DE69928525T2 - Resistenz für pflanzen gegenüber einer infektion mit einem einzelstrang-dns virus, die auf einem einzelstrang-dns-bindenden protein beruht, zusammensetzungen und verfahren für ihre verwendung. - Google Patents

Resistenz für pflanzen gegenüber einer infektion mit einem einzelstrang-dns virus, die auf einem einzelstrang-dns-bindenden protein beruht, zusammensetzungen und verfahren für ihre verwendung. Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung von Pflanzen, die gegen eine Infektion durch Pflanzenviren resistent sind.
  • Hintergrund
  • Geminiviren sind Pflanzenpathogene, die signifikante Ausbeuteverluste bei Erntepflanzen in vielen Ländern der Welt auslösen (Briddon et al., „Geminiviridae", S. 158 – 165. In F. A. Murphy (Ed.), Virus Taxonomy, Sixth Report of International Committee on Taxonomy of Viruses, Springer-Verlag, Wien & New York, 1995; Frischmuth et al., Semin. Virol., 4: 329 – 337, 1993; Harrisson et al., Ann. Rev. Phytopathol., 23 : 55 – 82, 1985; Polston et al., Plant Dis., 81 : 1358 – 1369, 1997). Different members are transmitted by whiteflies or leafhoppers (Davies et al., Genet., 5 : 77 – 81, 1989; Lazarowitz et al., Crit. Rev. Plant Sci., 11 : 327 – 349, 1992). Die meisten der durch Weißfliegen übertragenen Geminiviren (WTGs) haben zweigeteilte Genome, wohingegen alle durch Blatthüpfer übertragene Geminiviren und einige WTGs einteilige Genome aufweisen. Die einteiligen Genome (2566 – 3028 Nukleotide) kodieren Proteine, die zur Replikation, Verkapselung und Bewegung notwendig sind, während in dem Fall der zweigeteilten Viren die Bewegungsfunktionen durch eine zweite Genomkomponente ähnlicher Größe kodiert werden (Davies et al., Genet., 5 : 77 – 81, 1989; Ingham et al., Virology, 207 : 191 – 204, 1995; Timmermans et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 45 : 79 – 112, 1994).
  • Geminiviren haben zirkuläre einzelsträngige (ss) DNA-Genome, die in doppelicosahedrischen Partikeln verkapselt sind. Geminiviren replizieren durch einen rollenden Kreis- („rolling circle") Mechanismus, der analog zur Replikation von Bakteriophagen mit ssDNA-Genomen ist. Die eingehende einzelsträngige (ss) DNA des Geminivirus wird durch Wirtsenzyme in doppelsträngige (ds) DNA umgewandelt, welche wiederum als eine Matrize zur Transkription der frühen Replikations-assoziierten Gene auf dem komplementären Sense-Strang dient. Das Replikationsstarterprotein (Rep oder AC1) ist das einzige virale Protein, das zur Replikation benötigt wird. In doppeltgenomischen Geminiviren verstärkt ein zweites Protein (AC3) die Replikation. AC2, ein anderes frühes Genprodukt, transaktiviert die Expression des Gens des Hüllproteins (CP) auf dem Sense-Strang der Virionen. Obwohl das CP nicht zur Replikation des Virus in Protoplasten oder Pflanzen notwendig ist, führen Mutationen in dem CP zu dramatischen Verringerungen in der Anhäufung von ssDNA in Protoplasten oder Pflanzen ohne Beeinträchtigung der Anhäufung von dsDNA. Auf der anderen Seite hatten CP-Mutationen des Tomatengoldenmosaikvirus keinerlei Wirkung auf die DNA-Anhäufung in Pflanzen, reduzierten aber die ssDNA-Anhäufung, während sie die dsDNA-Anhäufung in Protoplasten verstärken. In Pflanzen resultiert an Mangel an CP in einem vollständigen Verlust der Infektiösität von einteilig genomischen Viren, nicht aber in zweigeteilt genomischen Viren.
  • Das Hüllprotein kann die Verhältnisse von ss- zu ds-DNA -Mengen in einer passiven Weise durch das Aufbrauchen der ssDNA, die zur Umwandlung in dsDNA verfügbar ist, durch die Verkapselung oder durch die Modulierung der ssDNA-Synthese oder durch beides beeinflussen. Es gibt keinerlei Beweise dafür, wie CP die ssDNA- Anhäufung in Geminiviren beeinflusst. In dem Tomatenblattkräuselvirus aus Neu Delhi (ToLCV-NbE, hiernach als ToLCV bezeichnet) resultierte ein Geminivirus mit zweigeteiltem Genom, der die Synthese des Wildtyps von CP unterbricht, in einer drastischen Verringerung der ssDNA und in einer drei- bis vierfachen Erhöhung in der dsDNA- Anhäufung in infizierten Protoplasten. Jedoch entwickeln inokulierte Pflanzen schwere Symptome und akkumulieren Wildtypmengen an dsDNA und geringe Mengen an ssDNA.
  • Es bleibt ein Bedarf an einem besseren Verständnis der Rolle von CP in der Geminivirusreplikation.
  • Kurze Zusammensetzung der Erfindung
  • Wir haben nun herausgefunden, das ein heterologes ssDNA-bindendes Protein die Funktion von CP bei der Anhäufung von ssDNA des Geminivirus komplementieren kann. Es wurde auch herausgefunden, dass ToLCV, das zur Expression des ssDNA-bindenden Gen-5-Proteins (g5p) aus dem E. coli Phagen M13 anstelle von CP modifiziert wurde, ssDNA in Wildtypmengen in Protoplasten anhäuft, aber dahingehend versagt, sich effizient in Pflanzen zu bewegen, was die Schlüsselerkenntnis der vorliegenden Erfindung zur Verfügung stellt. Beispielhafte heterologe ssDNA-bindende Proteine sind in der Inoviridae Virus-Familie zu finden.
  • Somit beschreibt die Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung einer Resistenz in einer Pflanze gegen ein einzelsträngiges DNA- (ssDNA-) Virus der Geminivirus-Familie, das in der Lage ist, eine Pflanze zu infizieren, umfassend das Einführen eines ssDNA-bindenden Proteins der Inoviridae-Virus-Familie in die Pflanze. Das ssDNA-bindende Protein der Inoviridae-Virus-Familie wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus den Gattungen Inovirus und Plectrovirus besteht, und das Virus der Gattung Inovirus wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus Coli-Phagen-, Enterobacteria-Phagen-, Pseudomonas-Phagen-, Vibrio-Phagen- und Xanthomonas-Phagen-Arten besteht. Eine bevorzugte Coli-Phagen-Art des Virus wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus den Coli-Phagen AE2, dA, Ec9, f1, fd, HR, M13, ZG/2 und ZJ/2 besteht, wobei ein Gen-5-Protein bevorzugt ist. Besonders bevorzugt ist das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13.
  • Das Verfahren zum Einführen des ssDNA-bindenden Proteins in die Pflanze kann das Herstellen einer transgenen Pflanze umfassen, die einen Expressionsvektor zur Expression des Proteins enthält, das in Kontaktbringen einer Pflanze mit einem Expressionsvektor zur Expression des Proteins, das Infizieren der Pflanze mit einem Trägervektor, wie einem Agrobakteriumvektor und ähnliche Verfahren umfassen.
  • Die Erfindung beschreibt auch einen DNA-Expressionsvektor, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein ssDNA-bindendes Protein der Inoviridae-Virus-Familie kodiert, wobei der Vektor in der Lage ist, das Protein in Pflanzen zu exprimieren. Der Vektor wird in den hierin beschriebenen Verfahren verwendet.
  • Es wird auch eine Zusammensetzung zum Herstellen einer Resistenz gegen ein ssDNA-Virus der Geminivirus-Familie, das in der Lage ist, eine Pflanze zu infizieren, beschrieben, umfassend eine wirksame Menge eines DNA-Expressionsvektors, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein ssDNA-bindendes Protein der Inoviridae-Virus-Familie kodiert, wobei der Vektor in der Lage ist, das Protein in der Pflanze zu exprimieren. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Vektor ein Trägervektor, der die Pflanze infizieren kann. Ein besonders bevorzugter Vektor ist ein Agrobakterium-Vektor.
  • Die Erfindung sieht auch eine transgene Pflanze vor, die einen DNA-Expressionsvektor dieser Erfindung enthält, die bedingt durch die Expression eines ssDNA-bindenden Proteins, wie es hierin beschrieben wird, gegen eine ssDNA-Virusinfektion, resistent ist.
  • Andere Ausführungsformen werden sich aus den Lehren der Beschreibung und der Ansprüche ergeben.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 illustriert die Genomorganisation und schematische Darstellung von Konstrukten des Tomatenblattkräuselvirus aus Neu Delhi (ToLCV-Nde). 1A illustriert die Genomorganisation von ToLCV-Nde und zeigt die ORFs (offenen Leseraster) und deren Funktionen. CR („common region"), gemeinsame Region für beide Komponenten. 1B illustriert eine lineare physikalische Karte von AV2, und die CP-Region von ToLCV- Nde wird unten mit den Nukleotidpositionen und relevanten Restriktionsenzymschnitt stellen gezeigt. Die Positionen der verschiedenen Genersetzungen werden über der linearen Karte gezeigt. Es wird betont, dass die gezeigten Genersetzungen nicht der Skalierung entsprechen. Die Beschreibungen der Konstrukte werden in Tabelle 1 wiedergegeben.
  • 2 stellt die Replikation von ToLCV-Konstrukte in infizierten BY2-Protoplasten dar. Eine Southern Blot-Analyse wurde so, wie es in den Beispielen beschrieben wird, durchgeführt. Die zur Infektion von Protoplasten verwendeten vitalen Konstrukte werden über den Bahnen gezeigt. Die Protoplasten wurden mit DNA der Komponente A allein (Bahnen 1 – 11) inokuliert oder mit DNA-Komponenten von A und B (Bahnen 12 – 15) ko-inokuliert. Jede Bahn enthielt 4 μg DNA, die aus Protoplasten (Einzeltransfektion) hergestellt wurdn. Virale DNA wurde unter Verwendung einer radioaktiv markierten Sonde aus der DNA der Komponente A nachgewiesen. Die Position der supergewundenen („supercoiled", sc), einzelsträngigen („single-stranded", ss), offen zirkulären (oz) und linearen (li) vitalen DNA-Formen werden angezeigt. Es wird betont, dass die Positionen der supergewundenen und der anderen viralen DNA-Formen in Bahn 11 bedingt durch die größere Größe des CP66:6G:BC1 – Konstrukts nach oben verschoben sind.
  • 3 illustriert die indirekte Immunfluoreszenz der Proteine, die in Protopasten exprimiert werden (3A – 3G) und die Fluoreszenz des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), das in Pflanzen exprimiert wird (3H – 3P). Protoplasten wurden transfiziert und Antigene wurden mit unterschiedlichen Antikörpern und einem FITC- oder Rhodamin-konjugierten sekundären Antikörper sichtbar gemacht. Die GFP-Fluoreszenz in Pflanzen wurde alle drei Tage für eine Dauer von 15 Tagen beobachtet und die gezeigte Fläche korrespondiert mit 2,5 × 2,5 mm der Blattfläche. (3A) Protoplasten, die mit CP66 : Stag : 6G : g5-Virus infiziert und mit S-Protein gefärbt sind, das an FITC gebunden ist. (3B) Protoplast, der mit Wildtyp-Virus infiziert ist und mit Anti-CP-Antiseren gefärbt ist. (3C) Protoplast, der mit CP66 : GUS-Virus infiziert ist und mit Anti-GUS-Antiseren gefärbt ist. (3D) Protoplast, der mit g5 : GUSAV2- CP- Virus infiziert ist und mit Anti-GUS-Antiseren gefärbt ist. (3E) Protoplast, der mit GUSAV2- CP- Virus infiziert ist und mit Anti-GUS-Antiseren gefärbt ist. (3F) Protoplast, der mit FBV1AV2- CP- Virus infiziert ist und mit Anti-Flag-Antikörper gefärbt ist. (3G) Protoplasten, die mit TBC1AV2- CP- Virus infiziert sind und mit Anti-T7-Tag-Antikörper gefärbt sind. Es wird betont, dass zwei Zellen in dieser Mikrografik gezeigt werden. Inokuliertes Blatt (3H) und systemisches Blatt (3I) einer Pflanze, die mit GFPAV2 -CP- + CP66 : g5-Viren 6 Tage nach Inokulation infiziert wurde.
  • Inokuliertes Blatt (3J) und systemisches Blatt (3K) einer Pflanze, die mit GFPAV2- CP- + CP66 : g5- Viren 15 Tage nach der Inokulation infiziert ist. Inokuliertes Blatt (3L) und systemisches Blatt (3M) einer Pflanze, die mit GFPAV2- CP- + CP66 : 6G : g5 Viren sechs Tage nach Inokulation infiziert ist. Inokuliertes Blatt (3N) und systemische Blätter (3O und 3P) einer Pflanze, die mit GFPAV2- CP- + CP66 : 6G : g5 Viren 15 Tage nach Inokulation infiziert ist.
  • 4 illustriert die in vivo-Bindung des Gen-5-Proteins an ToLCV-Nde-DNA. (4A). Flag-Epitop-markiertes CP66 : 6G : g5- Protein, das in Protoplasten exprimiert wird, wurde mit Anti-Flag-Antikörper immunpräzipitiert, der an Agarose gebunden ist, nach dem Lysieren der Protoplasten in NP40-Puffer, der unterschiedliche Konzentrationen an NaCl (oberhalb der Bahnen gezeigt) oder RIPA-Puffer enthält, und das immunpräzipitierte Protein wurde auf einem Westernblot mit Anti-Flag-Antikörper (Bahnen 2 – 6) nachgewiesen. Bahn 1 enthielt Proteine, die aus Protoplasten immunpräzipitiert wurden, die mit Wildtyp-Virus als eine Kontrolle transfiziert waren. Die Proteinbande, die bei ≈ 24 kDa in allen Banden vorhanden ist, ist die leichte Kette des Anti-Flag-Antikörpers, der für die Immunpräzipitationen verwendet wurde. Das immunpräzipitierte CP66 : 6G : g5-Protein wurde bei zwei unterschiedlichen Molekularmassen nachgewiesen, die mit den Monomer- und Dimerformen korrespondieren. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker werden in Kilodalton auf der linken Seite gezeigt. (4B) Virale ssDNA, die mit dem Flag-Epitop-markierten CP66 : 6G : g5-Protein ko-immunpräzipitiert wurde, wurde in einem Southernblot unter Verwendung von 32P-markierter DNA der Komponente A als eine Sonde nachgewiesen. Die Banden 1 – 7 hatten die gleichen Behandlungen, wie es in 4A gezeigt wird.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass das ssDNA-bindende Protein der Inoviridae-Virus-Familie die Virusverbreitung während des Infektionsvorganges von Viren der Gemini-Virus-Familie beeinträchtigt, die in der Lage sind, eine Pflanze zu infizieren. Durch die Hemmung der Virusverbreitung wird die Virusinfektion verringert und/oder blockiert, wodurch die „Resistenz" von Pflanzen gegen die Virusinfektion erhöht wird.
  • Die Erfindung beschreibt Verfahren zur Hemmung von ssDNA-Viren der Gemini-Virus-Famlie, die in der Lage sind, eine Pflanze zu infizieren, unter Verwendung des ssDNA-bindenden Proteins der Inoviridae-Virus-Familie, Expressionsvektoren, die in der Lage sind, die bindenden Proteine in Pflanzen zu exprimieren, Zusammensetzungen zur Verabreichung der Expressionsvektoren und transgene Pflanzen, die Gene enthalten, die in der Lage sind, das bindende Protein zu exprimieren.
  • A. Verfahren zur Hemmung von ssDNA-Pflanzenviren
  • Die Erfindung schlägt Verfahren zur Herstellung einer Resistenz in einer Pflanze gegen eine Infektion und/oder die Virulent eines einzelsträngigen (ssDNA-) DNA-Virus der Gemini-Virus-Familie, das in der Lage ist, eine Pflanze zu infizieren, vor. Das Verfahren umfasst das Einführen eines ssDNA-bindenden Proteins aus der Inoviridae-Virus-Familie in eine empfängliche Pflanze.
  • Das ssDNA-bindende Protein wird typischer Weise durch die Expression einer Nukleotidsequenz bereit gestellt, die das ssDNA-bindende Protein kodiert, und die Expressionskontrollelemente enthält, die die Expression des Proteins in Pflanzen bereit stellen.
  • Das Einführen des Proteins in die Pflanze kann durch eine Reihe von Verfahren, einschließlich durch Standardgentransferverfahren, die Inokulation der Pflanze mit einem Transfer- oder Trägervektor (d. h., Infektion durch einen rekombinant entwickelten Pflanzenvirus oder Phagen), die „biolistische" (d. h., ballistische") Einführung von Nukleinsäuren in ausgereiftes Pflanzengewebe, die direkte DNA-Aufnahme in Pflanzenprotoplasten, die Transformation von Pflanzen mit auf Agrobakterium tumefaciens basierenden Vektoren und ähnliche gut bekannte Verfahren durchgeführt werden.
  • Pflanzenexpressionselemente für eine Nukleotidsequenz sind im Allgemeinen auf dem Gebiet gut bekannt und werden nicht als Einschränkung für die Erfindung angesehen. Die Nukleotidsequenz, die das ssDNA-bindende Protein kodiert, kann auf einem Expressionsvektor, als ein DNA-Fragment oder als eine Komponente eines „Transfer"- oder Trägervektors, wie dem infektiösen Agrobakterium Gentransfersystem, das üblicher Weise in Pflanzen verwendet wird, vorhanden sein.
  • Ein bevorzugtes ssDNA-bindendes Protein ist ein Protein der Inoviridae-Virus-Familie mit der Fähigkeit zur Bindung an ssDNA. Das bevorzugte Protein ist das virale „Gen 5"-Protein. Obwohl das ganze (d. h. native) Protein verwendet werden kann, können auch Teile des ganzen Proteins verwendet werden, die den ssDNA-bindenden Anteil des Proteins enthalten. Zusätzlich ist zu verstehen, dass Modifikationen an der Aminosäuresequenz eines nativen Proteins ohne das Kompromittieren der wesentlichen funktionellen Eigenschaften des Proteins für die Erfindung durchgeführt werden können. Somit bedeutet der Begriff „ssDNA-bindendes Protein" jegliches einer Reihe von Konfigurationen des Proteins, einschließlich aktive Fragmente, Fusionsproteine, die ein aktives Fragment enthalten, das gesamte Protein und Derivate davon, die die ssDNA-bindende Aktivität besitzen.
  • Die Fähigkeit zur Bindung von ssDNA kann leicht durch auf dem Gebiet anerkannte Verfahren gemessen werden, einschließlich der hierin beschriebenen Bindungsverfahren. Somit soll die Erfindung nicht als eingeschränkt interpretiert werden, so lange das ssDNA-bindende Protein die Fähigkeit zur Bindung von viraler pflanzlicher ssDNA aufweist, wie es hierin beschrieben wird, und die Virusreplikation und/oder virale Pathogenese hemmt.
  • Die Inoviridae-Virus-Familie ist eine große Familie, die die Gattungen Inovirus und Plectovirus umfasst. Bevorzugte Inovirus-Arten umfassen Coli-Phagen-, Enterobakteria-Phagen-, Pseudomonas-Phagen, Vibrio-Phagn- und Xanthomonas-Phagenarten. Bevorzugte Coli-Phagen-Arten umfassen AE2, dA, Ec9, f1, fd, HR, M13, ZG/2 und ZJ/2 Coli-Phagen. Ein besonders bevorzugtes Protein ist das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13.
  • In bevorzugten Ausführungsformen hat das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13 die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird.
  • In einer verwandten Ausführungsform umfasst das Verfahren das Einführen des ssDNA-bindenden Proteins durch das Herstellen einer transgenen Pflanze, die ein Gen umfasst, das in der Lage ist, das Protein zu exprimieren, und dadurch wird eine Pflanzenresistenz gegen den ssDNA-Pflanzenvirus bereit gestellt. Die Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die in der Lage ist, ein Fremdprotein, wie ein ssDNA-bindendes Protein dieser Erfindung zu exprimieren, werden weiter hierin beschrieben.
  • In einer weiteren verwandten Ausführungsform umfassen die Verfahren das Einführen des ssDNA-bindenden Proteins durch das in Kontaktbringen der Pflanze mit einer Zusammensetzung, die einen Expressionsvektor enthält, der in der Lage ist, das Protein in der Pflanze zu exprimieren. Verfahren zur Herstellung und Verwendung eines Expressionsvektors in einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung werden weiter hierin beschrieben.
  • In den verschiedenen auf Nukleinsäure basierenden Verfahren, in denen eine Nukleotidsequenz das ssDNA-bindende Protein kodiert, und die in der Lage ist, das Protein zu exprimieren, ist es zu verstehen, dass die Nukleotidsequenz in ihrem Inhalt variieren kann, so lange ein vorgesehenes ssDNA-bindendes Protein kodiert wird. Zum Beispiel toleriert der genetische Code die Variation der Kodonverwendung zur Kodierung einer Aminosäuresequenz, und daher ist die Erfindung nicht dahingehend als auf eine bestimmte Nukleinsäuresequenz eingeschränkt auszulegen.
  • Jedoch ist auch zu verstehen, dass eine Expressionsumgebung, z. B. die Pflanzenzelle, bevorzugte Kodonverwendungen aufweist, und daher ist es wünschenswert, die bevorzugten Kodons zur Optimierung der Expression der exprimierbaren Gene in Pflanzen zu verwenden.
  • Diesbezüglich kann eine bevorzugte Nukleotidsequenz zur Verwendung in einem Expressionsvektor oder einer transgenen Pflanze dieser Erfindung bevorzugte Kodons verwenden. Eine besonders bevorzugte Nukleotidsequenz zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kodiert ein Gen-5-Protein aus M13, vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird. In einer Ausführungsform umfasst eine bevorzugte Nukleotidsequenz die Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt wird, die die native Nukleotidsequenz aus dem vitalen Genom von M13 ist, die das native Gen-5-Protein aus M13 kodiert. In einer anderen Ausführungsform umfasst eine bevorzugte Nukleotidsequenz die Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 3 gezeigt wird, die eine synthetische Nukleotidsequenz ist, die entwickelt wurde, um bevorzugte Kodonverwendungen für hoch exprimierte menschliche Gene einzubringen, und die das native Gen-5-Protein aus M13 kodiert.
  • Die vollständige Sequenz des Bakteriophagen M13, einschließlich der das Gen-5-kodierenden Sequenz, ist von GenBank unter den Zugangszahlen V00604, J02461 und M10377 verfügbar. Die Aminosäuresequenz der Nukleotidsequenz, die das Gen-5 aus M13 kodiert, wird jeweils in den SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigt.
  • Das eingeführte Protein ist zur Hemmung einer Infektion eines jeglichen ssDNA-Virus aus der Geminiviridae-Familie, die Pflanzen infizieren, wirksam. Bevorzugte Viren sind die Viren der Geminiviridae-Familie, die die Gattungen Mastrevirus, Curfovirus und Begomovirus umfassen.
  • Bevorzugte Arten der Gattung Mastrevirus werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus Bajra-Streak-Virus, Bean-Yellow-Dwarf-Virus (Verzwergungs-Virus), Bromus-Striate-Mosaic-Virus, Chickpea-Chlorotic-Dwarf-Virus, Chlorfis-Striate-Mosaic-Virus, Digitaria-Streak-Virus, Digitaria-Striate-Mosaic-Virus, Maize-Streak-Virus//Äthiopien, Maize-Streak-Virus//Ghana1, Maize-Streak-Virus//Ghana2, Maize-Streak-Virus//Kenia, Maize-Streak-Virus//Komatipoort, Maize-Streak-Virus//Malawi, Maize-Streak-Virus//Mauritius, Maize-Streak-Virus//Mosambik, Maize-Streak-Virus//Nigeria1, Maize-Streak-Virus//Nigeria2, Maize-Streak-Virus//Nigeria3, Maize-Streak-Virus//Port Elizabeth, Maize-Streak-Virus//Reunion1, Maize-Streak-Virus//Reunion2, Maize-Streak-Virus//Setaria, Maize-Streak-Virus//Südafrika, Maize-Streak-Virus//Tas, Maize-Streak-Virus//Uganda, Maize-Streak-Virus/Naalhart-Mais, Maize-Streak-Virus//Vaalhart-Weizen, Maize-Streak-Virus//Weizen-Eleusian, Maize-Streak-Virus//Zaire, Maize-Streak-Virus//Zimbabwe1, Maize-Streak-Virus//Zimbabwe2, Miscanthus-Streak-Virus, Panicum-Streak-Virus/Karino, Panicum-Streak-Virus/Kenia, Paspalum-Striate-Mosaic-Virus, Sugarcane-Streak- Virus/Ägypten, Sugarcane-Streak-Virus/Natal, Sugarcane-Streak-Virus/Mauritius, Tobacco-Yellow-Dwarf-Virus (Verzwergungs-Virus), Weizen-Verzwergungs-Virus/Tschechische Republik [Weizen-Verzwergungs-Virus-CJI, WDV-CJI], Weizen-Verzwergungs-Virus/Frankreich und Weizen-Verzwergungs-Virus/Schweden besteht.
  • Bevorzugte Arten der Gattung Curtovirus werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus Beet-Curly-Top-Virus Kalifornien, Beet-Curly-Top-Virus Kalifornien//Logan, Beet-Curly-Top-Virus-CFH, Beet-Curly-Top-Virus//Iran, Beet-Curly-Top-Virus Worland, Horseradish-Curly-Top-Virus, Tomato-Leafroll-Virus (Tomaten-Blattroll-Virus) und Tomato-Pseudo-Curly-Top-Virus besteht.
  • Bevorzugte Arten der Gattung Begomovirus werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus Abutilon-Mosaic-Virus, Acalypha-Yellow-Mosaic-Virus, Afrikanischem Cassava-Mosaic-Virus//Ghana, Afrikanischem Cassava-Mosaic-Virus//Kenia, Afrikanischem Cassava-Mosaic-Virus//Nigeria, Afrikanischem Cassava-Mosaic-Virus//Uganda, Ageratum-Yellow-Vein-Virus, Althea-Rosea-Enation-Virus, Asystasia-Golden-Mosaic-Virus, Bean-Calico-Mosaic-Virus, Bean-Dwarf-Mosaic-Virus, Bean-Golden-Mosaic-Virus Brasilien, Bean-Golden-Mosaic-Virus Puerto-Rico, Bean-Golden-Mosaic-Virus Puerto-Rico/Dominikanische Rep. [Bean-Golden-Mosaic-Virus Dominikanische-Rep., BGMV-DR], Bean-Golden-Mosaic-Virus Puerto-Rico/Guatemala [Bean-Golden-Mosaic-Virus Guatemala, GBMV-GA], Bhendi-Yellow-Vein-Mosaic-Virus, Chinodel-Tomato-Virus [Tomato-Leaf-Crumple-Virus, TLCrV], Cotton-Leaf-Crumple-Virus, Cotton-Leaf-Curl-Virus Indien, Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan1/Faisalabad1 [Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan2], Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan1/Faisalabad2 [Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan3], Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan1/Multan [Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan1], Cotton-Leaf-Curt-Virus Pakistan2Faisalabad [Pakistanischem Cotton-Leaf-Curl-Virus], Cowpea-Golden-Mosaic-Virus, Cooton-Yellow-Vein-Mosaic-Virus//Lucknow, Dolichos-Yellow-Mosaic-Virus, Ostafrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Kenia, Ostafrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Malawi, Ostafrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Tansania, Ostafrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Uganda//1 [Afrikanischem Cassava-Mosaic-Virus Uganda-Variante], Ostafrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Uganda//2, Eclipta-Yellow-Vein-Virus, Eggplant-Yellow-Mosaic-Virus, Eupatorium-Yellow-Vein-Virus, Euphorbia-Mosaic-Virus, Honeysuckle-Yellow-Vein-Mosaic-Virus, Horsegram-Yellow-Mosaic-Virus, Indischem Cassava-Mosaic-Virus, Jatropha-Mosaic-Virus, Leonurus-Mosaic-Virus, Limabean-Golden-Mosaic-Virus, Lupin-Leaf-Curl-Virus, Macroptilium-Golden-Mosaic-Virus Jamaika//2, Macroptilium-Golden-Mosaic-Virus Jamaika//3, Macrotyloma-Mosaic-Virus, Malvaceous-Chlorosis-Virus, Melon-Leaf-Curl-Virus, Mungbean-Yellow-Mosaic-Virus, Okra-Leaf-Curl-Virus/Elfenbeinküste, Okra-Leaf-Curl-Virus/Indien, Papaya-Leaf-Curl-Virus, Pepper-Huasteco-Virus, Pepper-Golden-Mosaic-Virus, [Texas-Pepper-Virus], Pepper-Mild-TigrA-Virus, Potato-Yellow-Mosaic-Virus//Guadeloupe, Potato-Yellow-Mosaic-Virus/Trinidad und Tobago, Potato-Yellow-Mosaik-Virus/Venezuela, Pseuderanthemum-Yellow-Vein-Virus, Rhynchosia-Mosaic-Virus, Serrano-Golden-Mosaic-Virus, Sida-Golden-Mosaic-Virus/Costa Rica, Sida-Golden-Mosaic-Virus/Honduras, Sida-Golden-Mosaic-Virus/Honduras//Yellow-Vein, Sida-Yellow-Vein-Virus, Solanum-Apical-Leaf-Curl-Virus, Soybean-Crincle-Leaf-Virus, Squash-Leaf-Curl-Virus, Squash-Leaf-Curl-Virus/Erweiterter Wirt, Squash-Leaf-Curl-Virus/Eingeschränkter Wirt, Squash-Leaf-Curl-Virus/Los Mochis, Squash-Leaf-Curl-Virus China, Tomato-Golden-Mosaic-Virus/Gewöhnlicher Stamm, Tomato-Golden-Mosaic-Virus/Yellow-Vein-Stamm, Tobacco-Leaf-Curl-Virus//Indien, Tobacco-Leaf-Curl-Virus China, Tomato-Leaf-Curl-Virus//Solanum-Art D1, Tomato-Leaf-Curl-Virus//Solanum-Art D2, Tomato-Leaf-Curl-Virus Australien, Tomato-Leaf-Curl-Virus Bangalore1 [Indischem Tomato-Leaf-Curl-virus Bangalorel], Tomato-Leaf-Curl-Virus Bongalore2, [Indischem Tomato-Leaf-Curl-Virus, ItoLCV], Tomato-Leaf-Curl-Virus Bangalore3 [Indischem Tomato-Leaf-Curl-Virus Bangalorell] Tomato-Leaf-Curl-Virus Neu Delhi/Stark [Tomato-Leaf-Curl-Virus Indien2, TYLCV-IN1], Tomato-Leaf-Curl-Virus Neu Delhi/Schwach [Tomato-Leaf-Curl-Virus Indien2, ToICV-IN2], Tomato-Leaf-Curl-Virus Neu Delhi/Lucknow [Indischem Tomato-Leaf-Curl-Virus], Tomato-Leaf-Curl-Virus//Senegal, Tomato-Leaf-Curl-Virus Sinaloa [Sinaloa-Tomato-Leaf-Curl-Virus, STLCV], Tomato-Leaf-Curl-Virus Taiwan, Tomato-Leaf-Curl-Virus Tansania, Tomato-Mottle-Virus, Tomato-Mottle-Virus Taino [Taino-Tomato-Mottle-Virus, TTMoV], Tomato-Severe-Leaf-Curl-Virus/Guatemala, Tomato-Severe-Leaf-Curl-Virus//Honduras, Tomato-Severe-Leaf-Curl-Virus//Nicaragua, Tomato-Yellow-Dwarf-Virus (Verzwergungs-Virus), Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus China, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel/Schwach, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel/Ägypten, [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Ägypten, TYLCV-EG], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel//Kuba, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel//Kuba, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel//Jamaika, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel//Saudi Arabien1, [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Nördliches Saudi-Arabien, TYLCV-NSA], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Nigeria, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Sardinien, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Sardinien/Sizilien [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Sizilien, TYLCV-SY], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Sardinien/Spanien//1 [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Spanien, TYLCV-Sp], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Sardinien/Spanien//2 [Tomato-Yellow-Leaf-Curl- Virus Almeria, TYLCV-Almeria], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Sardinien/Spanien//3 [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Europäischer Stamm], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Saudi-Arabien [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Südliches Saudi-Arabien, TYLCV-SSA], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Tansania, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Thailand//1, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Thailand//2, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus//Jemen, Tomato-Yellow-Mosaic-Virus Brasilien//1, Tomato-Yellow-Mosaic-Virus Brasilien//2, Tomato-Yellow-Mottle-Virus, Tomato-Yellow-Vein-Streak-Virus Brasilien, Watermelon-Chlorotic-Stunt-Virus, Watermelon-Curly-Mottle-Virus und Wissadula-Golden-Mosaic-Virus Jamiaka//1 besteht.
  • Die oben beschriebenen ssDNA-Pflanzenviren, die durch die vorliegenden Verfahren gehemmt werden können, infizieren eine große Anzahl von Pflanzenarten. Insoweit neue Pflanzenarten entdeckt werden, die gegenüber einer Infektion durch einen ssDNA-Pflanzenvirus empfänglich sind, wie er gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, ist zu verstehen, dass die Erfindung nicht dahingehend vorgesehen ist, nur auf bekannte Pflanzen eingeschränkt zu sein. Statt dessen ist eine Pflanze gemäß den vorliegenden Verfahren dahingehend vorgesehen, jegliche Pflanze zu sein, die für eine Infektion durch den beschriebenen ssDNA-Pflanzenvirus der Inoviridae-Virus-Familie empfänglich ist, wobei die Empfänglichkeit leicht durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren, einschließlich der hierin beschriebenen Infektionsverfahren, bestimmt werden kann.
  • Der Begriff „Pflanze" umfasst ganze Pflanzen, Pflanzenorgane (z. B., Blätter, Stämme, Wurzeln, etc.), Samen und Pflanzenzellen und Nachkommen derselben. Die Klasse der Pflanzen, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden kann, ist im Allgemeinen so breit wie die Klasse der höheren Pflanzen, die Transformationstechniken zugänglich sind, und umfasst sowohl die einkeimblättrigen (Monokotyledonen) wie auch die zweikeimblättrigen (Dikotyledonen) Pflanzen. Sie umfasst Pflanzen einer Vielzahl ploider Formen, einschließlich polyploide, diploide und haploide Formen.
  • Beispielhafte Pflanzen, die für eine Infektion empfänglich sind, und daher Zielpflanzen für die Behandlungsverfahren und Zusammensetzungen sind, die hierin beschrieben werden, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, eine Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Abutilon, Acalypha, Apfel, Ageratum, Althea rosea, Asystasia, Bajra, Banane, Gerste, Bohnen, Rübe, Urbohne („Blackgram"), Bromus, Cassava, Kichererbse, Paprikas, Chlorfis, Klee, Kokosnuss, Kaffee, Baumwolle, Kuherbse/-Bohne, Croton, Gurke, Digitaria, Dolichos, Aubergine, Eupatorium, Euphorbia, Fababohne, Geißblatt, Pferdebohne, Jatropha, Leonurus, Limabohne, Lupine, Macroptilium, Macrotyloma, Mais, Melone, Hirse, Mungbohne, Hafer, Okra, Panicum, Papaya, Paspalum, Erdnuss, Erbse, Pfeffer, Straucherbse (Taubenerbse), Ananas, Phaseolus, Kartoffel, Pseuderanthemum, Speisekürbis („Pumpkin"), Rhynchosia, Reis, Serrano, Sida, Sorghum, Sojabohne, Kürbis („Squash"), Zuckerrohr, Zuckerrübe, Sonnenblume, Süßkartoffel, Tee, Tomate, Tabak, Wassermelone, Weizen und Wissadula oder jeglicher einzelnen Pflanze oder Kombination von Pflanzen davon besteht.
  • Bevorzugte Beispiele der Verfahren der Erfindung werden hierin unter Verwendung des Gen-5-Proteins aus M13, das unter Verwendung eines rekombinanten Tamatenblattkräuselvirus (ToLCV)- Vektors auf Tabakpflanzen und Protoplasten exprimiert wird, beschrieben. Die viralen genomischen Nukleotidsequenzen des ToLCV für sowohl die Awie auch B-Komponenten des zweiteiligen Genoms des ToLCV sind bekannt und sind jeweils unter den GenBank Zugangszahlen U15015 und U15016 verfügbar und werden jeweils in SEQ ID NO: 4 und 5 gezeigt.
  • B. Nukleinsäuremoleküle
  • Die Erfindung schlägt auch ein Nukleinsäuremolekül vor, wie einen DNA-Expressionsvektor, der zur Expression eines ssDNA-bindenden Proteins dieser Erfindung in Pflanzen nützlich ist. Somit enthält das Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die das ssDNA-bindende Protein der Inoviridae-Virus-Familie dieser Erfindung kodiert, und enthält zusätzlich Elemente zur Regulation und Steuerung der Genexpression in Pflanzen. Beispielhafte Elemente zur Expression in Pflanzen werden in den U.S. Patenten Nr. 5,188,642, 5,202,422, 5,463,175 und 5,639,947 beschrieben. Zusätzlich sind die Verfahren zur Manipulation von Nukleinsäuren und zur Herstellung von Expressionsvektoren in Pflanzen im Allgemeinen gut bekannt und sind daher nicht als einschränkend für die vorliegende Erfindung auszulegen.
  • Beispielhafte Expressionsvektoren und Systeme zur Einführung eines ssDNA-bindenden Proteins in Pflanzen werden in den Beispielen beschrieben.
  • Somit beschreibt die Erfindung in einer Ausführungsform ein auf Nukleinsäure basierendes Expressionssystem, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein ssDNA-bindendes Protein der Inoviridae-Virus-Familie kodiert, wobei das Expressionssystem in der Lage ist, das Protein in einer Pflanze zu exprimieren, die für eine Infektion durch einen ssDNA-Pflanzenvirus der Gemini-Virus-Familie, wie es hierin beschrieben wird, empfänglich ist.
  • Das ssDNA-bindende Protein kann jegliches Protein sein, wie es hierin beschrieben wird, und ist zur Durchführung der Verfahren der Erfindung bevorzugt. Besonders bevorzugt ist das Gen-5-Protein aus M13, wie die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird.
  • Das Expressionssystem kann abhängig von der vorgesehenen Verwendung ein Vektor oder ein Gen sein. In dem Fall einer transgenen Pflanze beschreibt die Erfindung ein Gen, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine Expressionskassette definiert, d. h., die notwendigen Elemente zur Expression eines strukturellen Gens eines ssDNA-bindenden Proteins, einschließlich Promotoren, Transkriptionsstartsignale, Translationsstartsignale, eine das Strukturprotein kodierende Sequenz und Translations- und Transkriptionsstoppsequenzen, die wohl bekannt sind. In dem Fall eines Vektors oder eines infektiösen Mittels, das verwendet wird, um eine Expressionskassette einzuführen, umfasst der Vektor oder das Mittel zusätzliche genetische Elemente, die für die Funktion des Vektors oder des infektiösen Mittels geeignet sind.
  • Zum Beispiel kann der Vektor auch Elemente enthalten, die die Replikation, Manipulation und Ähnliches bereit stellen, wie sie auf Plasmiden zu finden sind, die die Massenherstellung des Vektors erleichtern. In dem Fall von infektiösen Mitteln, die typischer Weise modifizierte Pflanzenviren oder Pflanzenphagen sind, die die Pflanze infizieren können, kann das Mittel zusätzliche Elemente zur Replikation des Mittels und zum Zusammenbau in eine infektiösen Partikel enthalten, die wohl bekannt ist.
  • Eine bevorzugte Expressionskassette ist ein Vektor, ein Gen oder ein infektiöses Mittel gemäß der Erfindung, der/das eine Nukleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 2 oder 3 gezeigt wird, wie sie hierin beschrieben wird.
  • Zur allgemeinen Klonierung von Nukleinsäuren werden Plasmide verwendet, die wohl bekannt sind. Ein bevorzugtes Klonierungsplasmid, das hierin verwendet wird, ist der pBluescript II SK- Vektor (Stratagene, La Jolla, CA). Die vollständige Nukleotidsequenz des pBluescript- Plasmids ist in GenBank unter der Zugangsnummer X52330 verfügbar und wird auch in SEQ ID NO: 6 gezeigt.
  • Für Pflanzentransformationen sind eine Reihe von Verfahren, Vektoren und Mittel verfügbar, und daher ist die Erfindung nicht dahingehend als eingeschränkt auszulegen. Beispielhafte Verfahren umfassen die Pflanzentransformation, die die direkte Aufnahme einer Expressionskassette aus Nukleinsäuren in einen Protoplasten, gefolgt durch Pflanzenregeneration zur Ausbildung einer Pflanze, die Elektroporation in einen Protoplasten, die biolistische Verabreichung einer Nukleinsäure in entweder kultivierte Pflanzenzellen oder ganzes Pflanzengewebe, durch Pollen vermittelte Transformationen, die Infektion durch einen rekombinanten Virus oder ein Phagenmittel, wie die modifizierte ToLCV- oder eine durch Agrobakterium vermittelte Transformation und Ähnliches umfasst. Beispielhafte Vektoren zur Durchführung einiger der oben genannten Verfahren umfassen pBIN19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res., 12 : 8711, 1984; GenBank Zugangszahl U09365), pMON316 oder pMON, die von Monsanto verfügbar sind (St. Louis, MO), pGA482 (An et al., Plant Physiol., 81 : 86, 1986), pCGN1547 (McBride et al., Plant Mol. Biol., 14 : 269, 1990), pPZP100 (Ajdukiewicz et al., Plant Mol. Biol., 25 : 989, 1994, und GenBank Zugangsnummer U10456) pMOG410 und Ähnliche.
  • C. Transgene Pflanzen
  • Die Erfindung schlägt zusätzlich eine transgene Pflanze vor, die eine Nukleotidsequenz dieser Erfindung enthält, zur Expression des ssDNA-bindenden Proteins der Inoviridae-Virus-Familie. Die transgene Pflanze enthält eine Expressionskassette, wie sie hierin definiert wird, als einen Teil der Pflanze, wobei die Kassette durch Transformation einer Pflanze mit einem Vektor dieser Erfindung eingeführt wurde.
  • Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, werden in den U.S. Patenten Nr. 5,188,642; 5,202,422; 5,234,834; 5,463,175 und 5,639,947 beschrieben.
  • Techniken zur Transformation einer großen Bandbreite an Pflanzenarten sind wohl bekannt und werden in der technischen und wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Siehe zum Beispiel Weising et al., Ann. Rev. Genet., 22 : 421 – 477, 1988. Ein konstitutiver oder induzierbarer Promoter wird in einem geeigneten Vektor operativ an die gewünschte heterologe DNA-Sequenz gebunden, die ein ssDNA-bindendes Protein dieser Erfindung kodiert. Der Vektor, der einen Promoter umfasst, der an die heterologe DNA gebunden ist, wird typischer Weise ein Markergen enthalten, das einen selektierbaren Phenotyp auf die Pflanzenzelle vermittelt. Zum Beispiel kann der Marker eine Biocidresistenz, insbesondere Antibiotikaresistenz, wie eine Resistenz gegen Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, oder eine Herbizidresistenz, wie eine Resistenz gegen Chlorsulfuron oder Basta kodieren. Solche selektiven Markergene sind in Protokollen zur Herstellung von transgenen Pflanzen nützlich.
  • DNA-Konstrukte, die die Expressionskassette enthalten, können das Genom der gewünschten Pflanzenwirtszelle durch eine Reihe konventioneller Techniken eingeführt werden. Zum Beispiel kann das DNA-Konstrukt direkt in die DNA der Pflanzenzelle unter Verwendung von Techniken wie der Elektroporation und Mikroinjektion von Pflanzenzellenprotoplasten eingeführt werden. Alternativ dazu können die DNA-Konstrukte direkt in Pflanzengewebe unter Verwendung biolistischer Verfahren, wie der Bombardierung mit DNA-Mikropartikeln eingeführt werden. Zusätzlich können die DNA-Konstrukte mit geeigneten T-DNA-flankierenden Regionen verbunden werden und in einen konventionellen Agrobakterium tumefaciens – Wirtsvektor eingeführt werden. Die Virulenzfunktionen des Agrobakterium tumefaciens – Wirts werden das Einfügen des Konstrukts und den benachbarten Markers in die DNA der Pflanzenzelle dirigieren, wenn die Pflanzenzelle mit dem Bakterium infiziert wird.
  • Mikroinjektionstechniken sind auf dem Gebiet bekannt und gut in der wissenschaftlichen und Patentliteratur beschrieben. Die Einführung von DNA-Konstrukten unter Verwendung einer Polyethylenglycolfällung wird in Paszkowski et al., EMBO J., 3 : 2717 – 2722, 1984, beschrieben. Elektroporationstechniken werden in Fromm et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 82 : 5824, 1985, beschrieben. Biolistische Transformationstechniken werden in Klein et al., Nature 327 : 70 – 73, 1987, beschrieben.
  • Eine Variation involviert die biolistische Penetration mit Hochgeschwindigkeit durch kleine Partikel, bei denen die Nukleinsäure entweder innerhalb der Matrix kleiner Kügelchen oder Partikel oder auf der Oberfläche vorliegt (Klein et al., Nature, 327 : 70 – 73, 1987). Obwohl typischer Weise nur eine einzelne Einführung eines Nukleinsäuresegments notwendig ist, ermöglicht dieses Verfahren insbesondere mehrfache Einführungen.
  • Durch Agrobakterium tumefaciens vermittelte Transformationstechniken werden in der wissenschaftlichen Literatur gut beschrieben. Siehe zum Beispiel Horsch et al., Science, 233 : 496 – 498, 1984, und Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90 : 4803, 1983. Genauer gesagt wird eine Pflanzenzelle, ein Ableger, ein Meristem oder ein Samen mit Agrobakterium tumefaciens infiziert, das mit dem Segment transformiert wurde. Unter geeigneten Bedingungen, die auf dem Gebiet bekannt sind, werden die transformierten Pflanzenzellen wachsen gelassen, um Triebe, Wurzeln zu bilden und sich weiter in ganze Pflanzen zu entwickeln. Die Nukleinsäuresegmente können in geeignete Pflanzenzellen eingeführt werden, zum Beispiel mittels des Ti-Plasmids von Agrobakterium tumefaciens. Das Ti-Plasmid wird in Pflanzenzellen bei der Infektion durch Agrobakterium tumefaciens übertragen und wird in das Pflanzengenom stabil integriert (Horsch et al., Science, 233 : 496 – 498, 1984; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90 : 4803, 1983.)
  • Die Ti-Plasmide enthalten zwei Regionen, die für die Produktion transformierter Zellen wesentlich sind. Eine von diesen, die Transfer-DNA (T-DNA) genannt wird, induziert die Tumorbildung. Die andere, die Virulenzregion genannt wird, ist für die Einführung der T DNA in Pflanzenzellen wesentlich. Die Transfer-DNA-Region, die zu dem Pflanzengenom transferiert wird, kann in ihrer Größe durch das Einführen der Fremdnukleinsäuresequenz ohne das Beeinträchtigen ihrer Übertragungsfähigkeit erhöht werden. Durch das Entfernen der Tumor-auslösenden Gene, so dass sie nicht länger beeinträchtigen, kann das modifizierte Ti-Plasmid dann als ein Vektor, wie ein „behinderter Ti-Vektor", für die Übertragung der Genkonstrukte der Erfindung in eine geeignete Pflanzenzelle verwendet werden.
  • Alle Pflanzenzellen, die durch Agrobakterium transformiert werden können, sowie ganze Pflanzen, die aus den transformierten Zellen regeneriert wurden, können auch gemäß der Erfindung transformiert werden, um transformierte ganze Pflanzenzellen herzustellen, die die übertragene Fremdnukleinsäuresequenz enthalten.
  • Es gibt verschiedene Arten zur Transformierung von Pflanzenzellen mit Agrobakterium, umfassend:
    • (1) die Ko-Kultivierung von Agrobakterium mit kultivierten isolierten Protoplasten,
    • (2) die Ko-Kultivierung von Zellen oder Geweben mit Agrobakterium, oder
    • (3) die Transformation von Samen, Spitzen oder Meristems mit Agrobakterium.
  • Verfahren (1) setzt ein etabliertes Kultursystem voraus, das die Kultivierung von Protoplasten und die Pflanzenregeneration aus kultivierten Protoplasten ermöglicht. Verfahren (2) setzt (a) voraus, dass die Pflanzenzellen oder -gewebe durch Agrobakterium transformiert werden können und (b) dass die transformierten Zellen oder Gewebe induziert werden können, um in ganzen Pflanzen zu regenerieren.
  • Verfahren (3) setzt eine Mikrovermehrung voraus.
  • In dem binären System werden zwei Plasmide benötigt, um eine Infektion zu begründen:
    ein T-DNA-haltiges Plasmid und ein vir-Plasmid. Es kann jede Anzahl von T-DNA-haltigen Plasmiden verwenden werden, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass das eine in der Lage ist, unabhängig für jedes der beiden Plasmide zu selektieren.
  • Nach der Transformation der Pflanzenzelle oder der Pflanze können solche Pflanzenzellen oder Pflanzen, die mit dem Ti-Plasmid transformiert wurden, so dass das gewünschte DNA-Segment integriert ist, durch einen geeigneten phenotypischen Marker ausgewählt werden. Diese phenotypischen Marker umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Antibiotikaresistenz, Herbizidresistenz oder visuelle Sichtung. Andere phenotypischen Marker sind auf dem Gebiet bekannt und können in dieser Erfindung verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von Expressionsvektoren, die hierin beschrieben werden, für die Transformation einer Pflanze, einschließlich sowohl zweikeimblättriger wie auch einkeimblättriger Pflanzen. Die Transformation von zweikeimblättrigen Pflanzen wird in den Bezugsstellen oben beschrieben. Die Transformation von einkeimblättrigen Pflanzen unter Verwendung verschiedener Techniken, einschließlich der Elektroporation (z. B. Shimamoto et al., Nature, 338 : 274 – 276, 1992; Ballistiken (z. B. europäische Patentanmeldung 270, 356) und Agrobakterium (z. B. Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84 : 5345 – 5349, 1987) ist bekannt.
  • Transformierte Pflanzenzellen, die aus jeglicher der oben genannten Transformationstechniken abgeleitet werden, können kultiviert werden, um eine ganze Pflanze zu regenerieren, die den gewünschten transformierten Phenotyp besitzt. Solche Regenerationstechniken basieren auf der Manipulation bestimmter Phytohormone in einem Gewebekulturwachstumsmedium, das typischer Weise auf einem Biozid- und/oder Herbizidmarker basiert, der zusammen mit den Nukleotidsequenzen eingeführt wurde. Die Pflanzenregeneration aus kultivierten Protoplasten wird in Evans et al., Handbook of Plant Cell Culture, S. 124 – 176, MacMillan Publishing Company, New York, 1983 und Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, S. 21 – 73, CRC Press, Boca Raton, 1985, beschrieben. Die Regeneration kann auch aus Pflanzencallus, Trieben, Organen oder Teilen davon, durchgeführt werden. Solche Regenerationstechniken werden im Allgemeinen durch Klee et al., Ann. Rev. Plant. Phys., 38: 467 – 486, 1987, beschrieben.
  • Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass, nachdem eine Expressionskassette stabil in die transgenen Pflanzen eingebracht wurde und als funktionell bestätigt wurde, sie abhängig von der zu kreuzenden Art in andere Pflanzen durch sexuelle Kreuzung eingeführt werden kann. Es kann jegliche Anzahl von Standardzüchtungstechniken verwendet werden.
  • D. Zusammensetzungen
  • Auch vorgesehen ist eine Zusammensetzung, die zur Einführung einer Nukleinsäuresequenz dieser Erfindung in Pflanzen nützlich ist. Die Zusammensetzung ist zur Herstellung einer Resistenz gegen einen ssDNA-Virus der Gemini-Virus-Familie, der Pflanzen infiziert, nützlich und umfasst eine wirksame Menge der Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung zum Einführen des ss-DNA-bindenden Proteins der Gemini-Virus-Familie in eine Zelle und hängt von dem Verfahren ab, das verwendet wird, um das Protein in die Pflanze einzuführen. Zum Beispiel ist die Zusammensetzung bei Verwendung einer direkten DNA-Aufnahme durch Protoplasten eine wässrige Lösung, die Nukleinsäure und Puffer enthält, um die Aufnahme durch Protoplasten zu erleichtern, wie es wohl bekannt ist. Zur Transformation durch einen Agrobakterium-Vektor enthält die Zusammensetzung eine Suspension aus Agrobakterien, die die Nukleotidsequenz enthalten, die in der Lage ist, das ssDNA-bindende Protein zu exprimieren.
  • E. Systeme zur Verwendung
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein System, vorzugsweise in Kit-Form, das zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich ist. Somit sind die Kits zum Einführen einer Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung in eine Pflanze, wie es in den Verfahren dieser Erfindung durchgeführt wird, nützlich.
  • Das Kit umfasst eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer Menge, die ausreicht, um wenigstens eine Einführung durchzuführen, die ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die in der Lage ist, ein ssDNA-bindendes Protein gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, die in einem Verpackungsmaterial oder Behälter zur Bereitstellung des Systems vorhanden ist.
  • Typischer Weise sind auch Instruktionen zur Verwendung des verpackten Reagenz in dem System in der Form einer Verpackungsbeilage oder eines Aufklebers vorhanden.
  • „Instruktionen zur Verwendung" umfassen typischer Weise einen geeigneten Ausdruck, der die Inhalte des Reagenzien) in dem System oder wenigstens einen Verfahrensparameter, wie die relativen Mengen der Zusammensetzung und der Pflanze, die vermischt werden sollen, Verfahren zum in Kontaktbringen der Pflanze, Temperatur, Pufferbedingungen und Ähnliches zur Durchführung eines Verfahrens der Erfindung beschreibt. Typischer Weise werden die Instruktionen das Verfahrens zum in Kontaktbringen einer Pflanze zum Einführen des ssDNA-bindenden Proteins der Inoviridae-Virus-Familie in eine Pflanze und dadurch das Hemmen der Symptome einer ssDNA-Virusinfektion durch ein Mitglied der Geminivirusfamilie in der Pflanze beschreiben.
  • Die Reagenzarten, das infektiöse Mittel, Virus oder Phage, Nukleinsäuremolekül oder Expressionsvektor zur Durchführung eines Verfahrens, das hierin beschrieben wird, können in Lösungen, als eine flüssige Dispersion oder ein im Wesentlichen trockenes Pulver, z. B. in lyophilisierter Form, bereit gestellt werden.
  • Der Begriff „Verpackung" bezieht sich auf eine feste Matrix oder ein Material wie Glas, Plastik (z. B. Polyethylen, Polypropylen und Polycarbonat), Papier, Folie und Ähnliches, das/die in der Lage ist, in begrenzter Räumlichkeit ein Reagenz wie ein Polynukleotid, Transformationsmittel, infektiöses Virus oder Phagen der vorliegenden Erfindung aufzunehmen. Somit kann zum Beispiel eine Verpackung eine Flasche, ein Schraubbecher, Plastik- und Plastikfolien-laminierter Umschlag oder ähnlicher Behälter sein, der verwendet wird, um eine vorgesehene Zusammensetzung zu beinhalten.
  • Die Verpackung kann eine oder mehrere Einheitsdosierungen der Zusammensetzung der Erfindung enthalten oder kann alternativ dazu mit der Zusammensetzung verpackt werden, die als Großmenge bereit gestellt wird.
  • Ein System dieser Erfindung kann ein Trägermittel umfassen, das kompatimentiert ist, um in enger räumlicher Nähe einen oder mehrere Behälter wie Schraubbecher, Röhrchen und Ähnliches aufzunehmen, wobei jeder der Behälter eines der getrennten Elemente umfasst, das in dem Verfahren zu verwenden ist. Zum Beispiel kann einer der Behälter eine Zusammensetzung zum Infizieren einer Pflanze enthalten. Das Kit kann auch Behälter aufweisen, die andere Reagenzien enthalten, die bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden.
  • Andere Verwendungen werden sich einem Fachmann auf dem Gebiet im Lichte der vorliegenden Offenbarungen und der folgenden Beispiele von selbst ergeben.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele werden im Wege einer Darstellung und nicht einer Einschränkung bereit gestellt.
  • 1. Plasmidkonstrukte
  • Infektiöse Klone der A- und B-Komponenten des Tomatenblattkräuselvirus (Padidam et al., J. Gen. Virol., 76 : 25 – 35, 1995) wurden eingesetzt, um die Viruskonstrukte, die hierin verwendet werden, zu generieren. Die Genomorganisation von ToLCV und die schematische Darstellung der Viruskonstrukte, die verwendet werden, werden in 1 gezeigt, und die detaillierten Beschreibungen und Verfahren zur Herstellung eines jeden Plasmids werden in Tabelle 1 zusammengefasst. Teilweise Kopf- und Schwanzdimere, die aus diesen Konstrukten hergestellt wurden, werden verwendet, um Nicotiana benthamiana – Pflanzen und N. tabacum BY2 – Protoplasten zu infizieren. Beschreibung und Verfahren zur Herstellung viraler DNAs TABELLE 1
    Konstruktion AV2-CP- Beschreibung und Verfahren zur Herstellung Eine Doppelmutante mit AV2 und Hüllprotein (CP) in der das Met1-Kodon von AV2 zum Stopkodon vgeändert wurde und das Arg66-Kodon von CP wurde im Raster versetzt. Die Mutante wurde zuvor als M1telR66fr beschrieben (Padidam et al., Virology, 224 : 390 – 404, 1996).
    g5 AV2- CP- Eine 264-Bp-Sequenz, die das Gen-5- (g5-) Protein aus dem Bakteriophagen M13mp18-Vektor kodiert, wurde durch PCR (10 Zyklen) amplifiziert und zwischen die Afl III (Nt 125) und Sty I (Nt 479)-Positionen kloniert, was in dem Ersatz des AV2-ORF
    und dem Überlappen der 5' CP-ORF-Sequenzen mit g5 resultierte.
    g5- AV2- CP- Eine negative Kontrolle des g5AV2- CP+ – Konstrukts, in der das Met1-Kondon von g5 zu einem Stopkodon mutiert war.
    CP- Eine Mutante von CP, die durch das Auffüllen am Ende und die Religation an der einzelnen Sty I-Position (Nt 479) hergestellt wurde, was eine Rasterverschiebung bei Kodon Arg66 und die Terminierung nach der Aminosäure (As) 69 bewirkt. Die Mutante wurde zuvor als R66fr beschrieben (Padidam et al., Virology, 224 : 390 – 404, 1996).
    CP66 : g5 Eine 264 Bp-Sequenz, die für das g5-Protein aus dem M13mp18-Vektor kodiert, wurde durch PCR (10 Zyklen) ampliziert und zwischen die Sty I (Nt 479) und Sph I (Nt 836-) Positionen kloniert, was in der Fusion der g5-Sequenz an das Arg66-Kodon von CP resultierte.
    CP66 : 6G : g5 Ähnlich wie CP66 : g5, außer dass ein Oligonukleotid, das für 6 Glycine kodiert, zwischen den Kodons für Arg66 von CP und Met1 von g5 eingefügt wurde.
    CP66 : g5- Eine negative Kontrolle, in der das Kodon Arg66 von CP66 : g5 im Raster verschoben wurde.
    CP66 : Stag : 6G : g5 Ähnlich wie CP66 : 6G : g5, außer dass eine Sequenz, die für das 15 Aminosäuren lange Stag-Peptidepitop kodiert [KETAAAKFERQHMDS; (Kim et al., J. S., Protein Sci., 2 : 348 – 356, 1993)], nach dem Arg66 Kodon von CP eingefügt wurde. Das Stag-Epitop wurde eingefügt, um das CP66 : 6G : g5-Protein in Protoplasten unter Verwendung des S-
    Proteins, das an das FITC gebunden war, zu immunlokalisieren.
    FCP66 : 6G : g5 Eine Sequenz, die für ein 9 Aminosäuren langes Flag-Peptidepitop kodiert [MDYKDDDDK; (Hopp et al., J. Immunol. Methods., 88 : 1 – 18, 1986)], wurde vor dem Met1-Kodon von CP66 : 6G : g5 hinzugefügt und zwischen Afl III (Nt 125) und Sph I (Nt 836) kloniert. Das AV2 ORF wird in diesem Konstrukt deletiert. Das Flag-Epitop wurde hinzugefügt, um CP66: 6G : g5-Protein aus Protoplasten unter Verwendung des Anti-Flag-Antikörpers zu immunpräzipitieren.
    CP66 : GUS Ein 1806-Bp großes DNA-Fragment, das für das β-Glucuronidase- (GUS-) Protein kodiert (Jefferson et al., Plant. Mol. Biol. Reg., 5 : 387 – 405, 1987) wurde PCR amplifiziert (10 Zyklen) und zwischen die Sty I (Nt 479) und Hind III (Nt 1041)- Positionen einer A-Komponente kloniert. Die Hind III-Position wurde an dem Kolon für Tyr251 von CP hergestellt [15-Bp vor dem Stopkodon, (Padidam et al., Virology, 224 : 390 – 404, 1996)]. Dies erleichtert das Ersetzen der CP-Sequenz mit anderen Sequenzen.
    GUSAV2-CP-- Ein 1869 Bp langes Nco I bis EcoR I DNA-Fragment, das für das GUS-Protein kodiert, wurde zwischen die Afl III (Nt 125) und Hind III (Nt 1041)- Positionen der A-Komponente kloniert, nach dem Stumpfmachen der EcoR I-Stelle auf dem GUS-Gen und der Hind III-Stelle auf der DNA der Komponente A.
    GFPAV2-CP- Ein 717 Bp langes Nco I bis BamH I DNA-Fragment, das für das grün fluoreszierende Protein kodiert [GFP – S65C, M153T, V163A; (Reichel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 : 5888 – 5893, 1996)], wurde zwischen die Afl III (Nt 125) und Sph I (Nt 836)-
    Positionen einer A-Komponente kloniert, nach dem Stumpfmachen der BamH I-Stelle auf dem GFP-Gen und der Sph I-Stelle auf der DNA der A-Komponente.
    BV1AV2-CP- Eine 849-Bp lange Sequenz, die für BV1 aus der B- Komponente von ToLCV kodiert, wurde durch PCR amplifiziert (10 Zyklen) und zwischen die Afl III (Nt 125) und Hind III (Nt 1041)-Positionen der A-Komponente kloniert.
    FBVIAV2-CP- Ähnlich wie BV1AV2- CP-, außer dass die Sequenz, die für ein 9 Aminosäuren langes Flag-Peptid kodiert, vor das Met1-Kodon von BV1 hinzugefügt wurde. Das Flag-Epitop wurde hinzugefügt, um das BV1-Protein in Protoplasten unter Verwendung des Anti-Flag-Antikörpers zu immunlokalisieren.
    BC1AV2- CP- Eine 882 Bp lange Sequenz, die für BC1 aus der B-Komponente von ToLCV kodiert, wurde durch PCR (10 Zyklen) amplifiziert und zwischen die Afl III (Nt 125) und Hind III (Nt 1041)-Positionen der A-Komponente kloniert.
    TBC1AV2- CP- Ähnlich zu BC1AV2- CP-, außer dass die Sequenz, die für 11 Aminosäuren des T7 [MASMTGGQQMG; (Krek et al., Cell., 78 : 161 – 172, 1994)] -Epitops kodiert, vor dem Met1-Kodon von BC1 hinzugefügt wurde. Das T7 Tag-Epitop wurde hinzugefügt, um das BC1-Protein in Protoplasten unter Verwendung des Anti-T7-Tag-Antikörpers zu immunlokalisieren.
    CP66 : 6G : BC1 Eine 900 Bp lange Sequenz, die für 6 Glycine und BC1 aus der B-Komponente von ToLCV kodiert, wurde durch PCR (10 Zyklen) amplifiziert und zwischen die Sty I (Nt 479) und Hind III (Nt 1041)-Positionen kloniert.
    BC1- Die DNA der B-Komponente, in der eine Rasterverschiebungsmutation von BC1 durch das Deletieren des 3'-Überhangs und das Religieren an der Pst I-Stelle (Nt 2075) hergestellt wurde. Zuvor als BC1M beschrieben (Padidam et al., Virology, 224 : 390 – 404, 1996).
  • 2. Protoplasten- und Pflanzeninokulationen
  • N. benthamiana- Pflanzen (2 Wochen alte Setzlinge, die in Magenta-Boxen wachsen) und Protoplasten, die aus BY2-Suspensionszellen isoliert wurden, wurden mit viralen DNAs, wie sie zuvor beschrieben wurden, infiziert (Padidam et al., J. Gen. Virol., 76 : 25 – 35, 1995; Padidam et al., Virology, 224 : 390 – 404, 1996). Die Protoplasten wurden aus den Kulturen 48 Stunden nach der Inokulation zur DNA-Isolierung, Immunpräzipitationsreaktionen in Westernblotanalyse gesammelt. Die Pflanzen wurden auf Symptome hin bewertet und die neu gebildeten oberen Blätter wurden zur Southernblotanalyse 22 bis 25 Tage nach der Inokulierung gesammelt. Zur Untersuchung der lokalen und systemischen Bewegung des Virus exprimierten grün fluoreszierenden Proteins [GFP; (Chalfie et al., Science, 263 : 802 – 805, 1994)] wurden die unteren Blätter von 4-Wochen alten Setzlingen (10 Pflanzen pro Konstrukt) inokuliert. Inokulierte und obere nicht inokulierte Blätter wurden in 3-tägigen Intervallen für 15 Tage unter einem Fluoreszenzmikroskop zum Nachweis der Fluoreszenz, die durch das GFP ausgestrahlt wird, beobachtet. In allen Experimenten, die Pflanzen involvierten, wurde DNA der Wildtyp B-Komponente, die zur systemischen Verbreitung und Symptomentwicklung wesentlich ist, mit umfasst.
  • 3. Southern blotting
  • Gesamt-DNA wurde aus Protoplasten (Mettler et al., Plant Mol. Biol. Rep., 5 : 346 – 349, 1987) und Pflanzen (Dellaporta et al., Plant Mol. Biol. Rep., 1 : 19 – 21, 1983) isoliert und elektrophoretisch in 1 %-igen Agarosegele (ohne Ethidiumbromid) behandelt und auf Hybond Nylon-Membranen (Amersham, Arlington Heights, IL) unter Verwendung eines Standardprotokolls (Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) übertragen. Die Hybridisierungsreaktionen wurden unter Verwendung einer zufällig geprimten 32P-markierten A-Komponenten-spezifischen Sonde durchgeführt (das 900 Bp Afl II-Pst I-Fragment, das die ORFs AC1, AC2 und AC3 enthält). Die Menge der viralen ss- und ds- DNA (supergewunden, linear, offen zirkulär und dimere Formen) wurde durch das Aussetzen der Southernblots an Phosphorlagerplatten und das Auszählen auf einem Phosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) quantifiziert. Die ssDNA-Form wurde durch ihre Empfänglichkeit für S1- und Mungbohnennukleasen bestätigt (Padidam et al., Virology, 224 : 390 – 404, 1996). In der Abwesenheit von Ethidiumbromid läuft die supergewundene virale DNA-Form vor der ssDNA-Form.
  • 4. Immunpräzipitation und Westernblot
  • Für Immunpräzipitationsreaktionen wurden Protoplasten, die mit der A-Komponente des Virus infiziert wurden, die das CP66 : 6G : g5- Protein exprimiert, das mit dem Flag-Epitop markiert ist (FCP66 : 6G : g5, Tabelle 1), mit einem mit der Hand gehaltenen Polytron in NP40-Puffer lysiert [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 % NP40, mit 0,15, 0,25, 0,50, 0,75 oder 1,0 M NaCl] oder RIPA-Puffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 % NP40, 0,5 % DOC, 0,1 % SDS], der einen Cocktail aus Proteasehemmern enthält (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Zelldebris wurde durch Zentrifugation bei 40 °C für 10 Minuten bei 15000 × g entfernt. Die Lysate wurden mit dem Anti-Flag monoclonalen M2-Antikörper immunpräzipitiert, der kovalent an Agarose gebunden war (Sigma, St. Louis, MO). Die Immunkomplexe wurden vier Mal mit NP40- oder RIPA-Puffer und ein Mal mit Tris-gepufferter Salzlösung [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl] gewaschen. Die Hälfte der Probe wurde in Laemmli-Probenpuffer erwärmt, durch SDS-PAGE (13 % Acrylamid) fraktioniert und auf eine PVDF-Membran (Schleicher & Schnell, Keene, NH) übertragen.
  • Immunpräzipitiertes Protein wurde mit einem Anti-Flag M2-Antikörper unter Verwendung von ECL-Westernblot-Reagenzien (Pierce, Rockfort, IL) sichtbar gemacht. Die verbleibende Hälfte des Immunkomplex, der durch diese Prozedur gesammelt wurde, wurde zur Isolierung der viralen DNA verwendet. Gesamtzellproteinextrakte für direktes Westernblotten wurden durch das Sieden der Protoplastenpellets mit einem gleichen Volumen 2 × Laemmli-Probenpuffer hergestellt.
  • 5. Immunfluoreszenz
  • Protoplasten, die mit viralen Konstrukten transfiziert waren, wurden auf Kammerplatten für 48 Std. kultiviert (Nalge Nunc, Rochester, NY), mit 3 % Paraformaldehyd in PBSEM [50 mM Phosphat (pH 6,95), 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5 mM MgSO4] für 30 Min. fixiert und mit 100 % Methanol bei –20 °C für 10 Min. permeabilisiert. Die Zellen wurden zwei Mal für 30 Min. mit PBSEM gewaschen, das 0,5 % Tween 20 enthält. CP55 : 6G g5-Protein, das mit dem Stag-Epitop markiert war (CP66 : Stag : 6G : g5, Tabelle 1), wurde mit dem S-Protein nachgewiesen, das an FITC gebunden war (Novagen, Madison, WI). Das fünfzehn Aminosäuren lange Stag-Peptid wurde nach Arg66 des CPs eingefügt, um das CP66 : Stag : 6G : g5-Protein herzustellen. Flag-Epitop-markiertes BV1, T7-Epitop-markiertes BC1, CP und β-Glucuronidase (GUS) (Tabelle 1) wurden jeweils mit einem Anti-Flag M2-Antikörper (Sigma, St. Louis, MO), einem Anti-T7-Tag-Antikörper (Novagen, Madison, WI), einem Anti-CP-Antiserum (Padidam et al., Virology, 224 : 390 – 404, 1996) und einem Anti-GUS-Antiserum (5' – 3', Boulder, CO), die 1 : 100 in PBS verdünnt waren, nachgewiesen. Nach der Inkubation in primärem Antikörper für 1 Std. bei 30 °C wurden die Zellen wie zuvor gewaschen und mit FITC- oder Rhodaminkonjugierten IgGs (Pierce, Rockford, IL) bei einem Verdünnungsfaktor von 1 : 100 inkubiert. Die Zellen wurden in ein Fluoromount G (Elektron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) eingesetzt und mit einem Nikon-Fluoreszenz-Mikroskop oder einem konfokalen Olympus-Mikroskop (zum Nachweis des T7-Epitop-markierten BC1-Proteins) gesichtet.
  • 6. ToLCV, das Gen-5-Protein oder CP66 : 6G : g5-Protein exprimiert akkumuliert ssDNA in Wildtypmengen in Protoplasten
  • Vorherige Berichte, die mit ToLCV arbeiten, haben gezeigt, dass virales CP und AV2 zur Virusreplikation in Protoplasten nicht notwendig sind, wohingegen AV2 zur effizienten Bewegung in Pflanzen notwendig ist (Padidam et al., Virology, 224 : 390 – 404, 1996). Das Hüllprotein ist für die systemische Bewegung und Symptomentwicklung in ToLCV nicht wesentlich. Jedoch bewirkten Mutationen in der CP-Sequenz eine deutliche Verringerung in der ssDNA-Anhäufung in N. bentamiana und Tomatenpflanzen und in BY2-Protoplasten, wohingegen sich die dsDNA-Anhäufung in Protoplasten erhöht. Viren, die Mutationen in dem AV2 plus CP enthalten, verhielten sich wie AV2-Mutanten in Pflanzen (d. h. schwache Virusbewegung und sehr milde Symptome) und wie CP-Mutanten in Protoplasten (d. h., Verringerung an ssDNA und Erhöhung der dsDNA-Anhäufung).
  • Die vorliegenden Plasmidkonstrukte stellen Information bezüglich der Wirkungen des Gen-5-Proteins (g5p) aus dem E. coli Phagen M13 (Salstrom et al., J. Mol. Biol., 61 : 489 – 501, 1971) bezüglich der Replikation von ToLCV zur Verfügung. Jede dieser Mutationen wird in Tabelle 1 und 1 beschrieben. Das AV2 und der überlappende 5'-Teil des CP ORF wurden durch das g5p ersetzt und auf seine Wirkung auf die Virusreplikation in Protoplasten hin untersucht. In diesen Experimenten wurden Protoplasten mit Wildtyp (WT) oder anderen Mutanten, wie sie unten beschrieben werden, inokuliert. Die modifizierte A-Komponente, die g5AV2- CP- bezeichnet wird, führte zu einer Anhäufung von ssDNA in den gleichen Mengen, wie Infektionen mit der WT-Virus A-Komponente (Tabelle 2; 2, Bahnen 1 und 3). Jedoch war die dsDNA-Anhäufung (3- bis 6-fach höher als bei WT-Mengen) hoch und ähnlich zur Anhäufung in Viren mit Mutationen in CP (Tabelle 2, 2, Bahnen 2 – 4). Die Infektion durch Viren, in denen das g5-Gen zur Verhinderung seiner Translation (g5- AV2- CP-, Tabelle 1) mutiert worden war, verhielt sich wie Virusinfektionen mit A-Komponentenmutanten AV2- CP- und CP- (Tabelle 2; 2, Bahn 4). Da AV2 zur effizienten Virusbewegung in Pflanzen notwendig ist, wurde ein anderes Konstrukt hergestellt, bei dem g5 an CP an Arg66 ohne das Beeinträchtigen des AV2 ORF gebunden wurde (CP66 : g5, Tabelle 1). Die CP66 : g5-Virus-A-Komponente führte auch zur Anhäufung von ssDNA, aber in geringeren Mengen als g5AV2- CP- DNA (Tabelle 2; 2, Bahn 6). Zur Bewertung, ob die N-terminalen 66 Aminosäuren (AS) von CP mit der Fähigkeit von g5p zur Bindung an DNA interferiert, wurde ein Linker aus sechs Glycinresten zwischen Arg66 von CP und g5 zur Trennung der CP-Domäne von dem g5p eingeführt (CP66 : 6G : g5). Die Zugabe des Linkers stellte die Fähigkeit der CP66 : 6G : g5 Virus A-Komponente zur Anhäufung von ssDNA in Mengen wieder her, die mit denen von g5AV2- CP- vergleichbar sind (Tabelle 2; 2, Bahn 7). Ein Kontrollkonstrukt, in dem der g5-Anteil des Fusionsproteins nicht translatiert war (CP66 : g5-) versagte dahingehend, ssDNA anzuhäufen (Tabelle 2; 2, Bahn 8). Die Fähigkeit der Virus A-Komponente, die CP66 : 6G : g5-Protein exprimiert, zur Anhäufung von ssDNA, war nicht durch die N-terminalen 66 AA des CP bedingt. Dieses wurde durch die Tatsache angedeutet, dass die Virus A-Komponente, die g5p allein exprimierte, ssDNA anhäufte, und die Virus A-Komponenten, die CP66 : 6G : BC1 (siehe unten) oder CP66 : 6G : AV2 exprimierten, dahingehend versagten, ssDNA anzuhäufen. TABELLE 2 Wirkung des Gen-5-Proteins auf die Replikation und Bewegung des Tomatenblattkräuselvirus in Nicotiana tabacum-Protoplasten und N. benthamiana-Pflanzen Protoplasteninokulationen
    Figure 00260001
    Figure 00270001
    Pflanzeninokulationen
    Figure 00270002
    • a Die Werte stellen die durchschnittliche Menge (den Bereich) der einzelsträngigen (ss) und doppelsträngigen (ds) DNA der A-Komponente in fünf unabhängigen Protoplasten-Transfektionen pro Mutante dar. Die Protoplasten (≈ 106) wurden mit 2 μg der DNA der A-Komponente und 40 μg von Heringsperma DNA transfiziert. Die virale DNA wurde in Southernblots unter Verwendung des „Phosphorlmager" von Molecular Dynamics quantifiziert.
    • b Die Werte waren durchschnittliche (Bereich) Mengen der viralen DNA in zwölf inokulierten Pflanzen pro Virus-Konstrukt, außer für AV2- CP-, für das die Werte Durchschnitte von vier Pflanzen waren. Jede Pflanze wurde mit 0,5 μg der A- und 0,5 μg der Wildtyp B-Komponenten-DNA inokuliert, die für die virale Bewegung und Symptomentwicklung wesentlich ist.
    • c Der Menge an viraler DNA in Protoplasten und Pflanzen, die mit der viralen Wildtyp-DNA inokuliert waren, wurde ein Wert von 100 zugeordnet.
    • d Viele Pflanzen zeigten keine Symptome.
    • e Schwere Symptome, wie in Pflanzen, die mit dem Wildtyp-Virus inokuliert waren, aber ohne intensive Chlorose.
  • Geminiviren replizieren in dem Nukleus (Accotto et al., Virology, 195 : 257 – 259, 1993; Nagar et al., Plant Gell, 7 : 705 – 719, 1995), so ist es wahrscheinlich, dass die CP66 6G : g5- und g5-Proteine in dem Nukleus vorhanden sein müssen, um die Anhäufung von ssDNA zu bewirken. Zur Immunlokalisierung des CP66 : 6G : g5-Fusionsproteins in Protoplasten, wurde das Stag-Epitop zwischen Arg66 des CP und dem Glycinlinker eingefügt (CP66 : Stag : 6G : g5, Tabelle 1). Bei 48 Std. nach der Infektion wurden die Protoplasten fixiert und Reaktionen mit S-Protein ausgesetzt, das an FITC gebunden war. Das CP66 : Stag : 6G : g5-Protein sowie das wt-CP (mit Anti-CP-Antiseren nachgewiesen) waren in dem Nukleus lokalisiert (3A und 3B). Wenn ein GUS-Protein als ein Fusionsprotein mit den N-terminalen 66 AS von CP (CP66 : GUS) hergestellt wurde, war das GUS (mit Anti-GUS-Antiseren nachgewiesen) auch in dem Nukleus lokalisiert (3C). Dieses zeigte an, dass die N-terminalen 66 AS des CP ein nukleares Lokalisationssignal enthielten.
  • g5p enthält ein nukleares Lokalisationssignal, wie es durch das Fusionieren der g5-Sequenz an den N-terminus der Sequenz gezeigt wird, die für GUS kodiert. Das g5 GUS-Fusionsprotein (exprimiert in g5 : GUSAV2- CP- Virus A-Komponente, Tabelle 1) und das nicht fusionierte GUS-Protein (exprimiert in der GUSAV2- CP- Virus A-Komponente, Tabelle 1) verblieben in dem Cytoplasma (3D und 3E), was anzeigt, dass g5p kein nukleares Lokalisationssignal aufweist. Das g5p gelangt in den Nukleus am wahrscheinlichsten in einer passiven Weise, basierend auf seiner Größe (9,7 kDa), die kleiner als die Durchlässigkeitsgrenze der nuklearen Hülle (Dingwall et al., Ann. Rev. Cell Biol., 2 : 367 – 390, 1986)ist.
  • 7. Die Bewegung von ToLCV, das CP66 : 6G : g5 - Protein exprimiert, ist in Pflanzen eingeschränkt
  • N. benthamiana-Pflanzen wurden mit ausgewählten Viruskonstrukten inokuliert, um die Wirkung des g5p auf die Virusverbreitung zu bestimmen: In diesen Studien wurde die DNA der B-Komponente mit der A-Komponente auf Setzlinge von N. benthamiana ko inokuliert. Wie erwartet, zeigten Pflanzen, die mit den A-Komponentenmutanten AV2- CP- g5AV2- CP- oder g5- AV2- CP- plus B-Komponente inokuliert worden waren, sehr milde oder keine Symptome, und alle inokulierten Pflanzen häuften geringe Mengen an viraler DNA (Tabelle 2) an. Eine zuvor berichtete ToCLV-Mutante (Padidam et al., Virology, 224 390 – 404, 1996), die kein CP herstellte, aber AV2 herstellte (CP-), entwickelte schwere Krankheitssymptome und wt-Mengen an dsDNA bei systemischen Infektionen (Tabelle 2). Überraschender Weise zeigten Pflanzen, die mit dem Virus inokuliert wurden, das das CP66 : 6G : g5-Protein exprimierte, sehr milde oder keinerlei Symptome, sogar obwohl der Virus ein intaktes AV2-Gen enthielt (Tabelle 2). Diese Pflanzen häuften geringe Mengen an viraler DNA ähnlich zu Pflanzen an, die mit AV2- CP--Virus inokuliert waren (Tabelle 2). Pflanzen, die mit dem Virus, das das CP66 : g5-Protein exprimiert, inokuliert waren (das ssDNA in einer geringeren Menge als CP66 : 6G : g5-Virus in Protoplasten anhäufte), zeigten milde Symptome und häuften moderate Mengen an dsDNA an. Die beschränkte Bewegung der Viren, die g5p exprimieren, war durch die möglichen toxischen Wirkungen von g5p bedingt. Es wurden keine Unterschiede in der Protoplastenüberlebensfähigkeit oder in dem Erscheinungsbild der Pflanzenblätter beobachtet, die mit wt-Virus oder Virus, das g5p exprimiert, inokuliert waren, die eine Toxizität gegen g5p vorschlagen würden.
  • Die Bewegung von Zelle zu Zelle und über eine längere Distanz von ToLCV, das das CP66 : 6G : g5-Protein exprimiert, wurde durch die Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als einen sichtbaren Macker zur Virusbewegung untersucht. Die Pflanzen wurden mit einer DNA der A-Komponente inokuliert, die GFP anstelle von AV2 und CP allein (GFPAV2- CP-) exprimiert, oder mit DNA der A-Komponente des wt-, CP66 : 6G : g5 oder CP66 : g5- Konstrukts ko-inokuliert. Von dem GFPAV2- CP- Virus wurde erwartet, sich ineffizient in Pflanzen zu bewegen, da es AV2 nicht kodiert; es wurde erwartet, dass es sich effizient bewegt, wenn es durch einen anderen Virus komplementiert wird, der AV2 kodiert. GFP konnte in Pflanzen 3 Tage nach der Inokulation nicht beobachtet werden, aber es war auf inokulierten und oberen Blättern am Tag 6 in dem größten Teil der Pflanzen vorhanden, die mit GFPAV2- CP- + wt A-Komponente oder GFPAV2- CP- + CP66 : g5- Viren inokuliert waren (3H, 3I; es werden nur Daten mit Pflanzen, die mit GFPAV2- CP- + CP66 : g5- -Viren inokuliert waren, gezeigt). Der Virus, der GFP exprimiert, verbreitete sich weiter bis zu den oberen und den neu auswachsenden Blättern in diesen Pflanzen (3J, 3K). GFP wurde in Venen, Mesophyll und epidermalen Zellen beobachtet und war in großen Breichen des Blattes in Pflanzen vorhanden, die mit GFPAV2- CP- plus CP66 : g5- -Viren inokuliert waren. Im Gegensatz dazu war GFP auf kleine Flecken der inokulierten Blätter der meisten der Pflanzen eingeschränkt, die mit GFPAV2- CP- oder GFPAV2- CP- plus CP66 6G : g5-Viren inokuliert waren (3L, 3M, es werden nur Daten von Pflanzen, die mit GFPAV2- CP- plus CP66 : 6G : g5-Viren inokuliert waren, gezeigt). Diese Pflanzen zeigten auch eine GFP-Färbung in einigen benachbarten oder neu austreibenden Blättern, waren aber auf die Venen eingeschränkt (3N, 3O, 3P). Diese Ergebnisse zeigten an, dass das Exprimieren von g5p anstelle von CP die Effizienz der viralen systemischen Bewegung verringert hat.
  • 8. In vivo-Bindung des CP66 : 6G : g5 – Proteins an virale DNA
  • Die Anhäufung viraler ssDNA in Protoplasten, die mit der Virus A-Komponente inokuliert waren, die g5p oder CP66 : 6G : g5-Protein exprimiert, zeigte an, dass g5p an ssDNA bindet. Zur Verifizierung wurden Protoplasten mit der viralen A-Komponente inokuliert, die Flag-Epitop-markiertes CP66 : 6G : g5 – Protein (FCP66 : 6G : g5, Tabelle 1) exprimiert, und immunpräzipitierten das Flag-Epitop-markierte CP66 : 6G : g65 – Protein unter Verwendung des Anti-Flag-Antikörpers, und charakterisierten die virale DNA, die mit dem CP66 : 6G : g5-Protein ko-immunpräzipitierte durch Southernblotting. Die Immunpräzipitationen wurden unter verschiedenen Salz- (1 % NP40-Puffer mit 0,15 bis 1,0 M NaCl) bedingungen und in der Gegenwart von 0,1 % SDS, 0,5 % DOC und 1 % NP40 Tensiden (RIPA-Puffer) durchgeführt, um die Affinität der Bindung zu untersuchen. Flag-Epitop-markiertes CP66 : 6G : g5-Protein wurde unter allen getesteten Pufferbedingungen immunpräzipitiert; die Menge des immunpräzipitierten Proteins erhöhte sich mit der Erhöhung der Salzkonzentration. (4A). Die Menge der ko-immunpräzipitierten ssDNA erhöhte sich bis zu 0,5 M Salz und verringerte sich bei höheren Konzentrationen (4B), was anzeigt, dass der g5p-ssDNA-Komplex in Puffer, der 1 M Salz enthielt, destabilisiert war.
  • Die Immunpräzipitation in RIPA-Puffer resultierte auch in einer verringerten Menge der präzipitierten DNA (4B). Diese Ergebnisse zeigten, dass g5p an virale ssDNA band und 1 M Salz (in NP40-Puffer) g5p von viraler DNA dissoziierte.
  • 9. Die Rolle der BV1- und BC1-Bewegungsproteine bei der Ausbreitung von ToLCV
  • Zusammen zeigen die oben genannten Ergebnisse an, dass CP66 : 6G : g5-Protein in dem Nukleus lokalisiert ist und stabil an DNA des ToLCV-Virus in vivo bindet und dass ToLCV, das CP66 : 6G : g5 exprimiert, sich nicht effizient in Pflanzen bewegt. Die ineffiziente Bewegung von ToLCV, das CP66 : 6G : g5-Protein exprimiert, kann durch die Störung der Funktion der BV1- oder BC1-Bewegungsproteine von ToLCV durch g5p bedingt sein. In dem Kürbispflanzenblätterkräuselvirus (Squash leaf curl virus, SLCV) bindet BV1 (das als BR1 in SLCV bezeichnet wird) -Protein, nicht aber BC1 (in SLCV als BL1 bezeichnet) an ssDNA in vitro (Pascal et al., Plant Cell, 6 : 995 – 1006, 1994). BV1 und BC1 aus SLCV wechselwirken miteinander in einer kooperativen Weise; in Protoplasten ist BV1 in dem Nukleus in der Abwesenheit von BC1 lokalisiert, lokalisiert sich aber in der Zellperipherie in der Anwesenheit von BC1 (Sanderfoot et al., Plant Physiol., 110 : 23 – 33, 1996; Sanderfoot et al., Plant Cell, 7 : 1185 – 1194, 1995). Sowohl BV1 wie auch BC1 sind zur systemischen Ausbreitung und Symptomentwicklung von ToLCV notwendig (Padidam et al., Virology, 224 : 390 – 404, 1996). Zur Feststellung, ob BV1 und BC1 aus ToLCV ähnliche Funktionen wie BV1 und BC1 in SLCV aufweisen, wurden BV1 und BC1 aus ToLCV immunlokalisiert und auf deren Fähigkeit hin untersucht, die virale ssDNA-Anhäufung von CPA-Mutanten zu komplementieren. Für diese Experimente wurden die BV1- und BC1-Gene an Sequenzen fusioniert, die für den Flag-Epitopmarker und den T7-Epitopmarker kodieren, und anstelle von AV2 und CP in die A-Komponente eingefügt (FBV1AV2- CP- und TBC1AV2 -CP-, Tabelle 1). In Protoplasten, die mit dem FBV1AV2- CP- Konstrukt inokuliert waren, häufte sich das BV1-Protein in dem Nukleus an (durch den Anti-Flag-Antikörper nachgewiesen, 3F), wohingegen in Protoplasten, die mit TBC1AV2- CP- inokuliert waren, das BC1-Protein in der Zellperipherie Lokalisiert war (unter Verwendung des Anti-T7-tag-Antikörpers nachgewiesen, 3G). Die Expression von BV1-Protein anstelle des AV2- und CP-Proteins (BV1AV2- CP-) führte auch zu der Anhäufung von ssDNA der A-Komponente (Tabelle 3; 2, Bahn 9). Die Bindungsaffinität des BV1-Proteins, das mit dem Flag-Epitop markiert ist, an virale DNA in Protoplasten, die mit FBVAV2- CP- -DNA inokuliert waren, wurde durch immunpräzipitierende Reaktionen bestimmt, die ähnlich zu denen waren, die in 4 beschrieben werden. Die Bindungsaffinität des BV1-Proteins an virale ssDNA war zu der Bindungsaffinität des CP66 : 6G : g5-Proteins an virale DNA ähnlich. Im Gegensatz zu den Ergebnissen, die mit der DNA der A-Komponente erhalten wurden, die BV1 exprimiert, häufte DNA der A-Komponente, die das BC1-Protein anstelle von AV2 und CP exprimierte (BC1AV2- CP-) ssDNA nicht an (Tabelle 3; 2, Bahn 10). Da das BC1-Protein in der Zellperipherie lokalisiert war, wurde BC1 an die N-terminalen 66 AS des CP (CP66 : 6G : BC1) fusioniert, um es in den Nukleus zu führen. Die Virus-DNA der A-Komponente, die das CP66 : 6G : BC1 – Protein exprimiert, häufte auch keine ssDNA an (Tabelle 3; 2, Bahn 11), was zeigt, dass das BC1-Bewegungsprotein vielleicht nicht an virale ssDNA bindet, oder dass die Bindungsaffinität nicht ausreichend stark war, um in der Anhäufung von ssDNA zu resultieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass BV1 in der Abwesenheit von BC1 in dem Nukleus lokalisiert ist, und das BV1 an virale ssDNA in vivo bindet.
  • TABELLE 3 Komplementierung durch BV1- und BC1-Bewegungsproteine für die Anhäufung von ssDNA des Tomatenblattkräuselvirus in Protoplastena
    Figure 00320001
    • a Protoplasten wurden mit 2 μg DNA der A-Komponente mit und ohne 10 μg der DNA der B-Komponenten transfiziert. Virale einzelsträngige (ss) und doppelsträngige (ds) DNA wurde auf Southernblots unter Verwendung des „Phosphorlmagers" quantifiziert und die Werte stellen die durchschnittliche Menge (den Bereich) der viralen DNA in zwei bis fünf unabhängigen Transfektionen dar.
  • In Pflanzen, die mit der ToLCV A-Komponente inokuliert worden waren, die das CP66 6G : g5-Gen plus wt-B-Komponente enthalten, wird die Expression des CP66 : 6G : g5-Proteins durch den relativ starken CP-Promotor gesteuert. Das CP66 : 6G : g5-Protein, das aus der A-Komponente hergestellt wird, kann mit dem BV1-Protein um die DNA-Bindung kompetitieren (aus der B-Komponente exprimiert), wenn die Menge des BV1, das unter dessen eigenem Promotor hergestellt wird, relativ gering ist. Wir führten ein Experiment zur Bestimmung durch, ob BV1, das unter seinem eigenen Promotor auf der B-Komponente exprimiert wird, zu einer Anhäufung von ssDNA führen kann. Es wird betont, dass BV1 zu einer Anhäufung von ssDNA führte, wenn es anstelle von CP auf der A-Komponente exprimiert wurde (Tabelle 3). Jedoch häufte sich sehr wenig virale ssDNA in Protoplasten an, die mit DNA der A-Komponente mit Mutationen in CP (CP-) plus der DNA der wt B-Komponente (d. h., exprimiert sowohl BV1 wie auch BC1) oder der B-Komponente mit einer Mutation in BC1 (BC1-, d. h., exprimiert nur BV1) (Tabelle 3, 2, Bahnen 12 – 15) ko-inokuliert waren. Das Versagen von BV1 zur Bewirkung einer Anhäufung von ssDNA, wenn es aus der B-Komponente exprimiert wird, scheint durch die niedrigen Mengen an hergestelltem BV1-Protein bedingt zu sein; es wurde kein BV1-Protein durch Immunlokalisierung und Westernblot-Techniken in Protoplasten nachgewiesen, die mit DNA der A-Komponente und DNA der B-Komponente, die Flag-Epitop-markiertes BV1 exprimiert, inokuliert waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Promotor der B-Komponente, der die Expression von BV1 antreibt, nicht so stark ist, wenn das Gen von dem CP-Promotor auf der A-Komponente exprimiert wurde.
  • 10. Diskussion der Beispiele 1 – 9
  • Ein nicht spezifisches ssDNA-bindendes Protein (g5) wurde anstelle von CP exprimiert und wurde auf die Anhäufung von ssDNA hin untersucht, um zu bestimmen, ob es als ein Ersatz für CP in Geminiviren dienen könnte. Das g5p aus dem E. coli Phagen M13 wurde bedingt durch seine kleine Größe (9,7 kDa) und dem Mangel an einer enzymatischen Funktion bei der DNA-Replikation ausgewählt. Die Rolle von g5p bei der Replikation von M13 und anderen filamentösen Phagen wurde ausgiebig untersucht (Rasched et al., Microbiol. Rev., 50 : 401 – 427, 1986) und seine Struktur wurde bestimmt (Skinner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 : 2071 – 2075, 1994). Das Gen-5-Protein bindet neu gebildete virale ssDNA innig, kooperativ und in einer von der Sequenz unabhängigen Weise und schützt sie vor dem Abbau durch E. coli Nukleasen.
  • Es wird gezeigt, dass g5p an ToLCV ssDNA in Pflanzenzellen binden kann, und ToLCV, das g5p oder g5p, das an die N-terminalen 66 AS des CP gebunden ist, häuft ssDNA in Wildtypmengen an. Die Bindung von g5p an virale ssDNA in vivo war ähnlich zu der Bindung von g5p an ssDNA aus M13 in vitro (Anderson et al., Biochemistry, 14 : 907 – 917, 1975). Obwohl g5p den Mangel an CP durch die Bewirkung einer Erhöhung der Anhäufung von ssDNA von ToLCV kompensierte, verringert es die Menge an dsDNA auf wt-Mengen nicht. Das BV1-Bewegungsprotein (wenn es anstelle von CP exprimiert wird) verhielt sich auch wie g5p dahingehend, dass es die dsDNA nicht auf wt-Mengen nach unten reguliert. Wenn CP die Mengen an ss- und dsDNA durch die Verringerung der ssDNA, die zur Umwandlung in dsDNA verfügbar ist, reguliert, könnte von der Expression von g5p oder BV1 erwartet werden, dass sie in normalen Mengen an dsDNA resultiert. Die Tatsache, dass sie das nicht tut, schlägt vor, dass CP eine direkte Rolle bei der Regulierung der Virusreplikation haben könnte, möglicher Weise durch die Hemmung der Minusstrang-DNA-Synthese oder durch die Regulierung der Genexpression. Das CP des Alfaalfa-Mosaikvirus (AIMV), ein Virus mit einem ssRNA(+)-Genom, spielt eine direkte Rolle in der Regulierung der Plus- und Minus-Strang-RNA-Synthese. Das CP des AIMV wurde in enger Assoziation mit der viralen RNA-Polymerase gefunden und hemmte die Minus-Strang-Synthese, wohingegen es die Plus-Strang-Synthese stimulierte. Kürzlich erschiene Ergebnisse für SLCV schlagen vor, dass CP als ein Signal fungiert, um von viraler dsDNA-Replikation auf ssDNA-Replikation umzuschalten, oder um ssDNA von Virionen aus dem Replikationspool zu verbrauchen, ohne sie vollständig zu verkapseln. Die Aufreinigung des Geminivirus-Replikationskomplex ist notwendig, um direkt die Rolle des CPs in der Replikation zu untersuchen.
  • Pflanzen, die mit einem Virus infiziert sind, der das CP66 : 6G : g5-Protein kodiert, zeigen sehr milde Symptome und häufen niedrige Mengen an viraler DNA an, während infizierte Protoplasten grosse Mengen an viraler DNA anhäuften. Dies kommt dadurch zustande, weil, bedingt durch die Bindung an virale ssDNA, das g5p die Virusbewegung durch Beeinträchtigung der Funktion des BV1-Bewegungsproteins beinflusst. BV1 aus ToLCV war in dem Nukleus in infizierten Protoplasten lokalisiert und band an virale ssDNA in vivo, wohingegen BC1 in der Zellperipherie Lokalisiert war und die virale ssDNA-Anhäufung sogar dann nicht komplementierte, wenn es in den Nukleus als ein Fusionsprotein mit dem nuklearen Lokalisierungssignal von CP gerichtet war. Kürzlich durchgeführte Studien bezüglich der Rolle von BV1 und BC1 bei der SLCV-Bewegung haben gezeigt, dass BV1 in den Nukleus lokalisiert, an ssDNA in vitro bindet und als ein nukleares Shuttle-Protein fungiert. BC1 aus SLCV ist in der Zellperipherie in Protoplasten lokalisiert und mit aus dem endoplasmatischen Reticulum abgeleiteten Tubuli in sich entwickelnden Phloem-Zellen der systemisch infizierten Kürbissetzlinge assoziiert. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Modell für SLCV vorgeschlagen, bei dem BC1-haltige Tubuli als ein Mittel zum Transport von BV1 und seine assoziierte virale ssDNA von einer Zelle zur anderen dienen (Ward et al., J. Vitro., 71 : 3726 – 33, 1997). Studien mit TGMV haben gezeigt, dass BV1 mit viraler ssDNA in vivo wechselwirkt und BV1 und BV2 unterschiedliche und wesentliche Rollen bei der Zell-zu-Zell-Bewegung sowie der systemischen Bewegung (Jeffrey et al., Virology., 223 : 208 – 218, 1996) haben. ToLCV setzt eine ähnliche Strategie bei der Bewegung von Zelle zu Zelle ein. Die schwache Bewegung von ToLCV, das das CP66 : 6G : g5-Protein produziert, ist durch die verringerte Bindung von BV1 an virale ssDNA bedingt. Es wird betont, dass BV1 nicht zu einer Anhäufung von ssDNA der A-Komponente führte, der CP fehlte, wenn BV1 unter seinem eigenen Promotor aus der B-Komponente exprimiert wurde. In Pflanzen, die mit der A-Komponente, die CP66 : 6G : g5 produziert, plus der A-Komponente, die GFP produziert, ko-inokuliert waren, war die GFP-Färbung hauptsächlich auf kleine Flächen beschränkt, sowohl auf inokulierte wie auch auf systemisch infizierte Blätter, was eher eine Gesamtverringerung der effizienten viralen Bewegung als eine spezifische Beeintrachtigung der Zell-zu-Zell-Ausbreitung oder der Langstreckenbewegung anzeigt.
  • Die Beeinträchtigung der ToLCV-Bewegung bedingt durch die Bindung von g5p an vitale ssDNA zeigt an, dass sich in diesem Virus ssDNA von Zelle zu Zelle bewegt. Diese Ergebnisse zeigen auch an, dass die Expression von g5p in transgenen Zellen einen neuen Weg der Kontrolle von Geminiviren bereit stellt, und dass solch eine Resistenz gegen Geminiviren wirksam ist.
  • In der Zusammenfassung wurde ToLCV, dem das CP-Gen fehlt, zur Bestimmung, ob das Gen-5-Protein (g5p), ein ssDNA-bindendes Protein aus dem Escherichia coli Phagen M13, die Anhäufung von ssDNA wiederherstellen könnte, modifiziert, um g5p oder g5p, das mit den N-terminalen 66 Aminosäuren von GP (CP66 : 6G : g5) fusioniert wurde, zu exprimieren. Die modifizierten Viren führten zu einer Anhäufung von ssDNA in Wildtypmengen und hohen Mengen an dsDNA. Die Anhäufung von ssDNA war durch die stabile Bindung von g5p an die virale ssDNA bedingt. Die großen Mengen der dsDNA-Anhäufung während der Infektionen der modifizierten Viren, schlagen für CP eine direkte Rolle in der viralen DNA-Replikation vor. ToLCV, das das CP66 : 6G : g5-Protein produzierte, verbreitete sich in Nicotiana benthamiana – Pflanzen nicht effizient und inokulierte Pflanzen entwickelten sehr milde Symptome. In infizierten Protoplasten war das CP66 : 6G : g5-Protein in den Nuklei immunlokalisiert; dieses zeigt an, dass das Fusionsprotein mit der Funktion des BV1-Bewegungsproteins wechselwirkt und dadurch die Ausbreitung der Infektion verhindert.
  • Die vorgenannte Beschreibung einschließlich der spezifischen Ausführungsformen und Beispiele ist dahingehend vorgesehen, für die vorliegende Erfindung illustrativ zu sein und nicht als einschränkend anzusehen. Viele andere Variationen und Modifikationen können ohne Abweichung von dem wahren Geist und dem Umfang der Erfindung durchgeführt werden. SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00360001
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    Figure 00400001

Claims (45)

  1. Verfahren zum Herstellen einer Resistenz in einer Pflanze gegen ein einzelsträngiges DNA- (ssDNA-) Virus der Geminivirus-Familie, das in der Lage ist, eine Pflanze zu infizieren, umfassend das Einführen eines ssDNA-bindenden Proteins der Inoviridae-Virus-Familie in die Pflanze.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Virus der Inoviridae-Familie aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Gattungen Inovirus und Plectrovirus besteht.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Virus der Inovirus-Gattung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Coli-Phagen-, Enterobacteria-Phagen-, Pseudomonas-Phagen-, Vibrio-Phagen- und Xanthomonas-Phagen-Arten besteht.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Virus der Coli-Phagen-Art aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Coli-Phagen AE2, dA, Ec9, f1, fd, HR, M13, ZG/2 und ZJ/2 besteht.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ssDNA-bindende Protein ein Gen-5-Protein ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ssDNA-bindende Protein das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13 ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13 die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Einführen das Herstellen einer transgenen Pflanze umfasst, die ein Gen enthält, welches das ssDNA-bindende Protein exprimiert.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Gen eine Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 2 oder 3 angegeben ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Einführen ein Inkontaktbringen der Pflanze mit einer Zusammensetzung umfasst, die einen Expressionsvektor enthält, der in der Lage ist, das ssDNA-bindende Protein zu exprimieren.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Expressionsvektor eine Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 2 oder 3 angegeben ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Inkontaktbringen einen biolistischen Gentransfer oder eine direkte DNA-Aufnahme in einen Protoplasten umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Inkontaktbringen eine Infektion der Pflanze mit einem Transportvektor umfasst.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Transportvektor ein Agrobacterium-Vektor ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Expressionsvektor in einem Viruspartikel vorliegt, das in der Lage ist, die Pflanze zu infizieren und das ssDNA-bindende Protein zu exprimieren.
  16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanze aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Abutilon, Acalypha, Apfel, Ageratum, Althea rosea, Asystasia, Bajra, Banane, Gerste, Bohnen, Rübe, Urdbohne („Blackgram"), Bromus, Cassava, Kichererbse, Paprikas, Chlorfis, Klee, Kokosnuss, Kaffee, Baumwolle, Kuherbse/-bohne, Croton, Gurke, Digitaria, Dolichos, Aubergine, Eupatorium, Euphorbia, Fababohne, Geißblatt, Pferdebohne, Jatropha, Leonurus, Limabohne, Lupine, Macroptilium, Macrotyloma, Mais, Melone, Hirse, Mungbohne, Hafer, Okra, Panicum, Papaya, Paspalum, Erdnuss, Erbse, Pfeffer, Straucherbse (Taubenerbse), Ananas, Phaseolus, Kartoffel, Pseuderanthemum, Speisekürbis („Pumpkin"), Rhynchosia, Reis, Serrano, Sida, Sorghum, Sojabohne, Kürbis („Squash"), Zuckerrohr, Zuckerrübe, Sonnenblume, Süßkartoffel, Tee, Tomate, Tabak, Wassermelone, Weizen und Wissadula besteht.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Geminivirus aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Gattungen Mastrevirus, Curtovirus und Begomovirus besteht.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ssDNA-Virus eine Art der Mastrevirus-Gattung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bajra-Streak-Virus, Bean-Yellow-Dwarf-Virus (Verzwergungs-Virus), Bromus-Striate-Mosaic-Virus, Chickpea-Chlorotic-Dwarf-Virus, Chlorfis-Striate-Mosaic-Virus, Digitaria-Streak-Virus, Digitaria-Striate-Mosaic-Virus, Maize-Streak-Virus//Äthiopien, Maize-Streak-Virus//Ghana1, Maize-Streak-Virus//Ghana2, Maize-Streak-Virus//Kenia, Maize-Streak-Virus//Komatipoort, Maize-Streak-Virus//Malawi, Maize-Streak-Virus//Mauritius, Maize-Streak-Virus//Mosambik, Maize-Streak-Virus//Nigeria1, Maize-Streak-Virus//Nigeria2, Maize-Streak-Virus//Nigeria3, Maize-Streak-Virus//Port Elizabeth, Maize-Streak-Virus//Reunion1, Maize-Streak-Virus//Reunion2, Maize-Streak-Virus//Setaria, Maize-Streak-Virus//Südafrika, Maize-Streak-Virus//Tas, Maize-Streak-Virus//Uganda, Maize-Streak-Virus//Vaalhart-Mais, Maize-Streak-Virus//Vaalhart-Weizen, Maize-Streak-Virus//Weizen-Eleusian, Maize-Streak-Virus//Zaire, Maize-Streak-Virus//Zimbabwe1, Maize-Streak-Virus//Zimbabwe2, Miscanthus-Streak-Virus, Panicum-Streak-Virus/Karino, Panicum-Streak-Virus/Kenia, Paspalum-Striate-Mosaic-Virus, Sugarcane-Streak-Virus//Ägypten, Sugarcane-Streak-Virus/Natal, Sugarcane-Streak-Virus/Mauritius, Tobacco-Yellow-Dwarf-Virus (Verzwergungs-Virus), Weizen-Verzwergungs-Virus/Tschechische Republik [Weizen-Verzwergungs-Virus-CJI, WDV-CJI], Weizen-Verzwergungs-Virus/Frankreich und Weizen-Verzwergungs-Virus/Schweden besteht.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ssDNA-Virus eine Art der Gattung Curtovirus ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Beet-Curly-Top-Virus Kalifornien, Beet-Curly-Top-Virus Kalifornien//Logan, Beet-Curly-Top-Virus-CFH, Beet-Curly-Top-Virus//Iran, Beet-Curly-Top-Virus Worland, Horseradish-Curly-Top-Virus, Tomato-Leafroll-Virus (Tomaten-Blattvoll-Virus) und Tomato-Pseudo-Curly-Top-Virus besteht.
  20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ssDNA-Virus eine Art der Begomovirus-Gattung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Abutilon-Mosaic-Virus, Acalypha-Yellow-Mosaic-Virus, Afrikanischem Cassava-Mosaic-Virus//Ghana, Afrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Kenia, Afrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Nigeria, Afrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Uganda, Ageratum-Yellow-Vein-Virus, Althea-Rosea-Enation-Virus, Asystasia-Golden-Mosaic-Virus, Bean-Calico-Mosaic-Virus, Bean-Dwarf-Mosaic-Virus, Bean-Golden-Mosaic-Virus Brasilien, Bean-Golden-Mosaic-Virus Puerto-Rico, Bean-Golden-Mosaic-Virus Puer to-Rico/Dominikanische Rep. [Bean-Golden-Mosaic-Virus Dominikanische-Rep., BGMV-DR], Bean-Golden-Mosaic-Virus Puerto-Rico/Guatemala [Bean-Golden-Mosaic-Virus Guatemala, BGMV-GA], Bhendi-Yellow-Vein-Mosaic-Virus, Chinodel-Tomato-Virus [Tomato-Leaf-Crumple-Virus, TLCrV], Cotton-Leaf-Crumple-Virus, Cotton-Leaf-Curl-Virus Indien, Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan1/Faisalabad1 [Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan2], Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan1/Faisalabad2 [Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan3], Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan1/Multan [Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan1], Cotton-Leaf-Curl-Virus Pakistan2/Faisalabad [Pakistanischem Cotton-Leaf-Curl-Virus], Cowpea-Golden-Mosaic-Virus, Cooton-Yellow-Vein-Mosaic-Virus//Lucknow, Dolichos-Yellow-Mosaic-Virus, Ostafrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Kenia, Ostafrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Malawi, Ostafrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Tanzania, Ostafrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Uganda//1 [Afrikanischem Cassava-Mosaic-Virus Uganda-Variante], Ostafrikanischem Cassava-Mosaic-Virus/Uganda//2, Eclipta-Yellow-Vein-Virus, Eggplant-Yellow-Mosaic-Virus, Eupatorium-Yellow-Vein-Virus, Euphorbia-Mosaic-Virus, Honeysuckle-Yellow-Vein-Mosaic-Virus, Horsegram-Yellow-Mosaic-Virus, Indischem Cassava-Mosaic-Virus, Jatropha-Mosaic-Virus, Leonurus-Mosaic-Virus, Limabean-Golden-Mosaic-Virus, Lupin-Leaf-Curl-Virus, Macroptilium-Golden-Mosaic-Virus Jamaika//2, Macroptilium-Golden-Mosaic-Virus Jamaika//3, Macrotyloma-Mosaic-Virus, Malvaceous-Chlorosis-Virus, Melon-Leaf-Curl-Virus, Mungbean-Yellow-Mosaic-Virus, Okra-Leaf-Curl-Virus//Elfenbeinküste, Okra-Leaf-Curl-Virus//Indien, Papaya-Leaf-Curl-Virus, Pepper-Huasteco-Virus, Pepper-Golden-Mosaic-Virus, [Texas-Pepper-Virus], Pepper-Mild-TigrA-Virus, Potato-Yellow-Mosaic-Virus//Guadeloupe, Potato-Yellow-Mosaic-Virus/Trinidad und Tobago, Potato-Yellow-Mosaik-Virus/Venezuela, Pseuderanthemum-Yellow-Vein-Virus, Rhynchosia-Mosaic-Virus, Serrano-Golden-Mosaic-Virus, Sida-Golden-Mosaic-Virus/Costa Rica, Sida-Golden-Mosaic-Virus/Honduras, Sida-Golden-Mosaic-Virus/Honduras//Yellow-Vein, Sida-Yellow-Vein-Virus, Solanum-Apical-Leaf-Curl-Virus, Soybean-Crincle-Leaf-Virus, Squash-Leaf-Curl-Virus, Squash-Leaf-Curl-Virus/Erweiterter Wirt, Squash-Leaf-Curl-Virus/Eingeschränkter Wirt, Squash-Leaf-Curl-Virus/Los Mochis, Squash-Leaf-Curl-Virus China, Tomato-Golden-Mosaic-Virus/Gewöhnlicher Stamm, Tomato-Golden-Mosaik-Virus/Yellow-Vein-Stamm, Tobacco-Leaf-Curl-Virus//Indien, Tobacco-Leaf-Curl-Virus China, Tomato-Leaf-Curl-Virus//Solanum-Art D1, Tomato-Leaf-Curl-Virus//Solanum-Art D2, Tomato-Leaf-Curl-Virus Australien, Tomato-Leaf-Curl-Virus Bangalore1 [Indischem Tomato-Leaf-Curl-Virus Bangalorel], Tomato-Leaf-Curl-Virus Bangalore2, [Indischem-Tomato-Leaf-Curl-Virus, ItoLCV], Tomato-Leaf-Curl-Virus Bangalo re3 [indischem Tomato-Leaf-Curl-Virus Bangalorell], Tomato-Leaf-Curl-Virus Neu Delhi/Stark [Tomato-Leaf-Curl-Virus Indien2, ToLCV-IN1], Tomato-Leaf-Curl-Virus Neu Delhi/Schwach [Tomato-Leaf-Curl-Virus Indien2, ToLCV-IN2], Tomato-Leaf-Curl-Virus Neu Delhi/Lucknow [Indischem Tomato-Leaf-Curl-Virus], Tomato-Leaf-Curl-Virus//Senegal, Tomato-Leaf-Curl-Virus Sinaloa [Sinaloa-Tomato-Leaf-Curl-Virus, STLCV], Tomato-Leaf-Curl-Virus Taiwan, Tomato-Leaf-Curl-Virus Tanzania, Tomato-Mottle-Virus, Tomato-Mottle-Virus Taino [Taino-Tomato-Mottle-Virus, TTMoV], Tomato-Severe-Leaf-Curl-Virus//Guatemala, Tomato-Severe-Leaf-Curl-Virus//Honduras, Tomato-Severe-Leaf-Curl-Virus//Nicaragua, Tomato-Yellow-Dwarf-Virus (Verzwergungs-Virus), Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus China, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel/Schwach, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel/Ägypten, [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Ägypten, TYLCV-EG], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel//Kuba, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel//Jamaika, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Israel//Saudi-Arabien1, [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Nördliches Saudi-Arabien, TYLCV-NSA], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Nigeria, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Sardinien, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Sardinien/Sizilien [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Sizilien, TYLCV-SY], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Sardinien/Spanien//1 [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Spanien, TYLCV-Sp], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Sardinien/Spanien//2 [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Almeria, TYLCV-Almeria], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Sardinien/Spanien//3 [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Europäischer Stamm], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Saudi-Arabien [Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Südliches Saudi-Arabien, TYLCV-SSA], Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Tanzania, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Thailand//1, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus Thaüand//2, Tomato-Yellow-Leaf-Curl-Virus//Jemen, Tomato-Yellow-Mosaic-Virus Brasilien//1, Tomato-Yellow-Mosaic-Virus Brasilien//2, Tomato-Yellow-Mottle-Virus, Tomato-Yellow-Vein-Streak-Virus Brasilien, Watermelon-Chlorotic-Stunt-Virus, Watermelon-Curly-Mottle-Virus und Wissadula-Golden-Mosaic-Virus Jamaika//1 besteht.
  21. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ssDNA-bindende Protein das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13 ist.
  22. Verfahren zum Herstellen einer Resistenz gegen pflanzenpathogene Geminiviren in einer Pflanze, umfassend das Einführen eines Gens in die Pflanze, das in der Lage ist, das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13 in der Pflanze zu exprimieren.
  23. DNA-Expressionsvektor, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein ssDNA-bindendes Protein der Inoviridae-Virus-Familie codiert, wobei der Vektor in der Lage ist, das Protein in Pflanzen zu exprimieren.
  24. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 23, wobei das Virus der Inoviridae-Familie aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Gattungen Inovirus und Plectrovirus besteht.
  25. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 24, wobei das Virus der Inovirus-Gattung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Coli-Phagen-, Enterobacteria-Phagen-, Pseudomonas-Phagen-, Vibrio-Phagen- und Xanthomonas-Phagen-Arten besteht.
  26. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 25, wobei das Virus der Coli-Phagen-Art aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Coli-Phagen AE2, dA, Ec9, f1, fd, HR, M13, ZG/2 und ZJ/2 besteht.
  27. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 23, wobei das ssDNA-bindende Protein ein Gen-5-Protein ist.
  28. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 23, wobei das ssDNA-bindende Protein das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13 ist.
  29. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 28, wobei das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13 die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
  30. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 23, wobei die Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 2 oder 3 angegeben ist.
  31. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 23, wobei der Vektor ein Transportvektor ist.
  32. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 31, wobei der Transportvektor ein Agrobacterium-Vektor ist.
  33. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 23, wobei die Pflanze aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Abutilon, Acalypha, Apfel, Ageratum, Althea rosea, A systasia, Bajra, Banane, Gerste, Bohnen, Rübe, Urdbohne („Blackgram"), Bromus, Cassava, Kichererbse, Paprikas, Chlorfis, Klee, Kokosnuss, Kaffee, Baumwolle, Kuherbse/-bohne, Croton, Gurke, Digitaria, Dolichos, Aubergine, Eupatorium, Euphorbia, Fababohne, Geißblatt, Pferdebohne, Jatropha, Leonurus, Limabohne, Lupine, Macroptilium, Macrotyloma, Mais, Melone, Hirse, Mungbohne, Hafer, Okra, Panicum, Papaya, Paspalum, Erdnuss, Erbse, Pfeffer, Straucherbse (Taubenerbse), Ananas, Phaseolus, Kartoffel, Pseuderanthemum, Speisekürbis („Pumpkin"), Rhynchosia, Reis, Serrano, Sida, Sorghum, Sojabohne, Kürbis („Squash"), Zuckerrohr, Zuckerrübe, Sonnenblume, Süßkartoffel, Tee, Tomate, Tabak, Wassermelone, Weizen und Wissadula besteht.
  34. Zusammensetzung zum Herstellen einer Resistenz, gegen ein ssDNA-Virus der Geminivirus-Familie, das Pflanzen infiziert, umfassend eine wirksame Menge eines DNA-Expressionsvektors, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein ssDNA-bindendes Protein der Inoviridae-Virus-Familie codiert, wobei der Vektor in der Lage ist, das Protein in der Pflanze zu exprimieren.
  35. Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei der DNA-Expressionsvektor der Vektor nach Anspruch 23 ist.
  36. Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei das ssDNA-bindende Protein das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13 ist.
  37. Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13 die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
  38. Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei die Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 2 oder 3 angegeben ist.
  39. Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei der DNA-Expressionsvektor ein Transportvektor ist.
  40. Zusammensetzung nach Anspruch 39, wobei der Transportvektor ein Agrobacterium-Vektor ist.
  41. Transgene Pflanze, die einen DNA-Expressionsvektor enthält, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein ssDNA-bindendes Protein der Inoviridae-Virus- Familie codiert, wobei der Vektor in der Lage ist, das Protein in der Pflanze zu exprimieren.
  42. Transgene Pflanze nach Anspruch 41, wobei der DNA-Expressionsvektor der Vektor nach Anspruch 23 ist.
  43. Transgene Pflanze nach Anspruch 41, wobei das ssDNA-bindende Protein das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13 ist.
  44. Transgene Pflanze nach Anspruch 43, wobei das Gen-5-Protein des Coli-Phagen M13 die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
  45. Transgene Pflanze nach Anspruch 41, wobei die Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 2 oder 3 angegeben ist.
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