ES2210557T3 - Procedimiento para la induccion de resistencia viral en una planta. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO QUE SIRVE PARA PROVOCAR LA RESISTENCIA A UN VIRUS QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE TGB3, CON LA CONDICION DE QUE NO SEA EL VIRUS X DE LA PATATA, EN UNA PLANTA O EN UNA CELULA DE PLANTA, LO QUE CONSISTE EN PREPARAR UN PRODUCTO DE RECOMBINACION DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CONTIENEN UNA SECUENCIA DE ACIDOS NUCLEICOS CORRESPONDIENTES AL, POR LO MENOS, 70% DE LA SECUENCIA DE ACIDOS NUCLEICOS DE TGB3 DE DICHO VIRUS Y DE SU ADNC CORRESPONDIENTE, Y UNIDA A UNA O VARIAS SECUENCIAS REGULADORAS ACTIVAS EN LA PLANTA; EN TRANSFORMAR UNA CELULA DE LA PLANTA MEDIANTE EL PRODUCTO DE RECOMBINACION DE ACIDOS NUCLEICOS Y, OCASIONALMENTE, EN REGENERAR UNA PLANTA TRANSGENICA A PARTIR DE LA CELULA TRANSFORMADA. SE REFIERE TAMBIEN A LA PLANTA OBTENIDA MEDIANTE ESTE PROCEDIMIENTO.

Description

Procedimiento para la inducción de resistencia viral en una planta.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la inducción de resistencia viral en una célula y planta, especialmente resistencia BNYVV en una célula y planta de remolacha azucarera, así como a la célula y planta resistentes viralmente obtenidas.

Antecedentes de la invención y estado de la técnica

La extendida enfermedad viral de la planta de la remolacha azucarera (Beta vulgaris) denominada rizomanía está causada por un furovirus, el virus de las nerviaduras amarillas y necróticas (BNYVV)(23, 24), el cual es transmitido a la raíz de la remolacha por el hongo del suelo Polymyxa betae (25).

La enfermedad afecta significativamente a acres del área donde se cultiva la planta de la remolacha azucarera para su uso industrial en Europa, USA y Japón, y todavía se encuentra en expansión en varios sitios de Europa Occidental (26, 27). Debido a que no existe ningún procedimiento práctico para controlar eficazmente la propagación del virus a gran escala mediante medios químicos o físicos (28), ni en las plantas ni en el suelo, los esfuerzos se han concentrado en identificar las fuentes naturales de resistencia en el germoplasma de la remolacha azucarera, y en el desarrollo mediante el cultivo de variedades de la planta de la remolacha azucarera que expresen los genes de la resistencia. Se ha identificado una variedad de tales genes de tolerancia al virus, y algunos han sido utilizados con éxito en el cultivo de variedades comerciales de remolacha azucarera (29, 30, 31).

Solamente la utilización de variedades resistentes o tolerantes al BNYVV permitirá a los agricultores el cultivo de plantas de la remolacha en áreas infectadas por BNYVV donde la planta de la remolacha azucarera sea un componente esencial de la rotación de cultivos y contribuya significativamente a los ingresos del cultivador.

Una serie de estudios detallados han mostrado que una diferencia en la susceptibilidad a la infección por BNYVV entre genotipos o variedades de remolacha azucarera refleja generalmente diferencias en la difusión o translocación del virus en los tejidos de las raíces (32).

Sin embargo, todavía existen pocos trabajos que indiquen claramente que los genes de la tolerancia, incluso procedentes de diferentes fuentes de germoplasma de remolacha azucarera o de germoplasma de líneas salvajes emparentadas (33), proporcionarían mecanismos diferenciados de resistencia. Tal situación sería más controlable para diseñar estrategias de larga duración de resistencia al BNYVV.

Desde 1986 se ha descrito en una serie de trabajos y publicaciones la utilización de secuencias aisladas de genes virales expresadas en plantas con el fin de conferir un alto nivel de tolerancia frente al virus, o incluso con el fin de conferir un tipo de resistencia de amplio espectro frente a una serie de virus relacionados (34, 35, 36). Una de las estrategias de resistencia viral más documentadas basada en ingeniería genética, utilizada en muchas especies cultivadas, tal como la patata, calabaza, pepino o tomate, es la utilización de la secuencia génica viral que codifica la proteína de cubierta del virus diana (37) que, bajo el control de los elementos regulatorios de la planta, se expresará en la misma.

Sin embargo, en el caso de la resistencia mediada por la proteína de cubierta, la expresión de cierto nivel de resistencia en la planta transgénica puede atribuirse a mecanismos diferentes, tal como la co-supresión del ARN, y no necesariamente a la producción de la secuencia proteica.

En general, se transformará la secuencia viral en una célula apropiada o en un cultivo de tejido de la especie de planta utilizando un sistema de transformación mediado por Agrobacterium, o mediante un método directo de transferencia génica, de acuerdo con las restricciones del método de cultivo de tejido o células que pueda aplicarse con éxito en una especie dada. Se regenerará una planta entera y se caracterizará la expresión del transgen.

Aunque la remolacha azucarera se considera una especie recalcitrante en el cultivo celular, limitando el alcance de las aplicaciones prácticas de la ingeniería genética en la especie, algunos trabajos aislados han dado a conocer la transformación y regeneración exitosa de plantas completas (38). También se han publicado algunos ejemplos de tolerancia a BNYVV creada mediante ingeniería mediante la transformación y expresión de la secuencia de proteína de cubierta de BNYVV en el genoma de la remolacha azucarera (39, WO91/13159), aunque raramente dan a conocer datos sobre plantas funcionales completas de remolacha azucarera transgénica (40). En particular, la literatura proporciona datos limitados sobre el nivel de resistencia observado en condiciones de infección en plantas transgénicas de remolacha azucarera transformadas con un gen que codifique una secuencia de proteína de cubierta de BNYVV (41, 42).

Se ha descrito en la solicitud de patente nº WO91/13159 un paquete tecnológico completo que incluye un método de transformación de la remolacha azucarera y la utilización de la expresión de la secuencia de la proteína de cubierta de BNYVV como fuente de resistencia en la planta transgénica de remolacha azucarera obtenida mediante dicho método de transformación.

Sobre la base de la información publicada, no puede concluirse que el mecanismo de resistencia mediado por la proteína de cubierta proporcione cualquier potencial de conferir inmunidad total a la planta de remolacha azucarera frente a la infección por BNYVV mediante la inhibición total de los mecanismos de multiplicación y propagación vírica. La identificación de un mecanismo de resistencia que permita bloquear significativamente la propagación del virus en una etapa temprana del proceso de infección sería un criterio fundamental de éxito para el desarrollo de tal resistencia transgénica, además de que incluso un nivel de resistencia comparable a los ya disponibles, conferido por genes de resistencia identificados en el germoplasma de la remolacha azucarera, diversificaría los mecanismos disponibles de resistencia.

Debido a que se ha demostrado que la enfermedad se está expandiendo en muchos países o áreas, a una velocidad dependiente de la combinación de numerosos factores locales y agrícolas, existe un gran interés en diversificar las fuentes de mecanismos de resistencia genética que puedan, solos o en combinación, conferir una estrategia de resistencia estable y duradera en las variedades actuales y futuras de planta de la remolacha azucarera que se cultivan para uso industrial.

La publicación Xu H. et al. (Plant Cell Report, volumen 15, páginas 91-96 (1995)) describe el constructo de ingeniería genética de resistencia al virus X de la patata en cuatro cultivares comerciales de la patata. Sin embargo, dicho documento afirma que los clones transgénicos de la patata en los que se ha incluido el gen 8KG (el constructo TGB3). Sin embargo, cuando se enfrentaron estas plantas transgénicas a PVX, no estaban protegidas contra PVX, sugiriendo que la proteína OK no desempeña papel alguno en la protección contra PVX.

Objetivos de la invención

La presente invención pretende proporcionar un nuevo método de introducción de diversas resistencias virales en una célula y en una planta, y la célula y planta resistentes viralmente que se obtienen.

Un objetivo principal de la invención consiste en proporcionar un nuevo método de introducción de resistencia BNYVV en una célula y en una planta, así como la célula y la planta resistente -BNYVV, en particular una célula de la remolacha azucarera y la planta (Beta vulgaris ssp.) obtenidas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona utilización de una secuencia alternativa de virus vegetal, especialmente BNYVV, con el fin de obtener un alto nivel de tolerancia a la infección viral, en particular para asegurar un bloqueo rápido y total de los mecanismos de multiplicación y propagación vírica en una planta, especialmente en la planta de la remolacha azucarera (Beta vulgaris), incluyendo la remolacha forrajera, remolacha de hoja y remolacha de mesa, las cuales también pueden verse afectadas por esta infección vírica. Se obtendrá la expresión de resistencia en células y plantas transgénicas, especialmente en células y plantas de la remolacha azucarera que se produzcan por el método de transformación objeto de la solicitud de patente nº WO95/10178, o por otros métodos de transformación basados en Agrobacterium tumefaciens o en la transferencia génica directa. Debido a su elevada eficiencia, el método de transformación descrito en la patente nº WO95/10178 permite la producción de gran número de plantas transformadas, especialmente plantas de la remolacha azucarera, y será preferible para el desarrollo de plantas transgénicas, que pueden analizarse y caracterizarse para identificar su nivel de resistencia viral, especialmente de resistencia BNYVV, incluyendo su evaluación de campo.

El genoma del furovirus de las nerviaduras amarillas y necróticas de la remolacha (BNYVV) consiste en cinco cadenas de ARN de sentido positivo, dos de las cuales (ARN 1 y 2) codifican funciones esenciales para la infección de todas las plantas, mientras que las otras tres (ARN 3, 4 y 5) están implicadas en la infección mediada por vectores de las raíces de la remolacha azucarera (Beta vulgaris) (1). El movimiento célula a célula del BNYVV está gobernado por un conjunto de tres genes virales sucesivos ligeramente solapados situados en el ARN 2, conocidos como el bloque génico triple (TGB) (2), los cuales codifican, en orden, las proteínas virales P42, P13 y P15 (los productos génicos se denominan con su M_{r} calculada, en kilodaltons) (3).

En la descripción siguiente, se identificarán los genes TGB y las proteínas correspondientes mediante los términos siguientes: TGB1, TGB2, TGB3, o por su número de proteína viral codificada, P42, P13 y P15. Existen contrapartidas al TGB en otros furovirus (4, 5), y en potexvirus, carlavirus y hordeivirus (6).

En la tabla 1 se muestran los virus que tienen una secuencia TGB3, el peso molecular del TGB3 de dichos virus, su huésped y las referencias.

TABLA 1

1

Los solicitantes proponen en la presente invención un nuevo método que proporciona resistencia frente a virus vegetales a plantas mediante el bloqueo de los mecanismos de multiplicación y propagación vírica en dichas plantas, especialmente en el tejido de las raíces. Con el fin de demostrar dicha resistencia, los inventores describen seguidamente el efecto de la sobreexpresión de las secuencias TGB, solas o en combinación, sobre el mecanismo de multiplicación y propagación del BNYVV en plantas de C. quinoa, las cuales también son huéspedes del virus BNYVV y que el experto en la materia podía manipular con mayor facilidad.

Los inventores también han realizado experimentos con Beta macrocarpa. Estos resultados han demostrado que será posible obtener también la transformación de plantas mediante el método según la invención y obtener la expresión del gen TGB3 por dichas plantas. Por lo tanto, según se explica en la descripción siguiente, dicho método podría utilizarse para obtener diversas resistencias virales en diversas especies vegetales sometidas a la infección por virus caracterizados por la presencia de una secuencia TGB3 en su genoma.

Se conoce que BNYVV no requiere la síntesis de proteína de cubierta viral para la producción de lesiones locales en hojas de húespedes, tal como Chenopodium quinoa (7), indicando que no se requiere la formación de virión para el movimiento célula a célula.

Sin embargo, no se entiende el modo en el que los componentes del TGB ayudan en el proceso del movimiento, aunque comparaciones computerizadas de secuencias han detectado secuencias conservadas características que podrían proporcionar claves acerca de su función. De esta manera, la proteína TGB 5'-proximal (TGB1) contiene invariablemente una serie de secuencias motivo características de una helicasa de unión a ATP/GTP, mientras que la segunda proteína (TGB2) siempre tiene dos dominios hidrofóbicos que potencialmente atraviesan la membrana, separados por una secuencia hidrofílica que contiene una secuencia péptido motivo altamente conservado de significación desconocida (6). La secuencia y tamaño de la tercera proteína TGB (TGB3) es más variable, aunque la porción N-terminal es generalmente más bien hidrofóbica. Se han detectado ARN subgenómicos con extremos 5' situados corriente arriba de los marcos de lectura abierta (ORF) de TGB1 y TGB2 de BNYVV (figura 1), pero no se ha dado a conocer tal especie para TGB3 de BNYVV (2), o de cualquier otro virus que contenga TGB. En el caso del virus X de la patata (PVX; ref. 8) y del virus del mosaico estriado de la cebada (BSMV; ref. 9), existe evidencia de que los productos de TGB2 y TGB3 se expresan a partir del mismo ARN subgenómico.

Hasta el momento, no se ha dado a conocer ningún ejemplo de un virus en el que los tres elementos TGB se organicen de manera diferente sobre el mismo ARN o estén distribuidos en diferentes ARN genómicos, sugieriendo que su asociación en un orden particular puede ser importante en la regulación de su función.

La presente invención se refiere a un método para inducir resistencia viral en un virus que comprende un bloque génico triple (TGB) bajo la condición de que no sea el virus X de la patata. Dicho virus se selecciona preferentemente de entre el grupo que consiste en el virus del picado del tallo de la manzana, virus del moteado del arándano, el virus M de la patata, el virus del mosaico del trébol blanco, el virus del mosaico del Cymbidium; el virus del mosaico estriado de la cebada, el virus "mop top" de la patata, el virus del mosaico del cacahuete y el virus de la rizomanía de la remolacha; comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

- preparación de un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica correspondiente a por lo menos 70% de la secuencia nucleotídica de TGB3 de dicho virus o de su ADNc correspondiente, estando unido operativamente a una o más secuencias reguladoras activas en una planta,

- transformación de una célula vegetal con el constructo de ácido nucleico, y posiblemente

- regeneración de la planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada.

Preferiblemente, la planta puede infectarse con los virus anteriormente descritos y se selecciona preferiblemente de entre el grupo que consiste en la planta de la manzana, arándano, patata, trébol, orquídea, cebada, cacahuete o remolacha azucarera.

La presente invención también se refiere a la célula vegetal obtenida y a la planta (formada por dichas células vegetales) transgénica (o transformada) que es resistente a dichos virus y que comprende dicho constructo de ácido nucleico.

Los inventores también han descubierto inesperadamente que es posible inducir resistencia a BNYVV en una planta mediante un método que comprende las etapas siguientes:

- preparación de un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica correspondiente por lo menos a 70%, preferiblemente por lo menos 90%, de la secuencia nucleotídica comprendida entre los nucleótidos nº 3627 y nº 4025 de la hebra 5' del ARN 2 genómico o subgenómico del BNYVV, o su ADNc correspondiente, estando unido operativamente a una o más secuencias reguladoras activas en una planta,

- transformación de una célula vegetal con dicho constructo, y posiblemente

- regeneración de una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada.

La secuencia nucleotídica comprendida entre los nucleótidos nº 3627 y nº 4025 de la hebra 5' del ARN 2 genómico o subgenómico que codifica la proteína P15 se describe en la figura 6 y en la publicación (3). Dicha secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos correspondiente se describen en la especificación siguiente como SEC ID nº 1.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una célula vegetal y a una planta transgénica (formada por dichas células vegetales) que son resistentes al BNYVV y que comprenden un constructo de ácido nucleico con una secuencia nucleotídica correspondiente a por lo menos 70%, preferiblemente por lo menos 90%, de la secuencia nucleotídica comprendida entre los nucleótidos nº 3627 y nº 4025 de la hebra 5' del ARN 2 genómico o subgenómico del BNYVV o el ADNc correspondiente, estando unido operativamente a una o más secuencias reguladoras activas en la planta.

Preferiblemente, dicha célula vegetal o planta transgénica (formada por dichas células vegetales) que es resistente al BNYVV se obtiene por el método según la invención.

Las variantes de la secuencia nucleotídica descritas como SEC ID nº 1 comprenden la inserción, sustitución o deleción de nucleótidos que codifican uno o más aminoácidos iguales o diferentes. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a dichas variantes de la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1 que presenten más del 70% de homología con dicha secuencia nucleotídica y que preferiblemente son capaces de hibridarse con dicha secuencia nucleotídica bajo condiciones restrictivas o no restrictivas.

Preferiblemente, dichas secuencias también son capaces de inducir resistencia a BNYVV en una planta.

La expresión "inducir una resistencia viral en una planta" significa inducir una posible reducción o un retardo significativo en la aparición de síntomas de infección, propagación vírica o sus mecanismos de propagación en la planta, especialmente en el tejido de las raíces.

La secuencia o secuencias reguladoras de dicha secuencia nucleotídica son secuencias promotoras y secuencias de terminación activas en una planta.

El constructo de ácido nucleico también puede incluir un gen marcador seleccionable que podría utilizarse para identificar la célula o planta transformada y expresar el constructo de ácido nucleico según la invención.

Preferiblemente, la célula es estomatal y la planta es de remolacha azucarera (Beta vulgaris ssp.) formada de dichas células.

Según la invención, la secuencia promotora es una secuencia promotora vegetal constitutiva o foránea, seleccionada preferiblemente de entre el grupo que consiste en la secuencia promotora 35S del virus del mosaico de la coliflor, el promotor poliubiquitina de Arabidopsis thaliana (43), un promotor que está principalmente activo en tejidos de raíces, tal como el promotor par del gen de la hemoglobina de Perosponia andersonii (Landsman et al., Mol. Gen. Genet. 214: 68-73 (1988)), o una mezcla de los mismos.

Un último aspecto de la presente invención se refiere a un tejido vegetal transgénico, tal como fruta, tallo, raíz, tubérculo, semilla de la planta transgénica según la invención, o una estructura reproducible (preferiblemente seleccionada de entre el grupo consistente en callos, capullos o embriones) obtenida de la planta o célula transgénicas según la invención.

Las técnicas de transformación de la planta, de cultivo de tejidos y de regeneración utilizadas en el método según la invención son bien conocidas por los expertos en la técnica. Tales técnicas son preferiblemente las descritas en las solicitudes de patente internacional nº WO95/10 o WO91/13159, correspondientes a la solicitud de patente Europea nº EP-B-0517833, las cuales se incorporan en el presente documento como referencia. Estas técnicas se utilizan preferiblemente para la preparación de remolacha azucarera transgénica según la invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 representa la estructura del ARN 2 del BNYVV de tipo salvaje y de los replicones que expresan las proteínas TGB.

Figura 2 representa la traducción in vitro de los replicones de los genes TGB en extracto de germen de trigo.

Figura 3 representa la amplificación de los replicones que codifican las proteínas TGB en protoplastos de Chenopodium quinoa y la expresión de P42.

Figura 4 representa la complementación de transcripciones de ARN 2 que contienen defectos en los diferentes genes TGB por los genes de tipo salvaje correspondientes suministrados por un replicón.

Figura 5 muestra el efecto de los replicones tras la infección con ARN 1 y 2 del BNYVV de tipo salvaje.

Figura 6 representa los nucleótidos y secuencia de aminoácidos de TGB3 que codifica el P15 del BNYVV.

Figura 7 muestra la presencia de las regiones codificantes del gen p15 de BNYVV en el genoma de remolacha azucarera mediante un PCR.

Figura 8 muestra la integración del gen P15 de BNYVV en el genoma de remolacha azucarera mediante hibridación de transferencia Southern.

Descripción de la invención

Con el fin de determinar el uso potencial de secuencias génicas particulares aisladas del ARN 2 viral de BNYVV y crear resistencia a BNYVV en la remolacha azucarera mediante la transformación de la planta, los inventores han investigado si son posibles las expresiones independientes de la proteína TGB de BNYVV mediante la inserción del ORF de cada uno en un "replicón" dependiente de la replicación viral derivado del ARN 3 de BNYVV. Los inventores han demostrado que, en infecciones mixtas de hojas de C. quinoa, la proteína TGB1 o TGB2 de BNYVV expresadas de esta manera pueden complementar el ARN 2 de BNYVV que contiene una mutación que deshabilita la proteína TGB correspondiente. Sin embargo, no se ha observado complementación con un replicón que contenía TGB3, a menos que se situase el ORF de TGB3 corriente abajo del ORF de TGB2 en el replicón. Cuando se co-inoculaba con ARN 1 y 2 de tipo salvaje, el replicón que expresaba el ORF de TGB3 de BNYVV inhibía la infección. Los datos son consistentes con un modelo de expresión de las proteínas TGB en el que la traducción de P15 procedente de un ARN subgenómico dicistrónico regula los niveles de expresión de P15 in vivo. Los inventores también han determinado que la expresión elevada de P15 podría asegurar un bloqueo rápido y total de los mecanismos de multiplicación y propagación vírica en la planta.

Materiales y métodos Clones de ADNc

Los vectores de transcripción para la producción de ARN 1 y ARN 2 de longitud completa de BNYVV de tipo silvestre fueron pB15 (10) y pB2-14 (11), respectivamente. Los vectores de transcripción para los mutantes de ARN 2 anteriormente descritos fueron pB2-14-F, -H, -I y -J (2) y pB2-14-\DeltaSN, -\DeltaSN12, -\DeltaSN37, -\DeltaBi, -\DeltaB2, -\DeltaB2, -\DeltaN y -GAA (11). El mutante por deleción del ARN 2, pB2-14-HP1 se produjo por eliminación de la secuencia entre los nucleótidos nº 3158 y nº 3258. El replicón vacío de BNYVV derivado del ARN 3, rep0, se obtuvo por transcripción del mutante por deleción del ARN 3, pB35A\DeltaES (12). Las secuencias TGB para la inserción en rep0 se amplificaron mediante la reacción polimerasa en cadena (PCR) utilizando cebadores cada uno de los cuales contenía un sitio BamHI sin molde situado en su extremo 5'. Los fragmentos PCR correspondientes al gen P42 (nucleótidos nº 2127-3297), el gen P13 (nucleótidos nº 3282-3650), el gen P15 (nucleótidos nº 3627-4025), y ambos los genes P13 y P15 (nucleótidos nº 3282-4025) se digerieron con BamHI y se insertaron en pB35A\DeltaES cortado con BamHI. Los constructos resultantes se utilizaron para transcribir rep42, rep13, rep15 y rep1315, respectivamente. Se produjo un replicón que contenía una mutación con desplazamiento de marco de lectura en el ORF de P15 (Repl5-X) mediante el relleno de los extremos salientes de una inserción en el sitio XbaI (nucleótido nº 3948). Las mutaciones con desplazamiento de marco de lectura que se insertaron en rep13-I, rep1315-I y rep15-J se generaron como se describe para las mutaciones correspondientes en ARN 2 de longitud completa (2). Se verificó que las secuencias amplificadas por PCR estaban libres de errores mediante secuenciación (13).

Transcripciones in vitro

Se prepararon transcripciones con cofia mediante transcripción "run-off" utilizando la polimerasa del bacteriófago T7 (10), del plásmido de ADN, linearizado con HindIII para pB15 y constructos de replicón, y con SaII para pB2-14 y constructos relacionados. Se evaluó la concentración e integridad de las transcripciones mediante electroforesis en gel de agarosa. Se inocularon mecánicamente las hojas con 50 \mul por hoja de tampón de inoculación que contenía 1 \mug de cada transcripción (2). En algunos experimentos, se sustituyeron las transcripciones del ARN 1 y 2 por 0,025 \mug del ARN viral altamente infeccioso purificado a partir del aislamiento de BNYVV Stras 12 (10). Los experimentos preliminares mostraron que esta cantidad de ARN viral era aproximadamente equivalente en infectividad (según mediciones mediante un ensayo de lesión local) a una mezcla que contenía 1 \mug de cada uno de las transcripciones del ARN 1 y 2. Para las infecciones de protoplasto, se inocularon 0,5 \mug de ARN viral 1 y 2, más 3 \mug de transcripción replicona, en 2 x 10^{5} protoplastos por electroporación (2).

Las transcripciones obtenidas a partir de replicones se tradujeron en extracto de germen de trigo (14), y los productos de traducción marcados con ^{35}S se visualizaron mediante autorradiografía tras SDS-PAGE (15, 16). Se cuantificó la radioactividad incorporada en los productos de traducción con un Fujix MAS1000 BioAnalyzer y los valores se ajustaron para el contenido en metionina al calcular los niveles relativos de traducción.

Detección de proteínas y ARN virales

Se extrajo todo el ARN (2) de hojas inoculadas 10 días postinoculación (pi) y de los protoplastos, 48 horas pi. Se detectó el ARN viral mediante hibridación northern utilizando como sondas, transcripciones de ARN antisentido marcadas con ^{32}P (17). La sonda específica de ARN 1 era complementaria a los nucleótidos nº 4740-5650, la sonda específica del ARN 2, a los nucleótidos nº 2324-3789, y la sonda específica del ARN 3, a los nucleótidos nº 1-380. P42, P14 y la proteína de cubierta se detectaron mediante transferencia Western de extractos de proteína total de protoplastos infectados utilizando un antisuero policlonal de conejo específico para cada proteína (18). Se ensayó la estabilidad de las mutaciones introducidas en el ARN 2 mediante reacción en cadena polinucleotídica, seguida de la transcripción inversa (RT-PCR) de extractos de ARN total procedentes de plantas infectadas. Las transcripciones inversas se generaron con un kit de transcripción inversa Expand^{TM} (Boehringer) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo la PCR esencialmente como se ha descrito (19), utilizando 25 ciclos del régimen siguiente: 95º (30 segundos), 50º (30 segundos), 72º (3 minutos). Los pares de cebadores para la amplificación por PCR de diferentes regiones del ADNc del ARN 2 correspondían a (o eran complementarias con, en el caso del segundo miembro de cada par de cebadores) los nucleótidos nº 1143-1151 y nº 3393-3412 (gen P42), y a los nucleótidos nº 3151-3169 y nº 4128-4148 (genes P13 y P15). El cebador utilizado para iniciar la síntesis de ADNc previamente a las reacciones por PCR era complementario a los nucleótidos nº 4128-4148.

Resultados Replicones de expresión de las proteínas TGB de BNYVV

Bajo la condición de que se conserven suficientes secuencias en los extremos 3' y 5', una transcripción de ARN 3 del BNYVV del que se ha delecionado la región central puede replicarse eficientemente en hojas de C. quinoa cuando se coinocula con ARN 1 y 2, y puede expresar un gen foráneo insertado en lugar de la secuencia delecionada (12, 20). Los inventores han utilizado tal "replicón" basado en ARN 3 para expresar cada una de las proteínas TGB de BNYVV fuera de su contexto normal en ARN 2, y han ensayado la capacidad de cada replicón de complementar un mutante ARN 2 defectuoso en el gen TGB correspondiente.

Se muestran en la figura 1 los replicones utilizados en el presente estudio. La figura 1 A es el mapa genómico del ARN 2. Los genes TGB están sombreados y las líneas encima del mapa indican la extensión de los ARN subgenómicos 2sub_{a} y 2sub_{b}. Se indican las posiciones de las deleciones e inserciones que inducen desplazamientos de marco de lectura en ARN 2. La estructura de cofia 5'-terminal se denota mediante un círculo. P21 es la principal proteína de cubierta viral. RT = dominio ultraleído (3). (B) replicones derivados de ARN 3 de BNYVV que contienen los genes TGB de BNYVV (sombreado pálido), o el gen TGB3 que codifica P17 del virus del mosaico del cacahuete (PCV) (sombreado oscuro). Se muestra el sitio BamHI en el replicón vacío (rep0) utilizado para la inserción de las secuencias TGB amplificadas por PCR. Se indican las posiciones de las inserciones que inducen desplazamientos de marco de lectura en los diversos replicones de P13 y P15 mutante. Además de los constructos rep42, rep13 y rep15, cada uno de los cuales contiene un gen TGB, se generó un cuarto constructo (rep1315) que contenía ambos los genes P13 y P15 dispuestos en la misma configuración relativa que en el ARN 2. La capacidad de cada replicón de dirigir la expresión del gen o genes insertados se ensayó mediante traducción in vitro de la transcripción en un extracto de germen de trigo. Cada una de las transcripciones rep42, rep13 y rep15 dirige la síntesis de un producto abundante (figura 2A, pista 2; figura 2B, pistas 2 y 3) no producido en traducciones programadas con la transcripción correspondiente con el replicón vacío, rep0 (figura 2A, pista 1; figura 2B, pista 1). En la figura 2 (A), se representan los productos de traducción marcados con metionina-^{35}S del replicón vacío rep0 (pista 1) y de rep42 (pista 2), mostrados por autorradiografía tras PAGE (15). La banda indicada se identificó como P42 mediante la comparación de su movilidad con la de marcadores de peso molecular (no mostrados). En la figura 2 (B) se representan los productos de traducción dirigidos por rep0 (pista 1), rep13 (pista 2), rep15 (pista 3) y rep1315 (pista 4) mostrados por autorradiografía tras PAGE (16). Las bandas identificadas tentativamente como P13 y P15 se indican a la derecha. La banda de fondo señalada con un asterisco también se sintetizó sin introducción de transcripción alguna en el extracto de traducción. Las movilidades relativas de los diversos productos de traducción fueron los esperados, excepto en que el P13 putativo migró algo más lentamente que P15, presumiblemente debido a su composición de aminoácidos atípica. El constructo dicistrónico rep13 dirigió la síntesis de ambos P13 y P15 (figura 2B, pista 4) en cantidades molares relativas de 3:1 (valores corregidos para la diferencia en contenido de metionina de las dos proteínas; si se elimina la metionina N-terminal de cada proteína post-traduccionalmente, la proporción molar es 5:1).

Se ensayó la capacidad de los replicones de amplificarse mediante la maquinaria replicativa viral in vivo mediante la co-inoculación de transcripciones de replicón en protoplastos de C. quinoa, junto con los ARN 1 y 2 de BNYVV. El análisis de transferencia northern del ARN total extraído de los protoplastos 48 horas pi reveló que todos los replicones que contenían los genes TGB fueron eficientemente amplificados (figura 3A). La figura 3(A) representa la detección mediante hibridación northern de ARN virales en protoplastos de C. quinoa inoculados solamente con los ARN 1 y 2 de BNYVV (pista 2), o suplementados con rep0 (pista 3), rep 13 (pista 5), rep1315 (pista 6), y rep15 (pista 7). Se analizó el ARN de protoplastos falsamente inoculados en la pista 1. Se recogieron los protoplastos 48 horas pi y se detectaron los ARN virales utilizando sondas de ARN antisentido específicas de ARN viral marcado con 32P. Se indican los replicones mediante flechas. La figura 3 (B) representa la inmunodetección de P42 en extractos de proteína total de protoplastos de C. quinoa inoculados con los ARN 1 y 2 de BNYVV (pista 2), transcripción de ARN 1 de tipo salvaje más transcripción del mutante de ARN 2 pB2-14-H, el cual contiene una mutación de desplazamiento de marco de lectura en el gen P42 (11)(pista 3), el ARN 1 y las transcripciones pB2-14-H más rep42 (pista 4). Se analizaron las proteínas extraídas de protoplastos falsamente inoculados en la pista 1. Tras el PAGE (15) y electro transferencia a nitrocelulosa, P42, la proteína de cubierta viral principal (CP) y P14 se inmunodetectaron con una mezcla de antisueros específicos para cada proteína (18). Se han marcado las posiciones de los estándares de peso molecular en kilodaltons a la izquierda de la transferencia. El análisis de transferencia western reveló que el nivel de P42 en los protoplastos infectados con una mezcla de rep42 más transcripciones de ARN 1, y el mutante de desplazamiento de marco de lectura pB2-14-H, causado por el relleno en un sitio SpeI dentro del gen P42 del ARN 2 (ver figura 1), era aproximadamente el doble del nivel en los protoplastos infectados por ARN 1 más ARN 2 de tipo salvaje (figura 3B, pistas 2 y 3). Nótese que los niveles de acumulación de dos otros productos génicos de ARN 2 inmunodetectables (la proteína principal de cubierta viral y P14; figura 1) no fueron modificados por la presencia de rep42. P13 y P15 no pudieron ser inmunodetectados en tales experimentos.

Las proteínas TGB de BNYVV pueden ser complementadas en trans

La capacidad de los replicones que contienen los genes TGB de suministrar funciones de movimiento en plantas enteras se ensayó mediante la co-inoculación de hojas del huésped con lesiones locales C. quinoa con uno de una serie de transcripciones de ARN 2 que contenían una mutación que deshabilitaba a un gen TGB, más un replicón que contenía el gen de tipo salvaje correspondiente. En todos los experimentos, el inóculo también contenía la transcripción del ARN 1 de tipo salvaje como fuente de ARN replicasa viral ARN-dependiente, aunque este hecho no siempre será explícitamente afirmado a continuación. Para el gen P42, los mutantes de ARN 2 ensayados incluían el mutante de desplazamiento de marco de lectura (pB2-14-H) generado por el relleno en un sitio SpeI en el nucleótido nº 2280, una serie de mutantes que contenían deleciones cortas dentro del marco en diferentes posiciones en el ORF de P42 (mutantes pB2-14-\DeltaS12, -\DeltaSN, -\DeltaB1, -\DeltaB2, y -\DeltaHP1; figura 1A; ver también la ref. 11), y un mutante por deleción (pB2-14-F; figura 1) donde la eliminación de una secuencia de 935 nucleótidos corriente arriba del ORF de P42 ha inactivado el promotor para el ARN subgenómico (ARN 2sub_{a}) responsable de la síntesis de P42. Los inóculos que contienen transcripción de ARN 1 más cualquiera de las transcripciones de ARN 2 mutante no produjeron lesiones locales en C. quinoa y no pudo detectarse progenie de ARN viral en las hojas inoculadas 10 días pi (figura 4, pistas 3 y 5; ver ref. 11 para otros mutantes). En la figura 4, el replicón indicado encima de cada pista se inoculó en hojas de C. quinoa junto con la transcripción de ARN 1 de tipo salvaje más la transcripción de ARN 2 de tipo salvaje (pista 2), o la transcripción mutante de ARN 2 indicado encima de cada pista. En las pistas 19 y 20, el inóculo contenía rep42 y rep15 (pista 19), ó rep42 y rep1315 (pista 20), además de transcripciones de ARN 1 y de pB2-14-HP1. La pista 1 contiene ARN procedente de una planta no inoculada de control. Se recogieron las hojas inoculadas 10 días pi y se determinó su contenido en ARN viral mediante hibridación northern según se describe en la figura 3. Las posiciones de los replicones se indican mediante flechas. Al incluir la transcripción rep42 en el inóculo, aparecieron numerosas lesiones locales (20-80 por hoja) en las hojas inoculadas excepto en el inóculo que contenía transcripción del mutante por deleción de ARN 2, pB2-14-HP1, el cual permaneció sin síntomas. Las lesiones de color verde pálido resultantes eran similares en apariencia a aquéllas provocadas por la inoculación con ARN 1 más ARN 2 de tipo salvaje, excepto en el caso del ARN 2 mutante pB2-14-F, con el cual se formaron lesiones locales necróticas. En este último caso, el fenotipo de lesión necrótica puede relacionarse con la producción de una forma truncada de la proteína ultraleída (RT) por parte de este ARN 2 mutante (7).

La hibridación northern de las hojas inoculadas 10 días pi reveló la presencia de progenie de ARN virales de la longitud que se esperaría para ARN 1, 2 y rep42 en todos los ARN 2 mutantes (figura 4, pistas 2, 4, 7-11) excepto en el mutante por deleción pB2-14-HP1 (figura 4, pista 13). Como se mostrará posteriormente, la falta de complementación de pB2-14-\DeltaHP1 con rep42 se debe probablemente a la deleción del promotor para el ARN subgenómico (ARN 2sub_{b}), el cual se cree que dirige la traducción de las proteínas TGB corriente abajo.

Se llevaron a cabo experimentos similares de complementación con rep13, rep15 y el constructo dicistrónico rep1315. Ambos rep13 y rep1315 fueron capaces de complementar la acumulación en las hojas (figura 4, pistas 14 y 15) del mutante pB2-14-I, en el cual el gen P13 había sido deshabilitado por inserción de cuatro nucleótidos (la inserción generó un sitio XhoI), aunque las lesiones locales resultantes eran necróticas. También se generaron lesiones locales necróticas durante las infecciones mixtas con los replicones anteriormente mencionados y con ARN 1 y 2 de tipo salvaje (ver a continuación), indicando que el fenotipo sintomático relacionado con el replicón es dominante sobre el tipo salvaje. Los nuevos síntomas pueden estar relacionados con diferencias en el transcurso de la síntesis o con el nivel de acumulación de P13 cuando se expresa a partir del replicón y no a partir del ARN 2 de longitud completa.

En experimentos tales como los descritos anteriormente, es importante demostrar que la mutación originariamente introducida en el gen P42 o P13 en la transcripción de ARN 2 todavía estaba presente en la progenie de ARN 2, es decir, la copia defectiva del gen TGB en la transcripción no había sido convertida al tipo salvaje mediante recombinación del ARN in planta (21) con la copia presente en el replicón. Por lo tanto, se llevó a cabo un experimento de RT-PCR con la progenie de ARN viral procedente de una planta infectada con ARN 1, transcripción pB2-14-H (gen P42 alterado por la inserción en un sitio SpeI) y rep42. El par de cebadores utilizado en el RT-PCR se hibridó con secuencias de ARN 2 flanqueantes del gen P42 y, por lo tanto, amplificó la copia del gen presente en ARN 2 pero no la copia en el replicón, donde no había secuencias flanqueantes. El análisis de enzimas de restricción reveló la ausencia de sitio SpeI en el fragmento de ADN amplificado resultante, como sería esperable en la forma mutada antes bien que en el tipo salvaje del gen TGB. Un análisis similar de la progenie de ARN viral procedente de plantas infectadas con ARN 1, pB2-14-I (mutación de desplazamiento de marco en el gen P13 que genera un sitio XhoI), y rep13 o rep1315, demostró similarmente que la mutación que deshabilita la copia del gen P13 en la transcripción de ARN 2 estaba conservada en la progenie de ARN 2. Se concluye que rep42 y rep13 en efecto están complementando la función de P42 y P13 al suministrar el producto génico in trans antes bien que simplemente sirviendo como una fuente de secuencia TGB de tipo salvaje para la recombinación.

Inesperadamente, el replicón que expresaba el gen P15 de tipo salvaje (rep15) fue incapaz de complementarse con el mutante de ARN 2 defectivo en P15, pB2-14-J, en inoculaciones mixtas. No se formaron lesiones locales en las hojas inoculadas 10 días pi y no pudo detectarse ARN viral en las hojas mediante transferencia northern (figura 4, pista 17). Por otra parte, cuando se co-inoculó transcripción pB2-14-J con rep1315, aparecieron lesiones locales (del tipo necrótico) y se detectó facilmente la progenie de ARN viral (figura 4, pista 18). En este último caso, el análisis de un producto de RT-PCR que contenía el gen P15 en la progenie de ARN 2 reveló que la mutación que deshabilitaba el gen estaba presente todavía. La complementación de pB2-14-J todavía tenía lugar cuando el ORF de P13 en el replicón dicistrónico quedaba interrumpido por un mutación de desplazamiento de marco (rep1315-I; figura 1), demostrando que la expresión de P13 de longitud completa desde el primer ORF del replicón dicistrónico no es necesaria para la complementación con la copia situada corriente abajo del gen P15.

Evidencia de que P15 se expresa desde un ARN subgenómico dicistrónico

Se ha detectado un ARN subgenómico derivado de ARN 2 (ARN 2sub_{b}) de aproximadamente 1500 nucleótidos de longitud en tejido infectado por BNYVV (2). El extremo 5' de esta especie no ha sido mapado con exactitud, pero se predice que se encuentra cerca del extremo 5' del ORF de P13. No se ha detectado ARN subgenómico con extremo 5' corriente arriba del ORF de P15, sugiriendo la posibilidad de que, al igual que en BSMV (8), ambos P13 y P15 se expresan a partir de ARN 2sub_{b}.

La incapacidad mencionada anteriormente de rep42 de complementarse con el ARN 2 mutante defectivo en P42, pB2-14-HP1, podría originarse en efectos polares de la deleción del ARN 2 sobre la síntesis de proteínas TGB corriente abajo si la deleción ha deshabilitado el promotor ARN 2sub_{b} (El límite derecho de la deleción en pB2-14-\DeltaHP1 se encuentra a solamente 30 residuos corriente arriba del codón de iniciación de P13). Para probar esta hipótesis, se llevó a cabo un experimento en el que el se complementaba la transcripción pB2-14-\DeltaHP1 con ambos rep42 y rep1315. Las hojas inoculadas con esta mezcla desarrollaron lesiones locales y contenían progenie de ARN viral (figura 4, pista 20). Si, por otra parte, se utilizaba rep13, antes bien que rep1315, juntamente con rep42, para complementar pB2-24-HP1, no aparecía síntoma alguno y no se detectaba progenie de ARN viral mediante transferencia northern (figura 4, pista 19). Estas observaciones son consistentes con la hipótesis de que la deleción en pB2-14-HP1 interfiere con la expresión de los ORF de TGB corriente abajo, presumiblemente mediante el bloqueo de la transcripción del ARN 2sub_{b}. Además, el hecho de que la complementación fuese posible con rep1315 pero no con rep13, indica que P15, al igual que P13, son traducidos a partir de ARN 2sub_{b}.

La expresión independiente de P15 inhibe la infección con ARN viral de tipo salvaje

La capacidad de rep1315, pero no de rep15, de complementarse con el ARN 2 mutante defectivo en P15, pB2-14-J, en infecciones de hojas, podría indicar que la expresión independiente de P15 a partir del replicón monocistrónico interfiere con el ciclo de infección viral mediante la producción del producto génico en cantidades excesivas respecto a P13. Para probar esta hipótesis, se llevó a cabo un experimento en el que se inoculó rep15 en hojas de C. quinoa con ARN 1 y 2 virales de tipo salvaje. No aparecieron lesiones en las hojas inoculadas, incluso mucho tiempo pi (figura 5A), y no pudo detectarse ARN viral mediante transferencia northern (figura 5B, pista 6). La figura 5 (A) representa hojas de C. quinoa inoculadas con ARN 1 y 2 (izquierda), o con ARN 1 y 2 más rep15 (derecha). Se fotografiaron las hojas 20 días pi cuando las lesiones locales en la hoja de la izquierda se habían extendido tanto que cubrían gran parte de la superficie de la misma. En la figura 5 (B), análisis mediante hibridación northern (según se describe en la figura 3) del contenido en ARN viral de hojas de C. quinoa inoculadas con sólo ARN 1 y 2 de BNYVV (pista 1), o inoculadas también con rep0 (pista 2), rep42 (pista 3), rep13 (pista 4), rep1315 (pista 5), rep15 (pista 6), rep15-J (pista 7), rep15-X (pista 8), o repPCV-P17 (pista 9). Se indican las posiciones de los replicones mediante flechas. (C) Análisis mediante hibridación northern del contenido en ARN viral de hojas (pistas 1, 3 y 5) y raíces inoculadas (pistas 2, 4 y 6) de Beta macrocarpa, inoculadas falsamente (pistas 1 y 2), inoculadas con ARN 1, 2 y 3 de BNYVV (pistas 3 y 4), o con ARN 1, 2 y 3 más rep15 (pistas 5 y 6). Se incluyó ARN 3 en el inóculo porque es necesario para el movimiento sistémico en B. macrocarpa (22). Bajo estas condiciones, las hojas inoculadas con ARN 1 y 2 solamente, estaban fuertemente infectadas (figura 5A; figura 5B, pista 2). La inhibición de la infección vírica por rep15 era dosis-dependiente. La adición de diez veces menos de rep15 a la mezcla de inóculo todavía resultaba en la casi completa inhibición de la formación de lesiones, pero cantidades menores del replicón eran progresivamente menos eficaces en el bloqueo de la infección. Rep15 también bloqueaba la aparición de progenie de ARN viral en las hojas y raíces inoculadas de Beta macrocarpa, un huésped sistémico de BNYVV (figura 5C, pistas 5 y 6). El replicón vacío, rep0, y los replicones que expresaban las otras dos proteínas TGB (rep42, rep13, rep1315), por otra parte, no inhibieron significativamente la infección por BNYVV de hojas de C. quinoa (figura 5B, pistas 2-5).

Debido a que rep15 no interfirió con la amplificación de ARN 1 y 2 en protoplastos de C. quinoa (ver figura 3), esto sugiere que el replicón interfiere con el movimiento del virus desde el sitio inicial de infección hacia células vecinas (movimiento célula a célula) durante la formación de lesiones locales en las hojas. La formación de lesiones no era inhibida por la co-inoculación de ARN Stras 12 y replicones rep15-J o rep15-X (figura 5B, pistas 7 y 8), los cuales codifican formas truncadas de marco desplazado de P15. Este descubrimiento confirma que la expresión de P15 a partir del replicón, antes bien que la simple presencia de la secuencia de ARN correspondiente, es necesaria para la inhibición durante los experimentos de infección mixta. Sin embargo, en presencia de rep15-X, las lesiones locales resultantes eran de aproximadamente un tercio del diámetro de las lesiones formadas por la infección con Stras 12 solo, o con Stras 12 más rep15-J, y el contenido en progenie de ARN viral en las hojas infectadas era significativamente menor (figura 5B, pista 8). Este descubrimiento sugiere que la molécula P15 de longitud casi completa producida por rep15-X, aunque es incapaz de sustituir a P15 de tipo salvaje en un experimento de complementación, puede interferir con el movimiento célula a célula de P15 de tipo salvaje producido a partir de ARN 2. Presumiblemente, las formas de longitud completa y truncadas de P15 compiten entre sí por los sitios de unión en otro componente (que podría ser de origen vírico o celular) implicado en el proceso del movimiento.

Como se ha indicado anteriormente, las comparaciones de secuencias entre diferentes virus que poseen un TGB han revelado poca similaridad de secuencias entre los diferentes genes TGB3. Por ejemplo, la proteína TGB3 de 17 kDa (P17) del furovirus del mosaico del cacahuete (PCV) no muestra similaridad significativa de sus secuencias con P15 de PNYVV (4), aunque ambos virus pueden infectar C. quinoa. Con el fin de determinar si la expresión independiente de la proteína TGB3 de PCV puede interferir con una infección por BNYVV de una manera similar a la observada con rep15, se construyó un replicón de BNYVV derivado de ARN 3 que contenía el TGB3 de PCV (rep-PCV-P17; figura 1). Las hojas de C. quinoa inoculadas con ARN 1 y 2 de BNYVV más repPCV-P17 no desarrollaron síntomas y no pudo detectarse progenie de ARN viral mediante transferencia northern (figura 5A, pista 9). Esta observación sugiere que las rutas por las que se mueven BNYVV y PCV de célula a célula en C. quinoa comparten por lo menos un elemento común que, a pesar de su disimilaridad de secuencia, interactúa con los productos TGB3 de ambos virus.

Los inventores han demostrado que los replicones que portan P42 y P13 pueden complementarse con ARN 2 de BNYVV que porta el gen defectivo correspondiente, pero que un replicón que porta P15 no puede. En el último caso, puede darse complementación, sin embargo, si el gen P15 se suministra como segundo gen en un ARN dicistrónico (rep1315) que porta el gen P13 en primera posición. Nótese que la posición relativa de los genes P13 y P15 sobre rep1315 es idéntica a su disposición sobre ARN 2sub_{b}, el ARN subgenómico que se cree que dirige la síntesis de ambos proteínas en infecciones de tipo salvaje. Esto sugiere que el movimiento exitoso célula a célula de BNYVV requiere la presencia de P13 y P15 en cantidades relativas apropiadas y que la producción de ambas proteínas a partir del mismo ARN subgenómico representa un mecanismo para coordinar su síntesis. La capacidad de rep15 de complementar la transcripción de ARN 2 mutante en P15, pB2-14-J, y su capacidad de inhibir la infección por el virus de tipo salvaje sería, por lo tanto, debida a la sobreproducción de P15 respecto a P13 cuando el primero es traducido a partir del replicón, y el segundo, a partir de ARN 2. Cuando P15 se expresa a partir del replicón dicistrónico rep1315, por otra parte, se producirían niveles relativos apropiados de P13-P15, permitiendo que se efectúe el movimiento célula a célula. No se conocen los niveles relativos de acumulación "correctos" de P13 y P15 en una infección de tipo salvaje. La traducción de rep1315 en extracto de germen de trigo produjo tres a cinco veces más P13 que P15, pero tales experimentos no reflejan necesariamente la situación en la planta debido a que las tasas de renovación de las dos proteínas pueden diferir significativamente. Nótese que los resultados indican que el movimiento célula a célula mediado por TGB es menos sensible a la sobreexpresión de P42 y P13 respecto a los niveles "correctos" característicos de una infección normal, ya que la co-inoculación de rep42, rep13 o rep1315 con el virus de tipo salvaje no inhibió la infección (figura 5, pistas 3-5), aunque las lesiones producidas en presencia de rep13 y rep1315 eran necróticas. De esta manera, se demuestra que la expresión de P15 en plantas transgénicas podría proporcionar un mecanismo para inducir la resistencia a BNYVV ("resistencia derivada del patógeno"; ref. 23) en tales plantas, bajo la condición de que se pueda conseguir un nivel suficiente de expresión de P15.

Para alcanzar una mejor compresión de cómo se regulan los niveles relativos de P13 y P15 durante la traducción se requiere comprender cómo acceden los ribosomas situados sobre el ARN 2sub_{b} al cistrón P15. El inicio de la traducción en un cistrón interno de un ARN mensajero eucariótico puede ocurrir mediante varios mecanismos, incluyendo (i) el deslizamiento ribosómico imperfecto, en el que una fracción de las subunidades ribosómicas que empiezan a deslizarse por el ARN desde el extremo 5' se mueven pasado el primer AUG (no óptimo) corriente arriba sin producirse iniciación (24), y (ii) entrada interna, en la que las subunidades ribosómicas se unen directamente a una secuencia especial en el ARN cerca del codón interno de iniciación (25). Un tercer posible mecanismo, de terminación-reinicio (24), parece improbable que sea aplicable a cualquiera de los virus que contienen TGB porque el solapamiento entre los cistrones TGB2 y TGB3 requeriría que los ribosomas deslizasen hacia atrás tras terminar TGB2 para poder alcanzar el codón de iniciación de TGB3. Se ha sugerido que las proteínas TGB3 de BSMV y PVX se traducen mediante un mecanismo de deslizamiento imperfecto (8, 9). El gen P15 de BNYVV también podría ser producido mediante deslizamiento imperfecto aunque debe señalarse, sin embargo, que el contexto del codón de iniciación de P13 de BNYVV (AUAAUGU) es casi óptimo y también hay dos AUG corriente abajo que las subunidades deberían ignorar durante el deslizamiento para poder alcanzar el codón de iniciación de P15.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes son transformaciones de plantas realizadas mediante la técnica descrita en la solicitud de patente internacional nº WO95/101 incorporada en el presente documento por referencia.

El material vegetal y condiciones de cultivo eran las descritas por Hall et al., Plant Cell Reports 12, páginas 339-342 (1993), Pedersen et al., Plant Science 95, páginas 89-97 (1993), y Hall et al., Nature biotechnology 14, 1996, en prensa.

Vectores plásmido y preparación del ADN

Se cortó el plásmido pET-P15 (que contenía la secuencia nucleotídica P15) en su sitio único BamHI y se generó un extremo romo con la ADN polimerasa T4. Tras purificar mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se cortó el plásmido lineal en su sitio único NcoI. Se purificó el fragmento génico P15 de 400 pb mediante electroforesis y se insertó en pMJBX-Ub (que contenía el promotor poliubiquitina de Arabidopsis (Norris et al., Plant Molecular Biology 21, páginas 895-906 (1993), una secuencia intensificadora del TMV, y la secuencia de terminación 3' NOS) cortado con las endonucleasas de restricción NcoI y SmaI. En el plásmido obtenido de esta manera (pMJBX-Ub-P15), la secuencia nucleotídica del gen P15 se sitúa bajo el control del promotor poliubiquitina de Arabidopsis seguido de la secuencia intensificadora del TMV. El fragmento EcoRI del plásmido pB235SAck contiene el gen pat, utilizado como marcador selectivo, que codifica la fosfinotricin acetil transferasa (obtenida de Agrevo, Berlín, Alemania). En este fragmento EcoRI, la secuencia nucleotídica del gen pat se encuentra bajo el control de la señales de expresión 5' y 3' del virus de la coliflor. El plásmido pMJBS6, resultante de la combinación de este fragmento EcoRI-pat y de una digestión EcoRI parcial del plásmido pMJBX-Ub-P15, contiene ambos los genes pat y P15. Este plásmido pMJBS6 es un plásmido de alto poder de copia basado en el vector pUC18 y que también contiene el gen lactamasa (amp^{r}). En el plásmido pIGPD7, que contenía el mismo fragmento pat que pB235Sack, se sustituyó el gen lactamasa por un gen igpd (imidazol glicerol fosfato deshidratasa) procedente de Saccharomyces cerevisiae (Struhl et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 73, páginas 1471-1475 (1976)). Se consiguió la selección y mantenimiento del plásmido en Escherichia coli mediante la complementación de la cepa auxotrófica para hisB, SB3930, en medio mínimo en ausencia de antibióticos. El fragmento P15, con su promotor ubiquitina y secuencia de terminación, se purificó como fragmento de 2500 pb, a partir del plásmido pMJBX-Ub-P15 tras cortar el mismo en su sitio único HindIII, seguido de una restricción parcial EcoRI. Este fragmento tenía extremos romos y se insertó en un plásmido pIGPD7 de extremos romos, cortado en su sitio único NcoI. El plásmido pIGPDS4 resultante contenía ambos los genes pat y P15 en un vector sin el gen \beta-lactamasa.

Material vegetal

Se iniciaron cultivos de brotes in vitro de plántulas de remolacha azucarera con el fin de proporcionar una fuente reutilizable y uniforme de material de partida estéril, y se mantuvieron con un periodo de subcultivo de 4 semanas, según se describe en Hall et al., Plant Cell Reports 12, páginas 339-342 (1993).

Aislamiento a gran escala de epidermis de remolacha azucarera

Se utilizó una versión modificada del método del mezclador de Kruse et al., Plant Physiology 690, páginas 1382-1386 (1989). Para cada aislamiento, se mezclaron 2 g de hojas (retirando las nerviaduras centrales) de brotes de 4 semanas en un mezclador Waring a velocidad máxima (23000 rpm) durante 60 segundos en un vaso metálico de 250 ml que contenía 50 ml de medio Ficoll frío (4ºC) (100 g/l Ficoll, 735 mg/l CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 1 g/l PVP40, autoclavado). A continuación, se recuperaron los fragmentos epidérmicos con un filtro de nilón de 297 \mum y se lavaron con 500 ml de agua de grifo estéril. Los fragmentos resultantes se retiraron del filtro enjuagando hacia una placa de Petri de 9 cm con 10 ml de CPW9M que contenía CaCl_{2}\cdot2H_{2}O al 3,8% (p/v) (Krens et al., Theoretical and Applied Genetics 79, páginas 390-396 (1990)). Se eliminaron cualesquiera fragmentos de hoja restantes y las placas se preincubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.

Aislamiento de protoplastos de células guardia de fracciones enriquecidas de epidermis

Para recuperar la fracción de epidermis, se centrifugó la suspensión durante 1 minuto a 55 x g, después de lo cual se retiró el sobrenadante. Se resuspendió el pellet en 50 ml de mezcla de enzima y se transfirieron alícuotas de 5 ml a cada una de 10 placas de Petri de 6 cm (Greiner, TC quality), se sellaron con parafilm y se incubaron durante la noche a 25ºC en condiciones de oscuridad bajo agitación suave. El medio de digestión consistía en CPW9M suplementado con Cellulase RS al 0,5% (p/v) y Macerozyme R10 al 3% (p/v) (Yakult Honsha, Tokyo, Japón), pH 5,8. A la mañana siguiente, generalmente se observaba que los protoplastos flotaban cerca de la superficie de la mezcla de digestión. Tras agitación suave de las suspensiones utilizando una pipeta estéril para liberar los protoplastos todavía adheridos a fragmentos de cutícula, se agruparon las digestiones y se pasaron a través de filtros de nilón de 297 y 55 \mum. El filtrado se mezcló con un volumen igual de Percoll isosmótico que contenía sacarosa (Percoll 15S) al 15% (p/v), y se distribuyó en 12 tubos de centrifugación de 12 ml. En cada tubo, se añadieron cuidadosamente en capas por encima de la suspensión de protoplastos, primero, 1 ml de CPW15S (Krens et al., 1990) y, a continuación, 0,5 ml de manitol al 9% (p/v) que contenía CaCl_{2} 1 mM (9M). Tras centrifugar a 55 x g durante 10 minutos las células guardia viables eran visibles en bandas situadas en la interfase CPW15S/9M. Para concentrar los protoplastos, se recogieron estas bandas y se mezclaron con Percoll 15S, dando un volumen final de 16 ml. A continuación, este volumen se dividió entre 2 tubos de centrifugación, añadiendo en capas como anteriormente, y se recentrifugaron. La retirada cuidadosa de las capas 9M rindió la fracción enriquecida en protoplastos de células guardia para su conteo posterior utilizando un hemocitómetro.

Transformación de protoplastos

Las transformaciones se llevaron a cabo en tubos de centrifugación de 12 ml, con 1 x 10^{6} protoplastos cada uno suspendidos en 0,75 ml de medio 9M. Se añadió plásmido de ADN (50 \mug de Pmjbx-Ub-P15 y pIGPDS4) e, inmediatamente tras la mezcla, se añadieron 0,75 ml de medio PEG gota a gota (PEG 6000 al 40% disuelto en medio F (Krens et al., Nature 296, páginas 72-74 (1982))). Tras mezcla concienzuda, se mantuvo la suspensión a temperatura ambiente durante 30 minutos bajo agitación intermitente. Posteriormente, a intervalos de 5 minutos, se añadieron 4 alícuotas de 2 ml de medio F. Tras centrifugar durante 5 minutos a 55 x g, se retiró el sobrenadante, y el pellet de protoplastos se resuspendió en 9M y se recentrifugó. Finalmente, se resuspendieron las células en 1 ml de medio 9M para su conteo.

Cultivo y selección de protoplastos

Se incluyeron protoplastos en alginato de calcio y se cultivaron en medio líquido modificado K8P (Hall et al., 1990). Para seleccionar las células transformadas establemente, se añadió bialaphos, el compuesto activo de Herbiace (Meiji Seika Ltd., Japón) tras 7 días, proporcionando una concentración final de 200 \mug/l. En el día 18, se cortaron los discos de alginato en rodajas de 3 mm y se transfirieron a medio PGo (De Greefs y Jacobs, Plant Science Letters 17, páginas 55-61, 1979) suplementado con BAP 1 \muM (PG1B) y 250 \mug/l de bialaphos, y se solidificó con agarosa al 0,8%.

Cultivo y regeneración de callos

Tras 21 días, se transfirieron los trozos de alginato que contenían los microcallos no visibles a placas de Petri de 9 cm que contenían 20 ml de medio K (sacarosa al 3%, agarosa al 0,8%, BAP 1 \muM, medio PGo, pH = 5,8 autoclavado). El cultivo fue en condiciones de oscuridad, como anteriormente.

Se recogieron individualmente los callos fácilmente rompibles, de tipo acuoso, al alcanzar un tamaño de aproximadamente 1-2 mm de diámetro, y se cultivaron en grupos de 20 en medio K fresco. En esta etapa, los análisis de PCR confirmaron la presencia de transformantes.

A intervalos de dos semanas, todos los callos se subcultivaron en medio fresco.

Los regenerantes aparecieron durante las primeras 8 semanas de cultivo de los callos individuales. Al hacerse visibles los primeros brotes y alcanzar un tamaño de aproximadamente 2 mm, la placa se transfirió a condiciones de luz (3000 lux), 25ºC, longitud del día 15 horas.

Las plántulas de aproximadamente 4 mm de longitud se transfirieron a tubos de cultivo individuales que contenían 15 ml de medio K y se subcultivaron adicionalmente en condiciones de luz, como anteriormente.

Enraizamiento y transferencia al suelo

Cuando las plántulas alcanzaron la etapa de cuatro hojas (habitualmente tras 5 a 6 semanas, subcultivando tras 3 semanas), se transfirieron a tubos de cultivo que contenían 15 ml de medio L (sacarosa al 3%, agarosa al 0,8%, ácido indolebutírico 25 \muM (IBA), medio PGo, pH = 5,8 autoclavado) (medio PGo descrito por De Greef W. et al., Plant Science Letters 17, páginas 55-61 (1979)) y se cultivaron al igual que anteriormente.

Cuando por lo menos una raíz había alcanzado una longitud de 1 cm, se retiraron las plántulas de los tubos de cultivo y se lavaron bajo agua corriente de grifo para eliminar todos los fragmentos de ágar y se transfirieron a macetas de 9 cm en un invernadero.

Las plántulas se cubrieron con un vaso de plástico transparente para proporcionar un ambiente húmedo, durante 7 días, después de lo cual se podían cultivar sin protección.

La planta transformada por la secuencia SEC ID nº 1 según la invención se recuperó y había expresado P15.

Análisis de ADN

Se sometió ADN genómico procedente de transformantes primarios a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% tras tratarlo con enzimas de restricción, y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa utilizando procedimientos estándar, siguiendo el protocolo del fabricante. Se llevó a cabo hibridación con el ADN, en forma de sondas marcadas \alpha^{32}P-dATP, cuya presencia se deseaba determinar. Se lavaron las membranas hasta una astringencia final del 0,1% x SSC, SDS al 0,1% a 60ºC. El ADN hibridado se visualizó oscureciendo la película de rayos X durante 24 a 48 horas.

Análisis de PCR

Se utilizaron técnicas estándar de PCR para detectar una serie de secuencias intactas de plásmido. Se llevaron a cabo reacciones utilizando 25 ciclos de desnaturalización de 1 minuto a 94ºC, anillado durante 1 minuto; extensión durante 2 minutos a 72ºC, con un periodo final de extensión de 5 minutos. Las temperaturas de anillado se optimizaron para cada combinación de cebadores. La presencia de la región codificante del gen P15 de BNYVV en el genoma de la remolacha azucarera se verificó mediante PCR utilizando un par de oligonucleótidos como cebadores: MOV1, cebador sentido [5'-GGTGCTTGTGGTTAAAGTAGATTTATC-3' (nucleótidos 3 a 29 en SEC ID nº 1)] y MOV2 cebador antisentido [5'-CTATGATACCAAAACCAAACTATAGAC-3' (complementario a los nucleótidos 369 a 395 en SEC ID nº 1)]. Este fragmento de 393 pb de longitud comprende toda la región codificante del gen P15 para BNYVV (ver figura 7).

Figura 7: Análisis de los productos de PCR obtenidos con el ADN de la remolacha azucarera de transformantes P15 (pistas 5 a 7) y de una planta no transformada (pista 4). Se utilizó Low DNA Mass Ladder® (Life Technologies) como marcador de tamaño (pista 1). Las pistas 2 y 3 corresponden a los controles positivos (pMJBS6/pIGPDS4). La flecha situada a la izquierda muestra la posición del producto PCR esperado.

Análisis de hibridación por transferencia Southern

Se verificó la integración del gen P15 de BNYVV en el genoma de la remolacha azucarera mediante hibridación transferencia Southern. Se aisló el ADN total de regenerantes transgénicos primarios, se digerió con enzimas de restricción (PstI, KpnI, NcoI, SacI), se sometió a electroforesis, se transfirió e hibridó con sondas BNYVV P15-específicas marcadas con ^{32}P utilizando el fragmento MOV1-MOV2 amplificado por PCR (ver figura 8).

Figura 8: Análisis de transferencia Southern. Se utilizó ADN lambda digerido con HindIII como marcador de tamaño (pista 1). Pistas 2 a 16, ADN de los transgénicos: 2 a 4 digerido con SaCI, 6 a 8 digerido con PstI, 10 a 12 digerido con NcoI, 14 a 16 digerido con KpnI. Las pistas 5, 9, 13 y 17 corresponden a la planta no transformada.

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Claims (20)

1. Método para inducir resistencia a un virus que comprende la introducción de una secuencia de bloque génico triple 3, con la condición de que no sea el virus X de la patata, en una célula vegetal o en una planta, que comprende las etapas siguientes:

- preparación de un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que se corresponde con por lo menos el 70% de la secuencia nucleotídica del bloque génico triple 3 de dicho virus, o con su ADNc correspondiente, estando unido operativamente a una o más secuencias reguladoras en la planta,

- transformación de una célula vegetal con el constructo de ácido nucleico, y posiblemente

- regeneración de la planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia nucleotídica del constructo de ácido nucleico se corresponde con por lo menos 90% de la secuencia nucleotídica del bloque génico triple 3 de dicho virus, o con su ADNc complementario.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el virus se selecciona de entre el grupo que consiste en el virus del tallo picado de la manzana, el virus del moteado del arándano, el virus M de la patata, el virus del mosaico del trébol blanco, el virus del mosaico del Cymbidium, el virus del mosaico estriado de la cebada, el virus "mop top" de la patata, el virus del mosaico del cacahuete y el virus de la rizomanía de la remolacha.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la célula vegetal es una célula estomatal.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la planta se selecciona de entre el grupo que consiste en la planta de la manzana, arándano, trébol, orquídea, cebada o cacahuete.

6. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el virus es BNYVV, la secuencia nucleotídica del bloque génico triple 3 de dicho virus está comprendida entre el nucleótido nº 3627 y nº 4025 de la hebra 5' del ARN 2 genómico o subgenómico de BNYVV, y la planta es una planta de la remolacha, preferiblemente una planta de la remolacha azucarera (Beta vulgaris).

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia reguladora comprende una secuencia promotora o una secuencia de terminación activas en la planta.

8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque la secuencia promotora es una secuencia promotora vegetal constitutiva o foránea.

9. Método según la reivindicación anterior 7, caracterizado porque la secuencia promotora se selecciona de entre el grupo que consiste en el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, y/o el promotor poliubiquitina de Arabidopsis thaliana.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la secuencia promotora está principalmente activa en el tejido de las raíces de la plantas, tal como el promotor par en el gen de la hemoglobina de Perosponia andersonii.

11. Planta transgénica resistente a un virus, con la condición de que no sea el virus X de la patata, que comprende un constructo de ácido nucleico con una secuencia nucleotídica que se corresponde con por lo menos 70% de la secuencia nucleotídica del bloque génico triple 3 de dicho virus, o con su ADNc correspondiente, estando unido operativamente a una o más secuencias reguladoras activas en la planta.

12. Planta transgénica según la reivindicación 11, caracterizada porque el constructo de ácido nucleico tiene una secuencia nucleotídica que se corresponde con por lo menos el 90% de la secuencia nucleotídica del bloque génico triple 3 de dicho virus, o con su ADNc complementario.

13. Planta transgénica según la reivindicación 11 ó 12, caracterizada porque el virus se selecciona de entre el grupo que consiste en el virus del picado del tallo de la manzana, el virus del moteado del arándano, el virus M de la patata, el virus del mosaico del trébol blanco, el virus del mosaico del Cymbidium, el virus X de la patata, el virus del mosaico estriado de la cebada, el virus "mop top" de la patata, el virus del mosaico del cacahuete y el virus de la rizomanía de la remolacha.

14. Planta transgénica según las reivindicaciones 11 a 13, que es una planta seleccionada de entre el grupo que consiste en la planta de la manzana, arándano, patata, trébol, orquídea, cebada o cacahuete.

15. Planta transgénica según las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizada porque es una planta de la remolacha, preferiblemente una planta de la remolacha azucarera (Beta vulgaris), el virus es BNYVV, y la secuencia nucleotídica del bloque génico triple 3 de dicho virus está comprendida entre el nucleótido nº 3627 y nº 4025 de la hebra 5' del ARN 2 genómico o subgenómico de BNYVV, o de su ADNc correspondiente.

16. Planta transgénica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 11 a 15, caracterizada porque la secuencia reguladora comprende una secuencia promotora y una secuencia de terminación activas en la planta.

17. Planta transgénica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 11 a 16, caracterizada porque la secuencia o secuencias reguladoras comprenden una secuencia promotora que es una secuencia promotora vegetal constitutiva o foránea.

18. Planta transgénica según la reivindicación 17, caracterizada porque la secuencia promotora se selecciona de entre el grupo que consiste en el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, y/o el promotor poliubiquitina de Arabidopsis thaliana.

19. Planta transgénica según la reivindicación 17 ó 18, caracterizada porque la secuencia promotora está principalmente activa en tejidos de las raíces, tal como el promotor par del gen de la hemoglobina de Perosponia andersonii.

20. Tejido de planta transgénica seleccionado de entre el grupo que consiste en tejido de fruta, tallo, raíz, tubérculo, semilla de una planta, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 11 a 19.