ES2695580T3

ES2695580T3 - Método para reducir la amplificación de dímeros de cebadores

Info

Publication number: ES2695580T3
Application number: ES16787706T
Authority: ES
Inventors: Zhaohui Wang; Gang Song
Original assignee: Pillar Biosciences Inc
Current assignee: Pillar Biosciences Inc
Priority date: 2015-07-07
Filing date: 2016-06-16
Publication date: 2019-01-09
Anticipated expiration: 2036-06-16
Also published as: EP3134554A4; JP6310099B2; EP3134554A1; CA2991401C; JP2017521999A; CN106795569B; KR20180027557A; US9605305B2; EP3134554B1; CN106795569A; KR102625365B1; AU2016289369B2; US20170009281A1; WO2017007586A1; AU2016289369A1; CA2991401A1

Abstract

Un método para reducir la amplificación de dímeros de cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple, que comprende las etapas de: (a) obtener una primera secuencia de ácido nucleico que comprende una primera etiqueta (t1) y un primer cebador directo (F1) complementario a una cadena de un primer fragmento de ácido nucleico diana de doble cadena, (b) obtener una segunda secuencia de ácidos nucleicos que comprende una segunda etiqueta (t2) y un primer cebador inverso (R1) complementario a la otra cadena del primer fragmento de ácido nucleico diana de doble cadena, (c) obtener una tercera secuencia de ácidos nucleicos que comprende una tercera etiqueta (t3) y un segundo cebador directo (F2) complementario a una cadena de un segundo fragmento de ácido nucleico diana de doble cadena, (d) obtener una cuarta secuencia de ácidos nucleicos que comprende la primera etiqueta (t1), un segundo cebador inverso (R2) complementario a la otra cadena del segundo fragmento de ácido nucleico diana de doble cadena, y una secuencia parcial del extremo 5' (F1^) o una secuencia completa del primer cebador directo (F1) entre la primera etiqueta (t1) y el segundo cebador inverso (R2), en el que el primer cebador directo (F1) y el segundo cebador inverso (R2) tienen una región complementaria en sus extremos 3', F1^ tiene 3-30 nucleótidos o 40-90% de la secuencia F1, (e) mezclar el primer y el segundo fragmentos de ácido nucleico diana, la primera, la segunda, la tercera y la cuarta secuencias de ácidos nucleicos, y una cantidad efectiva de reactivos necesarios para realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR); y (f) realizar la PCR.

Description

DESCRIPCION

Metodo para reducir la amplificacion de d ^e ro s de cebadores

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un metodo para reducir la amplificacion de dfmeros de cebadores en una reaccion en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles) multiple.

Antecedentes de la invencion

La PCR multiple consiste en multiples conjuntos de cebadores dentro de una sola mezcla de PCR para producir amplicones que son espedficos de diferentes secuencias de ADN. Al dirigirse a multiples genes a la vez, se puede obtener informacion adicional a partir de un solo ensayo que de otra manera requerina varias veces los reactivos y los esfuerzos para realizarlo.

Uno de los principales obstaculos que pueden disminuir la sensibilidad del ensayo de la PCR multiple es la acumulacion de dfmeros de cebadores (PD, por sus siglas en ingles). Un PD consiste en moleculas de cebadores que se hibridan entre sf debido a cadenas de bases complementarias, particularmente en los extremos 3' de los cebadores. La presencia de muchos pares de cebadores en concentraciones muy altas en las reacciones de PCR multiple aumenta las posibilidades de formacion de dfmeros de cebadores. Una vez formados, los PD cortos tienden a amplificarse de manera muy eficiente, inhibiendo potencialmente la amplificacion de las secuencias de ADN deseadas por la utilizacion masiva de cebadores y otros reactivos. La formacion de PD puede reducirse mediante una combinacion de diferentes enfoques, incluidos el diseno especial de cebadores y los metodos de modificacion, el uso de polimerasa Taq de arranque en caliente, los aditivos de PCR y las condiciones de ciclos de PCR optimizadas.

Se han descrito metodos de diseno y modificacion de cebadores para reducir la formacion de PD. Brownie et al (Nucleic Acids Res, 25 (16): 3235-41, 1997) describen sistemas no dimerizados asistidos por homo-etiquetado (HANDS, por sus siglas en ingles: Homo-Tag Assisted Non-Dimer System). En la PCR HANDS, todos los cebadores espedficos diana contienen una secuencia de cola comun en sus extremos 5' a baja concentracion y se mezclan con un unico cebador espedfico de cola a una concentracion mas alta. Despues de al menos dos ciclos de PCR diana espedfica, la temperatura de hibridacion se eleva para los ciclos de amplificacion posteriores que son impulsados completamente por el cebador espedfico de cola. En consecuencia, las cadenas sencillas de todos los productos de PCR, incluidos los amplicones deseados y productos secundarios como el PD, tienen extremos 5' y 3' complementarios que conducen a la formacion de las mismas estructuras de tallo-bucle. Debido a las altas concentraciones locales de las secuencias de cola, las estructuras de tallo-bucle formadas en productos cortos, como el PD, son muy estables y superan la subsiguiente hibridacion del cebador espedfico de cola, lo que da como resultado la inhibicion de la amplificacion del PD. Sin embargo, con la misma secuencia de cola en cada extremo de todos los cebadores, este metodo requiere que los amplicones diana sean lo suficientemente largos como para minimizar los efectos inhibitorios de los bucles en el tallo en los productos objetivo correctos. Dependiendo de la longitud y la composicion de los amplicones diana en una PCR altamente multiplicada, la estrechez en el bucle del tallo de cada amplicon vana, lo que puede llevar a una amplificacion significativamente desequilibrada. Ademas, el bucle en el tallo puede no ser lo suficientemente estable como para inhibir la formacion de PD entre los cebadores largos.

El documento de patente US n° 5,792,607 (Backman et al) y de solicitud de patente US n° de publicacion 20140329245 describen un metodo que utiliza la endonucleasa IV para separar los 3' no extensibles modificados de los cebadores para activar los cebadores tras la hibridacion espedfica cebador-molde. Dobosy et al. (BMC Biotechnol. 11: 80, 2011) describen un metodo de PCR dependiente de RNasa H (rhPCR, por sus siglas en ingles) que utiliza RNAasa H para separar una unica base de ARN posicionada cerca del extremo 3' de los cebadores bloqueados para activar los cebadores en la hibridacion espedfica cebador-molde. Este metodo se comercializo recientemente por IDT (Integrated DNA Technologies, solicitud de patente US n° de publicacion 2009/0325169, PCT/US2012/030413). Todas estas estrategias requieren bases modificadas en los cebadores y enzimas adicionales para la activacion del cebador, lo que da como resultado un mayor coste.

Peleg et al (Appl. Environ. Microbiol., 75: 6393-6398, 2009; W0/2009/004630) describen que los cebadores quimericos de ADN-ARN en la PCR reducen la formacion de PD. Se ha descrito que el cebador de oligonucleotido de cebado doble (DPO, por sus siglas en ingles) (Seegene Technologies) reduce la formacion de PD en PCR (Chun et al., Nucleic Acids Res. 35 (6): e40, 2007). El DPO comprende dos regiones de cebado separadas (el extremo 5' estabilizador y el extremo 3' determinador) unidas por un enlazador de polideoxinosina. Las hibridaciones no espedficas de los cebadores, como el PD, se reducen en el extremo 3' del cebador DPO debido a la estructura "burbuja" que comprende los enlaces de hidrogeno debiles del enlazador de polideoxinosina. Las bases de ARN anteriores en los cebadores quimericos y el enlazador de polideoxinosina en los cebadores DPO aumentan significativamente la complejidad y el coste de la fabricacion de cebadores.

Scatterfield (J. Mol. Diagn., 16: 163-173, 2013) describe cebadores cooperativos que consisten en dos secuencias de ADN unidas a traves de un enlazador de polietilenglicol, ya sea 5' a 5' o 5' a 3'. Los resultados indican que las reacciones de PCR singleplex que utilizan cebadores cooperativos reducen enormemente la propagacion del cebadorcebador en presencia de dfmeros de cebador agregados. El documento WO2008/118839 describe una PCR multiple que involucra cebadores espedficos diana directos e inversos con colas 5' identicas para suprimir la formacion de d ^e ro s de cebadores. A pesar de estos esfuerzos, la formacion de PD sigue siendo un gran reto en la PCR multiple. En particular, el nivel multiple para el enriquecimiento diana en aplicaciones de secuenciacion de segunda generacion (n Gs , por sus siglas en ingles) es extremadamente alto cuando cientos de o incluso miles de cebadores estan presentes en el mismo grupo de reaccion de PCR. Todos estos cebadores pueden potencialmente formar dfmeros de cebadores.

Breve descripcion de los dibujos.

FIG. 1A ilustra un primer ciclo y un segundo ciclo de PCR para la amplificacion de dos secuencias diana, con t1F1, t2R1, t3F2 y t1F1AR2 como cebadores. FIG. 1B ilustra la interaccion de F1 y R2, y la formacion, amplificacion e inhibicion del dfmero de cebadores.

FIG. 2 muestra que F1 y R2 tienen 7 bases complementarias en sus extremos 3' y forman un dfmero de cebador.

FIG. 3 muestra los resultados de la electroforesis en gel de los productos de PCR mediante amplificacion por PCR en 1 etapa (panel superior) y amplificacion por PCR en 2 etapas (panel inferior). Carril 1: 1-ple amplicon 1, Carril 2: 1-ple amplicon 2, Carriles 3-8: 2-ple con cebador t1_F1Ax_R2, donde x = 0, 3, 6, 9, 12, 15 nucleotidos, respectivamente. Carril M: escalera de ADN de 50 bases.

Descripcion detallada del invento

Definicion

Un "amplicon" es un fragmento de ADN o ARN que es la fuente y/o el producto de eventos de amplificacion o replicacion naturales o artificiales. En este contexto, "amplificacion" se refiere a la produccion de una o mas copias de un fragmento genetico o secuencia diana, espedficamente el amplicon. Como producto de una reaccion de amplificacion, el amplicon se usa indistintamente con terminos comunes de laboratorio, tales como producto de PCR.

Un "dfmero de cebadores" (PD, por sus siglas en ingles) es un subproducto potencial en la PCR. Un PD consiste en moleculas cebadoras que se hibridan entre sf debido a las bases complementarias en los cebadores. El alcance de la invencion se define por las reivindicaciones adjuntas. La presente invencion se dirige a un metodo para reducir la amplificacion de dfmeros de cebadores en una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR). Cuando un primer cebador directo (F1) y un segundo cebador inverso (R2) tienen una region complementaria en sus extremos 3', puede producirse la formacion de un dfmero de cebadores. Debido a las altas concentraciones de cebadores, la region complementaria puede ser tan corta como 2-3 nucleotidos para causar la amplificacion del dfmero de cebadores. Cuando la region complementaria es de al menos 4 o 5 nucleotidos, es casi seguro que se produce la amplificacion del dfmero de cebadores no deseado.

El presente metodo reduce el problema del dfmero de cebadores cuando un primer cebador directo (F1) y un segundo cebador inverso (R2) tienen una region complementaria en sus extremos 3'. El metodo comprende las etapas de: (a) obtener una primera secuencia de acidos nucleicos que comprende una posible primera formacion. Debido a las altas concentraciones de cebadores, la region complementaria puede ser tan corta como 2-3 nucleotidos para causar la amplificacion del dfmero de cebadores. Cuando la region complementaria es de al menos 4 o 5 nucleotidos, es casi seguro que se produzca la amplificacion del dfmero de cebadores no deseada.

El presente metodo reduce el problema del dfmero de cebadores cuando un primer cebador directo (F1) y un segundo cebador inverso (R2) tienen una region complementaria en sus extremos 3'. El metodo comprende las etapas de: (a) obtener una primera secuencia de acidos nucleicos que comprende una primera etiqueta (t1) y un primer cebador directo (F1) complementario a un primer fragmento de acido nucleico diana, (b) obtener una segunda secuencia de acidos nucleicos que comprende una segunda etiqueta (t2) y un primer cebador inverso (R1) complementario al primer fragmento de acido nucleico diana, (c) obtener una tercera secuencia de acidos nucleicos que comprende una tercera etiqueta (t3) y un segundo cebador directo (F2) complementario a un segundo fragmento de acido nucleico diana, (d) obtener una cuarta secuencia de acidos nucleicos que comprende la primera etiqueta (t1), un segundo cebador inverso (R2) complementario al segundo fragmento de acido nucleico y una secuencia parcial del extremo 5' (F1A) o una secuencia completa del primer cebador directo (F1) entre la primera etiqueta (t1) y el segundo cebador inverso (R2), (e) mezclar el primer y el segundo fragmento de acido nucleico diana, la primera, la segunda, la tercera, y la cuarta secuencia de acidos nucleicos, y una cantidad efectiva de reactivos necesarios para realizar una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR); y (f) realizar PCR. La presente descripcion incluye metodos que involucran los siguientes elementos:

F1, R1, F2, R2 son cebadores espedficos de genes, que son complementarios a regiones espedficas de ADN genomico (ADN o amplicones objetivo). La longitud de estos cebadores puede ser elegida por un experto en la tecnica. En general, los cebadores espedficos de genes tienen una longitud de 6-40, 10-50 o 10-100 nucleotidos. Por ejemplo, los cebadores espedficos de genes pueden tener 15-30 nucleotidos.

F1A es la porcion 5' de las secuencias del cebador F1 que estan etiquetadas en el extremo 5' del cebador R2; F1A puede ser una secuencia completa o parcial de F1. La longitud de F1A puede depender de su contenido en GC, que afecta a su punto de fusion cuando se hibrida con bases complementarias. En una realizacion, la secuencia parcial de F1A es 1-20, 1-10, o 1-5 nucleotidos mas corta que F1. En una realizacion, la secuencia parcial de F1A contiene 10 50, 20-80, 30-70, 40-90, o 50-90% de la secuencia F1. En otra realizacion, la secuencia parcial de F1A contiene 3-30, o 5-20, u 8-15 nucleotidos.

Las etiquetas t1, t2 y t3 son secuencias de etiquetas universales que no se unen a los ADN diana. En una realizacion, las etiquetas t2 y t3 tienen secuencias identicas. En otra realizacion, t2 y t3 son diferentes, es decir, no son 100% identicos. Ambas etiquetas t2 y t3 son diferentes de la etiqueta t1.

Las FIGs. 1A y 1B se utilizan con fines ilustrativos y la presente invencion no pretende limitarse unicamente a los dibujos. FIG. 1A muestra una amplificacion de p Cr tipica con dos secuencias diana que no tienen regiones superpuestas. FIG. 1B muestra la formacion de PD por los cebadores F1 y R2 y la inhibicion de la acumulacion de PD por la estructura tallo-bucle.

FIG. 1B ilustra como la presente invencion evita la amplificacion exponencial de un dfmero de cebadores. En la FIG.

1B, un cebador directo F1 y un cebador inverso R2 tienen una region complementaria en sus extremos 3'. Despues del ciclo 1, se forman las cadenas PD 1 y PD 2. En el Ciclo 2, en el lado izquierdo, la cadena PD 2 forma un bucle en el tallo, en el que t1 y F1A se hibridan con sus contrapartes complementarias respectivamente para formar un tallo, y los nucleotidos restantes forman un bucle. Debido a las altas concentraciones locales de t1 y F1a y sus contrapartes complementarias respectivas, p. ej., estan en la misma cadena PD 2 y estan cerca entre sf, la formacion del bucle en el tallo es mas favorable que la hibridacion con un cebador t1F1 separado; por lo tanto, la hibridacion del cebador adicional se bloquea, y no se puede obtener ningun producto de amplificacion adicional de la cadena PD 2. La presencia de F1A es importante para bloquear completamente la hibridacion del cebador (t1_F1) con la cadena PD 2 y luego la amplificacion de la cadena PD 2. Sin F1A, el cebador t1_F1 puede superar la estructura del tallo que contiene solo t1 y luego hibridar con la cadena PD 2. Con la adicion de F1A, el cebador t1_F1 ya no puede superar la estructura del tallo que contiene t1_F1A para hibridar con la cadena PD 2.

En el ciclo 2 de la FIG. 1B, en el lado derecho, similar a la cadena PD 2, la cadena PD 1 tambien forma un bucle en el tallo, en el que t1 y F1A se hibridan con sus contrapartes complementarias respectivamente para formar un tallo, y los nucleotidos restantes forman un bucle. Debido a la mayor longitud y, por lo tanto, a un mayor punto de fusion del cebador R2 etiquetado (t1_F1A_R2), este cebador puede superar a t1_F1A en el tallo para la hibridacion, y puede obtenerse una posible amplificacion lineal para la cadena PD 1. La FIG. 1B ilustra la invencion de que con el diseno del cebador de t1F1 y t1_F1A_R2, el PD a lo sumo se amplificana linealmente para una cadena, y no se amplificana exponencialmente.

En la etapa (f) del presente metodo, la PCR se puede realizar en un paso (una condicion de ciclo) o en dos pasos (dos condiciones de ciclo diferentes). En la PCR de dos pasos, la temperatura de hibridacion se incrementa en la segunda condicion de ciclo, lo que reduce aun mas la formacion del dfmero de cebadores.

En un paso, la PCR comprende las etapas de: (f1) activar la ADN polimerasa y los ADN desnaturalizantes en la mezcla de (e), y (f2) ciclar la mezcla de (f1) a traves de las etapas de desnaturalizacion, hibridacion y extension del cebador de la PCR varias veces para obtener productos de amplificacion.

En dos pasos, la PCR comprende las etapas de: (f-i) activar la ADN polimerasa y los ADN desnaturalizantes en la mezcla de (e), (f-ii) ciclar la mezcla de (f-i) a traves de desnaturalizacion, hibridacion y etapas de extension del cebador de la PCR al menos dos veces, y (f-iii) ciclar la mezcla de (f-i) a traves de las etapas de desnaturalizacion, hibridacion y extension del cebador de la PCR a una temperatura de hibridacion mas alta que la de la etapa (f-ii) para obtener productos de amplificacion.

En la PCR en dos pasos, en la etapa (f-ii), la mezcla de acidos nucleicos y reactivos se hace pasar por el ciclo de PCR de las etapas de desnaturalizacion, hibridacion y extension del cebador al menos dos veces, como 2-5 veces. En la etapa (f-iii), la mezcla de (f) se hace pasar por mas ciclos de PCR de desnaturalizacion, hibridacion y extension del cebador; esta vez a una temperatura de hibridacion superior a la de la etapa (f-ii). Por ejemplo, la temperatura de hibridacion en la etapa (f-iii) es aproximadamente 4-35°C, o 5-25°C, o 6-20°C, o 6-15°C mas alta que la temperatura de hibridacion en la etapa (f-ii). Por ejemplo, la primera temperatura de los primeros ciclos de hibridacion y extension (etapa f-ii) es de 58-62°C, por ejemplo, 60°C, y la segunda temperatura de los segundos ciclos de hibridacion y extension (etapa f-iii) es 66-70°C, por ejemplo, 68°C.

En la PCR en dos pasos, la temperatura de hibridacion en el segundo paso (f-iii) se incrementa para evitar la iniciacion repetida de dfmeros de cebadores. Despues del primer paso de PCR (f-ii), cada producto de secuencia diana amplificada se alarga por las etiquetas en ambos extremos y en consecuencia las regiones de hibridacion se alargan por las etiquetas. Por lo tanto, aumentar las temperaturas de hibridacion en el segundo paso no afectara la hibridacion del cebador a ADN diana espedfico. Sin embargo, el aumento de las temperaturas de hibridacion en el segundo paso reducira la iniciacion de dfmeros de cebadores, en el que las regiones complementarias siguen teniendo la misma longitud.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invencion. Estos ejemplos pretenden ser meramente ilustrativos de la presente invencion y no deben considerarse limitativos.

Ejemplos

La Tabla 1 muestra las secuencias de oligonucleotidos utilizadas en los siguientes ejemplos.

Tabla 1

Oligo 1-4 en la Tabla 1 son cebadores diana espedficos para el gen BRCA1 Amplicon1 y Amplicon2 sin las secuencias etiquetadoras; Ampliconl y Amplicon2 no tienen secuencias superpuestas. Oligo 5-6 son secuencias de etiquetas de Illumina TSCA secuencias de etiquetas. Oligo 7-15 son los cebadores etiquetados utilizados en los Ejemplos 1-3. F1 y R2 tienen 7 bases complementarias en sus extremos 3'y forman un heterod^ero como se muestra en la FIG. 2. La Tabla 2 muestra los tamanos de los amplicones, incluida la PD, y las ubicaciones en el genoma humano 19.

Tabla 2

La Tabla 3 muestra informacion para las combinaciones de cebadores en los Ejemplos 1, 2 y 3.

Tabla 3

Ejemplo 1: Amplificacion por PCR de 1 etapa

Una mezcla de reaccion de PCR tfpica de 25 pL de PCR espedfica de gen incluyo: 2 pL de ADN genomico humano (Promega Cat# G3041, diluido a 5 ng/pL usando un tampon de bajo TE (USB Cat# 75793)), 12,5 pL de 2x Master Mix (Qiagen Cat# 206413), 8,5 pL de agua libre de nucleasas, y 2 pL de la mezcla de cebadores espedficos del gen (2,5 pM cada uno, ver Tabla 3 para obtener informacion sobre mezclas y la Tabla 1 para las secuencias de oligonucleotidos).

Las reacciones de PCR 1-ple y 2-ple se realizaron en un termociclador de la siguiente manera:

1 Ciclo 95°C 15 min Activacion enzimatica y desnaturalizacion inicial del ADN

30 Ciclos 95°C 30 s Desnaturalizacion

60°C 90 s Hibridacion/extension

1 Ciclo 72°C 5 min Extension final

1 Ciclo 8°C Mantenimiento

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para reducir la amplificacion de d ^e ro s de cebadores en una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) multiple, que comprende las etapas de:

(a) obtener una primera secuencia de acido nucleico que comprende una primera etiqueta (t1) y un primer cebador directo (F1) complementario a una cadena de un primer fragmento de acido nucleico diana de doble cadena, (b) obtener una segunda secuencia de acidos nucleicos que comprende una segunda etiqueta (t2) y un primer cebador inverso (R1) complementario a la otra cadena del primer fragmento de acido nucleico diana de doble cadena,

(c) obtener una tercera secuencia de acidos nucleicos que comprende una tercera etiqueta (t3) y un segundo cebador directo (F2) complementario a una cadena de un segundo fragmento de acido nucleico diana de doble cadena,

(d) obtener una cuarta secuencia de acidos nucleicos que comprende la primera etiqueta (t1), un segundo cebador inverso (R2) complementario a la otra cadena del segundo fragmento de acido nucleico diana de doble cadena, y una secuencia parcial del extremo 5' (F1A) o una secuencia completa del primer cebador directo (F1) entre la primera etiqueta (t1) y el segundo cebador inverso (R2), en el que el primer cebador directo (F1) y el segundo cebador inverso (R2) tienen una region complementaria en sus extremos 3', F1A tiene 3-30 nucleotidos o 40-90% de la secuencia F1,

(e) mezclar el primer y el segundo fragmentos de acido nucleico diana, la primera, la segunda, la tercera y la cuarta secuencias de acidos nucleicos, y una cantidad efectiva de reactivos necesarios para realizar una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR); y

(f) realizar la PCR.

2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa (f) comprende:

(f1) activar la ADN polimerasa y los ADN desnaturalizantes en la mezcla de (e),

(f2) ciclar la mezcla de (f1) a traves de las etapas de desnaturalizacion, hibridacion y extension del cebador de PCR varias veces para obtener productos de amplificacion.

3. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa (f) comprende:

(f-i) activar la ADN polimerasa y los ADN desnaturalizantes en la mezcla de (e),

(f-ii) ciclar la mezcla de (f-i) a traves de las etapas de desnaturalizacion, hibridacion y extension del cebador de la PCR al menos dos veces, y

(f-iii) ciclar la mezcla de (f-ii) a traves de las etapas de desnaturalizacion, hibridacion y extension del cebador de la PCR varias veces a una temperatura de hibridacion mas alta que la de la etapa (f-ii) para obtener productos de amplificacion.

4. El metodo segun la reivindicacion 3, en el que la temperatura de hibridacion en la etapa (f-iii) es 4-35°C mas alta que la temperatura de hibridacion en la etapa (f-ii).

5. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que las etiquetas t3 y t2 tienen la misma secuencia.

6. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia de ambas etiquetas t3 y t2 es diferente de la secuencia de la etiqueta t1.

7. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 4, en el que F1A tiene 3-30 nucleotidos de la secuencia F1 desde el extremo 5'.

8. El metodo segun la reivindicacion 1 o 4, en el que F1A tiene 40-90% de la secuencia F1 desde el extremo 5'.

9. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que F1, F2, R1 y R2 son cebadores espedficos de gen.