JPH0690758A - ウイルス耐性を得るためのｒｎａおよびｄｎａ分子 - Google Patents

ウイルス耐性を得るためのｒｎａおよびｄｎａ分子

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JPH0690758A
JPH0690758A JP5018498A JP1849893A JPH0690758A JP H0690758 A JPH0690758 A JP H0690758A JP 5018498 A JP5018498 A JP 5018498A JP 1849893 A JP1849893 A JP 1849893A JP H0690758 A JPH0690758 A JP H0690758A
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ペーター・ロス
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ペーター・シュライヤー
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エトガル・マイス
Rudolf Schneider
ルドルフ・シュナイダー
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、ウイルスＲＮＡの複製中間体の少
なくとも一部に相補性であって、かつ該ＲＮＡ複製中間
体に結合することによって、そして好ましくは該ＲＮＡ
複製中間体を特異的に切断することによってウイルスの
増殖サイクルを阻害するＲＮＡ分子に関する。 【効果】 本発明のＲＮＡ分子によって、所望の生物の
ウイルス耐性を信頼性高く改良することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、実質的に、ウイルスＲ
ＮＡの複製中間体の少なくとも一部に相補性であって、
かつ該ＲＮＡ複製中間体に安定に結合することによって
ウイルスの増殖サイクルを阻害するＲＮＡ分子に関す
る。さらに、本発明は、該ＲＮＡ分子をコードするＤＮ
Ａ分子に関する。さらに別の態様は以下の記載および特
許請求の範囲から明らかである。
【０００２】
【従来の技術】ＲＮＡウイルスは、そのゲノムが１本鎖
または２本鎖であってよいリボ核酸(ＲＮＡ)からなるウ
イルスである。１本鎖のＲＮＡウイルスにおいて、複製
は合成中間体工程を経て、即ちウイルス粒子中に導入さ
れるビリオンＲＮＡに厳密に相補性の鎖である複製中間
体を経て進行する。
【０００３】複製中間体として相補性ＲＮＡを形成する
ＲＮＡウイルスに加えて、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)な
どの１本鎖ＤＮＡウイルスが、その増殖サイクル中にＲ
ＮＡ複製中間体を合成することが知られている。
【０００４】原核および真核生物の両方に対して、天然
のアンチセンスＲＮＡ分子が記載されている[van der K
rolら、1988年]。過去数年間の間に、アンチセンス分子
を、植物および動物の両方における遺伝子発現を阻害す
るために内生のＲＮＡ分子に対して使用する例が増加し
ている[IzantおよびWeintraub、1984年]。これらのアン
チセンスＲＮＡ分子は、対応する基質ＲＮＡ分子に対し
て極めて高度の相補性を示し、それによりインビボの条
件下でハイブリッド分子を生成することができる。さら
に、アンチセンスＲＮＡ分子は、キュウリモザイクウイ
ルス[Rezaianら、1988年]、ジャガイモウイルスＸ[Heme
nwayら、1988年]またはタバコモザイクウイルス[Powell
ら、1989年]などのウイルス感染から植物を保護するた
めに、ウイルスＲＮＡ分子に対して用いられている。全
ての場合に、極めて低い接種濃度において全身性のウイ
ルス感染に対する保護が達成できるにすぎない。従っ
て、別の方法として使用されることが増えてきたコート
タンパク質保護[Beachy、1990年]が、現在ではトランス
ジェニック植物においてウイルス耐性を得るための好ま
しい方法と考えられているにちがいない。この方法によ
ると、トランスジェニック植物においてコートタンパク
質が過剰発現される。コートタンパク質の発現を伴わず
に実質的に交差-保護の結果が得られる機序を、非病原
性またはごくわずかに病原性であるウイルス(そのＲＮ
Ａが病原性株のウイルスＲＮＡにある程度の同一性を示
す)のウイルス性核酸の存在下に観察することができ
る。保護性ウイルスのウイルス(＋)鎖または(−)鎖ＲＮ
Ａは、病原性ウイルスの相補性ＲＮＡと相互作用するこ
とができ、従って後者を中和することができる[Palukai
tisおよびZaitlin、1984年]。この保護性ウイルスの
(＋)または(−)鎖ＲＮＡの一部は、それらが宿主植物の
ゲノム中に組込まれるときには、同様の作用を有するこ
とができる[PalukaitisおよびZaitlin、1984年]。
【０００５】内生のmＲＮＡを阻害するための別の方法
において、リボザイムを用いることができる。上記した
アンチセンスＲＮＡ分子とは対照的に、「リボザイム」
は酵素活性を有しており、基質ＲＮＡを規定の部位で切
断することができる[CottenおよびBirnstiel、1989年；
Steineckeら、1992年]。この２分子的に用いられる「リ
ボザイム」の基本構造は、ある種のウイロイド、ウイル
ソイドおよび直線状サテライトＲＮＡ中に見い出される
共通(コンセンサス)構造から導かれる(本願の場合は単
分子であり、いわゆるハンマーヘッド構造である)[Symo
ns、1989年]。リボザイムの結合には、基質ＲＮＡ分子
上に位置する切断部位の両側の、基質ＲＮＡ分子に相補
性の２つの領域が必要である。基質ＲＮＡ分子にハイブ
リダイズするリボザイム分子の領域の間に、通常は２２
ヌクレオチドの保存性の高い構造が存在する。
【０００６】２分子性のリボザイム／基質複合体は、次
のように例示される：
【化１】 ここで、Ｋは基質ＲＮＡ分子の任意のヌクレオチドを表
し、ＬはリボザイムＲＮＡの対応する相補性ヌクレオチ
ドを表す。その他のヌクレオチドは保存性が高い部分で
ある。「ＧＵＧＡ」ヘアピン構造(ループ)は、天然のサ
テライトＲＮＡにおいても変化しているので、他の配列
で置換することができる。コンセンサス配列について言
うと、ヌクレオチドＣ、ＡおよびＵを位置Ｘの代わりに
置くことができる。
【０００７】既知のアンチセンスＲＮＡおよびリボザイ
ム法を使用する際の大きな欠点は、ウイルス耐性を得る
ときの信頼度が低いことである。従って、これらの方法
はこれまで予防および治療の分野においてコートタンパ
ク質保護ほどの重要な地位を獲得することはなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】即ち、本発明の技術的
課題は、所望の宿主生物を感染から実質的に保護する増
強されたウイルス耐性を該宿主生物において達成するこ
とができるＲＮＡおよびＤＮＡ分子を得ることである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記の技術的課題を、特
許請求の範囲に記載した各種態様を提供することによっ
て解決した。即ち、本発明の対象は、次の特徴を有する
ＲＮＡ分子である： (a)ウイルスＲＮＡ複製中間体の少なくとも一部に相補
性である配列を表すこと； (b)細胞内でウイルスＲＮＡ複製中間体と安定な結合を
形成することができること； (c)細胞内条件のもとで結合に利用可能なウイルスＲＮ
Ａ複製中間体の一部に結合すること；および (d)ウイルスＲＮＡ複製中間体への安定な結合がウイル
スの増殖サイクルを阻害すること。
【００１０】本発明のＲＮＡ分子の大きな利点は、細胞
内濃度がウイルスmＲＮＡ転写体の濃度およびゲノム性
ウイルスＲＮＡの濃度(NassuthおよびBol、1983年)また
はＤＮＡの濃度よりもかなり低いウイルスＲＮＡ複製中
間体への結合性である。低い細胞内濃度で存在するこれ
らウイルスＲＮＡ複製中間体が、制御するのが比較的容
易なウイルス増殖の阻害のための標的である。従って、
本発明のＲＮＡ分子の抗ウイルス作用は従来技術から既
知のＲＮＡ分子の抗ウイルス作用と比較して増強されて
おり、ウイルス増殖の信頼度の高い阻害または所望の宿
主生物のウイルス耐性の増加が達成される。
【００１１】本明細書において、「ウイルスＲＮＡ複製
中間体」とは、１本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスの
複製によって得られるＲＮＡを指し、ビリオンＲＮＡま
たはＤＮＡに相補性であり、新しいビリオンＲＮＡまた
はＤＮＡまたはサブゲノムＲＮＡの合成に役立つ。さら
に、「安定な結合」なる用語は、相補性配列に基づいて
細胞のイオン環境の中で安定な基質と活性分子の間の相
互作用を意味する。得られたらせんの安定性は、長さと
配列の両方によって決定される。
【００１２】「細胞内条件のもとで結合に利用可能な」
なる用語は、基質分子の分子内の個々の構造とアンチセ
ンスまたはリボザイム分子の個々の構造のどちらも分子
間の相互作用を阻害しないことを意味する。この相互作
用の可能性を予測できるようにするために、種々のコン
ピュータープログラムの助けを借りて熱力学的な性質を
シミュレートすることができる(例えば、Abrahamsら、1
990年に従って)。「ウイルスの増殖サイクルの阻害」な
る用語は、アンチセンスまたはリボザイム分子の結合の
後に、ビリオン鎖、即ちゲノム性ウイルスＲＮＡまたは
ＤＮＡを調製することがもはや不可能であるか、または
減弱されることを意味する。
【００１３】本発明の好ましい態様は、ポリ(Ａ)配列を
さらに保持しているＲＮＡ分子である。この「ポリ(Ａ)
配列」なる用語は、転写後にポリ(Ａ)ホモポリマーが１
次転写体の３'末端に合成されることを意味する。１次
転写体のレベルにおいて、該転写体の３'末端のすぐ前
には、例えば６ヌクレオチドのシグナル配列が存在して
いるはずである。該ポリ(Ａ)配列はＲＮＡの安定性に、
およびその細胞核から細胞質への輸送に決定的なもので
ある。
【００１４】本発明のさらに好ましい態様は、アンチセ
ンスＲＮＡであるＲＮＡ分子である。「アンチセンスＲ
ＮＡ」なる用語は、基質ＲＮＡの結合部位に実質的に相
補性であり、５'および３'の両末端にさらにいくつかの
ベクター特異的な塩基を有していてよく、そして３'末
端にポリ(Ａ)配列を有していてよいＲＮＡに関する。
【００１５】特に好ましい態様においては、本発明のア
ンチセンスＲＮＡは、オープン・リーディング・フレー
ムに対応するかまたはオープン・リーディング・フレー
ムに相補性であるウイルスＲＮＡ複製中間体のＲＮＡ配
列に結合する。
【００１６】本発明のさらに好ましい態様は、リボザイ
ム活性を示すＲＮＡ分子である。特に好ましい態様にお
いては、該ＲＮＡ分子は、配列「ＧＵＸ」を含むウイル
スＲＮＡ複製中間体中の配列に結合する。「リボザイム
活性」なる用語は、基質ＲＮＡ分子が特異的な部位で、
即ちＧＵＸコンセンサス配列のヌクレオチドＸに面する
３'末端で切断され、切断後の該基質ＲＮＡ分子が２つ
の直線状分子の形態で存在することを意味する。コンセ
ンサス配列のヌクレオチドＸは、塩基Ｃ、ＵまたはＡの
ヌクレオチドである。
【００１７】本発明のさらに好ましい態様は、動物また
は植物のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスのウイルスＲＮＡ
複製中間体に結合するＲＮＡ分子である。このような動
物ウイルスの例を以下に挙げる：(＋)ＲＮＡウイルス・ ピコルナウイルス科：例えば、ポリオウイルス(１ＲＮ
Ａ染色体)・ カリシウイルス科：例えば、ネコカリシウイルス(１Ｒ
ＮＡ染色体)・ トガウイルス科：例えば、シンドビスウイルス(１ＲＮ
Ａ染色体)・ フラビウイルス科：例えば、Ｃ型肝炎ウイルス(１ＲＮ
Ａ染色体)(−)ＲＮＡウイルス・ ラブドウイルス科：例えば、水疱性口内炎ウイルス(１
ＲＮＡ染色体)・ オルソミクソウイルス科：例えば、インフルエンザウ
イルス(８ＲＮＡ染色体)・ パラミクソウイルス科：例えば、センダイウイルス(１
ＲＮＡ染色体)・ アレナウイルス科：例えば、ラッサ熱ウイルス(２ＲＮ
Ａ染色体)・ ブニアウイルス科：例えば、ラ・クロッセウイルス(３
ＲＮＡ染色体)ＤＮＡウイルス・ Ｂ型肝炎ウイルス
【００１８】植物ＲＮＡウイルスの例を以下に挙げる：(＋)ＲＮＡウイルス・ タバモウイルス科：例えば、タバコモザイクウイルス
(１ＲＮＡ染色体)・ コモウイルス科：例えば、ササゲモザイクウイルス(２
ＲＮＡ染色体)・ トブラウイルス科：例えば、タバコラットルウイルス
(２ＲＮＡ染色体)・ ククモウイルス科：例えば、キュウリモザイクウイル
ス(３ＲＮＡ染色体)、アルファルファモザイクウイルス
(３ＲＮＡ染色体)・ ブロモウイルス科：例えば、ブロモモザイクウイルス
(３ＲＮＡ染色体)(−)ＲＮＡウイルス・ ラブドウイルス科：例えば、レタス・ネクロティック
・イエローウイルス(１ＲＮＡ染色体)・ ブニアウイルス科：例えば、トマト・スポッテッド・
ウイルトウイルス(３ＲＮＡ染色体；アンビセンス（amb
isense）暗号パターンを示す最小のＲＮＡを有する)
【００１９】特に好ましい態様においては、本発明のＲ
ＮＡ分子は、ＲＮＡウイルスＴＳＷＶ(トマト・スポッ
テッド・ウイルトウイルス)から導かれる複製中間体に
結合する。ＴＳＷＶは、ブニアウイルス科に属するトス
ボ(tosbo)ウイルス属[de Haanら、1989年、1990年]の代
表例である。このウイルスは非常に広い宿主範囲を有す
る。現在では、このウイルスが蔓延する５０科３７０種
が記載されている[R.Kormelinkら、1991年]。このウイ
ルスはアザミウマ(thripidae)を介して転移し、双子葉
植物および単子葉植物の両方に感染する。ＴＳＷＶは
(−)鎖のウイルスであり、そのゲノムは大きさの異なる
３種類の１本鎖ＲＮＡ分子からなる(ＳＲＮＡ：約２.９
kb；ＭＲＮＡ：約５.２kb；ＬＲＮＡ：８.９kb)。ＬＲ
ＮＡおよびＭＲＮＡにおいて、(−)鎖はビリオン中にパ
ッケージされている。即ち、植物中で合成された相補性
の鎖だけが正しいオープン・リーディング・フレーム
(ＯＲＦ)を保持しており、細胞中で翻訳され得る。ＬＲ
ＮＡはウイルスのレプリカーゼをコードしており[de Ha
anら、1991年]、ＭＲＮＡは(少なくとも)２種類の糖タ
ンパク質をコードしている[Elliottら、1991年]。ＳＲ
ＮＡはいわゆるアンビセンス暗号法を有している。１つ
のＯＲＦがビリオン中に存在するＲＮＡ分子に対応して
おり、第２のＯＲＦが相補性のＲＮＡ分子によって示さ
れる。両ＯＲＦは重なり合うことはなく、いわゆる遺伝
子間領域によって隔てられている。ＳＲＮＡにコードさ
れている両タンパク質はサブゲノムＲＮＡによって翻訳
される。小さい方のタンパク質(２８.９kＤa)は核タン
パク質であり[de Haanら、1990年]、これはウイルスの
ゲノム核酸に結合する。大きい方のタンパク質(５２.４
kＤa)は最近になって細胞質中に検出された[Kormelink
ら、1991年]。
【００２０】さらに別の特に好ましい態様においては、
本発明のＲＮＡ分子は、ＴＳＷＶ複製中間体の一部に相
補性である図１〜図４に示したＲＮＡ配列の１つを含有
している。
【００２１】図１は、ＴＳＷＶ基質ＲＮＡ分子の一部、
ならびに第１の選択したＴＳＷＶ−ＧＵＣ部位(複製中
間体)に特異的なリボザイムの相補性および保存領域を
示すものである。本発明のＲＮＡ分子はリボザイムＲＮ
Ａと呼ばれる分子である。以下においては、このリボザ
イムをＲＺ２と呼ぶ。
【００２２】図２は、ＴＳＷＶ基質ＲＮＡ分子の一部、
ならびに第２の選択したＴＳＷＶ−ＧＵＣ部位(複製中
間体)に特異的なリボザイムの相補性および保存領域を
示すものである。本発明のＲＮＡ分子はリボザイムＲＮ
Ａと呼ばれる分子である。以下においては、このリボザ
イムをＲＺ３と呼ぶ。
【００２３】図３は、本発明に係るアンチセンスＲＮＡ
分子(ＡＳ３)を示すものである。この配列は複製中間体
のＮＳ5タンパク質の暗号領域において相補性である。
【００２４】図４は、本発明に係るアンチセンスＲＮＡ
分子(ＡＳ４)を示すものである。この配列は複製中間体
のＮタンパク質の暗号領域において相補性である。
【００２５】図５は、ＴＳＷＶ複製中間体のどの部位に
上記のリボザイムＲＺ２およびＲＺ３ならびに上記のア
ンチセンスＲＮＡ分子ＡＳ３およびＡＳ４が相補性であ
るかを示すものである。
【００２６】図６は、ＨＢＶ基質ＲＮＡ分子の一部、な
らびに選択したＨＢＶ−ＧＵＣ部位(複製中間体)に特異
的なリボザイムの相補性領域を示すものである。本発明
に係るＲＮＡ分子はリボザイムＲＮＡと呼ばれる分子で
ある。以下においては、このリボザイムをＲＺ６と呼
ぶ。
【００２７】図７は、ＨＣＶ基質ＲＮＡ分子の一部、な
らびに選択したＨＣＶ−ＧＵＣ部位(複製中間体)に特異
的なリボザイムの相補性領域を示すものである。本発明
に係るＲＮＡ分子はリボザイムＲＮＡと呼ばれる分子で
ある。以下においては、このリボザイムをＲＺ７と呼
ぶ。
【００２８】本発明に係るＲＮＡ分子は合成によって、
および／または遺伝子工学の方法によって調製すること
ができる。
【００２９】本発明の他の対象は、本発明に係る上記の
ＲＮＡ分子の１つをコードしているか、または転写する
ＤＮＡ配列である。
【００３０】本発明のさらに別の対象は、次の特徴を有
する遺伝子である： (a)所望の宿主細胞において転写を制御するのに適した
プロモーターを表すこと；および (b)本発明に係る上記のＤＮＡ配列の１つを含有してい
ること。
【００３１】本発明の好ましい態様において、この遺伝
子は上記の特徴に加えて、次の特徴の少なくとも１つを
表す： (c)転写終止配列(ＴＴＳ)；および (d)ポリアデニル化部位。
【００３２】「転写終止配列」なる用語は、ある種のポ
リメラーゼによる母体として働く、ある種のＤＮＡ配列
のＲＮＡ合成の終止を規定する配列を指すことを意味す
る。トランスジェニック植物において使用される「キメ
ラ遺伝子」の場合には、例えば、ノパリンシンテターゼ
遺伝子[Zambryskiら、1983年]、オクトピンシンテター
ゼ遺伝子[Herrera-Estrellaら、1983年]、またはＣaＭ
Ｖ(カリフラワーモザイクウイルス)の３５Ｓ転写体[Pie
trzakら、1986年]のＴＴＳを使用することができる。
【００３３】「ポリアデニル化部位」なる用語は好まし
くは６つのヌクレオチド(例えば、ＡＡＵＡＡＡ)からな
る配列を指し、これは１次転写体の正確なプロセシング
および１次転写体の３'末端へのポリＡ配列の転写後合
成を与える。
【００３４】本発明の好ましい態様においては、遺伝子
はキメラ遺伝子である。この「キメラ遺伝子」なる用語
は、個々の制御領域およびシグナル配列[例えば、上記
特徴の(a)〜(d)]の少なくとも１つが被転写遺伝子と同
じ起源を有していない合成遺伝子を指すことを意味す
る。
【００３５】本発明の別の対象は、本発明の上記ＤＮＡ
配列の１つまたは本発明の上記遺伝子もしくはキメラ遺
伝子の１つを含有するベクターである。この「ベクタ
ー」なる用語は、１本鎖または２本鎖として、「裸の」
核酸(例えば、プラスミド)または「パッケージされた」
核酸(例えば、λファージ)として存在しうる直線状また
は環状の核酸配列を指す。ベクターは、複製および選択
に必要な特異的な配列を含有している。これらの配列に
加えて、組換えベクターは細胞中に導入されるべき所望
のＤＮＡ配列を含有している。例えば、植物ベクターと
してバイナリーベクター系のpＭＥＸ００１などの誘導
体が使用されている[KonczおよびSchell、1986年]。こ
のベクターは、アグロバクテリウム属細菌の形質転換に
適しており、かつ大腸菌中でも複製するバイナリーベク
ターと言われている。
【００３６】本発明のさらに別の対象は、上記の特徴を
示す本発明のベクターを含有している宿主生物である。
【００３７】好ましい態様においては、この宿主生物は
微生物、好ましくはEscherichiaもしくはAgrobacterium
属の微生物、さらに好ましくはEscherichia coli(大腸
菌)もしくはAgrobacterium tumefaciens種の微生物、植
物または動物細胞である。
【００３８】本発明の他の対象は、ゲノム中に、本発明
に係る上記ＤＮＡ配列の１つ、または本発明に係る上記
遺伝子もしくはキメラ遺伝子の１つを保持する宿主生物
である。好ましくは、微生物、植物および動物細胞であ
る。これらＤＮＡ配列または遺伝子もしくはキメラ遺伝
子の発現によって、ウイルスＲＮＡ複製中間体に安定に
結合することによりＲＮＡまたはＤＮＡウイルスのウイ
ルス増殖サイクルを阻害するそれぞれのＲＮＡ配列が産
生される。このウイルス増殖サイクルの十分に強い阻害
は、宿主生物のウイルス耐性の増加を導く。
【００３９】本発明のさらに他の対象は、本発明に係る
植物細胞から再生され、かつゲノム中に本発明に係る上
記のＤＮＡ配列、遺伝子またはキメラ遺伝子のいずれか
を含有するウイルス耐性のトランスジェニック植物であ
る。また、本発明はこれら植物の子孫に関する。ここ
で、「再生」なる用語は、例えば葉切片形質転換によっ
て、再生植物プロトプラスト細胞培養物とAgrobacteriu
m tumefaciensの同時培養によって、あるいは適当な培
養培地中での直接ＤＮＡ感染によるトランスジェニック
植物の完成によって得られる被形質転換植物細胞を成長
させることを意味する。この被形質転換植物細胞を、適
切な培養培地の助けを借りて常法に従い、培養および再
生させて植物を完成させる[NagyおよびMaliga、1976
年]。このようにして得られたトランスジェニック植物
を、必要なら、リポーター遺伝子(マーカー遺伝子)の発
現によって同定することができる。
【００４０】外来ＤＮＡを双子葉および単子葉植物のゲ
ノム中に移転させるために、特に有用かつ広く適用でき
るベクターとしてAgrobacterium tumefaciensのＴiプラ
スミドが利用可能である。本発明に係るＤＮＡ配列また
は本発明に係るキメラ遺伝子を、適当なＴiプラスミド
の両境界配列の間に、または右側境界配列の領域中に挿
入し[Zambryskiら、1983年]、植物の感染、植物の一部
もしくは植物組織、例えば、葉切片、茎、胚軸、子葉、
分裂組織およびそれらを導く組織、例えば、２次胚およ
びカルスの感染によって、あるいはプロトプラストとAg
robacterium tumefaciensの同時培養によって移転させ
る。また、直接のＤＮＡ導入によって細胞の形質転換を
達成することもできる。この導入は、必要なら、電場に
よって好ましい影響を与えることができる(電気穿孔法)
[Frommら、1986年]。
【００４１】本発明の別の対象は、本発明のトランスジ
ェニック植物の繁殖物質である。ここで、「植物」なる
用語は、完全な植物および植物の一部、例えば、葉、種
子、球根、さし穂などの両方を指す。「繁殖物質」なる
用語は、被形質転換植物の繁殖に用いることができる植
物の一部および植物細胞を指す。このような植物の一部
の例は種子またはさし穂である。
【００４２】本発明のさらに別の対象は、１またはそれ
以上の本発明に係る上記ＤＮＡ配列、１またはそれ以上
の本発明に係る遺伝子もしくはキメラ遺伝子、または１
またはそれ以上の本発明に係るベクター、あるいはこれ
らの組合せを含有するウイルス耐性のトランスジェニッ
ク宿主生物を調製するためのキットである。好ましい態
様は、ウイルス耐性の植物細胞、ウイルス耐性の植物、
またはウイルス耐性の動物細胞の調製に用いることがで
きるキットである。「植物細胞」なる用語には、プロト
プラスト、セルラインおよび植物カルスが含まれる。本
発明に係るウイルス耐性の動物細胞は、例えば、体細胞
治療に用いることができる。
【００４３】最後の本発明の対象は、少なくとも１つの
本発明に係るＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、遺伝子もしくは
キメラ遺伝子、または少なくとも１つの本発明に係るベ
クター、あるいはそれらの組合せを含有する、ウイルス
感染の治療剤である。
【００４４】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明する。実施例１ １．ベクターの構築 １-１．ＲＺ２およびＲＺ３(リボザイムの構築) 所望のリボザイムＲＺ２またはＲＺ３(図１または図２)
をコードする相補性のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成
装置(Applied Biosystems 380A)を用いて調製し、ポリ
ヌクレオチド−キナーゼを用いて５'末端をホスホリル
化した。このオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーシ
ョン後に対応する突出５'配列を与えるように設計した
ので、塩基対化したオリゴヌクレオチドを、制限エンド
ヌクレアーゼＥcoＲＩおよびＨindIIIで消化したpＢＬ
ＵＥＳＣＲＩＰＴ ＫＳプラスミド(Stratagene)中にク
ローン化することができた。この反応生成物は大腸菌Ｄ
Ｈ５α細胞を形質転換するのに役立った。ポジティブな
組換え体のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨincIIお
よびＢamＨＩで消化し、挿入フラグメントを、ＳmaＩ／
ＢamＨＩで消化したpＭＥＸ００１ベクター中にクロー
ン化した。この使用したプラスミドpＭＥＸ００１はア
ンピシリン耐性の遺伝子を１つおよびメトトレキセート
耐性の遺伝子を１つ保持し、大きさが８,６５０bpであ
る。これを常法により大腸菌細胞中で増殖させることが
できる。これは、大腸菌細胞中だけでなくAgrobacteriu
m tumefaciens細胞中でも複製することができるバイナ
リーベクターである。このプラスミドは、３５Ｓプロモ
ーター、ポリリンカーおよび３５Ｓ終止配列、ならびに
ポリアデニル化シグナルを含有している。このように構
築したＲＺ２およびＲＺ３含有のプラスミドpＲＺ２お
よびpＲＺ３を、それぞれ直接形質転換によってAgrobac
terium tumefaciens ＧＶ３１０１[KonczおよびSchel
l、1986年]に転移させた。得られたAgrobacterium株
を、次いで植物の形質転換に用いた。
【００４５】 １-２．ＡＳ３およびＡＳ４(アンチセンスの構築) １-２-１．ＡＳ３(図３) クローンＴＳＷＶ−Ｌ３／３３５[Maissら、1991年]の
ＢamＨＩ／ＥcoＲＶ消化によって大きさが１.１８kbpの
フラグメントを得、これをＸbaＩ(充填)／ＢamＨＩ(３
５Ｓプロモーターのうしろ)で消化したpＭＥＸ００１ベ
クター中にクローン化した。この連結調製物はコンピテ
ントな大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換するのに役立つ。
ポジティブな組換え体のＤＮＡを、コンピテントなAgro
bacterium tumefaciens ＧＶ３１０１株[KonczおよびSc
hell、1986年]の細胞の形質転換に用いた。得られたAgr
obacterium株を、次いで植物の形質転換に用いた。
【００４６】１-２-２．ＡＳ４(図４) クローンＴＳＷＶ−Ｌ３／３０８[Maissら、1991年]の
ＢamＨＩ／ＥcoＲＶ消化によって大きさが１.７kbpのフ
ラグメントを得、これをＳmaＩ／ＢamＨＩ(３５Ｓプロ
モーターのうしろ)で消化したpＭＥＸ００１ベクター中
にクローン化した。この連結調製物はコンピテントな大
腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換するのに役立つ。ポジティ
ブな組換え体のＤＮＡを、コンピテントなAgrobacteriu
m tumefaciens ＧＶ３１０１株[KonczおよびSchell、19
86年]の細胞の形質転換に用いた。得られたAgrobacteri
um株を、次いで植物の形質転換に用いた。
【００４７】１-２-３．容易に単離できる形態でベクタ
ーＭＯＭＰＩ３３５Ｂ(ＡＳ３をコードしている)または
ＭＯＭＰＩ３０８Ａ(ＡＳ４をコードしている)を含有し
ている大腸菌株ＤＨ５αは、ブダペスト条約の規則に従
って、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (ＤＳ
Ｍ)[Griese-bachstr. 8, W-3400 Goettingen，ドイツ連
邦共和国]に寄託されており、寄託番号ＤＳＭ ６７３５
(ＭＯＭＰＩ３３５Ｂ)およびＤＳＭ ６７３４(ＭＯＭＰ
Ｉ３０８Ａ)を有している。
【００４８】２．植物の形質転換 ２-１．Agrobacteriumの形質転換 ２-１-１．タバコ植物の形質転換のために葉切片を用い
た[Horschら、1985年]。長さが２〜３cmの滅菌新芽培養
物の葉を１cm直径のスライスに切り取り、２４時間増殖
させて１０mＭ ＭgＳＯ4および２０mlのＭＳ培地に添加
したAgrobacterium培養物と共に２６℃で６０時間イン
キュベートした[MurashigeおよびSkoog、1965年]。次い
で、この葉切片を１,０００μg Ｃlaforanを含むＭＳ培
地で３回洗浄し、０.５μg／ml メトトレキセート、０.
５μg／ml ＮＡＡ(酢酸ナフチル)、０.２mg／ml ＢＡＰ
(ベンジルアミン プリン)および２％ スクロースを含む
ＭＳプレート(「カルス誘導培地」)に広げ、２６℃でイ
ンキュベートした。２週間経過する毎に、この葉切片を
新しいカルス誘導培地に移した。小さなカルスが検出で
きるようになったらすぐに、これらカルスを新芽誘導培
地(カルス誘導培地に一致するが、０.２μg／ml ＮＡＡ
および０.５μg／ml ＢＡＰを含有する)に移した。再生
された新芽が長さ２〜３cmになったら、これらを１％
スクロースを含むが根誘導用のホルモンを含まないＭＳ
培地に移し、２４〜２６℃の滅菌条件下で培養した[１
２時間の光照射(１,０００〜３,０００ルックス)、１２
時間の暗所]。４〜６週間後に、この新芽培養物を新鮮
な培地に移し、植物まで成長させ、次いで適当な条件
下、温室中で栽培した。
【００４９】２-１-２．ジャガイモ植物の形質転換のた
めに、葉切片をAgrobacterium浮遊液(２-１-１)中でイ
ンキュベートし、次いで暗所でさらに２日間インキュベ
ートした。次いで、この葉切片を、１.６％ グルコー
ス、５mg／l ＮＡＡ、０.１mg／l ＢＡＰ、５００mg／l
Ｃlaforan、およびそれぞれの選択マーカーを含むＭＳ
培地において、光に１６時間暴露して８日間インキュベ
ートした。この葉切片を、１.６％ グルコース、２.０m
g／l ゼアチンリボシド、０.０２mg／l ＮＡＡ、０.０
２mg／l ＧＡ３[ギベリリン酸(giberrilinic acid)]、
および５００mg／l Ｃlaforanを含むＭＳプレートに移
した。１４日間インキュベートした後、この葉切片を新
しいプレートに移した。最初のカルスが約６〜７週間後
に現れた。現れた新芽を、３％ スクロースと０.５mg／
ml カルベニシリンを含むＭＳ培地を入れた２５０mlの
ガラス管に移した。最初の根は約１４日後に観察され
た。次いで、この植物を適当な条件下、温室中で栽培し
た。
【００５０】２-１-３．トマト植物の形質転換を、実質
的に上記２-１-２に記載した方法に従って行なった。
【００５１】２-１-４．得られた植物から、常法を用い
てＤＮＡ[Dellaportaら、1983年]およびＲＮＡ[Goodall
ら、1990年；ChomczynskiおよびSacchi、1987年]を単離
した。ＤＮＡの分析(サザーンブロット)は移転した遺伝
子の無欠性と量を測定するのに有用であり、ＲＮＡの分
析[VankanおよびFilipowics、1988年；GoodallおよびFi
lipowics、1989年；Steineckeら、1992年に従うＲＮア
ーゼ保護]は転写体の量を測定するのに有用である(後記
の３項を参照)。
【００５２】２-２．プロトプラストの単離およびＰＥ
Ｇ媒介の形質転換 滅菌培養物からの４〜８週令のNicotiana tabacum ＳＲ
１の葉を切断し、蒸留水で清浄にし、０.０５％ ＳＤＳ
溶液中に置いて細菌汚染を避けた。滅菌水で２回洗浄す
ることによりＳＤＳを除去した。この葉を、Ｋ３培地
[５００mg／l Claforan、１mg／l ＮＡＡ、０.２mg／l
カイネチン]中で１０分間平衡化した。中央脈を除去
し、葉を１〜２cm2片に切断した。葉肉プロトプラスト
を単離するために、この葉片をセルラーゼおよびマゼロ
チームを含む酵素溶液(３０ml；Ｋ３培地中に１.５％
セルラーゼおよび０.５％ マゼロチーム)を含む１Ｌの
滅菌ビンに入れ、１０分間穏やかな真空のもとに置い
た。２７℃の暗所で１６時間インキュベートした後、こ
の調製物を７５rpmで３０分間撹拌した。このプロトプ
ラスト浮遊液を２５０および１００μmの孔サイズを有
する鋼製ふるいに通し、濾液を１２mlの遠心管に配分
し、Ｈettich遠心機 Ｕniversal ２Ｓ中、６５０rpmで
５分間遠心した。沈澱を含む低部の相を１００μmのガ
ラス製毛細管で抜き取り、プロトプラストをＫ３培地
(１０ml)で洗浄し、さらに遠心(上記を参照)した後に培
地を排出した。次いで、プロトプラストをＷ５培地[１
５４mＭ ＮaＣl、１２５mＭ ＣaＣl2ｘＨ2Ｏ、５mＭ グ
ルコース、５mＭ ＫＣl、pＨ５.６]に加え、Ｆuchs-Ｒo
senthalカウンターで計数し、Ｗ５培地中で３０分間放
置した。６５０rpmで５分間遠心することによってプロ
トプラストを分離し、沈澱をＭaＭg溶液[４５０mＭ マ
ンニトール、１５mＭ ＭgＣl2、０.１％ ＭＥＳ、pＨ
５.６]に懸濁させ、その密度を１〜３ｘ１０6プロトプ
ラスト／mlに調節した。次に、このプロトプラストを直
ちにトランスフェクションすることができるし、また、
４時間まで冷蔵庫で維持することができる。
【００５３】形質転換のために、このプロトプラストを
間欠的な撹拌のもと熱水浴中で４５℃の熱ショックを５
分間かけ、次いで直ちに氷／水中、４５秒間で室温まで
冷却した。次いで、プロトプラスト浮遊液(０.３５mlづ
つ)を１０mlの遠心管に配分し、ＤＮＡ溶液を５０μl容
量で加えた。１０分後に、ＰＥＧ溶液[１００mＭ Ｃa
(ＮＯ3)2ｘ４Ｈ2Ｏ、４００mＭ マンニトール、４０％
ＰＥＧ４０００、pＨ７〜９](０.３５ml)を滴下した。
さらに２０分後(その間、調製物を５分毎に撹拌する)、
このトランスフェクション調製物をペトリ皿に移した。
Ｋ３培地(４ml)を滴下し、プロトプラストを暗所で６〜
４８時間、２７℃で培養した。このインキュベートの
後、プロトプラストを洗浄用の海水を満たした１２mlの
遠心管に入れ、６５０rpmで３分間遠心した。この上清
を１mlを除いて除去し、プロトプラストを再懸濁し、Ｅ
ppendorfバイアルに移した。１３,０００rpmで１分間遠
心(Biofuge)して上清を注意深く除いた後、プロトプラ
ストをそれぞれの抽出緩衝液に加えた。
【００５４】上記の方法に従って調製したプロトプラス
トに、例えば、ＴＳＷＶウイルスまたはその一部を導入
することができた。対応して処理したプロトプラストに
おいて、ウイルスＲＮＡの複製および例えばベクターに
よってプロトプラスト中に導入した本発明に係るＲＮＡ
分子の阻害の有効性を証明することができた。これらの
結果は、この初期の段階で既にウイルス複製の阻害を観
察しえたことを示している(下記３項をも参照)。
【００５５】３．ＲＮＡ分析 ３-１．プロトプラストからのＲＮＡの抽出[Steinecke
ら、1992年] 本発明の被形質転換プロトプラストの転写されたＲＮＡ
分子によるウイルス複製の阻害またはウイルスＲＮＡの
切断を、下記の方法の助けを借りて証明した。この方法
[Goodallら、1990年；ChomczynskiおよびSacchi、1987
年に従う]は、６ｘ１０5のプロトプラストから５〜２５
μgＲＮＡの収量を与える。遠心の後に、単一の形質転
換のプロトプラストを、Ｅppendorfバイアル中で溶液Ｄ
[４Ｍ グアニジン チオシアネート、２５mＭ クエン酸
ナトリウム(pＨ７.０)、０.５％ サルコシル(sarkosy
l)、０.１Ｍ ２−メルカプトエタノール](０.４ml)を用
いて激しく撹拌することにより溶解した。２Ｍ 酢酸ナ
トリウム(pＨ４.０)(４０μl)、フェノール(４００μl)
およびクロロホルム／イソアミルアルコール(８０μl)
を加え、調製物全体を十分に混合し、氷上で１５分間イ
ンキュベートした。これを４℃および１３,０００rpm(B
iofuge)で２０分間遠心し、水性の上清をイソプロパノ
ール(４００μl)を入れた新しいＥppendorfバイアルに
移し、ＲＮＡを２０℃で１５分間沈澱させた。４℃およ
び１３,０００rpm(Biofuge)で１５分間遠心した後、沈
澱を短時間乾燥し、次いで溶液Ｄ(０.３ml)に加え、等
容量のイソプロパノールと混合し、−２０℃で１５分間
沈澱させた。遠心した後、沈澱を７５％ エタノール(２
００ml)で洗浄し、空気中で短時間乾燥し、脱イオン化
ホルムアミド(６μl)を含むＤＥＰＣ処理した水(５０m
l)に溶解した。
【００５６】この溶解したＲＮＡに、１０ｘＤＮアーゼ
緩衝液[１００mＭトリス-ＨＣl(pＨ８.０)、１００mＭ
ＭgＣl2](６ml)、１０Ｕ／μl ＲＮアジン(１μl)およ
び１Ｕ／μl ＲＮアーゼ不含のＤＮアーゼ(１μl)を加
えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、ＴＥ緩
衝液(１００μl)およびフェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール(１６０μl)を加え、十分に混合
し、室温および１３,０００rpm(Biofuge)で５分間遠心
した。水相を新しいＥppendorfバイアルに移し、ＲＮＡ
をエタノールで沈澱させた。この沈澱をＤＥＰＣ処理し
た水(５０ml)に溶解した。
【００５７】３-２．ＲＮアーゼ保護試験 ＲＮアーゼ保護試験[VankanおよびFilipowicz、1988
年；GoodallおよびFilipowicz；Steineckeら]は、細胞
の全ＲＮＡ中のＲＮＡ種の検出および定量に対して極め
て感度の高い方法である。分析しようとする標的ＲＮＡ
に大部分が相補性である放射活性ラベルしたＲＮＡプロ
ーブを合成する。
【００５８】全ての調製物に対して、２ｘ１０4〜１ｘ
１０5cpmの32Ｐまたは35Ｓラベルしたアンチセンスプロ
ーブと１〜５μgの全ＲＮＡを、Ｅppendorfバイアル
中、３００mＭの酢酸ナトリウムと２.５倍容量のエタノ
ールの存在下に−７０℃で１５分間沈澱させた。次い
で、この沈澱を、Ｅppendorf挿入体を有するＳorvall
ＳＳ３４ローター中、４℃および１１,０００rpmで１５
分間遠心した。この上清を注意深く除去した後、それぞ
れの沈澱を、短く撹拌および遠心することにより、溶液
Ａ[８０％ 脱イオン化ホルムアミド、４０mＭ ＰＩＰＥ
Ｓ(pＨ６.４)、４００mＭ 酢酸ナトリウム(pＨ６.４)、
１mＭ ＥＤＴＡ](２０μl)に加えた。この反応混合物を
９０℃で４分間変性させ、短時間遠心し、加熱ブロック
中にて４５〜４８℃で一晩インキュベートした。
【００５９】ハイブリダイゼーションの後、反応混合物
を短時間遠心し、５０Ｕ／ml ＲＮアーゼＴ2およびＲＮ
アーゼ制限溶液Ｒ[５０Ｕ／ml ＲＮアーゼＡ、１０,０
００Ｕ／ml ＲＮアーゼＴ1]の１／５０希釈液(２００μ
l)を加え、ＲＮアーゼ処理を行なった(Vankanの方法に
従う)。短時間撹拌して遠心(Biofuge)した後、この調製
物を３７℃で４０分間インキュベートした。溶液Ｄ２
(２０％ ＳＤＳ)を等容量の溶液Ｄ１(１０mg／ml プロ
テイナーゼＫ)と混合し、それぞれ２０mlを各調製物に
加え、さらに３７℃で１５分間インキュベートした。こ
の混合物を、フェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコール(２５０μl)を入れた新しいＥppendorfバイア
ルに入れた。徹底的に混合した後、これを５分間遠心
し、その上清を９６％ エタノール(６２５μl)を入れた
新しいＥppendorfバイアルに移した。この反応混合物を
短時間撹拌し、−７０℃で１５分間沈澱させ、Ｅppendo
rf挿入体を有するＳorvall ＳＳ３４ローター中、１１,
０００rpmおよび４℃で１５分間遠心した。この上清を
注意深く除去し、沈澱を１５分間乾燥し、溶液Ｅ[８０
％ ホルムアミド、０.１％ キシレンシアノール、０.１
％ ブロモフェノールブルー、２mＭ ＥＤＴＡ](８ml)に
加えた。この調製物を９０℃で４分間変性し、遠心し、
５〜９％ポリアクリルアミドゲル上にて２０mＡで２時
間分離した。このゲルを３ＭＭ紙に移し、サラン・フォ
イルで覆いをし、乾燥した。増強スクリーン(Rapidscre
en, Kodak)を用いて−７０℃でオートラジオグラフィー
を行なった。
【００６０】ＲＮＡの分析により、本発明に係るＲＮＡ
分子で同時トランスフェクションしたプロトプラスト中
のウイルスＲＮＡの量が、モック(模造品)−感染させた
プロトプラスト中の量よりもかなり低いことがわかっ
た。
【００６１】４．トランスジェニック植物のＴＳＷＶ耐
性を試験するための方法 ４-１．植物の繁殖 トランスジェニック植物の種子をＦloraＤur(Ｂ型)栽培
基層(Floragard GmbH)に蒔き、温室条件のもとで２０〜
２５℃に置いた。子葉が現れた後(約２週間)、胚をＦlo
raＤur(Ｂ型)栽培基層の移植トレイに移植し、３〜４週
間栽培した。次いで、若い植物を１０cm直径のポットに
植え、０.２％ Ｗuxal溶液(Aglukon)を１週間に２回与
えた(８／８／６)。
【００６２】４-２．植物の接種 ３週間前にＴＳＷＶ単離体Ｌ３(ＤＳＭ Ｎo.ＰＶ０１８
２)に感染させたタバコ植物(Nicotiana rustica L.)か
ら、３gの葉物質を明瞭なウイルス症状を示す１次感染
させた葉から集め、乳鉢中の標準緩衝液[０.２％ ポリ
ビニルピロリドン(Ｍw１００００)および０.２％(w／v)
Ｎa2ＳＯ3を含む０.１Ｍ Ｎa−Ｋ リン酸緩衝液(pＨ
７.０)](３０ml)中でホモジナイズした。１：２５希釈
液を標準緩衝液で調製し、８〜１０週の試験植物のそれ
ぞれの３枚の葉に葉あたり０.１mlを、葉を綿の先端で
こすることによって機械的に塗布した。この試験植物は
予め研磨剤(Ｃarborundum ６００メッシュ)を噴霧して
おき、接種後に水道水ですすいだ。
【００６３】４-３．植物の評価、ＥＬＩＳＡと評価 植物における症状の出現を、１４日間にわたる接種後の
５日目に、評価法を用いて視覚により評価した。 段階０＝症状なし； 段階１＝穏やかな症状、葉上の環状の斑点(壊死)； 段階２＝強い症状、黄変脈状、モザイク状の壊疽症状。 評価の値から、平均値を決定し、対照植物の値と比較し
た。
【００６４】植物の耐性をさらに定量するために、３重
の抗体サンドイッチ(ＴＡＳ)ＥＬＩＳＡ法を用いてＴＳ
ＷＶ抗原の量を測定した[CasperおよびMeyer、1981
年]。Ｇreiner微量滴定プレート(655001型)を、ウエル
あたり０.１mlのポリクローナル抗血清(ＤＳＭ Ｎo.Ａ
Ｓ-０１０５、２μg／l)で被覆した。試験植物の圧搾液
を、１次および２次感染させた葉から、標準ＥＬＩＳＡ
緩衝液を用いて１：３０および１：５００の希釈で調製
した。各プレートの３つのウエルに全ての試料(０.１m
l)を満たし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ
Ｔweenによる３回の洗浄の後、２種類のモノクローナル
抗体４Ｆ２および２Ｂ６[Adamら、1991年]の１：１,０
００希釈液をウエルあたり０.１ml加え、３７℃で３時
間インキュベートした。ＰＢＳ Ｔweenによる３回の洗
浄の後、ウサギ抗-マウスＩgＧコンジュゲート[DAKOPAT
TS, No.D314]の１：１,０００希釈液をウエルあたり０.
１ml加え、３７℃で３時間インキュベートした。ＰＢＳ
Ｔweenによる３回の洗浄の後、１mg／mlの基質 リン酸
p-ニトロフェニルを加え、３０分後および１時間後に光
度計で４０５nmでの吸光を測定した。平均の吸光値を各
吸光値から求め、対照の値と比較した。これらの結果か
ら、トランスジェニック植物が全くないかまたは穏やか
な症状のみを示すが、一方、対照の植物は強い症状を示
すことがわかった。さらに、トランスジェニック植物中
のＴＳＷＶ抗原量が対照植物中の抗原量に比べてかなり
低いことが明らかになった。
【００６５】５．ＲＮＡ分子ＲＺ６またはＲＺ７を用い
た動物細胞中のＨＢＶまたはＨＣＶ複製の阻害 ５-１．ＲＺ６またはＲＺ７を含有するベクターpＣＤＮ
ＡＩneoによるＨＢＶまたはＨＣＶ被感染動物細胞のト
ランスフェクション 所望のリボザイムＲＺ６またはＲＺ７(図６または図７)
をコードする相補性のオリゴヌクレオチドを１-１項の
記載のように調製し、ベクターpＣＤＮＡＩneo(company
in vitro-Gen)中に機能的にクローン化した。ＲＺ６を
含むベクター構築物pＲＺ６を用いて肝腫瘍セルライン
ＨepＧ２.２１５[Sellsら、1987年]をトランスフェクシ
ョンした。このセルラインは完全なＨＢＶゲノムを発現
した。ＲＺ７を含むベクター構築物pＲＺ７を用いて単
球をトランスフェクションした。この単球は適当に刺激
したときにＨＣＶゲノムを発現した。
【００６６】５-２．ウイルス複製の阻害の検定 pＲＺ６でトランスフェクションした肝腫瘍細胞のＨＢ
Ｖ-ＲＮＡおよびＨＢＶ-ＤＮＡ含量を検定し、そして、
当分野で周知のハイブリダイゼーション法および３-２
項に記載したＲＮアーゼ保護試験を用いてＨＢＶの複製
中間体を分析した。さらに、ＨＢＶ抗原の量をＥＬＩＳ
Ａ試験(Behring)で測定した。また、pＲＺ７でトランス
フェクションした単球のＨＣＶ-ＲＮＡ含量を検定し、
そしてＨＣＶの複製中間体を上記のように分析した。こ
れらの結果から、pＲＺ６トランスフェクションされた
肝腫瘍細胞およびpＲＺ７トランスフェクションされた
単球の両方において、対応する対照細胞と比較してＨＢ
ＶまたはＨＣＶの複製のかなりの阻害が観察できること
がわかった。pＲＺ７でトランスフェクションされた肝
腫瘍細胞についての結果は、電子顕微鏡によるＨＣＶ粒
子(「Dane粒子」)の培養上清の別の実験で確認された。
【００６７】参照文献 本明細書中で引用した文献を以下に挙げる。 ・Abrahamsら, Nucleic Acids Res. 18 (1990), 3035-3
044 ・Adamら，Annals of Applied Biology (1991), 87-104 ・Beachy，"ウイルス感染に対する耐性を付与するため
の植物の形質転換"，"植物の改良における遺伝子操作I
I"中，Plenum Press, New York, 1990 ・ChomzynskiおよびSacchi，Anal.Bioch. 162 (1987),
156-159 ・Dellaportaら, Plant Mol.Biol.Rep. 1 (1983), 19-2
1 ・CottenおよびBirnstiel, EMBO J. 8 (1989), 3861-38
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伝子発現"，"微生物学および免疫学における最近のトピ
ックス"中，Vol.169, 91-141, Springer Verlag,Berlin
Heidelberg 1991 ・Frommら，Nature 319 (1986), 791-793 ・de Haanら，J.Gen.Virology 70 (1989), 3469-3473 ・Goodallら，Meth. in Enzym. 181 (1990), 148-161 ・GoodallおよびFilipowicz, Cell 58 (1989),473-483 ・de Haanら，J.Gen.Virology 7 (1990), 1001-1007 ・Hemenwayら, EMBO J. 7 (1988), 1273-1280 ・Herrera-Estrellaら, Nature 303 (1983), 209-213 ・IzantおよびWeintraub, Cell 36 (1984), 1007-1015 ・KonczおよびSchell, Mol.Gen.Genet. 204 (1986), 33
8-396 ・Kormelinkら, Virology 181 (1991), 459-468 ・van der Krolら, Biotechniques 6 (1988), 958-976 ・Maissら, J.Gen.Virol. 72 (1991), 461-464 ・NagyおよびMaliga, Z.Pflanzenphysiol. 78 (1975),
453-455 ・NassuthおよびBol, Virology 124 (1983), 75-85 ・PalukaitisおよびZaitlin, "植物ウイルスおよびウイ
ロイドによって示される「交差-保護」の現象を説明す
るためのモデル", "植物微生物の相互作用、分子および
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-6952 ・Rezaianら, Plant Mol.Biol. 11 (1988), 463-471 ・Sellsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 (1987), 4641-
4646 ・Steineckeら, EMBO J. 11 (1992), 1525-1530 ・Symons (1989), TIBS 14 (1989), 445-450 ・Vankanら, Nucleic Acid Res. 16 (1988), 10415-104
30 ・Zambryskiら, EMBO J. 2 (1983), 2143-2150
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＴＳＷＶ基質ＲＮＡ分子の一部、ならびに第
１の選択したＴＳＷＶ−ＧＵＣ部位(複製中間体)に特異
的なリボザイムの相補性および保存領域を示す模式図で
ある。
【図２】 ＴＳＷＶ基質ＲＮＡ分子の一部、ならびに第
２の選択したＴＳＷＶ−ＧＵＣ部位(複製中間体)に特異
的なリボザイムの相補性および保存領域を示す模式図で
ある。
【図３】 本発明に係るアンチセンスＲＮＡ分子(ＡＳ
３)を示す模式図である。
【図４】 本発明に係るアンチセンスＲＮＡ分子(ＡＳ
４)を示す模式図である。
【図５】 ＴＳＷＶ複製中間体のどの部位に上記のリボ
ザイムＲＺ２およびＲＺ３ならびに上記のアンチセンス
ＲＮＡ分子ＡＳ３およびＡＳ４が相補性であるかを示す
模式図である。
【図６】 ＨＢＶ基質ＲＮＡ分子の一部、ならびに選択
したＨＢＶ−ＧＵＣ部位(複製中間体)に特異的なリボザ
イムの相補性領域を示す模式図である。
【図７】 ＨＣＶ基質ＲＮＡ分子の一部、ならびに選択
したＨＣＶ−ＧＵＣ部位(複製中間体)に特異的なリボザ
イムの相補性領域を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ０１Ｋ 67/027 9123−2Ｂ Ａ０１Ｎ 63/02 8517−4Ｈ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＹ 8314−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 7/01 15/05 15/40 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 7/00 (71)出願人 390023607 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト ＢＡＹＥＲ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳ ＣＨＡＦＴ ドイツ連邦共和国51368 レーヴァークー ゼン１番バイエルヴェルク (71)出願人 593032905 ヘキスト・アクチエンゲゼルシャフト Ｈｏｅｃｈｓｔ ＡＧ ドイツ連邦共和国6230フランクフルト／マ イン80、ペー・オー・ボックス800320番 (72)発明者 ペーター・ロス ドイツ連邦共和国4000デュッセルドルフ、 クリーヴェーク30番 (72)発明者 ペーター・シュライヤー ドイツ連邦共和国5000ケルン、ダッセルシ ュトラーセ16番 (72)発明者 エトガル・マイス ドイツ連邦共和国3300ブラウンシュヴァイ ク、メッセヴェーク11−12番 ビオロギシ ェ・ブンデザンシュタルト内 (72)発明者 ルドルフ・シュナイダー ドイツ連邦共和国6230フランクフルト／マ イン80、ペー・オー・ボックス800320番 ヘキスト・アクチエンゲゼルシャフト内

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の特徴を有するＲＮＡ分子： (a)ウイルスＲＮＡ複製中間体の少なくとも一部に相補
    性である配列を含有すること； (b)細胞内でウイルスＲＮＡ複製中間体と安定な結合を
    形成することができること； (c)細胞内条件のもとで結合に利用可能なウイルスＲＮ
    Ａ複製中間体の一部に結合すること；および (d)ウイルスＲＮＡ複製中間体への安定な結合がウイル
    スの増殖サイクルを阻害すること。
  2. 【請求項２】 ポリ(Ａ)配列をさらに保持する請求項１
    に記載のＲＮＡ分子。
  3. 【請求項３】 アンチセンスＲＮＡである請求項１また
    は２に記載のＲＮＡ分子。
  4. 【請求項４】 アンチセンスＲＮＡがウイルスＲＮＡ複
    製中間体のオープン・リーディング・フレームに結合す
    る請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
  5. 【請求項５】 アンチセンスＲＮＡがウイルスＲＮＡ複
    製中間体のオープン・リーディング・フレームに相補性
    であるＲＮＡ配列に結合する請求項１〜３のいずれかに
    記載のＲＮＡ分子。
  6. 【請求項６】 リボザイム活性を示す請求項１〜５のい
    ずれかに記載のＲＮＡ分子。
  7. 【請求項７】 配列「ＧＵＸ」(ここで、Ｘは塩基Ｃ、
    ＵまたはＡを有するヌクレオチドを表す)を含むウイル
    スＲＮＡ複製中間体中の配列に結合する請求項６に記載
    のＲＮＡ分子。
  8. 【請求項８】 ウイルスＲＮＡ複製中間体が動物または
    植物ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに由来する請求項１〜
    ７のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
  9. 【請求項９】 植物ＲＮＡウイルスがＴＳＷＶ(トマト
    ・スポッテッド・ウイルトウイルス)である請求項８に
    記載のＲＮＡ分子。
  10. 【請求項１０】 図１および図２に示したＴＳＷＶリボ
    ザイム配列、図３に示したＴＳＷＶ−ＮＳ5アンチセン
    ス配列、または図４に示したＴＳＷＶ−Ｎアンチセンス
    配列のいずれかを含有する請求項９に記載のＲＮＡ分
    子。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれかに記載のＲ
    ＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列。
  12. 【請求項１２】 次の特徴を有する遺伝子： (a)所望の宿主細胞において転写を制御するのに適した
    プロモーターを含有すること；および (b)請求項１１に記載のＤＮＡ配列を含有しているこ
    と。
  13. 【請求項１３】 さらに次の特徴の少なくとも１つを含
    有する請求項１２に記載の遺伝子： (c)転写終止配列(ＴＴＳ)；および (d)ポリアデニル化部位。
  14. 【請求項１４】 キメラ遺伝子である請求項１２または
    １３に記載の遺伝子。
  15. 【請求項１５】 請求項１１に記載のＤＮＡ配列、請求
    項１２もしくは１３に記載の遺伝子、または請求項１４
    に記載のキメラ遺伝子を含有するベクター。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載のベクターを含有す
    る宿主生物。
  17. 【請求項１７】 微生物、植物または動物細胞である請
    求項１６に記載の宿主生物。
  18. 【請求項１８】 ゲノム中に、請求項１１に記載のＤＮ
    Ａ配列、請求項１２もしくは１３に記載の遺伝子、また
    は請求項１４に記載のキメラ遺伝子を保持するウイルス
    耐性の宿主生物。
  19. 【請求項１９】 微生物、植物または動物細胞である請
    求項１８に記載のウイルス耐性の宿主生物。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の植物細胞から再生
    されたウイルス耐性のトランスジェニック植物およびそ
    のウイルス耐性の子孫。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載のウイルス耐性植物
    の繁殖物質。
  22. 【請求項２２】 請求項１１に記載のＤＮＡ配列、請求
    項１２もしくは１３に記載の遺伝子、請求項１４に記載
    のキメラ遺伝子、または請求項１５に記載のベクターを
    含有するウイルス耐性のトランスジェニック宿主生物を
    調製するためのキット。
  23. 【請求項２３】 ウイルス耐性の宿主生物が植物細胞、
    植物または動物細胞である請求項２２に記載のキット。
  24. 【請求項２４】 請求項１〜１０のいずれかに記載のＲ
    ＮＡ分子、請求項１１に記載のＤＮＡ配列、請求項１２
    もしくは１３に記載の遺伝子、請求項１４に記載のキメ
    ラ遺伝子、または請求項１５に記載のベクターを含有す
    るウイルス感染の治療剤。
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