JPH09504701A

JPH09504701A - 塩基を修飾した酵素的核酸

Info

Publication number: JPH09504701A
Application number: JP7513927A
Authority: JP
Inventors: アスマン，ナシム; ベイジェルマン，レオニド; マクスウィゲン，ジェームズ・エイ
Original assignee: リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1993-11-08
Filing date: 1994-11-07
Publication date: 1997-05-13
Also published as: EP0728204A1; US20010006801A1; CA2176035A1; WO1995013378A1; AU687479B2; AU1090495A; US6528639B2; US20030166896A1

Abstract

(57)【要約】リボザイムの基質結合アームまたはその触媒的コア中に修飾塩基を取り込ませることにより、活性のより高いリボザイムを製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】塩基を修飾した酵素的核酸発明の背景本出願は、１９９２年１０月１５日に出願された米国特許出願第０７／９６３，３２２号、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，”ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＲｉｂｏｚｙｍｅＡｃｔｉｖｉｔｙ”の一部継続出願であり、この内容のすべてを本明細書の一部としてここに引用する。本発明は、修飾されたヌクレオチド塩基配列を有する酵素的ＲＮＡ分子すなわちリボザイムに関する。以下は酵素的ＲＮＡ分子すなわちリボザイムの発見の歴史および活性の簡単な記載である。この歴史は完全であることを意味するものではなく、以下の発明の理解のためにのみ提供される。この概要は、以下に記載される研究が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。１９７０年代までは、すべての遺伝子はそれがコードする蛋白質の直接的一次的表示であると考えられていた。この単純な観点は、すべての遺伝子がチッカーテープのメッセージのようなものであること、すなわち、翻訳においてＤＮＡの「文字」のそれぞれのトリプレットが１つの蛋白質の「単語」を表示することを意味していた。蛋白質合成は、まず遺伝子をＤＮＡからＲＮＡへ転写し（文字から文字へ）、次にＲＮＡを蛋白質に翻訳する（１度に３文字）ことにより生ずる。１９７０年代の半ばに、いくつかの遺伝子はそれがコードする蛋白質の正確な一次的表示ではないことが発見された。これらの遺伝子は、コーディング配列中の分断物を含み、これは蛋白質に翻訳される前にＲＮＡから除去、すなわち「スプライスアウト」されることが見いだされた。コーディング配列中のこれらの分断物は、介在配列（またはイントロン）と名付けられ、ＲＮＡからこれらを除去するプロセスは「スプライシング」と称された。ＲＮＡからのイントロンの除去については、少なくとも３つの異なる機構が発見されている。このうち２つのスプライシング機構には、多様な蛋白質因子の結合が関与しており、これは次に、ＲＮＡを正しく切断し、かつ連結するように作用する。第３の機構には、イントロン自身によるＲＮＡの切断および連結が関与しており、これが触媒的ＲＮＡ分子の最初の発見である。Ｃｅｃｈおよび同僚は、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａと呼ばれる単細胞淡水生物において、ＲＮＡスプライシングがどのように行われるかを理解しようと試みていた。Ｃｅｃｈは、介在配列ＲＮＡがそれ自身のスプライシング因子として働いており、それ自身を周囲のＲＮＡから切り出すことを証明した。１９８０年代初めの継続研究により、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａのイントロンの複雑な構造が明らかにされ、自己スプライシングが生ずる機構が解読された。多くの研究グループの助力により、切断されスプライシングされるＲＮＡの部分を結び合わせるためには、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａのイントロンの特異的折り畳みが重要であることが示された。スプライシングが完了した後であっても、放出されたイントロンはその触媒的構造を保持する。したがって、放出されたイントロンは、それ自身に対してさらに別の開裂およびスプライシング反応を実施する（イントロン環を形成する）ことが可能である。１９８６年までには、Ｃｅｃｈは、短い形態のＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａイントロンが、他のＲＮＡ断片に対して種々の切断および連結反応を行いうることを示すことができた。この証明は、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａイントロンが真の酵素として作用しうることを立証した：（ｉ）それぞれのイントロン分子は、多くの基質分子を切断することが可能であるが、イントロン分子は変化しない、および（ii）反応は、イントロンがＲＮＡを認識しそれに結合することを可能にするユニーク配列（ＣＵＣＵ）を含むＲＮＡ分子に特異的である。ＺａｕｇおよびＣｅｃｈは、酵素様の特性を有する任意のリボ核酸分子を記述するために、用語「リボザイム」を造り出した。また、１９８６年に、Ｃｅｃｈは、リボザイム自身の中の配列を変更することにより、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａリボザイムにより認識されるＲＮＡ基質配列を変更しうることを示した。この性質により、他のＲＮＡ配列を開裂するために個々に設計された多くの部位特異的リボザイムが開発された。Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａイントロンは、イントロンの大きなクラスであるグループＩイントロンとして現在認識されているイントロンのうち最もよく研究されたものである。いくつかの配列要素を含む全体的な折り畳み構造は、グループＩイントロンの間で保存されており、スプライシングの一般的機構も保存されている。Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａイントロンと同様に、このクラスのいくつかのメンバーは触媒的（すなわちイントロンそれ自身が自己スプライシング反応を行うことができる）である。他のグループＩイントロンは、おそらくはイントロンをその活性型構造に折り畳み、それを維持するために、追加の因子（蛋白質）を必要とする。リボヌクレアーゼＰ（ＲＮＡｓｅＰ）は、ＲＮＡおよび蛋白質成分の両方を含む酵素であり、末端の一方の過剰のＲＮＡを取り去ることにより前駆体ｔＲＮＡ分子を最終的形態に変換する働きをする。ＲＮａｓｅＰ活性は、試験したすべての生物において見いだされている。ＳｉｄｎｅｙＡｌｔｍａｎおよび同僚は、ＲＮＡｓｅＰのＲＮＡ成分がそのプロセシング活性に必須であることを示した。しかし、彼らはまた、その実験条件においては蛋白質成分もまたプロセシングに必要であることを示した。Ｃｅｃｈによる、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａイントロンによる自己スプライシングの発見の後、ＲＮＡｓｅＰにおける蛋白質およびＲＮＡ成分の両方についての要件が再試験された。１９８３年、ＡｌｔｍａｎおよびＰａｃｅは、ＲＮＡはＲＮａｓｅＰ複合体の酵素的成分であることを示した。このことは、ＲＮＡ分子が真の酵素として作用し、それ自身が何ら変化することなく多くのｔＲＮＡ分子をプロセシングしうることを実証した。ＲＮａｓｅＰＲＮＡの折り畳まれた構造が決定され、異なる種に由来するＲＮＡ間では配列は厳密には保存されていないが、この高次構造は保存されている。ＲＮａｓｅＰ複合体の蛋白質成分は、折り畳まれたＲＮＡをインビボで安定化するのに働くものと考えられる。Ｓｙｍｏｎｓおよび同僚は、既に報告されている他の形の触媒的ＲＮＡとは異なる自己開裂ＲＮＡの２つの例を同定した。Ｓｙｍｏｎｓは、アボカドサンブロッチ（ｓｕｎｂｌｏｔｃｈ）ウイロイド（ＡＳＶ）（植物アボカドに感染するＲＮＡウイルス）の増殖を研究していた。Ｓｙｍｏｎｓは、ＡＳＶＲＮＡの５５ヌクレオチド程度の少ないヌクレオチドが、それ自身を２つの部分に切断するように折り畳まれることが可能であることを示した。これらのＲＮＡインビボ自己開裂は、ウイルス増殖の間に、ＲＮＡを単一ゲノムの長さの切片に切断する働きをすると考えられる。Ｓｙｍｏｎｓは、ＡＳＶからの最小触媒配列における変異が、多くの他の植物病原性ＲＮＡにも見いだすことができることを発見した。これらの配列の比較により、多くの保存された（１つのＲＮＡから別のＲＮＡへと変異しない）ヌクレオチドを含む中央ループにより接続される３つのステムおよびループからなる共通の構造的デザインが明らかとなった。この触媒的ＲＮＡの予想二次構造は、研究者にハンマーの頭を思い出させ、したがって、そのように名付けられた。Ｕｈｌｅｎｂｅｃｈは、リボザイムの触媒的領域を基質領域から分離することに成功した。したがって、２つ（または３つ）の小さな合成ＲＮＡからハンマーヘッドリボザイムを組み立てることが可能となった。１９ヌクレオチドの触媒領域および２４ヌクレオチドの基質が、特異的開裂を維持するのに十分であった。多くのハンマーヘッドリボザイムの触媒ドメインは、これまでに、ＵｈｌｅｎｂｅｃｈおよびＳｙｍｏｎｓのグループの両方により、特異的組み立ておよび触媒活性に必要なヌクレオチドの定義ならびに種々の条件下における開裂速度の決定に関して研究されてきた。ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈは、ハンマーヘッドリボザイムのドメインを異なる様式で分割することが可能であることを示した。これを行うことにより、彼らは、必要なほとんどの配列を切断されない鎖中に配置し（リボザイム）、必要なＵＨ（ここでＨはＣ，ＡまたはＵである）のみを切断される鎖中に配置した（基質）。このことにより、より長い「其質認識」配列中に埋め込まれた任意のＵＨＲＮＡ配列を開裂しうる触媒的リボザイムの設計が可能となった。いくつかのこのようなハンマーヘッドリボザイムを用いる、長いｍＲＮＡの予想された様式での特異的開裂は、１９８８年に報告された。１つの植物病原性ＲＮＡ（タバコリングスポットウイルスの（−）鎖から）は、自己開裂を行うが、上述の保存的ハンマーヘッド構造に折り畳まれることはできない。Ｂｒｕｅｎｉｎｇおよびその同僚は、独立して、このＲＮＡの５０ヌクレオチドの触媒的ドメインを同定した。１９９０年、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚは、触媒的ドメインを、多数回ターンオーバーする切断反応において其質およびリボザイムとして作用する２つの部分に分割することに成功した。ハンマーヘッドリボザイムにおけるように、触媒的部分は触媒活性に必要な配列のほとんどを含み、短い配列（この場合はＧＵＣ）のみが標的において必要である。ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚは、このＲＮＡの折り畳まれた構造を、１つのヘアピンからなるものであると記載し、「ヘアピン」リボザイムとの用語を作り出した（Ｂｒｕｅｎｉｎｇおよびその同僚は、このリボザイムモチーフについて「紙ばさみ（ｐａｐｅｒｃｌｉｐ）との用語を使用した）。継続実験により、標的ＲＮＡの結合および開裂機構の両方に関して、ヘアピンとハンマーヘッドリボザイムとの間の類似性が増大することが示唆された。デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）は、そのゲノムが一本鎖ＲＮＡからなるウイルスである。ゲノムＲＮＡおよび相補的なアンチゲノムＲＮＡの両方の中の小さな領域（約８０ヌクレオチド）が、自己開裂を維持するのに十分である。１９９１年、ＢｅｅｎおよびＰｅｒｒｏｔｔａは、ゲノムおよびアンチゲノムＲＮＡの間で保存され、触媒活性に必要なＨＤＶＲＮＡの二次構造を提唱した。ＨＤＶＲＮＡを「リボザイム」部分および「其質」部分に分離することは、最近、Ｂｅｅｎにより達成された。Ｂｅｅｎはまた、ＨＤＶリボザイムのサイズを約６０ヌクレオチドに減少させることに成功した。以下の表は、上で議論したリボザイムの性質のいくつかを掲げたものである。本明細書において用いる場合、用語リボザイムは、一般に、他の別個のＲＮＡ分子をヌクレオチド塩基配列特異的様式で反復開裂しうる酵素的活性を有するＲＮＡ分子（修飾リボザイムまたはデオキシリボヌクレオチドを含んでいてもよい）である。これらの酵素的ＲＮＡ分子は実質的にいかなるＲＮＡ転写産物をも標的としてインビトロで効果的な開裂を達成することができる。Ｋｉｍ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８７，８４：８７８８；ＨａｓｅｌｏｆｆａｎｄＧｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ１９８８，３３４：５８５；Ｃｅｃｈ，ＪＡＭＡ１９８８，２６０：３０３０；ならびにＪｅｆｆｅｒｉｅｓ，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９８９，１７：１３７１。すなわち、この用語は、自己スプライシングＲＮＡ分子とは区別され、他のＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ分子に作用して分子間開裂を生じさせる分子のみに関する。リボザイムは、まず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを開裂させる作用をするＲＮＡの酵素的部分に近接して保持された、リボザイムの標的ＲＮＡ結合部分により行われる。従って、リボザイムは、まず標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対合により標的ＲＮＡに結合し、適正な部位にいったん結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。このような標的ＲＮＡの戦略的開裂により、それがコードする蛋白質の合成を指令する能力を破壊する。リボザイムはそのＲＮＡ標的に結合して開裂させたのち、そのＲＮＡから離脱して他の標的を探し、新たな標的に繰り返し結合して開裂させることができる。リボザイムの酵素的性質は他の技術、例えばアンチセンス技術（この場合は核酸分子が単に核酸標的に結合して、その転写を阻止するだけである）より有利である。療法処置を行うのに必要なリボザイムの有効濃度はアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより低いからである。この利点は、リボザイムが酵素的に作用しうることを反映している。すなわち、１個のリボザイム分子が多数の標的ＲＮＡ分子を開裂しうる。さらにリボザイムは特異性の高い阻害剤であり、その阻害の特異性は結合の塩基対合メカニズムのみでなく、その分子がそれの結合するＲＮＡの発現を阻害するメカニズムにも依存する。すなわち、阻害はＲＮＡ標的の開裂により引き起こされ、従って特異性は非標的ＲＮＡの開裂速度に対する標的ＲＮＡの開裂速度の比率として定義される。この開裂メカニズムは、塩基対合に関与するものとは別の因子に依存する。従って、リボザイムの作用の特異性は同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより大きいと考えられる。「酵素的ＲＮＡ分子」とは、基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する相補性を有し、かつその標的内のＲＮＡを特異的に開裂する作用をする酵素的活性をも有するＲＮＡ分子を意味する。すなわち、酵素的ＲＮＡ分子はＲＮＡを分子間開裂し、このことにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性は、開裂を起こさせるのに十分なほど、標的ＲＮＡに酵素的ＲＮＡ分子をハイブリダイズさせる機能を有する。１００％の相補性が好ましいが、５０−７５％程度の低い相補性もまた本発明において有用である。本発明の好ましい態様においては、酵素的ＲＮＡ分子はハンマーヘッドのモチーフで形成されるが、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、またはＲＮａｓｅＰＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に関連する）のモチーフで形成されてもよい。このようなハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉ，ｅｔａｌ．，ＡｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ１９９２，８：１８３；ヘアピンモチーフの例は、１９８９年９月２０日に出願された、Ｈａｍｐｅｌｅｔａｌ．， ”ＲＮＡＣａｔａｌｙｓｔｆｏｒＣｌｅａｖｉｎｇＳｐｅｃｉｆｉｃＲＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅＳ”（１９８８年９月２０日に出願された米国特許出願第０７／２４７，１００号の一部継続出願）；ＨａｍｐｅｌａｎｄＴｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８９，２８：４９２９およびＨａｍｐｅｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９９０，１８：２９９に記載され；デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａａｎｄＢｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９２，３１：１６；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋｅｄａｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１９８３，３５：８４９；グループＩイントロンの例は、Ｃｅｃｈｅｔａｌ．，米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。これらの具体的なモチーフは本発明を限定するものではなく、当業者は、本発明の酵素的ＲＮＡ分子において重要なすべては、それが１または２以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に対して相補的な特異的基質結合部位を有し、かつその基質結合部位内またはその周囲にその分子にＲＮＡ開裂活性を付与するヌクレオチド配列を有することであることを認識するであろう。本発明は、所望の標的のＲＮＡに対して高い程度の特異性を示す１つのクラスの酵素的開裂剤を設計する方法を提供する。リボザイム分子は、好ましくは、単一のリボザイムを用いて疾患または状態の特異的処置を提供しうるように、標的の高度に保存された配列領域を標的とする。このような酵素的ＲＮＡ分子は、要求にしたがって特定の細胞に外因的に送達することができる。好ましいハンマーヘッドモチーフにおいては、小さいサイズ（４０ヌクレオチド未満、好ましくは３２ヌクレオチドと３６ヌクレオチドの間の長さ）の分子は、他のリボザイムモチーフと比較して治療のコストを低減させることを可能にする。１００ヌクレオチドより大きい長さのリボザイムの合成は、自動化方法を用いては非常に困難であり、そのような分子の治療コストは禁止的である。発現ベクターによるリボザイムの送達は、主として、エクスビボ治療のみを用いて実用可能である。このことはこの方法の用途を限定する。本発明においては、小さいリボザイムモチーフ（例えば、ハンマーヘッド構造のもの）を外因性送達に用いる。これらの分子のこの単純な構造はまた、リボザイムがｍＲＮＡ構造の標的領域に侵入する能力を増加させる。したがって、ハンマーヘッド構造がより長い転写産物に包含される状況とは異なり、リボザイム構造または相補的領域との正しい折り畳みを妨害する非リボザイムフランキング配列は存在しない。Ｅｃｋｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９９０，３４４：５６５；Ｐｉｅｋｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１，２５３：３１４；ＵｓｍａｎａｎｄＣｅｄｅｒｇｒｅｎＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７：３３４；Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７およびＲｏｓｓｉｅｔａｌ．，ＷＯ９１／０３１６２は、酵素的核酸分子の糖部分に対して行うことのできる種々の化学修飾を記載する。以下の関連する技術についての議論は、図５に示す図表にしたがうものであり、図中、ハンマーヘッドリボザイムの種々のヌクレオチドの番号付けが提供される。これは、この図が本願発明に対する先行技術であることまたは議論される技術が本願発明に対する先行技術であることを示すとみなされるものではない。Ｏｄａｉｅｔａｌ．，ＦＥＢＳ１９９０，２６７：１５０は、ハンマーヘッドリボザイムの５位におけるグアノシンのイノシンによる置換は、触媒活性を大きく減少させ、このことは「触媒活性についてのこのグアノシンの２−アミノ基の重要性」を示唆すると述べている。ＦｕａｎｄＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９２，８９：３９８５は、ハンマーヘッドリボザイムの５位におけるグアノシンの２−アミノ基の除去、または５位もしくは８位のいずれかにおける２’−ヒドロキシル基の除去により、減少した開裂効力を有するリボザイムが得られたことを述べている。ＦｕａｎｄＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９２，３１：１０９４１は、ハンマーヘッドリボザイム中のアデノシン残基の７−デアザアデノシンによる置換は、開裂効力の減少を引き起こしうることを述べている。彼らは、「結果は、ハンマーヘッドリボザイム／基質複合体の６位のアデノシンのＮ⁷−窒素は、有効な開裂活性に重要であることを示唆する」と述べている。彼らは、続けて、ハンマーヘッドリボザイムの４量体配列ＧＡＵＧ中に局在する５つの重要な機能的グループが存在することを示している。発明の概要本発明は、ハンマーヘッド、ヘアピンまたはデルタ肝炎ウイルス由来のリボザイムなどのリボザイムの基質結合部位に１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含有させることにより、標的核酸基質に対して増強されたもしくは減少した結合親和性および増強された酵素的活性を有する酵素的ＲＮＡ分子すなわちリボザイムを製造することに関する。本出願人は、リボザイムと基質との間の塩基対形成もしくは水素結合の程度を小さく変化させるだけで、その基質におけるリボザイムの酵素的活性に著しい影響を及ぼしうることを見いだした。すなわち、本出願人は、リボザイムの基質結合アームに沿った水素結合の程度を微妙に変化させることを用いて、リボザイム活性をそのような変更されたヌクレオチドを含まない未変更リボザイムと比較して改良しうることを見いだした。したがって、例えば、グアノシン塩基をイノシンで置き換えて、リボザイムとその基質との間のより弱い相互作用を生じさせることができ、あるいは、ウラシルをブロモウラシル（ＢｒＵ）で置き換えて、アデノシンとの水素結合相互作用を増加させることができる。４つの標準的なリボヌクレオチド塩基の変更の他の例は、図４ａ−ｄに示されており、それぞれの図においてより弱いかまたはより強い水素結合能力が示されている。さらに、本出願人は、いくつかの触媒的コアヌクレオチド中における塩基の修飾が、未修飾分子と比較して酵素的活性を維持または増強することを見いだした。このようなヌクレオチドは、図５において矢印により示される。具体的には、図５を参照すると、ハンマーヘッドリボザイムの触媒的コアの５’から３’方向の好ましい配列は、ＣＵＧＡＵＧＡＧ●ＣＧＡＡＡである。塩基対形成したステムII（図１および５）およびステムＩおよびIIIの認識アームの性質はさまざまである。本発明においては、ハンマーヘッドリボザイムの触媒活性および／またはヌクレアーゼ耐性を維持または増強する、これらの領域における塩基修飾ヌクレオチドの使用が記載される。本発明において有用な塩基置換の例が図６に示されている。好ましい態様においては、シチジン残基を５−アルキルシチジン（例えば５−メチルシチジン、図６、Ｒ＝ＣＨ₃，９）で置換し、ウリジン残基を５−アルキルウリジン（例えばリボチミジン（図６、Ｒ＝ＣＨ₃，４）または５−ハロウリジン（例えば５−ブロモウリジン、図６、Ｘ＝Ｂｒ，１３）または６−アザピリミジン（図６、１７）で置換する。コアまたはステムのいずれかにおいてグアノシンまたはアデノシン残基をジアミノプリン残基（図６、２２）で置換してもよい。ハンマーヘッドリボザイムの、いずれの官能基もマグネシウムの複合体形成または他の機能に重要ではない塩基においては、これらを任意にプリンリボヌクレオチドで置き換えてもよい（図６、２３）。プリン核の化学的取り込みの間に塩基保護基を必要としないため、このことはハンマーヘッドリボザイムの化学合成の複雑性を著しく減少させる。さらに、上述で議論したように、塩基修飾ヌクレオチドを用いて、同様の修飾を有するステムＩおよびIIIにおける認識アームの結合の特異性または強度を増強することができる。一般に、塩基修飾ヌクレオチドを用いて、これらが取り込まれた触媒的核酸のヌクレアーゼ耐性を増強することもできる。上述に引用した技術に記載される糖部分の置換を用いて触媒活性を増強することもできる。したがって、第１の観点においては、本発明は、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチド塩基を含む１つまたはそれ以上の基質結合アームを有する修飾されたリボザイムを特徴とする。また、関連する観点においては、本発明は、１つまたはそれ以上のそのような修飾ヌクレオチド塩基を基質結合アーム中に取り込ませることにより、より活性な（未修飾リボザイムと比較して）修飾リボザイムを製造する方法を特徴とする。本発明は、標準的なアッセイにより測定して、インビトロおよびインビボにおいて増加した酵素的活性を有するリボザイムを提供する。すなわち、リボザイムの速度論的性質は、基質結合アームにおいて適当な修飾塩基を選択することにより増強することができる。本出願人は、リボザイムによる基質への強い結合は特異性を増強するが、これはまた開裂された基質からのリボザイムの分離を阻害するかもしれないことを認識している。したがって、本出願人は、塩基対形成の最適化を達成しうる方法を提供する。具体的には、本発明は、修飾塩基を有し、未修飾の対応するリボザイムの少なくとも１．５倍（好ましくは２または３倍）またはそれより高い酵素的活性を有するリボザイムを特徴とする。本発明はまた、修飾塩基をリボザイムに取り込ませ、より高い酵素的活性を有するものについてスクリーニングすることによる、リボザイムの速度論的活性を最適化する方法を特徴とする。このような選択はインビトロまたはインビボで行うことができる。「酵素的部分」とは、ＲＮＡ基質の開裂に必須の、リボザイムの部分を意味する。「基質結合アーム」とは、リボザイムの基質の部分に相補的な（すなわちそれと塩基対形成しうる）リボザイムの部分を意味する。一般に、このような相補性は１００％であるが、所望によりより低くてもよい。例えば、１４塩基中の１０塩基程度という少ない場合でも塩基対形成をすることができる。このようなアームは、以下に議論するように、一般に図１−３に示される。すなわち、これらのアームは、リボザイムおよび標的ＲＮＡを相補的塩基対形成相互作用を介して一緒にさせることが意図されるリボザイム中の配列を含む。例えば標準的ハンマーヘッドリボザイムのステムＩおよびIII中のリボザイムの配列は、基質結合ドメインを形成する（図１を参照のこと）。「未修飾ヌクレオチド塩基」とは、β−Ｄ−リボーフラノースの１’炭素に結合した、アデニン、シトシン、グアノシン、ウラシルの１つの塩基を意味する。糖はまた、５’炭素へのリン酸結合を含む。これらのヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの３’炭素と次のヌクレオチドの５’炭素との間のホスホジエステルにより結合し、ＲＮＡを形成する。「修飾ヌクレオチド塩基」とは、未修飾ヌクレオチド塩基の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を意味し、これは、水素結合の強度を増加させることまたはそれを減少させること（例えば、上述にイノシンおよびブロモウラシルについて例示したように）のいずれかにより、その塩基がその正常な相補的塩基と水素結合する能力に影響を及ぼす。修飾塩基の他の例としては、図４ａ−ｄに示されるものが挙げられ、複素環誘導体および類似のものを含む他の修飾は当該技術分野においてよく知られている。好ましい態様においては、修飾リボザイムは、ハンマーヘッド、ヘアピンまたはデルタ肝炎ウイルス由来のリボザイムであり、ハンマーヘッドリボザイムは３２と４０の間のヌクレオチド塩基を含む。修飾塩基の選択は、最も好ましくは、選択されたリボザイムの酵素的活性（開裂の速度論を測定するために設計された標準的な速度論アッセイにおいて観察される）を増強させるように、すなわち、修飾塩基を含まない同一のヌクレオチド塩基配列を有するリボザイムと比較してリボザイムによる基質の開裂の速度または程度を増強するように選択される。「ハンマーヘッドリボザイム」とは、図１に示されるように、中央保存配列「コア」（配列の周辺の囲みにより示される）をフランキングする３つのデュープレックスステムからなるリボザイムモチーフを意味する。３つのデュープレックスの任意のものまたはすべては、ステムの中央コアから離れた側の末端に追加のヌクレオチドを結合させることにより、拡張または閉環してもよい。３つのデュープレックスの１つのみが閉環している場合、ハンマーヘッドリボザイムは、基質部分（開裂部位を含むセグメント）とリボザイム部分とに分割することができる。３つのデュープレックスのうち２つが閉環している場合、ハンマーヘッドリボザイムは自己開裂しうる単一の分子からなる。中央コアのヌクレオチド配列は、既知のハンマーヘッド配列の間で保存されている。ほとんどいかなる保存ヌクレオチドで１つの塩基を置き換えても、リボザイム活性は１００倍以上減少する。ステムIIIの下部におけるＡ●Ｕ塩基対はまた、その方向で必要である。Ｕ ●Ａ、Ｇ●ＣまたはＣ●Ｇにより置き換えると、リボザイム活性は１００倍以上減少する。ステムIIIとステムＩとの間の１つのヌクレオチドは、Ｃ、ＡまたはＵであってもよく（しかしＧではない）、依然として活性を維持する。コア領域の外側の配列のほとんどは、デオキシリボヌクレオチドまたは化学的に修飾したヌクレオチドで置換することができ、依然として活性を維持する。コア領域の中における置換は、より限定されている。「ヘアピンリボザイム」とは、図２に示されるように、デュープレックス構造を形成しないと予測される（三次的相互作用には関与するかもしれないが）２対の「ループ」配列により分断される４つのデュープレックスステムからなるリボザイムモチーフを意味する。切断部位における「ループ」の配列は、標的配列については５’−Ｎ↓ＧＵＣ−３’であり、リボザイムについては３’−ＡＧＡＡ −５’であることが必要である。「デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム」とは、図３に示されるように、デュープレックス構造を形成しないと予測される（三次的相互作用には関与するかもしれないが）４つの配列により分断される４つのデュープレックスステムからなるリボザイムモチーフを意味する。ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ（Ｎａｔｕｒｅ１９９１，３５０：４３４）により定義されたように、ＨＤＶリボザイムは１つの「シュードノット」配列（ステムII）を含む。「速度論的アッセイ」または「開裂の速度論」とは、標的ＲＮＡの切断速度を決定する実験を意味する。しばしば、開裂の速度に及ぼすパラメータの影響を決定するために、１つのアッセイから次のアッセイへとリボザイムまたは基質のいずれかの濃度を変化させる一連のアッセイが実施される。「開裂の速度」とは、開裂される標的ＲＮＡの量の時間の関数としての測定値を意味する。第２の態様においては、ハンマーヘッドのコンフィギュレーション、および酵素的活性を維持するかまたは増強する修飾塩基を有する酵素的核酸が提供される。このような核酸はまた、一般に、未修飾核酸よりもヌクレアーゼに対してより高い耐性を有する。この観点において、「修飾塩基」とは、図６に示されるものまたはその均等物を意味する。このような塩基を酵素の触媒的コアにおいて、ならびに基質結合領域において用いることができる。本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい態様の記載および特許請求の範囲から明らかであろう。好ましい態様の記載まず、図面について簡単に記載する。図面図１、２および３は、それぞれ、ハンマーヘッド、ヘアピンおよびＨＤＶリボザイムを図示したものである。図４ａ−ｄは、それぞれアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルについての標準的塩基修飾を図示したものである。それぞれの図面の上列の修飾は、下列のものと比較してより強い塩基対形成能力を有する構造を示す。図５は、位置の番号付を行ったハンマーヘッドリボザイム（Ｈｅｒｔｅｌ，ｅｔａｌ．，ｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９２，２０：３２５２に従う）を図示したものである。触媒的コアおよび基質結合アームにおける特定の置換が示される。図６は、ハンマーヘッドリボザイムの触媒的コアにおいて置換しうる種々のヌクレオチドを図示したものである。図７は、５−メチルシチジンホスホルアミダイトの合成を図示したものである。図８は、５−ブロモウリジンホスホルアミダイトの合成を図示したものである。図９は、６−アザウリジンホスホルアミダイトの合成を図示したものである。図１０は、リボチミジンホスホルアミダイトの合成を図示したものである。図１１は、２，６−ジアミノプリンホスホルアミダイトの合成を図示したものである。修飾リボザイム最大リボザイム活性を生ずるであろうリボザイムとその基質との間の結合自由エネルギーの範囲は狭い。このような結合エネルギーは、基質結合アームにおいて、ＧからＩおよびＵからＢｒＵの置換（または均等な置換）を有するリボザイムを作成することにより最適化することができる。このことにより、標的認識配列、２つの基質結合アームの長さまたはリボザイムの酵素的部分を実際に変化させることなく結合自由エネルギーを操作することが可能となる。自由エネルギー対リボザイム活性の曲線の形状は、それぞれの塩基（またはいくつかの塩基）を修飾するかまたは修飾しない実験からのデータを用いて、リボザイム／基質相互作用のサイズを変化させるという複雑さを伴わずに、容易に決定することができる。このような実験は、最も活性の高いリボザイム構造を示すであろう。結合自由エネルギーの非常に小さい変化（１塩基対相互作用でさえ）がリボザイム活性に大きく影響しうるため、１つまたは２つの修飾のみが必要なようである。したがって、修飾塩基の使用は、最大リボザイム活性を確証するための結合自由エネルギーの「微調整」を可能とする。さらに、そのような塩基の置換（例えばＧの代わりにＩ）は、非標的ＲＮＡの開裂が問題である場合に、より高いレベルの基質特異性を可能とするであろう。方法修飾基質結合アームは、標準的な方法論を用いて合成することができる。例えば、イノシンおよび５−ブロモウラシルのホスホルアミダイトを用いることができる。一般に、ステムＩおよびIIIの長さについて最適化され、ステムＩおよびI IIのリボザイム部分においてＧおよび／またはＵを有する標的部位が選択される（ハンマーヘッドリボザイムにおいて−−他のリボザイムは同様の様式で取り扱うことができる）。修飾リボザイムは、リボザイムの合成の間に、種々のＧおよびＵ残基をそれぞれＩおよびＢｒＵで置き換えることにより作成される。次に、標準的な方法を用いて修飾リボザイムを試験して、速度論パラメータを決定する（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，米国特許出願第０７／８８４，５２１号、１９９２年５月１４日出願、”ＩｍｐｒｏｖｅｄＲｉｂｏｚｙｍｅｓ”を参照されたい。この内容を本明細書の一部としてここに引用する）。リボザイムの結合親和性もまた、標準的な方法、例えばＴ−メルト、ゲル結合、または競合速度論的アッセイを用いて決定することができる。結合親和性およびリボザイム活性を比較することにより、次にリボザイムの最適結合親和性を見いだすことができる。次に、ほとんど同一の結合自由エネルギーを有するが異なる塩基配列を有する、Ｇ、Ｉ、Ｕ、ＢｒＵおよび他の塩基の他の組み合わせを試験して、単なる結合自由エネルギー以外の因子が役割を果たしているか否かを決定することができる。未修飾リボザイムと修飾基質（修飾塩基を含む）を用いてこの種の繰り返し実験を実施して、所望のリボザイム基質結合配列を選択することが好ましい。すなわち、上述したものと逆の実験を実施する。基質は一般にリボザイムより短く、その二次構造を考慮することなく容易に合成することができるため、このような実験はより容易に実施することができる。したがって、いずれの基質がよりよい速度論的結果を与えるかを判定するために、１つのリボザイムを複数の修飾基質に対して試験することができる。好ましい基質がいったん同定されれば、次に、選択された基質を反映するようにリボザイムを修飾して、未修飾基質に対して試験することができる。このような実験により、基質結合アーム中に１つまたはそれ以上の修飾塩基を有し、対応する未修飾リボザイムより高いインビトロおよびインビボでの酵素的活性を有する、本発明の有用なリボザイムが定義されるであろう。このような修飾はまた、インビボにおける酵素的分解に対するリボザイムの耐性を増加させる場合にも有利であろう。実施例以下は、塩基を修飾した触媒的核酸の合成を示す非制限的実施例である。実施例１：塩基修飾ヌクレオチドを含むハンマーヘッドリボザイムの合成用いた合成法は、Ｕｓｍａｎ，Ｎ．，Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｋ．Ｋ．，Ｊｉａｎｇ，Ｍ．Ｙ．，Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，７８４５−７８５４およびＳｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．，Ｆｒａｎｋｌｙｎ，Ｃ．，Ｕｓｍａｎ，Ｎ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８，５４３３−５４４１に記載される、通常のＲＮＡ合成のための方法に従い、慣用的な核酸保護基およびカップリング基、例えば、５’末端においてジメトキシトリチル、および３’末端においてホスホルアミダイト（化合物４、９、１３、１７、２２、２３）を用いる。段階的カップリングの平均収率は．９８％であった。これらの塩基修飾ヌクレオチドは、ハンマーヘッドリボザイムのみならず、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、またはグループ１もしくはグループ２イントロン中に取り込ませることができる。したがって、これらは、任意の核酸構造において置換モチーフとして一般に用いることができる。ハンマーヘッドリボザイムの場合には、以下の特定の置換を用いることができる：図５を参照すると、触媒的コア（囲まれたヌクレオチド）において、ピリミジンＣ３を、図４ｃに示されるシトシン類似体および図６の化合物９で置き換えることができる。図５を参照すると、触媒的コア（囲まれたヌクレオチド）において、ピリミジンＵ４およびＵ７を、図４ｃに示されるシトシン類似体、図４ｄに示されるウリジン類似体、および図６の化合物４、９、１３および１７で置き換えることができる。図５を参照すると、触媒的コア（囲まれたヌクレオチド）において、プリンＧ５、Ｇ８およびＧ１２を、図４ｂに示されるグアニン類似体および図６の化合物２２および２３で置き換えることができる。図５を参照すると、触媒的コア（囲まれたヌクレオチド）において、プリンＡ６、Ａ９、Ａ１３およびＡ１４を、図４ａに示されるアデニン類似体および図６の化合物２２および２３で置き換えることができる。図１および５を参照すると、ステムＩ、IIおよびIIIにおいて、任意のピリミジンを、ステムにおいて塩基対形成が保持される限り、図４ｃおよび４ｄに示されるピリミジン類似体および図６の化合物４、９、１３および１７で置き換えることができる。図１および５を参照すると、ステムＩ、IIおよびIIIにおいて、任意のプリンを、ステムにおいて塩基対形成が保持される限り、図４ａおよび４ｂに示されるプリン類似体、および図６の化合物２２および２３で置き換えることができる。図１および５を参照すると、ループII（図５において／／として示される）において、任意のヌクレオチドを、図４ｃおよび４ｄに示されるピリミジン類似体、図４ａおよび４ｂに示されるプリン類似体および図６の化合物４、９、１３、１７、２２および２３で置き換えることができる。実施例２：リボチミジンホスホルアミダイト４の合成図１０を参照すると、Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９８１，１１４：１２３４にしたがってリボチミジン１を製造し、トリチル化してＤＭＴ誘導体２を得た。２をシリル化して、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ誘導体３を得た。ホスホロアミダイト４は、Ｓｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８：５４３３にしたがって製造した。実施例３：５−メチルシチジンホルホルアミダイト９の合成図７を参照すると、リボチミジン１（４ｇ，１５．５ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２×１００ｍｌ）と共蒸発させ、乾燥ピリジン（１００ｍｌ）に再溶解した。得られた溶液に、４，４’−ＤＭＴ−Ｃｌ（６．３ｇ，１８．６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温に放置した（約２０−２５℃、１６時間）。反応混合物をメタノール（２５ｍｌ）で急冷し、蒸発乾固させた。残渣をクロロホルムと５％炭酸水素ナトリウムとの間に分配した。有機層を５％炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄し、次に硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。乾燥ピリジン（２×５０ｍｌ）とともに共蒸発させることにより残渣をさらに乾燥し、次に乾燥ピリジン（１００ｍｌ）に溶解し、得られた溶液に無水酢酸（４．４ｍｌ，４６．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一夜放置し、次にメタノール（２５ｍｌ）で急冷し、蒸発させ、上述のように後処理した。粗生成物５’−Ｏ− ジメトキシトリチル−２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−リボ−チミジン５を、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン／４５：４５：１０）により精製して、化合物５６．８６ｇ（６８．７％）を帯黄色泡状物として得た。乾燥アセトニトリル１００ｍｌ中のトリアゾール（６．５６ｇ，９５．０４ｍｏｌ）およびオキシ塩化リン（２ｍｌ，２１．２ｍｍｏｌ）の撹拌した氷冷混合物に、トリエチルアミン（１４．７２ｍｌ，１０５．６ｍｍｏｌ）を滴加した。得られた懸濁液に乾燥アセトニトリル５０ｍｌ中のヌクレオシド５（６．８９，１０．５６ｍｍｏｌ）の溶液を滴加し、反応混合物を室温において４時間撹拌した。反応系を濃縮し、クロロホルムに溶解し、炭酸水素ナトリウムの飽和水性溶液および水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させた。ジオキサン（１２０ｍｌ）中の残渣（７．２４ｇ）の溶液に２９％水性ＮＨ₄ＯＨ４０ｍｌを加え、得られた溶液を一夜放置し、次に蒸発乾固させて、粗シチジン誘導体６６．８６ｇを得て、これをさらに精製せずに用いた。遊離糖ヒドロキシルを一時的に保護するために、乾燥ピリジン（１００ｍｌ）中の化合物６（３．５ｇ，６．２５ｍｍｏｌ）の溶液にトリメチルクロロシラン３．９７ｍｌを加えた。次に、反応混合物を塩化イソブチル（０．９８ｍｌ，９．３７５ｍｍｏｌ）で５時間処理した。得られた混合物をメタノール１０ｍｌで急冷し、次に水１０ｍｌを加え、１０分後に２９％水性アンモニアを加え、反応混合物を２時間撹拌し、蒸発乾固させた。得られた残渣を、化合物５について上述したように後処理し、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン／１：３）により精製して、ヌクレオシド７２．３７ｇ（６０％）を得た。乾燥ピリジン中の化合物７（１．３ｇ，２．０６ｍｍｏｌ）の溶液に、硝酸銀０．９７ｇ（５．７２ｍｍｏｌ）を加え、次にＴＨＦ中の塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルの１Ｍ溶液２．８６ｍｌを加えた。反応混合物を８時間放置し、蒸発させ、クロロホルムに溶解した。析出した銀塩を濾別し、反応溶液を５％水性炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ−（ヘキサン：酢酸エチル／４：１）により２’−および３’−異性体を分離して、２’−異性体８０．６２ｇ（４０％）を得た。これをＳｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８：５４３３に記載される一般的方法により、ホスホルアミダイト９に変換した。実施例４：５−ブロモウリジンホスホルアミダイト１３の合成（Ｔａｌｂａｔｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：３５２１−２１，１９９０を参照のこと）図８を参照すると、５−ブロモウリジン１０（１．６１５ｇ，５ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンと共蒸発させて、乾燥ピリジンに再溶解した。得られた溶液に、ＤＭＴ−Ｃｌ２．０３ｇ（６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を一夜放置した。後処理およびシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール／９５：５）による精製の後、ジメトキシトリチル化化合物１１２．５ｇ（８０％）を得た。乾燥ピリジン中の１１（２ｇ）の溶液に、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ１．５等量を加え、２日間おいた。反応混合物を蒸発させ、クロロホルムに溶解し、５％水性炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン／１：２）により精製し、２’−異性体１２１．４ｇ（６０％）を得た。これを、Ｓｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８：５４３３に記載される一般的方法により、ホスホルアミダイト１３に変換した。実施例５：６−アザウリジンホスホルアミダイト１７の合成図９を参照すると、６−アザウリジン（４．９ｇ，２０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２×１００ｍｌ）とともに蒸発させ、乾燥ピリジン（１００ｍｌ）に溶解し、４，４’−ＤＭＴ−Ｃｌ（７．４５ｇ，２２ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で１６時間放置した。反応混合物を乾燥ＭｅＯＨ（５０ｍｌ）で希釈し、蒸発乾固させ、トルエン（２×１００ｍｌ）と共蒸発させ、残渣をＣＨＣｌ₃（５００ｍｌ）に溶解し、５％ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ）およびブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、乾燥し、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃から５％ＥｔＯＨ／ＣＨＣｌ₃の勾配）により精製して、中間体１５１ｇ（９２．２％）を得た。乾燥ＴＨＦ１００ｍｌ中の１５（３．２３ｇ，５．９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＡｇＮＯ₃（７．０８ｍｍｏｌ）および乾燥ピリジン（２．１ｍｌ，４．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、ＡｇＮＯ₃が完全に溶解するまで（約１時間）室温で撹拌した。次に、ＴＨＦ中のＴＢＤＭＳ−Ｃｌの１Ｍ溶液７ｍｌを加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を蒸発乾固させた。得られた残渣をＣＨＣｌ₃（３００ｍｌ）に溶解し、５％ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ）およびブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、乾燥し、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサンからヘキサン：酢酸エチル／１：１の勾配）により精製して、２’−ＴＢＤＭＳ−異性体１６３．７１ｇ（６２％）を得た。これを、Ｓｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８：５４３３に記載される一般的方法により、ホスホルアミダイト１７に変換した。実施例６：２，６−ジアミノプリンホスホルアミダイト２２の合成図１１を参照すると、ホスホルアミダイト２２を、Ｓｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８：５４３３に記載される一般的方法により製造した。具体的には、グアノシン（１１．３２ｇ，４０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンと共蒸留することにより乾燥し、乾燥ピリジンに再溶解した。クロロトリメチルシラン（２６．４ｍｌ，２０８ｍｍｏｌ）を上述の溶液に撹拌しながら加え、反応混合物を一夜撹拌した。得られたパーシリル化グアノシン誘導体に塩化フェニルアセチル（１２．７ｍｌ，９６ｍｍｏｌ）を滴加し、反応混合物を１２時間撹拌した。メタノール５０ｍｌおよび水５０ｍｌで反応を急冷し、１５分間撹拌し、次に２９％アンモニア５０ｍｌを加え、反応混合物をさらに２時間放置した。真空下で溶媒を除去し、得られた油状物を酢酸エチルと水との間に分配した。分離した水層を酢酸エチルで洗浄し、４℃で析出させた。得られた固体を濾別して、Ｎ²−フェニルアセチルグアノシン１８８ｇを得た。母液を濃縮して追加の生成物（４ｇ）を得た。総収量約１２ｇ（７５％）。Ｎ²−フェニルアセチルグアノシン１８（２．３ｇ，５．７３ｍｍｏｌ）を、乾燥ピリジンと共蒸留（３回）することにより乾燥させ、乾燥ピリジン５０ｍｌに溶解した。得られた溶液に、塩化ジメトキシトリチル（２．３３ｇ，６．８８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で５時間放置した。メタノール２５ｍｌで反応を急冷し、蒸発乾固させた。残渣をジクロロメタンに溶解し、５％水性炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。得られた油状物を、乾燥ピリジンと共蒸留することによりさらに乾燥させ、ピリジンに溶解し、無水酢酸（１．４ｍｌ）で室温で４時間処理した。反応混合物を上述のように急冷し、後処理した。粗最終生成物を、溶出剤としてジクロロメタン：メタノール／９８：２の混合物を用いてシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。所望の画分を回収し、蒸発させて、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−Ｎ²−フェニルアセチルグアノシン１９３．５ｇ（７７％）を帯黄色泡状物として得た。ジイソプロピルエチルアミン３．１１ｍｌを含む乾燥ジクロロメタン５０ｍｌ中の化合物１９（３．５ｇ，４．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化メシチレンスルホニル（１．９ｇ，８．９ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（０．２８ｇ）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、蒸発させ、ジクロロメタン（１１）、続いてジクロロメタン中の２％メタノール（０．７１）を用いてシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｏ⁶−メシチレン中間体２０２．８ｇ（６４％）を得た。乾燥テトラヒドロフラン４０ｍｌ中の化合物２０の溶液に、リチウムジスルフィド（０．３ｇ，６．８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２０時間撹拌した。得られた透明溶液を蒸発させ、上述のように後処理した。残渣を、ジクロロメタン中の１％メタノール中でシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−Ｎ²−フェニルアセチル−６−チオグアノシン２１１．１ｇ（３１％）を得た。ピリジン：メタノール／２０ｍｌ：２．６ｍ１中の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−Ｎ²−フェニルアセチル−６−チオグアノシン２１（１ｇ）の氷冷（０℃）溶液に、１Ｍ水性水酸化ナトリウム２．４ｍｌを加え、反応混合物を０℃で２０分間放置した。Ｄｏｗｅｘ２ｘ８（Ｐｙｒ⁺ ）により溶液を中和してｐＨ７とした。樹脂を濾別し、水性ピリジンで洗浄した。合わせた濾液および洗浄液を蒸発させ、真空下で乾燥して、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ²−フェニルアセチル−６−チオグアノシンを定量的に得た。乾燥アセトニトリル（３５ｍｌ）およびトリエチルアミン（１ｍｌ）中の５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ²−フェニルアセチル−６−チオグアノシン（１．１３ｇ，１．５７ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、ジニトロフルオロベンゼン（０．３４ｇ，１．８８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を無水条件下で２時間撹拌した。反応液を蒸発させ、化合物２０について記載したように後処理し、溶出液としてクロロホルム中１％メタノール（１％トリエチルアミンを含む）を用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ²−フェニルアセチル−６−Ｓ−ジニトロフェニルグアノシン０．９３ｇ（６７％）を得た。乾燥ピリジン中の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ²−フェニルアセチル− ６−Ｓ−ジニトロフェニルグアノシン（０．９ｇ，１ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（０．４６ｇ，３ｍｍｏｌ）および硝酸テトラブチルアンモニウム（３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を５０時間放置した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル／３：１）は、出発物質の消失および２つの新規化合物（Ｒ_fの低い方（^lＨ−ＮＭＲによれば３’−Ｏ−シリル異性体）が支配的である）の形成を示した。蒸発および後処理、および溶出液としてヘキサン：酢酸エチル／４：１を用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによる分離の後、所望の２’−異性体（７０ｍｇ）を得た。残りの混合物をメタノール中で２滴のトリエチルアミンを用いて転位させ、上述のように分離した。この転位方法を２回繰り返して、最終的に所望の２’−異性体２５０ｍｇを得た。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−Ｎ²−フェニルアセチル−６−Ｓ−ジニトロフェニルグアノシン。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−Ｎ² −フェニルアセチル−６−Ｓ−ジニトロフェニルグアノシン（０．１８ｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を、乾燥アルゴン下で乾燥テトラヒドロフランに溶解した。Ｎ− メチルイミダゾール（０．０１ｍｌ，０．０９ｍｍｏｌ）およびｓｙｍ−コリジン（０．１７８ｍｌ，１．３５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を氷冷した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．０８３ｍｌ，０．３６ｍｍｏｌ）を滴加し、室温で３時間撹拌を続けた。反応混合物を再度氷冷し、乾燥脱ガス酢酸エチル６ｍｌで急冷した。５分間撹拌した後、混合物を真空下で濃縮し（４０℃）、クロロホルムに溶解し、５％水性炭酸水素ナトリウムで、次にブラインで洗浄し、蒸発させた。残渣を、溶出液として２％トリエチルアミンを含む酢酸エチル：ヘキサン／：３を用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ −ブチルジメチルシリル−Ｎ²−フェニルアセチル−６−Ｓ−ジニトロフェニルグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）２２０．１４ｇ（６４％）を黄色泡状物として得た。他の具体例は、以下の特許請求の範囲に含まれる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１２月２７日【補正内容】差し替え用紙第３２−３３頁の翻訳文請求の範囲１．非天然塩基の代わりに天然に生ずる塩基を有する同一の核酸と比較して核酸の酵素的活性を増強させる非天然塩基を有する酵素的核酸であって、前記非天然塩基が図４ａ−ｄまたは図６に示される非天然塩基から選択されることを特徴とする酵素的核酸。２．前記核酸がハンマーヘッドモチーフを有する、請求項１記載の酵素的核酸。３．修飾リボザイムと同一の基質を認識する未修飾リボザイムと比較してより高い生物学的活性を有する修飾リボザイムを製造する方法であって、ここで前記修飾リボザイムおよび未修飾リボザイムは、同一の酵素的部分を有しており、前記修飾リボザイムの基質結合アーム中に１つまたはそれ以上の修飾塩基を有する前記修飾リボザイムを形成する工程を含み、前記修飾塩基が、アデノシン、グアノシン、シトシンまたはウラシルから選択されるヌクレオチド塩基の化学構造中に、水素結合の強度を増加させるかまたは減少させることのいずれかによりその塩基がその正常な相補的塩基と水素結合する能力に影響を及ぼす修飾を有することを特徴とする方法。４．前記修飾リボザイムが、ハンマーヘッド、ヘアピンまたはデルタ肝炎ウイルス由来のリボザイムの構造を有する、請求項３記載の方法。５．前記ハンマーヘッドリボザイムが、３２〜４０ヌクレオチド塩基からなる、請求項４記載の方法。６．前記修飾リボザイムおよび未修飾リボザイムが、標的ＲＮＡに対して異なる結合自由エネルギーを有する、請求項３記載の方法。７．前記修飾塩基が、図４ａ−ｄまたは図６に示される修飾塩基から選択される、請求項３記載の方法。

Claims

【特許請求の範囲】１．修飾リボザイムと同一の基質を認識する未修飾リボザイムと比較してより高い生物学的活性を有する修飾リボザイムを製造する方法であって、ここで前記修飾リボザイムおよび未修飾リボザイムは、同一の酵素的部分を有しており、前記修飾リボザイムの基質結合アーム中に１つまたはそれ以上の修飾塩基を有する前記修飾リボザイムを形成する工程を含む方法。２．前記修飾塩基が、アデノシン、グアノシン、シトシンまたはウラシルから選択されるヌクレオチド塩基の化学構造中に、水素結合の強度を増加させるかまたは減少させることのいずれかによりその塩基がその正常な相補的塩基と水素結合する能力に影響を及ぼす修飾を有する、請求項１記載の方法。３．前記修飾リボザイムが、ハンマーヘッド、ヘアピンまたはデルタ肝炎ウイルス由来のリボザイムの構造を有する、請求項１記載の方法。４．前記ハンマーヘッドリボザイムが、３２〜４０ヌクレオチド塩基からなる、請求項３記載の方法。５．前記修飾リボザイムおよび未修飾リボザイムが、標的ＲＮＡに対して異なる結合自由エネルギーを有する、請求項１記載の方法。６．前記修飾塩基が、図４ａ−ｄまたは図６に示される修飾塩基から選択される、請求項１記載の方法。７．非天然塩基の代わりに天然に生ずる塩基を有する同一の核酸と比較して核酸の酵素的活性を増強させる非天然塩基を有する酵素的核酸。８．前記非天然塩基が、図４ａ−ｄまたは図６に示される非天然塩基から選択される、請求項７記載の酵素的核酸。９．前記核酸がハンマーヘッドモチーフを有する、請求項７記載の酵素的核酸。