PL189499B1 - Sposób indukowania odporności na wirus BNYVV, roślina transgeniczna odporna na wirus BNYVV, transgeniczna tkanka roślinna i struktura odtwarzalna otrzymana z rośliny transgenicznej - Google Patents

Abstract

1. Sposób indukowania odpornosci na wirus BNYVV zawierajacy sekwencje bloku 3 potrójnego genu w komórce rosliny lub w roslinie, zwlaszcza wybranej sposród C. qu- inoa i buraków, znam ienny tym, ze: - wytwarza sie konstrukt kwasu nukleinowego obejmujacy sekwencje kwasu nukle- inowego odpowiadajaca co najmniej 70% sekwencji kwasu nukleinowego bloku 3 potrójnego genu tego wirusa lub jego odpowiedniego cDNA, polaczonego funkcjo- nalnie z jedna lub wieksza liczba aktywnych w roslinie sekwencji regulacyjnych, - transformuje sie komórki rosliny tym konstruktem kwasu nukleinowego, i ewentu- alnie - z transformowanej komórki rosliny regeneruje sie rosline transgeniczna. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest również roślina transgeniczna odporna na wirus BNYVV, zawierająca konstrukt kwasu nukleinowego mający sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą w co najmniej 70% sekwencji kwasu nukleinowego bloku 3 genu potrójnego wirusa BNYW lub jego odpowiedniego cDNA, połączonego funkcjonalnie z jedną lub większą liczbą aktywnych w roślinie sekwencji regulacyjnych, zwłaszcza wybranej z grupy obejmującej C quinoa i buraki.

Korzystnie konstrukt kwasu nukleinowego ma sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą co najmniej 90% sekwencji kwasu nukleinowego bloku 3 genu potrójnego wirusa BNYVV lub jego komplementarnego cDNA.

V innej korzystnej postaci roślina jest burakiem, a szczególnie korzystnie burakiem cukrowym - Beta vulgaris.

Korzystnie sekwencja kwasu nukleinowego bloku 3 genu potrójnego wirusa BNYW jest zawarta między nukleotydami 3627 i 4025 nici 5' genomowego lub subgenomowego RNA 2 wirusa BNYW lub jego odpowiedniego cDNA.

V dalszej korzystnej postaci wynalazku sekwencja regulacyjna zawiera aktywną w roślinie sekwencję promotora i aktywną w roślinie sekwencję terminatora, korzystniej sekwencja regulacyjna zawiera sekwencję promotora, która jest konstytutywną lub obcą roślinną sekwencją promotora, a zwłaszcza sekwencja promotora jest wybrana spośród promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S i/lub promotora poliubichityny Arabidopsis thaliana V szczególnie korzystnej postaci sekwencja promotora jest promotorem, który jest aktywny głównie w tkankach korzenia, takim jak par promotor genu hemoglobiny z Perosponia andersonii.

V dalszym aspekcie wynalazek dotyczy transgenicznej tkanki roślinnej wybranej spośród tkanek: owocu, łodygi, korzenia, bulwy, nasienia rośliny określonej powyżej.

V kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy także struktury odtwarzalnej otrzymanej z rośliny transgenicznej określonej powyżej.

Vynalazek oparty jest na zastosowaniu alternatywnej sekwencji wirusa roślinnego, zwłaszcza BNYW w celu uzyskania wysokiego stopnia tolerancji na infekcję wirusową, a w szczególności w celu zapewnienia szybkiego i całkowitego blokowania mechanizmów rozmnazania i dyfuzji wirusa w roślinie, zwłaszcza w roślinie buraka cukrowego (Beta vulgaris), a także buraka pastewnego, Swiss Vhard i buraka stołowego, które mogą także podlegać tej infekcji wirusowej. Ekspresję odporności uzyskuje się w transgenicznej komórce i roślinie, zwłaszcza w komórkach i roślinach buraka cukrowego wytwarzanych sposobem transformacji według zgłoszenia patentowego VO 95/10178 lub innymi sposobami transformacji opartymi na Agrobacterium tumefaciens lub bezpośrednim przenoszeniu genu. Vskutek wysokiej skuteczności sposób transformacji taki jak opisano w VO 95/10178 umożliwia wytwarzanie dużej liczby transformowanych roślin, zwłaszcza roślin buraka cukrowego i będzie preferowany w opracowaniu roślin transgenicznych, które można będzie analizować i charakteryzować z punktu widzenia ich poziomu odporności wirusowej, zwłaszcza odporności względem BNYW, włączając w to ich ocenę połową.

189 499

Genom buraczanego furowirusa Beat necrotic yellow vein virus (BNYVV) składa się z pięciu plus-sensownych RNA, z których dwa (RNA 1 i 2) kodują funkcje zasadnicze dla infekcji wszystkich roślin, podczas gdy inne trzy (RNA 3, 4 i 5) są związane z odbywającą się za pośrednictwem wektora infekcją korzeni buraka cukrowego (Beta vulgaris) (1). Przemieszczanie wirusa BNYW z komórki do komórki następuje pod kontrolą zbioru trzech kolejnych, nieznacznie nakładających się genów wirusowych na RNA 2, znanych jako blok genu potrójnego (TGB) (2), który koduje, w kolejności, białka wirusowe P42, P13 i P15 (produkty genowe są oznaczane przez ich obliczone M_r w kilodaltonach (3)).

W poniższym opisie, geny TGB i odpowiadające im białka będą identyfikowane przez następujące określenia: TGB1, TGB2, TGB3 lub przez ich numer zakodowanego białka wirusowego P42, P13 i P15. Odpowiedniki TGB są obecne w innych furowirusach (4, 5) oraz w poteks-, karla- i hordeiwirusach (6).

W tabeli 1 podano wirusy posiadające sekwencję TGB3, ciężar cząsteczkowy TGB3 wskazanych wirusów, ich gospodarza i odnośniki literaturowe.

Tabela 1

Wirus	Wielkość TGB3	Gospodarz	Odnośnik literaturowy
Wirus jamkowatości pma jabłoni	8 kDa	jabłoń	Jelkman, J Gen Virol 75, 1535-1542 (1994)
Wirus Blueberry scorch	7 kDa	borówka amerykańska	Cavileer i in., J Gen Virol 75,711-720 (1994)
Wirus wirozy M ziemniaka	7 kDa	ziemniak	Zavriev i in , J Gen Virol 72, 9-14 (1991)
Wirus mozaiki białej koniczyny	8 kDa	biała koniczyna	Forster i in., Nuci Acids Res 16, 291-303 (1988)
Wirus Cymbidium mozaiki storczyków	10 kDa	storczyk	Neo i in., Plant Mol Biol 18, 1027-1029 (1992)
Wirus paskowanej mozaiki jęczmienia	17 kDa	jęczmień	Gustafson i in., Nuci Acids Res 14, 3895-3909 (1986)
Wirus miotlastości wierzchołkowej ziemniaka	21 kDa	ziemniak	SCott i in , J Gen Kirol 75, 3561 -3568 (1994)
Wirus Peanut clump orzecha ziemnego	17 kDa	orzech ziemny	Herzog i in, J Gen Virol 75,3147-3155 (1994)
Wirus buraka przenoszony przez glebę	22 kDa	burak cukrowy	Koenig i in., Virology 216, 202-207 (1996)

W zgłoszeniu zaproponowano nowy sposób nadawania roślinie odporności na wirusy roślin przez blokowanie mechanizmów rozmnażania wirusów i dyfuzji we wspomnianej roślinie, zwłaszcza w tkance korzenia. Aby zademonstrować wspomnianą odporność, opisano poniżej wpływ nadekspresji sekwencji TGB, samych lub w połączeniu, na mechanizm rozmnazania i dyfuzji wirusa BNYW w roślinach C. ąuinoa, które są także gospodarzami wirusa BNYW i którymi fachowiec mógłby łatwiej posługiwać się.

Wykonano także doświadczenia na Beta macrocarpa Wyniki te pokazały, ze będzie możliwe otrzymanie także transformacji roślin sposobem według wynalazku i uzyskanie ekspresji genu TGB3 przez wskazane rośliny. Zatem, jak objaśniono w poniższym opisie, wskazany sposób mógłby być stosowany do nadawania różnych odporności wirusowych w różnych gatunkach roślin poddanych infekcji wirusami charakteryzującymi się obecnością sekwencji TGB3 w ich genomie.

189 499

Wiadomo, ze dla wytwarzania miejscowych uszkodzeń na liściach gospodarzy, takich jak Chenopodium quinoa (7), BNYW nie wymaga syntezy białka powłoki wirusowej co wskazuje, ze do przemieszczenia z komórki do komórki nie jest wymagane tworzenie wirionu.

Jednak sposób, w jaki składniki TGB wspomagają proces przemieszczania nie został wyjaśniony, chociaż wspomagane komputerowo porównania sekwencji wykryły charakterystyczne zachowane sekwencje, które mogą stanowić klucz do ich funkcji. I tak, białko TGB blisko 5' (TGB1) niezmiennie zawiera szereg motywów sekwencyjnych cechujących się helikazą wiążącą ATP/GTP, podczas gdy drugie białko (TGB2) zawsze ma dwie domeny hydrofobowe potencjalnie obejmujące błonę, oddzielone przez sekwencje hydrofitową, która zawiera wysoce zachowany motyw peptydowy o nieznanym znaczeniu (6). Sekwencja i wielkość trzeciego białka TGB (TGB3) jest bardziej zmienna, chociaż część N-końcowa jest zasadniczo raczej hydrofobowa. Wykryto subgenomowe RNA z końcami 5' mapującymi „w górę” otwartych ramek odczytu (ORF) TGB1 i TGB2 wirusa BNYW (fig. 1), lecz nie opisywano takich indywiduów dla TGB3 wirusa BNVVV (2) lub dla jakichkolwiek innych wirusów zawierających TGB. W przypadku wirusa mozaiki X ziemniaka (PVX, odnośnik literaturowy 8) i wirusa paskowanej mozaiki jęczmienia (BSMV; odnośnik literaturowy 9), istnieje dowód, że produkty TGB2 i TGB3 są eksprymowane z tego samego subgenomowego RNA.

Dotąd nie opisano przykładu wirusa, w którym trzy człony TGB są rozmieszczone różnie na tym samym RNA lub są rozdzielone na różnych genomowych RNA i co sugerowałoby, ze ich powiązanie w szczególnym porządku może być ważne przy regulacji ich funkcji.

Wynalazek dotyczy sposobu indukowania odporności wirusowej na wirus obejmujący blok genu potrójnego (TGB) pod warunkiem, że nie jest to wirus mozaiki X ziemniaka. W korzystnej postaci wynalazku wirus jest wybrany z grupy obejmującej: wirusa jamkowatości pnia jabłoni, wirusa Blueberry scorch borówki amerykańskiej, wirusa wirozy M ziemniaka, wirusa mozaiki białej koniczyny, wirusa Cymbidium mozaiki storczyków, wirusa paskowanej mozaiki jęczmienia, wirusa miotlastości wierzchołkowej ziemniaka, wirusa Peanut clump orzecha ziemnego i wirusa buraka przenoszonego przez glebę; wskazany sposób obejmuje następujące etapy:

- wytworzenia konstruktu kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą co najmniej 70% sekwencji kwasu nukleinowego TGB3 wskazanego wirusa lub jego odpowiedniego cDNA, połączonego funkcjonalnie z jedną lub większą liczbą aktywnych w roślinie sekwencji regulacyjnych.

- transformowania komórki roślinnej konstruktem kwasu nukleinowego i ewentualnie

- regenerowania rośliny transgenicznej z transformowanej komórki rośliny.

Korzystnie roślina jest rośliną, która może być zainfekowana przez wyżej opisany wirus i jest korzystnie wybrana z grupy obejmującej: jabłoń, borówkę amerykańską, ziemniak, koniczynę, storczyki, jęczmień, orzechy ziemne i burak cukrowy.

Wynalazek dotyczy także otrzymanej komórki roślinnej i transgenicznej (lub transformowanej) rośliny (wytworzonej z komórek wskazanej rośliny) odpornej na wskazane wirusy i obejmującej wskazany konstrukt kwasu nukleinowego.

Nieoczekiwanie okazało się także, że jest możliwe indukowanie odporności względem BNYW w roślinie sposobem, który obejmuje następujące etapy:

- wytworzenia konstruktu kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 90%, sekwencji kwasu nukleinowego, za wartej między nukleotydami 3627 i 4025 nici 5' genomowego lub subgenomowego RNA2 wirusa BNYW lub jego odpowiedniego cDNA, połączonego funkcjonalnie z jedną lub większą liczbą aktywnych w roślinie sekwencji regulacyjnych,

- transformowania komórki rośliny wskazanym konstruktem i ewentualnie

- regenerowania rośliny transgenicznej z transformowanej komórki rośliny.

Sekwencja kwasu nukleinowego zawarta między nukleotydami 3627 i 4025 nici 5' genomowego lub subgenomowego RNA 2 kodującego białko PI 5 jest podana na rysunku fig. 6 i w publikacji (3). Wskazaną sekwencję kwasu nukleinowego i odpowiednią sekwencję aminokwasową określono w ponizszym opisie jako SEQ ID NO 1.

189 499

W innym aspekcie wynalazek dotyczy komórki roślinnej i rośliny transgenicznej (wytworzonej ze wskazanych komórek roślinnych) odpornych na BNYVV i obejmujących konstrukt kwasu nukleinowego o sekwencji kwasu nukleinowego odpowiadającej co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 90%, sekwencji kwasu nukleinowego, zawartej między nukleotydami 3627 i 4025 nici 5' genomowego lub subgenomowego RNA 2 wirusa BNYVV lub odpowiedniego cDNA, połączonego funkcjonalnie z jedną lub większą liczbą aktywnych w roślinie sekwencji regulacyjnych.

Korzystnie, wskazana komórka roślinna lub roślina transgeniczna (wytworzona ze wskazanych komórek roślinnych) odporna na BNYVV jest otrzymywana sposobem według wynalazku.

Odmiany sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako SEQ ID NO.l obejmują wstawianie, podstawianie lub delecję nukleotydów kodujących ten sam lub inny aminokwas (aminokwasy). Zatem wynalazek dotyczy także odmian sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID NO. 1, wykazujących ponad 70% homologię ze wskazaną sekwencją kwasu nukleinowego i które są korzystnie zdolne do hybrydyzacji do wskazanej sekwencji kwasu nukleinowego w warunkach ścisłych lub nieścisłych.

Korzystnie, wskazane sekwencje są także zdolne do indukowania odporności na wirus BNYVV w roślinie.

Określenie „indukcja odporność wirusowej w roślinie” oznacza możliwą redukcję lub znaczące opóźnienie pojawienia się objawów infekcji, mechanizmów rozmnażania wirusa lub jego dyfuzji w roślinie, zwłaszcza w tkance korzenia.

Sekwencja(e) regulacyjna(e) wskazanej sekwencji kwasu nukleinowego to aktywne w roślinie sekwencja(e) promotora i sekwencja(e) terminatora.

Konstrukt kwasu nukleinowego może także obejmować wybieralny gen markera, który mógłby być zastosowany do identyfikacji transformowanej komórki lub rośliny i ekspresji konstruktu kwasu nukleinowego zgodnie z wynalazkiem.

Korzystnie, komórka jest komórką porową, a roślina jest burakiem cukrowym (Beta vulgaris ssp.) wytworzonym ze wspomnianych komórek.

Zgodnie z wynalazkiem, sekwencja promotora jest konstytutywną lub „obcą” roślinną sekwencją promotora, korzystnie wybraną z grupy obejmującej: sekwencję promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S, sekwencję promotora poliubichityny Arabidopsis thaliana (43), promotora, który jest głównie aktywny w tkankach korzenia, takiego jak par promotor genu hemoglobiny z Perosponia andersonii (Landsman i in., Mol. Gen Genet 214: 68-73 (1988)) i ich mieszaniny.

W ostatnim aspekcie wynalazek dotyczy tkanki, takiej jak tkanka owocu, łodygi, korzenia, bulwy, nasion rośliny transgenicznej według wynalazku lub struktury reprodukowalnej (korzystnie wybranej z grupy obejmującej kallusy, pączki i zarodki) otrzymanej z transgenicznej rośliny lub komórki według wynalazku.

Techniki transformacji roślin, hodowli tkankowej i regeneracji stosowane w sposobie według wynalazku są technikami dobrze znanymi fachowcom. Takie techniki są korzystnie technikami opisanymi w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych WO 95/10178 lub WO 91/13159, odpowiadających europejskiemu zgłoszeniu patentowemu EP-B-0517833, które włączono jako odnośniki literaturowe do zgłoszenia. Techniki te są korzystnie stosowane dla wytworzenia transgenicznych buraków cukrowych według wynalazku.

Wynalazek zobrazowano na rysunku, na którym:

Figura 1 przedstawia strukturę RNA 2 typu dzikiego BNYYV i replikonów eksprymujących białko TGB.

Figura 2 przedstawia translację in vitro replikonów genów TGB w ekstrakcie zarodków pszenicy.

Figura 3 przedstawia amplifikację replikonów kodujących białka TGB w protoplastach Chenopodium quinoa i ekspresję P42.

Figura 4 przedstawia komplementację transkryptów RNA 2 zawierających defekty w różnych genach TGB przez odpowiedni gen typu dzikiego dostarczony przez replikon.

Figura 5 przedstawia wpływ replikonów na infekcje RNA 1 i 2 wirusa BNYVV typu dzikiego.

189 499

Figura 6 przedstawia nukleotydy i sekwencję aminokwasową TGB3 kodującą P15 wirusa BNYVV.

Figura 7 przedstawia obecność obszarów kodujących genu P15 wirusa BNYVV w genomie buraka cukrowego przez PGR.

Figura 8 przedstawia integrację genu P15 wirusa BN W w genomie buraka cukrowego przez hybrydyzację typu Southern biot.

Aby zidentyfikować potencjalne zastosowanie szczególnych sekwencji genu wyodrębnionych z wirusowego RNA 2 z BNYVV i wytworzyć odporność na BNYVV w buraku cukrowym przez transformację rośliny, zbadano czy niezależne eksprymowanie białka TGB wirusa BNYVV jest możliwe przez wstawienie ORF każdego z nich do wirusowego „replikonu” zależnego od replikacji wyprowadzonego z RNA 3 wirusa BNYVV. Wykazano, ze przy mieszanych infekcjach liści C. quinoa, tak eksprymowane białko TGB1 lub TGB2 wirusa BNYVV może komplementować RNA 2 wirusa BNYVV zawierające mutację unieszkodliwiającą odpowiednie białko TGB. Nie zaobserwowano komplementowania z udziałem replikonu zawierającego TGB3, jeśli ORF TGB3 nie było umieszczone „w dół” ORF dla TGB2 w replikonie. W przypadku koinokulowania z RNA 1 i 2 typu dzikiego, replikon eksprymujący ORF TGB3 BNYVV hamował infekcję. Dane są zgodne z modelem ekspresji białek TGB, w których translacja P15 z dicistronowego subgenomowego RNA reguluje in vivo poziomy ekspresji P15. Ustalono również, że wysoka ekspresja P15 mogłaby zapewnić szybkie i całkowite blokowanie mechanizmów rozmnażania wirusów i dyfuzji w roślinie.

Klony cDNA

Wektorem transkrypcji dla wytwarzania RNA 1 i RNA 2 wirusa BNYVV typu dzikiego pełnej długości były odpowiednio pB15 (10) i pB2-14 (11). Wektorami transkrypcji dla uprzednio opisanych mutantów RNA 2 były pB2-14-F, -H, -1 i -J (2) oraz pB2-14-ASN, -AS12, -AS37, -AB1, -AB2, -AB2, -AN i -GAA (11). Mutant delecyjny RNA 2 pB2-14-HPl wytworzono przez eliminację sekwencji miedzy nukleotydami 3158 i 3258. Pusty replikon wyprowadzony z RNA 3 BNYVV, rep0, otrzymano przez transkrypcję mutanta delecji RNA 3 -pB35AAES (12). Sekwencje TGB dla wstawiania w rep0 amplifikowano przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) stosując primery, z których każdy zawierał nieszablonowane miejsce BamHi przy ich końcu 5'. Fragmenty PCR odpowiadające genowi P42 (nukleotydy 2127-3297), genowi P13 (nukleotydy 3282-3650), genowi P15 (nukleotydy 3627-4025) i obydwu genom P13 i P15 (nukleotydy 3282-4025) wytrawiono z użyciem BamHl i wstawiono w rozszczepiony przez BamHi pB35AAES. Uzyskane konstrukty zastosowano do transkrypcji odpowiednio rep42, rep 13, rep 15 i rep1315. Replikon zawierający mutację przesunięcia ramki w ORF P15 (Repl5-X) wytworzono przez wypełnienie wystającej części insertu miejsca Xbai (nukleozyd 3948). Mutacje insertu przesunięcia ramki w rep13-1, rep1315^1 i rep15-J utworzono jak opisano w odpowiednich mutacjach w RNA 2 pełnej długości (2). Klonowane sekwencje amplifikowane PCR zweryfikowano jako pozbawione błędów przez sekwencjonowanie (13).

Transkrypty in vitro „Przykryte” transkrypty wytworzono przez transkrypcję „run-off’ polimerazy bakteriofagu T7 (10) plazmidu DNA, zlinearyzowanego przez Hindiii dla pB 15 i konstruktów replikonu i przez Sali dla pB2-14 i konstruktów pokrewnych. Stężenie i integralność transkryptów oceniono przez elektroforezę na żelu agarozowym. Liście mechanicznie inokulowano z użyciem 50 j.1 na liść inokulacyjnego buforu zawierającego 1 pg każdego transkryptu (2). W pewnych doświadczeniach transkrypty RNA 1 i 2 zostały zastąpiono na 0,025 pg wysoce infekcyjnego wirusowego RNA oczyszczonego z Stras 12 (10) izolatu BNYVV. Wstępne badania wykazały, że ta ilość wirusowego RNA była w przybliżeniu równoważna infekcyjności (jak zmierzono przez próbę lokalnego uszkodzenia) mieszaniny zawierającej 1 pg każdego z transkryptów RNA 1 i 2. W przypadku infekcji protoplastów, 0,5 pg wirusowych RNA 1 i 2 plus 3 pg transkryptu replikonu inokulowano do 2.10⁵ protoplastów przez elektroporację (2).

Transkrypty otrzymane z replikonów poddano translacji w ekstrakcie zarodków pszenicy (14) i produkty translacji znaczone [³⁵S] wizualizowano przez autoradiografię według SDS-PAGE (15, 16). Radioaktywność włączoną w produkty translacji skwantyfikowano

189 499 z użyciem Fujix MAS 1000 BioAnalyzer i wartości dostosowano do zawartości metioniny przy obliczaniu względnych poziomów translacji

Wykrywanie wirusowych RNA i białek

Całość RNA wyekstrahowano (2) z inokulowanych liści 10 dni po inokulacji, a z protoplastów 48 godzin po inokulacji. Wirusowy RNA wykryto metodą hybrydyzacji Northern z użyciem znaczonych ³²P antysensownych wirusowych transkryptów RNA (17) jako sond. Sonda specyficzna względem RNA 1 była komplementarna względem nukleotydów 4740-5650, sonda specyficzna względem RNA 2 - względem nukleotydów 2324-3789, a sonda specyficzna względem RNA 3 - względem nukleotydów 1-380. P42, P14 i białko powłoki wykryto metodą Western biot całkowitych ekstraktów białkowych infekowanych protoplastów, stosując specyficzną względem każdego białka poliklonalną surowicę odpornościową królika (18). Stabilność mutacji wprowadzonych do RNA 2 zbadano z użyciem reakcji łańcuchowej polinukleotydów po odwrotnej transkrypcji (RT-PCR) całkowitych ekstraktów RNA z zainfekowanych roślin. Odwrotne transkrypty wytworzono z użyciem zestawu do odwrotnej transkrypcji Expand™ (Boehringer) według instrukcji producenta. PCR wykonano zasadniczo jak opisano (19), stosując 25 cykli o następującym trybie: 94° (30 sek), 50° (30 sek), 72° (3 min). Pary primerów dla amplifikacji PCR różnych obszarów RNA 2 cDNA odpowiadały (lub były do nich komplementarne, w przypadku drugiego członu każdej pary primerów) nukleotydom 1143-1151 oraz 3393-3412 (gen P42) i nukleotydom 3151-3169 i 4128-4148 (geny P13 i P15). Primer zastosowany do zainicjowania syntezy cDNA przed reakcjami PCR był komplementarny względem nukleotydów 4128-4148

Wyniki

Replikony eksprymujące białka TGB wirusa BNYVV

Gdy wystarczające sekwencje przy końcach 3' i 5' są zachowane, transkrypt RNA 3 BNYVV, z którego usunięto obszar centralny, może replikować skutecznie na liściach C qulnoa, gdy są koinokulowane RNA 1 i 2 i może eksprymować obcy gen wstawiony w miejsce deletowanej sekwencji (12, 20). Taki „replikon” oparty na RNA-3 zastosowano więc dla ekspresji każdego z białek TGB wirusa BNYVV z ich normalnego kontekstu w RNA 2 i zbadano pojemność każdego replikonu, by komplementować mutant RNA 2 wadliwy w odpowiednim genie TGB

Replikony użyte w tym badaniu przedstawiono na fig. 1. Figura 1A jest mapągenomową RNA 2. Geny TGB zacieniowano, a linie powyżej mapy wskazują stopnie subgenomowych RNA 2suba i 2subb Wskazano miejsca delecji i msercji indukujących przesunięcie ramki w RNA 2 Strukturę 5'-końcowej „pokrywy” oznaczono kółkiem. P21 jest głównym białkiem powłoki wirusowej RT oznacza domenę „readthrough” (odczytu) (3). B - Replikony wyprowadzone z RNA 3 wirusa BNYVV zawierające geny TGB BNYVV (jasno cieniowane) lub P17 kodujące gen TGB3 wirusa Peanu! clump orzecha ziemnego (PCV) (ciemno cieniowane). Pokazano miejsce BcimHl w pustym rephkonie (rep0) użyte dla wstawienia sekwencji TGB amplifikowanych PCR. Wskazano miejsca msercji indukujących przesunięcie ramki w różnych replikonach mutantów P13 i P15 Oprócz konstruktów rep42, rep 13 i repl5, z których każdy zawiera gen TGB, wytworzono czwarty konstrukt (rep 1315) zawierający zarówno geny P13 jak i P15 rozmieszczone w tej samej konfiguracji względnej jak w RNA 2. Zdolność każdego replikonu do bezpośredniej ekspresji wstawionego genu lub genów zbadano przez translację in vitro transkryptu w ekstrakcie zarodków pszenicy Każdy z transkryptów rep42, rep 13 i rep 15 ukierunkowywał syntezę obfitego produktu (fig. 2A, pasek 2; fig 2B, paski 2 i 3), który nie został wytworzony w translacjach zaprogramowanych w transkrypcie odpowiadającym pustemu replikonowi, rep0 (fig 2A, pasek 1; fig 2B, pasek 1) Na fig 2 (A) przedstawiono znakowane S³⁵-metioniną produkty translacji pustego replikonu repO (pasek 1) i rep42 (pasek 2) wykazane przez autoradiografię po PAGE (15). Wskazane pasmo zidentyfikowano jako P42 przez porównanie jego ruchliwości z ruchliwością markerów ciężaru cząsteczkowego (nie uwidocznione) Na fig 2 (B) przedstawiono produkty translacji ukierunkowane przez rep0 (pasek 1), rep 13 (pasek 2), rep 15 (pasek 3) i i ep 1315 (pasek 4) wykazane przez autoradiografię po PAGE (16) Pasma wstępnie określone jako P13 i P15 wskazano po prawej stronie. Pasmo tła oznaczone gwiazdką także zsyntetyzowano, gdy nie wprowadzono transkryptu do ekstraktu translacyjnego. Względne ruchliwości różnych produktów translacji były takie jak oczekiwano oprócz tego, ze domniemany P13 migrował nieznacznie wolniej niż

189 499

P15, przypuszczalnie wskutek jego nietypowego składu anunokwasowego Dicistronowy konstrukt repl315 ukierunkował syntezę P13 i P15 (fig 2B, pasek 4) przy względnych ilościach molowych 3:1 (wartości skorygowane na różnicę w zawartości metioniny dwóch białek, jeśli

N-końcowa metionina każdego białka jest usuwana posttranslacyjnie, stosunek molowy wynosi 5:1)

Zbadano zdolność replikonów do ulegania amphfikacji przez wirusowy mechanizm replikacji in vivo przez koinokulowame transkryptów replikonów do protoplastów C quinoa wraz z RNA 1 i 2 BNYVV. Analiza Northern biot całości RNA wyekstrahowanego z protoplastów 48 godzin po inokulacji ujawniła, ze wszystkie replikony zawierające geny TGB były skutecznie amplifikowane (fig. 3A). Figura 3(A) przedstawia wykrycie metodą hybrydyzacji Northern wirusowych RNA w protoplastach C quinoa inokulowanych samymi RNA 1 i 2 BNYVV (pasek 2) lub uzupełnionych rep0 (pasek 3), rep42 (pasek 4), rep 13 (pasek 5), repl315 (pasek 6) i repl5 (pasek 7). RNA z próbnie inokulowanych protoplastów zanalizowano na pasku 1. Protoplasty zostały zebrane 48 godzin po inokulacji i wirusowe RNA wykryto stosując znakowane ^j2P wirusowe antysensowne sondy RNA specyficzne względem RNA. Replikony wskazano grotami strzałek. Figura 3 (B) przedstawia immunodetekcję P42 w ekstraktach całości białek z protoplastów C quinoa inokulowanych RNA 1 i 2 BNYVV (pasek 2), transkrypt typu dzikiego RNA 1 plus transkrypt mutanta RNA 2 pB2-14-H, który zawiera mutację przesunięcia ramki w genie P42 (11) (pasek 3), transkrypty RNA 1 i pB2-I4-H plus rep42 (pasek 4). Białko wyekstrahowane z próbnie inokulowanych protoplastów zanalizowano na pasku 1. Po PAGE (15) i elektrotransferze do nitrocelulozy, P42, główne białko powłoki wirusa (CP) i P14 poddano lmmunodetekcji z użyciem mieszaniny surowic odpornościowych specyficznych dla każdego białka (18) Miejsca wzorców ciężaru cząsteczkowego znakowano w kilodaltonach po lewej stronie plamy. Analiza metodą Western biot, ujawniła ze poziom P42 u protoplastów zainfekowanych mieszaniną rep42 plus transkrypty RNA 1 i mutant przesunięcia ramki odczytu pB2-14-H. spowodowany przez wypełnienie miejsca Spel w obrębie genu P42 RNA 2 (patrz fig. 1), był około dwukrotnie większy niż w protoplastach zainfekowanych RNA 1 plus RNA 2 typu dzikiego (fig 3B, paski 2 i 3). Należy zauwazyć, ze poziomy nagromadzenia dwóch innych immunowykrywalnych produktów genowych RNA 2 (główne wirusowe białko powłoki i P14, fig 1) nie były zmodyfikowane przez obecność rep42. P13 i P15 nie mogły być immunowykiywane w takich doświadczeniach

Białka TGB wirusa BNYVV mogą być komplementowane m trans

Zdolność replikonów zawierających geny TGB do dostarczenia funkcji przesuwania w całych roślinach zbadano przez koinokulowame liści gospodarza miejscowego uszkodzenia C quinoa jednym z szeregu transkryptów RNA 2 zawierających mutacje unieszkodliwiającą gen TGB plus replikon zawierający odpowiadający gen typu dzikiego. We wszystkich doświadczeniach mokulum zawierało także transkrypt RNA 1 typu dzikiego jako źródło replikazy RNA zależnej od RNA wirusowego, chociaż fakt ten nie zawsze jest wyraźnie podany poniżej W przypadku genu P42, badane mutanty RNA 2 objęty mutant przesunięcia ramki (pB2-14-H) spowodowany przez wypełnienie miejsca Spel w nukleotydzie 2280, szereg mutantów zawierających krótkie delecje „m-frame w różnych miejscach w ORF P42 (mutanty pB2-14-AS12, -ASN, -AB1, -AB2, -AN i -AHP1, lig 1A; patrz także odnośnik literaturowy 11) oraz mutant delecyjny (pB2-14-F, fig 1), gdzie usuniecie sekwencji nukleotydowej 935 „w górę” od ORF P42 inaktywowało promotor subgenomowego RNA (RNA 2suba) odpowiedzialny za syntezę P42. Inokula zawierające transkrypt RNA 1 plus którykolwiek z powyższych transkryptów mutanta RNA 2 nie wytworzyły miejscowych uszkodzeń C quinoa i nie można było wykryć żadnego potomstwa wirusowego RNA w inokulowanych liściach 10 dni po inokulacji (fig. 4, paski 3 i 5, patiz odnośnik literaturowy 11 dla innych mutantów). Na fig. 4, replikon wskazany u góry każdego paska był mokulowany do liści C quinoa wraz z transkryptem RNA 1 typu dzikiego plus bądź transkryptem RNA 2 typu dzikiego (pasek 2) bądź transkryptem mutanta RNA 2 zidentyfikowanym powyżej każdego paska Na paskach 19 i 20, mokulum zawierało rep42 i repl5 (pasek 19) lub rep42 i rep 1315 (pasek 20), oprócz transkryptów RNA 1 i pB2-14-HP1. Pasek 1 zawiera RNA z niemokulowanej rośliny kontrolnej. Inokulowane liście zebrano 10 dni po inokulacji i zbadano na zawartość wirusowego RNA metodą hybrydyzacji Northern, jak przedstawiono na fig 3 Miejsca replikonów wska12

189 499 zano strzałkami. Gdy transkrypt rep42 włączono w mokulum. pojawiły się liczne miejscowe uszkodzenia (20-80 na liść) na inokulowanych liściach oprócz mokulum zawierającego transkrypt mutanta delecyjnego RNA 2 - pB2-14-HP1, który pozostał bez objawów. Uzyskane bladozielone uszkodzenia były podobne co do wyglądu do wywołanych przez mokulację z użyciem RNA 1 plus RNA 2 typu dzikiego, oprócz mutanta RNA 2 -pB2-14-F, gdzie utworzyły się nekrotyczne uszkodzenia miejscowe. W tym ostatnim przypadku fenotyp uszkodzenia nekrotycznego może być powiązany z wytwarzaniem obciętej formy białka „readthrough” (odczytu) (RT) przez tego mutanta RNA 2 (7).

Hybrydyzacja typu Northern inokulowanych liści 10 dni po inokulacji ujawniła obecność potomstwa wirusowego RNA o długości oczekiwanej dla RNA 1, 2 i rep42 dla wszystkich mutantów RNA 2 (fig 4, paski 2, 4, 7-11) oprócz mutanta delecyjnego - pB2-14-HP1 (fig. 4, pasek 13). Jak to pokazano poniżej, niepowodzenie w komplementowaniu pB2-14-AHP1 przez rep42 jest prawdopodobnie spowodowane przez delecję promotora subgenomowego RNA (RNA 2subb), o którym sądzi się, ze ukierunkowuje translację białek „w dół” białek TGB.

Podobne doświadczenia z komplementacją wykonano w przypadku rep 13, rep 15 i dicistronowego konstruktu rep 1315 Zarówno rep 13 jak i rep 1315 były zdolne do komplementowania nagromadzenia na liściach (fig. 4, paski 14 i 15) mutanta pB2-14-l, w którym gen P13 był unieszkodliwiony przez wstawienie czterech nukleotydów (wstawienie to utworzyło miejsce Xhol), chociaż otrzymane miejscowe uszkodzenia były nekrotyczne. Nekrotyczne uszkodzenia miejscowe wytworzono także podczas mieszanych infekcji wyżej wskazanymi replikonami oraz RNA 1 i 2 typu dzikiego (patrz poniżej), wskazując na to, ze fenotyp objawu zależnego od replikonu jest dominujący nad typem dzikim. Nowe objawy można związać z różnicami w przebiegu czasowym syntezy lub poziomie nagromadzenia P13, gdy jest on eksprymowany raczej z replikonu niż RNA 2 pełnej długości

W doświadczeniach takich jak opisane powyżej, ważne jest wykazanie, ze mutacja oryginalnie wprowadzona do genu P42 lub P13 na transkrypcie RNA 2 była wciąż obecna w potomstwie RNA 2, tzn. wadliwa kopia genu TGB na transkrypcie nie była konwertowana do typu dzikiego przez rekombinację RNA in plantu (21) z kopią obecną w replikonie Zatem doświadczenie RT-PCR wykonano na wirusowym RNA potomstwa z rośliny zainfekowanej RNA 1, transkryptem pB2-14-H (gen P42 rozerwany przez wypełnienie miejsca Spel) i rep42 Para primeru została użyta w RT-PCR hybrydyzowanym do sekwencji RNA 2 otaczających gen P42 i w związku z tym amplifikuje kopie genu obecnego w RNA 2, lecz nie kopie replikonu, gdzie sekwencje flankujące są nieobecne. Analiza enzymu restrykcyjnego wykazała, ze w uzyskanym fragmencie amplifikowanego DNA miejsce Spel było nieobecne, jak oczekiwano w przypadku formy genu TGB mutowanej, a nie typu dzikiego Podobna analiza wirusowego RNA potomstwa z roślin zainfekowanych RNA 1, pB2-14-1 (mutacje przesunięcia ramki w genie P13 tworzącym miejsce anXhoI) i rep 13 lub rep 1315 analogicznie wykazała, ze mutacja unieszkodliwiająca kopię genu P13 na transkrypcie RNA 2 była zachowana w RNA 2 potomstwa Zatem rep42 i rep13 faktycznie komplementują funkcję P42 i P13 dostarczając produkt genowy in trans, raczej niż sbiżąjako źródło sekwencji TGB typu dzikiego dla rekombinacji.

Nieoczekiwanie replikon eksprymujący gen P15 typu dzikiego (rep 15) był niezdolny do komplementowania pB2-14-J mutanta RNA 2 wadliwego co do P15 w mieszanych mokulacjach. Na inokulowanych liściach 10 dni po inokulacji nie utworzyły się żądne miejscowe uszkodzenia i metodą Northern biot (fig. 4, pasek 17) nie można było wykryć w liściach żadnego wirusowego RNA. Z drugiej strony, gdy transkrypt pB2-14-J był koinkulowany z użyciem rep 1315, pojawiły się miejscowe uszkodzenia (typu nekrotycznego) i łatwo wykryto wirusowe RNA potomstwa (fig. 4, pasek 18) W tym ostatnim przypadku, analiza produktu RT-PCR zawierającego gen P15 w RNA 2 potomstwa ujawniła, ze mutacja unieszkodliwiająca gen była wciąż obecna Komplementacja pB2-14-J wciąż występowała, gdy ORF P13 w replikonie dicistronowym było przerwane przez mutację przesunięcia ramki (rep 1315-1; fig 1), pozwoliło to ustalić, ze ekspresja pełnej długości P13 z pierwszego ORF replikonu dicistronowego nie jest wymagana dla komplemcntacji przez kopię „w dół” genu P15.

189 499

Dowód, ze P15 jest eksprymowane z dicistronowego subgenomowego RNA

V tkance zainfekowanej BNYVV wykryto subgenomowy RNA wyprowadzony z RNA 2 (RNA 2subb) o długości około 1500 nukleotydów (2) 5'-Końcowy odcinek tego indywiduum nie był mapowany dokładnie, lecz przewiduje się. ze leży on w pobliżu końca 5' ORF P13 Nie wykryto subgenomowego RNA z końcem 5' ,.w górę’’ ORF P15, istnieje możliwość, ze tak jak w BSMV (8), obydwa P13 i P15 są eksprymowane z 2subb

Vyzej wspomniana niezdolność rep42 do komplementowania pB2-14-HPl - mutanta RNA 2 wadliwego co do P42 może mieć swoje źródło w polarnym wpływie delecji RNA 2 na syntezę białek TGB „w dół”, jeśli delecja unieszkodliwiła promotor 2subb RNA (lewostronna granica delecji w pB2-14-AHPl wynosi jedynie 30 reszt „w górę” kodonu inicjującego P13). Aby zbadać tę hipotezę, wykonano doświadczenie, w którym transkrypt pB2-14-AHP1 komplementowano zarówno rep42 jak i repl315. Liście inokulowane tą mieszaniną wykazały miejscowe uszkodzenia i zawierały wirusowe RNA potomstwa (fig. 4, pasek 20) Z drugiej strony, jeśli użyto rep13, a nie rep 1315 wraz z rep42, by komplementować pB2-24-HP1, nie pojawiły się żadne objawy i metodą Northern biot nie wykryto wirusowego RNA potomstwa (fig. 4, pasek 19). Obserwacje te są spójne z hipotezą, ze delecja pB2-14-HPl ingeruje w ekspresję ORF TGB „w dół”, przypuszczalnie przez blokowanie transkrypcji 2subb RNA. Ponadto fakt, ze komplementacja była pomyślna w rep 11315, lecz nie w repl3 wskazuje, ze P15, jak również P13 pochodzi z translacji z 2subb RNA

Niezalezna ekspresja P15 hamuje infekcję wirusowego RNA typu dzikiego

Zdolność rep 1315, lecz nie repl5, do komplementowania pB2-14-J - mutanta RNA 2 wadliwego co do P15 w infekcjach liści mogłaby wskazywać na to, ze niezalezna ekspresja P15 rephkonem monocistronikowym ingeruje w cykl infekcji wirusowej przez wytwarzanie produktu genowego w nadmiernych ilościach względem P13. Aby zbadać te hipotezę, przeprowadzono doświadczenie, w którym rep 15 inokulowano do liści C quinoa wraz z RNA 1 i 2 wirusowym typu dzikiego. Nie pojawiły się żadne uszkodzenia na mokulowanych liściach, nawet przy długich czasach po inokulacji (fig 5A) i nie wykryto wirusowego RNA metodą Northern blot (fig. 5B, pasek 6) Figura 5 (A) przedstawia liście C quinoa inokulowane RNA 1 i 2 (z lewej) lub RNA 1 i 2 plus rep 15 (z prawej) Liście sfotografowano 20 dni po inokulacji, gdy miejscowe uszkodzenia na liściu po lewej rozszerzyły się tak, ze pokryty większość powierzchni liścia. Na fig. 5(B), analiza metodą hybrydyzacji Northern (jak opisano na fig. 3) zawartości wirusowego RNA w liściach C quinoa mokulowanych samym RNA 1 i 2 wirusa BNYVV (pasek 1) lub wraz z rep0 (pasek 2), rep42 (pasek 3), rep 13 (pasek 4), rep 1315 (pasek 5), rep 15 (pasek 6), repl5-J (pasek 7), rep15-X (pasek 8) lub repPCV-P17 (pasek 9). Miejsca replikonów wskazano strzałkami (C) Analiza metodą hybrydyzacji Northern zawartości wirusowego RNA mokulowanych liści (paski 1, 3 i 5) i korzeni (paski 2, 4 i 6) Beta macrocarpa bądź próbnie inokulowanych (paski 1 i 2), mokulowanych RNA 1, 2 i 3 wirusa bNyVV (paski 3 i 4) lub RNA 1, 2 i 3 plus rep 15 (paski 5 i 6) RNA 3 włączono w mokulum, ponieważ jest to niezbędne dla przesunięcia układowego w B macrocarpa (22). V tych warunkach liście inokulowane samym RNA 1 i 2 były poważnie zainfekowane (fig. 5A, fig. 5B, pasek 2) Inhibitowanie infekcji wirusowej przez repl5 było zalezne od dawki. Dodanie 10 razy mniej rep 15 do mieszanki mokulum wciąż prowadziło do prawie pełnego hamowania tworzenia uszkodzeń lecz mniejsze ilości replikonu były postępujące mniej skuteczne w blokowaniu infekcji Rep15 blokował także pojawienie się wirusowego RNA potomstwa w inokulowanych liściach i korzeniach Beta macrocarpa, układowym gospodarzu BNYVV (fig. 5C, paski 5 i 6). Z drugiej strony, pusty replikom, rep0 i replikony eksprymujące dwa inne białka TGB (rep42, rep13, rep 1315) nie hamowały znacząco infekcji BNYVV liści C quinoa (fig 5B, paski 2-5).

Ponieważ rep 15 nie ingeruje w amplifikację RNA 1 i 2 w protoplastach C quinoa (patrz fig. 3), sugeruje to ze replikon ingeruje w pi zesuniecie wirusa z początkowego miejsca infekcji do sąsiadujących komórek (ruch z komórki do komórki) podczas tworzenia miejscowego uszkodzenia na liściach Tworzenie uszkodzenia nie było hamowane przez koinokulację RNA Stras 12 z użyciem replikonów rep15-J lub rep15-X (fig 5B, paski 7 i 8), które kodują formy P15 o obciętych przesunięciach ramki. To ustalenie potwierdza, ze dla hamowania podczas doświadczeń mieszanej infekcji wymagana jest raczej ekspresja P15 z replikonu niz prosta

189 499 obecność odpowiadającej sekwencji RNA Jednak w obecności rep15-X uzyskane miejscowe uszkodzenia stanowiły około jednej trzeciej średnicy uszkodzeń utworzonych przez infekcję z użyciem samego lub Stras 12 plus rep 15-J. a zawartość wirusowego RNA potomstwa w infekowanych liściach była znacząco niższa (fig 5B, pasek 8). Ustalenie to sugeruje, ze prawie pełnej długości cząsteczka P15 wytworzona przez rep15-X. chociaż niezdolna do podstawiania typu dzikiego P15 w doświadczeniu komplementowania, może ingerować w aktywność ruchu P15 typu dzikiego wytworzonego z RNA 2 z komórki do komórki Przypuszczalnie, pełnej długości i obcięte formy P15 współzawodniczą z sobą o miejsca wiązania na innym składniku (który mógłby być pochodzenia wirusowego lub komórkowego) związanym z procesem ruchu.

Jak zaznaczono powyżej, porównania sekwencji miedzy różnymi wirusami mającymi TGB ujawniły małe podobieństwo sekwencji między różnymi genami TGB3. Np. białko TGB3 o 17 kDa z furowirusa Peanut clump orzecha ziemnego (PCV) nie wykazuje znaczącego podobieństwa sekwencji z P15 BNYVV (4) chociaż obydwa wirusy mogą infekować C quinoa Aby określić, czy niezalezna ekspresja białka TGB3 PCV może ingerować w infekcję BNYVV w sposób podobny do obserwowanego w przypadku rep 15, skonstruowano replikon wyprowadzony z RNA 3 BNYVV zawierający TGB3 PCV (repPCV-P17; fig 1) Liście C quinoa inokulowane RNA 1 i 2 BNYVV plus repPCV-P17 nie wykazały objawów i nie można było wykryć RNA BNYVV potomstwa metodą Northern blot (fig. 5A, pasek 9). Ta obserwacja sugeruje, ze szlaki, którymi BNYVV i PCV poruszają się z komórki do komórki w C quinoa mają przynajmniej jeden wspólny element, który pomimo ich niepodobieństwa w sekwencji oddziaływa z produktami TGB3 obydwu wirusów

Wykazano, ze replikony zawierające P42 i P13 mogą komplementować RNA 2 BNYVV zawierające odpowiedni wadliwy gen, lecz ze replikon zawierający P15 nie może komplementować. W tym ostatnim przypadku, komplementacja może jednak wystąpić, jeśli gen P15 jest dostarczony jako drugi gen na dicistronowym RNA (rep 1315) niosącym gen P13 w pierwszej pozycji. Należy zaznaczyć, ze względna dyspozycja genów P13 i P15 na rep 1315 jest identyczna z ich dyspozycją na 2subb RNA, subgenomowym RNA. o którym uważa się, ze ukierunkowuje syntezę obydwu białek w infekcjach typu dzikiego. Sugeruje to, ze pomyślny ruch BNYVV z komórki do komórki wymaga obecności P13 i P15 w odpowiednich względnych ilościach i ze wytwarzanie obydwu białek z tego samego subgenomowego RNA przedstawia mechanizm koordynowania ich syntezy. Niezdolność rep 15 do komplementowania pB2-14-J-transkryptu RNA 2 mutanta P15 i jego zdolność do hamowania infekcji przez wirus typu dzikiego byłaby zatem spowodowana nadprodukcją P15 względem P13, zarówno gdy pierwszy z nich pochodzi z translacji z replikonu, jak i gdy drugi z nich pochodzi z translacji z RNA 2. Gdy P15 jest eksprymowany z dicistronowego replikonu rep 1315, z drugiej strony, byłyby wytwarzane odpowiednie względne poziomy P13-P15, umożliwiając postępowanie ruchu z komórki do komórki „Prawidlowe” względne poziomy nagromadzania P13 i P15 w infekcji typu dzikiego nie są znane. Translacja rep 1315 w ekstrakcie zarodków pszenicy wytworzyła trzy do pięciu razy więcej P13 niż P15, lecz takie doświadczenia niekoniecznie odzwierciedlają sytuację in planta ponieważ szybkości obrotu metabolicznego dwóch białek mogą się znacząco różnić. Należy zauwazyć, ze wyniki te wskazują, ze ruch z komórki do komórki, w którym pośredniczy TGB jest mniej wrażliwy na nadekspresję P42 i P13 względem „prawidłowych” poziomów charakterystycznych dla normalnej infekcji ponieważ koinokulacja rep42, rep13 lub rep 1315 w przypadku wirusa typu dzikiego nie hamowała infekcji (fig 5, paski 3-5), chociaż uszkodzenia wytworzone w obecności rep 13 i rep 1315 były nekrotyczne Zatem, wykazuje to, ze ekspresja P15 w roślinach transgenicznych mogłaby dostarczyć mechanizm indukowania odporności BNYVV („odporność wypiowadzona z patogenu”, odn. 23) w takich roślinach, pod warunkiem, ze osiąga się wystarczające poziomy ekspresji P15

Aby lepiej zrozumieć, jak względne poziomy P13 i P15 są regulowane podczas translacji należy poznać, jak jest uzyskiwany dostęp rybosomów na 2subb RNA do cistronu P15 Zainicjowanie translacji przy wewnętrznym cistrome eukariotycznego informacyjnego RNA może wystąpić za pomocą szeregu mechanizmów, włączając w to (i) nieszczelne skanowanie, gdy frakcja podjednostek rybosomowych, które rozpoczynają skanowanie RNA przy końcu 5' przesuwa się poza pierwszy (nieoptymalny) AUG „w górę” bez zainicjowania (24) i (ii) wej189 499 ście wewnętrzne, gdy podjednostki rybosomowe wiążą się bezpośrednio ze specjalną sekwencją na RNA w pobliżu wewnętrznego kodonu inicjującego (25). Trzeci możliwy mechanizm, zakończenie-powtórne rozpoczęcie, wydaje się niemożliwy do zastosowania do jakiegokolwiek z wirusów zawierających TGB ponieważ zachodzenie na siebie między cistronami TGB2 i TGB3 wymagałoby, by rybosomy skanowały wstecz po zakończeniu TgB2, aby osiągnąć kodon inicjujący TGB3. Zasugerowano, ze białka TGB3 BSMV i PVX są translowane przez mechanizm nieszczelnego skanowania (8, 9). Gen P15 BNYVV można także wytworzyć przez nieszczelne skanowanie, chociaż należy zaznaczyć, ze kontekst kodonu inicjującego P13 BNYVV (AUAAUGU) jest niemal optymalny i istnieją także dwa AUG „w dół”, które podjednostki skanujące zignorowałyby, by osiągnąć kodon inicjujący P15

Przykłady

Poniższe przykłady są opisują transformację rośliny wykonaną techniką opisaną w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 95/10178 włączonym do niniejszego tekstu jako odnośnik literaturowy

Materiał roślinny i warunki wzrostu były takie jak opisano w Hall i in , Plant Cell Reports 12, str. 339-342 (1993), Pedersen i in., Plant Science 95, str. 89-97 (1993) i Hall i in, Nature Biotechnology 14, 1996, w druku.

Wektory plazmidów i wytwarzanie DNA

Plazmid pET-P15 (zawierający sekwencję kwasu nukleinowego P15) poddano restrykcji w jego pojedynczym miejscu BamHI i zaopatrzono w tępy koniec z użyciem polimerazy DNA T4. Po oczyszczeniu przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, liniowy plazmid poddano restrykcji w pojedynczym miejscu Ncol. Fragment genu P15 o 400 bp oczyszczono przez elektroforezę i wstawiono w pMJBX-Ub [zawierający promotor poliubichityny Arabidopsis (Norris i in., Plant Molecular Biology 21, str 895-906 (1993), sekwencja enhansera TMV i terminator Nos 3')] obcięte endonukleazami restrykcyjnymi Ncol i Smal W tak otrzymanym plazmidzie (pMJBX-Ub-P15), sekwencja kwasu nukleinowego genu P15 jest umieszczona pod kontrolą promotora poliubichityny Arabidopsis, po którym następuje sekwencja enhansera TMV. Fragment EcoRI z plazmidu pB235SAck zawiera gen pat, zastosowany jak w markerze selektywnym, kodujący transferazę acetylową fosfinotrycyny (otrzymana z Agrevo, Berlin, Niemcy). W tym fragmencie EcoRI, sekwencja kwasu nukleinowego genu pat jest pod kontrolą sygnałów ekspresji 5' i 3' wirusa kalafiora Plazmid pMJBS6, uzyskany z kombinacji tego fragmentu EcoRI-pat i częściowego trawienia EcoRI plazmidu pMJBX-UbP15, zawiera zarówno geny pat jak i P15 Ten plazmid pMJBS6 jest plazmidem wysoce kopiowanym opartym na wektorze pUC18 i zawiera także gen -laktamazy (amp^). W plazmidzie pIGPD7, mieszczącym ten sam fragment pat co pB235SAck, gen -laktamazy zastąpiono przez gen igpd (dehydrataza fosforanowa lmidazologliceryny) z Saccharomyces cerevisiae (Struhl i in., Proceedings of the National Academy of Science USA 73, str. 1471-1475 (1976). Wybór i utrzymywanie plazmidu w Escherichia coli osiągnięto przez komplementację szczepu SB3930 auksotropowego hisB na pożywce minimalnej, w nieobecności antybiotyków Fragment P15, z jego promotorem ubichityny i sekwencją terminatora oczyszczono jako fragment o 2500 bp otrzymany z plazmidu pMJBX-Ub-P15 po jego cięciu w pojedynczym miejscu HindHf a następnie po częściowej restrykcji za pomocą EcoRI Fragment ten zakończono tępo i wstawiono w plazmid pIGPD7 o tępych końcach, cięty w pojedynczym miejscu Ncol. Uzyskany plazmid pIGPDS4 zawiera zarówno geny pat jak i P15 na wektorze bez genu β-laktamazy.

Materiał roślinny

Hodowle pędów roślinnych in vilro roślin buraka cukrowego zainicjowano, by zapewnić nadające się do wielokrotnego użycia i jednolite źródło sterylnego surowca i utrzymywano przy zachowaniu 4-tygodmowego okresu subhodowli, jak opisano w. Hall i in , Plant Celi Reports 12, str. 339-342 (1993) ‘

Wyodrębnienie na dużą skalę epidermy buraka cukrowego

Użyto zmodyfikowaną wersję sposobu z mieszarką do ciał sypkich według Kruse i in., Plant Physiology 690, str. 1382-1386 (1989) W przypadku każdego wyodrębnienia, 2 g liści (z usuniętymi żyłkami) z 4-tygodmowymi pędami mieszano w mieszarce Waringa przy maksymalnej szybkości (23000 obrlmin) przez 60 sekund w 250 ml zlewce metalowej zawierają16

189 499 cej 50 ml zimnej (4°C) pożywki Ficoll (100 g/l Ficoll. 735 mg/l CaCUżHLO. 1 g/l PVP40, autoklawowana). Następnie fragmenty epidermy odzyskano na Fiitrze nylonowym 297 pm i przemyto 500 ml sterylnej wody wodociągowej. Następnie wypłukano je z filtra do 9 cm szalki Petnego stosując 10 ml CPW9M zawierającego 3,8% (wag./obj ) CaCb’2H2O (Krens 1 in., Theoretlcal and Applied Genetics, 79, str. 390-396 (1990). Wszelkie pozostałe fragmenty usunięto i szalki preinkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Wyodrębnienie protoplastów komórki ochronnej ze wzbogaconych frakcji epidermy

Aby odzyskać frakcję epidermy, suspensję odwirowano przez 1 min przy 55 x g, a następnie usunięto supematant. Osad ponownie przeprowadzono w stan suspensji w 50 ml mieszaniny enzymu i 5 ml próbki przeniesiono do każdej z 10, 6 cm szalek Petriego (Greiner, jakość TC), zamknięto parafilmem i inkubowano przez noc w 25°C, w ciemności, delikatnie mieszając. Pożywka trawiąca składała się z CPW9M uzupełnionego o 0,5% (wag /obj.) Cellulase RS i 3% (wag./obj.) Macerozyme R10 (Yakult Honsha, Tokio, Japonia), pH 5,8. Następnego dnia rano protoplasty zasadniczo pływały blisko powierzchni mieszanki trawiącej Po delikatnym mieszaniu suspensji z użyciem sterylnej pipety w celu uwolnienia protoplastów wciąż przylegających do fragmentów nabłonka, produkty trawienia zebrano i przepuszczono przez filtry nylonowe 297 i 55 pm. Przesącz zmieszano z równą objętością izoosmotycznego Percoll zawierającego 15% (wag/obj.) sacharozy (PercolH5S) i rozdzielono do 12 x 12 ml probówek do wirowania. W każdej probówce pierwszy 1 ml CPW15S (Krens i in., 1990), a następnie 0,5 ml 9% (wag./obj.) mannitolu zawierającego 1 mM CaC1 (9M) starannie ułożono w warstwy u góry suspensji protoplastów Po odwirowaniu przy 55 x g przez 10 min zdolne do życia komórki ochronne były widzialne w pasmach przy powierzchni rozdziału CPW15S/9M Aby zatęzyć protoplasty, pasma te zebrano i zmieszano z Percoll 15S uzyskując końcową objętość 16 ml Następnie tę mieszaninę podzielono miedzy 2 probówki do wirowania, utworzono warstwy jak powyżej i powtórnie odwirowano W wyniku starannego usunięcia warstw 9M otrzymano wzbogaconą frakcję protoplastów komórek ochronnych dla następnego zliczania z użyciem hemocytometru

Transformacja protoplastów

Transformacje wykonano w 12 ml probówkach do wirówki, z których każda zawierała 1 x 10⁶ protoplastów przeprowadzonych w stan suspensji w 0,75 ml pożywki 9M. Dodano DNA plazmidu (50 pg pMJBX-Ub-P15 i p1GPDS4) i bezpośrednio po zmieszaniu wkroplono 0,75 ml pożywki PEG (40% PEG 6000 rozpuszczony w pożywce F (Krens i in , Naturę 296, str. 72-74, (1982)). Po starannym mieszaniu, suspensję utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy nieciągłym mieszaniu. Następnie, w odstępach 5 minut, dodano próbki 4 x 2 ml pożywki F Po odwirowywaniu przez 5 min przy 55 x g supernatant odrzucono, a osad protoplastów powtórnie przeprowadzono w stan suspensji w 9M i powtórnie odwirowano. Komórki ostatecznie przeprowadzono w stan suspensji w 1 ml pożywki 9M dla zliczania

Hodowla i selekcja protoplastów

Protoplasty osadzono w algimame Ca i hodowano w zmodyfikowanej, ciekłej pożywce K8P (Hall i in., 1990) Aby wybrać trwale transformowane komórki, po 7 dniach dodano bialaphos, związek aktywny Herbiace (Meiji Seika Ltd, Japonia), uzyskując końcowe stężenie 200 pg/l. Dnia 18, dyski alginianów pocięto na 3 mm plastry i przeniesiono do pożywki PGo (De Greef i Jacobs, Plant Science Letters 17, str. 55-61, 1979) uzupełnionej 1 pM BAP (PG1B) i 250 pg/l bialaphos, i zestalono z użyciem 0.8% agarozy.

Hodowla i regeneracja kallusa

Po 21 dniach, kawałki alginianu zawierające niewidoczne mikrokallusy przeniesiono do 9 cm szalek Petriego zawierających 20 ml pożywki K (3% sacharozy, 0,8% agarozy, 1 pM BAP, pożywka PGo, pH = 5,8, autoklawowane). Hodowlę prowadzono w ciemności, jak wyżej

Kruche, wodniste kallusy, które osiągnęły wielkość o średnicy w przyblizemu 1-2 mm indywidualnie zebrano i hodowano w grupach po 20 w świeżej pożywce K Na tym etapie, analizy PCR potwierdziły obecność transformantów

W odstępach dwutygodniowych wszystkie kallusy subhodowano na świeżej pożywce

Regeneranty pojawiły się podczas pierwszych 8 tygodni hodowli poszczególnych kallusów. Gdy pierwsze pędy były widoczne i osiągnęły wielkość około 2 mm, szalkę przeniesiono do światła (3000 luksów), 25°C, 15 godzin dziennie

189 499

Rośliny o długości około 4 mm przeniesiono do indywidualnych probówek do hodowli zawierających 15 ml pożywki K i dalej subhodowano w świetle jak wyżej.

Ukorzenienie i przeniesienie do gleby

Gdy rośliny osiągnęły etap czterech liści (zwykle po 5 - 6 tygodniach; przy jednej subhodowli po 3 tygodniach), przeniesiono je do probówek do hodowli zawierających 15 ml pożywki L (3% sacharozy, 0,8% agarozy, 25 pM kwasu indolomasłowego (1BA), pożywka PGo, pH=5,8, autoklawowane) (pożywkę PGo opisali De Greef W i in., Plants Science Letters 17, str. 55-61 (1979)) i dalej hodowano jak wyżej

Gdy co najmniej jeden korzeń osiągnął długość 1 cm, rośliny usunięto z probówek do hodowli i przemyto pod bieżąca wodą wodociągową w celu usunięcia wszystkich fragmentów agaru i przeniesiono do gleby w 9 cm doniczkach, w szklarni.

Rośliny przykryto przeźroczystą plastikową miseczką, aby zapewnić wilgotne środowisko przez 7 dni, po czym mogły one rosnąć bez ochrony

Roślinę transformowaną przez sekwencje SEQ ED NO 1 odzyskano, a P15 poddano ekspresji.

Analiza DNA

Genomowy DNA wyodrębniony z pierwotnych transformant, po działaniu enzymami restrykcyjnymi poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym i przeniesiono na membrany nitrocelulozowej stosując standardowe procedury, zgodnie z protokołem producenta. Hybrydyzację wykonano z użyciem DNA, jako sond znaczonych a^j2P-dATP, których obecność jest pożądana dla ustalenia. Membrany przemyto do końcowej ostrości wymagań 0,1% x SSC, 0,1% SDS w 60°C Hybrydyzowane DNA wizualizowano przez ciemnienie błony rentgenowskiej przez 24-48 godzin.

Analiza PCR

Zastosowano standardowe techniki PCR do wykrywania niezmienionych sekwencji plazmidu. Reakcje wykonano stosując 25 cykli 1 minutowej denaturacji w 94°C, 1 minutową hybrydyzację; 2 minutowe wydłużenie w 72° C z końcowym 5 minutowym okresem wydłużenia. Temperatury hybrydyzacji zoptymalizowano dla każdej kombinacji primera Obecność obszaru kodującego genu P15 BNYVV w genomie buraka cukrowego zweryfikowano przez PCR stosując parę oligonukleotydów jako primery MOV1, primer sensowny (5'-GGTGCTTGTGGTTAAAGTAGATTTATC-3' (nukleotydy 3-29 w SEQ 1D NO 1) i primer antysensowny MOV2 [5'-CTATGATACCAAAACCAAACTATAGAC-3' (komplementarny względem nukleotydów 369-395 w SEQ 1D NO 1)] Ten fragment o długości 393 bp obejmuje cały obszar kodujący genu P15 dla BNYVV (patrz fig 7)

Figura 7: Analiza produktów PCR otrzymanych z użyciem DNA buraka cukrowego z transformantów P15 (pasek 5 do 7) i z nietiansformowanej rośliny (pasek 4) Jako marker wielkości (pasek 1) zastosowano Low DNA Mass Ladder® (Life Technologies) Paski 2 i 3 odpowiadają pozytywnym próbkom kontrolnym (pMJBS6/plGPDS4). Strzałka po lewej stronie wskazuje miejsce spodziewanego produktu PCR.

Analiza hybrydyzacji Southern biot

Integrację genu P15 BNYVV w genomie buraka cukrowego zweryfikowano metodą hybrydyzacji Southern biot. Całość DNA pierwotnych regenerantów transgenicznych wyodrębniono, wytrawiono enzymami restrykcyjnymi (Pstl, Kpn1, Ncol. SacI), poddano elektroforezie, blotowano i hybrydyzowano z użyciem znaczonych ^P sond specyficznych względem P15 BNYVV, stosując fragment MOV1-MOV2 amplifikowany PCR (patrz fig 8)

Figura 8: Analiza Southern biot Jako marker wielkości (pasek 1) zastosowano DNA lambda wytrawiony Hindili. Paski 2-16, DNA transgemków. 2-4 wytrawione z użyciem SaC1, 6-8 wytrawione z użyciem Pstl, 10-12 wytrawione z użyciem Ncol, 14-16 wytrawione z użyciem Kpn1. Paski 5, 9, 13 i 17 odpowiadają roślinie nietransformowanej.

189 499

Literatura:

1. Richards K.E. i Tamada T., Annu Rev Phytopathol 30, str 292-313 (1992),

2. Gilmer D i wsp , Virology 189, sti. 40-47 (1992);

3. Bouzoubaa S i wsp., J Gen Virol 68, str 615-626 (1987);

4. Herzog E. i wsp., J Gen Virol 18. str 3147-3155 (1994),

5. Scott K.P. i wsp., J Gen Virol 75, str 3561-3568 (1994) ,

6. Koonin E.V. i Dolja V.V., Crit Rev Biochem and Mol Biol 28, str 375-430 (1993);

7. Schmitt C. i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 89, str 5715-5719 (1992);

8. Morozov S.Y. i wsp., J Gen Virol 72, str. 2039- 2042 (1991),

9. Zhou H. i Jackson A.O., Virology 216, str 367-379 (1996),

10. Quillet L i wsp., Virology 172, str. 293-301 (1989);

11. Bleykasten i wsp., J. Gen Virol 77, str 889-897 (1996);

12. Jupin I. i wsp., Virology 178, str. 273-280 (1990),

13. Sanger F i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 74, str 5463-5467 (1997),

14. Fntsch C. i wsp. J. Gen Virol 46, str. 381-389 (1980);

15. Laemmli U.K., Nature 227, str 680-685 (1972),

16. Schagger H i von Jagow G., Anal Biochem 166, str. 368-379 (1987);

17. Lemaire O. i wsp., Virology 162, str 232-235 (1988),

18. Niesbach-Klosgen U. i wsp., Virology 178. ^^r 52-61 (1990),

19. Hehn A. i wsp , Virology 210, str. 73-81 (1995);

20. Tamada T. i wsp, J. Gen Virol 70, str 3399-3409 (1989),

21. Kozak M., J. Cell Biol 108, strony 299-241 ( 1989),

22. Pelletier J , Sonenberg N , Nature 334, str 320-325 (1988),

23. Tamada T. i Baba T., Annals of the Phytopathological Society ofJapan 39, str. 325-332 (1973);

Kuszala M. i Putz C., Annals of Phytopathology 9, str 435-446 (1977),

25. Keskm B.. Archiv fur Mikrobiology 99, str 348-374 11964),

26. A^^hi^r Rhizomania w The sugcn· beet cup. ed DA Cooke and R.K Scott,

Chapman & Hali, London, str 312- 338 (1993),

27. Richard-.Molard M,. Rhizomanie w Institul franęats de Co betterace industrielle Compte-rendu des trcvaux effectues en 1994, 1TB, Pans, str 225-229 (1S^<?^);

28. Henry C.M. i wsp., Plant Pathology 41, str 483-489 (1992),

29. Grassi G. i wsp . Phytopath Medit 28. str 131-139 (1989);

30. Merdinoglu D . i wsp . Acad Agric Fr· 79. nr 6. str . 85-^8 (19B>3),

31. Scolten O.E. i wsp , Archives of Virology 136. ^^r 349-36. (1994);

32. Buttenr G. i Biircky K., Proceedings of the First Symposium of the International Working Group on Plant Viruses with Fungal Vectors, Braunschweig Niemcy, 21-24 sierpma (1990);

Whitney E.D. Plant Disease 72, sb 287-289 (1989),

34. Powel. A.P ί wsp,. Science 232. str 728-743 (1986);

35. Fritchen J.H . . Beachy R N,. Ann Rev Microbiol 47. str 73 9-767 (1993 ,.

36. Wilson TM A,. Proc Natl Acad Set USA 90. str 31343314. (1993);

37. Gonsalves D. i Slightom J L, Seminars m Virology 4. ^^r 397-405 (1993),

38. D'Halluin K i wsp . Biotechnology 10. st. 309-314 (1992),

Kallerhof J. i wsp,. Plant Cell Reports 9. sir 224- 228 (1990),

40. Ehlers U Theoretical and Applied Genetic 81. str 777—'8^21199)),

41. Kraus J . wsp . Field performance of transgenic sugar beet plants expressng BNYVV coct protein plants, Fourth Internationa! Congi-ess of Plant Molecular Biology, Int Soc for Plant Molecular Biology,. Amsterdam (1994);

42. Maiss E i wsp,. Proceedings of the Third International Symposium on the Biosafely Results o f Field Tests of Genetically Modified Plants and MniCfoorganisms, Monterey, str. 129-139 (1994);

43. Norris i wsp., Plant Molecular Biology 21. ^tr 895- 906( 1993)

189 499 \Ζ

FIG. 1

2.

«. ¹

7. 3 Μ-

FIG. 2

189 499

FIG. 3

2 3 4 5 6 7 3 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

FIG. 4

B C

A

189 499

1/1 ATG M

GTG V

CTT L

GTG V

GTT V

AAA K

GTA V

GAT D

TTA L

TCT S

:31111 AAT ATT N I

GTA V

TTG L

TAC I

ATA I

GTT V

GCC A

GGT G

TGT C

61/21

91311

GTT

GTT

GTC

AGT

ATG

TTG

TAC

TCA

CCA

ttt

TTC AGC

AAC

GAT

GTT

AAA

GCG

TCC

AGC

TAT

V

V

V

S

M

L

Y

S

P

F

F S

N

D

V

K

A

S

S

T

121/41

1£^1551

GCG GGA

GCA

ATT

TCT

AG

GGG AGC

GGC

T^^T

ATC AAG

GGA

AAG

AM

TCG

TTT

GGT

CCA

TTT

A

G

A

1

F

K

G

S

G

C

I M

D

R

N

S

F

A

Q

F

181/61

211/71

GGG AGT

TGC

GAT

ATT

CCA

AAG

CAT

GTA

GCC

GAG TCC

ATC

ACT

AAG

GTT

GCC

ACC

AAA

GAG

G

S

C

D

1

F

K

H

V

A

E S

I

T

K

V

A

T

K

E

241/81 271911

CAC GAT GTT GAC ATA ATG GTA AAA AGG GGT GAA GTG ACC GIT CGT GTT GTG ACT CTC ACC

H D

V

D

1

M

V

K

R

G

E V

T

V

R

V

V

T

L

T

301/101

331111

GAA ACT

ATT

TTT

ATA

ATA

T^TA

TcGT

AGA

TG

TTT GGT

TTG

GVG

GTG

TTT

TTG

TT^C

A1TT3

AAA

E T

1

F

1

1

L

S

R

L

F G

L

A

V

F

L

F

M

I

361/121

3911131

TGT TTA

AAT

TCT

ATA

GTT

TGG

TTT

TGG

TAT

CAT AGA

TAA

C L

M

s

1

V

W

F

W

Y

H R

*

FIG 6

SEO ID NO. 1

189 499

co

FIG

Depaitament Vydawnictw UP RP Nakład 50 egz Cena 4,00 zł

Claims (19)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób indukowania odporności na wirus BNYVV zawierający sekwencję bloku 3 potrójnego genu w komórce rośliny lub w roślinie, zwłaszcza wybranej spośród C quinoa i buraków, znamienny tym, ze:

   - wytwarza się konstrukt kwasu nukleinowego obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą co najmniej 70% sekwencji kwasu nukleinowego bloku 3 potrójnego genu tego wirusa lub jego odpowiedniego cDNA, połączonego funkcjonalnie z jedną lub większą liczbą aktywnych w roślinie sekwencji regulacyjnych,

   - transformuje się komórki rośliny tym konstruktem kwasu nukleinowego, i ewentualnie

   - z transformowanej komórki rośliny regeneruje się roślinę transgeniczna.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego konstruktu kwasu nukleinowego odpowiada co najmniej 90% sekwencji kwasu nukleinowego bloku 3 genu potrójnego wirusa BNYW lub jego komplementarnego cDNA.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że komórka roślinna jest komórką szparkową.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze rośliną jest burak, korzystnie burak cukrowy - Beta vulgaris.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze sekwencja kwasu nukleinowego bloku 3 potrójnego genu wirusa BNYW jest zawarta między nukleotydami 3627 i 4025 nici 5' genomowego lub subgenomowego RNA 2 wirusa BNYW.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze sekwencja regulacyjna zawiera aktywną w roślinie sekwencję promotora lub aktywną w roślinie sekwencję terminatora.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że sekwencja promotora jest konstytutywną lub obcą roślinną sekwencją promotora.
8. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, ze sekwencja promotora jest wybrana spośród promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S i/lub promotora poliubichityny Arabidopsis thaliana.
9. 9. Sposób według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienny tym, że sekwencja promotora jest promotorem, który jest aktywny głównie w tkance korzenia roślin, takim jak par promotor genu hemoglobiny z Perosponia andersonii.
10. 10. Roślina transgeniczna odporna na wirus BNYW, zawierająca konstrukt kwasu nukleinowego mający sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą w co najmniej 70% sekwencji kwasu nukleinowego bloku 3 genu potrójnego wirusa BŃYW lub jego odpowiedniego cDNA, połączonego funkcjonalnie z jedną lub większą liczbą aktywnych w roślinie sekwencji regulacyjnych, zwłaszcza wybranej z grupy obejmującej C. quinoa i buraki.
11. 11. Roślina transgeniczna według zastrz. 10, znamienna tym, że konstrukt kwasu nukleinowego ma sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą co najmniej 90% sekwencji kwasu nukleinowego bloku 3 genu potrójnego wirusa BNYW lub jego komplementarnego cDNA.
12. 12. Roślina transgeniczna według zastrz. 10 albo 11, znamienna tym, że jest burakiem, korzystnie burakiem cukrowym - Beta vulgaris.
13. 13. Roślina transgeniczna według zastrz. 10, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego bloku 3 genu potrójnego wirusa BNYW jest zawarta między nukleotydami 3627 i 4025 nici 5' genomowego lub subgenomowego RNA 2 wirusa BNYVV lub jego odpowiedniego cDNA.
14. 14. Roślina transgeniczna według zastrz. 10, znamienna tym, że sekwencja regulacyjna zawiera aktywną w roślinie sekwencję promotora i aktywną w roślinie sekwencję terminatora.

    189 499
15. 15. Roślina transgeniczna według zastrz. 14, znamienna tym, ze sekwencja regulacyjna zawiera sekwencję promotora, która jest konstytutywną lub obcą roślinną sekwencją promotora.
16. 16. Roślina transgeniczna według zastrz. 15, znamienna tym, że sekwencja promotora jest wybrana z grupy obejmującej promotor wirusa mozaiki kalafiora 35S i/lub promotor poliubichityny Arabidopsis thaliana.
17. 17. Roślina transgeniczna według zastrz. 15 albo 16, znamienna tym, ze sekwencja promotora jest promotorem, który jest aktywny głównie w tkankach korzenia, takim jak par promotor genu hemoglobiny z Perosponia andersonii.
18. 18. Transgeniczna tkanka roślinna wybrana spośród tkanek: owocu, łodygi, korzenia, bulwy, nasienia rośliny określonej w zastrz. 10.
19. 19. Struktura odtwarzalna otrzymana z rośliny transgenicznej określonej w zastrz. 10.

    Wynalazek dotyczy sposobu indukowania odporności na wirus BNYW, rośliny transgenicznej odpornej na wirus BNYW, transgenicznej tkanki roślinnej i struktury odtwarzalnej otrzymanej z rośliny transgenicznej.

    Rozpowszechniona wirusowa choroba rośliny buraka cukrowego (Beta vulgaris) o nazwie rizomania buraka jest powodowana przez furowirus, Beat necrotic yellow vein virus (BNYW) (23, 24), który trafia do korzenia buraka przez przenoszony przez glebę grzyb Polymyxa betae (25).

    Choroba dotyczy w znaczący sposób obszaru uprawy buraka cukrowego do celów przemysłowych w Europie, USA oraz Japonii i wciąż rozpowszechnia się w szeregu miejscach Europy Zachodniej (26, 27). Ponieważ nie istnieje praktyczny sposób skutecznej kontroli rozprzestrzeniania się wirusa na duzą skalę środkami chemicznymi lub fizycznymi (28) w roślinach ani w glebie, najwięcej uwagi poświęcono zidentyfikowaniu naturalnych źródeł odporności w obrębie zarodkoplazmy buraka cukrowego i opracowaniu poprzez hodowlę odmian buraka cukrowego poddających ekspresji geny odpornościowe. Zidentyfikowano szereg genów tolerancji względem tego wirusa, a pewne z nich pomyślnie zastosowano w uprawie handlowych odmian buraka cukrowego (29, 30, 31).

    Jedynie zastosowanie odmian tolerancyjnych lub odpornych na wirus BNYW umożliwi rolnikom uprawę buraków cukrowych na obszarach zainfekowanych przez BNYW, gdzie burak cukrowy stanowi zasadniczy element płodozmianu i stanowi znaczący składnik dochodów rolników.

    Szereg szczegółowych badań wskazało, że różnica między podatnością na infekcję wirusem BNYW między genotypami lub odmianami buraka cukrowego zasadniczo jest odbiciem różnicy w dyfuzji lub translokacj i wirusa w tkankach korzenia (32).

    Jednak wciąż jest kilka doniesień wskazujących wyraźnie, ze geny tolerancji, nawet z różniących się źródeł zarodkoplazmy buraka cukrowego lub pokrewnej zarodkoplazmy dzikiej (33), dostarczyłyby wyraźnych mechanizmów odporności. Taka sytuacja dawałaby lepszą możliwość zaprojektowania długotrwałych strategii odporności na BNYW.

    Od 1986 w szeregu doniesieniach i publikacjach opisywano zastosowanie wyodrębnionych sekwencji genu wirusowego eksprymowanych w roślinie, by nadać wysoki poziom tolerancji względem wirusa lub nawet by nadać szerokie spektrum odporności względem szeregu pokrewnych wirusów (34, 35, 36). Jedną z najlepiej udokumentowanych strategii odporności wirusowej opartej na inżynierii genetycznej, przy wielu uprawianych gatunkach, takich jak ziemniak, kabaczek, ogórek lub pomidor, jest zastosowanie sekwencji genu wirusowego kodującej białko powłoki docelowego wirusa (37), która pod kontrolą elementów regulacyjnych rośliny będzie eksprymowana w roślinie.

    Jednak w przypadku odporności zachodzącej za pośrednictwem białka powłoki, ekspresję pewnego poziomu odporności w roślinie transgenicznej można przypisać różnym mechanizmom, takim jak kosupresja RNA, a niekoniecznie wytwarzaniu sekwencji białkowej.

    Generalnie, sekwencja wirusowa będzie transformowana w odpowiedniej hodowli komórkowej lub tkankowej gatunku rośliny z użyciem układu transformacji za pośrednictwem

    189 499

    Agrobacterium lub metodę bezpośredniego przeniesienia genu zgodnie z warunkami wiążącymi metody hodowli tkankowej lub komórkowej, które można pomyślnie zastosować w danym gatunku. Cała roślina zostanie zregenerowana, natomiast ekspresja transgenu będzie scharakteryzowana.

    Chociaż burak cukrowy jest znany jako gatunek oporny w hodowli komórkowej, co ogranicza stopień praktycznych zastosowań inżynierii genetycznej w tym gatunku, istnieje szereg sporadycznych doniesień o pomyślnej transformacji i regeneracji całych roślin (38). Opublikowano także pewną liczbę przykładów uzyskiwania metodami inżynierii genetycznej tolerancji względem BNYVV przez transformowanie i poddanie ekspresji sekwencji białka powłoki wirusa BNYVV w genomie buraka cukrowego (39, WO 91/13159), chociaż rzadko są podawane dane na temat całych funkcjonalnych roślin transgenicznych buraka cukrowego (40). W szczególności, raporty podają ograniczoną ilość danych dotyczących odporności obserwowanej w stanach zainfekowanych z transgenicznymi roślinami buraka cukrowego transformowanymi genem kodującym sekwencję białka powłoki BNYVV (41, 42).

    Pełen pakiet technologiczny obejmujący metodę transformacji buraka cukrowego i zastosowanie ekspresji sekwencji białka powłoki BNYW jako źródła odporności w transgenicznej roślinie buraka cukrowego otrzymanej wskazanym sposobem transformacji opisano w zgłoszeniu patentowym WO 91/13159.

    W oparciu o opublikowane informacje nie można wywnioskować, że mechanizm odporności za pośrednictwem białka powłoki zapewnia jakikolwiek potencjał dla nadania roślinie buraka cukrowego całkowitej odporności na infekcję BNYVV przez całkowite hamowanie mechanizmów rozmnażania i dyfuzji wirusa. Określenie mechanizmu odporności, który umożliwia znaczące blokowanie rozprzestrzeniania się wirusa we wczesnym stadium procesu infekcji stanowiłoby główne kryterium sukcesu rozwinięcia odporności transgenicznej, przy uwzględnieniu faktu, że nawet poziom odporności porównywalny z poziomami znanymi dla genów odporności zidentyfikowanych w zarodkoplazmie buraka cukrowego zróżnicowałby dostępne mechanizmy odporności.

    Ponieważ wykazano, że choroba rozszerza się w wielu krajach i obszarach, z szybkością zależną od kombinacji licznych lokalnych czynników środowiskowych i rolniczych, istnieje znaczne zainteresowanie zróżnicowania źródeł mechanizmów odporności genetycznej, które mogą, same lub w połączeniu nadać stałą i długotrwałą strategię odporności w obecnych i przyszłych odmianach roślin buraka cukrowego hodowanych dla celów przemysłowych.

    W publikacji Xu H. i in. (Plant Cell Report, tom 15, str. 91-96 (1995)) opisano uzyskany metodami inżynierii genetycznej konstrukt odporności na wirus mozaiki X ziemniaka w czterech handlowych odmianach ziemniaka. Wspomniany dokument donosi o transgenicznych klonach ziemniaka zawierających gen 8KG (konstrukt TGB3). Jednakże w przypadku, gdy takie rośliny transgeniczne prowokowano PVX, nie występowała ochrona przed PVX, co sugeruje, że białko OK nie odgrywa roli w ochronie przeciw PVX.

    Celem wynalazku jest dostarczenie nowego sposobu wprowadzania różnych odporności wirusowych do komórki i do rośliny oraz zapewnienie komórki i rośliny odpornej na wirusy otrzymywanych tym sposobem.

    Głównym celem wynalazku jest zatem dostarczenie nowego sposobu wprowadzania odporności na wirus BNYW do komórki i rośliny oraz dostarczenie komórki i rośliny odpornej na BNYW, w szczególności komórki i rośliny buraka cukrowego (Beta vulgarls ssp.).

    Wynalazek dotyczy więc sposobu indukowania odporności na wirus BNYW zawierający sekwencję bloku 3 potrójnego genu w komórce rośliny lub w roślinie, zwłaszcza wybranej spośród C quinoa I buraków, w którym:

    - wytwarza się konstrukt kwasu nukleinowego obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą co najmniej 70% sekwencji kwasu nukleinowego bloku 3 potrójnego genu tego wirusa lub jego odpowiedniego cDNA, połączonego funkcjonalnie z jedną lub większą liczbą aktywnych w roślinie sekwencji regulacyjnych,

    - transformuje się komórki rośliny tym konstruktem kwasu nukleinowego, i ewentualnie

    - z transformowanej komórki rośliny regeneruje się roślinę transgeniczną..

    189 499

    Korzystnie sekwencja kwasu nukleinowego konstruktu kwasu nukleinowego odpowiada co najmniej 90% sekwencji kwasu nukleinowego bloku 3 genu potrójnego wirusa BNYVV lub jego komplementarnego cDNA.

    V innej korzystnej postaci komórka roślinna jest komórką szparkową.

    Korzystnie rośliną jest burak, szczególnie korzystnie burak cukrowy - Beta vulgaris.

    V sposobie według wynalazku korzystnie sekwencja kwasu nukleinowego bloku 3 potrójnego genu wirusa BNYVV jest zawarta między nukleotydami 3627 i 4025 nici 5' genomowego lub subgenomowego RNA 2 wirusa BNYVV.

    V dalszej korzystnej postaci wynalazku sekwencja regulacyjna zawiera aktywną w roślinie sekwencję promotora lub aktywną w roślinie sekwencję terminatora, korzystniej sekwencja promotora jest konstytutywną lub obcą roślinną sekwencją promotora, a zwłaszcza sekwencja promotora jest wybrana spośród promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S i/lub promotora poliubichityny Arabidopsis thaliana V szczególnie korzystnej postaci sekwencja promotora jest promotorem, który jest aktywny głównie w tkance korzenia roślin, takim jak par promotor genu hemoglobiny z Perosponia andersonii.