JP2004537288A

JP2004537288A - パパイヤ輪紋ウイルス遺伝子

Info

Publication number: JP2004537288A
Application number: JP2002582262A
Authority: JP
Inventors: デニスゴンサルべス; チュー−フイチャン; ポーラエフ．テンナント; キャロルブイ．ゴンサルベス; ノングラックサリンドゥ; マノエルテクセイラジュニア．ソウザ; オスマーニッケル; グスタボアルベルトフェルミンムノズ; サンジャイサクセナ; ウェンキカイ
Original assignee: コーネルリサーチファンデーションインコーポレーテッド
Priority date: 2001-04-11
Filing date: 2002-04-11
Publication date: 2004-12-16
Also published as: AU2002307322B9; US7553668B2; WO2002083925A2; AU2002307322B2; BR0208888A; US20070089197A1; JP2008283978A; US7078586B2; MXPA03009235A; WO2002083925A3; US20030172397A1

Abstract

本発明は、カポホ(Kapoho)(KA)、ケアウ(Keaau)(KE)、タイ(TH)、ブラジル(BR)、ジャマイカ(JA)、メキシコ(ME)、ベネズエラ(VE)、およびオアフ(Oahu)(OA)株におけるパパイヤ輪紋ウイルスのコートタンパク質をコードする核酸配列の単離および同定、ならびにウイルス性抵抗をパパイヤ植物に与えるためのそれらの使用に関する。また、本発明は、個々のまたは多数のパパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそのような構築物を含む宿主細胞およびトランスジェニック植物に関する。本発明はまた、パパイヤ輪紋ウイルスに対して植物に抵抗性を与えるこのような構築物を使用する方法に関する。

Description

【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、パパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列の単離および精製、1つまたは複数の単離ウイルスコートタンパク質核酸配列を含む構築物で植物を形質転換することによってパパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗力を与える方法、並びにこのような多数のウイルス核酸構築物で形質転換されたトランスジェニック植物および種子に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
パパイヤ（Carica papaya L.）は、熱帯および亜熱帯の低地の領域において広く栽培される重要な果実作物である（Manshardt,「Papaya in Biotechnology of Perennial Fruit Crops」、Hammerschlag編、21: 489-511, CAB Int., Wallingford, UK （1992））。世界的に、ブラジル、インド、およびメキシコは、パパイヤの最大の生産地である。米国におけるパパイヤの最大の生産地であるハワイは、全ての生鮮生産の66％を、主に米国本土に対し、および日本に対して輸出する（Martin, 「Papaya Production Statistics」, Proc. Annu. Hawaii Papaya Ind. Assoc. Conf., 39th, Kihei, pp. 31-36, Sept. 23-24 （1994））。総生産では、パパイヤが苺より上に順位し、グレープフルーツの下に順位する（Manshardt, 「Papaya in Biotechnology of Perennial Fruit Crops」, Hammerschlag編, 21: 489-511, CAB Int., Wallingford, UK （1992））。FAOは、1995年に約5,700,000計量トンの果実が収穫され、1980年のほとんど二倍の収穫であると見積もった（Galinsky, 「World Market for Papaya」, Reg. Agribus. Proj. Mark. Inf. Bull. Feb. No. 12, 5 pp. （1996））。
【０００３】
パパイヤ輪紋ウイルス（「PRSV」）は、植物ウイルスのポティウイルス（potyvirus）群のメンバーであり、これはいくつかの作物植物に病原性であり、異なる植物ファミリのメンバー間で相互感染性を示す。一般的に、ポティウイルスは、一本鎖の（+）RNA植物ウイルスである。ウィルスゲノムは、長さが約10,000塩基である。ポティウイルスの発現方法は、正方向のウイルスゲノムRNAから、完全なポリタンパク質を翻訳することを含む。PRSVは、これまでに、パパイヤに感染する最も広範囲に広がり、かつ損害を与えるウイルスであり、パパイヤが栽培されるところで世界的に発生している（Purcifull, 「Papaya Ringspot Virus」, CMI/AAB Descr. Plant Viruses, No. 292 （No. 84 Revis., July 1984） 8 pp. （1984））。PRSVの感染により、近年ブラジル、台湾、およびハワイにおけるパパイヤ業界の荒廃を生じる結果となった（Gonsalves, D., 「Control of Papaya Ringspot Virus in Papaya: A Case Study」, Annu. Rev. Phytopathol. 36: 415-37 （1998））。PRSVによる作物の感染を制御または阻止するために、種々の試みがなされたが、これらは概して不成功であった。
【０００４】
寄生生物に由来する抵抗性（「PDR」）の概念は（1980年代の中間に考えられた）、PRSVを制御するための新たなアプローチを提供した（Sanfordら、「The Concept of Parasite-Derived Resistance-Deriving Resistance Genes from the Parasite's Own Genome」, J. Theor. Biol. 113: 395-405 （1985））。寄生生物に由来する抵抗性は、寄生生物の遺伝子もしくは配列を含むトランスジェニック植物が、同じかまたは関連した病原体の有害効果に対して保護されることによる現象である。植物ウイルスについてのPDRの適用は、タバコモザイクウィルスのコートタンパク質遺伝子を発現するトランスジェニックタバコが、タバコモザイクウィルスによる感染に対して保護されたときに初めて示された（Powell Abelら、「Delay of Disease Development in Transgenic Plants that Express the Tobacco Mosaic Virus Coat Protein Gene」, Science, 232: 738-43 （1986））。次の報告では、このアプローチが多くの植物ウイルスの制御に有効であることを示した（Lomonossoff, G. P., 「Pathogen-Derived Resistance to Plant Viruses」, Ann. Rev. Phytopathol. 33: 323-43 （1995））。
【０００５】
PDRに関する報告の大多数は、制御の標的とされるウイルスのコートタンパク質遺伝子を利用している。トランスジェニック植物の試験は、主に実験室および温室実験に制限されていたが、多くの報告により、抵抗性は、野外条件下で有効であることが示された（Grumet, R., 「Development of Virus Resistant Plants via Genetic Engineering」, Plant Breeding Reviews 12: 47-49 （1994））。2つのウイルス抵抗性作物は、米国農務省の動植物衛生検査部（「USDA/APHIS」）によって規制撤廃され、したがって、米国における環境への無制限の放出は承認されている。カボチャモザイクウイルス2およびズッキーニ黄色モザイクポティウイルスに抵抗性であるカボチャは商業化されている（Fuchsら、「Resistance of Transgenic Hybrid Squash ZW-20 Expressing the Coat Protein Genes of Zucchini Yellow Mosaic Virus and Watermelon Mosaic Virus 2 to Mixed Infections by Both Potyviruses」, Bio/Technology 13: 1466-73 （1995）; Tricoliら、「Field Evaluation of Transgenic Squash Containing Single or Multiple Virus Coat Protein Gene Constructs for Resistance to Cucumber Mosaic Virus, Watermelon Mosaic Virus 2, and Zucchini Yellow Mosaic Virus」, Bio/Technology 13: 1458-65 （1995））。また、PRSVに抵抗性であるトランスジェニック・ハワイアンパパイヤも開発されている（Fitchら、「Virus Resistant Papaya Derived from Tissues Bombarded with the Coat Protein Gene of Papaya Ringspot Virus」, Bio/Technology 10: 1466-72 （1992）; Tennantら、「Differential Protection Against Papaya Ringspot Virus Isolates in Coat Protein Gene Transgenic Papaya and Classically Cross-Protected Papaya」, Phytopathology 84: 1359-66 （1994））。この抵抗性トランスジェニックパパイヤは、USDA/APHISによって最近規制撤廃された。ハワイのパパイヤ業界は、PRSVによって荒廃しているので、トランスジェニックパパイヤの規制撤廃は、時宜を得ている。
【０００６】
病原体由来の抵抗性の種々の形態に関与するメカニズムの不十分な理解にも関わらず、抵抗性トランスジェニック植物の開発がなされたことは、注目に値する（Lomonossoff, G. P., 「Pathogen Derived Resistance to Plant Viruses」, Ann. Rev. Phytopathol. 33: 323-43 （1995））。大部分の報告が、抵抗性を与えるためにコートタンパク質遺伝子の使用を論じるが、ウイルス性レプリカーゼ（Golemboskiら、「Plants Transformed with a Tobacco Mosaic Virus Nonstructural Gene Sequence are Resistant to the Virus」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6311-15 （1990））、運動タンパク質（Beckら、「Disruption of Virus Movement Confers Broad-Spectrum Resistance Against Systemic Infection by Plant Viruses with a Triple Gene Block」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10310-14 （1994））、potyvirusesの核封入a-プロテアーゼ（「NIaプロテアーゼ」）（Maitiら、「Plants that Express a Potyvirus Proteinase Gene are Resistant to Virus Infection」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6110-14 （1993））、およびその他のウィルス遺伝子をコードするその遺伝子も、抵抗性を与えるために有効であることが、多くの報告により示されている。さらに、ウイルス遺伝子は、翻訳可能および翻訳可能ではないセンス形態、並びに頻度は少ないが、アンチセンス形態で有効であり得る（Baulcombe, D. C., 「Mechanisms of Pathogen-Derived Resistance to Viruses in Transgenic Plants」, Plant Cell 8: 1833-44 （1996）; Doughertyら、「Transgenes and Gene Suppression: Telling us Something New ?」、Current Opinion in Cell Biology 7: 399-05 （1995）; Lomonossoff, G. P., 「Pathogen-Derived Resistance to Plant Viruses」, Ann. Rev. Phytopathol. 33: 323-43 （1995））。
【０００７】
ウイルス性病原体に対する植物抵抗性の分野においてなされる進歩にもかかわらず、PRSVは、世界中でパパイヤおよびその他の作物へその破壊的な効果を及ぼし続けている。トランスジェニック・ハワイアンパパイヤにより、一時的にハワイにおける問題は制御されているが、この株は、残念なことにハワイ以外の起源のPRSV分離株に対する感受性が高いようである。これらの観測は、標的としたPRSV分離株に特異的なコートタンパク質遺伝子でのトランスジェニックパパイヤが、世界的に効果的にPRSVを制御するためのトランスジェニックパパイヤが開発される必要があることを示唆する。PRSVによる荒廃を止めるために、より実用的かつ包括的なアプローチが必要である。このようなアプローチは、遺伝子工学技術を利用することによりPRSVに抵抗性を与え、作物にPRSVおよびその他のRNA-ウイルス性植物病原体に対するより強く、より確実な多病原体抵抗性を提供すると考えられる。
【０００８】
本発明は、従来技術におけるこれらおよびその他の欠陥を克服することを目的とする。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、パパイヤ輪紋ウイルスのウイルスコートタンパク質をコードする単離核酸分子、およびこれらの核酸分子によってコードされるタンパク質に関する。
【００１０】
本発明のもう一つの局面は、5'および3'調節領域に機能的に結合された本発明の単離核酸分子を含む核酸構築物に関する。
【００１１】
また、本発明は、複数の形質DNA分子を含む核酸構築物であって、前記形質DNA分子の少なくともいくつかは、その形質DNA分子で形質転換された植物に、その形質を独立して与えるためには不十分な長さを有する核酸構築物に関する。しかし、複数の形質DNA分子は、DNA構築物で形質転換された植物にこれらの形質を集合的に与え、これによりDNA構築物のサイレンシングに効果を及ぼす。この構築物のDNA分子に関連した形質は、耐病性であり、形質DNA分子は、タイ（「TH」）、ケアオウ（Keaau：「KE」）、カポホ（Kapoho：「KA」）、メキシコ（「ME」）、台湾（「YK」）、ブラジル（「BR」）、ジャマイカ（「JA」）、オアフ（Oahu：「OA」）、およびパナエワ（Panaewa：「PA」）からなる群より選択されるパパイヤ輪紋ウイルス株のパパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする遺伝子に由来する。
【００１２】
また、本発明は、DNA構築物であって、形質分子で形質転換した植物に、独立して所望の形質を与えるには不十分な長さを有する形質DNA分子を含む融合遺伝子と、転写後の遺伝子サイレンシングを達成するために有効なように機能的に結合されたサイレンサー分子とを含むDNA構築物に関する。形質DNA分子およびサイレンサー分子は、構築物で形質転換された植物に集合的に形質を与える。このDNA構築物のDNA分子は、TH、KE、KA、ME、YK、BR、JA、OA、およびVEからなる群より選択されるパパイヤ輪紋ウイルス株に由来するパパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする遺伝子に由来する。
【００１３】
また、本発明は、本発明の核酸構築物を含む宿主細胞、植物細胞、トランスジェニック植物、およびトランスジェニック植物種子に関する。
【００１４】
また、本発明は、パパイヤ植物にパパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗性を与える方法に関する。本方法は、パパイヤ植物を本発明の構築物で形質転換することを含む。
【００１５】
詳細な記載
本発明は、パパイヤ輪紋ウイルス（「PRSV」）のウイルスコートタンパク質（「CP」）をコードする核酸に関する。
【００１６】
本発明の核酸の1つの適切な形態は、以下の通りの配列番号：1に対応する核酸配列を有するPRSV株カポホ（「KA」）から単離されたCP遺伝子である。

【００１７】
また、本発明は、配列番号：1に対応するヌクレオチドよってコードされ、コードタンパク質が以下の通りの配列番号：2に対応するアミノ酸配列を有するPRSV-KA-CPに関する。

【００１８】
また、本発明は、以下の通りの配列番号：3に対応する核酸配列を有する、PRSVのタイ（「TH」）株から単離されたCP遺伝子をコードする単離核酸分子に関する。

【００１９】
また、本発明は、以下の通りの配列番号：4のアミノに対応する配列番号：3によってコードされる、PRSVのTH株のウイルスのコートタンパク質に関する。

【００２０】
また、本発明に使用するための核酸として適切なものは、PRSVのケアウ（Keaau）（「KE」）株から単離されたCP遺伝子をコードする核酸である。PRSV-KEは、2つの「切断部位」、すなわち成熟したコートタンパク質のための2つの可能性のある切断部位を含む。PRSVのKE株（本明細書においてKE-CP1として同定される）における第一の切断部位配列は、以下の通りの配列番号：5（KECP1）に対応する：

【００２１】
第二のKE-CP切断部位から開始される、PRSV-KEコートタンパク質配列をコードする第二のヌクレオチド配列は、本明細書においてKE-CP2として同定され、以下の通りの配列番号：6に対応する：

【００２２】
配列番号：5および6は、それぞれPRSV-KEコートタンパク質のN末端およびC末端切断部位を含む。両切断部位は、植物でのウイルス複製において機能的であると思われるタンパク質を生じる。配列番号：5は、PRSVのKE株の第一のコートタンパク質切断部位産物CP1をコードする。KE-CP1は、以下の通りの配列番号：7に対応するアミノ酸配列を有する：

【００２３】
配列番号：6は、PRSVのKE株の第二のコートタンパク質切断部位産物CP2をコードする。KE-CP2は、以下の通りの配列番号：8に対応するアミノ酸配列を有する：

【００２４】
本発明のもう一つの適切な核酸は、PRSVの台湾（「YK」）株から単離されたCP遺伝子であり、以下の通りの配列番号：9に対応する：

【００２５】
配列番号：9は、以下の通りの配列番号：10に対応するアミノ酸配列を有するPRSVのYK株のCPをコードする：

【００２６】
本発明のもう一つの適切な核酸は、PRSVのメキシコ（「ME」）株から単離されたCP遺伝子であり、以下の通りの配列番号：11に対応する：

【００２７】
配列番号：11は、以下の通りの配列番号：12に対応するアミノ酸配列を有するPRSVのME株のCPをコードする：

【００２８】
本発明のもう一つの適切な核酸は、PRSVのブラジル（「BR」）株から単離されたCP遺伝子であり、以下の通りの配列番号：13に対応する：

【００２９】
配列番号：13は、以下の通りの配列番号：14に対応するアミノ酸配列を有するPRSVのBR株のCPをコードする：

【００３０】
本発明のもう一つの適切な核酸は、PRSVのジャマイカ（「JA」）株から単離されたCP遺伝子であり、以下の通りの配列番号：15に対応する：

【００３１】
配列番号：15は、以下の通りの配列番号：16に対応するアミノ酸配列を有するPRSVのJA株のCPをコードする：

【００３２】
本発明のもう一つの適切な核酸は、PRSVのオアフ（「OA」）株から単離されたCP遺伝子であり、以下の通りの配列番号：17に対応する：

【００３３】
配列番号：17は、以下の通りの配列番号：18に対応するアミノ酸配列を有するPRSVのOA株のCPをコードする：

【００３４】
本発明のもう一つの適切な核酸は、PRSVのベネズエラ（「VE」）株から単離されたCP遺伝子であり、以下の通りの配列番号：19に対応する：

【００３５】
配列番号：19は、以下の通りの配列番号：20に対応するアミノ酸配列を有するPRSVのVE株のCPをコードする：

【００３６】
また、上で示した核酸分子の変種も、本発明に適している。適切な核酸の例は、デフォルトパラメータ解析を使用するベーシックBLASTにより、配列番号：1、3、5、6、9、11、13、15、17、および19のヌクレオチド配列と少なくとも85％の類似性を有するヌクレオチド配列を有するか、または約42℃〜約65℃（好ましくは45℃）の温度で、5×SSC緩衝液を含むハイブリダイゼーション緩衝液によって特徴づけられるストリンジェントな条件下で配列番号：1、3、5、6、9、11、13、15、17、および19のヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子である。
【００３７】
PRSV-CPをコードする遺伝子の断片は、本発明において特に有用である。本発明に使用できる断片は、いくつかの手段によって作製することができる。1つの方法において、選択したCPをコードする遺伝子のサブクローンは、従来の分子学的遺伝子操作により、サブクローニング遺伝子断片から作製される。もう一つの方法では、タンパク質の一次構造についての知識に基づいて、PRSV-CPコードする遺伝子の断片を、タンパク質の特定の部分を示すように選択したプライマーの特定のセットと共に、PCR技術を使用することによって合成してもよい。次いで、これらをセンスまたはアンチセンス方向で適切なベクターにクローンニングする。
【００３８】
本発明の核酸の適切な断片のもう一つの例は、CPタンパク質の保存（「con」）領域として同定された遺伝子の断片、または可変（「var」）領域として同定されたPRSV-CPヌクレオチド配列の部分のものである。PRSV-CP遺伝子において、DNAStar Megaアライメントプログラムを使用して、可変か、または保存されたかのいずれかとして同定された配列は、選択した領域を増幅するように設計したフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用する標準的なPCR方法を使用して増幅することができ、これには、選択したベクターにPCR産物のライゲーションができる制限酵素配列を含む。増幅された保存領域および可変領域の配列を組合せて、単一のベクターにライゲーションして、1つのベクターに複数のDNA分子を含む「カセット」を作製することもできる。PRSV-CP DNAの保存領域および可変領域の使用を、以下に実施例においてさらに詳細に記載する。
【００３９】
また、本発明は、様々なPRSV株、最も好ましくはTH、KA、KE、YK、ME、BR、JA、OA、およびVE株のいずれかに由来する単離されたPRSV-CPをコードするDNA分子を含むDNA構築物に関する。これは、配列番号：1、3、5、6、9、11、13、15、17、および19に対応する核酸の、本発明の核酸分子またはその適切な部分の1つまたは複数の核酸分子を、従来の組換えDNA技術を使用して宿主細胞へ組み入れることを含む。通常、これは、核酸分子が異種である（すなわち、正常では存在しない）発現系に核酸分子を挿入することを含む。異種の核酸分子は、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む発現系に挿入される。
【００４０】
本発明の核酸分子を、当技術分野に周知の試薬を使用する任意の多くの利用可能な発現ベクターおよび細胞系に挿入してもよい。適切なベクターは、ラムダベクター系gtl1、gtWES.tB、シャロン4などのウイルスのベクター、ならびにpBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescriptIISK+/-またはKS+/-（「Stratagene Cloning System」 Catalog（1993）Stratagene, La Jolla, CAを参照。これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、pQE、pIH821、pGEX、pETシリーズなどのプラスミドベクター（Studierら, 「Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes」, Gene Expression Technology vol. 185 （1990）を参照されたい、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、ならびにそのあらゆる誘導体を含むが、これらに限定されることはない。組換え分子は、トランスフォーメーション、特に形質導入、接合、可動化、またはエレクトロポレーションによって細胞に導入することができる。DNA配列は、Sambrookら、「Molecular Cloning : A Laboratory Manual」, 第2版, Cold Spring Harbor Press, NY （1989）；およびAusubel, F. M.ら、「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons, New York, N. Y.（1989）（これらは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）に記載されたような、当技術分野において標準的なクローニング手順を使用してベクターにクローニングされる。
【００４１】
発現のためのDNAベクターを調製する際に、通常は種々のDNA配列を細菌性プラスミドに挿入または置換してもよい。細菌の複製系、細菌における選択を可能にするマーカー、および一般に1つまたは複数の特有の都合よく位置する制限酵素切断部位を有することによって特徴づけられると考えられる任意の便利なプラスミドを使用してもよい。形質転換ベクターと称される多数のプラスミドは、植物形質転換のために利用できる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換のための標的種に依存すると考えられる。様々のベクターを、クラウンゴールを生じる土壌伝播性の細菌であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を使用する安定形質転換のために利用できる。クラウンゴールは、感染した植物の低い茎および主根で発達する腫瘍またはゴールによって特徴づけられる。これらの腫瘍は、植物染色体のDNAに細菌プラスミドDNAの一部が移動および取込まれることによる。この転移DNA（「T-DNA」）は、植物細胞の正常な遺伝子とともに発現される。「腫瘍誘導プラスミド」のためのプラスミドDNA、pTi、またはTi-DNAは、植物にT-DNAが移動するために必要なvir遺伝子を含む。T-DNAは、植物調節因子、および細菌の栄養素（オピン）の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有する。T-DNAは、「ボーダー（border）配列」と呼ばれる2つの25bpの不完全なダイレクトリピート配列によって区切られる。発癌遺伝子およびオピン遺伝子を除去し、関心対象の遺伝子とそれらを置換することにより、腫瘍の形成またはアグロバクテリウム・ツメファシエンスの増殖を伴わずに植物に外来性DNAを導入することが可能になる（Fraleyら、「Expression of Bacterial Genes in Plant Cells」, Proc. Nat'1 Acad. Sci. 80: 4803-4807 （1983）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００４２】
この技術のさらなる改良により、バイナリーベクター系の開発がなされた（Bevan, M.,「Binary Agrobacterium Vectors for Plant Transformation」, Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721 （1984）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。この系において、全てのT-DNA配列（ボーダーを含む）は、pTiから除去され、T-DNAを含む第二のベクターが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入される。この第二のベクターは、大腸菌（E.coli）並びにA.ツメファシエンス（A.tumefaciens）において複製可能であり、導入遺伝子のクローニングを容易にするマルチクローニング部位を含むという利点がある。通常使用されるベクターの例は、pBinl9である（Frischら、「Complete Sequence of the Binary Vector Binl9」, Plant Molec. Biol. 27: 405-409 （1995）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。現在公知であるか、または後に記載される遺伝子形質転換のためのいかなる適切なベクターも、本発明における使用に適している。
【００４３】
CohenおよびBoyerに付与された米国特許第4,237,224号（これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）は、制限酵素切断およびDNAリガーゼによるライゲーションを使用する組換えプラスミドの形態の発現系の作製を記載する。次いで、これらの組換えプラスミドを形質転換によって導入し、組織培養における原核生物および真核細胞の増殖を含む単細胞の培養において複製される。
【００４４】
また、ある「制御エレメント」または「調節配列」が、ベクター構築物に組み込まれる。これらは、ベクター、プロモーター、並びに宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を実行する5'および3'非翻訳領域における、翻訳されない領域を含む。このようなエレメントは、それらの強さおよび特異性を変更してもよい。利用されるベクター系および宿主により、構成的および誘導性のプロモーターを含む、いかなる数の適切な転写および翻訳エレメントを使用してもよい。
【００４５】
構成的プロモーターは、生物の発生および寿命の全体にわたって遺伝子発現を誘導するプロモーターである。導入遺伝子の発現を誘導するために広く使用されているいくつかの構成的プロモーターの例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のノポリンシンターゼ（「NOS」）遺伝子プロモーター（Rogerらによる米国特許第5034322号、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、カリフラワーモザイクウィルス（「CaMV」）35Sおよび19Sプロモーター（Fraleyらによる米国特許第5,352,605号、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、増強されたCaMV35Sプロモーター（「enhCaMV35S」）、ゴマノハグサモザイクウイルスの全長転写プロモーター（「FMV35S」））（大部分の細胞型で発現されることが知られているいくつかのアクチン遺伝子のいずれかに由来するもの）（Privalleらによる米国特許第6,002,068号、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、ならびにユビキチンプロモーター（「ubi」）（多くの細胞型において蓄積することが知られている遺伝子産物）を含む。
【００４６】
誘導性プロモーターは、誘導因子に応答して1つまたは複数のDNA配列または遺伝子の転写を直接または間接的に活性化することができるプロモーターである。誘導因子の非存在下では、DNA配列または遺伝子は、転写されないと考えられる。誘導因子は、代謝産物、増殖制御因子、除草剤、もしくはフェノール化合物などの化合物質、あるいは、寒冷、熱、塩、毒素、病原体の作用またはウイルスもしくは真菌などの疾患薬剤のような植物に直接与えた生理学的ストレスであってもよい。誘導性プロモーターを含む植物細胞を、吹付け、散水、加温などにより細胞または植物に誘導因子を外部から適用することによって、または操作可能な病原体にさらすことによって、誘導因子にさらしてもよい。本発明に使用される適切な誘導性プロモーターの例は、グルココルチコイド-誘導性プロモーター（「GIP」）である（Schenaら、「A Steroid-Inducible Gene Expression System for Plant Cells」, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 10421-5 （1991）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。その他の有用なプロモーターは、感染を起こすことが知られている特定の細胞型において、誘導性の方法でまたは組織特異的な方法でポティウイルスタンパク質の発現可能なプロモーターを含む。これらは、たとえばフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、カルコンシンターゼ、エクステンシン、病原性関連タンパク質、およびジャガイモ由来の創傷誘導性プロテアーゼ阻害因子に由来する誘導性のプロモーターを含む。このような組織特異的なプロモーターのその他の例は、当技術分野において周知である種子、花、または根に特異的なプロモーターを含む（Shewmakerらによる米国特許第5,750,385号、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。遺伝子形質発現を最大化するための総説については、RobertsおよびLauer, Methods in Enzymology 68: 473（1979）（これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）を参照のこと。
【００４７】
選択された特定のプロモーターは、好ましくはウイルス抵抗性を提供するが、これらが発現された細胞に対して有害でない程度で有効なタンパク質の量が生じるように、DNAコード配列に機能的に結合され、十分な発現を引き起こすことができる。発現が望まれており、その後に植物に対するウイルス抵抗性が与えられる場合、予め選択されたタンパク質の発現を達成するために十分な転写活性を有する限り、プロモーターの実際の選択は重要ではない。選択されるプロモーターは、表皮、維管束、および葉肉組織を含むがこれらに限定されない組織において機能可能であるべきである。
【００４８】
また、本発明の核酸構築物は、機能的3'調節領域を含み、これはその翻訳終結コドンの3'の機能的ポリ（A）添加シグナル（AATAAA）を提供する。これは、選択したタンパク質をコードするDNA分子に機能的に結合され、選択した宿主細胞における発現のためのmRNAの正しい転写終結およびポリアデニル化を提供することができるものの中から選択される。3'調節領域の多くは、植物において機能的であることが知られている。3'調節領域の例としては、ノパリンシンターゼ3'調節領域（Fraleyら、「Expression of Bacterial Genes in Plant Cells」, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80: 4803-4807 （1983）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、およびカリフラワーモザイクウィルス3'調節領域（Odellら、「Identification of DNA Sequences Required for Activity of the Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter」, Nature 313 （6005）: 810-812 （1985）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）が挙げられるが、これらに限定されない。実質的に、植物において機能的であることが知られているいずれの3'調節領域も、本発明の核酸構築物のコード配列の適当な発現に十分であると考えられる。
【００４９】
Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第2版, Cold Spring Harbor Press, NY（1989）；およびAusubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons, New York, N.Y.（1989）（これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）に記載されたものなどの周知の分子クローニング技術を使用して、選択したベクター、適切なプロモーター、および適切な3'調節領域を共にライゲーションして、本発明の核酸またはその適切な断片を含む発現系を作製することができる。
【００５０】
上記の通りの、種々のパパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質またはポリペチドをコードする単離核酸分子が、発現系にクローンニングされると、これらは宿主細胞に組み込ませる準備ができる。このような取込みは、ベクター/宿主細胞系に依存して、上記形質転換の種々の形態によって実行することができる。適切な宿主細胞は、細菌、ウイルス、酵母、哺乳動物細胞、昆虫、植物などを含むが、これらに限定されることはない。
【００５１】
したがって、本発明のもう1つの局面は、1つまたは複数の本発明のPRSV-CP核酸を含む組換え植物細胞に関する。基本的には、この方法は、プロモーターに応答してDNA分子の転写を得るために有効な条件下で、植物細胞を本発明の核酸構築物で形質転換することによって実施される。形質転換法により、プロモーター制御下のDNAの一過性発現または安定発現を生じうる。好ましくは、本発明の核酸構築物は、形質転換の結果として組換え植物細胞のゲノムに安定して挿入されるが、一過性発現は、重要な目的に、特に調査下の植物の成長が遅い場合に役立ち得る。
【００５２】
形質転換に適した植物組織は、葉組織、根組織、分裂組織、種子胚、不定胚、カルス、プロトプラスト、穂、花粉、胚、葯などを含むが、これらに限定されることはない。選択される形質転換の手段は、形質転換される組織に最も適したものである。
【００５３】
植物組織における一過性発現は、ボンバードメント（bombardment）によってしばしば達成される（Kleinら、「High-Velocity Microprojectiles for Delivering Nucleic Acids Into Living Cells」, Nature 327: 70-73 （1987）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。この方法において、タングステンまたは金の微小粒子（直径1〜2μm）を関心対象のDNAでコートして、次いで高圧ガスを使用して組織に打ち込む。このような方法で核へ外来性DNAを送達して、組織の現在の条件下で遺伝子の一過性発現を得ることができる。また、生物学的に活性な粒子（たとえば、ベクターおよび異種DNAを含む乾燥させた細菌細胞）を植物細胞（全てSanfordらによる、米国特許第4,945,050号、同第5,036,006号、および同第5,100,792号、これらは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）に発射することができる。パパイヤに対しては、パーティクル・ガン・ボンバードメントが特に成功した方法であった（Fitch, M. M., 「Stable Transformation of Papaya Via Micro-Projectile Bombardment」, Plant Cell Rep. 9: 189 （1990）、およびFitchら、「Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration from Immature Zygotic Embryos of Papaya （Carica papaya L.）」, Plant Cell Rep. 9: 320 （1990）、これらは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。現在既知かまたは今後開発される、パーティクル・ボンバードメントのその他の変形物も、使用することができる。
【００５４】
植物細胞に核酸構築物を安定して導入する適切な方法は、核酸構築物で以前に形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾジェネス（Agrobacterium rhizogenes）を植物細胞に感染させることである。上記の通りに、アグロバクテリウムのTi（または、RI）プラスミドにより、植物細胞に外来DNAを非常に成功して導入することができる。さらに、導入のもう１つの方法は、その他の実体、ミニセル、細胞、ライソソーム、またはその他の可融性の脂質表面体のいずれかとプロトプラストとの融合である（Fraleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1859-63 （1982）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。また、DNA分子を、植物細胞にエレクトロポレーションによって導入してもよい（Frommら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824 （1985）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。この技術では、植物プロトプラストは、発現カセットを含むプラスミドの存在下でエレクトロポレーションされる。高電界強度の電気的インパルスにより、可逆的に生体膜を透過してプラスミドの導入が可能となる。エレクトロポレーションされた植物プロトプラストは、細胞壁が再編成され、分裂して、再生する。形質転換の正確な方法は、本発明の実行には重要でない。選択した宿主細胞において効率的な形質転換を生じるどのような方法も、本発明を実施するために適している。
【００５５】
形質転換後、形質転換された植物細胞を再生しなければならない。培養したプロトプラストからの植物再生は、Evansら、Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1: （MacMillan Publishing Co., New York, 1983）; Vasil I. R. （編）, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I(1984)およびVol. III(1986)、ならびにFitchら、「Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration from Immature Zygotic Embryos of Papaya （Carica papaya L.）」, Plant Cell Rep. 9: 320 （1990）（これらは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）に開示されている。
【００５６】
実質的に全ての植物が培養細胞または組織から再生できることが知られており、これには、砂糖きび、砂糖大根、綿、果樹、およびマメ科植物の全ての主要種を含むが、これらに限定されることはない。
【００５７】
再生のための手段は、植物の種間で異なるが、一般的に、形質転換されたプロトプラストの懸濁液または外植体を含むペトリプレートが最初に提供される。カルス組織が形成され、カルスから苗条が誘導されて、その後、発根する。または、カルス組織において胚形成が誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として出芽して、植物を形成する。培養液は、一般に種々のアミノ酸ならびにオーキシンおよびサイトカイニンなどのホルモンを含むと考えられる。効率的な再生は、培地、遺伝子型、および培養歴に依存すると思われる。これらの3つの変数が制御される場合、再生は通常再現可能および繰り返し可能である。
【００５８】
好ましくは、形質転換された細胞は、本発明の核酸構築物とともに宿主細胞に同時に導入した選択マーカーを使用して、最初に同定される。適切なマーカーは、カナマイシン抵抗性を与えるnptII遺伝子（Fraleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803-4807 （1983）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）などの抗生物質抵抗性をコードするマーカー、ゲンタマイシン、G418、ハイグロマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールなどのものに対し、抵抗性を与える遺伝子を含むが、これらに限定されない。細胞または組織を適切な抗生剤を含む選択培地において培養することにより、一般に、抗生物質抵抗性マーカーを発現する形質転換体のみが増殖し続ける。また、その他の型のマーカーも、本発明の発現カセットの含有物に適している。たとえば、スルホニル尿素に対する寛容性などの除草剤寛容性をコードする遺伝子、またはメトトレキセートに抵抗性を与えるdhfr遺伝子は、有用である（Bourouisら、EMBO J. 2: 1099-1104 （1983）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。同様に、同定可能な化合物の産生を提供する酵素をコードする「リポーター遺伝子」も適している。遺伝子融合実験のために最も広く使われているリポーター遺伝子は、大腸菌由来のβ-グルクロニダーゼタンパク質をコードする遺伝子、uidAであり、GUSとしても知られる（Jeffersonら、「GUS Fusions: β Glucuronidase as a Sensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plants」, EMBO J. 6: 3901-3907 （1987）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。同様に、ルシフェラーゼなどのルミネセンスによって同定可能な化合物の産生を提供する酵素は、有用である。使用される選択マーカーは、標的種に依存し、ある標的生物種については、種々の抗生物質、除草剤、または生合成選択マーカーが好ましい。
【００５９】
次いで、阻害剤またはその他の選択マーカーによって選択された植物細胞および組織では、形質転換に使用した所与のカセットに含まれるウイルス遺伝子に特異的なプローブを使用して、サザンブロットハイブリダイゼーション解析によるウイルス遺伝子の獲得について試験する（Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Press （1989）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００６０】
また、ウイルスコートタンパク質遺伝子の存在は、Nambaら、「Expression of the Gene Encoding the Coat Protein of Cucumber Mosaic Virus （CMV） Strain WL appears to Provide Protection to Tobacco Plants Against Infection by Several Different CMV Strains」, Gene 107: 181-188 （1991）（これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）により記載され、Clarkら、「Characteristics Of the Microplate Method for Enzyme-Linked Immunosorbent Assay For the Detection of plant Viruses」, J. Gen. Virol. 34, 475-83 （1977）（これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）による修飾された二重抗体サンドイッチアッセイ法などの免疫学的アッセイ法によって検出することもできる。ポティウイルス抵抗性は、Nambaら、「Protection of Transgenic Plants Expressing the Coat Protein Gene of Watermelon Virus ii or Zucchini Yellow Mosaic Virus Against Potyviruses」, Phvtopath. 82: 940946 （1992）（これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）によって一般的に記載された感染研究によってアッセイすることもでき、ここでは接種をした任意の葉が葉脈クリーニング（veinclearing）、モザイク、または壊死の症状を示す場合に、植物が症状を有するとしてスコアされる。
【００６１】
発現カセットがトランスジェニック植物に安定して取り入れられた後は、性交雑によってその他の植物へ移すことができる。交雑させる種に依存して、多くの標準的な繁殖方法のいずれを使用することもできる。この型のトランスジェニック植物を産生すると、生じた植物中に核酸構築物が存在するように、植物を従来の手順に従って培養することができる。または、トランスジェニック種子または繁殖材料を（たとえば、切断して）トランスジェニック植物から回収する。次いで、これらの種子を土壌に植えて、従来の手順を使用して栽培し、トランスジェニック植物を産生する。
【００６２】
また、本発明は、パパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする1つまたは複数の遺伝子に由来する複数のDNA分子を含むDNA構築物に関する。PRSV-CP DNA分子は、TH、KE、KA、ME、YK、BR、JA、OA、およびVEを含む1つまたは複数の株に由来してもよいが、これらに限定されない。いくつかのPRSV-CP DNA分子は、それ自体は短すぎる、すなわち、上記の通りにベクター内に配置され、植物細胞を形質転換するために使用される場合にそのそれぞれの形質を伝えるために十分なヌクレオチド配列を含まない、選択した1つまたは複数のCPにおける核酸配列の断片であってもよい。しかし、ひとまとめにして、この複数のDNA分子は、それらの形質を形質転換された植物に与える。与えられる形質は、構築物の所与のDNA分子のいずれかに由来するPRSV株に対する抵抗性である。この構築物に適した核酸は、TH、KE、KA、ME、YK、BR、JA、OA、およびVEを含む任意の株のPRSV CPコードDNA分子の断片を含むが、これらに限定されない。DNA分子は、全長DNAより短く、好ましくは全長PRSV-CP DNA分子の約200bpの範囲で構築物に挿入される。200bp断片は、好ましくはCPコードDNAの保存領域および可変領域から選択される。それぞれの断片について別々のプロモーターを含む必要はなく；単一のプロモーターのみが必要である。さらに、このようなウイルスの遺伝子断片は、好ましくは単一の発現系に組み入れて単一の形質転換事象でトランスジェニック植物を作製することができる。
【００６３】
また、本発明は、転写後の遺伝子サイレンシングを達成するために有効なサイレンサー分子に機能的に結合された、形質分子で形質転換した植物に独立して所望の形質を与えるには不十分な長さを有する、形質DNA分子を含む融合遺伝子を含むDNA構築物に関する。この形質DNA分子およびサイレンサー分子は、この構築物で形質転換した植物にこの形質を集合的に与える。このDNA構築物の形質DNA分子は、TH、KE、KA、ME、YK、BR、JA、OA、およびVEを含む（これらに限定されない）パパイヤ輪紋ウイルス株に由来するパパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする遺伝子に由来する。形質DNA分子の断片は、融合遺伝子カセットにサブクローニングされる。適切なDNA断片は、選択したCPコード分子の可変領域および保存領域に由来する約200bpのものである。本発明の構築物のサイレンサー分子は、実質的に遺伝子サイレンシングに効果を及ぼすいずれの核酸からでも選択することができる。これは、導入遺伝子のmRNAに相同的なmRNAを分解するための細胞メカニズムを含む。サイレンサーDNA分子は、植物に対して異種であってもよく、植物において形質DNA分子と相互作用する必要はなく、形質DNA分子の3'に配置することもできる。たとえば、サイレンサーDNA分子は、レプリカーゼ、運動タンパク質、またはヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスのcDNA分子；緑色蛍光タンパク質をコードするDNA分子、植物DNA分子、またはその組み合わせであることができるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明のいずれの構築物においても、耐病性を与えるDNA分子は、センス（5'→3'）方向でDNA構築物内に配置することができる。または、アンチセンス（3'→5'）方向を有することもできる。アンチセンスRNA技術は、標的遺伝子のメッセンジャーRNA分子に相補的であるRNA分子の作製を含む。アンチセンスRNAは、標的とされた遺伝子の全ての発現を潜在的にブロックすることができる。アンチウィルス環境において、植物に、ウイルスRNAに対応するアンチセンスRNA分子を発現させる（すなわち、アンチセンスRNAは、感染するウイルスによってコードされる「プラス」（+）センスRNA分子種に相補的である）。このような植物は、そのウイルスによる感染に対していくらか減少された感受性を示しうる。このような相補的RNA分子は、アンチセンスRNAと呼ばれる。
【００６５】
本発明のDNA構築物は、形質およびサイレンサーDNA分子が翻訳可能なRNA分子をコードするように配列することができる。その結果、このRNA分子は、リボソームで翻訳され、DNA構築物によってコードされるタンパク質を産生すると考えられる。本方法におけるタンパク質の産生は、ウイルス調節配列を示す合成二本鎖オリゴヌクレオチド（すなわち、5'非翻訳配列）と関心対象のDNA構築物をコードするクローニングされた遺伝子を結合することによって増大させることができる（Gehrkeらによる米国特許第4,820,639号、およびWilsonらによる米国特許第5,849,527号、これらは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００６６】
または、本発明のDNA構築物は、形質およびサイレンサーDNA分子が、翻訳できないmRNAをコードするように配列することができる。これは、DNA分子に1つまたは複数の中途停止コドンを導入すること、1つまたは複数の塩基（3つの塩基の多重を除く）を付加して解読枠を置換すること、翻訳開始コドンを除去すること等によって達成される。Doughertyらによる米国特許第5,583,021号（これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。目的のDNA構築物は、上で詳述したものなどの従来の組換えDNA技術を使用して、細胞に導入することができる。
【００６７】
本発明のもう1つの局面は、植物にPRSVに対する抵抗を与えるための方法である。これは、上記記載の通りに、1つまたは複数の本発明の核酸構築物で感受性の高い植物を形質転換する段階；ベクターに固有のマーカーを使用して、形質転換のための試験をする段階；トランスジェニックを選択する段階；およびトランスジェニック植物を再生および再現させる段階を含む。本発明の発現系は、適切な条件下で実質的に任意の植物組織も形質転換させるために使用することができる。形質転換した細胞は、PRSV導入遺伝子が無処理のトランスジェニック植物にPRSVに対する抵抗性を与えるように、植物全体中で再生することができる。いずれにせよ、本発明の組換えDNA発現系で形質転換された植物細胞は、増殖され、本発明の構築物中の1つまたは複数のDNA分子の発現を引き起こし、したがってパパイヤ輪紋抵抗性を伝える。
【００６８】
理論によって閉ざされることは望まないが、本発明の構築物により、転写後の遺伝子サイレンシングが達成されると考えられる。より詳細には、サイレンサーDNA分子は、細胞内で閾値レベルより上に異種RNAのレベルを増大すると考えられる。これは、ウイルス抵抗性が達成されることによる分解メカニズムを活性化する。
【００６９】
転写後の遺伝子サイレンシングに由来する抵抗性を示すトランスジェニック植物は、高度に抵抗性の状態を確立してウイルスの複製を妨げる。種々の小さな転写可能ではない断片ウィルスゲノムと融合されたサイレンサーDNA（たとえば、GFP）からなるキメラ導入遺伝子は、ウイルス抵抗性のために好ましい。いくつかの利点が存在する。第一に、サイレンサーDNAは、誘導される遺伝子サイレンシングを増大することができる。第二に、遺伝子のキメラ性は、多数のウイルス抵抗性を提供すると思われる。第三に、転写可能ではない構築物は、タンパク質を産生せず、したがって天然に存在する変異体の相補およびその他のウイルスのトランスキャプシド形成の可能性を減少する。第四に、小断片も、その他のウィルスゲノムと組換えの可能性を減少する。
【００７０】
この種の遺伝的操作を介して与えられるウイルス抵抗性のメカニズムは完全に理解されておらず、ウイルス抵抗性トランスジェニックの産生の最適化は、なおも検討中である。したがって、所与のトランスジェニック植物に与えられる抵抗性の程度（高、中、または低い効率）は、予測できない。しかし、ウイルス遺伝子形質発現カセットの組み合わせが同じバイナリープラスミドに配置され、プラスミドを含むその多遺伝子のカセットが植物に形質転換される場合に、ウイルス遺伝子の全てがトランスジェニック植物に存在する場合と実質的に同程度の効率を示すことが述べられている。たとえば、2つの異なる無処理のウイルス遺伝子カセットを含む多数のトランスジェニック株を検討するような場合、トランスジェニック株は、両方のウイルスによる感染に免疫性であると思われる。同様に、トランスジェニック株が1つのウイルスに対する症状発現の遅延を示す場合、これはまた、第二のウイルスに対する症状発現の遅延を示すと思われる。最後にトランスジェニック株がウイルスのうちの一方に対して感受性が高い場合、他方に対しても感受性であると思われる。この現象は、予想外である。これらの多数の遺伝子構築物において、それぞれの遺伝子の効率の間に相関がない場合、植物育種における手段としてのこのアプローチは、おそらく使用することが極端に困難であると思われる。有用なレベルの発現を有する株を見出す確率は、含まれる種に依存し、10〜50％の範囲であり得る（McMasterらによる米国特許第6,002,072号、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）
【００７１】
本発明は、以下の詳細な実施例を参照することにより、さらに記載されると思われる。
【００７２】
実施例
実施例1：CP可変領域DNAの増幅およびクローニング
総RNAを、PRSVに感染したパパイヤ植物から抽出した。台湾（YK）、ケアウ（KE）、およびタイ（TH）株に由来するそれぞれ約200bpの異なるPRSV-CP遺伝子断片は、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって増幅して、アガロースゲルから抽出した。YK、KE、およびTH株のPRSV-CP遺伝子の可変領域を増幅するために使用したプライマーを表1に示す。
【００７３】
【表１】

制限酵素配列は小文字で示し;停止コドンは下線なしで大文字で示し;ウイルス性配列は下線を引いた。
【００７４】
従来のPCR技術を使用する増幅に続いて、増幅された断片を適切な制限酵素で消化した。最初に制限酵素XbaI-XhoI消化したYK断片（209bp）をpEPJベクターにライゲーションした。XhoI-SmaI消化したKE断片（209bp）を、YK断片の後ろ（すなわち、3'末端）にライゲーションし、次いでSmaI-BamHI消化したTH断片（206bp）をKEの後ろにライゲーションした。生じたクローンである図1Aに示したpEPJ-YKTは、5'→3'方向でYK-KE-THからのCPの可変領域を含む。HindIII-KpnIで制限消化した後、pEPJ-YKT発現カセットを形質転換ベクターpGA482G（図1Bに示した）のHindIII-KpnIクローニング部位にライゲーションして、クローンpTi-EPJ-YKTを生じた。次いで、塩化セシウム精製したpTi-EPJ-YKTをパーティクル・ガン・ボンバードメントによる宿主細胞形質転換に使用した。
【００７５】
実施例2：サイレンサー構築物へのCP可変領域のクローニング
pEPJ-YKT由来の断片XbaI/BamHIをその他の発現ベクターpNP（図2Aに示した）およびpGFP（図2Bに示した）にライゲーションし、それぞれpNP-YKTおよびpGFP-YKTを作製した。図2Aに示した「M1/2NP」は、世界的に作物傷害を引き起こすトスポウイルス（tospovirus）であるトマト黄化えそウイルス（tomato spotted wilt virus：「TSWV」）のウィルスゲノムのヌクレオカプシドタンパク質（「N」または「NP」遺伝子）をコードする遺伝子の約半分（387〜453bp）からなる断片を表す。TSWVのN遺伝子の大きな断片（約1/2またはそれ以上）の発現により、断片で形質転換したR1植物の20％〜51％においてTSWV-BLに対する高レベルの抵抗性が与えられ、R1植物分離株の4％〜22％においてトスポウイルス感染に対する寛容性が示されたが、遠位に関連したインパチェンスえそ斑紋ウイルス（Impatiens necrotic spot virus：「INSV」）（Lawら、「The M RNA of Impatiens Necrotic Spot Tospovirus （Bunyaviridae） Has an Ambisense Genomic Orgarlization」, Virologv, 188: 732-41 （1992）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）または落花生輪紋ウイルス（groundnut ringspot virus：「GRSV」）（Pangら、「The Biological Properties of a Distinct Tospovirus and Sequence Analysis of Its mRNA」, Phytopathology, 83: 728-33 （1993）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）では示されなかった。TSWVのN遺伝子は、本発明の核酸構築物におけるサイレンサー分子として有用であるウィルスゲノムに由来する遺伝子の例である。次いで、これらの2つの発現ベクターからの制限酵素HindIII/KpnIで消化した断片を、形質転換ベクターpGA482GのHindIII/KpnIクローニング部位にライゲーションし、クローンpTi-NP-YKTおよびpTi-GFP-YKTを生じた。次いで、塩化セシウム精製したpTi-NP-YKTおよびpTi-GFP-YKTをパーティクル・ガン・ボンバードメントによる宿主細胞形質転換に使用した。
【００７６】
実施例3：CP保存領域DNAの増幅およびクローニング
総RNAをPRSV感染したパパイヤ植物から抽出した。ケアウ（KE）およびタイ（TH）由来の異なるPRSV-CP遺伝子断片（それぞれ約200bp）を、RT-PCRによって増幅した。KEおよびTH株のPRSV-CP遺伝子の保存領域を増幅するために使用したプライマーを表2に示す。
【００７７】
【表２】

制限酵素配列は小文字で示し;停止コドンは下線なしで大文字で示し;ウイルス性配列は下線を引いた。
【００７８】
サイレンサー分子1/2NPを含む構築物を図3A〜図3Gに示す。これらの構築物は、本明細書においてpNP-X_nとして示され、ここで「X」はPRSV株を示し、CP DNAは、この株に由来し、「n」は、カセットにおける「X」の断片数を表す。DNAがセンス方向で挿入されるとき、「X」は株の最初のイニシャルであり、たとえばKEについては「K」、THについては「T」である。断片がアンチセンス方向で挿入されるとき、株の頭字語は裏返り、たとえばKEがEKになり、「X」は、アンチセンス命名の最初のイニシャルになる。たとえば、KEのアンチセンス断片については、「X」が「E」になる。DNA分子の翻訳可能または翻訳可能ではない形態は、さらにそれぞれ接頭辞「TL」および「NTL」と示される。
【００７９】
図3Aに示したクローンpNP-Kは、単一のXbaI/XhoIで消化した203bpのKE DNA断片を、センス方向で365bpのM1/2NP DNA分子を含む発現ベクターpNPにライゲーションすることによって得られた。センスおよびアンチセンスのKE断片をそれぞれ含む、図3Bに示したクローンpNP-KK、および図3Cに示したpNP-EEは、SalI消化したKE DNA断片をpNP-Kにライゲーションすることによって得られた。図3Dに示したクローンpNP-KKTC、図3Eに示したpNP-KKTV、図3Fに示したpNP-EETC；および図3Gに示したpNP-EETVは、保存領域（KEcon）または可変領域（KEvar）に由来するSmaI/BamHI消化したKE断片をpNP-KKまたはpNP-EEにライゲーションすることによって得られた。
【００８０】
pNPクローンを発現ベクターからHindIII/KpnIで消化し、形質転換ベクターpGA482GのHindIII/KpnIクローニング部位にライゲーションして、クローンpTi-NP-K、pTi-NP-KK、pTi-NP-EE、pTi-NP-KKTC、pTi-NP-KKTV、pTi-NP-EETC、およびpTi-NP-EETVを生じた。次いで、塩化セシウム精製したpTi-NP-クローンをパーティクル・ガン・ボンバードメントによる宿主細胞形質転換に使用した。
【００８１】
実施例4：翻訳可能および翻訳可能でない全長KEの増幅並びにクローニング
図4に示した2つの全長KE-CP構築物は、第二のCP切断部位から60nt上流の第一のCP切断部位から開始する。pEPJ-TL KEおよびpEPJ-NTL KEの増幅ならびに構築のために使用されるプライマーを表3に示す。
【００８２】
【表３】

制限酵素配列は小文字で示し;停止コドンは下線なしで大文字で示し;ウイルス性配列は下線を引いた。
【００８３】
増幅に続いて、NcoI/BamHIで消化したPCR/KECP断片をpEPJベクターにライゲーションし、これを図4に示す。次いで、HindII/KpnIを使用して、発現カセットを形質転換ベクターpGA482Gにサブクローニングした。
【００８４】
実施例5：MEX CPの増幅およびクローニング
構築物pEPJ-MEX CPの増幅および調製のために使用したプライマーを表4に示す。
【００８５】
【表４】

制限酵素配列は小文字で示し;停止コドンは下線なしで大文字で示し;ウイルス性配列は下線を引いた。
【００８６】
実施例6：PRSV-CP DNA構築物によるパパイヤの形質転換
パパイヤ胚に、上記の通りに調製したDNA構築物を打ち込み、図2〜図5に示した。形質転換手順は、 Caiら、「A Protocol for Efficient Transformation and Regeneration of Carica papaya L. In Vitro」, Cell Devel. Biol-Plant 35: 61-69 （1999）（これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）にて説明した通りに行った。プラスミドDNAは、エチジウムブロマイドCsCl勾配（Ausubelら、「CsCl/Ethidium Bromide Preparations of Plasmid DNA」, Current Protocols in Molec Biol. unit 2.9.1-2.9.20 （1995）、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、エタノール沈殿、および水への懸濁によって精製した。未成熟の種子胚は、未成熟な緑色の「サンライズ（Sunrise）」または「カポホ（Kapoho）」パパイヤの種子から抽出し、誘導培地に静置し、暗闇で維持した。不定胚クラスターを有する種子胚をWhatman #2ろ紙に置き、広げた。不定胚を増殖させて、これに続いて、胚をしっかりと新しいろ紙上へ広げて、タングステン被覆プラスミドDNAを打ち込んだ。打ち込みの7日後、カナマイシンを75mg/Lで含む誘導培地へ材料を移した。4週間後、カナマイシンレベルを150mg/Lまで上げた。カナマイシン培地中で数週間後、活発に増殖する胚クラスターをカナマイシン非含有培地へ移した。胚が青白い象牙色を発して指のような伸張が現れたときに、これらを成熟培地へ2〜4週間移した。成熟不定胚を出芽培地へ移し、次いで深緑色の葉および初期の根を有する小植物に成長させた。これらの小植物を発根培地を有する小瓶へ移し、温室へ移した。
【００８７】
出芽培地からのトランスジェニック株をPCRによって分析し、ウイルス遺伝子が小植物にあることを確認した。ノーザンブロットを行って、トランスジェニック株で発現されたRNAのレベルを検出し、トランスジェニック植物中の導入遺伝子のコピー数をサザンブロット分析によって決定した。
【００８８】
温室に移した後、トランスジェニック植物に、PRSVのKE株に感染させた。その後、ウイルスの症状について植物をモニターした。接種後約４週後に疾患症状が現れなかった場合、これらの植物に、交叉抵抗性について試験するために、異なるPRSV株を感染させた。
【００８９】
実施例7：導入遺伝子によってPRSVに与えられる抵抗性
本発明の種々のPRSV DNA構築物を含む219個のトランスジェニック株を、上記した通りに温室に移した。KEウイルスでの接種は、少なくとも1つのKE含有DNA構築物で形質転換した90個の植物株で行った。PRSV-KEで感染させた90株のうちの26株は抵抗性を示し、64株は感受性であった。
【００９０】
好ましい態様を本明細書に詳細に記述および記載したが、種々の修飾、付加、置換などを、本発明の精神から逸脱することなく行い得ることは、当業者には明らかであり、したがって、特許請求の範囲において定義されたものとして本発明の範囲内であるとみなされると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明のDNA構築物に使用されるクローニングベクターを示す。図1Aは、pEPJベクターにライゲーションしたYK、KE、およびTH株のPRSV-CP可変領域を含む発現カセットpEPJ-YKTを示す。図1Bは、形質転換ベクターpGA482Gを示す。
【図２】サイレンサーPRSV-CP構築物をクローニングおよびサブクローニングするために使用される発現ベクターを示す。図2Aは、サイレンサーDNA分子と（M1/2NP）、PRSV株YK、KE、およびTHのPRSV-CP可変領域とを含むpNP-YKTベクターを示す。図2Bは、PRSV株YK、KE、およびTH PRSVのPRSV-CP可変領域にライゲーションされたサイレンサー分子GFPを含むpGFP-YKTベクターを示す。
【図３】発現ベクターにおいてサイレンサー分子（M1/2NP）にライゲーションされた種々のPRSV-CPDNA分子を示す。図3Aは、クローンpNP-Kを示し；図3Bは、クローンpNP-KKを示し；図3Cは、クローンpNP-EEを示し；図3Dは、クローンpNP-KKTCを示し；図3Eは、クローンpNP-KKTVを示し；図3Fは、クローンpNP-EETCを示し、および図3Gは、クローンpNP-EETVを示す。
【図４】図4Aは、発現ベクターpEPJにライゲーションされたPRSV-CPのための翻訳可能なRNAをコードする全長（1Kb）KE-CPDNA分子を示す。図4Bは、発現ベクターpEPJにライゲーションされたPRSV-CPのための非翻訳可能ななRNAをコードする全長（1Kb）KE-CPDNA分子を示す。
【図５】発現ベクターpEPJにライゲーションされた855bpのNcoI/BamHIメキシコPRSV-CP DNA分子を示す。

Claims

パパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする単離核酸分子であって、以下の(1)〜(4)のいずれかである核酸分子：（1）配列番号：1の核酸配列を有する；（2）配列番号：2を有するアミノ酸をコードする；（3）デフォルトパラメータ解析を使用するベーシックBLASTにより、配列番号：1のヌクレオチド配列と少なくとも85％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する；または（4）45℃の温度で5×SSC緩衝液を含むハイブリダイゼーション緩衝液によって特徴づけられるストリンジェントな条件下で配列番号：1のヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
請求項1記載の核酸分子、ならびに
機能的に結合されたプロモーターおよび3'調節領域
を含む、DNA構築物。
請求項2記載のDNA構築物を含む、DNA発現ベクター。
請求項2記載のDNA構築物を形質導入した宿主細胞。
前記細胞が、細菌細胞、ウイルス、酵母細胞、および植物細胞からなる群より選択される、請求項4記載の宿主細胞。
請求項2記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物。
前記植物がパパイヤである、請求項6記載のトランスジェニック植物。
請求項2記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物種子。
前記植物がパパイヤである、請求項8記載のトランスジェニック植物種子。
パパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする単離核酸分子であって、以下の(1)〜(4)のいずれかである核酸分子：（1）配列番号：3の核酸配列を有する；（2）配列番号：4を有するアミノ酸をコードする；（3）デフォルトパラメータ解析を使用するベーシックBLASTにより、配列番号：3のヌクレオチド配列と少なくとも85％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する；または（4）45℃の温度で5×SSC緩衝液を含むハイブリダイゼーション緩衝液によって特徴づけられるストリンジェントな条件下で配列番号：3のヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
請求項10記載の核酸分子、ならびに
機能的に結合されたプロモーターおよび3'調節領域
を含むDNA構築物。
請求項11記載のDNA構築物を含む、発現ベクター。
請求項11記載のDNA構築物を形質導入した宿主細胞。
前記細胞が、細菌細胞、ウイルス、酵母細胞、および植物細胞からなる群より選択される、請求項13記載の宿主細胞。
請求項11記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物。
前記植物がパパイヤである、請求項15記載のトランスジェニック植物。
請求項11記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物種子。
前記植物がパパイヤである、請求項17記載のトランスジェニック植物種子。
パパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする単離核酸分子であって、以下の(1)〜(4)のいずれかである核酸分子：（1）配列番号：5の核酸配列を有する；（2）配列番号：7を有するアミノ酸をコードする；（3）デフォルトパラメータ解析を使用するベーシックBLASTにより、配列番号：5のヌクレオチド配列と少なくとも85％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する；または（4）45℃の温度で5×SSC緩衝液を含むハイブリダイゼーション緩衝液によって特徴づけられるストリンジェントな条件下で配列番号：5のヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
請求項19記載の核酸分子、ならびに
機能的結合されたプロモーターおよび3'調節領域
を含むDNA構築物。
請求項20記載のDNA構築物を含む、DNA発現ベクター。
請求項20記載のDNA構築物を形質導入した宿主細胞。
前記細胞が、細菌細胞、ウイルス、酵母細胞、および植物細胞からなる群より選択される、請求項22記載の宿主細胞。
請求項20記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物。
前記植物がパパイヤである、請求項24記載のトランスジェニック植物。
請求項20記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物種子。
前記植物がパパイヤである、請求項26記載のトランスジェニック植物種子。
パパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする単離核酸分子であって、以下の(1)〜(4)のいずれかである核酸分子：（1）配列番号：6の核酸配列を有する；（2）配列番号：8を有するアミノ酸をコードする；（3）デフォルトパラメータ解析を使用するベーシックBLASTにより、配列番号：6のヌクレオチド配列と少なくとも85％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する；または（4）45℃の温度で5×SSC緩衝液を含むハイブリダイゼーション緩衝液によって特徴づけられるストリンジェントな条件下で配列番号：6のヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
請求項28記載の核酸分子、ならびに
機能的に結合されたプロモーターおよび3'調節領域
を含むDNA構築物。
請求項29記載のDNA構築物を含む、発現ベクター。
請求項29記載のDNA構築物を形質導入した宿主細胞。
前記細胞が、細菌細胞、ウイルス、酵母細胞、および植物細胞からなる群より選択される、請求項31記載の宿主細胞。
請求項29記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物。
前記植物がパパイヤである、請求項33記載のトランスジェニック植物。
請求項29記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物種子。
前記植物がパパイヤである、請求項35記載のトランスジェニック植物種子。
パパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする単離核酸分子であって、以下の(1)〜(4)のいずれかである核酸分子：（1）配列番号：11の核酸配列を有する；（2）配列番号：12を有するアミノ酸をコードする；（3）デフォルトパラメータ解析を使用するベーシックBLASTにより、配列番号：11のヌクレオチド配列と少なくとも85％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する；または（4）45℃の温度で5×SSC緩衝液を含むハイブリダイゼーション緩衝液によって特徴づけられるストリンジェントな条件下で配列番号：11のヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
請求項37記載の核酸分子、ならびに
機能的に結合されたプロモーターおよび3'調節領域
を含むDNA構築物。
請求項38記載のDNA構築物を含む、DNA発現ベクター。
請求項38記載のDNA構築物を形質導入した宿主細胞。
前記細胞が、細菌細胞、ウイルス、酵母細胞、および植物細胞からなる群より選択される、請求項40記載の宿主細胞。
請求項38記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物。
前記植物がパパイヤである、請求項42記載のトランスジェニック植物。
請求項38記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物種子。
前記植物がパパイヤである、請求項44記載のトランスジェニック植物種子。
パパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする単離核酸分子であって、以下の(1)〜(4)のいずれかである核酸分子：（1）配列番号：13の核酸配列を有する；（2）配列番号：14を有するアミノ酸をコードする；（3）デフォルトパラメータ解析を使用するベーシックBLASTにより、配列番号：13のヌクレオチド配列と少なくとも85％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する；または（4）45℃の温度で5×SSC緩衝液を含むハイブリダイゼーション緩衝液によって特徴づけられるストリンジェントな条件下で配列番号：13のヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
請求項46記載の核酸分子、ならびに
機能的に結合されたプロモーターおよび3'調節領域
を含むDNA構築物。
請求項47記載のDNA構築物を含む、発現ベクター。
請求項47記載のDNA構築物を形質導入した宿主細胞。
前記細胞が、細菌細胞、ウイルス、酵母細胞、および植物細胞からなる群より選択される、請求項49記載の宿主細胞。
請求項47記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物。
前記植物がパパイヤである、請求項51記載のトランスジェニック植物。
請求項47記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物種子。
前記植物がパパイヤである、請求項53記載のトランスジェニック植物種子。
パパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする単離核酸分子であって、以下の(1)〜(4)のいずれかである核酸分子：（1）配列番号：15の核酸配列を有する；（2）配列番号：16を有するアミノ酸をコードする；（3）デフォルトパラメータ解析を使用するベーシックBLASTにより、配列番号：15のヌクレオチド配列と少なくとも85％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する；または（4）45℃の温度で5×SSC緩衝液を含むハイブリダイゼーション緩衝液によって特徴づけられるストリンジェントな条件下で配列番号：15のヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
請求項55記載の核酸分子、ならびに
機能的に結合されたプロモーターおよび3'調節領域
を含むDNA構築物。
請求項56記載のDNA構築物を含む、DNA発現ベクター。
請求項56記載のDNA構築物を形質導入した宿主細胞。
前記細胞が、細菌細胞、ウイルス、酵母細胞、および植物細胞からなる群より選択される、請求項58記載の宿主細胞。
請求項56記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物。
前記植物がパパイヤである、請求項60記載のトランスジェニック植物。
請求項56記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物種子。
前記植物がパパイヤである、請求項62記載のトランスジェニック植物種子。
パパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする単離核酸分子であって、以下の(1)〜(4)のいずれかである核酸分子：（1）配列番号：17の核酸配列を有する；（2）配列番号：18を有するアミノ酸をコードする；（3）デフォルトパラメータ解析を使用するベーシックBLASTにより、配列番号：17のヌクレオチド配列と少なくとも85％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する；または（4）45℃の温度で5×SSC緩衝液を含むハイブリダイゼーション緩衝液によって特徴づけられるストリンジェントな条件下で配列番号：17のヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
請求項64記載の核酸分子、ならびに
機能的に結合されたプロモーターおよび3'調節領域
を含むDNA構築物。
請求項65記載のDNA構築物を含む、発現ベクター。
請求項65記載のDNA構築物を形質導入した宿主細胞。
前記細胞が、細菌細胞、ウイルス、酵母細胞、および植物細胞からなる群より選択される、請求項67記載の宿主細胞。
請求項65記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物。
前記植物がパパイヤである、請求項69記載のトランスジェニック植物。
請求項65記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物種子。
前記植物がパパイヤである、請求項71記載のトランスジェニック植物種子。
パパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする単離核酸分子であって、以下の(1)〜(4)のいずれかである核酸分子：（1）配列番号：19の核酸配列を有する；（2）配列番号：20を有するアミノ酸をコードする；（3）デフォルトパラメータ解析を使用するベーシックBLASTにより、配列番号：19のヌクレオチド配列と少なくとも85％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する；または（4）45℃の温度で5×SSC緩衝液を含むハイブリダイゼーション緩衝液によって特徴づけられるストリンジェントな条件下で配列番号：19のヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
請求項73記載の核酸分子、ならびに
機能的に結合されたプロモーターおよび3'調節領域
を含むDNA構築物。
請求項74記載のDNA構築物を含む、発現ベクター。
請求項74記載のDNA構築物を形質導入した宿主細胞。
前記細胞が、細菌細胞、ウイルス、酵母細胞、および植物細胞からなる群より選択される、請求項76記載の宿主細胞。
請求項74記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物。
前記植物がパパイヤである、請求項78記載のトランスジェニック植物。
請求項74記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物種子。
前記植物がパパイヤである、請求項80記載のトランスジェニック植物種子。
以下を含むDNA構築物：
複数の形質DNA分子の少なくともいくつかは、形質DNA分子で形質転換された植物に形質を与えるためには不十分な長さを有しているが、該複数の形質DNA分子が、該DNA構築物で形質転換された植物にこれらの形質を集合的に与えて、該DNA構築物のサイレンシングに効果を有する、複数の形質DNA分子であって、該形質が耐病性であり、および該形質DNA分子が、TH、KE、KA、ME、YK、BR、JA、OA、VE、およびPAからなる群より選択されるパパイヤ輪紋ウイルス株のパパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする遺伝子に由来する、複数の形質DNA分子。
1つまたは複数の形質DNA分子が、パパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質の可変領域および保存領域からなる群より選択される、請求項82記載のDNA構築物。
1つまたは複数の形質DNA分子がセンス（5'→3'）方向である、請求項82記載のDNA構築物。
1つまたは複数の形質DNA分子がアンチセンス（3’→5'）方向で挿入される、請求項82記載のDNA構築物。
請求項82記載のDNA構築物を含む、発現ベクター。
請求項82記載のDNA構築物を形質導入した宿主細胞。
前記細胞が、細菌細胞、ウイルス、酵母細胞、および植物細胞からなる群より選択される、請求項87記載の宿主細胞。
請求項82記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物。
前記植物がパパイヤである、請求項89記載のトランスジェニック植物。
請求項82記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物種子。
前記植物がパパイヤである、請求項91記載のトランスジェニック植物種子。
以下を含むDNA構築物：
形質DNA分子で形質転換された植物に、独立して所望の形質を与えるためには不十分な長さを有する形質DNA分子と、
転写後の遺伝子サイレンシングを達成するために有効であり、かつ該形質DNA分子に機能的に結合したサイレンサーDNA分子であって、該形質DNA分子および該サイレンサーDNA分子が、DNA構築物で形質転換された植物に該形質を集合的に与え、並びに該形質DNA分子が、TH、KE、KA、ME、YK、BR、JA、OA、VE、およびPAからなる群より選択されるパパイヤ輪紋ウイルス株のパパイヤ輪紋ウイルスコートタンパク質をコードする遺伝子に由来する、サイレンサーDNA分子と
を含む融合遺伝子。
融合遺伝子に機能的に結合したプロモーター配列、および
末端転写のために該融合遺伝に選択的に結合した終結配列
をさらに含む、請求項93記載のDNA構築物。
サイレンサーDNA分子が、ウイルスDNA分子、蛍光タンパク質をコードするDNA分子、植物DNA分子、ウイルス遺伝子サイレンサー、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項93記載のDNA構築物。
請求項93記載のDNA構築物を含む、発現ベクター。
請求項93記載のDNA構築物を形質導入した宿主細胞。
前記細胞が、細菌細胞、ウイルス、酵母細胞、および植物細胞からなる群より選択される、請求項97記載の宿主細胞。
請求項93記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物。
前記植物がパパイヤである、請求項36記載のトランスジェニック植物。
請求項93記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物種子。
前記植物がパパイヤである、請求項101記載のトランスジェニック植物種子。
請求項2記載のDNA構築物でパパイヤ植物を形質転換することを含む、パパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗力をパパイヤ植物に与える方法。
請求項11記載のDNA構築物でパパイヤ植物を形質転換することを含む、パパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗力をパパイヤ植物に与える方法。
請求項20記載のDNA構築物でパパイヤ植物を形質転換することを含む、パパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗力をパパイヤ植物に与える方法。
請求項29記載のDNA構築物でパパイヤ植物を形質転換することを含む、パパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗力をパパイヤ植物に与える方法。
請求項38記載のDNA構築物でパパイヤ植物を形質転換することを含む、パパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗力をパパイヤ植物に与える方法。
請求項47記載のDNA構築物でパパイヤ植物を形質転換することを含む、パパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗力をパパイヤ植物に与える方法。
請求項56記載のDNA構築物でパパイヤ植物を形質転換することを含む、パパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗力をパパイヤ植物に与える方法。
請求項65記載のDNA構築物でパパイヤ植物を形質転換することを含む、パパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗力をパパイヤ植物に与える方法。
請求項74記載のDNA構築物でパパイヤ植物を形質転換することを含む、パパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗力をパパイヤ植物に与える方法。
請求項82記載のDNA構築物でパパイヤ植物を形質転換することを含む、パパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗力をパパイヤ植物に与える方法。
請求項93記載のDNA構築物でパパイヤ植物を形質転換することを含む、パパイヤ輪紋ウイルスに対する抵抗力をパパイヤ植物に与える方法。