen.
4) Es gibt bestimmte Retroviren, welche direkt T-Zellen (d. h. das menschliche Immunsystem) angreifen (wie die Viren, welche AIDS erzeugen), wodurch unser natürlicher Immunverteidigungsmechanismus überlistet wird. Eine Resistenz kann wie oben beschrieben erzeugt werden, wobei AIDS-Genomfragmente verwendet werden und wobei auch ein AIDS- oder ein ähnliches Retrovirus für die Konstruktion eines T-Zellen-spezifischen Transformationsvektors verwendet wird. Transformierte T-Zellen mit resistenzverleihenden Fragmenten des AIDS-Genoms würden einen selektiven Vorteil gegenüber anderen empfänglichen T-Zellen besitzen, wodurch sie die vorherrschende Form der T-Zelle werden und dadurch die Resistenz des einzelnen Lebewesens erhöhen.
5) Ein weiter Bereich an Bakterien und Pilzen, welche Pflanzen befallen, besitzen einen innigen Kontakt mit den lebenden Wirtszellen und zeigen Gen-für-Gen- Wirt/Parasit-Beziehungen. Eine Resistenz kann in solchen Fällen erzeugt werden durch Klonen von Avirulenzallelen aus avirulenten Stämmen des Parasiten und Einführen dieser Gene in den entsprechenden Wirt zum Zweck des Verleihens einer Resistenz. Einige wenige Pathogene, bei welchen dieses Verfahren relevant ist, umfassen eine Infektion von Mais mit Puccinia sorghi, eine Infektion von Weizen mit Puccinia, eine Infektion von Kartoffeln mit Phytophthora infestans, eine Infektion von Roggen mit Ustilago und eine Infektion von Flachs mit Melampsora lini.
6) Ein weiter Bereich von Insekten, befallen Pflanzen, verursachen ernste wirtschaftliche Verluste und sind abhängig von einer geeigneten Ausgewogenheit des Juvenilhormons und Häutungshormons, um ihre Entwicklung zu regulieren. Daher kann ein breites Spektrum an von Insekten abgeleiteten Pflanzenresistenzen gegenüber Insekten erzeugt werden durch Klonen der Insektengene, welche verantwortlich sind für die letzten Schritte der Biosynthese dieser Hormone, und Transferieren dieser Gene auf den betreffenden Pflanzenwirt, wobei etablierte Transformationstechniken verwendet werden. Typische Gene würden eine enzymatische Steuerung der Umwandlung einer Vorstufe zu dem gewünschten Regulatorprodukt (z. B. Hormon) codieren. Grundsätzlich enthalten alle Pflanzenwirte die Vorstufen für die Synthesen dieser Hormone; d. h. Farnesol im Fall des Juvenilhormons und Phytosterole im Fall des Häutungshormons. Andere brauchbare Gene würden solche sein, welche andere Regulatorsubstanzen erzeugen, die die Produktion von Hormonen in Parasiten auslösen. Einige wenige Insektenparasiten, welche durch dieses Verfahren kontrolliert werden könnten, umfassen Flohkäfer, Drahtwürmer, Raupen des Eulenfalters der Gattung Agratis, Insektenlarven, Blattläuse, Singzirpen, "tarnished plant bugs", Colorado-Kartoffelkäfer, Gurkenkäfer, "weevils", Larven des großen Kohlweißlings, "cabbage lopper", Miniermotten, Hessenfliege, Heuschrecke, "tent worm", Großer Schwammspinner, Bürstenspinner, Heerwurm, Larve des Eulenfalters, Raupe des Maiszünslers und Japankäfer.
7) Ein weiter Bereich von Insekten befallen Pflanzen und enthalten Neurotransmitter, welche wesentliche Körperfunktionen steuern. Solche Neurotransmitter sind Oligopeptide, welche typischerweise lediglich 5-20 Aminosäuren lang sind. In diesem Fall kann eine von dem Insekt abgeleitete Resistenz erzeugt werden durch Sequenzieren des Oligopeptids und Synthetisieren eines künstlichen Genhomologen zu den natürlichen Insektengenen, welche diese Neurotransmitter codieren. Diese synthetischen Gene können, wenn sie in einem Pflanzenwirt exprimiert werden, dann diese kritische Körperfunktion, welche normalerweise durch den Neurotransmitter des Insektenparasiten reguliert wird, stören. Die in dem vorherigen Beispiel aufgelisteten Insekten wären gleichermaßen als Kandidaten für dieses Verfahren zum Verleihen einer vom Parasiten abgeleiteten Resistenz geeignet.
Zusätzlich zu den obigen allgemeinen Verfahren, welche zur Herstellung von rekombinanten DNA-Molekülen und transformierten einzelligen Organismen gemäß der Praxis dieser Erfindung verwendet werden können, können bei der praktischen Durchführung der Erfindung andere bekannte Techniken und Modifikationen davon verwendet werden. Insbesondere unterlagen vor kurzem die Techniken der Gentechnik einem Wachstum und einer Entwicklung von explosivem Ausmaß. Viele neuere US-Patente offenbaren Plasmide, gentechnische Mikroorganismen und Verfahren der Durchführung der Gentechnik, welche in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Zum Beispiel offenbart das US-Patent 4,273,875 ein Plasmid und ein Verfahren zu dessen Isolierung. Das US-Patent 4,304,863 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Bakterien mittels Gentechnik, in welchem ein Hybridplasmid aufgebaut und zur Transformierung eines bakteriellen Wirts verwendet wird. Das US-Patent 4,419,450 offenbart ein Plasmid, welches als ein Klonierungsvehikel bei der Bearbeitung von rekombinanter DNA brauchbar ist. Das US-Patent 4,362,867 offenbart Aufbauverfahren für rekombinante cDNA und dadurch hergestellte Hybridnukleotide, welche in Klonierungsverfahren nützlich sind. Das US-Patent 4,403,036 offenbart Genreagenzien zur Erzeugung von Plasmiden, welche mehrfache Kopien von DNA-Segmenten enthalten. Das US-Patent 4,363,877 offenbart rekombinante DNA-Transfervektoren. Das US-Patent 4,356,270 offenbart ein Klonierungsvehikel für rekombinante DNA und ist eine besonders nützliche Offenbarung für solche mit einer begrenzten Erfahrung auf dem Gebiet der Gentechnik, da es viele der Begriffe, die in der Gentechnik verwendet werden, und die darin verwendeten grundlegenden Verfahren definiert. Das US-Patent 4,336,336 offenbart ein fusioniertes Gen und ein Verfahren zu dessen Herstellung. Das US-Patent 4,349,629 offenbart Plasmidvektoren und deren Herstellung und Verwendung. Das US-Patent 4,332,901 offenbart einen in rekombinanter DNA nützlichen Klonierungsvektor. Obwohl einige dieser Patente auf die Herstellung eines speziellen Genprodukts, das nicht innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt, ausgerichtet sind, können die darin beschriebenen Verfahren durch einen Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Gentechnik auf einfache Weise für die Praxis der in dieser Beschreibung beschriebenen Erfindung modifiziert werden.
Alle Patente und anderen Veröffentlichungen, die in dieser Beschreibung zitiert werden, geben das Niveau der Fähigkeit und des Wissens eines Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet an, zu welchem die vorliegende Erfindung gehört.
Zusätzlich zu dem Verfahren der Erzeugung einer Resistenz gegenüber einem Parasiten, was oben ausführlich beschrieben ist, umfaßt diese Erfindung ebenfalls Wirte, welche durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, ebenso wie rekombinante Vektoren und andere Produkte der Gentechnik, welche in der Praxis der Erfindung nützlich sind.
Die Erfindung, die nun allgemein beschrieben wurde, wird besser verstanden werden durch einen Bezug auf einige bestimmte Beispiele, welche hierin lediglich zum Zweck einer Veranschaulichung enthalten sind und nicht beabsichtigen, sofern nicht derart angegeben, die Erfindung oder irgendeine Ausführungsform davon einzuschränken.

BEISPIEL

Die Durchführbarkeit des oben dargelegten Konzepts wurde mit Experimenten überprüft, wobei der Bakteriophage Qß und dessen Wirt E. coli verwendet wurden. Unter Verwendung von cDNA-Klonen von Qß (Qß ist ein RNA-Phage) wurden als erstes Plasmide aufgebaut oder erhalten, welche Teile der Qß-cDNA in E. coli exprimieren würden und eine Resistenz verleihen würden.
Hüllprotein: Das zur Herstellung des Hüllproteins verwendete Plasmid war pGL101, erhalten von R.B.
Winter (Cell 33, 977). Dieses Plasmid exprimiert das Hüllprotein unter einer lac-Operatorsteuerung, so daß seine Expression durch IPTG induziert werden kann (obwohl es auch eine konstitutive Expression gibt). Dieses Plasmid ebenso wie die anderen nachfolgend beschriebenen enthalten das "gene encoding-ampr".
Negativer Strang: Es wurde ein Plasmid aufgebaut, welches das 0,9 Kb HpaII-Fragment von Qß-cDNA an der AccI-Stelle in das pUR222-Plasmid einfügt. Dieses Fragment erstreckt sich in Qß (FIGUR) von Positionen 2547 bis 3473 und schließt Translationssequenzen des Replicasegens ein. Diese Sequenzen enthalten ebenfalls die M-Bindungsstelle der Replicase. In der "sense"-Orientierung dieses Fragments wird ein Fusionsprodukt zwischen β- Galactosidaseprotein und dem Replicasefragment gebildet. In der antisense-(Gegenrichtung)-Ligation dieses Fragments wird ein RNA-Komplementär zu der Qß-RNA-Sequenz gebildet. Es wurden beide Konstruktionen hergestellt.
Test auf Resistenz: Der Stamm GM1 (durch R.W. Webster zur Verfügung gestellt) wurde transformiert mit pUR222 oder einem der oben beschriebenen Testplasmide. Diese Stämme wurden aufgezogen, kompetent gemacht, mit Qß inkubiert und dann auf Weichagarplatten ausgebracht. Es wurden die Anzahl und Größe der Plaques bestimmt, um zu bestimmen, ob eine Resistenz stattgefunden hat.
In einem Anfangsexperiment zum Testen des Hüllproteins wurden GM1 + pUR222 und GM1 + pGL101 aufgezogen in 10 ml L-Broth, welches Ampicillin enthielt in LPTG. Bei einer stationären Phase wurden die Kulturen pelletisiert und in 4 ml an 50 mlvi YCaCl&sub2; resuspendiert. Es wurde eine kleine Portion, 0,1 ml, dieser Schalenkultur während 60 Minuten mit 107 pfu an Qß inkubiert. Dies wurde dann auf YT-AMP-Schalen in 3 ml Weichagar mit IPIG ausgebracht. Die Ergebnisse waren derart, daß die GM1 + pUR222-Schalen Tausende an Plaques besaßen, welche bald (24 Stunden) die Schalen belegten; wobei die GM1 + pGL101-Schale anfänglich keine Plaques aufzeigte, jedoch später viele sehr kleine Plaques entwickelte.
Um die Möglichkeit zu überprüfen, daß die Resistenz des GM1-Stamms + pGL101 von einem Verlust des F'-Elements herrührt, wurden die Stämme anschließend auf einem Minimalmedium aufgezogen, welchem Prolin zur Aufrechterhaltung der Selektion für das F' fehlte. Es wurde dasselbe Protokoll wie oben wiederholt, einschließlich der Stämme von GM1 mit den Plasmiden, welche HpaII (sense) und HpaII (antisense) trugen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgezeigt. Sowohl das Hüllprotein als auch die HpaII- (antisense)-Plasmide konnten eine Resistenz gegenüber einer Qß-Infektion verleihen. Dieses Experiment wurde zweimal mit im wesentlichen denselben Ergebnissen wiederholt. Nach einer fortlaufenden Passage ordneten sich jedoch die plasmidtragenden QJB-cDNA-Sequenzen um oder gingen verloren. Tabelle 1

ZITIERTE REFERENZEN.

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Claims

1. Verfahren zum Verleihen einer Resistenz in einem nichtmenschlichen, nichttierischen Wirt gegenüber einem Parasit davon, welches umfaßt:

(a) Isolieren eines Genfragments aus dem Parasit, und

(b) Einfügen des Genfragments oder eines DNA- oder RNA-Segments, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, in den Wirt, auf eine Weise, so daß ein vererbbares charakteristisches Merkmal zur Verfügung gestellt wird,

wobei das Genfragment oder das DNA- oder RNA-Segment in dem Wirt in einer anti-sense-Richtung transkribiert wird und das Transkriptionsprodukt des Genfragments oder des DNA- oder RNA-Segments die Funktionen und Reproduktion des Parasiten beeinflussen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Einfügen ein Transformieren des Wirts mit einem Vektor, der das Genfragment trägt, umfaßt, wobei der Vektor in der Lage ist, in dem Wirt stabil zu replizieren, oder das Genfragment in der Lage ist, in ein Chromosom des Wirts eingefügt zu werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Wirt eine Pflanze oder ein Bakterium ist und der Parasit ein Virus ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Wirt ein einzelliger Organismus ist und der Parasit ein Virus ist, der in der Lage ist, den einzelligen Organismus zu infizieren.

5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Wirt ein Bakterium ist und der Parasit ein Virus ist, der in der Lage ist, das Bakterium zu infizieren.

6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Vektor ein Plasmid oder Transposon ist, welches in dem Wirt vorkommt, oder ein Teil des Plasmids oder Transposons ist, welches in der Lage ist, als ein Vektor zu funktionieren.

7. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Wirt eine Pflanze ist und der Parasit ein virulenter Virus ist, der in der Lage ist, die Pflanze zu infizieren.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Vektor ein Plasmid, transposables Element oder ein nichtschädliches Virus ist, das in dem Wirt vorkommt, oder Teil des Plasmids, transposablen Elements oder Virus ist, welches in der Lage ist, die Pflanze zu infizieren.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Vektor ein Tiplasmid von Agrobacterium tumefaciens oder ein Teil davon ist, der in der Lage ist, als ein Vektor für die Transformation einer Pflanze zu funktionieren.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Parasit ein virulenter Virus, Pilz oder Bakterium mit Gen-für-Gen Wirt/Parasit-Beziehungen ist und das Gen ein dominantes Avirulenz-Allel von einem avirulenten Stamm des Parasiten ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gen ein Regulatorgen für den Parasit ist oder ein Gen ist, das in die Biosynthese eines Regulatormoleküls in dem Parasiten involviert ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Regulatorgen codierend für ein Genprodukt ist, das in die Synthese eines Insektenjuvenil- oder Häutungshormons, eines Insektenneurotransmitters, eines Regulators zur Haustorialentwicklung oder Sporenbildung bei Pilzen oder eines Pheromons involviert ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Wirt Pflanzenzellen umfaßt.

14. Isolierte Zellen eines tierischen Wirts, welche resistent gegenüber einem Parasiten des tierischen Wirts sind, wobei ein von dem Parasit isoliertes Genfragment oder ein DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, auf eine Weise eingefügt worden ist, so daß ein vererbbares charakteristisches Merkmal zur Verfügung gestellt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Genfragment oder ein DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, welches auf eine Weise in die Zellen des tierischen Wirts eingefügt ist, um ein vererbbares charakteristisches Merkmal zur Verfügung zu stellen, in einer anti-sense-Richtung transkribiert wird, und sein Transkriptionsprodukt die Funktionen und die Reproduktion des Parasiten beeinflußt.

15. Isolierte Zellen eines tierischen Wirts nach Anspruch 14, wobei das Genfragment oder ein DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, welches eingefügt ist und in einer anti-sense-Richtung transkribiert wird, eines ist, das von einem viralen Parasiten stammt.

16. Zellen eines pflanzlichen Wirts, welche resistent gegenüber einem Parasiten des pflanzlichen Wirts sind, wobei ein von dem Parasit isoliertes Genfragment oder ein DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, auf eine Weise eingefügt worden ist, so daß ein vererbbares charakteristisches Merkmal zur Verfügung gestellt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Genfragment oder ein DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, welches auf eine Weise in die Zellen des pflanzlichen Wirts eingefügt ist, um ein vererbbares charakteristisches Merkmal zur Verfügung zu stellen, in einer antisense-Richtung transkribiert wird, und sein Transkriptionsprodukt die Funktionen und die Reproduktion des Parasiten beeinflußt.

17. Zellen eines pflanzlichen Wirts nach Anspruch 16, wobei das Genfragment oder ein DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, welches eingefügt ist und in einer antisense-Richtung transkribiert wird, eines ist, das von einem viralen Parasiten stammt.

18. Zellen eines bakteriellen Wirts, welche resistent gegenüber einem Parasiten des bakteriellen Wirts sind, wobei ein von dem Parasit isoliertes Genfragment oder ein DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, auf eine Weise eingefügt worden ist, so daß ein vererbbares charakteristisches Merkmal zur Verfügung gestellt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Genfragment oder ein DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, welches in die Zellen des bakteriellen Wirts eingefügt und stabil integriert ist, in einer anti-sense-Richtung transkribiert wird, und sein Transkriptionsprodukt die Funktionen und die Reproduktion des Parasiten beeinflußt.

19. Zellen eines bakteriellen Wirts nach Anspruch 18, wobei das Genfragment oder DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, welches eingefügt ist und in einer antisense-Richtung transkribiert wird, eines ist, das von einem viralen Parasiten stammt.

20. Pflanze, die gegenüber einem Parasiten der Pflanze resistent gemacht ist, wobei ein von dem Parasiten isoliertes Genfragment oder ein DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, auf eine Weise eingefügt worden ist, so daß ein vererbbares charakteristisches Merkmal in der Pflanze zur Verfügung gestellt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Genfragment oder DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, welches auf eine Weise eingefügt ist, um ein vererbbares charakteristisches Merkmal in der Pflanze zur Verfügung zu stellen, in einer anti-sense-Richtung transkribiert wird, und sein Transkriptionsprodukt die Funktionen und die Reproduktion des Parasiten beeinflußt.

21. Pflanze nach Anspruch 20, wobei das Genfragment oder ein DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, welches eingefügt ist und in einer anti-sense-Richtung transkribiert wird, eines ist, das von einem viralen Parasiten stammt.

22. Nichtmenschliches Tier, das gegenüber einem Parasiten des Tieres resistent gemacht ist, wobei ein von dem Parasiten isoliertes Genfragment oder ein DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, auf eine Weise eingefügt worden ist, so daß ein vererbbares charakteristisches Merkmal in dem Tier zur Verfügung gestellt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Genfragment oder DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, welches auf eine Weise eingefügt ist, um ein vererbbares charakteristisches Merkmal in dem Tier zur Verfügung zu stellen, in einer anti-sense-Richtung transkribiert wird, und sein Transkriptionsprodukt die Funktionen und die Reproduktion des Parasiten beeinflußt.

23. Nichtmenschliches Tier nach Anspruch 22, wobei das Genfragment oder ein DNA- oder RNA-Segment, welches im wesentlichen zu mindestens einem Teil des Genfragments oder zu einer DNA- oder RNA-Sequenz, die zu dem Genfragment funktionell äquivalenten ist, homolog ist, welches eingefügt ist und in einer anti-sense- Richtung transkribiert wird, eines ist, das von einem viralen Parasiten stammt.