CN100366733C - 利用丝杆噬菌体科病毒ssDNA结合蛋白、组合物及适当方法使植物对ssDNA病毒感染具有抗性 - Google Patents

Abstract

本发明描述了产生植物抗ssDNA病毒抗性的方法，特别是对双粒病毒组如马斯特病毒，科特病毒，贝各母病毒的方法。该方法包括将丝杆噬菌体科病毒的ssDNA结合病毒导入到植物中，导入的蛋白包括噬菌体包膜蛋白，特别是大肠杆菌噬菌体基因5蛋白。本发明还描述了转基因植物，其中包含有表达ssDNA结合蛋白的基因以及用于在植物中表达该基因用的载体。

Description

利用丝杆噬菌体科病毒ssDNA结合蛋白、组合物及适当方法使植物对ssDNA病毒感染具有抗性

技术领域

本发明涉及产生抗植物病毒感染植株的方法及组合物。

发明背景

双粒病毒是一类造成世界上许多国家的农作物严重减产的植物病原体(Briddon等，“双粒病毒科(Geminiviridae)”，p.158-165，In F.A.Murphy(编)，病毒分类学。在国际病毒分类学会议上的第 6次报告.Springer-Verlag，Vienna & New York，1995；Frischmuth等，Semin.Virol.，4：329-337，1993；Harrison等，Ann.Rev. Phytopathol.，23：55-82，1985；Polston等，Plant Dis.，81：1358-1369，1997)。其不同成员可由粉虱或叶蝉加以传播(Davies等，Genet.，5：77-81，1989；Lazarowitz等，Crit.Rev.Plant Sci.，11：327-349，1992)。大多数由粉虱传播的双粒病毒(WTGs)具有双拷贝基因组，而所有由叶蝉传播的双粒病毒及某些WTGs则含有单拷贝基因组。单拷贝基因组(2566-3028核苷酸)编码病毒复制、壳化及运动所必需的蛋白，而在双拷贝基因组病毒中，运动功能由大小相近的第二套基因组部分负责编码(Davies等，Genet.，5：77-81，1989；Ingham等，Virology，207：191-204，1995；Timmermans等，A植物生理学和植物分子生物学年鉴(Annu.Rev.Plant Physiol. Plant Mol.Biol).，45：79-112，1994)。

双粒病毒具有环状的单链(ss)DNA基因组，并被包装在双廿面体颗粒中。它们通过滚环机制进行复制，这与具有ssDNA基因组的细菌噬菌体的复制相类似。新产生的双粒病毒单链(ss)DNA被宿主的酶转变为双链(ds)DNA，dsDNA进而又作为互补链上复制相关基因的早期转录模板。复制启始蛋白(Rep或AC1)是复制所需的唯一病毒蛋白。在双拷贝基因组双粒病毒中，有第二种蛋白(AC3)可增强复制。另一种早期基因产物AC2可转而激活病毒有义链上的衣壳蛋白(CP)基因的表达。尽管CP不是原生质体或植物体内的病毒复制所必需的蛋白，但CP突变会导致原生质体或植物体内ssDNA积累的急剧减少，而对dsDNA的积累则不产生影响。另一方面，番茄金色花叶病毒的CP突变对植物体内的DNA积累没有影响，但是会使原生质体内的ssDNA积累减少而使dsDNA积累增加。在植物中，CP的缺乏会导致单拷贝基因组病毒的感染性完全丧失，而对双拷贝基因组病毒则不会如此。

衣壳蛋白能够以一种消极方式来影响ssDNA与dsDNA的比例，如通过壳化使ssDNA转换为dsDNA从而消耗ssDNA，或者通过调节ssDNA的合成，或是二者兼备。尚无证据说明CP是如何在双粒病毒中影响ssDNA积累的。在新德里番茄卷叶病毒(ToLCV-NbE，以下表示为ToLCV)这种双拷贝基因组双粒病毒中，破坏野生型CP的合成将导致被感染原生质体中的ssDNA急剧减少，而dsDNA的积累却增加3-5倍。然而，接种的植物却产生严重的症状，其dsDNA的积累达到野生型水平而ssDNA的水平却很低。

目前还有必要对CP在双粒病毒复制中的作用做进一步地了解。

发明概述

我们现已发现一种异种的ssDNA结合蛋白可补充CP在双粒病毒ssDNA积累上的功能。并且还发现，当ToLCV被修饰成表达来源于大肠杆菌噬菌体M13的ssDNA基因5结合蛋白(g5p)而不是表达CP时可使原生质体中的ssDNA积累达到野生型水平，而在植物体中却没有此效应，这为本发明提供了关键的思路。在丝杆噬菌体科病毒中即发现了典型的异种ssDNA结合蛋白。

因此，本发明在一项实施方案中描述了使植物产生单链DNA(ssDNA)病毒抗性的方法，其中包括将丝杆噬菌体科病毒的一种ssDNA结合蛋白引入植物。丝杆噬菌体科病毒ssDNA结合蛋白选自丝杆病毒属和细杆病毒属，而丝杆病毒属病毒选自大肠杆菌噬菌体、肠杆菌噬菌体、假单胞菌噬菌体、弧菌噬菌体以及黄单胞菌噬菌体。优选的大肠杆菌噬菌体种病毒的选自AE2、dA、Ec9、f1、fd、HR、M13、ZG/2和ZJ/2大肠杆菌噬菌体，其中具有衣壳蛋白或基因5蛋白的为更优选的方案。特别优选的蛋白为大肠杆菌噬菌体M13基因5蛋白。

将ssDNA结合蛋白引入植物体的方法包括，产生含有用于表达蛋白的表达载体的转基因植物，将植物与一种用于表达蛋白的表达载体相接触，用携带载体，如土壤杆菌属载体，感染植物，等。

本发明还描述一种含有编码丝杆噬菌体属病毒ssDNA结合蛋白的核苷酸序列的DNA表达载体，其中该载体能够在植物体内表达蛋白。该载体在此处所述的方法中使用。

本发明还描述一种用来对感染植物的ssDNA病毒产生抗性的组合物，该组合物中包括有效剂量的含有编码丝杆噬菌体科病毒ssDNA结合蛋白的核苷酸序列的DNA表达载体，其中该载体能够在植物体内表达蛋白。在优选实施方案中，该载体为可感染植物的携带载体。特别优选的载体为土壤杆菌属载体。

本发明还考虑一种带有本发明所述DNA表达载体的转基因植物，该转基因植物由于表达此处所述的ssDNA结合蛋白而能够抵抗ssDNA病毒的感染。

其它实施方案将在详细说明书及权利要求书中阐明。

附图简述

图1显示新德里番茄卷叶病毒(ToLCV-Nde)构建体的基因组结构及构建示意图。图1A为ToLCV-Nde的基因组结构，图中说明ORFs及其功能。两种部件的共用区CR。图1B为ToLCV-Nde的AV2和CP区域的线形物理图谱，核苷酸位置及相关的限制性酶切位点标注于下部。线形图上方显示不同基因替代的位置。请注意基因替代并非按比例显示。有关构建体的描述将在表1中给出。

图2显示ToLCV构建体在感染的BY2原生质体中的复制情况。按照实施例中的描述进行Southern印迹分析。用于感染原生质体的病毒构建体显示在泳道上方。原生质体仅用A组DNA接种(1-11道)，或用A组和B组DNAs共接种(12-15道)。每道含4μg由原生质体制备的DNA(单次转染)。病毒DNA的检测采用由A组DNA制备的放射性标记探针。图中标明超螺旋(sc)、单链(ss)、开环(op)及线形(li)病毒DNA的位置。应注意到由于CP66:6G:BC1构建体的尺寸较大，第11道中超螺旋形式及其它形式的病毒DNA的位置均上移。

图3显示原生质体中表达的蛋白的间接免疫荧光(图3A-3G)和植物中表达的绿色荧光蛋白(GFP)的荧光(图3H-3P)。原生质体被转染后，用不同抗体及FITC-或罗丹明-偶联的二级抗体显现抗原。植物中的GFP荧光每3天监测一次，持续15天，所示区域相当于2.5×2.5mm的叶片面积。(图3A)CP66:Stag:6G:g5病毒感染的原生质体，并用与FITC结合的S蛋白染色。(图3B)野生型病毒感染的原生质体，并用抗CP抗血清染色。(图3C)CP66:GUS病毒感染的原生质体，并用抗GUS抗血清染色。(图3D)g5:GUSAV2-CP-病毒感染的原生质体，并用抗GUS抗血清染色。(图3E)GUSAV2-CP-病毒感染的原生质体，并用抗GUS抗血清染色。(图3F)FBV1AV2-CP-病毒感染的原生质体，并用抗Flag抗体染色。(图3G)TBC1AV2-CP-病毒感染的原生质体，并用抗T7标记的抗体染色。请注意该显微照片中显示了两个细胞。由GFPAV2^-CP^-+CP66:g5^-病毒感染的植株的接种后天数(dpi)为6天的接种叶片(图3H)及全叶片(图3I)。由GFPAV2^-CP^-+CP66:g5^-病毒感染的植株的15dpi的接种叶片(图3J)及全叶片(图3K)。由GFPAV2CP^-+CP66:6G:g5病毒感染的植株的6dpi的接种叶片(图3L)及全叶片(图3M)。由GFPAV2^-CP^-+CP66:6G:g5病毒感染的植株的15dpi的接种叶片(图3N)及全叶片(图30和图3P)。

图4显示基因5蛋白与ToLCV-Nde DNA的体内结合。(图4A)原生质体在含有不同浓度NaCl(显示于泳道上方)的NP40缓冲液或RIPA缓冲液中裂解后，用结合抗Flag抗体的琼脂糖对原生质体内表达的经Flag抗原决定簇标记的CP66:6G:g5蛋白进行免疫沉淀，免疫沉淀出的蛋白用抗Flag抗体进行Western印迹检测(2-6道)。1道包含由野生型病毒转染的原生质体中免疫沉淀出的蛋白，以此作为对照。各道在约24Kda位置出现的蛋白条带是用于免疫沉淀的抗Flag抗体的轻链。免疫沉淀的CP66:6G:g5蛋白在两个不同分子量的位置上被检测到，分别相当于单体和二聚体形式。分子量标记的位置以千道尔顿为单位在左侧标明。(图4B)32P-标记的A组DNA为探针，通过Sounthern印迹检测出与Flag抗原决定簇标记的CP66:6G:g5蛋白共免疫沉淀的病毒ssDNA。1-7道的处理方法与图4A所示相同。

发明详述

本发明基于以下发现，即丝杆噬菌体科病毒的ssDNA结合蛋白可在ssDNA型植物病毒的感染过程中干扰病毒的传播。通过抑制病毒传播而减少和/或阻断病毒的感染，从而提高植物对病毒感染的“抗性”。

本发明描述了利用丝杆噬菌体科病毒ssDNA结合蛋白抑制ssDNA植物病毒的方法、能够在植物体内表达结合蛋白的表达载体、运送表达载体的组合物，以及含有能够表达结合蛋白的基因的转基因植物。

A.抑制ssDNA植物病毒的方法

本发明考虑使植物对单链DNA(ssDNA)病毒感染和/或毒性产生抗性的方法。该方法包括将来自丝杆噬菌体科病毒的一种ssDNA结合蛋白引入到易感植物体内。

ssDNA结合蛋白通常是将编码ssDNA结合蛋白并含有用于在植物体内表达蛋白的表达控制元件的核苷酸序列加以表达而获得。

将蛋白进入植物可通过多种方法加以实现，如基因转移标准方法、用转移载体或携带载体对植物进行接种(即利用设计好的植物病毒或噬菌体进行感染)、利用“生物枪”(即发射枪)将核酸引入成熟植物组织、植物原生质体直接吸收DNA、用基于根癌土壤杆菌的载体转化植物，等众所周知的方法。

植物的核苷酸序列表达元件已为该领域所熟知，因而认为它们不受本发明的限制。编码ssDNA结合蛋白的核苷酸序列可作为DNA片段，或作为“转移”载体或携带载体，如在植物中常用的感染性土壤杆菌属基因转移系统，的一个部分出现在表达载体上。

优选的ssDNA结合蛋白为能够结合ssDNA的丝杆噬菌体科病毒蛋白。优选的蛋白为病毒衣壳蛋白或病毒“基因5”蛋白。尽管可采用全蛋白(即天然蛋白)，但也可采用全蛋白的包含其ssDNA结合部分的某些部分。此外还应了解，可对天然蛋白的氨基酸残基序列进行某些修改而又不损害本发明所述蛋白的基本功能特性。因此，术语“ssDNA结合蛋白”是指包括活性片段、含有活性片段的融合蛋白、全蛋白及其具有ssDNA结合活性的衍生物在内的多种构型的蛋白中的任意一种。

利用该领域认可的方法，包括本文所述的结合方法，可轻易地对ssDNA结合能力加以检测。因此，只要ssDNA结合蛋白能够如文中所述与植物病毒ssDNA结合，并能够抑制病毒复制和/或病毒发病机制，本发明就不被认为受到这些限制。

丝杆噬菌体科病毒是一个大家族，它包括丝杆病毒属和细杆病毒属。优选的丝杆病毒种类包括大肠杆菌噬菌体、肠杆菌噬菌体、假单胞菌噬菌体、弧菌噬菌体以及黄单胞菌噬菌体。优选的大肠杆菌噬菌体的种类包括AE2、dA、Ec9、f1、fd、HR、M13、ZG/2和ZJ/2大肠杆菌噬菌体。特别优选的蛋白为大肠杆菌噬菌体M13基因5蛋白。

在优选实施方案中，大肠杆菌噬菌体M13基因5蛋白具有如SEQID NO 1所示的氨基酸残基序列。

在相关实施方案中描述的方法包括，通过含有可表达该蛋白的基因的转基因植物的制备方法引入ssDNA结合蛋白，从而使植物获得对ssDNA植物病毒的抗性。文中将对可表达本发明所述ssDNA结合蛋白等外源蛋白的转基因植物的制备方法做进一步的描述。

在另一相关实施方案中描述的方法包括，通过将植物与一种含有可在植物体内表达蛋白的表达载体的组合物相接触的方法引入ssDNA结合蛋白，文中将对制备以及在本发明所述组合物中使用表达载体的方法做进一步的描述。

应该了解的是，在以核酸，其中含有编码并可表达ssDNA结合蛋白的核苷酸序列，为基础的各种方法中，只要能够编码预期的ssDNA结合蛋白，核苷酸序列在内容上就可以有所不同。举例来说，在编码氨基酸残基序列时，遗传密码允许在密码子选择上有所不同，因此本发明将不被认为限定于某个特定的核苷酸序列。但同样应该理解的是，一种表达环境，如植物细胞，具有密码选择的优先性，因此可以使用优先密码子，以优化可表达基因在植物中的表达。

由此，在本发明所述表达载体或转基因植物中使用的优选核苷酸序列可使用优先密码子。在本发明中使用的特别优选核苷酸序列编码M13基因5蛋白，其优选的氨基酸残基序列显示于SEQ ID NO 1。在一项实施方案中，优选的核苷酸序列含有如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，SEQ ID NO 2显示来自M13病毒基因组的编码天然M13基因5蛋白的天然核苷酸序列。在另一项实施方案中，优选的核苷酸序列含有如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，SEQ ID NO 3显示设计加入高表达人类基因优先采用的密码子的编码天然M13基因5蛋白的合成核苷酸序列。

从GenBank中可获得细菌噬菌体M13的完整序列，登录号为V00604、J02461和M10377，其中包括基因5编码序列。氨基酸残基序列和编码M13基因5的核苷酸序列分别如SEQ ID Nos 1和2所示。

引入的蛋白可有效抑制任何一种可感染植物的ssDNA病毒的感染。优选的病毒为双粒病毒科病毒，包括马斯特病毒属(Mastrevirus)、科特病毒属(Curtovirus)和贝各母病毒属(Begomovirus)。

优选的马斯特病毒属种类选自御谷线条病毒、菜豆黄矮病毒、雀麦条点花叶病毒、马豆褪绿矮缩病毒、虎尾草条点花叶病毒、马唐条纹病毒、马唐条点花叶病毒、玉米条纹病毒//埃塞俄比亚、玉米条纹病毒//加纳1、玉米条纹病毒//加纳2、玉米条纹病毒//肯尼亚、玉米条纹病毒//卡马替普(Kamatipoort)、玉米条纹病毒//马拉维、玉米条纹病毒//毛里求斯、玉米条纹病毒//莫桑比克、玉米条纹病毒//尼日利亚1、玉米条纹病毒//尼日利亚2、玉米条纹病毒//尼日利亚3、玉米条纹病毒//伊丽莎白港、玉米条纹病毒//留尼汪1、玉米条纹病毒//留尼汪2、玉米条纹病毒//赛它利亚(Setaria)、玉米条纹病毒//南非、玉米条纹病毒//台斯(Tas)、玉米条纹病毒//乌干达、玉米条纹病毒//瓦哈特(Vaalhart)玉米、玉米条纹病毒//瓦哈特小麦、玉米条纹病毒//小麦-伊卢西亚(eleusian)、玉米条纹病毒//扎伊尔、玉米条纹病毒//津巴布韦1、玉米条纹病毒//津巴布韦2、芒条纹病毒、黍条纹病毒/卡理诺(Karino)、黍线条病毒/肯尼亚、雀稗条点花叶病毒、甘蔗条纹病毒//埃及、甘蔗条纹病毒/纳塔耳、甘蔗条纹病毒/毛里求斯、烟草黄矮病毒、小麦矮化病毒/捷克共和国[小麦矮化病毒-CJI，WDV-CJI]、小麦矮化病毒/法国以及小麦矮化病毒/瑞典。

优选的科特病毒属种类选自甜菜曲顶病毒-加利福尼亚、甜菜曲顶病毒-加利福尼亚//罗干(Logan)、甜菜曲顶病毒-CFH、甜菜曲顶病毒//伊朗、甜菜曲顶病毒-沃兰德(Worland)、辣根曲顶病毒、番茄卷叶病毒以及番茄伪曲顶病毒。

优选的贝各目病毒属种类选自白麻花叶病毒、铁苋菜黄花叶病毒、非洲木薯花叶病毒//加纳、非洲木薯花叶病毒/肯尼亚、非洲木薯花叶病毒/尼日利亚、非洲木薯花叶病毒/乌干达、藿香黄脉病毒、蜀葵耳突病毒、十万错金色花叶病毒、菜豆印色花叶病毒、菜豆矮花叶病毒、菜豆金色花叶病毒-巴西、菜豆金色花叶病毒-波多黎哥、菜豆金色花叶病毒-波多黎哥/多米尼加共和国[菜豆金色花叶病毒-多米尼加共和国，BGMV-DR]、菜豆金色花叶病毒-波多黎哥/危地马拉[菜豆金色花叶病毒-危地马拉，BGMV-GA]、本迪(Bhendi)黄脉花叶病毒、奇诺的汤姆特(Chino del tomate)病毒[番茄皱叶病毒，TLCrV]、棉花皱叶病毒、棉花曲叶病毒-印度、棉花曲叶病毒-巴基斯坦1/发斯拉巴达(Faisalabad)1[棉花曲叶病毒-巴基斯坦2]、棉花曲叶病毒-巴基斯坦1/发斯拉巴达2[棉花曲叶病毒-巴基斯坦3]、棉花曲叶病毒-巴基斯坦1/木耳坦[棉花曲叶病毒-巴基斯坦1]、棉花曲叶病毒-巴基斯坦2/发斯拉巴达[巴基斯坦棉花曲叶病毒]、豇豆金色花叶病毒、巴豆黄脉花叶病毒//勒克瑙、扁豆黄花叶病毒、东非木薯花叶病毒/肯尼亚、东非木薯花叶病毒/马拉维、东非木薯花叶病毒/坦桑尼亚、东非木薯花叶病毒/乌干达//1[非洲木薯花叶病毒-乌干达变种]、东非木薯花叶病毒/乌干达//2、旱莲草黄脉病毒、茄子黄花叶病毒、泽兰黄脉病毒、大戟花叶病毒、忍冬黄脉花叶病毒、马豆(Horsegram)黄花叶病毒、印度木薯花叶病毒、麻风树花叶病毒、益母草花叶病毒、利马豆金色花叶病毒、羽扇豆曲叶病毒、麦可托利母(Macroptilium)金色花叶病毒-牙买加//2、麦可托利母金色花叶病毒-牙买加//3、硬皮豆花叶病毒、锦葵褪绿病毒、甜瓜曲叶病毒、绿豆黄花叶病毒、秋葵曲叶病毒//象牙海岸、秋葵曲叶病毒//印度、番木瓜曲叶病毒、胡椒哈斯台口(huasteco)病毒、胡椒金色花叶病毒[得克萨斯胡椒病毒]、胡椒淡味替格(tigr_)病毒、马铃薯黄花叶病毒//瓜德罗普、马铃薯黄花叶病毒/特立尼达和多巴哥、马铃薯黄花叶病毒/委内瑞拉、钩粉草黄脉病毒、鹿霍花叶病毒、赛雷诺(Serrano)金色花叶病毒、黄花稔属金色花叶病毒/哥斯达黎加、黄花稔属金色花叶病毒/洪都拉斯、黄花稔属金色花叶病毒/洪都拉斯//黄脉、黄花稔属黄脉病毒，茄属顶叶卷曲病毒、大豆皱叶病毒、南瓜曲叶病毒、南瓜曲叶病毒/扩展型宿主、南瓜曲叶病毒/限制型宿主、南瓜曲叶病毒/洛莫气斯(Los Mochis)、南瓜曲叶病毒-中国、番茄金色花叶病毒/普通株、番茄金色花叶病毒/普通株、番茄金色花叶病毒/黄脉株、烟草曲叶病毒//印度、烟草曲叶病毒-中国、番茄曲叶病毒//茄属物种D1、番茄曲叶病毒//茄属物种D2、番茄曲叶病毒-澳大利亚、番茄曲叶病毒-班加罗尔1[印度番茄曲叶病毒-班加罗尔I]、番茄曲叶病毒-班加罗尔2[印度番茄曲叶病毒，ItoLCV]、番茄曲叶病毒-班加罗尔3[印度番茄曲叶病毒-班加罗尔II]、番茄曲叶病毒-新德里/严重型[番茄曲叶病毒-印度2，ToLCV-IN1]、番茄曲叶病毒-新德里/轻微型[番茄曲叶病毒-印度2，ToLCV-IN2]、番茄曲叶病毒-新德里/勒克瑙[印度番茄曲叶病毒]、番茄曲叶病毒//塞内加尔、番茄曲叶病毒-西那洛(Sinaloa)[西那洛番茄曲叶病毒，STLCV]、番茄曲叶病毒-台湾、番茄曲叶病毒-坦桑尼亚、番茄斑驳病毒、番茄斑驳病毒-泰诺(Taino)[泰诺番茄斑驳病毒，TTMoV]、番茄重曲叶病毒//危地马拉、番茄重曲叶病毒//洪都拉斯、番茄重曲叶病毒//尼加拉瓜、番茄黄矮病毒、番茄黄曲叶病毒-中国、番茄黄曲叶病毒-以色列、番茄黄曲叶病毒-以色列/轻微型、番茄黄曲叶病毒-以色列/埃及[番茄黄曲叶病毒-埃及，TYLCV-EG]、番茄黄曲叶病毒-以色列//古巴、番茄黄曲叶病毒-以色列//牙买加、番茄黄曲叶病毒-以色列//沙特阿拉伯1[番茄黄曲叶病毒-北沙特阿拉伯，TYLCV-NSA]、番茄黄曲叶病毒-尼日利亚、番茄黄曲叶病毒-撒丁岛、番茄黄曲叶病毒-撒丁岛/西西里岛[番茄黄曲叶病毒-西西里岛，TYLCV-SY]、番茄黄曲叶病毒-撒丁岛/西班牙//1[番茄黄曲叶病毒-西班牙，TYLCV-Sp]、番茄黄曲叶病毒-撒丁岛/西班牙//2[番茄黄曲叶病毒-阿尔米亚(Almeria)，TYLCV-阿尔米亚]、番茄黄曲叶病毒-撒丁岛/西班牙//3[番茄黄曲叶病毒-欧洲株]、番茄黄曲叶病毒-沙特阿拉伯[番茄黄曲叶病毒-南沙特阿拉伯，TYLCV-SSA]、番茄黄曲叶病毒-坦桑尼亚、番茄黄曲叶病毒-泰国//1、番茄黄曲叶病毒-泰国//2、番茄黄曲叶病毒//也门、番茄黄花叶病毒-巴西//1、番茄黄花叶-巴西//2、番茄黄斑驳病毒、番茄黄脉条纹病毒-巴西、西瓜褪绿矮小病毒、西瓜曲斑驳病毒以及隔蔌炯金色花叶病毒-牙买加//1。

其它ssDNA植物病毒包括香蕉束顶病毒、椰子腐叶病毒、蚕豆坏死性黄化病毒、黄芪矮小病毒以及地三叶矮小病毒。

可由本发明所述方法抑制的上述ssDNA植物病毒能够感染很多种类的植物。由于处在本发明范围内的易受所述ssDNA植物病毒感染的新型植物种类可能会发现，因此应理解本发明并非局限于已知植物。相反，该方法所说的植物可指任何一种易被所述ssDNA植物病毒易感的植物，其易感性可用该领域认可的方法加以测定，其中包括文中所述的感染方法。

“植物”一词包括完整植株、植物器官(如叶、茎、根等)、种子和植物细胞及同样的后代。可在本发明所述方法中使用的植物种类的范围通常与可实施转化技术的高等植物的范围相当，其中包括单子叶植物(monocots)和双子叶植物(dicots)。它包括多种倍体型的植物，如多倍体、二倍体和单倍体。

易受感染并因此可成为文中所述处理方法和组合物的作用对象的典型植物包括，但并不局限于，选自如下的一种植物：白麻属、铁苋菜属、苹果、藿香蓟属、蜀葵属玫瑰、十万错属、御谷、香蕉、大麦、甜菜、黑绿豆属、雀麦属、木薯、鹰嘴豆属、其利(Chilllies)、虎尾草属、三叶草、椰子、咖啡、棉花、豇豆、巴豆、黄瓜、马唐属、扁豆属、茄子、泽兰属、大戟属、蚕豆、忍冬、马豆(horsegram)、麻风树属、益母草属、利马豆、羽扇豆、麦可托利母、硬皮豆属、玉米、甜瓜、小米、绿豆、燕麦、秋葵、黍属、木瓜、雀稗属、花生、豌豆、胡椒、木豆、菠萝、菜豆属、马铃薯、钩粉草、西葫芦、鹿霍属、水稻、赛雷诺(Serrano)、黄花稔属、高粱、大豆、南瓜、甘蔗、糖甜菜(sugarbeet)、向日葵、甘薯、茶叶、番茄、烟草、西瓜、小麦和隔蒴苘属，或任何单个植物或其植物结合体。

在此利用由番茄曲叶病毒(ToLCV)重组载体在烟草植株和原生质体上表达的M13基因5蛋白对本发明所述方法的优选实例加以描述。ToLCV双拷贝基因组中A组及B组的ToLCV病毒基因组核苷酸序列均为已知，它们分别可由GenBank登录号U15015和U15016而获得，并分别显示于SEQ ID Nos 4和5。

B.核酸分子

本发明还考虑一种用于本发明所述ssDNA结合蛋白在植物体内表达的核酸分子，如一种DNA表达载体。因此，该核酸分子含有一段编码本发明所述ssDNA结合蛋白的核苷酸序列，并进一步含有调节和控制植物体内基因表达的元件。植物体内用于表达的典型元件在美国专利号5,188,642、5,202,422、5,463,175和5,639,947中有所描述，其公开内容在此引入作为参考。此外，核酸操作及植物表达载体产生的方法已众所周知，因而认为该部分不受本发明的限制。

用于将ssDNA结合蛋白引入植物体的典型表达载体及系统将在实施例中描述。

因此，本发明在一项实施方案中描述了一种基于核酸的表达系统，该表达系统包含编码丝杆噬菌体科病毒ssDNA结合蛋白的核苷酸序列，并能够通过文中所述的ssDNA植物病毒在易受敏感的植物中表达该蛋白。

ssDNA结合蛋白可以是文中描述以及实施本发明所述方法时指定的任何一种蛋白。特别优选的蛋白为M13基因5蛋白，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO 1所示。

表达系统可以是一个载体或一个基因，这取决于预期的用法。在采用转基因植物的情况下，本发明描述了一种基因，该基因包含的核苷酸序列定义了一个表达盒，即ssDNA结合蛋白结构基因表达所必需的元件，众所周知，这些元件包括启动子、转录起始信号、翻译起始信号、结构蛋白编码序列、以及翻译和转录终止信号。在采用载体或感染性制剂来引入表达盒的情况下，该载体或制剂中还含有适合其功能的附加遗传元件。

例如，载体还可包含用于复制或调控等的元件，如在质粒中发现的便于载体大量制备的元件。感染性制剂则通常为能够感染植物的改进型植物病毒或植物噬菌体，它还可包含用于其复制及组装在感染性颗粒内的附加元件。

本发明所述载体、基因或感染性制剂中的优选表达盒含有文中所述SEQ ID Nos 2或3显示的核苷酸序列。

众所周知，质粒可用于核酸的常规克隆。文中使用的优选克隆质粒为pBluescript II SK载体(Stratagene，La Jolla，CA)。pBluescript质粒的完整核苷酸序列可由登录号X52330从GenBank中获得，并显示于SEQ ID No 6。

有多种方法、载体和制剂可用于植物转化，因此不认为本发明受到这些限制。典型的方法包括，由原生质体直接吸收表达盒核酸并使植物再生以形成植株而实现的植物转化、由电穿孔进入原生质体、由生物枪将核酸输送到培养的植物细胞或整个植物组织内、花粉介导的转化、由重组病毒或噬菌体制剂感染，如改进的ToLCV或土壤杆菌介导的转化，等等。用于实施某些上述方法的典型载体包括pBIN19(Bevan等，Nucl.Acids Res.，12：8711，1984；GenBank登录号U09365)、可由Monsanto(St.Louis，MO)获得的pMON316或pMON、pGA482(An等，Plant Physiol.，81：86，1986)、pCGN1547(McBride等，Plant Mol.Biol.，14：269，1990)、pPZP100(Ajdukiewicz等Plant Mol.Biol.，25：989，1994，GenBank登录号U10456)、pMOG410，等。

C.转基因植物

本发明进而考虑一种含有本发明所述用于ssDNA结合蛋白表达的核苷酸序列的转基因植物。该转基因植物包含一种如文中定义的表达盒作为其一部分，该表达盒已利用本发明所述载体经植物转化而引入到植物中。

本发明所使用的转基因植物的产生方法在美国专利号5,188,642；5,202,422；5,234,834；5,463,175；和5,639,947中有所描述，其公开内容在此引入作为参考。

对多种植物进行转化的技术亦为人们所熟知，并且在技术及科学文献中均有所描述。例如，见Weising等，Ann.Rev.Genet.，22：421-477，1988。经操作将一种组成型或诱导型启动子与适当载体中编码本发明所述ssDNA结合蛋白的特定异种DNA序列相连接。载体中含有与异种DNA融合的启动子，并且通常还包含一种为植物细胞提供可选表型的标记基因。举例来说，该标记基因可编码杀生物剂抗性，尤其是抗生素抗性，如抗卡那霉素、G418、博莱霉素、潮霉素的抗性，或抗chlorsulfuron或Basta等除莠剂的抗性。这种选择性标记基因在转基因植物的产生过程中非常有用。

包含表达盒的DNA构建体可通过多种常规技术引入特定植物宿主的基因组中。例如，可采用植物细胞原生质体的电穿孔及显微注射技术将DNA构建体直接引入植物细胞的DNA中。作为选择，也可采用生物枪方法，如DNA微颗粒轰击，将DNA构建体直接引入植物组织。此外，还可将DNA构建体结合到适当的T-DNA侧翼区，并引入到根癌土壤杆菌宿主的常规载体中。当根癌土壤杆菌宿主被细菌感染后，其毒性功能将指导DNA构建体和邻近的标记物进入植物细胞DNA中。

显微注射技术已为该领域所熟知，并在科学及专利文献有详细描述。利用聚乙二醇沉淀引入DNA构建体的方法在Paszkowski等，EMBO J.，3：2717-2722，1984中有所描述。电穿孔技术在Fromm等.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA，82：5824，1985中有所描述。生物枪转化技术在Klein等，Nature 327：70-73，1987中有所描述。所有引用文献的全部公开内容均在此引入作为参考。

用小颗粒进行高速生物枪穿透的方法还涉及一种变化，它可把核酸置于小珠或颗粒的内部，或置于其表面(Klein等，Nature327：70-73，1987)。尽管通常的要求是只需作新核酸片段的单次引入，但是该方法特别适合于多次引入。

根癌土壤杆菌介导的转化技术在科学文献中有详细的阐述。例如，见Horsch等，Science，233：496-498，1984，和Fraley等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA，90：4803，1983。更详细而言，即利用经片段转化的根癌土壤杆菌感染植物细胞、外植体、分生组织或种子。在为该领域所熟知的适当条件下使转化的植物细胞生长，以形成芽、根，并进而发育为植株。例如，利用根癌土壤杆菌的Ti质粒可将核酸片段引入适当的植物细胞。一旦经根癌土壤杆菌感染，Ti质粒即被传递到植物细胞内，并稳定整合到植物基因组中(Horsch等，Science，233：496-498，1984；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：4803，1983)。

Ti质粒包含两个产生转化细胞所必需的区域。其中一个称为转化DNA(T DNA)，可诱导肿瘤形成。另一个称为毒性区，它是把T DNA引入植物体所必需的。转化DNA区可转移到植物基因组中，通过插入外源核酸序列可使其大小增加但又不影响其转移能力。去除致肿瘤基因使其不再致病，然后可将改进的Ti质粒作为载体用于将本发明所述基因构建体转移到适当的植物细胞中，这种Ti质粒即称为“灭活Ti载体”。

所有可被土壤杆菌转化的植物细胞以及由转化细胞再生出的完整植株同样可按照本发明所述进行转化，以产生含有转移的外源核酸序列的完整转化植株。

用土壤杆菌转化植物细胞的方法多种多样，其中包括：

(1)土壤杆菌与培养并分离的原生质体共培养，

(2)土壤杆菌与细胞或组织共培养，

(3)用土壤杆菌转化种子、顶端组织或分生组织。

方法(1)需要一套正规的培养系统，该系统可培养原生质体及由原生质体再生出的植株。

方法(2)要求(a)植物细胞或组织可被土壤杆菌转化，以及(b)转化细胞或组织可诱导再生成完整植株。

方法(3)需要显微繁殖。

为在二元系统中实现感染，需要有两种质粒：含有T-DNA的质粒和vir质粒。在多种含有T-DNA的质粒中可任选一种使用，唯一的要求是要能够对这两种质粒进行各自独立地筛选。

植物细胞或植株被转化后，那些被Ti质粒转化因而整合所需DNA片段的植物细胞或植株可通过适当的表型标记而被筛选出来。这些表型标记包括，但并不局限于，抗生素抗性、除草剂抗性或目测。其它已为该领域所熟知的表型标记均可在本发明中使用。

本发明包括文中所述表达载体在转化任何植物，包括双子叶植物和单子叶植物，中的应用。双子叶植物的转化在上述文献中有所描述。单子叶植物的转化则可采用多种技术，包括电穿孔法(如Shimamoto等，Nature，338：274-276，1992)；发射枪法(如EuropeanPatent Application 270，356)；及土壤杆菌法(如Bytebier等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA，84：5345-5349，1987)。

将通过上述任何一种转化技术获得的转化植物细胞进行培养，可再生出具有所需转化表型的完整植株。这些再生技术需要在组织培养基中加入某些植物激素来进行调控，而这通常又需要将一种杀生物剂和/或除草剂标记与核苷酸序列共同引入。由培养的原生质体再生出植株的技术在Evans等，Handbook of Plant Cell Culture，pp.124-176，MacMillan Publishing Company，New York，1983，和Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，pp.21-73，CRC Press，Boca Raton，1985中有所描述。植物愈伤组织、外植体、器官或其某些部分也可进行再生。Klee等，Ann.Rev. Plant Phys.，38：467-486，1987对这些再生技术进行了全面地描述。

专家都将承认，当表达盒稳定合并到转基因植物体内并确认具有可操作性之后，可通过有性杂交将其引入到其它植物体内。在多种标准育种技术中可采用任意一种，这取决于要杂交的物种。

D.组合物

本发明还考虑一种用于将本发明所述核苷酸序列引入植物的组合物。该组合物可用来产生对感染植物的ssDNA病毒的抗性，为能够将ssDNA结合蛋白引入植物，该组合物中含有有效剂量的本发明所述核苷酸序列，其组成则取决于将蛋白引入植物所采用的方法。举例来说，若采用原生质体直接吸收DNA的方法，则都知道该组合物应是一种包含核酸以及可促进原生质体吸收的缓冲液的水性溶液。若通过土壤杆菌载体转化，则该组合物包含一种具有可表达ssDNA结合蛋白的核苷酸序列的土壤杆菌的悬浮液。

E.所用系统

本发明还考虑一种可用来实施本发明所述方法的系统，其优选形式为试剂盒。因此，该试剂盒可按照本发明所述方法中的实施办法用来将本发明所述核酸序列引入植物。

该试剂盒包含一种本发明所述组合物，其含量足以完成至少一次引入操作，该组合物中包含一种含有可表达本发明所述ssDNA结合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，其提供方式是置于一种包装材料或容器中。

通常该系统还包括已包装试剂的使用说明，其形式为标签或包装插页。

“使用说明”通常包括对系统中制剂容量或至少一种方法参数的明确表述，如组合物与要混合的植物的相对用量、植物进行接触的步骤、温度、缓冲液条件等用来实施本发明所述方法的参数。通常，该说明将详细描述把ssDNA结合蛋白引入植物从而抑制ssDNA病毒感染植物的症状的接触植物方法。

用于实施本发明所述方法的各类试剂、感染性制剂、病毒或噬菌体、核酸分子或表达载体均能够以溶液形式提供，作为流体分散物或基本干燥的粉末，如冻干形式。

“包装”一词是指玻璃、塑料(如聚乙烯，聚丙烯和聚碳酸酯)、纸张、金属薄片等能够将本发明所述多核苷酸、转化制剂、感染性病毒或噬菌体等试剂保持在固定范围内的固体基质或材料。因此，举例来说，用来容纳特定组合物的包装可以是瓶子、小药水瓶、塑料及塑料-金属薄片分层封套等类型的容器。

包装中可含有一单位或多单位剂量的本发明所述组合物，或可选择以散装形式提供该组合物。

本发明的系统可包含一种被分隔开的运载装置，以密封容纳一个或多个小药水瓶、试管等容器装置，每种容器装置中含有一种在该方法中使用的单独成分。例如，其中一种容器可含有感染植物用的组合物。试剂盒中的容器还可包含任何在实施本发明所述方法时使用的其它试剂。

根据此公开内容以及下文的实施例，其它的应用对该领域的专家而言是显而易见的。

实施例

以下提供的实例为说明性，而非限定性。

1.质粒构建体

文中所用病毒构建体是采用番茄曲叶病毒中A组及B组的感染性克隆(Padidam等，J.Gen.Virol.，76：25-35，1995)而产生。ToLCV的基因组结构和病毒构建体示意图如图1所示，其详细描述及每种质粒的构建方法概括于表1。由这些结构获得的部分头接尾二聚体被用来感染Nicotiana benthamiana植物和N.tabacum BY2原生质体。

表1

病毒DNA的描述及构建方法

构建体	描述及构建方法
		AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>	AV2和衣壳蛋白(CP)的双突变体，其中AV2的Met1密码子改为终止密码子，CP的Arg66密码子出现移码。该突变体早期被描述为Mite/R66fr(Padidam 等，<u>Virology</u>，224：390-404，1996)。
g5AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>	将细菌噬菌体M13mp18载体中编码基因5(g5)蛋白的264bp序列经PCR扩增(10个循环)，并克隆到Af1III(nt125)和Sty I(nt479)位点之间，导致AV2 ORF被替换并且5’CP ORF序列与g5重叠。
		g5<sup>-</sup>AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>	g5AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>构建体的阴性对照，其中g5的Met1密码子突变为终止密码。
CP<sup>-</sup>	通过末端补齐并连接到单一Sty I位点(nt 479)上产生的CP突变体，导致Arg66密码子的读码框移动并在第69位氨基酸(aa)后终止。该突变体早期被描述为R66fr(Padidam等，<u>Virology</u>，224：390-404，1996)。
		CP66：g5	将编码M13mp18载体中编码g5蛋白的264bp序列经PCR扩增(10个循环)，并克隆到Sty I(nt 836)位点之间，导致g5序列与CP的Arg66密码子融合。
				CP66：6G：g5	除了将编码6个甘氨酸的寡核苷酸序列插入CP的Arg66密码子和g5的Met1密码子之间外，其余与CP66：g5类似。
CP66：g5	阴性对照，其中CP66：g5的Arg66密码子读码框移动。
		CP66：Stag：6G：g5	除将15aa的Stag多肽抗原决定簇[KETAAAKFERQHMDS；(Kim等，J.S.，<u>Protein</u>)]

	Sci.，2：348-356，1993)]的编码序列插入CP的Arg66密码子之后以外，其余与CP66:6G:g5类似。插入Stag抗原决定簇是为能利用与FITC偶联的S-蛋白将原生质体中的CP66:6G:g5蛋白免疫定位。
		FCP66:6G:g5	将9 aa的Flag多肽抗原决定簇[MDYKDDDDK；(Hopp等，<u>J.Immunol.Methods.</u>，88：1-18，1986)]的编码序列加在CP66:6G:g5的Met1密码子前，并克隆到Afl III(nt 125)和Sph I(nt836)位点之间。该构建体中的AV2 ORF缺失。加入Flag抗原决定簇是为能利用抗Flag抗体将原生质体中的CP66:6G:g5蛋白免疫沉淀。
CP66:GUS	将编码β-葡糖苷酸酶(GUS)蛋白(Jefferson等，Plant Mol.Biol.Rep.，5：387-405，1987)的1806bp的DNA片段经PCR扩增(10个循环)，并克隆到A组的Sty I(nt479)和Hind III(nt1041)位点之间。Hind III位点建立在CP的Tyr251密码子处[位于终止密码子前15bp，(Padidam  等，<u>Virology</u>.224：390-404，1996)]。这可促进其它序列替代CP序列。
		GUSAV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>	将GUS基因上的EcoR I位点和A组DNA的HindIII位点的末端钝化，然后把编码GUS蛋白的由Nco I至EcoR I位点的1869bp DNA片段克隆到A组的Afl III(nt 125)和Hind III(nt 1041)位点之间。
GFPAV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>	将GFP基因上的BamH I位点和A组DNA的Sph I位点的末端钝化，然后把编码绿色荧光蛋白[GFP-S65C，M153T，V163A；(Reichel等，<u>Proc.</u><u>Natl.</u>Acad.Sci.USA.93：5888-5893，1996)]的由Nco I至BamH I位点的DNA片段克隆到A组的Afl III(nt 125)和Sph I(nt 836)位点之间。

BV1AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>	将编码ToLCV的B组中BV1的849bp的序列经PCR扩增(10个循环)，并克隆到A组的Afl III(nt125)和Hind III(nt 1041)位点之间。
		FBV1AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>	除了将9aa的Flag肽的编码序列加在BV1的Met1密码子之前以外，其余与BV1AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>类似。加入Flag抗原决定簇是为能利用抗Flag抗体将原生质体中的BV1蛋白免疫定位。
BC1AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>	将编码ToLCV的B组中BC1的882bp的序列经PCR扩增(10个循环)，并克隆到A组的Afl III(nt 125)和Hind III(nt 1041)位点之间。
		TBC1AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>	除了将11aa的T7[MASMTGGQQMG；(Krek等，<u>Cell</u>，78：161-172，1994)]抗原决定簇的编码序列加在BC1的Met1密码子之前以外，其余与BV1AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>类似。加入T7 tag抗原决定簇是为能利用抗T7tag抗体将原生质体中的BC1蛋白免疫定位。
CP66:6G:BC1	将编码6个甘氨酸和ToLCV的B组中BC1的900bp的序列经PCR扩增(10个循环)，并克隆到Sty I(nt 479)和Hind III(nt 1041)位点之间。
		BC1<sup>-</sup>	B组DNA，其中通过删除3’突出并重新连接在PstI位点(nt2075)上而造成BC1的移码突变。早期被描述为BC1M(Padidam等，<u>Virology</u>，224：390-404，1996)。

2.原生质体和植物的接种

按早期的描述(Padidam等，J.Gen.Virol.，76：25-35，1995；Padidam等，Virology，224：390-404，1996)用病毒DNA将N.benthamiana植株(在Magenta盒中培养的两周龄幼苗)和由BY2悬浮细胞分离的原生质体。接种后48小时收集培养物中的原生质体用于DNA分离、免疫沉淀反应以及蛋白免疫印迹分析。计算植株的症状，并在接种后22-25天时收集新形成的上叶用于DNA印迹分析。为研究表达绿色荧光蛋白[GFP；(Chalfie等，Science，263：802-805，1994)]的病毒在局部及系统内的运动，可将四周龄幼苗(10棵植株/构建体)的底叶进行接种。在荧光显微镜下观测接种叶片和上部未接种叶片中GFP发射的荧光，每隔三天观察一次，持续15天。在所以涉及植物的实验中均加入野生型B组DNA，它对系统扩散及症状发展至关重要。

3.Southern印迹

从原生质体(Mettler等，Plant Mol.Biol.Rep.，5：346-349，1987)和植物(Dellaporta等，Plant Mol.Biol.Rep.，1：19-21，1983)中分离的总DNA，在1％琼脂糖凝胶中电泳(无溴化乙啶)，然后按标准步骤(Sambrook等，M分子克隆：实验指南。冷泉港实验 室出版社。冷泉港，纽约。1989)转移到Hybond尼龙膜上(Amersham，Arlington Heights，IL)。杂交反应采用随机引物32P-标记的A组特异探针(Afl II-Pst I的900bp片段，包含有ORFs AC1、AC2和AC3)。病毒单链及双链DNA(超螺旋、线形、开环及二聚体形式)的含量测定是通过将Southern印迹结果置存储磷光筛板上曝光，并以PhosphorImager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)计数。ssDNA形式是利用其对S1和绿豆核酸酶的敏感性加以确定(Padidam等，Virology，224：390-404，1996)。在无溴化乙啶的情况下，超螺旋形式的病毒DNA跑在ssDNA的前面。

4.免疫沉淀及蛋白免疫印迹

在免疫沉淀反应中，由表达CP66:6G:g5蛋白并被Flag抗原决定簇标记的病毒A组分(FCP66:6G:g5，表1)感染的原生质体用手持polytron溶解在含有组合蛋白酶抑制剂(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的NP40缓冲液[50mM Tris-HCl(pH7.5)，1％NP40，含有0.15、0.25、0.5、0.75或1.0M NaCl]或RIPA缓冲液[50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，1％NP40，0.5％DOC，0.1％SDS]中。在4℃和15000×g条件下离心10min以去除细胞碎片。裂解物用共价连接在琼脂糖上的抗Flag单克隆M2抗体(Sigma，St.Louis，MO)进行免疫沉淀。免疫复合物用NP40或RIPA缓冲液冲洗4次，再用Tris缓冲盐溶液[50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl]冲洗一次。每种样品取一半置Laemmli样品缓冲液中加热，经SDS-PAGE(13％丙烯酰胺)分离，然后转移到PVDF膜上(Schleicher &Schuell，Keene，NH)。用抗Flag M2抗体和ECL-蛋白印迹试剂(Pierce，Rockford，IL)显现免疫沉淀的蛋白。该过程中收集的免疫复合物的剩余一半用来分离病毒DNA。直接用于蛋白免疫印迹的全细胞蛋白抽提物的制备是将原生质体沉淀与等体积的2×Laemmli样品缓冲液共同煮沸。

5.免疫荧光

经病毒构建体转染的原生质体置分室玻片(Nalge Nunc，Rochester，NY)上培养48小时，用溶于PBSEM[50mM磷酸盐(pH6.95)，150mM NaCl，5mM EGTA，5mM MgSO4]的3％多聚甲醛固定30分钟，再用100％甲醇于-20℃渗透10分钟。细胞用含有0.5％Tween20的PBSEM清洗两次，每次30分钟。用FITC的S蛋白(Novagen，Madison，WI)检测被Stag抗原决定簇标记的CP66:6G:g5蛋白(CP66:Stag:6G:g5，表1)。15个氨基酸的Stag长肽是插入在CP的Arg66后而构建成CP66:Stag:6G:g5蛋白。分别用1∶100稀释于PBS的抗Flag M2抗体(Sigma，St.Louis，MO)、抗T7 tag抗体(Novagen，Madison，WI)、抗CP抗血清(Padidam等，Virology，224：390-404，1996)和抗GUS抗血清(5’-3’，Boulder，CO)检测Flag抗原决定簇标记的BV1、T7抗原决定簇标记的BC1、CP以及B-葡糖苷酸酶(GUS)(表1)。在30℃下与一级抗体保温1小时后，细胞按前述方法洗涤，再与1∶100稀释的偶联FITC或罗丹明的IgGs(Pierce，Rockford，IL)保温。细胞用Fluoromount G(ElectronMicroscopy Sciences，Fort Washington，PA)封固，并用Nikon荧光显微镜或Olympus共焦显微镜(用于检测T7抗原决定簇标记的BC1蛋白)观察。

6.表达基因5蛋白或CP66:6G:g5蛋白的ToLCV使原生质体中 ssDNA的积累达到野生型水平

有关ToLCV的早期报道显示，病毒CP和AV2不是原生质体中病毒复制所必需的，但AV2是病毒在植物中高效移动所必需的(Padidam，Virology，224：390-404，1996)。衣壳蛋白并非ToLCV中系统移动及症状发展所必需的。但CP序列的突变导致N.bentamiana和番茄植株以及BY2原生质体中ssDNA积累的显著降低，而原生质体中dsDNA的积累却增加。AV2和CP均突变的病毒在植物中的表现与AV2突变体相似(即病毒很少移动且症状极轻微)，而在原生质体中的表现与CP突变体相似(即ssDNA积累降低而dsDNA积累增加)。

该质粒构建体可提供有关大肠杆菌噬菌体M13的基因5蛋白(g5p)(Salstrom等，J.Mol.Biol.，61：489-501，1971)对ToLCV复制的影响的信息。这些突变体在表1和图1中均有所描述。用g5p替代AV2及CP ORF的重叠5’部分，并分析它对原生质体中病毒复制的影响。在这些实验中，原生质体均按下文所述用野生型(wt)或其它突变体接种。由改进的A组分，即g5AV2^-CP^-，所导致的ssDNA积累与野生型病毒A组分感染所导致的水平相同(表2；图2，1和3道)。但dsDNA的积累水平却高出许多(比野生型的水平高3-6倍)，并与CP突变的病毒所导致的积累水平相似(表2；图2，2-4道)。经g5基因突变而阻止其翻译的病毒(g5^-AV2^-CP^-，表1)感染后的表现与A组分突变体AV2^-CP^-和CP^-病毒(表2；图2，4道)感染后的表现相似。由于AV2是病毒在植物中高效移动所必需的，因此构建了另一种构建体，其中g5融合于CP的Arg66位置，但又不影响AV2ORF(CP66:g5，表1)。CP66:g5病毒A组分亦导致ssDNA积累，但要比g5AV2^-CP^-DNA的水平低(表2；图2，6道)。为评价CP N末端的66个氨基酸(aa)是否干扰了g5p与DNA结合的能力，而在CP的Arg66和g5之间引入6个甘氨酸残基的衔接物，用于将CP结构域与g5p分离(CP66:6G:g5)。衔接物的加入恢复了CP66:6G:g5病毒A组分使ssDNA积累水平与g5AV2^-CP^-相近的能力(表2；图2，7道)。融合蛋白的g5部分不被翻译的对照构建体(CP66:g5^-)不能使ssDNA积累(表2；图2，8道)。只表达g5p的病毒A组分可聚积ssDNA，而表达CP66:6G:BC1(见下文)或CP66:6G:AV2的病毒A组分却不能聚积ssDNA，这些事实表明，表达CP66:6G:g5蛋白的病毒A组分的ssDNA聚集能力与CP N端的66个氨基酸无关。

表2

基因5蛋白对Nicotiana tabacum原生质体及N.benthamiana植株中番茄曲叶病毒的复制和运动的影响

原生质体接种

病毒	ssDNA<sup>a</sup>	dsDNA<sup>a</sup>
			野生型<sup>c</sup>AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>g5AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>g5<sup>-</sup>AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>CP66:g5CP66:6G:g5CP66:g5<sup>-</sup>	100＜1(0-0.03)102(79-133)7(5-12)5(2-7)17(8-27)118(34-234)9(3-14)	100506(427-584)409(349-573)384(210-779)241(148-369)442(345-576)517(133-784)424(179-789)

植物接种

病毒	接种植<u>物数量</u>	症状<u>类型</u>	ssDNA<sup>b</sup>	dsDNA<sup>b</sup>
					野生型<sup>c</sup>AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>g5AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>g5<sup>-</sup>AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>CP66:g5CP66:6G:g5CP66:g5<sup>-</sup>	2010202020203020	严重很轻<sup>d</sup>很轻<sup>d</sup>很轻<sup>d</sup>严重<sup>e</sup>轻很轻<sup>d</sup>严重<sup>e</sup>	1000.3(0.05-0.5)0.6(0.1-2.7)0.1(0.0-0.2)4.3(2.6-6.5)2.2(0.8-4.2)0.9(0.4-1.7)4.0(1.8-6.1)	10011(9.6-17)15.2(6.2-49.2)5.7(0.0-11.4)102(65-139)30.6(15.3-55.1)10.9(5.5-14.7)139.7(56.0-197.7)

a该值代表每种突变体的5个独立的转染原生质体中单链(ss)和双链(ds)A组DNA的平均数(范围)。原生质体(约10⁶)用2μg的A组DNA和40μg鲱鱼精DNA转染。用Molecular Dynamics的“PhosphorImager”对Southern印迹结果进行病毒DNA定量。

b该值为每种病毒构建体接种的12个植株中的病毒DNA平均数(范围)，AV2^-CP^-除外，其数值为4个植株的平均数。每个植株用0.5μg的A组DNA和0.5μg的野生型B组DNA接种，其中野生型B组DNA是病毒移动和症状发展所必需的。

c用野生型病毒DNA接种的原生质体和植物内的病毒DNA量设为100。

d很多植物未显示出症状。

e严重症状是指类似于用野生型病毒接种的植物的症状，但无强烈的萎黄症状。

双粒病毒可在核内复制(Accotto等，Virology，195：257-259，1993；Nagar等，Plant Cell，7：705-719，1995)，因此，可能为导致ssDNA聚积，CP66:6G:g5和g5蛋白必定存在于核内。为能够将原生质体中的CP66:6G:g5融合蛋白免疫定位，而在CP的Arg66和甘氨酸衔接物之间插入Stag抗原决定簇(CP66:Stag:6G:g5，表1)。感染48小时后将原生质体固定，并用偶联FITC的S蛋白进行反应。CP66:Stag:6G:g5蛋白和wt CP(用抗CP抗血清检测)定位于细胞核(图3A和3B)。当GUS蛋白与CP N端的66个氨基酸的融合蛋白(CP66:GUS)产生时，GUS(用抗GUS抗血清检测)亦定位于细胞核(图3C)。这提示CP N端的66个氨基酸含有核定位信号。

将g5序列融合于GUS编码序列N端所得的结果显示，g5p包含一种核定位信号。g5:GUS融合蛋白(在g5:GUSAV2^-CP^-病毒A组分中表达，表1)和未融合的GUS蛋白(在GUSAV2^-CP^-病毒A组分中表达，表1)仍存在于细胞质(图3D和3E)，这表明g5p没有核定位信号。g5p极可能是以一种消极方式进入核内，因为其大小(9.7KDa)要小于核被膜的渗透屏障(Dingwall等，Ann.Rev.Cell.Biol.，2：367-390，1986)。

7.表达CP66:6G:g5蛋白的ToLCV在植物中的移动减少

用选定的病毒构建体接种N.benthamiana植株，以确定g5p对病毒扩散的影响：在这些研究中，B组DNA与A组DNA共同接种到N.benthamiana幼苗中。与预期的一致，用B组分与A组突变体AV2^-CP^-、g5AV2^-CP^-或g5^-AV2^-CP^-接种的植物显示出极轻的症状或者不显示出症状，并且所有接种植物中的病毒DNA聚积水平都很低(表2)。此前报导的一种不产生CP但可产生AV2(CP^-)的ToLCV突变体(Padidam等，Virology，224：390-404，1996)可在系统感染后发展出严重的患病症状及野生型水平的dsDNA(表2)。令人惊奇的是，用表达CP66:6G:g5蛋白的病毒接种的植株显示出很轻微的症状或者不显示出症状，尽管该病毒中包含完整的AV2基因(表2)。这些植株积累病毒DNA的水平很低，与AV2^-CP^-病毒接种的植株相似(表2)。用表达CP66:g5蛋白的病毒(其在原生质体中积累的ssDNA水平要低于CP66:6G:g5病毒)接种的植株显示出轻微的症状及中等水平的dsDNA聚集。表达g5p的病毒的移动被减弱，这可能是由于g5p的毒性作用。用野生型病毒或表达g5p的病毒接种后，未检测到原生质体的生命力或植物叶片的表观有任何差别，这提示g5p可能具有毒性。

将绿色荧光蛋白(GFP)作为病毒运动的可见标记，以此来检测表达CP66:6G:g5蛋白的ToLCV的细胞至细胞移动及长距离移动。植物用表达GFP但不表达AV2和CP的A组DNA(GFPAV2^-CP^-)单独接种，或者与野生型、CP66:6G:g5、或CP66:g5^-构建体的A组DNA共接种。预计GFPAV2^-CP^-病毒不编码AV2而不能在植物中有效移动；而当补充另一种编码AV2的病毒后即可有效移动。在接种后3天的植株中不能检测到GFP，但在GFPAV2^-CP^-+野生型A组分接种、或GFPAV2^-CP^-+CP66:g5^-病毒接种的大多数植物及第6天的顶叶中均存在GFP(图3H、3I；仅显示用GFPAV2^-CP^-+CP66:g5^-病毒接种的植株的数据)。表达GFP的病毒不断传播到这些植物的顶叶及新生叶片中(图3J、3K)。GFP可在叶脉、叶肉和表皮细胞中观察到，并且在GFPAV2^-CP^-+CP66:g5^-接种的植株叶片的大面积区域中存在。相反，在GFPAV2^-CP^-或GFPAV2^-CP^-+CP66:6G:g5病毒接种的大多数植物中，GFP仅限于接种叶片的小点区域(图3L、3M；仅显示用GFPAV2^-CP^-+CP66:6G:g5病毒接种的植株的数据)。在这些植株的某些临近叶片和新生叶片上也显示出GFP染色，但大部分都局限于叶脉(图3N、3O、3P)。这些结果提示用g5p取代CP的表达降低了病毒的系统移动效率。

8.CP66:6G:g5蛋白与病毒DNA的体内结合

用表达g5p或CP66:6G:g5蛋白的病毒A组分接种的原生质体中可聚集病毒ssDNA，这提示g5p能够与ssDNA结合。证实过程是用表达Flag抗原决定簇标记的CP66:6G:g5蛋白的病毒A组分(FCP66:6G:g5，表1)接种原生质体，并且用抗Flag抗体将Flag抗原决定簇标记的CP66:6G:g5蛋白免疫沉淀，再通过Southern印迹确定与CP66:6G:g5蛋白共免疫沉淀的病毒DNA的特性。在不同的盐浓度条件下(含有0.15-1.0M NaCl的1％NP40缓冲液)以及存在0.1％SDS、0.5％DOC和1％NP40去污剂(RIPA缓冲液)的条件下进行免疫沉淀，以测定结合的亲合力。Flag抗原决定簇标记的CP66:6G:g5蛋白在所有测试的缓冲液条件下均被免疫沉淀；免疫沉淀的蛋白量随盐浓度的增加而增加(图4A)。当盐浓度小于0.5M时，共免疫沉淀的ssDNA的量逐渐增加，而在更高的盐浓度下又逐渐减少(图4B)，这提示g5p-ssDNA复合物在含有1M盐浓度的缓冲液中不稳定。在RIPA缓冲液中进行免疫沉淀同样会导致DNA的沉淀量减少(图4B)。这些结果表明g5p与病毒ssDNA结合，而1M的盐(NP40缓冲液中)使g5p与病毒DNA解离。

9.BV1和BC1移动蛋白在ToLCV扩散中的作用

综合上述结果可表明，CP66:6G:g5蛋白定位于细胞核，并且能够在体内与ToLCV病毒DNA稳定结合，而表达CP66:6G:g5蛋白的ToLCV不能在植物体内有效移动。表达CP66:6G:g5蛋白的ToLCV不能有效移动可能是由于g5p可干扰ToLCV的BV1或BC1移动蛋白的功能。南瓜曲叶病毒(SLCV)中的BV1(在SLCV中称为BR1)蛋白能够在体外与ssDNA结合(Pascal等，Plant Cell，6：995-1006，1994)，但BC1(在SLCV中称为BL1)蛋白不能。SLCV的BV1和BC1蛋白以一种协同方式相互作用；在原生质体中，当不存在BC1时，BV1定位于细胞核，但若存在BC1时，BV1则定位于细胞外围(Sanderfoot等，Plant Physiol.，110：23-33，1996；Sanderfoot等，Plant Cell，7：1185-1194，1995)。BV1和BC1都是ToLCV的系统扩散及症状发展所必需的(Padidam等，Virology，224：390-404，1996)。为能够确定ToLCV的BV1和BC1是否具有与SLCV的BV1和BC1相似的功能，而将ToLCV的BV1和BC1免疫定位，并检测其对CP突变体中病毒ssDNA聚积的互补能力。在这些实验中，BV1和BC1基因分别与Flag抗原决定簇标记和T7抗原决定簇标记的编码序列相融合，并插入到A组分的AV2和CP的位置(FBV1AV2^-CP^-和TBC1AV2^-CP^-，表1)。在用FBVAV2^-CP^-构建体接种的原生质体中，BV1蛋白聚积于细胞核内(用抗Flag抗体检测，图3F)，而用TBC1AV2^-CP^-构建体接种的原生质体中，BC1蛋白定位于细胞外围(用抗T7标记的抗体检测，图3G)。BV1蛋白替代AV2和CP蛋白的表达(BV1AV2^-CP^-)也导致A组分ssDNA的聚积(表3；图2，9道)。利用与图4所述类似的免疫沉淀反应检测用FBV1AV2^-CP^-DNA接种的原生质体中经Flag抗原决定簇标记的BV1蛋白对病毒DNA的亲合力。BV1蛋白与病毒ssDNA的亲合力类似于CP66:6G:g5蛋白与病毒DNA的亲合力。与表达BV1的A组DNA所得的结果相比，用BC1代替AV2和CP表达的A组DNA(BC1AV2^-CP^-)不能使ssDNA聚积(表3；图2，10道)。由于BC1蛋白定位于细胞外围，因此将BC1与CP N端的66个氨基酸融合(CP66:6G:BC1)，以将其引导入细胞核。表达CP66:6G:BC1蛋白的病毒A组DNA同样不能使ssDNA聚集(表3；图2，11道)，这表明BC1移动蛋白可能不与病毒ssDNA结合，或者其结合亲合力的强度不足以导致ssDNA聚积。这些结果说明，当BC1不存在时，BV1定位于细胞核，并且BV1能够在体内与病毒ssDNA结合。

表3

BV1和BC1移动蛋白对原生质体内番茄曲叶病毒ssDNA聚积的补偿作用

A组分	B组分	SsDNA	dsDNA
				野生型BV1AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>FB1AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>BC1AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>CP66:6G:BC1野生型野生型AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>AV2<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>CP<sup>-</sup>	无无无无无野生型BC1<sup>-</sup>野生型BC1<sup>-</sup>野生型BC1<sup>-</sup>	10086(50-121)33(25-54)2(1-3)5(1-10)57(37-78)48(38-58)2.4(1.2-3.6)2.7(1.5-4.0)2.5(1.6-3.3)2.9(2.1-3.7)	100230(119-195)47(40-58)224(162-288)214(180-267)61(42-81)50(40-60)131(76-187)135(82-188)100(78-121)106(98-113)

a原生质体的转染采用2μg的A组DNA和10μg的B组DNA或不使用B组DNA。用“PhoshorImager”在Southern印迹结果上对病毒单链(ss)DNA和双链(ds)DNA加以定量，这些数值代表2-5个独立转染植株中病毒DNA的平均数(范围)。

在用含有CP66:6G:g5基因的ToLCV A组分+野生型B组分接种的植物体中，CP66:6G:g5蛋白的表达由相对较强的CP启动子控制。如果BV1在其自身启动子的调控下表达的量相对较低，那么由A组分产生的CP66:6G:g5蛋白可能会与BV1蛋白(由B组分表达)竞争结合DNA。我们进行了一项实验，以确定BV1在B组分自身启动子的调控下表达时是否会导致ssDNA聚积。请注意，当BV1替代CP在A组分中表达时可导致ssDNA聚积(表3)。但是由带有CP突变的A组DNA(CP^-)+野生型B组DNA(即同时表达BV1和BC1)或带有BC1突变的B组DNA(BC1^-；即只表达BV1)接种的原生质体中只有极少的病毒ssDNA聚集(表3；图2，12-15道)。当BV1由B组分表达时不能导致ssDNA聚积，这似乎是由于产生的BV1蛋白水平较低；通过免疫定位及Western印迹发现，在由A组DNA和表达经Flag抗原决定簇标记的BV1的B组DNA共接种的原生质体中检测不到BV1蛋白。这些结果说明，驱动BV1表达的B组启动子不象A组分中表达该基因的CP启动子那么强。

10.实例1-9的讨论

检测替代CP而被表达的一种非特异性ssDNA结合蛋白(g5)对ssDNA聚积的影响，以确定其是否可作为双粒病毒中CP的替代物。选择大肠杆菌噬菌体M13的g5p是由于其尺寸较小(9.7KDa)，并且不具有任何DNA复制酶功能。对g5p在M13及其它丝状噬菌体复制中的作用已做过深入的研究(Rasched等，Microbiol.Rev.，50：401-427，1986)，其结构也已确定(Skinner等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，91：2071-2075，1994)。基因5蛋白能够以一种非序列依赖性方式与新形成的病毒ssDNA协同性紧密结合，并保护核酸不被大肠杆菌中的核酸酶降解。

g5p能够在植物细胞中与ToLCV的ssDNA结合，并且表达g5p或表达与CP蛋白N端的66个氨基酸融合的g5p的ToLCV可使ssDNA聚集达到野生型水平。g5p与病毒ssDNA的体内结合类似于g5p与M13ssDNA的体外结合(Anderson等，Biochemistry，14：907-917，1975)。尽管g5p可通过增加ToLCV中的ssDNA聚积来补偿CP的缺失，但是它不能使dsDNA的量降低至野生型水平。BV1移动蛋白(当替代CP表达时)的表现与g5p相似，不能使dsDNA下行调节至野生型水平。如果CP是通过减少用于转化为dsDNA的ssDNA的量来调节ssDNA和dsDNA，那么g5p或BV1的表达应该能够形成正常的dsDNA水平。但事实并非如此，这说明CP可能在调控病毒复制方面具有直接作用，其方式可能是通过抑制负链的合成或通过调节基因的表达。苜蓿花叶病毒(ALMV)是一种具有ssRNA(+)基因组的病毒，已证明该病毒的CP在调节正链和负链RNA的合成方面具有直接作用。并发现ALMV CP与病毒RNA聚合酶紧密结合，并抑制负链合成而促进正链合成。最近在SLCV方面的研究结果提示，CP能够发出信号使病毒的dsDNA复制转换为ssDNA复制，或能够隔绝复制池中的病毒ssDNA而不使其完全壳化。要直接确定CP在复制中的作用需要纯化双粒病毒的复制复合物。

被编码CP:6G:g5蛋白的病毒感染的植株仅显示出非常轻微的症状，并且病毒DNA的聚积水平很低，而被感染的原生质体的病毒DNA聚积水平却很高。这是由于g5p可通过与病毒ssDNA结合而干扰BV1移动蛋白的功能，由此影响病毒的移动。在感染的原生质体中，ToLCV的BV1定位于细胞核，并与病毒ssDNA体内结合；而BC1定位于细胞外围，并且不能补偿病毒ssDNA的聚积，即使将其与CP的核定位信号融合而被引入细胞核内也同样如此。最近对BV1和BC1在SLCV移动中的作用的研究显示，BV1定位于细胞核，能够在体外与ssDNA结合，并且行使细胞核穿梭蛋白的功能。SLCV的BC1在原生质体中定位于细胞外围，并且在系统感染的南瓜幼苗的发育韧皮部细胞中能够与内质网来源的微管相结合。根据这些结果可提出一种SLCV模型，在该模型中，含有BC1的微管可作为BV1及其结合的病毒ssDNA从一个细胞至另一个细胞的运输管道(Ward，等J.Virol.，71：3726-33，1997)。对TGMV的研究显示，BV1能够在体内与病毒ssDNA相互作用，并且BV1和BC1在细胞至细胞移动以及系统移动中具有直接而又关键的作用(Jeffrey等，Virology.，223：208-218，1996)。ToLCV在细胞至细胞的移动中采用了相似的策略。产生CP66:6G:g5蛋白的ToLCV的运动能力较差，这是由于BV1与病毒DNA的结合减少。应当注意的是，当BV1在B组分的自身启动子调控下表达时不能引起缺乏CP的A组分的ssDNA聚积。在用产生CP66:6G:g5的A组分+产生GFP的A组分共接种的植物中，GFP染色大多局限在很小的区域范围内，在接种的叶片和系统感染的叶片中均是如此，这表明与特异干扰细胞至细胞扩散或长距离移动相比，病毒移动整体效率要降低得更多。

g5p与病毒ssDNA的结合会干扰ToLCV的运动，表明在该病毒中，ssDNA是进行细胞至细胞的运动。这些结果还提示，g5p在转基因植物中表达可成为控制双粒病毒的一种新方法，并且这种抗性可有效抵抗所有的双粒病毒。

总而言之，为确定基因5蛋白(g5p)这种来自大肠杆菌噬菌体M13的ssDNA结合蛋白是否能够使ssDNA聚积恢复，而对缺乏CP基因的ToLCV加以修饰，使其表达g5p或与CP N端的66个氨基酸融合的g5p(CP66:6G:g5)。修饰后的病毒可使ssDNA聚集达到野生型水平，同时产生高水平的dsDNA聚积。ssDNA聚积是由于g5p能够与病毒ssDNA稳定结合。在修饰病毒感染期间的dsDNA高水平聚集表明，CP在病毒DNA复制方面具有直接作用。产生CP66:6G:g5蛋白的ToLCV不能在Nicotiana benthamiana植株中有效扩散，并且接种的植株仅产生非常轻微的症状。在感染的原生质体中，CP66:6G:g5蛋白被免疫定位于细胞核；这提示该融合蛋白可干扰BV1移动蛋白的功能，从而可防止感染的扩散。

上述详细说明书，包括特定实施方案和实施例，是对本发明的说明，而不能作为限制。另外还有多种可实现目的而又未脱离本发明的精神实质和范围的变化及修正型式。

序列表

SEQ ID NO 1野生型M13基因5的氨基酸序列(87个氨基酸)：

MIKVEIKPSQ AQFTTRSGVS RQGKPYSLNE QLCYVDLGNE YPVLVKITLD

EGQPAYAPGL YTVHLSSFKV GQFGSLMIDR LRLVPAK

SEQ ID NO 2野生型M13基因5的核酸序列

5′ATGATTAAAG TTGAAATTAA ACCATCTCAA GCCCAATTTA CTACTCGTTC

TGGTGTTTCT CGTCAGGGCA AGCCTTATTC ACTGAATGAG CAGCTTTGTT

ACGTTGATTT GGGTAATGAA TATCCGGTTC TTGTCAAGAT TACTCTTGAT

GAAGGTCAGC CAGCCTATGC GCCTGGTCTG TACACCGTTC ATCTGTCCTC

TTTCAAAGTT GGTCAGTTCG GTTCCCTTAT GATTGACCGT CTGCGCCTCG

TTCCGGCTAA GTAA 3′

SEQ ID NO 3野生型M13基因5的核酸序列

5′ATGATCAAGG TGGAGATCAA GCCCAGCCAG GCCCAGTTCA CCACCCGCAG

CGGCGTGAGC CGCCAGGGCA AGCCCTACAG CCTGAACGAG CAGCTGTGCT

ACGTGGACCT GGGCAACGAG TACCCCGTGC TGGTGAAGAT CACCCTGGAC

GAGGGCCAGC CCGCCTACGC CCCCGGCCTG TACACCGTGC ACCTGAGCAG

CTTCAAGGTC GGCCAGTTCG GCAGCCTGAT GATCGACCGC CTGCGCCTGG

TGCCCGCCAA GTAA 3′

SEQ ID NO 4

ToLCV新德里    成分A    核酸序列

GenBank登记号：U15015

5′

TAATATTACCGAATGGCCGCGCAAATTTTTAGGTGGGCCCTCAACCAATGAAATTCACGCTACA

TGGCCTATTTAGTGCGTGGGGATCAATAAATAGACTTGCTCACCAAGTTTGGATCCACAAACAT

GTGGGATCCATTATTGCACGAATTTCCCGAAAGCGTTCATGGTCTAAGGTGCATGCTAGCTGTA

AAATATCTCCAAGAGATAGAAAAGAACTATTCACCAGACACAGTCGGCTACGATCTTATTCGAG

ATCTCATTCTTGTTCTCCGAGCAAAGAACTATGGCGAAGCGACCAGCAGATATCATCATTTCAA

CGCCCGCATCGAAGGTACGCCGACGTCTCAACTTCGACAGCCCCTATGGAGCTCGTGCAGTTGT

CCCCATTGCCCGCGTCACCAAAGCAAAGGCCTGGACCAACAGGCCGATGAACAGAAAACCCAGA

ATGTACAGAATGTATAGAAGTCCCGACGTGCCAAGGGGCTGTGAAGGCCCTTGTAAAGTGCAGT

CCTTTGAATCTAGGCACGATGTCTCTCATATTGGCAAAGTCATGTGTGTTAGTGATGTTACCCG

AGGAACTGGACTCACACATCGCGTAGGGAAGCGATTCTGTGTGAAATCTGTCTATGTGCTGGGA

AAGATATGGATGGATGAAAACATCAAGACAAAAAACCATACTAACAGTGTCATGTTTTTTCTGG

TTCGTGACCGTCGTCCTACAGGATCTCCCCAGGATTTCGGGGAAGTGTTTAATATGTTTGACAA

TGAACCGAGCACAGCAACGGTGAAGAACATGCATCGTGATCGTTATCAAGTCTTACGGAAGTGG

CATGCGACTGTGACGGGAGGAACATATGCATCTAAGGAGCAAGCATTAGTTAGGAAGTTTGTTA

GGGTTAATAATTATGTTGTTTATAATCAACAAGAGGCCGGCAAGTATGAGAATCATACTGAAAA

CGCATTAATGTTGTATATGGCCTGTACTCACGCATCAAATCCTGTATATGCTACTTTGAAAATC

CGGATCTACTTTTATGATTCGGCCACAAATTAATAAATATCCAGTTTTATATCATACGAAGTCC

ATACATCAATTGTTTGCTCCAATACATTATCCAATACATGATAAACTGCTCTTATTACATTATA

AATTCCTATGACACCTAACATATCCAGGTACTTAAGGACCTGGGTTTTGAAGACTCTCAAGAAA

ATCCCAATCTGAGGGCGTAAGCCCGTCCAGATTTTGAAAGTTAGAAAACACTTGTGAAGTCCCA

GGGCTTTCCGCAGGTTGTGGTTGAACTGTATTTGAATCTTGATTATGTCGTGCTGTGTTAGGAA

GGGCCTGCTGTCGTGTTTCAAAATTTTGAAATACAGGGGATTTCGAATTTCCCAGGTATATACG

CCACTCTCTGCTCGATCCGCAGTGATGTATTCCCCTGTGCGTGAATCCGTGATCATGGCAGTTG

ATCGATATGTAATACGAACAACCACACGGTAGATCAACTCGCCTCCTGCGAATGCTCTTCTTCT

TCTTCTGGGAGAGCGATGTTTTCGCGACCGGAATAGAGTGGTTCTTCGAGTGTGATGAAGACTG

CATTCTTGATTGCCCACTGCTTCAGTGCTGCATTTTTTTCTTCATCCAGATATTCCTTATAGCT

GCTGTTTGGACCTTTATTGCACAGGAAGATAGTGGGAATTCCACCTTTAATCATGACCGGCTTT

CCGTACTTCGTGTTGCTTTGGCAGTCACGCTGGGCCCCCATGAATTCTTTAAAGTGCTTTAGAT

AGTGGGGATCAACGTCATCAATGACGTTGTACCAGGCATCATTGCTATAGACCTTTGGGCTCAG

ATCAAGATGTCCACACAAGTAATTGTGTGGTCCTAAGCACCGAGCCCACATCGTTTTGCCCGTC

CTACTATCCCCCTCTATGACTATGCTTATGGGCCTAAAAGGCCGCGCAGCGGCACACACAACAT

TAGACGAGACCCAATCGACGAGGTCTGCCGGAACTCTGTCGAAGGATGAAATTGAAAATGGAGA

AACATAAACCTCGGAAGGAGGTTGAAAAATACGATCTAAATTGGTATTTAAATTGTGAAACTGC

AGAACGTAATCTTTTGGGGCTAATTCCTTTAATACTCTCAAAGCATCGTCTTTATTTCCCGTGT

TAATCGCCTGGGCATATGCATCGTTCGCCGTTTGTTGACCACCACGGGCAGATCGTCCATCGAT

CTGGAAAACACCCCATTCTAGAACGTCTCCATCTTTGGCGATGTAGTTTTTGACGTCCGACGCT

GATTTAGCTCCCTGAATGTTCGGATGGAAATGTGCTGACCGACTTGGGGAAACCAAGTCGAAGA

ATCTGTTATTTTTGCACTGGAATTTCCCTTCGAATTGGATGAGAACATGGATATGCGGAGACCC

ATCTTCGTGAAGCTCTCTACAGATCTTGATGAATTTCTTCTTCGTCGGGGTTTCTAGGGTTTGC

AATTGGGAGAGTGCCTCTTCTTTAGTTAGAGAGCACTTTGGATATGTGAGGAAATAGTTTTTGG

CATTTACTCTAAAACGACGTGGCGAAGCCATAAAACTTGTCGTTTTGATTCGGCGTCCCTCAAC

TTATCTATATGATTGGTGTCTGGAGTCCTATATATAGGTAAGACACCATATGGCATTATTGTAA

TTTTGAAAAGAAAATTACTTTAATTCAAATTCCCTAAAGCGGCCATTCGTA 3′

SEQ ID NO 5

ToLCV新德里    组分B    核酸序列

GenBank登记号：U15016

5′

TAATATTACCGAAAGGCCGCGAAAATTTTGACCCCCTTATCCTGACCGTTGATGCGTAATCATT

GCACGCCGTTATCCGTCCGATTTGCAACACGTGTATCCCACTAACAGACTTTATGGAAAATAAA

TGTGTGAATGCGTCTCTTTTCTGCATATGTGTTCCCCATATGTCTTTATCGTACTTCTATTATA

TGCGTCTGTGGTCCCCCCGCATTATATAAAGTCTTTCACATAAATCAAATTGCCTTCTTTGCTA

TGTATATTTTGATCGGTCGAGATCAAAATTAATATGTTGCGAACATATCCGTCGTTCGATCTTA

TGAGATATGCTTTAATTCAAACAATACTTGTTTGAATTTTATGCACGCTGTACAATACTAGTTT

ATAAAACTGCTACATATGTGACATTACATGGTGTTTCCGTTGCCACACATTTCCTATCCCAGCC

AAATGGCGTTTCCCTCTCCTTATTCCACGCCTCGTCGTTCGGGTTACCCATTCAACAGAACATA

CAACGGAAACAAGAGTTTCCGCTTGTGGAAGACCCGGAAGTATCAAAACTGGAAGCGCTATCGC

AGTACCCATTCCATAGCACGTTCTCCAACCGAACTGTTTGGCGATCCAATCTCCAAACAATATA

CGCGTAAGGAAATCTGTGAAACACAGGAGGGTTCGGAGTATCTGCTGCACAACAATCGTTACAT

GACGTCATATGTCACGTATCCATCAAAAACAAGAACTGGAACGGACAACCGCGTTCGTTCCTAT

ATCAAGCTAAAGAGTCTGAACATATCTGGGACATTTGCTGTTCGTAAATCTGACTTGATGACCG

AAGTGGTGCAAACAAATGGTCTATACGGAGTGATGTCTATAGTTGTAGTCCGCGATAAATCTCC

AAAGATTTATTCTGCGACCCAACCTTTAATACCGTTTGTTGAGCTATTTGGATCTGTTAATGCT

TGCAGGGGCAGTCTGAAAGTGGCAGAACGCCACCATGAACGCTTCGTACTTCTGAATCAAACAT

CCATCGTTGTCAATACCCCACATTCCAACGCTATCAAGAAATTCTGCATTCGTAACTGCATCCC

AAGAACTTACACAACCTGGGTAACGTTCAAGGACGAAGAAGAAGATAGCTGTACTGGACGATAT

TCTAACACCCTCCGAAATGCAATTATTTTATATTATGTATGGTTAAGCGATGTATCCTCACAAG

TCGATCTTTACAGCAATGTAATTCTTAATTACATTGGATAATATATAAAAATGCAGAAGAAACA

TCTTATTTTTTGAATAAATTTGGCTTAAAATTTATTACACGCTCTTCGATACTGGAGCATTTAC

ATTGGATTTTATACATTGCTCTACAGTCTTCCGTAATTATATCTGCAATCTCTTCCCTTGTAAT

ACTCCCCGCCTGTGATGCCGATGGACCTGGATCAATTGCCGAATCATCCAATCCGCTCAGATTT

TTATATGGTCTGCTGGTGACGGACGAAAGTCCGATCTCCGATCTGCTTGCCCATGATTCGTTCG

GACCTATAGCCAGATAGGGTACCCGTAACGATCTTGAACTATGTCCCATTAACCTTGAACCATC

TACAAGACGCCTTGTTTGTGGTTTGGAACCCACAGACCAGAAATCAATGTCGTTCATAGTGAAT

TCCTTGGTCTGTATTTCTATCTTTGGTGGTCGGAATTCGACGTCAGTCGAATGTTTAGCCGACG

ACAGCTTCAATTTCCCTAGCATCTTACAGAAGTGTACCCCATTCACGACGTTTGTGTTCTCCAC

TCGGTATTCAACTCTCCAAGGATTCTTATCCTTGAGAGAGAAGAATGAGGAAGAGTAGTAGTGC

AGGTTGCAATTGCATTTGATCGGAATTGTGAATTCCGCTTGTTTTGTGTCCCCCTCCGTCAATC

TCATGTCGTGTATCTCTACCACGACATGACCAACAGCATTAATTGGAACCTGACTGCGATATTC

CAGAACTACGTGATCTATTTTCATGCATCTATTCCTCAACTGGCTAAGCTTCTGCTCGAACATG

GATGGAAATGACAAGGTAACTTCTGCAGCATCGTTTGTGAGAGCGTACTCAACGCGCTCAGATT

GAATATACCCACCTACTCCCATACCCATACCATCATTTCCTATTGACATATTGGCCGCGCAGCG

CAAAACCCACTGAAACACAGAAGGACAGACTACGATCAAAGAAACCCCGACGAAGAAGAAACCC

TAGCAAACAACGAAGTTGTTTTGCAAAGAACGGATGTAGATGGTTTTATAATGCTATTGCATGT

CATGTCTATGTCATACCAATTACCCTAAAATGAACGGCACATATTTTTCTACGAAAAAGGAGTT

GTGCATGCATATGGGATGTCTGTTTATTTACGGTATAAATTGGAAGCCCAATTTATTTAATTGG

GCTGAAGTTTAAATTCAGAAGAAGTCCATGAAATTGGCCCAGCATCCAGGTCCATTGTTAAAAT

GACATCGTTTGTGTGTTATTGTGTGTATAGAAGTTAGAGAGAAGCAGCAGTTTCTCTCTCTAGA

ACTCATCGGGTGTCTCTCAACTTATCTATATAATTGGTGTCTGGAGTCCTATATATAGGTAAGA

CACCATATGGCATTATTGTAATTGTGAAAAGAAAATTACTTTAATTCAAATTCCCTATAGCGGC

CTTTCGTA 3′

SEQ ID NO6 pBluescript SK质粒表达载体

5′

CACCTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGAC

CGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACG

TTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTT

TACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTG

ATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAA

ACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTT

CGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATT

AACGCTTACAATTTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGG

CCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC

GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTA

TAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAAT

TCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTT

GTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG

AAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGG

GGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGG

GAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTAT

TGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCG

GTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGA

ACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTT

CCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAAC

CCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTC

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GGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCA

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AATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCC

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GAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCG

CAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGA

GTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGT

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ATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAG

TTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCAT

CCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCG

GCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTA

AAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGA

GATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAG

CGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGG

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TCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATT

TCCCCGAAAAGTGC 3′

Claims (41)

1.一种使植物产生双粒病毒科的单链DNA病毒抗性的方法，该方法包括将丝杆噬菌体科病毒的一种单链DNA结合蛋白引入所述植物。

2.权利要求1的方法，其中所述丝杆噬菌体科病毒选自丝杆病毒属和细杆病毒属。

3.权利要求2的方法，其中所述丝杆病毒属病毒选自大肠杆菌噬菌体、肠杆菌噬菌体、假单胞菌噬菌体、弧菌噬菌体和黄单胞菌噬菌体。

4.权利要求3的方法，其中所述大肠杆菌噬菌体病毒种选自AE2、dA、Ec9、f1、fd、HR、M13、ZG/2和ZJ/2大肠杆菌噬菌体。

5.权利要求1的方法，其中所述单链DNA结合蛋白为一种基因5蛋白。

6.权利要求1的方法，其中所述单链DNA结合蛋白为大肠杆菌噬菌体M13基因5蛋白。

7.权利要求6的方法，其中所述大肠杆菌噬菌体M13基因5蛋白具有SEQ ID NO 1的氨基酸残基序列。

8.权利要求1的方法，其中所述的引入包括制备一种含有表达所述单链DNA结合蛋白的基因的转基因植物。

9.权利要求8的方法，其中所述基因含有SEQ ID NOs 2或3所示的一段核苷酸序列。

10.权利要求1的方法，其中所述的引入包括将所述植物与一种含有可表达所述单链DNA结合蛋白的表达载体的组合物相接触。

11.权利要求10的方法，其中所述表达载体含有SEQ ID NOs 2或3所示的一段核苷酸序列。

12.权利要求10的方法，其中所述的接触包括用生物枪将基因转入原生质体或由原生质体直接吸收DNA。

13.权利要求10的方法，其中所述的接触包括用一种携带载体对所述植物进行感染。

14.权利要求13的方法，其中所述携带载体为土壤杆菌属载体。

15.权利要求10的方法，其中所述表达载体置于一种能够感染所述植物并表达所述单链DNA结合蛋白的病毒颗粒中。

16.权利要求1的方法，其中所述植物选自白麻属、铁苋菜、苹果、藿香蓟属、蜀葵属玫瑰、十万错属、御谷、香蕉、大麦、甜菜、黑绿豆属、雀麦属、木薯、鹰嘴豆属、其利、虎尾草属、三叶草、椰子、咖啡、棉花、豇豆、巴豆、黄瓜、马唐属、扁豆属、茄子、泽兰属、大戟属、蚕豆、忍冬、马豆、麻风树属、益母草属、利马豆、羽扇豆属、麦可托利母、硬皮豆属、玉米、甜瓜、小米、绿豆、燕麦、秋葵、黍属、木瓜、雀稗属、花生、豌豆、胡椒、木豆、菠萝、菜豆属、马铃薯、钩粉草属、西葫芦、鹿霍属、水稻、赛雷诺属、黄花稔属、高粱、大豆、南瓜、甘蔗、糖甜菜、向日葵、甘薯、茶、番茄、烟草、西瓜、小麦和隔蒴苘属。

17.权利要求16的方法，其中所述双粒病毒选自马斯特病毒属、科特病毒属和贝各母病毒属。

18.权利要求1的方法，其中所述单链DNA病毒为马斯特病毒。

19.权利要求18的方法，其中所述马斯特病毒选自御谷线条病毒、菜豆黄矮病毒、雀麦条点花叶病毒、马豆褪绿矮缩病毒、虎尾草条点花叶病毒、马唐条纹病毒、马唐条点花叶病毒、玉米条纹病毒//埃塞俄比亚、玉米条纹病毒//加纳1、玉米条纹病毒//加纳2、玉米条纹病毒//肯尼亚、玉米条纹病毒//卡马替普、玉米条纹病毒//马拉维、玉米条纹病毒//毛里求斯、玉米条纹病毒//莫桑比克、玉米条纹病毒//尼日利亚1、玉米条纹病毒//尼日利亚2、玉米条纹病毒//尼日利亚3、玉米条纹病毒//伊丽莎白港、玉米条纹病毒//留尼汪1、玉米条纹病毒//留尼汪2、玉米条纹病毒//赛它利亚、玉米条纹病毒//南非、玉米条纹病毒//台斯、玉米条纹病毒//乌干达、玉米条纹病毒//瓦哈特玉米、玉米条纹病毒//瓦哈特小麦、玉米条纹病毒//小麦-伊卢西亚、玉米条纹病毒//扎伊尔、玉米条纹病毒//津巴布韦1、玉米条纹病毒//津巴布韦2、芒条纹病毒、黍条纹病毒/卡理诺、黍线条病毒/肯尼亚、雀稗条点花叶病毒、甘蔗条纹病毒//埃及、甘蔗条纹病毒/纳塔耳、甘蔗条纹病毒/毛里求斯、烟草黄矮病毒、小麦矮化病毒/捷克共和国、小麦矮化病毒/法国以及小麦矮化病毒/瑞典。

20.权利要求1的方法，其中所述单链DNA病毒为科特病毒。

21.权利要求20的方法，其中所述科特病毒选自甜菜曲顶病毒-加利福尼亚、甜菜曲顶病毒-加利福尼亚//罗干、甜菜曲顶病毒-CFH、甜菜曲顶病毒//伊朗、甜菜曲顶病毒-沃兰德、辣根曲顶病毒、番茄卷叶病毒以及番茄伪曲顶病毒。

22.权利要求1的方法，其中所述单链DNA病毒为贝各母病毒。

23.权利要求22的方法，其中所述贝各母病毒选自白麻花叶病毒、铁苋菜黄花叶病毒、非洲木薯花叶病毒//加纳、非洲木薯花叶病毒/肯尼亚、非洲木薯花叶病毒/尼日利亚、非洲木薯花叶病毒/乌干达、藿香黄脉病毒、蜀葵耳突病毒、十万错属金色花叶病毒、菜豆印色花叶病毒、菜豆矮花叶病毒、菜豆金色花叶病毒-巴西、菜豆金色花叶病毒-波多黎哥、菜豆金色花叶病毒-波多黎哥/多米尼加共和国、菜豆金色花叶病毒-波多黎哥/危地马拉、本迪黄脉花叶病毒、奇诺的汤姆特病毒、棉花皱叶病毒、棉花曲叶病毒-印度、棉花曲叶病毒-巴基斯坦1/发斯拉巴达1、棉花曲叶病毒-巴基斯坦1/发斯拉巴达2、棉花曲叶病毒-巴基斯坦1/木耳坦、棉花曲叶病毒-巴基斯坦2/发斯拉巴达、豇豆金色花叶病毒、巴豆黄脉花叶病毒//勒克瑙、扁豆黄花叶病毒、东非木薯花叶病毒/肯尼亚、东非木薯花叶病毒/马拉维、东非木薯花叶病毒/坦桑尼亚、东非木薯花叶病毒/乌干达//1、东非木薯花叶病毒/乌干达//2、旱莲草黄脉病毒、茄子黄花叶病毒、泽兰黄脉病毒、大戟花叶病毒、忍冬黄脉花叶病毒、马豆黄花叶病毒、印度木薯花叶病毒、麻风树花叶病毒、益母草花叶病毒、利马豆金色花叶病毒、羽扇豆曲叶病毒、麦可托利母金色花叶病毒-牙买加//2、麦可托利母金色花叶病毒-牙买加//3、硬皮豆花叶病毒、锦葵褪绿病毒、甜瓜曲叶病毒、绿豆黄花叶病毒、秋葵曲叶病毒//象牙海岸、秋葵曲叶病毒//印度、番木瓜曲叶病毒、胡椒哈斯台口病毒、胡椒金色花叶病毒、胡椒淡味替格病毒、马铃薯黄花叶病毒//瓜德罗普、马铃薯黄花叶病毒/特立尼达和多巴哥、马铃薯黄花叶病毒/委内瑞拉、钩粉草黄脉病毒、鹿霍花叶病毒、赛雷诺金色花叶病毒、黄花稔属金色花叶病毒/哥斯达黎加、黄花稔属金色花叶病毒/洪都拉斯、黄花稔属金色花叶病毒/洪都拉斯//黄脉、黄花稔属黄脉病毒、茄属顶叶卷曲病毒、大豆皱叶病毒、南瓜曲叶病毒、南瓜曲叶病毒/扩展型宿主、南瓜曲叶病毒/限制型宿主、南瓜曲叶病毒/洛莫气斯、南瓜曲叶病毒-中国、番茄金色花叶病毒/普通株、番茄金色花叶病毒/黄脉株、烟草曲叶病毒//印度、烟草曲叶病毒-中国、番茄曲叶病毒//茄属物种D1、番茄曲叶病毒//茄属物种D2、番茄曲叶病毒-澳大利亚、番茄曲叶病毒-班加罗尔1、番茄曲叶病毒-班加罗尔2、番茄曲叶病毒-班加罗尔3、番茄曲叶病毒-新德里/严重型、番茄曲叶病毒-新德里/轻微型、番茄曲叶病毒-新德里/勒克瑙、番茄曲叶病毒//塞内加尔、番茄曲叶病毒-西那洛、番茄曲叶病毒-台湾、番茄曲叶病毒-坦桑尼亚、番茄斑驳病毒、番茄斑驳病毒-泰诺、番茄重曲叶病毒//危地马拉、番茄重曲叶病毒//洪都拉斯、番茄重曲叶病毒//尼加拉瓜、番茄黄矮病毒、番茄黄曲叶病毒-中国、番茄黄曲叶病毒-以色列、番茄黄曲叶病毒-以色列/轻微型、番茄黄曲叶病毒-以色列/埃及、番茄黄曲叶病毒-以色列//古巴、番茄黄曲叶病毒-以色列//牙买加、番茄黄曲叶病毒-以色列//沙特阿拉伯1、番茄黄曲叶病毒-尼日利亚、番茄黄曲叶病毒-撒丁岛、番茄黄曲叶病毒-撒丁岛/西西里岛、番茄黄曲叶病毒-撒丁岛/西班牙//1、番茄黄曲叶病毒-撒丁岛/西班牙//2、番茄黄曲叶病毒-撒丁岛/西班牙//3、番茄黄曲叶病毒-沙特阿拉伯、番茄黄曲叶病毒-坦桑尼亚、番茄黄曲叶病毒-泰国//1、番茄黄曲叶病毒-泰国//2、番茄黄曲叶病毒//也门、番茄黄花叶病毒-巴西//1、番茄黄花叶-巴西//2、番茄黄斑驳病毒、番茄黄脉条纹病毒-巴西、西瓜褪绿矮小病毒、西瓜曲斑驳病毒以及隔蒴苘金色花叶病毒-牙买加//1。

24.一种使植物产生双粒病毒抗性的方法，该方法包括将一种能够在所述植物内表达大肠杆菌噬菌体M13基因5蛋白的基因引入所述植物。

25.一种含有编码丝杆噬菌体科病毒单链DNA结合蛋白的核苷酸序列的DNA表达载体，其中所述载体能够在植物中表达所述蛋白。

26.权利要求25的DNA表达载体，其中所述丝杆噬菌体科病毒选自丝杆病毒属和细杆病毒属。

27.权利要求26的DNA表达载体，其中所述丝杆病毒属病毒选自大肠杆菌噬菌体、肠杆菌噬菌体、假单胞菌噬菌体、弧菌噬菌体和黄单胞菌噬菌体。

28.权利要求27的DNA表达载体，其中所述大肠杆菌噬菌体病毒种选自AE2、dA、Ec9、f1、fd、HR、M13、ZG/2和ZJ/2大肠杆菌噬菌体。

29.权利要求25的DNA表达载体，其中所述单链DNA结合蛋白为一种基因5蛋白。

30.权利要求25的DNA表达载体，其中所述单链DNA结合蛋白为大肠杆菌噬菌体M13基因5蛋白。

31.权利要求30的DNA表达载体，其中所述大肠杆菌噬菌体M13基因5蛋白具有SEQ ID NO1的氨基酸残基序列。

32.权利要求25的DNA表达载体，其中所述核苷酸序列包含SEQID NO s 2或3所示的一段核苷酸序列。

33.权利要求25的DNA表达载体，其中所述载体为一种携带载体。

34.权利要求33的DNA表达载体，其中所述携带载体为土壤杆菌属载体。

35.权利要求25的DNA表达载体，其中所述植物的选择集合包括白麻属、铁苋菜属、苹果、藿香蓟属、蜀葵属玫瑰、十万错属、御谷、香蕉、大麦、甜菜、黑绿豆属、雀麦属、木薯、鹰嘴豆属、其利、虎尾草属、三叶草、椰子、咖啡、棉花、豇豆、巴豆、黄瓜、马唐属、扁豆属、茄子、泽兰属、大戟属、蚕豆、忍冬、马豆、麻风树属、益母草属、利马豆、羽扇豆、麦可托利母、硬皮豆属、玉米、甜瓜、小米、绿豆、燕麦、秋葵、黍属、木瓜、雀稗属、花生、豌豆、胡椒、木豆、菠萝、菜豆属、马铃薯、钩粉草、西葫芦、鹿霍属、水稻、赛雷诺、黄花稔属、高粱、大豆、南瓜、甘蔗、糖甜菜、向日葵、甘薯、茶叶、番茄、烟草、西瓜、小麦和隔蒴苘属。

36.一种用于对感染植物的单链DNA病毒产生抗性的组合物，该组合物中包括有效剂量的含有编码丝杆噬菌体科病毒单链DNA结合蛋白的核苷酸序列的DNA表达载体，其中所述载体能够在所述植物内表达所述蛋白。

37.权利要求36的组合物，其中所述单链DNA结合蛋白为大肠杆菌噬菌体M13基因5蛋白。

38.权利要求37的组合物，其中所述大肠杆菌噬菌体M13基因5蛋白具有SEQ ID NO1的氨基酸残基序列。

39.权利要求36的组合物，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NOs2或3所示的一段核苷酸序列。

40.权利要求36的组合物，其中所述DNA表达载体为一种携带载体。

41.权利要求40的组合物，其中所述携带载体为一种土壤杆菌属载体。

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