KR20180027557A - 프라이머-다이머 증폭 감소 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 멀티플렉스 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 프라이머-다이머 증폭을 감소시킨다. 제 1 정방향 프라이머 (F1) 및 제 2 역방향 프라이머 (R2) 가 그들의 3'-말단에 상보성 영역을 갖는 경우, 프라이머 다이머가 형성될 수 있다. 본 방법은 프라이머-다이머 (F1_R2) 증폭을 감소시키기 위해, 제 1 태그 (t1) 와 R2 사이에 끼어 있는 제 1 정방향 프라이머의 5'-말단 부분 서열 또는 전체 서열을 포함하는 프라이머를 이용한다.
Description
본 발명은 멀티플렉스 (multiplex) 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 프라이머-다이머 증폭 감소 방법에 관한 것이다.
멀티플렉스-PCR 은 단일 PCR 혼합물 내 다중 프라이머 세트로 이루어져, 상이한 DNA 서열들에 특이적인 앰플리콘 (amplicon) 을 생성한다. 한번에 여러 유전자를 표적화함으로써, 단일 테스트 실행으로부터 추가적인 정보를 얻을 수 있으며, 그렇지 않는다면 수차례 시약 및 수행 노력이 요구될 수 있다.
멀티플렉스-PCR 의 검정 민감도를 낮출 수 있는 주요 장애물 중 하나는 프라이머-다이머 (PD) 의 축적이다. PD 는 상보성 염기들의 스트링 (string) 으로 인해, 특히 프라이머의 3'-말단에서 서로 하이브리드화하는 프라이머 분자로 이루어진다. 멀티플렉스 PCR 반응에서 매우 높은 농도의 많은 프라이머 쌍이 존재하면 프라이머 다이머가 형성될 가능성이 늘어난다. 일단 형성되면, 짧은 PD 는 매우 효율적으로 증폭되는 경향이 있어, 프라이머 및 기타 시약의 막중한 소비에 의해 원하는 DNA 서열의 증폭을 잠재적으로 저해한다. PD 형성은 특수 프라이머 디자인 및 개질 방법, 핫 스타트 Taq 폴리머라아제의 사용, PCR 첨가제 및 최적화된 PCR 싸이클링 조건을 비롯한 상이한 접근법들을 조합함으로써 감소시킬 수 있다.
다양한 프라이머 디자인 및 개질 방법이 PD 형성을 감소시키는 것으로 보고되어 있다. Brownie et al (Nucleic Acids Res, 25(16): 3235-41, 1997) 은, HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System; 호모-Tag 보조 비-다이머 시스템) 을 기술한다. HANDS PCR 에서, 모든 표적-특이적 프라이머는 그들 5'-말단에서 통상의 테일 (tail) 서열을 낮은 농도로 함유하고, 더 높은 농도로 단일의 테일-특이적 프라이머와 혼합된다. 표적 특이적 PCR 의 적어도 두 싸이클 후, 어닐링 온도는 테일-특이적 프라이머에 의해 완전히 구동되는 후속의 증폭 싸이클 동안 상승된다. 결과적으로, 원하는 앰플리콘 및 부산물, 예컨대 PD 를 비롯한 모든 PCR 생성물로부터의 단일 가닥은 상보적인 5' 및 3' 말단을 갖고, 이는 동일한 줄기-루프 (stem-loop) 구조의 형성을 도모한다. 테일 서열의 높은 국부적 농도로 인해, PD 와 같은 짧은 생성물에서 형성된 줄기-루프 구조는 매우 안정적이고, 테일-특이적 프라이머의 후속 어닐링 경쟁에서 우세하여, PD 증폭의 저해를 도모한다. 그러나, 모든 프라이머의 각 말단 상에 동일한 테일 서열을 이용한다면, 이 방법에서는 실제 표적 생성물에 대한 줄기 루프의 저해 효과를 최소화할 정도로 표적화된 앰플리콘이 충분히 길 것이 요구된다. 고도로 멀티플렉스화된 PCR 에서 표적화된 앰플리콘의 길이 및 조성에 따라, 각 앰플리콘의 줄기 루프의 견고성은 변하기 때문에, 상당히 불균형한 증폭이 초래될 수 있다. 나아가, 줄기 루프는 긴 프라이머 사이의 PD 형성을 저해할 정도로 충분히 안정하지 않을 수 있다.
U.S. Pat. No. 5,792,607 (Backman et al) 및 U.S. Patent Application Publication No. 20140329245 에는, 특이적 프라이머-주형 하이브리드화시 프라이머를 활성화하기 위해 프라이머의 개질된 비신장성 (non-extendable) 3' 을 절단하는 엔도뉴클레아제 IV 를 이용하는 방법이 개시되어 있다. Dobosy et al. (BMC Biotechnol. 11: 80, 2011) 에는, 프라이머-주형 특이적 하이브리드화시 프라이머를 활성화시키도록 차단된 프라이머의 3' 말단과 밀접하게 위치한 단일의 RNA 염기를 절단하는데 RNAse H 를 이용하는 RNase H-의존적 PCR (rhPCR) 이 보고되어 있다. 이 방법은 IDT (Integrated DNA Technologies, US Patent Application Publication No. 2009/0325169, PCT/US2012/030413) 에 의해 최근 상업화되었다. 이들 접근법 모두는 프라이머 활성화를 위한 프라이머 내 개질된 염기 및 추가 효소를 요구하며, 이로써 비용이 높아진다.
Peleg et al (Appl. Environ. Microbiol., 75: 6393-6398, 2009; WO/2009/004630) 에는, PCR 에서 DNA-RNA 키메라 프라이머가 PD 형성을 감소시킨다고 보고되어 있다. Dual Priming Oligonucleotide (DPO; 이중 프라이밍 올리고뉴클레오티드) 프라이머 (Seegene Technologies) 가 PCR PD 형성을 감소시키는 것으로 보고되어 있다 (Chun et al., Nucleic Acids Res. 35(6): e40, 2007). DPO 는 폴리데옥시이노신 링커에 의해 연결된 2 개의 개별 프라이밍 영역 (5'-말단 안정화제 및 3'-말단 결정인자) 을 포함한다. PD 와 같은 프라이머의 비특이적 하이브리드화는 폴리데옥시이노신 링커의 약한 수소 결합을 구성하는 "버블"-형 구조로 인해, DPO 프라이머의 3'-말단에서 감소된다. 키메라 프라이머에서 상기 RNA 염기 및 DPO 프라이머에서 폴리데옥시이노신 링커는 프라이머 제조의 복잡성 및 비용을 상당히 증가시킨다.
Scatterfield (J. Mol. Diagn., 16: 163-173, 2013) 에는 5' 에서 5' 또는 5' 에서 3' 의 폴리에틸렌 글리콜 링커를 통해 연결된 2 개의 DNA 서열로 이루어진 협동 프라이머가 보고되어 있다. 그 결과는 협동 프라이머를 이용하는 싱글플렉스 (singleplex) PCR 반응이 첨가된 프라이머 다이머의 존재 하에서 프라이머-프라이머 전파를 크게 감소시키는 것을 보여준다.
이들 노력에도 불구하고, PD 형성은 멀티플렉스 PCR 에서 여전히 커다란 과제이다. 특히, 차세대 시퀀싱 (next generation sequencing; NGS) 적용에서 표적 부유를 위한 멀티플렉스 수준은 동일한 PCR 반응 풀에서 수백 또는 심지어 수천 개의 프라이머가 존재할 경우 극도로 높다. 이들 프라이머 모두는 잠재적으로 프라이머 다이머를 형성할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1A 는 프라이머로서 t1F1, t2R1, t3F2, 및 t1F1^ R2 을 이용하는 두 개의 표적 서열의 증폭을 위한 PCR 의 제 1 싸이클 및 제 2 싸이클을 나타낸다. 도 1B 는 F1 및 R2 의 상호작용, 및 프라이머 다이머의 형성, 증폭 및 저해를 나타낸다.
도 2 는 F1 및 R2 가 그들의 3'-말단에서 7 개의 상보성 염기를 갖고 프라이머 다이머를 형성하는 것을 나타낸다.
도 3 은 1-단계 PCR 증폭 (상단 패널) 및 2-단계 PCR 증폭 (하단 패널) 에 의한 PCR 생성물의 겔 전기영동의 결과를 나타낸다. 레인 1: 1-플렉스 (1-plex) 앰플리콘 1, 레인 2: 1-플렉스 앰플리콘 2, 레인 3-8: 프라이머 t1_F1^x_R2 을 갖는 2-플렉스 (2-plex), 여기서 x= 0, 3, 6, 9, 12, 15 뉴클레오티드, 각각. 레인 M: 50 염기 DNA Ladder.
정의
"앰플리콘"은 자연적 또는 인위적 증폭 또는 복제 이벤트의 공급원 및/또는 생성물인 DNA 또는 RNA 조각이다. 이러한 문맥에서, "증폭"은 유전자 단편 또는 표적 서열의 하나 이상의 카피, 특히 앰플리콘의 생성을 지칭한다. 증폭 반응의 생성물로서, 앰플리콘은 PCR 생성물과 같은 통상의 실험실 용어와 상호교환가능하게 사용된다.
"프라이머 다이머" (PD) 는 PCR 에서 잠재적인 부산물이다. PD 는 프라이머에서 상보성 염기들 때문에 서로 하이브리드화되는 프라이머 분자들로 이루어진다.
본 발명은 멀티플렉스 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서 프라이머-다이머 증폭을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 제 1 정방향 프라이머 (Forward primer; F1) 및 제 2 역방향 프라이머 (Reverse primer; R2) 가 그들의 3' 말단에서 상보성 영역을 가질 때, 프라이머-다이머 형성이 발생할 수 있다. 프라이머의 고농도로 인해, 상보성 영역은 2-3 개의 뉴클레오티드만큼 짧을 수 있어 프라이머 다이머 증폭을 야기할 수 있다. 상보성 영역이 적어도 4 또는 5 개의 뉴클레오티드인 경우, 원하지 않는 프라이머 다이머 증폭은 거의 확실하게 일어난다.
본 방법은 제 1 정방향 프라이머 (F1) 및 제 2 역방향 프라이머 (R2) 가 그들의 3'-말단에서 상보성 영역을 갖는 경우 프라이머 다이머 문제를 감소시킨다. 이 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 제 1 태그 (t1) 및 제 1 표적 핵산 단편에 상보적인 제 1 정방향 프라이머 (F1) 을 포함하는 제 1 핵산 서열을 수득하는 단계, (b) 제 2 태그 (t2) 및 제 1 표적 핵산 단편에 상보적인 제 1 역방향 프라이머 (R1) 을 포함하는 제 2 핵산 서열을 수득하는 단계, (c) 제 3 태그 (t3) 및 제 2 표적 핵산 단편에 상보적인 제 2 정방향 프라이머 (F2) 를 포함하는 제 3 핵산 서열을 수득하는 단계, (d) 제 1 태그 (t1), 제 2 핵산 단편에 상보적인 제 2 역방향 프라이머 (R2), 및 제 1 태그 (t1) 과 제 2 역방향 프라이머 (R2) 사이 내에서의 제 1 정방향 프라이머의 5'-말단 부분 서열 또는 전체 서열 (F1^) 을 포함하는 제 4 핵산 서열을 수득하는 단계, (e) 제 1 및 제 2 표적 핵산 단편, 제 1, 제 2, 제 3, 및 제 4 핵산 서열, 및 유효량의 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 수행하는데 필수적인 시약을 혼합하는 단계; 및 (f) PCR 을 수행하는 단계.
F1, R1, F2, R2 은 유전자-특이적 프라이머로서, 이들은 게놈 DNA (표적 DNA 또는 앰플리콘) 의 특이적 영역에 대해 상보적이다. 이들 프라이머의 길이는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 유전자-특이적 프라이머는 6-40, 10-50, 또는 10-100 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 유전자-특이적 프라이머는 15-30 뉴클레오티드일 수 있다.
F1^ 는 R2 프라이머의 5'-말단에서 태깅된 (tagged) F1 프라이머 서열의 5' 부분이고; F1^ 는 F1 의 전체 서열 또는 부분 서열일 수 있다. F1^ 의 길이는 그의 GC 함량에 따라 좌우될 수 있는데, 이는 이것이 상보성 염기에 하이브리드화될 때 그의 용융점에 영향을 미친다. 한 구현예에서, F2^ 의 부분 서열은 F2 보다 더 짧은 1-20, 1-10, 또는 1-5 이다. 한 구현예에서, F2^ 의 부분 서열은 F2 서열의 10-50, 20-80, 30-70, 40-90, 또는 50-90% 을 함유한다. 또 다른 구현예에서,F2^ 의 부분 서열은 3-30, 또는 5-20, 또는 8-15 개의 뉴클레오티드를 함유한다.
태그 t1, t2, 및 t3 은 표적 DNA 에 결합하지 않는 범용 태그 서열이다. 한 구현예에서, 태그 t2 및 t3 은 동일한 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, t2 및 t3 은 상이하고, 즉 이들은 100% 동일하지 않다. 태그 t2 와 t3 양자 모두는 태그 t1 과 상이하다. 각각의 태그는 유전자-특이적 프라이머의 5'-말단에 있다. 본 발명에서, 태그 서열은 길이가 적어도 3 뉴클레오티드이고, 5-100, 3-40, 또는 10-30 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 태그는 전형적으로 유전자-특이적 태깅되지 않은 (untagged) 프라이머의 용융 온도에 적어도 5℃ 를 부가하도록 설계된다. 태그 서열은 개질 또는 비개질된 핵산일 수 있다. 많은 개질된 염기 (예를 들어, 잠김 (locked) 핵산 또는 펩티드 핵산) 는 그들의 상응하는 천연 염기보다 더 높은 어닐링 (annealing) 온도를 가진다. 더 짧은 태그 서열이 여러가지 이유로 요구되는 경우, 이들 개질된 염기가 천연 염기 대신에 이용될 수 있다.
도 1A 및 1B 는 설명의 목적으로 사용된 것이며, 본 발명이 도면에만 한정되는 것을 의미하는 것은 아니다. 도 1A 는 중첩 영역이 없는 2 개의 표적 서열을 갖는 전형적인 PCR 증폭을 나타낸다. 도 1B 는 F1 및 R2 프라이머에 의한 PD 형성 및 줄기-루프 구조에 의한 PD 축적의 저해를 나타낸다.
도 1B 는 본 발명이 프라이머 다이머의 지수적 증폭을 방지하는 방식을 나타낸다. 도 1B 에서, 정방향 프라이머 F1 및 역방향 프라이머 R2 는 그들의 3'-말단에서 상보성 영역을 가진다. 싸이클 1 후, PD-가닥 1 및 PD-가닥 2 가 형성된다. 싸이클 2 에서, 왼쪽에서 PD 가닥 2 는 줄기 루프를 형성하고, 여기서 t1 및 F1^ 이 각각 그들의 상보적 상대물에 어닐링되어 줄기를 형성하고, 나머지 뉴클레오티드는 루프를 형성한다. 높은 국부적 농도의 t1 및 F1^ 및 그들의 각 상보적 상대물로 인해, 즉 이들이 동일한 PD 가닥 2 에 있고 서로 가깝기 때문에, 줄기 루프의 형성이 별개의 t1F1 프라이머를 이용하는 어닐링보다 더 순조롭고; 따라서, 추가의 프라이머 어닐링이 차단되고, PD-가닥 2 의 추가 증폭 생성물은 수득될 수 없다. F1^ 의 존재가 PD 가닥 2 에 어닐링하는 프라이머 (t1_F1) 및 그 다음 PD 가닥 2 의 증폭을 완전히 차단하기 위해서 중요하다. F1^ 없이, 프라이머 t1_F1 는 t1 만을 함유하는 줄기 구조의 경쟁에서 우세하고 이어서 PD 가닥 2 에 어닐링할 수 있다. F1^ 를 첨가하면, 프라이머 t1_F1 는 PD 가닥 2 에 어닐링에 대해 t1_F1^ 를 함유하는 줄기 구조를 더이상 능가할 수 없다.
도 1B 의 싸이클 2 에서, 오른쪽에서 PD 가닥 2 와 마찬가지로, PD 가닥 1 은 또한 줄기 루프를 형성하고, 여기서 t1 및 F1^ 은 그들의 상보적 상대물에 각각 어닐링하여 줄기를 형성하고, 나머지 뉴클레오티드는 루프를 형성한다. 길이가 더 길고, 그에 따라 태깅된 R2 프라이머 (t1_F1^_R2) 의 더 높은 용융점으로 인해, 이 프라이머는 어닐링에 대해 줄기에서 t1_F1^ 를 능가할 수 있으며, PD 가닥 1 에 대해 가능한 선형의 증폭이 수득될 수 있다. 도 1B 는 t1F1 및 t1_F1^_R2 의 프라이머 디자인으로 PD 가 많아야 하나의 가닥에 있어서 선형적으로 증폭될 것이고, 지수적으로 증폭되지 않을 것이라는 본 발명을 설명한다.
본 방법의 단계 (f) 에서, PCR 은 하나의 단계 (하나의 싸이클링 조건) 또는 두 단계 (2 개의 상이한 싸이클링 조건) 로서 수행될 수 있다. 2-단계 PCR 에서, 어닐링 온도는 제 2 싸이클링 조건에서 증가되어, 프라이머 다이머 형성을 추가 감소시킨다.
1-단계에서, PCR 은 하기의 단계를 포함한다: (f1) DNA 폴리머라아제를 활성화시키고 (e) 의 혼합물에서의 DNA 를 변성시키는 단계, 및 (f2) 수회 PCR 의 변성, 어닐링 및 프라이머 신장 단계를 통한 (f1) 의 혼합물의 싸이클링으로 증폭 생성물을 수득하는 단계.
2-단계에서, PCR 은 하기의 단계를 포함한다: (f-i) DNA 폴리머라아제를 활성화시키고 (e) 의 혼합물에서의 DNA 를 변성시키는 단계, (f-ii) 적어도 2 회 PCR 의 변성, 어닐링 및 프라이머 신장 단계를 통한 (f-i) 의 혼합물의 싸이클링 단계, 및 (f-iii) 단계 (f-ii) 에서보다 더 높은 어닐링 온도에서 PCR 의 변성, 어닐링 및 프라이머 신장 단계를 통한 (f-i) 의 혼합물의 싸이클링으로 증폭 생성물을 수득하는 단계.
2-단계 PCR 에서, 단계 (f-ii) 에서, 핵산과 시약의 혼합물은 적어도 2 회, 예컨대 2-5 회 변성, 어닐링 및 프라이머 신장 단계의 PCR 싸이클을 겪는다. 단계 (f-iii) 에서, (f) 의 혼합물은 변성, 어닐링 및 프라이머 신장의 더 많은 PCR 싸이클을 겪는다; 이번 회에는 단계 (f-ii) 에서보다 더 높은 어닐링 온도에서 수행된다. 예를 들어, 단계 (f-iii) 에서 어닐링 온도는 단계 (f-ii) 에서의 어닐링 온도보다 약 4-35℃, 또는 5-25℃, 또는 6-20℃, 또는 6-15℃ 높다. 예를 들어, 어닐링 및 신장의 제 1 싸이클 (단계 f-ii) 의 제 1 온도는 58-62℃, 예를 들어, 60℃ 이고, 어닐링 및 신장 의 제 2 싸이클 (단계 f-iii) 의 제 2 온도는 66-70℃, 예를 들어, 68℃ 이다.
2-단계 PCR 에서, 제 2 단계 (f-iii) 에서 어닐링 온도는 상승되어 프라이머-다이머의 반복된 개시를 방지한다. PCR 의 제 1 단계 (f-ii) 후, 각 증폭된 표적 서열 생성물은 양쪽 말단에서의 태그들에 의해 길어지고, 그에 따라 어닐링 영역은 태그들에 의해 길어진다. 따라서, 제 2 단계에서 어닐링 온도를 상승시키는 것은 특이적 표적 DNA 에 대한 프라이머 어닐링에 영향을 미치지 않을 것이다. 그러나, 제 2 단계에서 어닐링 온도를 상승시키는 것은 상보성 영역이 동일한 길이로 남아 있는 프라이머 다이머 개시를 감소시킬 것이다.
하기의 실시예는 본 발명을 추가로 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
표 1 은 하기의 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
표 1 에서 Oligo 1-4 는 태그 서열이 없는 BRCA1 유전자 앰플리콘1 및 앰플리콘2 에 대한 표적 특이적 프라이머이다; 앰플리콘 1 및 앰플리콘 2 는 중복 (overlapping) 서열을 갖지 않는다. Oligo 5-6 은 Illumina TSCA 태그-서열로부터의 태그 서열이다. Oligo 7-15 는 실시예 1-3 에 사용된 태깅된 프라이머이다.
F1 및 R2 는 그들의 3'-말단에서 7 개의 상보성 염기를 갖고, 도 2 에서 나타낸 바와 같이 헤테로다이머를 형성한다.
표 2 는 인간 게놈 19 위치 및 PD 를 포함하는 앰플리콘 크기를 나타낸다.
표 2
*크기는 t1 및 t2 (F1^ 부재) 로 태깅된 프라이머를 이용한 앰플리콘만을 반영한다.
표 3 은 실시예 1, 2 및 3 에서 프라이머 조합에 대한 정보를 나타낸다.
표 3
* F1 및 R2 를 함유하는 상호작용 프라이머는 2-플렉스 PCR 프라이머 믹스에서 볼드체로 나타낸다.
실시예 1: 1-단계 PCR 증폭
유전자-특이적 PCR 의 전형적인 25 ㎕ PCR 반응 혼합물은 하기를 포함한다: 2 ㎕ 의 인간 게놈 DNA (Promega Cat# G3041, Low TE 버퍼 (USB Cat# 75793) 를 이용하여 5 ng/㎕ 로 희석), 12.5 ㎕ 의 2x Master Mix (Qiagen Cat# 206413), 8.5 ㎕ 뉴클레아제-미함유 물, 및 2 ㎕ 의 유전자-특이적 프라이머 믹스 (2.5 μM 각각, 혼합 정보를 위해서는 표 3 을, 올리고뉴클레오티드 서열을 위해서는 표 1 을 참조함).
두 1-플렉스 와 2-플렉스 PCR 반응을 열 순환기 상에서 하기와 같이 수행했다:
1 싸이클
95℃
15 분 효소 활성화 및 초기 DNA 변성
30 싸이클
95℃
30 초 변성
60℃
90 초 어닐링/신장
1 싸이클
72℃
5 분 최종 신장
1 싸이클
8℃
유지
이 실시예에서, 어닐링 및 신장 온도는 싸이클 동안 일정하게 유지되었다; 따라서. 이것은 1-단계 PCR 증폭으로서 지칭되었다.
실시예 2: 2-단계 PCR 증폭
유사한 PCR 반응 믹스를 실시예 1 에서와 같이 이용하나, 열 순환기 상 2-단계 PCR 싸이클링 프로토콜로 이용했다. 어닐링 및 신장의 첫 다섯 싸이클을 실시예 1 에 사용된 동일 온도인 60℃ 에서 수행하고; 후속 25 싸이클의 어닐링 및 신장을 68℃ 의 상승 온도에서 수행해 프라이머 다이머의 개시를 저해하였다.
2-단계 PCR 프로토콜은 하기와 같다:
1 싸이클
95℃
15 분 효소 활성화 및 초기 DNA 변성
5 싸이클
95℃
30 초 변성
60℃
90 초 어닐링/신장
25 싸이클
95℃
30 초 변성
68℃
90 초 어닐링/연장 (상승된 온도에서)
1 싸이클
72℃
5 분 최종 신장
1 싸이클
8℃
유지
실시예 3: 아가로오스 겔 전기영동
PCR 생성물을 E-Base 장치 (Life Technologies) 상에서 분석하였다. 2 ㎕ 의 각 PCR 생성물을 18 ㎕ 뉴클레아제-미함유 물과 혼합한 다음 직접 2% E-겔 상에 로딩하였다. 희석된 PCR 생성물 및 50 bp DNA Ladder (Invitrogen Cat# 10488-043) 의 DNA 전기영동을 수행했다. 실험 마지막 때, 겔의 디지털 이미지를 E-gel Imager (Life Technologies) 로 캡쳐하였다. 그 결과를 도 3 에 나타낸다.
도 3 에서, 상단 패널은 1-단계 PCR 프로토콜 (실시예 1) 로부터의 결과를 나타내고, 하단 패널은 2-단계 PCR 프로토콜 (실시예 2) 로부터의 결과를 나타낸다. 레인 1 및 2 는 표적화된 앰플리콘 1 및 2 의 크기를 나타내는 1-플렉스 PCR 이다. 나머지 반응은 모두 2-플렉스 PCR (레인 3-8) 이다. 이들 2 개의 앰플리콘이 함께 멀티플렉스화될 때, F1 및 R2 의 3'-말단의 강한 상호작용으로 인해, F1+R2 다이머 앰플리콘이 형성되고, 두 1 단계와 2-단계 PCR 조건 모두에서 PCR 반응 (레인 3 에 나타냄) 을 지배했다. 레인 4-8 의 PD 에서 형성된 줄기 구조는 각각 F1 서열의 5'말단 부분의 3, 6, 9, 12 및 15 뉴클레오티드에 부가적으로 t1 서열 (20 nt) 를 포함한다. 부분 F1 서열을 도입하는 것은 레인 3 (F1 서열 부재) 과 비교시 레인 4-8 에서 검출된 다이머 양을 감소시켰다. 다이머 증폭이 충분히 저해되었을 때, 표적화된 앰플리콘은 검출가능해졌다 (상단 패널의 레인 6, 및 하단 패널의 레인 5). 다이머 증폭의 거의 완전한 저해가 두 패널의 레인 7-8 에서 달성되었을 때, 표적화된 앰플리콘의 두 생성물이 반응을 지배했다.
본 발명 및 이것을 제조하고 사용하는 방법 및 공정은 완전하고 명확하고 간결하고 정확한 용어로 기술되어, 당해 기술 분야의 숙련자는 그 제조 및 사용이 가능하게 된다. 전술한 내용은 본 발명의 바람직한 구현예를 기술하고, 청구범위에 설명된 바와 같이 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 수정을 그 안에서 가할 수 있음은 이해되어야 한다. 본 발명으로서 간주되는 청구물을 구체적으로 지적하고 뚜렷하게 주장하기 위해, 다음의 청구항으로 명세서를 결론짓는다.
<110> WANG, Zhaohui
SONG, Gang
<120> METHOD FOR REDUCING PRIMER-DIMER AMPLIFICATION
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Claims (7)
- 하기 단계를 포함하는, 멀티플렉스 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서의 프라이머-다이머 증폭의 감소 방법:
(a) 제 1 태그 (t1) 및 제 1 표적 핵산 단편에 상보적인 제 1 정방향 프라이머 (F1) 를 포함하는 제 1 핵산 서열을 수득하는 단계,
(b) 제 2 태그 (t2) 및 제 1 표적 핵산 단편에 상보적인 제 1 역방향 프라이머 (R1) 를 포함하는 제 2 핵산 서열을 수득하는 단계,
(c) 제 3 태그 (t3) 및 제 2 표적 핵산 단편에 상보적인 제 2 정방향 프라이머 (F2) 을 포함하는 제 3 핵산 서열을 수득하는 단계,
(d) 제 1 태그 (t1), 제 2 핵산 단편에 상보적인 제 2 역방향 프라이머 (R2), 및 제 1 태그 (t1) 와 제 2 역방향 프라이머 (R2) 사이 내에 제 1 정방향 프라이머의 5'-말단 부분 서열 또는 전체 서열 (F1^) 을 포함하며, 이때 제 1 정방향 프라이머 (F1) 및 제 2 역방향 프라이머 (R2) 는 그들의 3'-말단에서 상보성 영역을 갖는 제 4 핵산 서열을 수득하는 단계,
(e) 제 1 및 제 2 표적 핵산 단편, 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 핵산 서열, 및 유효량의 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 수행하는데 필수적인 시약을 혼합하는 단계; 및
(f) PCR 을 수행하는 단계. - 제 1 항에 있어서, 단계 (f) 는 하기를 포함하는, 멀티플렉스 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서의 프라이머-다이머 증폭의 감소 방법:
(f1) DNA 폴리머라아제를 활성화하고, (e) 의 혼합물에서의 DNA 를 변성시키는 단계,
(f2) 수회 PCR 의 변성, 어닐링 및 프라이머 신장 단계를 통한 (f1) 의 혼합물의 싸이클링으로 증폭 생성물을 수득하는 단계. - 제 1 항에 있어서, 단계 (f) 는 하기를 포함하는, 멀티플렉스 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서의 프라이머-다이머 증폭의 감소 방법:
(f-i) DNA 폴리머라아제를 활성화하고, (e) 의 혼합물에서의 DNA 를 변성시키는 단계,
(f-ii) 적어도 2 회 PCR 의 변성, 어닐링 및 프라이머 신장 단계를 통해 (f1) 의 혼합물을 싸이클링하는 단계, 및
(f-iii) 단계 (f2) 에서보다 더 높은 어닐링 온도에서 수회 PCR 의 변성, 어닐링 및 프라이머 신장 단계를 통한 (f2) 의 혼합물의 싸이클링으로 증폭 생성물을 수득하는 단계. - 제 3 항에 있어서, 단계 (f3) 에서의 어닐링 온도가 단계 (f2) 에서의 어닐링 온도보다 4-35 ℃ 더 높은, 멀티플렉스 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서의 프라이머-다이머 증폭의 감소 방법.
- 제 1 항에 있어서, 제 1 정방향 프라이머의 부분 또는 전체 서열 (F1^) 이 1-35 뉴클레오티드 길이인, 멀티플렉스 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서의 프라이머-다이머 증폭의 감소 방법.
- 제 1 항에 있어서, 태그 t3 및 t2 가 동일 서열을 갖는, 멀티플렉스 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서의 프라이머-다이머 증폭의 감소 방법.
- 제 1 항에 있어서, 두 태그 t3 과 t2 의 서열이 태그 t1 의 서열과 상이한, 멀티플렉스 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에서의 프라이머-다이머 증폭의 감소 방법.
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