KR20210082556A - 반도체-기반 검출을 사용하는 고-처리율 서열분석용 시스템 및 디바이스 - Google Patents

반도체-기반 검출을 사용하는 고-처리율 서열분석용 시스템 및 디바이스 Download PDF

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알리 아가
트레이시 헬렌 펑
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일루미나, 인코포레이티드
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Abstract

일 실시형태에서, 바이오센서의 샘플 표면이 픽셀 면적을 포함하고, 일련의 샘플링 사건 동안 복수의 클러스터를 보유하여 상기 클러스터는 상기 픽셀 면적 위에 불균일하게 분포된다. 또 다른 실시형태에서, 바이오센서는 픽셀 면적 및 상기 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함하는 샘플 표면을 갖고, 상기 바이오센서는 픽셀 면적당 2개의 웰 및 2개의 클러스터를 포함한다. 픽셀 면적당 상기 2개의 웰은 지배 웰 및 종속 웰을 포함한다. 상기 지배 웰은 상기 종속 웰보다 상기 픽셀 면적에 걸쳐서 더 넓은 단면을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 샘플링 사건에 대해서, 상기 웰(1202, 1212) 각각을 탈축 조명(1200A, 1200B)으로 조명하는 것을 비롯하여, 일련의 샘플링 사건 동안 상기 픽셀 면적(1204', 1214')을 상이한 각의 조명(1201, 1211)으로 조명하여 상기 웰(1202, 1212) 각각에 비대칭적으로 조명되는 웰 영역을 생성시키는 조명 시스템이 바이오센서에 커플링된다.

Description

반도체-기반 검출을 사용하는 고-처리율 서열분석용 시스템 및 디바이스{SYSTEMS AND DEVICES FOR HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING WITH SEMICONDUCTOR-BASED DETECTION}
우선권 출원
본 출원은 하기 출원에 대한 우선권 또는 이의 이익을 주장한다:
미국 가특허 출원 제62/614,934호(대리인 참조 번호 ILLM 1003-2/IP-1656-PRV)(출원일: 2018년 1월 8일, 발명의 명칭: "SYSTEMS AND DEVICES FOR HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING WITH SEMICONDUCTOR-BASED DETECTION")
미국 가특허 출원 제62/614,930호(대리인 참조 번호 ILLM 1003-1/IP-1653-PRV)(출원일: 2018년 1월 8일, 발명의 명칭: "HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING WITH SEMICONDUCTOR-BASED DETECTION"); 및
네덜란드 출원 제2020758호(대리인 참조 번호 ILLM 1003-6/IP-1653-NL)(출원일: 2018년 4월 12일, 발명의 명칭: "HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING WITH SEMICONDUCTOR-BASED DETECTION").
우선권 출원은 모든 목적을 위해서 참고로 본 명세서에 포함된다.
다른 출원에 대한 상호 참조
하기 특허 출원은 모든 목적을 위해서 전문이 본 명세서에 포함된다:
동시 출원된 발명의 명칭이 "HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING WITH SEMICONDUCTOR-BASED DETECTION"인 미국 정규 특허 출원(대리인 참조 번호 ILLM 1003-3/IP-1653-US);
미국 가특허 출원(대리인 참조 번호 IP-1623-PRV)(출원일: 2018년 1월 8일, 발명의 명칭: "MULTIPLEXING OF AN ACTIVE SENSOR DETECTOR USING STRUCTURED ILLUMINATION");
미국 정규 특허 출원 제13/833,619호(대리인 참조 번호 IP-0626-US)(출원일: 2013년 3월 15일, 발명의 명칭: "BIOSENSORS FOR BIOLOGICAL OR CHEMICAL ANALYSIS AND SYSTEMS AND METHODS FOR SAME");
미국 정규 특허 출원 제15/175,489호(대리인 참조 번호 IP-0689-US)(출원일: 2016년 6월 7일, 발명의 명칭: "BIOSENSORS FOR BIOLOGICAL OR CHEMICAL ANALYSIS AND METHODS OF MANUFACTURING THE SAME");
미국 정규 특허 출원 제13/882,088호(대리인 참조 번호 IP-0462-US)(출원일:2013년 4월 26일, 발명의 명칭: "MICRODEVICES AND BIOSENSOR CARTRIDGES FOR BIOLOGICAL OR CHEMICAL ANALYSIS AND SYSTEMS AND METHODS FOR THE SAME"); 및
미국 정규 특허 출원 제13/624,200호(대리인 참조 번호 IP-0538-US)(출원일: 2012년 9월 21일, 발명의 명칭:"METHODS AND COMPOSITIONS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING").
기술분야
개시된 기술의 실시형태는 일반적으로 CMOS(complementary metal-oxide-semiconductor)-기반 검출을 사용한 서열분석 및 보다 특별하게는 CMOS-기반 검출을 사용한 서열분석의 처리율을 증가시키기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
생물학적 또는 화학적 연구의 각종 프로토콜은 국지적 지지 표면 상에서 또는 미리 규정된 반응 챔버(또는 웰) 내에서 광범위한 수의 제어된 반응을 수행하는 것을 포함한다. 이어서, 목적하는 반응을 관찰 또는 검출할 수 있고, 그 다음 분석은 반응에 관여되는 화학물질의 특성을 식별하거나 밝히는 것을 도울 수 있다. 예를 들어, 일부 멀티플렉스 검정에서, 식별 가능한 표지(예를 들어, 형광 표지)를 갖는 미지의 분석물(예를 들어, 클론성으로 증폭된 핵산의 클러스터)이 제어된 조건 하에서 수 천개의 공지된 프로브에 노출될 수 있다. 각각의 공지된 프로브는 마이크로플레이트 또는 플로우 셀의 대응하는 웰 내에 침착될 수 있다. 웰 내에서 공지된 프로브와 미지의 분석물 간에 일어나는 임의의 화학적 반응을 관찰하는 것은 분석물의 특성을 식별하거나 밝히는 것을 도울 수 있다. 이러한 프로토콜의 다른 예는 공지된 DNA 서열분석 과정, 예컨대, 합성에 의한 서열분석(sequencing-by-synthesis: SBS) 또는 사이클릭-어레이 서열분석(cyclic-array sequencing)을 포함한다.
일부 종래의 형광-검출 프로토콜에서, 광학 시스템을 사용하여 여기광(excitation light)을 형광-표지된 분석물에 안내하고, 또한 분석물로부터 방출될 수 있는 형광 신호를 검출한다. 그러나, 이러한 광학 시스템은 비교적 고비용이고, 더 큰 벤치탑 공간을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 광학 시스템은 렌즈의 배열, 필터 및 광원을 포함할 수 있다. 다른 제안된 검출 시스템에서, 형광 방출을 검출하기 위해서 큰 광학 어셈블리가 필요하지 않은 고체-상태 영상화기(예를 들어, 전하-결합 디바이스(charged-coupled device: CCD) 또는 상보성 금속-산화물-반도체(complementary metal-oxide-semiconductor: CMOS) 센서) 바로 위에서 제어된 반응이 일어난다.
그러나, 제안된 고체-상태 영상화 시스템은 일부 제한을 가질 수 있다. 예를 들어, 고체-상태 영상화기는 센서(또는 픽셀)당 하나의 클러스터 염기 콜(base call)로 제한되어, 이의 처리율은 픽셀 피치의 함수인, 센서의 픽셀 밀도에 좌우된다. 픽셀 피치를 상당히 감소시키는 것에 대한 한계가 존재하기 때문에, 고체-상태 영상화기의 처리율을 증가시키기 위해서 다른 해결책을 탐색하는 것이 바람직할 수 있다.
센서(또는 픽셀)당 다수의 클러스터를 염기 콜링((base calling)함으로써 고체-상태 영상화 시스템의 처리율을 증가시키고, 센서(또는 픽셀)당 다수의 클러스터 염기 콜을 가능하게 하는 시스템 및 디바이스를 제공하는 기회가 생긴다.
본 개시내용의 실시형태는 일반적으로 생물학적 또는 화학적 분석법, 보다 특별하게는 생물학적 또는 화학적 분석법을 위해서 검출 디바이스를 사용하는 시스템 및 방법에 관한 것이다.
생물학적 또는 화학적 연구의 각종 프로토콜은 국지적 지지 표면 상에서 또는 미리 규정된 반응 챔버 내에서 광범위한 수의 제어된 반응을 수행하는 것을 포함한다. 이어서, 목적하는 반응은 관찰 또는 검출될 수 있고, 그 다음 분석은 반응에 관여되는 화학물질의 특성을 식별하거나 밝히는 것을 도울 수 있다. 예를 들어, 일부 멀티플렉스 검정에서, 식별 가능한 표지(예를 들어, 형광 표지)를 갖는 미지의 분석물은 제어된 조건 하에서 수 천 개의 공지된 프로브에 노출될 수 있다. 각각의 공지된 프로브는 표면 상의 상응하는 위치 내에 침착될 수 있다. 표면 상에서 공지된 프로브와 미지의 분석물 간에 일어나는 임의의 화학적 반응을 관찰하는 것은 분석물의 특성을 식별하거나 밝히는 것을 도울 수 있다. 이러한 프로토콜의 다른 예는 공지된 DNA 서열분석 과정, 예컨대, 합성에 의한 서열분석(SBS) 또는 사이클릭-어레이 서열분석을 포함한다.
일부 종래의 형광-검출 프로토콜에서, 광학 시스템을 사용하여 여기광을 형광-표지된 분석물에 안내하고, 또한 분석물로부터 방출될 수 있는 형광 신호를 검출한다. 표준 영상화 기술의 처리율은 특히 검출 디바이스에서 사용 가능한 픽셀의 수에 의해서 제한된다. 이와 같이, 이러한 광학 시스템은 비교적 고비용이고, 분석물의 큰 수집물을 갖는 표면을 검출할 때 비교적 넓은 벤치탑 공간을 필요로 한다. 예를 들어, 유전형분석(genotyping), 발현, 또는 서열분석 분석에 사용되는 핵산 어레이는 제곱 센티미터당 어레이 상에 수 백만 개의 상이한 부위의 검출이 필요할 수 있다. 처리율에서의 한계가 이러한 분석의 비용을 증가시키고 정확도를 감소시킨다.
따라서, 예를 들어, 핵산 어레이를 검출하기 위한 더 높은 처리율의 장치 및 방법에 대한 필요성이 존재한다. 본 개시내용은 이러한 필요성을 다루고, 마찬가지로 다른 이점을 제공한다.
일 실시형태에 따라서, 바이오센서를 보유하도록 구성된 용기를 포함하는 염기 콜링을 위한 디바이스가 제공된다. 바이오센서는 (a) 일련의 샘플링 사건 동안 복수의 클러스터를 보유하는 샘플 표면, (b) 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 구성된 센서의 어레이, 및 (c) 복수의 일련의 픽셀 신호를 출력해 내는 통신 포트(communication port)를 갖는다. 어레이는 N개의 능동 센서를 갖고, 어레이 내의 센서는, 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 샘플 표면에 대해서 배치된다. 디바이스는 용기에 커플링된 신호 프로세서를 추가로 포함한다. 신호 프로세서는, 복수의 일련의 픽셀 신호를 수신 및 처리하여, 복수의 일련의 픽셀 신호를 사용하여 N개의 능동 센서로부터의 복수의 클러스터 내의 N + M개의 클러스터(여기서 M은 양의 정수임)에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하는 것을 비롯한, 복수의 클러스터 내의 클러스터에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하도록 구성된다.
일련의 샘플링 사건의 결과는 클러스터 내의 뉴클레오타이드 염기에 대응할 수 있다.
샘플링 사건은 시간 순서의 2개의 조명 단계(illumination stage)를 포함할 수 있고, 복수의 일련의 픽셀 신호에서 일련의 픽셀 신호는 각각의 샘플링 사건에 대한 신호 샘플의 세트를 포함할 수 있고, 그 세트는 2개의 조명 단계 각각으로부터의 적어도 하나의 픽셀 신호를 포함한다.
신호 프로세서는 센서의 어레이 내의 단일 센서로부터의 일련의 픽셀 신호로부터 2개의 클러스터에 대한 결과를 분류하기 위한 로직을 포함할 수 있다. 2개의 클러스터에 대한 결과를 분류하기 위한 로직은 특정 센서로부터의 샘플링 사건에 대한 신호 샘플의 세트의 제1 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈(bin)에 맵핑(mapping)하고, 샘플링 사건으로부터의 신호 샘플의 세트의 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 논리적으로 조합하여 두 클러스터에 대한 결과를 분류하는 단계를 포함할 수 있다.
센서의 어레이 내의 센서는 광 검출기를 포함할 수 있다.
샘플링 사건은 시간 순서의 2개의 조명 단계를 포함할 수 있고, 복수의 일련의 픽셀 신호에서 일련의 픽셀 신호는 각각의 샘플링 사건에 대한 신호 샘플의 세트를 포함할 수 있고, 그 세트는 2개의 조명 단계 각각으로부터의 적어도 하나의 픽셀 신호를 포함한다. 제1 조명 단계는 뉴클레오타이드 염기 A 및 T를 나타내는 주어진 클러스터로부터의 조명을 유도할 수 있고, 제2 조명 단계는 뉴클레오타이드 염기 C 및 T를 나타내는 주어진 클러스터로부터의 조명을 유도할 수 있고, 상기 분류 결과는 뉴클레오타이드 염기 A, C, T 또는 G 중 하나를 콜링하는 것을 포함할 수 있다.
클러스터는 샘플 표면의 픽셀 면적 상에 불균일하게 분포될 수 있고, 신호 프로세서는 복수의 일련의 픽셀 신호의 시간 순서 및 공간 분석을 실행하여 샘플 표면 상의 개별 클러스터에 대응하는 조명의 패턴을 검출하고, 개별 클러스터에 대한 샘플링 사건의 결과를 분류할 수 있다. 복수의 일련의 픽셀 신호는 픽셀 면적 상의 불균일 분포로부터 발생된 적어도 2개의 클러스터 간의 차등 크로스스톡(differential crosstalk)을 암호화한다.
샘플 표면은 픽셀 면적당 2개의 웰을 포함하는 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함할 수 있고, 픽셀 면적당 2개의 웰은 지배 웰(dominant well) 및 종속 웰(subordinate well)을 포함할 수 있고, 지배 웰은 종속 웰보다 픽셀 면적에 걸쳐서 더 넓은 단면을 가질 수 있다.
샘플 표면은 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함할 수 있고, 샘플링 사건은 K개의 조명 단계를 갖는 적어도 하나의 화학적 단계를 포함할 수 있고, 여기서 K는 양의 정수이다. K개의 조명 단계의 조명 단계는 픽셀 면적을 상이한 각의 조명으로 조명할 수 있고, 일련의 픽셀 신호는 각각의 샘플링 사건에 대한 신호 샘플의 세트를 포함할 수 있고, 그 세트는 샘플링 사건의 적어도 하나의 화학적 단계에 대해서 K개의 픽셀 신호를 포함한다.
샘플 표면은 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함할 수 있고, 샘플링 사건은 K개의 조명 단계를 갖는 제1 화학적 단계를 포함할 수 있고, 여기서 K는 양의 정수이다. K개의 조명 단계의 조명 단계는 픽셀 면적을 상이한 각의 조명으로 조명할 수 있고, 제2 화학적 단계는 J의 개의 조명 단계를 갖고, 여기서 J는 양의 정수이다. 제1 화학적 단계의 K개의 조명 단계 및 제2 화학적 단계의 J개의 조명 단계의 조명 단계는 웰의 어레이 내의 웰을 상이한 각의 조명으로 조명할 수 있고, 일련의 픽셀 신호는 각각의 샘플링 사건에 대한 신호 샘플의 세트를 포함할 수 있고, 그 세트는 제1 화학적 단계에 대해서 K개의 픽셀 신호 및 샘플링 사건의 제2 화학적 단계에 대해서 J개의 픽셀 신호를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 염기 콜링용 바이오센서가 제공된다. 바이오센서는 샘플링 디바이스를 포함한다. 샘플링 디바이스는 픽셀 면적의 어레이를 갖는 샘플 표면 및 센서의 어레이를 갖는 고체-상태 영상화기를 포함한다. 각각의 센서는 각각의 염기 콜링 주기에서 픽셀 신호를 생성시킨다. 각각의 픽셀 신호는 샘플 표면의 대응하는 픽셀 면적으로부터 수렴된 광을 나타낸다. 바이오센서는 샘플링 디바이스에 대한 연결을 위해서 구성된 신호 프로세서를 추가로 포함한다. 신호 프로세서는 염기 콜링 주기에서 염기 콜링용 센서로부터 픽셀 신호를 수신 및 처리하며, 염기 콜링 주기에서 염기 콜링된 클러스터의 수보다 더 적은 센서로부터의 픽셀 신호를 사용한다.
픽셀 면적은 샘플 표면 상의 웰로부터 광을 수신하고, 웰은 염기 콜링 주기 동안 하나를 초과하는 클러스터를 보유할 수 있다.
클러스터는 동일한 핵산 서열을 갖는 복수의 단일-가닥의 데옥시리보핵산(약칭 DNA) 단편을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 염기 콜링 방법이 제공된다. 합성에 의한 서열분석(약칭 SBS)의 염기 콜링 주기 실시를 위해서, 방법은, (1) 염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적으로부터 수렴된 광을 나타내는 제1 픽셀 신호 및 (2) 염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적으로부터 수렴된 광을 나타내는 제2 픽셀 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 제1 픽셀 면적은 제1 픽셀 면적을 공유하는 복수의 클러스터 아래에 존재한다. 방법은 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 조합을 사용하여 염기 콜링 주기 동안 복수의 클러스터의 각각의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함한다.
방법은 또한 제1 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하고, 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 조합하여 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 또한 이러한 방법을 적용하여 염기 콜링 주기 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 또한 이러한 방법을 연속적인 염기 콜링 주기에 걸쳐서 반복하여 염기 콜링 주기 각각 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
염기 콜링 주기 각각에 대해서, 방법은 또한 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터에 의해서 방출된 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호를 검출 및 저장하는 단계, 염기 콜링 주기 이후에, 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 조합을 사용하여 이전 염기 콜링 주기 각각 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
제1 픽셀 면적은 샘플 표면 상의 연관된 웰로부터 광을 수신할 수 있다. 제1 픽셀 면적은 샘플 표면 상의 하나를 초과하는 연관된 웰로부터 광을 수신할 수 있다. 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호는 제1 센서에 의해서 제1 픽셀 면적으로부터 수렴될 수 있다. 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호는 제1 센서에 의해서 수렴된 픽셀 신호를 처리하도록 구성된 신호 프로세서에 의해서 검출될 수 있다. 제1 조명 단계는 제1 클러스터 및 제2 클러스터로부터의 조명을 유도하여 표지된 뉴클레오타이드 염기 A 및 T로부터 방출을 생성시킬 수 있고, 제2 조명 단계는 제1 클러스터 및 제2 클러스터로부터의 조명을 유도하여 표지된 뉴클레오타이드 염기 C 및 T로부터 방출을 생성시킬 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 바이오센서의 샘플 표면 상에 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 픽셀 면적을 식별하고, 식별된 픽셀 면적에서 클러스터를 염기 콜링하는 방법이 제공된다. 방법은 복수의 염기 콜링 주기를 수행하는 단계를 포함하고, 각각의 염기 콜링 주기는 제1 조명 단계 및 제2 조명 단계를 갖는다. 방법은 샘플 표면의 픽셀 면적과 연관된 센서에서, (1) 염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 생성된 제1 세트의 강도 값, 및 (2) 염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 생성된 제2 세트의 강도 값을 캡처하는 단계를 포함한다. 방법은 신호 프로세서를 사용하여 16개의 분포를 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값에 피팅시키고, 피팅을 기초로, 픽셀 면적을 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 것으로서 분류하는 단계를 포함한다. 연속적인 염기 콜링 주기에 대해서, 방법은 신호 프로세서를 사용하여 픽셀 면적에서 클러스터 군에 대한 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값을 검출하는 단계 및 클러스터 군에 대한 분포를 선택하는 단계를 포함한다. 분포는 클러스터 군의 각각의 클러스터에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별한다.
방법은 k-평균 군집화 알고리즘(k-means clustering algorithm), k-평균-유사 군집화 알고리즘, 기댓값 최대화 알고리즘(expectation maximization algorithm) 및 히스토그램 기반 알고리즘을 비롯한, 하나 이상의 알고리즘을 사용하는 것을 포함하는 피팅을 포함할 수 있다.
방법은 강도 값을 정규화시키는 단계를 포함할 수 있다.
픽셀 면적은 샘플 표면 상의 연관된 웰로부터 광을 수신할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 염기 콜링을 위한 디바이스가 제공된다. 디바이스는 바이오센서를 보유하도록 구성된 용기를 포함한다. 바이오센서는 샘플 표면을 갖는다. 샘플 표면은 일련의 샘플링 사건 동안 복수의 클러스터가 아래에 놓여 클러스터가 픽셀 면적 위에 불균일하게 분포되는 픽셀 면적을 포함한다. 바이오센서는 또한 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성하도록 구성된 센서의 어레이를 갖는다. 어레이는 N개의 능동 센서를 갖는다. 어레이 내의 센서는, 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 샘플 표면에 대해서 배치된다. 바이오센서는 또한 복수의 일련의 픽셀 신호를 출력해 내는 통신 포트를 갖는다. 디바이스는 용기에 커플링된 신호 프로세서를 추가로 포함한다. 신호 프로세서는 복수의 일련의 픽셀 신호의 시간 순서 및 공간 분석을 실행하여 N개의 능동 센서로부터의 샘플 표면 상의 N + M개의 개별 클러스터(여기서 M은 양의 정수임)에 대응하는 조명의 패턴을 검출하고, N + M개의 개별 클러스터에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하도록 구성된다. 복수의 일련의 픽셀 신호는 픽셀 면적 상의 불균일 분포로부터 발생된 적어도 2개의 클러스터 간의 차등 크로스스톡을 암호화한다.
신호 프로세서는 검출된 조명 패턴을 사용하여 N개의 능동 센서로부터의 샘플 표면 상에 N + M개의 개별 클러스터를 배치할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 염기 콜링을 위한 디바이스가 제공된다. 디바이스는 바이오센서를 포함한다. 바이오센서는 샘플 표면을 갖는다. 샘플 표면은 픽셀 면적 및 픽셀 면적당 2개의 웰을 포함하는, 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함한다. 픽셀 면적당 2개의 웰은 지배 웰 및 종속 웰을 포함한다. 지배 웰은 종속 웰의 픽셀 면적보다 더 넓은 단면을 가질 수 있다.
2개의 웰은 픽셀 면적의 중심에 대해서 상이한 오프셋을 가질 수 있다. 샘플링 사건 동안, 픽셀 면적은 2개의 웰로부터 상이한 양의 조명을 수신할 수 있다. 2개의 웰 각각은 샘플링 사건 동안 적어도 하나의 클러스터를 보유할 수 있다. 샘플링 사건 동안, 픽셀 면적은 종속 웰 내의 어두운 클러스터(dim cluster)로부터 수신된 조명의 양보다 더 많은 지배 웰 내의 밝은 클러스터(bright cluster)로부터의 조명의 양을 수신할 수 있다.
바이오센서는 신호 프로세서에 커플링될 수 있다. 신호 프로세서는 복수의 일련의 픽셀 신호를 수신 및 처리하여 N개의 능동 센서로부터의 N + M개의 클러스터에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별하도록 구성될 수 있다. 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터에 대해서, 이것은 샘플링 사건의 제1 조명 단계 동안 픽셀 면적에 대응하는 센서에 의해서 생성된 제1 픽셀 신호를 적어도 4개 빈에 맵핑하는 단계, 샘플링 사건의 제2 조명 단계 동안 센서에 의해서 생성된 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 논리적으로 조합하여 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
바이오센서는 또한 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성하도록 구성된 센서의 어레이를 갖는다. 어레이는 N개의 능동 센서를 갖는다. 어레이 내의 센서는, 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 샘플 표면에 대해서 배치된다. 바이오센서는 또한 복수의 일련의 픽셀 신호를 출력해 내는 통신 포트를 갖는다.
추가의 또 다른 실시형태에서, 염기 콜링을 위한 디바이스가 제공된다. 디바이스는 바이오센서를 포함한다. 바이오센서는 샘플 표면을 갖는다. 샘플 표면은 픽셀 면적 및 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함한다. 디바이스는 조명 시스템을 추가로 포함한다. 조명 시스템은, 일련의 샘플링 사건에서의 샘플링 사건에 대해서, 웰 각각을 탈축(off-axis) 조명으로 조명하는 것을 비롯하여, 일련의 샘플링 사건 동안 픽셀 면적을 상이한 각의 조명으로 조명하여 웰 각각에 비대칭적으로 조명되는 웰 영역을 생성시킨다.
비대칭적으로 조명되는 웰의 영역은 적어도 지배 웰 영역 및 종속 웰 영역을 포함할 수 있어서, 샘플링 사건 동안 지배 웰 영역은 종속 웰 영역보다 더 많이 조명된다. 웰은 샘플링 사건 동안 하나를 초과하는 클러스터를 보유할 수 있고, 지배 웰 영역 및 종속 웰 영역 각각은 클러스터를 포함한다. 샘플링 사건 동안, 픽셀 면적 위에 놓인 웰은 종속 웰 영역 내의 어두운 클러스터로부터 수신된 조명의 양보다 더 많은 지배 웰 영역 내의 밝은 클러스터로부터의 조명의 양을 수신할 수 있다.
탈축 조명은 45도 각일 수 있다. 일부 실시형태에서, 픽셀 면적당 하나의 웰이 위에 놓인다. 다른 실시형태, 픽셀 면적당 2개의 웰이 위에 놓인다.
바이오센서는 신호 프로세서에 커플링될 수 있다. 신호 프로세서는 복수의 일련의 픽셀 신호를 수신 및 처리하여 N개의 능동 센서로부터의 N + M개의 클러스터에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별하도록 구성될 수 있다. 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터에 대해서, 이것은 샘플링 사건의 제1 조명 단계 동안 픽셀 면적에 대응하는 센서에 의해서 생성된 제1 픽셀 신호를 적어도 4개 빈에 맵핑하는 단계, 샘플링 사건의 제2 조명 단계 동안 센서에 의해서 생성된 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 논리적으로 조합하여 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
바이오센서는 또한 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성하도록 구성된 센서의 어레이를 갖는다. 어레이는 N개의 능동 센서를 갖는다. 어레이 내의 센서는, 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 샘플 표면에 대해서 배치된다. 바이오센서는 또한 복수의 일련의 픽셀 신호를 출력해 내는 통신 포트를 갖는다.
또 다른 실시형태에 따라서, 바이오센서를 보유하도록 구성된 용기를 포함하는 염기 콜링을 위한 디바이스가 제공된다. 바이오센서는 (a) 일련의 샘플링 사건 동안 복수의 클러스터를 보유하는 샘플 표면, (b) 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 구성된 센서의 어레이, 및 (c) 복수의 일련의 픽셀 신호를 출력해 내는 통신 포트를 갖는다. 어레이 내의 각각의 센서는 샘플 표면의 대응하는 픽셀 면적 내에 배치된 하나 이상의 클러스터로부터의 정보를 감지하여 샘플링 사건에서 픽셀 신호를 생성시킨다. 어레이는 N개의 능동 센서를 갖고, 어레이 내의 센서는, 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 샘플 표면에 대해서 배치된다. 디바이스는 용기에 커플링된 신호 프로세서를 추가로 포함한다. 신호 프로세서는 복수의 일련의 픽셀 신호를 수신 및 처리하여 복수의 클러스터 내의 클러스터에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하도록 구성된다. 각각의 샘플링 사건에 대해서 복수의 일련의 픽셀 신호 내의 적어도 하나의 일련의 픽셀 신호에서의 픽셀 신호는 대응하는 픽셀 면적 내의 적어도 2개의 클러스터로부터의 감지된 정보를 나타낸다. 신호 프로세서는 복수의 일련의 픽셀 신호를 사용하여 N개의 능동 센서로부터의 복수의 클러스터 내의 N + M개의 클러스터(여기서 M은 양의 정수임)에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류한다.
일련의 샘플링 사건의 결과는 클러스터 내의 뉴클레오타이드 염기에 대응할 수 있다.
샘플링 사건은 시간 순서의 적어도 2개의 조명 단계를 포함할 수 있고, 복수의 일련의 픽셀 신호에서 상기 적어도 하나의 일련의 픽셀 신호는 2개의 조명 단계 각각으로부터의 대응하는 픽셀 면적 내의 적어도 2개의 클러스터로부터의 정보를 포함하는 하나의 픽셀 신호를 포함할 수 있다.
신호 프로세서는 상기 적어도 하나의 일련의 픽셀 신호로부터의 일련의 픽셀 신호로부터 2개의 클러스터에 대한 결과를 분류하기 위한 로직을 포함할 수 있다. 2개의 클러스터에 대한 결과를 분류하기 위한 로직은 특정 센서로부터의 상기 적어도 하나의 일련의 픽셀 신호 내의 제1 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하고, 상기 적어도 하나의 일련의 픽셀 신호 내의 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 논리적으로 조합하여 두 클러스터에 대한 결과를 분류하는 단계를 포함할 수 있다.
센서의 어레이 내의 센서는 광 검출기를 포함할 수 있다.
샘플링 사건은 시간 순서의 2개의 조명 단계를 포함할 수 있고, 복수의 일련의 픽셀 신호에서 일련의 픽셀 신호는 2개의 조명 단계 각각으로부터의 적어도 하나의 픽셀 신호를 포함한다. 제1 조명 단계는 뉴클레오타이드 염기 A 및 T를 나타내는 센서의 픽셀 면적 내의 하나 이상의 클러스터로부터의 조명을 유도할 수 있고, 제2 조명 단계는 뉴클레오타이드 염기 C 및 T를 나타내는 센서의 픽셀 면적 내의 하나 이상의 클러스터로부터의 조명을 유도하고, 상기 분류 결과는 상기 적어도 하나의 순서를 사용하여 적어도 2개의 클러스터에 대해서 뉴클레오타이드 염기 A, C, T 또는 G 중 하나를 콜링하는 것을 포함한다.
클러스터는 샘플 표면의 픽셀 면적 상에 불균일하게 분포될 수 있고, 신호 프로세서는 복수의 일련의 픽셀 신호의 시간 순서 및 공간 분석을 실행하여 샘플 표면 상의 개별 클러스터에 대응하는 조명의 패턴을 검출하고, 개별 클러스터에 대한 샘플링 사건의 결과를 분류할 수 있다. 복수의 일련의 픽셀 신호는 픽셀 면적 상의 불균일 분포로부터 발생된 적어도 2개의 클러스터 간의 차등 크로스스톡을 암호화한다.
샘플 표면은 픽셀 면적당 2개의 웰을 포함하는 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함할 수 있고, 픽셀 면적당 2개의 웰은 지배 웰 및 종속 웰을 포함할 수 있고, 지배 웰은 종속 웰의 픽셀 면적보다 더 넓은 단면을 가질 수 있다.
샘플 표면은 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함할 수 있고, 샘플링 사건은 K개의 조명 단계를 갖는 적어도 하나의 화학적 단계를 포함할 수 있고, 여기서 K는 양의 정수이다. K개의 조명 단계의 조명 단계는 픽셀 면적을 상이한 각의 조명으로 조명할 수 있고, 일련의 픽셀 신호는 샘플링 사건의 적어도 하나의 화학적 단계에 대해서 K개의 픽셀 신호를 포함할 수 있다.
샘플 표면은 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함할 수 있고, 샘플링 사건은 K개의 조명 단계를 갖는 제1 화학적 단계를 포함할 수 있고, 여기서 K는 양의 정수이다. K개의 조명 단계의 조명 단계는 픽셀 면적을 상이한 각의 조명으로 조명할 수 있고, 제2 화학적 단계는 J의 개의 조명 단계를 갖고, 여기서 J는 양의 정수이다. 제1 화학적 단계의 K개의 조명 단계 및 제2 화학적 단계의 J개의 조명 단계의 조명 단계는 웰의 어레이 내의 웰을 상이한 각의 조명으로 조명할 수 있고, 일련의 픽셀 신호는 제1 화학적 단계에 대해서 K개의 픽셀 신호 및 샘플링 사건의 제2 화학적 단계에 대해서 J개의 픽셀 신호를 포함할 수 있다.
추가의 또 다른 실시형태에서, 염기 콜링용 바이오센서가 제공된다. 바이오센서는 샘플링 디바이스를 포함한다. 샘플링 디바이스는 픽셀 면적의 어레이를 갖는 샘플 표면 및 센서의 어레이를 갖는 고체-상태 영상화기를 포함한다. 각각의 센서는 각각의 염기 콜링 주기에서 픽셀 신호를 생성시킨다. 각각의 픽셀 신호는 샘플 표면의 대응하는 픽셀 면적 내의 하나 이상의 클러스터로부터 하나의 염기 콜링 주기에서 수렴된 광을 나타낸다. 바이오센서는 샘플링 디바이스에 대한 연결을 위해서 구성된 신호 프로세서를 추가로 포함한다. 신호 프로세서는 염기 콜링 주기에서 염기 콜링용 센서로부터 픽셀 신호를 수신 및 처리하며, 염기 콜링 주기에서 염기 콜링된 클러스터의 수보다 더 적은 센서로부터의 픽셀 신호를 사용한다. 더 적은 센서로부터의 픽셀 신호는 대응하는 픽셀 면적 내의 적어도 2개의 클러스터로부터 수렴된 광을 나타내는 적어도 하나의 픽셀 신호를 포함한다.
픽셀 면적은 샘플 표면 상의 웰로부터 광을 수신하고, 웰은 염기 콜링 주기 동안 하나를 초과하는 클러스터를 보유할 수 있다.
클러스터는 동일한 염기 서열을 갖는 복수의 단일-가닥 단편을 포함할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 염기 콜링 방법이 제공된다. 합성에 의한 서열분석(약칭 SBS)의 염기 콜링 주기 실시를 위해서, 방법은, (1) 염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적 내의 적어도 2개의 클러스터로부터 수렴된 광을 나타내는 제1 픽셀 신호 및 (2) 염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적 내의 상기 적어도 2개의 클러스터로부터 수렴된 광을 나타내는 제2 픽셀 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 제1 픽셀 면적은 제1 픽셀 면적을 공유하는 복수의 클러스터 아래에 존재한다. 방법은 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 조합을 사용하여 염기 콜링 주기 동안 적어도 2개의 클러스터의 각각의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함한다.
방법은 또한 제1 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하고, 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 조합하여 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 또한 이러한 방법을 적용하여 염기 콜링 주기 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 또한 이러한 방법을 연속적인 염기 콜링 주기에 걸쳐서 반복하여 염기 콜링 주기 각각 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
염기 콜링 주기 각각에 대해서, 방법은 또한 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터에 의해서 방출된 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호를 검출 및 저장하는 단계, 염기 콜링 주기 이후에, 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 조합을 사용하여 이전 염기 콜링 주기 각각 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
제1 픽셀 면적은 샘플 표면 상의 연관된 웰로부터 광을 수신할 수 있다. 제1 픽셀 면적은 샘플 표면 상의 하나를 초과하는 연관된 웰로부터 광을 수신할 수 있다. 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호는 제1 센서에 의해서 제1 픽셀 면적으로부터 수렴될 수 있다. 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호는 제1 센서에 의해서 수렴된 픽셀 신호를 처리하도록 구성된 신호 프로세서에 의해서 검출될 수 있다. 제1 조명 단계는 제1 클러스터 및 제2 클러스터로부터의 조명을 유도하여 표지된 뉴클레오타이드 염기 A 및 T로부터 방출을 생성시킬 수 있고, 제2 조명 단계는 제1 클러스터 및 제2 클러스터로부터의 조명을 유도하여 표지된 뉴클레오타이드 염기 C 및 T로부터 방출을 생성시킬 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 바이오센서의 샘플 표면 상에 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 픽셀 면적을 식별하고, 식별된 픽셀 면적에서 클러스터를 염기 콜링하는 방법이 제공된다. 방법은 복수의 염기 콜링 주기를 수행하는 단계를 포함하고, 각각의 염기 콜링 주기는 제1 조명 단계 및 제2 조명 단계를 갖는다. 방법은 샘플 표면의 픽셀 면적과 연관된 센서에서, (1) 염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 생성된 제1 세트의 강도 값, 및 (2) 염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 생성된 제2 세트의 강도 값을 캡처하는 단계를 포함한다. 방법은 신호 프로세서를 사용하여 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값을 분포 세트에 피팅시키고, 피팅을 기초로, 픽셀 면적을 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 것으로서 분류하는 단계를 포함한다. 연속적인 염기 콜링 주기에 대해서, 방법은 신호 프로세서를 사용하여 픽셀 면적에서 클러스터 군에 대한 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값을 검출하는 단계 및 클러스터 군에 대한 분포를 선택하는 단계를 포함한다. 분포는 클러스터 군의 각각의 클러스터에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별한다.
방법은 k-평균 군집화 알고리즘, k-평균-유사 군집화 알고리즘, 기댓값 최대화 알고리즘 및 히스토그램 기반 알고리즘을 비롯한, 하나 이상의 알고리즘을 사용하는 것을 포함하는 피팅을 포함할 수 있다.
방법은 강도 값을 정규화시키는 단계를 포함할 수 있다.
픽셀 면적은 샘플 표면 상의 연관된 웰로부터 광을 수신할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 염기 콜링을 위한 디바이스가 제공된다. 디바이스는 바이오센서를 보유하도록 구성된 용기를 포함한다. 바이오센서는 샘플 표면을 갖는다. 샘플 표면은 일련의 샘플링 사건 동안 복수의 클러스터가 아래에 놓여 클러스터가 픽셀 면적 위에 불균일하게 분포되는 픽셀 면적을 포함한다. 바이오센서는 또한 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성하도록 구성된 센서의 어레이를 갖는다. 어레이 내의 각각의 센서는 샘플 표면의 대응하는 픽셀 면적 내에 배치된 하나 이상의 클러스터로부터의 정보를 감지하여 샘플링 사건에서 픽셀 신호를 생성시킨다. 어레이는 N개의 능동 센서를 갖는다. 어레이 내의 센서는, 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 샘플 표면에 대해서 배치된다. 바이오센서는 또한 복수의 일련의 픽셀 신호를 출력해 내는 통신 포트를 갖는다. 디바이스는 용기에 커플링된 신호 프로세서를 추가로 포함한다. 신호 프로세서는 복수의 일련의 픽셀 신호의 시간 순서 및 공간 분석을 실행하여 N개의 능동 센서로부터의 샘플 표면 상의 N + M개의 개별 클러스터(여기서 M은 양의 정수임)에 대응하는 조명의 패턴을 검출하고, N + M개의 개별 클러스터에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하도록 구성된다. 각각의 샘플링 사건에 대해서 복수의 일련의 픽셀 신호 내의 적어도 하나의 일련의 픽셀 신호에서의 픽셀 신호는 대응하는 픽셀 면적 내의 적어도 2개의 클러스터로부터의 감지된 정보를 나타내고, 복수의 일련의 픽셀 신호는 픽셀 면적 상의 불균일 분포로부터 발생된 적어도 2개의 클러스터 간의 차등 크로스스톡을 암호화한다.
신호 프로세서는 검출된 조명 패턴을 사용하여 N개의 능동 센서로부터의 샘플 표면 상에 N + M개의 개별 클러스터를 배치할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 염기 콜링을 위한 디바이스가 제공된다. 디바이스는 바이오센서를 포함한다. 바이오센서는 샘플 표면을 갖는다. 샘플 표면은 픽셀 면적 및 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함하고, 바이오센서는 픽셀 면적당 2개의 웰 및 2개의 클러스터를 포함한다. 픽셀 면적당 2개의 웰은 지배 웰 및 종속 웰을 포함한다. 지배 웰은 종속 웰의 픽셀 면적보다 더 넓은 단면을 가질 수 있다.
바이오센서는 또한 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성하도록 구성된 센서의 어레이를 갖는다. 어레이 내의 각각의 센서는 샘플 표면의 대응하는 픽셀 면적 내에 배치된 2개의 클러스터로부터의 정보를 감지하여 샘플링 사건에서 픽셀 신호를 생성시킨다. 어레이는 N개의 능동 센서를 갖는다. 어레이 내의 센서는, 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 샘플 표면에 대해서 배치된다. 바이오센서는 또한 복수의 일련의 픽셀 신호를 출력해 내는 통신 포트를 갖는다.
2개의 웰은 픽셀 면적의 중심에 대해서 상이한 오프셋을 가질 수 있다. 샘플링 사건 동안, 픽셀 면적은 2개의 웰로부터 상이한 양의 조명을 수신할 수 있다. 각각의 샘플링 사건에 대해서 복수의 일련의 픽셀 신호 내의 적어도 하나의 일련의 픽셀 신호에서의 픽셀 신호는 대응하는 픽셀 면적 내의 2개의 클러스터로부터의 감지된 정보를 나타내고, 2개의 웰 각각은 샘플링 사건 동안 적어도 하나의 클러스터를 보유할 수 있다. 샘플링 사건 동안, 픽셀 면적은 종속 웰 내의 어두운 클러스터로부터 수신된 조명의 양보다 더 많은 지배 웰 내의 밝은 클러스터로부터의 조명의 양을 수신할 수 있다.
바이오센서는 신호 프로세서에 커플링될 수 있다. 신호 프로세서는 복수의 일련의 픽셀 신호를 수신 및 처리하여 N개의 능동 센서로부터의 N + M개의 클러스터에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별하도록 구성될 수 있다. 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터에 대해서, 이것은 샘플링 사건의 제1 조명 단계 동안 픽셀 면적에 대응하는 센서에 의해서 생성된 제1 픽셀 신호를 적어도 4개 빈에 맵핑하는 단계, 샘플링 사건의 제2 조명 단계 동안 센서에 의해서 생성된 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 논리적으로 조합하여 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
추가의 또 다른 실시형태에서, 염기 콜링을 위한 디바이스가 제공된다. 디바이스는 바이오센서를 포함한다. 바이오센서는 샘플 표면을 갖는다. 샘플 표면은 픽셀 면적 및 픽셀 면적당 적어도 2개의 클러스터를 갖는, 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함한다. 디바이스는 조명 시스템을 추가로 포함한다. 조명 시스템은, 일련의 샘플링 사건에서의 샘플링 사건에 대해서, 웰 각각을 탈축 조명으로 조명하는 것을 비롯하여, 일련의 샘플링 사건 동안 픽셀 면적을 상이한 각의 조명으로 조명하여 웰 각각에 비대칭적으로 조명되는 웰 영역을 생성시킨다.
비대칭적으로 조명되는 웰의 영역은 적어도 지배 웰 영역 및 종속 웰 영역을 포함할 수 있어서, 샘플링 사건 동안 지배 웰 영역은 종속 웰 영역보다 더 많이 조명된다. 웰은 샘플링 사건 동안 하나를 초과하는 클러스터를 보유할 수 있고, 지배 웰 영역 및 종속 웰 영역 각각은 클러스터를 포함한다. 샘플링 사건 동안, 픽셀 면적 위에 놓인 웰은 종속 웰 영역 내의 어두운 클러스터로부터 수신된 조명의 양보다 더 많은 지배 웰 영역 내의 밝은 클러스터로부터의 조명의 양을 수신할 수 있다.
탈축 조명은 45도 각일 수 있다. 일부 실시형태에서, 픽셀 면적당 하나의 웰이 위에 놓인다. 다른 실시형태, 픽셀 면적당 2개의 웰이 위에 놓인다.
바이오센서는 또한 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성하도록 구성된 센서의 어레이를 갖는다. 어레이 내의 각각의 센서는 샘플 표면의 대응하는 픽셀 면적 내에 배치된 적어도 2개의 클러스터로부터의 정보를 감지하여 샘플링 사건에서 픽셀 신호를 생성시킨다. 어레이는 N개의 능동 센서를 갖는다. 어레이 내의 센서는, 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 샘플 표면에 대해서 배치된다. 바이오센서는 또한 복수의 일련의 픽셀 신호를 출력해 내는 통신 포트를 갖는다.
바이오센서는 신호 프로세서에 커플링될 수 있다. 신호 프로세서는 복수의 일련의 픽셀 신호를 수신 및 처리하여 N개의 능동 센서로부터의 N + M개의 클러스터에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별하도록 구성될 수 있다. 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터에 대해서, 이것은 샘플링 사건의 제1 조명 단계 동안 픽셀 면적에 대응하는 센서에 의해서 생성된 제1 픽셀 신호를 적어도 4개 빈에 맵핑하는 단계, 샘플링 사건의 제2 조명 단계 동안 센서에 의해서 생성된 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 논리적으로 조합하여 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
개시된 기술의 다른 특징 및 양상은 개시된 기술의 실시형태에 따른 특징인 예의 방식에 의해서 도시된 첨부된 도면과 함께, 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 간단한 설명은 본 명세서에 기재된 임의의 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.
본 개시내용은, 하나 이상의 실시형태에 따라서, 하기 도면을 참고로 상세하기 기재된다. 도면은 단지 설명의 목적을 위해서 제공되며, 단지 예시적인 실시형태를 도시한다. 추가로, 설명의 명확성 및 용이성을 위해서, 도면에서의 요소는 반드시 축척대로 도시된 것은 아니라는 것을 주목해야 한다.
본 명세서에 포함된 도면 중 일부는 상이한 시야각으로부터 개시된 기술의 다양한 실시형태를 도시한다. 첨부된 설명 내용이 "상단", "하단" 또는 "측면" 관점과 같은 관점을 지칭할 수 있지만, 이러한 언급은 단지 설명이며, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 개시된 기술이 특정 공간적인 배향으로 구현되거나 사용되는 것을 암시하거나 요구하는 것은 아니다.
도 1은 일 실시형태에 따른 염기 콜링 시스템의 블록 다이어그램.
도 2는 도 1의 시스템에서 사용될 수 있는 시스템 제어기의 블록 다이어그램.
도 3은 각종 실시형태에서 사용될 수 있는 바이오센서의 단면도. 도 3의 바이오센서는 염기 콜링 주기 동안 하나를 초과하는 클러스터를 각각 보유할 수 있는 픽셀 면적을 갖는다(예를 들어, 픽셀 면적당 2개의 클러스터).
도 4는 각종 실시형태에서 사용될 수 있는 바이오센서의 단면도. 도 4의 바이오센서는 염기 콜링 주기 동안 하나를 초과하는 클러스터를 각각 보유할 수 있는 웰을 갖는다(예를 들어, 웰당 2개의 클러스터).
도 5A 및 도 5B는 일 실시형태에 따라서 공유된 센서(또는 픽셀)에 의해서 검출된 각각의 픽셀 신호를 사용한 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터의 클러스터 쌍의 염기 콜링을 도시한 산포도.
도 6은 일 실시형태에 따라서 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터의 클러스터 쌍으로부터의 강도 값에 의해서 생성된 16개의 분포를 도시한 산포도.
도 7A는 일 실시형태에 따른 하나의 염료 및 2개의 조명 단계 서열분석 프로토콜에 대한 염기 콜링 도식을 도시한 검출표.
도 7B는 일 실시형태에 따라서 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터의 클러스터 쌍으로부터의 조합된 픽셀 신호를 16개의 빈 중 하나로 분류하기 위한 분류 도식을 나타낸 염기 콜링 표.
도 8은 일 실시형태에 따라서 픽셀 면적을 공유한 복수의 클러스터에 의해서 방출된 픽셀 신호의 분석에 의한 염기 콜링의 방법을 도시한 도면.
도 9는 일 실시형태에 따라서 바이오센서의 샘플 표면 상에 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 픽셀 면적을 식별하고, 식별된 픽셀 면적에서 클러스터를 염기 콜링하는 방법이 제공된다.
도 10은 일 실시형태에 따라서 복수의 클러스터가 불균일하게 분포된 픽셀 면적을 갖는 샘플 표면의 평면도.
도 11A는 일 실시형태에 따라서 지배 웰 및 종속 웰을 포함하는, 픽셀 면적당 2개의 웰을 갖는 샘플 표면의 측면도.
도 11B는 도 11A의 샘플 표면의 평면도.
도 12A 및 도 12B는 샘플 표면의 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 탈축 조명을 나타낸 도면.
도 12C는 일 실시형태에 따라서 도 12A 및 도 12B의 탈축 조명에 의해서 생성된 비대칭적으로 조명되는 웰 영역을 도시한 도면.
본 명세서에 기재된 실시형태는 연구 또는 상업적인 분석을 위한 각종 생물학적 또는 화학적 방법 및 시스템에서 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 명세서에 기재된 실시형태는 목적하는 반응을 나타내는 사건, 특정, 품질 또는 특징을 검출하는 것이 바람직한 다양한 방법 및 시스템에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 실시형태는 카트리지, 바이오센서 및 이의 성분뿐만 아니라 카트리지 및 바이오센서와 함께 작동되는 생물검정 시스템을 포함한다. 특정 실시형태에서, 카트리지 및 바이오센서는 실질적으로 단일 구조로 함께 커플링된 플로우 셀 및 하나 이상의 센서, 픽셀, 광 검출기, 또는 광다이오드를 포함한다.
생물검정 시스템은 개별적으로 또는 집합적으로 검출될 수 있는 복수의 목적하는 반응을 수행하도록 구성될 수 있다. 바이오센서 및 생물검정 시스템은 복수의 목적하는 반응이 동시에 일어나는 다수의 주기를 수행하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 생물검정 시스템을 사용하여 효소 조작 및 데이터 획득의 반복적인 주기를 통해서 DNA 특징부의 조밀한 어레이를 서열분석할 수 있다. 이와 같이, 카트리지 및 바이오센서는 시약 또는 다른 반응 성분을 반응 부위에 전달하는 하나 이상의 미세유체 채널을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 반응 부위는 실질적으로 평탄한 표면에 걸쳐서 불균일하게 분포된다. 다른 실시형태, 반응 부위는 미리 결정된 방식으로 실질적으로 평탄한 표면에 걸쳐서 패턴화된다. 반응 부위 각각은 연관된 반응 부위로부터 광을 검출하는 하나 이상의 센서, 픽셀, 광 검출기 또는 광다이오드와 연관될 수 있다. 그러나 다른 실시형태에서, 반응 부위는 내부에서 목적하는 반응을 구분하는 반응 챔버(또는 웰) 내에 위치된다.
특정 실시형태의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 경우 보다 양호하게 이해될 것이다. 도면이 다양한 실시형태의 기능성 블록의 다이어그램을 설명하는 한, 기능성 블록은 하드웨어 회로 사이에 분할을 반드시 나타내는 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 기능성 블록 중 하나 이상(예를 들어, 프로세서 또는 메모리)은 하드웨어의 단일 조각(예를 들어, 다목적 신호 프로세서 또는 랜덤 액세스 메모리, 하드 디스크 등)에서 구현될 수 있다. 유사하게, 프로그램은 자립형(standalone) 프로그램일 수 있고, 작동 시스템에 서브루틴으로 혼입될 수 있고, 설치된 소프트웨어 패키지에서 기능할 수 있고 그 등등이다. 각종 실시형태는 도면에 도시된 배열 및 수단으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수로 언급되거나 및 단수 표현으로 수식된 부재 또는 단계는 이러한 배제가 명확하게 언급되지 않는 한, 상기 부재 또는 단계의 복수형을 배제하지 않는 것을 이해해야 한다. 추가로, "일 실시형태"에 대한 언급은 언급된 특징부를 또한 포함한 추가 실시형태의 존재를 배제하는 것으로 해석될 의도가 아니다. 또한, 명백하게 반대로 언급되지 않는 한, 특정 특성을 갖는 부재 또는 복수의 부재를 "포함하는" 또는 "갖는" 또는 "포함하고 있는" 실시형태는 그것이 그 특성을 갖는지에 관계없이 추가의 부재를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "목적하는 반응"은 관심대상 분석물의 화학적, 전기적, 물리적 또는 광학 특성(또는 품질) 중 적어도 하나의 변화를 포함한다. 특정 실시형태에서, 목적하는 반응은 양성 결합 사건(예를 들어, 관심대상 분석물을 갖는 형광 표지된 생물분자의 혼입)이다. 보다 일반적으로, 목적하는 반응은 화학적 변형, 화학적 변화, 또는 화학적 상호작용일 수 있다. 목적하는 반응은 또한 전기적 특성의 변화일 수 있다. 예를 들어, 목적하는 반응은 용액 내의 이온 농도의 변화일 수 있다. 예시적인 반응은 화학적 반응, 예컨대, 환원, 산화, 첨가, 제거, 재배열, 에스터화, 아마이드화, 에터화, 고리화 또는 치환; 제1 화학물질이 제2 화학물질과 결합하는 결합 상호작용; 둘 이상의 화학물질이 서로로부터 탈착되는 해리 반응; 형광; 발광; 생물발광; 화학발광; 및 생물학적 반응, 예컨대, 핵산 복제, 핵산 증폭, 핵산 혼성화, 핵산 결찰, 포스포릴화, 효소적 촉매작용, 수용체 결합, 또는 리간드 결합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 목적하는 반응은 또한 예를 들어, 주변 용액 또는 환경의 pH 변화로서 검출 가능한 양성자의 첨가 또는 제거일 수 있다. 추가의 목적하는 반응은 막(예를 들어, 자연 또는 합성 이중층 막)을 통한 이온의 유동을 검출하는 것일 수 있고, 예를 들어, 이온이 막을 통해서 유동할 때 전류가 차단되고, 그 차단이 검출될 수 있다.
특정 실시형태에서, 목적하는 반응은 분석물에 대한 형광 표지된 분자의 혼입을 포함한다. 분석물은 올리고뉴클레오타이드일 수 있고, 형광 표지된 분자는 뉴클레오타이드일 수 있다. 목적하는 반응은, 여기광이 표지된 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드에 대해서 안내되고, 형광단이 검출 가능한 형광 신호를 방출할 때 검출될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 검출된 형광은 화학발광 또는 생물발광의 결과이다. 목적하는 반응은 또한 예를 들어, 받개 형광단 부근에서 주개 형광단을 제공함으로써 형광(또는 푀스터(Foerster)) 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer: FRET)을 증가시킬 수 있거나, 주개 형광단 및 받개 형광단을 분리시킴으로써 FRET를 감소시킬 수 있거나, 형광단으로부터 켄처를 분리시킴으로써 형광을 증가시킬 수 있거나 또는 켄처 및 형광단을 함께 위치시킴으로써 형광을 감소시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "반응 성분" 또는 "반응물"은 목적하는 반응을 획득하는 데 사용될 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 예를 들어, 반응 성분은 시약, 효소, 샘플, 다른 생물분자 및 완충제 용액을 포함한다. 반응 성분은 전형적으로 용액으로 반응 부위에 전달되고/전달되거나 반응 부위에 고정된다. 반응 성분은 또 다른 물질, 예컨대, 관심대상 분석물과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "반응 부위"는 목적하는 반응이 일어날 수 있는 국지 영역이다. 반응 부위는 물질이 상부에 고정될 수 있는 기질의 지지 표면을 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응 부위는 상부에 핵산의 집락을 갖는 플로우 셀의 채널 내의 실질적으로 평탄한 표면을 포함할 수 있다. 전형적으로, 그러나 항상 그러한 것은 아니지만, 집락 내의 핵산은 예를 들어, 단일 가닥 또는 이중 가닥 주형의 클론성 카피인 동일한 서열을 갖는다. 그러나, 일부 실시형태에서 반응 부위는 예를 들어, 단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 형태의 단일 핵산 분자 만을 함유할 수 있다. 추가로, 복수의 반응 부위는 지지 표면을 따라서 불균일하게 분포되거나 또는 미리 결정된 방식으로(예를 들어, 매트릭스 내에서 나란히, 예컨대, 마이크로어레이로) 배열될 수 있다. 반응 부위는 또한 목적하는 반응을 구분하도록 구성된 공간 영역 또는 부피를 적어도 부분적으로 획정하는 반응 챔버(또는 웰)를 포함할 수 있다.
본 출원은 용어 "반응 챔버" 및 "웰"을 상호 교환 가능하게 사용한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "반응 챔버" 또는 "웰"은 플로우 채널과 유체 소통하는 공간 영역을 포함한다. 반응 챔버는 주변 환경 또는 다른 공간 영역으로부터 적어도 부분적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 복수의 반응 챔버는 공유된 벽에 의해서 서로로부터 분리될 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 반응 챔버는 웰의 내부 표면에 의해서 획정된 공동(cavity)을 포함할 수 있고, 개구부 또는 에퍼처(aperture)를 가져서 공동은 플로우 채널과 유체 소통할 수 있다. 이러한 반응 챔버를 포함하는 바이오센서는 전문이 참고로 본 명세서에 포함된 2011년 10월 20일자로 출원된 국제 출원 제PCT/US2011/057111호에 보다 상세하게 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 반응 챔버는 고체가 내부에 완전히 또는 부분적으로 삽입될 수 있도록 고체(반고체 포함)에 상대적인 크기 및 형상이다. 예를 들어, 반응 챔버는 단지 하나의 캡처 비드를 수용하도록 하는 크기 및 형상일 수 있다. 캡처 비드는 상부에 클론성으로 증폭된 DNA 또는 다른 물질을 가질 수 있다. 대안적으로, 반응 챔버는 대략적인 수의 비드 또는 고체 기질을 수용하도록 하는 크기 및 형상일 수 있다. 또 다른 예로서, 반응 챔버는 또한 반응 챔버로 유동할 수 있는 필터 유체 또는 확산을 제어하도록 구성된 다공성 젤 또는 물질로 충전될 수 있다.
일부 실시형태에서, 센서(예를 들어, 광 검출기, 광다이오드)는 바이오센서의 샘플 표면의 대응하는 픽셀 면적과 연관된다. 이와 같이, 픽셀 면적은 하나의 센서(또는 픽셀)에 대한 바이오센서의 샘플 표면 상의 면적을 나타내는 기하학적 구조이다. 픽셀 면적과 연관된 센서는, 목적하는 반응이 반응 부위 또는 연관된 픽셀 면적 위에 놓인 반응 챔버에서 일어났을 때 연관된 픽셀 면적으로부터 수렴되는 발광을 검출한다. 편평한 표면 실시형태에서, 픽셀 면적은 중첩될 수 있다. 일부 경우에, 복수의 센서는 단일 반응 부위 또는 단일 반응 챔버와 연관될 수 있다. 다른 경우에, 단일 센서는 반응 부위의 군 또는 반응 챔버의 군과 연관될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "바이오센서"는 복수의 반응 부위 및/또는 반응 챔버(또는 웰)를 갖는 구조물을 포함한다. 바이오센서는 고체-상태 영상화 디바이스(예를 들어, CCD 또는 CMOS 영상화기) 및, 선택적으로, 그에 장착된 플로우 셀을 포함할 수 있다. 플로우 셀은 반응 부위 및/또는 반응 챔버와 유체 소통하는 적어도 하나의 플로우 채널을 포함할 수 있다. 구체적인 일례로서, 바이오센서는 생물검정 시스템에 유체적으로 그리고 전기적으로 커플링하도록 구성된다. 생물검정 시스템은 미리 결정된 프로토콜(예를 들어, 합성에 의한 서열분석)에 따라서 반응물을 반응 부위 및/또는 반응 챔버에 전달하여, 복수의 영상화 사건을 수행할 수 있다. 예를 들어, 생물검정 시스템은 반응 부위 및/또는 반응 챔버을 따라서 유동하도록 용액을 안내할 수 있다. 용액 중 적어도 하나는 동일하거나 상이한 형광 표지를 갖는 4가지 유형의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 반응 부위 및/또는 반응 챔버에 위치된 상응하는 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있다. 이어서 생물검정 시스템은 여기광원(예를 들어, 고체-상태 광원, 예컨대, 발광 다이오드 또는 LED)을 사용하여 반응 부위 및/또는 반응 챔버를 조명할 수 있다. 여기광은 광범위한 파장을 비롯하여 미리 결정된 파장 또는 파장들을 가질 수 있다. 여기된 형광 표지는 센서에 의해서 캡처될 수 있는 방출 신호를 제공한다.
대안적인 실시형태에서, 바이오센서는 다른 식별 가능한 특성을 검출하도록 구성된 전극 또는 다른 유형의 센서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 센서는 이온 농도의 변화를 검출하도록 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, 센서는 막을 통한 이온 전류 유동을 검출하도록 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "카트리지"는 바이오센서를 보유하도록 구성된 구조물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 카트리지는 여기광을 바이오센서의 반응 부위 및/또는 반응 챔버에 제공하도록 구성된 추가의 특징부, 예컨대, 광원(예를 들어, LED)을 포함할 수 있다. 카트리지는 또한 유체 저장 시스템(예를 들어, 시약, 샘플 및 완충제에 대한 저장) 및 반응 성분, 샘플 등을 반응 부위 및/또는 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 수송하기 위한 유체 제어 시스템(예를 들어, 펌프, 밸브 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이오센서가 준비 또는 제조된 후, 바이오센서는 카트리지의 하우징 또는 컨테이너에 커플링될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오센서 및 카트리지는 자립적인 일회용 유닛일 수 있다. 그러나, 다른 실시형태는 사용자가 성분 또는 샘플의 유지 또는 대체를 위해서 바이오센서 또는 카트리지의 내부에 접근할 수 있도록 하는 제거 가능한 부품을 갖는 어셈블리를 포함할 수 있다. 바이오센서 및 카트리지는 내부에서 제어된 반응을 수행하는 더 큰 생물검정 시스템, 예컨대, 서열분석 시스템에 제거 가능하게 커플링되거나 또는 맞물릴 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제거 가능하게" 및 "커플링된"(또는 "맞물린")이 바이오센서(또는 카트리지)와 생물검정 시스템의 시스템 용기 또는 계면 간의 관계를 설명하기 위해서 함께 사용된 경우, 이 용어는 바이오센서(또는 카트리지)와 시스템 용기 간의 연결이 시스템 용기 및/또는 바이오센서(또는 카트리지)를 파괴하거나 손상시키지 않으면서 쉽게 분리될 수 있다는 것을 의미하도록 의도된다. 성분은, 성분을 분리하는 데 과도한 노력 또는 상당한 시간을 소모하지 않으면서 서로로부터 분리될 수 있는 경우, 쉽게 분리 가능하다. 예를 들어, 바이오센서(또는 카트리지)는 전기적 방식으로 시스템 용기에 제거 가능하게 커플링되거나 맞물릴 수 있어서 생물검정 시스템의 짝지움 접촉은 파괴되거나 손상되지 않는다. 바이오센서(또는 카트리지)는 또한 기계적 방식으로 시스템의 용기에 제거 가능하게 커플링되거나 맞물릴 수 있어서 바이오센서(또는 카트리지)를 보유하는 특징부는 파괴되거나 손상되지 않는다. 바이오센서(또는 카트리지)는 유체적 방식으로 시스템 용기에 제거 가능하게 커플링되거나 맞물릴 수 있어서 시스템 용기의 포트는 파괴되거나 손상되지 않는다. 시스템 용기 또는 성분은, 예를 들어, 성분에 대한 단지 단순한 조정(예를 들어, 재배열) 또는 단순한 교체(예를 들어, 노즐 교체)가 필요한 경우 파괴되거나 손상되었다고 간주되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "클러스터"는 유사하거나 또는 동일한 분자 또는 뉴클레오타이드 서열 또는 DNA 가닥의 집락이다. 예를 들어, 클러스터는 증폭된 올리고뉴클레오타이드 또는 동일하거나 또는 유사한 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 임이의 다른 군일 수 있다. 다른 실시형태에서, 클러스터는 샘플 표면 상의 물리적 면적을 점유하는 임의의 부재 또는 부재의 군일 수 있다. 실시형태에서, 클러스터는 염기 콜링 주기 동안 반응 부위 및/또는 반응 챔버에 고정된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "고정된"은 생물분자 또는 생물학적 또는 화학 물질과 관련하여 사용되는 경우, 표면에 대한 분자 수준의 생물 분자 또는 생물학적 또는 화학 물질의 실질적인 부착을 포함한다. 예를 들어, 생물분자 또는 생물학적 또는 화학 물질은 비공유 상호작용(예를 들어, 정전기력, 반데르발스 및 소수성 계면의 탈수) 및 작용기 또는 연결기가 생물분자를 표면에 부착시키는 것을 가능하게 하는 공유 결합 기술을 비롯한 흡착 기술을 사용하여 기재 물질의 표면에 고정될 수 있다. 기재 물질의 표면에 생물분자 또는 생물학적 또는 화학 물질을 고정시키는 것은, 기재 표면, 생물분자 또는 생물학적 또는 화학 물질을 보유하는 액체 매질의 특성, 및 생물분자 또는 생물학적 또는 화학 물질 자체의 특성을 기초로 할 수 있다. 일부 경우에, 기재 표면은 기재 표면에 대한 생물분자(또는 생물학적 또는 화학 물질)의 고정을 용이하게 하기 위해서 작용화될 수 있다(예를 들어, 화학적으로 또는 물리적으로 변형될 수 있다). 기재 표면은 먼저 표면에 결합되는 작용기를 갖도록 변형될 수 있다. 작용기는 이어서 생물분자 또는 생물학적 또는 화학 물질에 결합하여 이들을 상부에 고정시킬 수 있다. 물질은 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 공개 제US 2011/0059865 A1호에 기재된 바와 같이, 젤을 통해서 표면에 고정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산은 표면에 부착되고, 브리지 증폭을 사용하여 증폭될 수 있다. 유용한 브리지 증폭 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,641,658호; 국제 특허 제WO 2007/010251호, 미국 특허 제6,090,592호; 미국 특허 공개 제2002/0055100 A1호; 미국 특허 제7,115,400호; 미국 특허 공개 제2004/0096853 A1호; 미국 특허 공개 제2004/0002090 A1호; 미국 특허 공개 제2007/0128624 A1호; 및 미국 특허 공개 제2008/0009420 A1호에 기재되어 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 본 명세서에 포함된다. 표면 상에서 핵산을 증폭시키는 또 다른 유용한 방법은 예를 들어, 하기에 보다 상세하게 언급된 방법을 사용하는 롤링 서클 증폭(RCA)이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 표면에 부착되고, 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭될 수 있다. 예를 들어, 프라이머 중 하나는 용액 중에 존재할 수 있고, 나머지 프라이머는 표면 상에 고정될 수 있다(예를 들어, 5'-부착됨). 예의 방식에 의해서, 핵산 분자는 표면 상의 프라이머 중 하나에 혼성화되고, 그 다음 고정된 프라이머가 확장되어 핵산의 제1 카피를 생산할 수 있다. 이어서 용액 중의 프라이머는 핵산의 제1 카피에 혼성화되고, 이것은 핵산의 제1 카피를 주형으로서 사용하여 확장될 수 있다. 선택적으로, 핵산의 제1 카피가 생산된 후, 본래 핵산 분자는 표면 상의 제2의 고정된 프라이머에 혼성화될 수 있고, 용액 중에 존재하는 프라이머의 확장과 동시에 또는 그 후에 확장될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 고정된 프라이머 및 용액 중의 프라이머를 사용한 반복되는 확장(예를 들어, 증폭) 라운드는 핵산의 다수의 카피를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법에 의해서 실행되는 검정 프로토콜은 자연 뉴클레오타이드 및 또한 자연 뉴클레오타이드과 상호작용하도록 구성된 효소의 사용을 포함한다. 자연 뉴클레오타이드는 예를 들어, 리보뉴클레오타이드(RNA) 또는 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA)를 포함한다. 자연 뉴클레오타이드는 모노-, 다이-, 또는 트라이-포스페이트 형태로 존재할 수 있고, 아데닌(A), 티민(T), 우라실(U), 구아닌(G) 또는 사이토신(C)으로부터 선택된 염기를 가질 수 있다. 그러나 비자연 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 상기에 언급된 뉴클레오타이드의 유사체가 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 유용한 비자연 뉴클레오타이드의 일부 예는 합성 방법에 의한 가역적 종결인자(가역적 종결인자)-기반 서열분석과 관련하여 하기에 언급되어 있다.
반응 챔버를 포함하는 실시형태에서, 아이템 또는 고체 물질(반고체 물질 포함)은 반응 챔버 내에 배치될 수 있다. 배치되는 경우, 아이템 또는 고체는 억지 끼워맞춤(interference fit), 접착 또는 포착(entrapment)을 통해서 반응 챔버 내에 물리적으로 보유되거나 고정될 수 있다. 반응 챔버 내에 배치될 수 있는 예시적인 아이템 또는 고체는 중합체 비드, 펠릿, 아가로스 젤, 분말, 양자점 또는 반응 챔버 내에 압착 및/또는 보유될 수 있는 다른 고체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 핵산 상부구조, 예컨대, DNA 볼은, 예를 들어, 반응 챔버의 내부 표면에 대한 부착에 의해서 또는 반응 챔버 내의 액체 중의 체류에 의해서 반응 챔버 내부에 또는 반응 챔버에 배치될 수 있다. DNA 볼 또는 다른 핵산 상부구조가 미리 형성되고, 이어서 반응 챔버 내부에 또는 반응 챔버에 배치될 수 있다. 대안적으로, DNA 볼은 반응 챔버에서 동일계에서 합성될 수 있다. DNA 볼은 롤링 서클 증폭에 의해서 합성되어 특정 핵산 서열의 콘카타머(concatamer)를 생산할 수 있고, 콘카타머는 비교적 소형 볼을 형성하는 조건으로 처리될 수 있다. DNA 볼 및 이의 합성 방법은 예를 들어, 미국 특허 공개 제2008/0242560 A1호 또는 제2008/0234136 A1호에 기재되어 있고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 포함된다. 반응 챔버 내에 보유 또는 배치된 물질은 고체, 액체 또는 기체 상태로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "염기 콜링"은 핵산 서열 내의 뉴클레오타이드 염기를 식별한다. 염기 콜링은 특정 주기의 모든 클러스터에 대한 염기 콜(A, C, G, T)을 결정하는 과정을 지칭한다. 예로서, 염기 콜링은 미국 특허 출원 공개 제2013/0079232호에 포함된 문헌에 기재된 4-채널, 2-채널 또는 1-채널 방법 및 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 염기 콜링 주기는 "샘플링 사건"이라고 지칭된다. 1 염료 및 2-채널 서열분석 프로토콜에서, 샘플링 사건은 시간 순서의 2개의 조명 단계를 포함하여, 픽셀 신호가 각각의 단계에서 생성된다. 제1 조명 단계는 AT 픽셀 신호의 뉴클레오타이드 염기 A 및 T를 나타내는 주어진 클러스터로부터의 조명을 유도하고, 제2 조명 단계는 CT 픽셀 신호의 뉴클레오타이드 염기 C 및 T를 나타내는 주어진 클러스터로부터의 조명을 유도한다.
염기 콜링 시스템
도 1은 일 실시형태에 따른 염기 콜링 시스템(100)의 블록 다이어그램이다. 염기 콜링 시스템(100)은 생물학적 또는 화학 물질 중 적어도 하나에 관련된 임의의 정보 또는 데이터를 얻도록 작동될 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 콜링 시스템(100)은 벤치탑 디바이스 또는 데스크탑 컴퓨터와 유사할 수 있는 워크스테이션이다. 예를 들어, 목적하는 반응을 수행하기 위한 시스템 및 성분 대부분(또는 전부)은 공통 하우징(116) 내에 존재할 수 있다.
특정 실시형태에서, 염기 콜링 시스템(100)은 드 노보 서열분석, 전체 게놈 또는 표적 게놈 영역의 재서열분석 및 메타게노믹스를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 응용을 위해서 구성된 핵산 서열분석 시스템(또는 서열분석기)이다. 서열분석기는 DNA 또는 RNA 분석을 위해 또한 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 콜링 시스템(100)은 또한 바이오센서에서 반응 부위를 생성시키도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 염기 콜링 시스템(100)은 샘플을 수신하고, 샘플로부터 유래된 클론성으로 증폭된 핵산의 표면 부착된 클러스터를 생성시키도록 구성될 수 있다. 각각의 클러스터는 바이오센서 내의 반응 부위를 구성할 수 있거나 이의 일부일 수 있다.
예시적인 염기 콜링 시스템(100)은 바이오센서(102) 내에서 목적하는 반응을 수행하기 위해 바이오센서(102)와 상호 작용하도록 구성된 시스템 용기 또는 계면(112)을 포함할 수 있다. 도 1과 관련한 하기의 설명에서, 바이오센서(102)가 시스템 용기(112)에 로딩된다. 그러나, 바이오센서(102)를 포함하는 카트리지는 시스템 용기(112)에 삽입될 수 있고 일부 상태에서 카트리지는 일시적으로 또는 영구적으로 제거될 수 있다는 것이 이해된다. 상기에 기재된 바와 같이, 카트리지는, 특히, 유체 제어 및 유체 저장 성분을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 염기 콜링 시스템(100)은 바이오센서(102) 내에서 상당한 수의 병렬 반응을 수행하도록 구성된다. 바이오센서(102)는 목적하는 반응이 일어날 수 있는 하나 이상의 반응 부위를 포함한다. 반응 부위는, 예를 들어, 바이오센서의 대응하는 반응 챔버 내에 위치된 비드(또는 다른 이동 가능한 기재)에 고정되거나 바이오센서의 고체 표면에 고정될 수 있다. 반응 부위는, 예를 들어, 클론성으로 증폭된 핵산의 클러스터를 포함할 수 있다. 바이오센서(102)는 고체-상태 영상화 디바이스(예를 들어, CCD 또는 CMOS 영상화기) 및, 그에 장착된 플로우 셀을 포함할 수 있다. 플로우 셀은 염기 콜링 시스템(100)으로부터 용액을 수용하고, 용액을 반응 부위로 안내하는 하나 이상의 플로우 채널을 포함할 수 있다. 선택적으로, 바이오센서(102)는 열 에너지를 플로우 채널 내부 또는 외부로 전달하기 위해서 열 부재와 맞물리도록 구성될 수 있다.
염기 콜링 시스템(100)은 생물학적 분석 또는 화학적 분석을 위한 검정 프로토콜 또는 미리 결정된 방법을 수행하도록 서로 상호 작용하는 다양한 성분, 어셈블리, 및 시스템(또는 하위-시스템)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 염기 콜링 시스템(100)은, 염기 콜링 시스템(100)의 다양한 성분, 어셈블리 및 서브시스템 및 바이오 센서(102)와 통신할 수 있는 시스템 제어기(104)를 포함한다. 예를 들어, 시스템 용기(112)에 추가로, 염기 콜링 시스템(100)은 또한 바이오센서(102) 및 염기 콜링 시스템(100)의 유체 네트워크 전체에서 유체의 유동을 제어하기 위한 유체 제어 시스템(106); 생물검정 시스템에 의해 사용될 수 있는 모든 유체(예를 들어, 가스 또는 액체)를 보유하도록 구성된 유체 저장 시스템(108); 유체 네트워크, 유체 저장 시스템(108) 및/또는 바이오센서(102)의 유체의 온도를 조절할 수 있는 온도 제어 시스템(110); 및 바이오센서(102)를 조명하도록 구성된 조명 시스템(109)을 포함할 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이, 바이오센서(102)를 갖는 카트리지가 시스템 용기(112)에 로딩되면, 카트리지는 또한 유체 제어 및 유체 저장 성분을 포함할 수 있다.
또한 도시된 바와 같이, 염기 콜링 시스템(100)은 사용자와 상호 작용하는 사용자 인터페이스(114)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 사용자 인터페이스(114)는 사용자로부터의 정보를 디스플레이하거나 요청하기 위한 디스플레이(113) 및 사용자 입력값을 수신하기 위한 사용자 입력 디바이스(115)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 디스플레이(113) 및 사용자 입력 디바이스(115)는 동일한 디바이스이다. 예를 들어, 사용자 인터페이스(114)는 개별 터치의 존재를 검출하고, 디스플레이 상에서 터치의 위치를 또한 식별하도록 구성된 접촉-감지 디스플레이를 포함할 수 있다. 그러나 다른 사용자 입력 디바이스(115), 예컨대, 마우스, 터치패드, 키보드, 키패드, 휴대용 스캐너, 음성 인식 시스템, 모션 인식 시스템 등이 사용될 수 있다. 하기에 보다 상세하게 논의될 바와 같이, 염기 콜링 시스템(100)은, 목적하는 반응을 수행하기 위해서 (예를 들어, 카트리지의 형태의) 바이오센서(102)를 비롯한 다양한 성분과 통신할 수 있다. 염기 콜링 시스템(100)은 또한, 사용자에게 목적하는 정보를 제공하기 위해서 바이오센서로부터 획득된 데이터를 분석하도록 구성될 수 있다.
시스템 제어기(104)는, 마이크로제어기, RISC(reduced instruction set computer), ASIC(application specific integrated circuit), FPGA(field programmable gate array), 논리 회로, 및 본 명세서에 기재된 기능을 실행할 수 있는 임의의 다른 회로 또는 프로세서를 사용하는 시스템을 비롯한 임의의 프로세서 기반 또는 마이크로프로세서 기반 시스템을 포함할 수 있다. 상기 예는 단지 예시적이며, 따라서 용어 시스템 제어기의 의미 및/또는 정의를 어떠한 방식으로도 제한하도록 의도되지 않는다. 예시적인 실시형태에서, 시스템 제어기(104)는, 검출 데이터를 획득하는 것 및 분석하는 것 중 적어도 하나를 위해서, 하나 이상의 저장 부재, 메모리 또는 모듈에 저장되는 명령의 세트를 실행한다. 검출 데이터는, 수 백만 개의 센서(또는 픽셀) 각각으로부터의 일련의 픽셀 신호가 다수의 염기 콜링 주기에 걸쳐서 검출될 수 있도록, 복수의 일련의 픽셀 신호를 포함할 수 있다. 저장 부재는 염기 콜링 시스템(100) 내에 물리적 메모리 부재 또는 정보 소스의 형태로 존재할 수 있다.
명령의 세트는 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태의 방법 및 공정과 같은 구체적인 작동을 수행하기 위해서 염기 콜링 시스템(100) 또는 바이오센서(102)에 명령하는 다양한 명령어를 포함할 수 있다. 명령의 세트는 소프트웨어 프로그램의 형태일 수 있는데, 이것은 유형(tangible)의 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체 또는 매체들의 부분을 형성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "소프트웨어" 및 "펌웨어"는 상호 교환 가능하고, RAM 메모리, ROM 메모리, EPROM 메모리, EEPROM 메모리, 및 비휘발성 RAM(NVRAM) 메모리를 비롯한, 컴퓨터에 의한 실행을 위해서 메모리에 저장되는 임의의 컴퓨터 프로그램을 포함한다. 상기 메모리 유형은 단지 예시적이며, 따라서, 컴퓨터 프로그램의 저장을 위해서 사용 가능한 메모리의 유형에 대한 제한이 아니다.
소프트웨어는 다양한 형태, 예컨대, 시스템 소프트웨어 또는 응용 소프트웨어일 수 있다. 추가로, 소프트웨어는 개별 프로그램의 컬렉션의 형태이거나, 더 큰 프로그램 내의 프로그램 모듈 또는 프로그램 모듈의 일부일 수 있다. 소프트웨어는 또한 객체 지향형 프로그래밍(object-oriented programming)의 형태의 모듈식 프로그래밍을 포함할 수 있다. 검출 데이터를 획득한 후, 검출 데이터는 염기 콜링 시스템(100)에 의해서 자동으로 처리되거나, 사용자 입력에 응답하여 처리되거나, 또 다른 처리 기기에 의해서 행해진 요청(예를 들어, 통신 링크를 통한 원격 요청)에 응답하여 처리될 수 있다. 도시된 실시형태에서, 시스템 제어기(104)는 신호 프로세서(138)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 시스템 제어기(104)는 신호 프로세서(138)를 포함하지 않고, 대신에 신호 프로세서(138)에 대한 접근부를 갖는다(예를 들어, 신호 프로세서(138)는 클라우드 상에 별도로 호스팅될 수 있다).
시스템 제어기(104)는 통신 링크를 통해서 바이오센서(102) 및 염기 콜링 시스템(100)의 다른 성분에 연결될 수 있다. 시스템 제어기(104)는 또한, 오프-사이트 시스템 또는 서버에 통신 가능하게 연결될 수 있다. 통신 링크는 하드웨어 내장되거나, 유선이거나, 무선일 수 있다. 시스템 제어기(104)는, 사용자 인터페이스(114) 및 사용자 입력 디바이스(115)로부터, 사용자 입력 또는 명령어를 수신할 수 있다.
유체 제어 시스템(106)은 유체 네트워크를 포함하고, 유체 네트워크를 통해서 하나 이상의 유체의 유동을 안내 및 조절하도록 구성된다. 유체 네트워크는 바이오센서(102) 및 유체 저장 시스템(108)과 유체 소통할 수 있다. 예를 들어, 선택된 유체는 유체 저장 시스템(108)으로부터 배출될 수 있고, 제어된 방식으로 바이오센서(102)로 안내될 수 있거나, 유체는 바이오센서(102)로부터 배출되고, 예를 들어, 유체 저장 시스템 (108)의 폐기물 저장소를 향해 안내될 수 있다. 도시되지 않았지만, 유체 제어 시스템(106)은 유체 네트워크 내의 유체의 압력 또는 유량을 검출하는 플로우 센서를 포함할 수 있다. 센서는 시스템 제어기(104)와 통신할 수 있다.
온도 제어 시스템(110)은 유체 네트워크의 상이한 영역, 유체 저장 시스템(108) 및/또는 바이오센서(102)에서 유체의 온도를 조절하도록 구성된다. 예를 들어, 온도 제어 시스템(110)은 바이오센서(102)와 접속하여 바이오센서(102)의 반응 부위를 따라서 유동하는 유체의 온도를 제어하는 열순환기를 포함할 수 있다. 온도 제어 시스템(110)은 또한, 염기 콜링 시스템(100) 또는 바이오센서(102)의 고체 요소 또는 성분의 온도를 조절할 수 있다. 도시되지는 않았지만, 온도 제어 시스템(110)은 유체 또는 다른 성분의 온도를 검출하기 위한 센서를 포함할 수 있다. 센서는 시스템 제어기(104)와 통신할 수 있다.
유체 저장 시스템(108)은 바이오센서(102)와 유체 소통하고, 내부에서 목적하는 반응을 수행하는 데 사용되는 다양한 반응 성분 또는 반응물을 저장할 수 있다. 유체 저장 시스템(108)은 또한 유체 네트워크 및 바이오센서(102)를 세척 또는 세정하기 위한 유체 및 반응물을 희석시키기 위한 유체를 저장할 수 있다. 예를 들어, 유체 저장 시스템(108)은 샘플, 시약, 효소, 다른 생물분자, 완충제 용액, 수성 및 비극성 용액 등을 저장하기 위한 다양한 저장소를 포함할 수 있다. 추가로, 유체 저장 시스템(108)은 또한 바이오센서(102)로부터 폐기물을 수용하기 위한 폐기물 저장소를 포함할 수 있다. 카트리지를 포함하는 실시형태에서, 카트리지는 유체 저장 시스템, 유체 제어 시스템 또는 온도 제어 시스템 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 따라서, 이들 시스템과 관련한 것으로 본 명세서에 언급된 성분 중 하나 이상은 카트리지 하우징 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 카트리지는, 샘플, 시약, 효소, 다른 생물분자, 완충제 용액, 수용액 및 비극성 용액, 폐기물 등을 저장하기 위한 다양한 저장기를 가질 수 있다. 이와 같이, 유체 저장 시스템, 유체 제어 시스템 또는 온도 제어 시스템 중 하나 이상은, 카트리지 또는 다른 바이오센서를 통해서 생물검정 시스템과 제거 가능하게 맞물려있을 수 있다.
조명 시스템(109)은 바이오센서를 조명하기 위해서, 광원(예를 들어, 하나 이상의 LED) 및 복수의 광학 성분을 포함할 수 있다. 광원의 예는, 레이저, 아크 램프, LED 또는 레이저 다이오드를 포함할 수 있다. 광학 성분은, 예를 들어, 반사기, 다이크로익(dichroics), 빔 스플리터, 콜리메이터, 렌즈, 필터, 웨지, 프리즘, 거울, 검출기 등일 수 있다. 조명 시스템을 사용하는 실시형태에서, 조명 시스템(109)은 여기광을 반응 부위에 안내하도록 구성될 수 있다. 일례로서, 형광단은 광의 녹색 파장에 의해 여기될 수 있고, 따라서 여기광의 파장은 대락 532nm일 수 있다. 일 실시형태에서, 조명 시스템(109)은 바이오센서(102)의 표면에 법선인 표면에 평행인 조명을 생성시키도록 구성된다. 또 다른 실시형태, 조명 시스템(109)은 바이오센서(102)의 표면에 법선인 표면에 대해서 오프-각도인 조명을 생성시키도록 구성된다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 조명 시스템(109)은 일부는 평행 조명이고, 일부는 오프-각도 조명을 포함하는, 복수의 각도를 갖는 조명을 생성시키도록 구성된다.
시스템 용기 또는 계면(112)은 기계적, 전기적 및 유체적 방식 중 적어도 하나로 바이오센서(102)와 맞물리도록 구성된다. 시스템 용기(112)는 바이오센서(102)를 통한 유체의 유동을 용이하게 하기 위해서 목적하는 배향으로 바이오센서(102)를 보유할 수 있다. 시스템 용기(112)는 또한 염기 콜링 시스템(100)이 바이오센서(102)와 통신하고 그리고/또는 전력을 바이오센서(102)에 제공할 수 있도록, 바이오센서(102)와 맞물리도록 구성되는 전기적 접촉부를 포함할 수 있다. 추가로, 시스템 용기(112)는 바이오센서(102)와 맞물리도록 구성된 유체 포트(예를 들어, 노즐)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오센서(102)는 기계적 방식으로, 전기적 방식으로 그리고 또한 유체적 방식으로 시스템 용기(112)에 제거 가능하게 커플링된다.
또한, 염기 콜링 시스템(100)은 다른 시스템 또는 네트워크와 또는 다른 생물검정 시스템(100)과 원격으로 통신할 수 있다. 생물 검정 시스템(들)(100)에 의해서 획득된 검출 데이터는 원격 데이터베이스에 저장될 수 있다.
도 2는 도 1의 시스템에서 사용될 수 있는 시스템 제어기(104)의 블록 다이어그램이다. 일 실시예에서, 시스템 제어기(104)는 서로 통신할 수 있는 하나 이상의 프로세서 또는 모듈을 포함한다. 프로세서 또는 모듈 각각은, 특정 프로세스를 수행하기 위해서 알고리즘(예를 들어, 유형의 그리고/또는 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체 상에 저장된 명령) 또는 서브-알고리즘을 포함할 수 있다. 시스템 제어기(104)는 모듈의 집합으로서 개념적으로 도시되어 있지만, 전용 하드웨어 보드, DSP, 프로세서 등의 임의의 조합을 이용하여 구현될 수 있다. 대안적으로, 시스템 제어기(104)는 단일 프로세서 또는 다수의 프로세서를 갖는 기성품 PC를 이용하여 구현될 수 있으며, 기능적 작동은 프로세서 사이에 분포된다. 추가의 선택으로서, 하기에 기재된 모듈은 특정 모듈식 기능이 전용 하드웨어를 사용하여 수행되는 하이브리드 구성을 이용하여 구현될 수 있는 반면, 나머지 모듈식 기능은 기성품 PC 등을 이용하여 수행된다. 모듈은 또한 처리 유닛 내의 소프트웨어 모듈로서 구현될 수 있다.
작동 동안, 통신 포트(120)는 정보(예를 들어, 명령어)를 바이오센서(102)(도 1) 및/또는 하위-시스템(106, 108, 110)(도 1)에 전송하거나 이것으로부터 정보(예를 들어, 데이터)를 수신할 수 있다. 실시형태에서, 통신 포트(120)는 복수의 일련의 픽셀 신호를 출력해 낼 수 있다. 통신 링크(122)는 사용자 인터페이스(114)(도 1)로부터 사용자 입력을 수신할 수 있고, 사용자 인터페이스(114)에 데이터 또는 정보를 전송할 수 있다. 바이오센서(102) 또는 하위-시스템(106, 108, 110)으로부터의 데이터는 생물검정 세션 동안 실시간으로 시스템 제어기(104)에 의해서 처리될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 데이터는 생물검정 세션 동안 시스템 메모리에 일시적으로 저장될 수 있고, 실시간 또는 오프-라인 작동보다 더 느리게 처리될 수 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 시스템 제어기(104)는 주 제어 모듈(130)과 통신하는 복수의 모듈(131 내지 139)을 포함할 수 있다. 주 제어 모듈(130)은 사용자 인터페이스(114)(도 1)와 통신할 수 있다. 모듈(131 내지 139)은 주 제어 모듈(130)과 직접 통신하는 것으로 도시되지만, 모듈(131 내지 139)은 또한 서로, 사용자 인터페이스(114) 및 바이오센서(102)와 직접 통신할 수 있다. 또한, 모듈(131 내지 139)은 다른 모듈을 통해 주 제어 모듈(130)과 통신할 수 있다.
복수의 모듈(131 내지 139)은 각각 하위-시스템(106, 108, 110, 및 111)과 통신하는 시스템 모듈(131 내지 133, 139)을 포함한다. 유체 제어 모듈(131)은 유체 네트워크를 통해 하나 이상의 유체의 흐름을 제어하기 위해 유체 네트워크의 플로우 센서 및 밸브를 제어하도록 유체 제어 시스템(106)과 통신할 수 있다. 유체 저장 모듈(132)은, 유체가 적거나 폐기물 저장소가 용량이 찼거나 거의 찬 경우 사용자에게 통지할 수 있다. 유체 저장 모듈(132)은 또한 유체가 목적하는 온도로 저장될 수 있도록 온도 제어 모듈(133)과 통신할 수 있다. 조명 모듈(139)은 프로토콜 동안 지정된 시간에, 예컨대 목적하는 반응(예를 들어, 결합 사건)이 발생한 후, 반응 지점을 조명하기 위해 조명 시스템(109)과 통신할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조명 모듈(139)은 지정된 각도로 반응 부위를 조명하도록 조명 시스템(109)과 통신할 수 있다.
복수의 모듈(131 내지 139)은 또한 바이오센서(102)와 통신하는 디바이스 모듈(134) 및 바이오센서(102)와 관련된 식별 정보를 결정하는 식별 모듈(135)을 포함할 수 있다. 디바이스 모듈(134)은 예를 들어, 바이오센서가 염기 콜링 시스템(100)과 전기적 그리고 유체적 연결을 확립했다는 것을 확인하기 위해서 시스템 용기(112)와 통신할 수 있다. 식별 모듈(135)은 바이오센서(102)를 식별하는 신호를 수신할 수 있다. 식별 모듈(135)은 바이오센서(102)의 아이덴티티를 사용하여 사용자에게 다른 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 식별 모듈(135)은 로트 번호, 제조일 또는 바이오센서(102)와 구동되도록 권장되는 프로토콜을 결정하고 이어서 디스플레이할 수 있다.
복수의 모듈(131 내지 139)은 또한, 바이오센서(102)로부터 신호 데이터(예를 들어, 영상 데이터)를 수신 및 분석하는 신호 처리 모듈 또는 신호 프로세서(138)를 포함할 수 있다. 신호 프로세서(138)는 메모리(140)(예를 들어, RAM 또는 플래시)를 포함하여 검출 데이터를 저장한다. 검출 데이터는, 수 백만 개의 센서(또는 픽셀) 각각으로부터의 일련의 픽셀 신호가 다수의 염기 콜링 주기에 걸쳐서 검출될 수 있도록, 복수의 일련의 픽셀 신호를 포함할 수 있다. 신호 데이터는 후속 분석을 위해서 저장될 수 있거나 또는 사용자 인터페이스(114)로 전송되어 목적하는 정보를 사용자에게 디스플레이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 신호 프로세서(138)가 신호 데이터를 수신하기 전에, 신호 데이터는 고체-상태 영상화기(예를 들어, CMOS 영상 센서)에 의해 처리될 수 있다.
프로토콜 모듈(136 및 137)은 주 제어 모듈(130)과 소통하여 미리 결정된 검정 프로토콜을 수행하는 경우 하위-시스템(106, 108, 및 110)의 작동을 제어한다. 프로토콜 모듈(136 및 137)은 미리 결정된 프로토콜에 따라서 구체적인 작업을 수행하기 위해서 염기 콜링 시스템(100)을 명령하기 위한 명령의 세트를 포함할 수 있다. 나타낸 바와 같이, 프로토콜 모듈은 합성에 의한 서열분석 공정을 수행하기 위한 다양한 명령어를 제기하도록 구성된 합성에 의한 서열분석(SBS) 모듈(136)일 수 있다. SBS에서, 핵산 주형을 따르는 핵산 프라이머의 확장을 모니터링하여 주형에서 뉴클레오타이드의 서열을 결정한다. 근본적인 화학적 공정은 중합(예를 들어, 폴리머라제 효소에 의해서 촉매됨) 또는 결찰(예를 들어, 리가제 효소에 의해서 촉매됨)일 수 있다. 특정 폴리머라제-기반 SBS 실시형태에서, 프라이머에 첨가된 뉴클레오타이드의 순서 및 유형의 검출을 사용하여 주형의 서열을 결정할 수 있도록 주형 의존적인 방식으로 형광 표지된 뉴클레오타이드가 프라이머에 첨가된다(이에 의해서 프라이머를 확장시킴). 예를 들어, 제1 SBS 주기를 개시하기 위해서, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, DNA 폴리머라제 등을, 핵산 주형의 어레이를 수용하는 플로우 셀로/이를 통해서 전달하도록 하는 명령어가 제공될 수 있다. 핵산 주형은 대응하는 반응 부위에 위치될 수 있다. 프라이머 확장이 표지된 뉴클레오타이드가 혼입되도록 하는 이러한 반응 부위는 영상화 사건을 통해서 검출될 수 있다. 영상화 사건 동안, 조명 시스템(109)은 여기광을 반응 부위에 제공할 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는, 뉴클레오타이드가 프라이머에 첨가되었을 때 프라이머 확장을 추가로 종결시키는 가역적인 종결 특성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 탈블로킹제가 전달되어 모이어티를 제거할 때까지 후속 확장이 일어날 수 없도록 가역적인 종결인자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 유사체가 프라이머에 첨가될 수 있다. 따라서, 가역적인 종결을 사용하는 실시형태의 경우, (검출이 일어나기 이전에 또는 이후에) 플로우 셀에 탈블로킹 시약을 전달하기 위해서 명령어가 제공될 수 있다. 다양한 전달 단계 사이에 세척(들)을 수행하기 위해서 하나 이상의 명령어가 제공될 수 있다. 이어서 주기가 n회 반복되어 n개 뉴클레오타이드에 의해서 프라이머를 확장시켜, 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 예시적인 서열분석 기술은 예를 들어, 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], 국제 특허 제WO 2004/018497호; 미국 특허 제7,057,026호; 국제 특허 제WO 91/06678호; 제WO 2007/123744호; 미국 특허 제7,329,492호; 제7,211,414호; 제7,315,019호; 제7,405,281호 및 제2008/0108082호에 기재되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
SBS 주기의 뉴클레오타이드 전달 단계의 경우, 각각의 단일 유형의 뉴클레오타이드가 한 번에 전달될 수 있거나, 또는 다수의 상이한 뉴클레오타이드 유형(예를 들어, A, C, T 및 G 함께)이 전달될 수 있다. 한 번에 단일 유형의 뉴클레오타이드 만 존재하는 뉴클레오타이드 전달 구성의 경우, 상이한 뉴클레오타이드는 구별되는 표지를 가질 필요가 없는데, 그 이유는 그것은 개별화된 전달에서 고유한 시간적 분리를 기반으로 구별될 수 있기 때문이다. 따라서, 서열분석 방법 또는 장치는 단일 색상 검출을 사용할 수 있다. 예를 들어, 여기원(excitation source) 요구는 단지 단일 파장에서 또는 단일 파장 범위에서 여기를 제공할 필요가 있다. 전달이 플로우 셀 내에 동시에 다수의 상이한 뉴클레오타이드가 존재하게 하는 뉴클레오타이드 전달 구성의 경우, 상이한 뉴클레오타이드 유형을 혼입한 부위는 혼합물 중의 각각의 뉴클레오타이드 유형에 부착된 상이한 형광 표지를 기반으로 구별될 수 있다. 예를 들어, 각각 4개의 상이한 형광단 중 하나를 갖는, 4개의 상이한 뉴클레오타이드가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 4개의 상이한 형광단은 4개의 상이한 스펙트럼 영역에서의 여기를 사용하여 구별될 수 있다. 예를 들어, 4개의 상이한 여기 방사선 공급원이 사용될 수 있다. 대안적으로, 4개 미만의 상이한 여기원이 사용될 수 있지만, 단일 공급원으로부터의 여기 방사선의 광학 여과를 사용하여 플로우 셀에서 상이한 범위의 여기 방사선을 생성시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 4개 미만의 상이한 색상이 4개의 상이한 뉴클레오타이드를 갖는 혼합물에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 쌍이 동일한 파장에서 검출될 수 있지만, 그것은 나머지 것과 비교할 때 그 쌍 중 하나의 구성원에 대한 강도 차이를 기반으로, 또는 그 쌍 중 나머지 구성원에 대해서 검출되는 신호와 비교할 때 나타나거나 사라지는 명백한 신호를 유발하는 (예를 들어, 화학적 변형, 광화학적 변형 또는 물리적 변형을 통한) 그 쌍 중 하나의 구성원에 대한 변화를 기반으로 구별될 수 있다. 4개 미만의 색상의 검출을 사용하여 4개의 상이한 뉴클레오타이드를 구별하기 위한 예시적인 장치 및 방법은 예를 들어, 미국 특허 출원 시리얼 번호 제61/538,294호 및 제61/619,878호에 기재되어 있고, 이들은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 2012년 9월 21일자로 출원된 미국 출원 제13/624,200호가 상기 문헌에 상응하며, 또한 이의 전문은 참고로 포함된다.
복수의 프로토콜 모듈은 또한 유체 제어 시스템(106)에게 명령어를 제기하도록 구성된 샘플-제조(또는 생성) 모듈(137) 및 바이오센서(102) 내의 생성물을 증폭시키기 위한 온도 제어 시스템(110)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이오센서(102)는 염기 콜링 시스템(100)과 맞물릴 수 있다. 증폭 모듈(137)는 바이오센서(102) 내의 반응 챔버에 필요한 증폭 성분을 전달하도록 유체 제어 시스템(106)에 명령을 제기할 수 있다. 다른 실시형태에서, 반응 부위는 증폭을 위한 일부 성분, 예컨대, 주형 DNA 및/또는 프라이머를 이미 함유할 수 있다. 증폭 성분을 반응 챔버에 전달한 후, 증폭 모듈(137)은 공지된 증폭 프로토콜에 따라서 상이한 온도 단계를 통해서 순환시키도록 온도 제어 시스템(110)에게 명령할 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭 및/또는 뉴클레오타이드 혼입은 등온적으로 수행된다.
SBS 모듈(136)은 클론성 앰플리콘의 클러스터가 플로우 셀의 채널 내의 국지화된 면적 상에 형성되는 브리지 PCR을 수행하도록 명령어를 제기할 수 있다. 브리지 PCR을 통해서 앰플리콘을 생성시킨 후, 앰플리콘은 "선형화"되어 단일 가닥 주형 DNA, 또는 sstDNA를 제조할 수 있고, 서열분석 프라이머는 관심대상 영역에 측접된 범용 서열로 혼성화될 수 있다. 예를 들어, 합성에 의한 가역적 종결인자-기반 서열분석 방법이 상기 또는 하기에 언급된 바와 같이 사용될 수 있다.
각각의 염기 콜링 또는 서열분석 주기는, 예를 들어, 변형된 DNA 폴리머라제를 사용함으로써 달성될 수 있는 단일 염기 및 4개의 유형의 뉴클레오타이드의 혼합물에 의해서 sstDNA를 확장시킬 수 있다. 상이한 유형의 뉴클레오타이드는 고유한 형광 표지를 가질 수 있고, 각각의 뉴클레오타이드는 단일-염기 혼입이 각각의 주기에서 일어나는 것을 가능하게 하는 가역적 종결인자를 추가로 가질 수 있다. 단일 염기가 sstDNA에 첨가된 후, 반응 부위 상에 여기광이 입사될 수 있고, 형광 방출이 검출될 수 있다. 검출 후, 형광 표지 및 종결인자는 sstDNA로부터 화학적으로 절단될 수 있다. 또 다른 유사한 염기 콜링 또는 서열분석 주기가 이어질 수 있다. 이러한 서열분석 프로토콜에서, SBS 모듈(136)은 바이오센서(102)를 통해서 시약 및 효소 용액의 유동을 지시하도록 유체 제어 시스템(106)을 명령할 수 있다. 본 명세서에 언급된 장치 및 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적인 가역적 종결인자-기반 SBS 방법은 미국 특허 출원 공개 제2007/0166705 A1호, 미국 특허 출원 공개 제2006/0188901 A1호, 미국 특허 제7,057,026호, 미국 특허 출원 공개 제2006/0240439 A1호, 미국 특허 출원 공개 제2006/0281109 A1호, PCT 공개 제WO 2005/065814호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0100900 A1호, PCT 공개 제WO 2006/064199호 및 PCT 공개 제WO 2007/010251호에 기재되어 있고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 가역적 종결인자-기반 SBS를 위한 예시적인 시약은 미국 특허 제7,541,444호; 제7,057,026호; 제7,414,116호; 제7,427,673호; 제7,566,537호; 제7,592,435호; 및 국제 특허 제WO 2007/135368호에 기재되어 있다, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 증폭 및 SBS 모듈은, 예를 들어, 주형 핵산이 증폭되고, 이어서 동일한 카트리지 내에서 서열분석되는, 단일 검정 프로토콜로 작동될 수 있다.
염기 콜링 시스템(100)은 또한 사용자가 검정 프로토콜을 재구성하는 것을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 염기 콜링 시스템(100)은 결정된 프로토콜을 변형시키기 위해서 사용자 인터페이스(114)를 통해서 사용자에게 선택을 제공할 수 있다. 예를 들어, 바이오센서(102)가 증폭을 위해서 사용되려고 결정되는 경우, 염기 콜링 시스템(100)은 어닐링 주기를 위한 온도를 요청할 수 있다. 추가로, 염기 콜링 시스템(100)은, 사용자가 선택된 검정 프로토콜에 대해서 일반적으로 허용되지 않는 사용자 입력을 제공한 경우 사용자에게 경고를 제기할 수 있다.
실시형태에서, 바이오센서(102)는 수 백만 개의 센서(또는 픽셀)를 포함하며, 이들 각각은 연속적인 염기 콜링 주기에 걸쳐서 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시킨다. 신호 프로세서(130)는 복수의 일련의 픽셀 신호를 검출하고, 그것은 센서의 어레이 상의 센서의 행 방식(row-wise) 및/또는 열 방식(column-wise) 위치에 따라서 대응하는 센서(또는 픽셀)로 인한 것이다.
바이오센서
도 3은 각종 실시형태에서 사용될 수 있는 바이오센서(300)의 단면도를 도시한다. 바이오센서(300)는 염기 콜링 주기 동안 하나를 초과하는 클러스터를 각각 보유할 수 있는 픽셀 면적(306', 308', 310', 312' 및 314')을 갖는다(예를 들어, 픽셀 면적당 2개의 클러스터). 바이오센서(300)는 상기에 기재된 바이오센서(102)(도 1)와 유사한 특징부를 가질 수 있고, 예를 들어, 카트리지에서 사용될 수 있다. 도시된 바와 같이, 바이오센서(300)는 샘플링 디바이스(304) 상에 탑재된 플로우 셀(302)을 포함할 수 있다. 도시된 실시형태에서, 플로우 셀(302)은 샘플링 디바이스(304)에 직접 부착된다. 그러나, 대안적인 실시형태에서, 플로우 셀(302)은 샘플링 디바이스(304)에 제거 가능하게 커플링될 수 있다. 샘플링 디바이스(304)는 작용화될 수 있는 (예를 들어, 목적하는 반응을 수행하기에 적합한 방식으로 화학적으로 또는 물리적으로 변형될 수 있는) 샘플 표면(334)을 갖는다. 예를 들어, 샘플 표면(334)은 염기 콜링 주기 동안 하나를 초과하는 클러스터를 각각 보유할 수 있는 복수의 픽셀 면적(306', 308', 310', 312' 및 314')을 포함할 수 있다(예를 들어, 각각 상부에 고정된 대응하는 클러스터 쌍(306AB, 308AB, 310AB, 312AB 및 314AB)을 가짐). 각각의 픽셀 면적은 대응하는 센서(또는 픽셀 또는 광다이오드)(306, 308, 310, 312 및 314)와 연관되어, 픽셀 면적에 의해서 수신된 광은 대응하는 센서에 의해서 캡처된다. 픽셀 면적(306')은 또한 클러스터 쌍을 보유하는 샘플 표면(334) 상의 대응하는 반응 부위(306'')와 연관될 수 있어서, 반응 부위(306'')로부터 방출된 광은 픽셀 면적(306')에 의해서 수신되고, 대응하는 센서(306)에 의해서 캡처된다. 이의 감지 구조의 결과로서, 염기 콜링 주기(예를 들어, 각각 대응하는 클러스터 쌍을 가짐) 동안 특정 센서의 픽셀 면적 내에 2개 이상의 클러스터가 존재하는 경우에, 염기 콜링 주기 내의 픽셀 신호는 2개 이상의 클러스터 전부를 기반으로 하는 정보를 보유한다. 그 결과, 본 명세서에 기재된 바와 같은 신호 처리을 사용하여, 특정 염기 콜링 주기의 주어진 샘플링 사건에서의 픽셀 신호보다 더 많은 클러스터가 존재하는 경우 각각의 클러스터를 구별한다.
도시된 실시형태에서, 플로우 셀(302)은 측벽(338, 340), 및 측벽(338, 340)에 의해서 지지되는 플로우 커버(336)를 포함한다. 측벽(338, 340)은 샘플 표면(334)에 커플링되고, 이것은 플로우 커버(336)와 측벽(338, 340) 사이에 연장된다. 일부 실시형태에서, 측벽(338, 340)은 플로우 커버(336)를 샘플링 디바이스(304)에 결합시키는 경화성 접착제 층으로로부터 형성된다.
측벽(338, 340)은 플로우 채널(344)이 플로우 커버(336)와 샘플링 디바이스(304) 사이에 존재하도록 하는 크기 및 형상이다. 도시된 바와 같이, 플로우 채널(344)은 측벽(338, 340)에 의해서 결정되는 높이 H1을 포함할 수 있다. 높이 H1은 약 50 내지 400㎛(마이크로미터), 보다 특별하게는 약 80 내지 200㎛일 수 있다. 도시된 실시형태에서, 높이 H1은 약 100㎛이다. 플로우 커버(336)는 바이오센서(300)의 외부로부터 플로우 채널(344)로 전파되는 여기광(301)에 투과적인 재료를 포함할 수 있다. 도 3에 도시된 바와 같이, 여기광(301)은 비-직교각으로 플로우 커버(336)와 접촉한다. 그러나, 이것은 단지 예시의 목적을 위해서인데, 그 이유는 여기광(301)은 상이한 각도로 플로우 커버(336)와 접촉할 수 있기 때문이다.
또한 도시된 바와 같이, 플로우 커버(336)는 다른 포트(도시되지 않음)와 유체 흐름 가능하게 맞물리도록 구성된 유입 포트 및 유출 포트(342, 346)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 카트리지 또는 워크스테이션으로부터 기인된 다른 포트가 존재할 수 있다. 플로우 채널(344)은 샘플 표면(334)을 따라서 유체를 안내는 크기 및 형상이다. 플로우 채널(344)의 높이 H1 및 다른 치수는 샘플 표면(334)을 따르는 유체의 실질적으로 균일한 유동을 유지시키도록 배열될 수 있다. 플로우 채널(344)의 치수는 또한 방울 형성을 제어하도록 구성될 수 있다.
예시적인 도 3에 도시된 바와 같이, 측벽(338, 340) 및 플로우 커버(336)는 서로에 커플링된 별개의 성분이다. 대안적인 실시형태에서, 측벽(338, 340) 및 플로우 커버(336)는 측벽(338, 340) 및 플로우 커버(336)가 재료의 연속적인 조각으로부터 형성된다. 예의 방식에 의해서, 플로우 커버(336)(또는 플로우 셀(302))은 투명한 재료, 예컨대, 유리 또는 플라스틱을 포함할 수 있다. 플로우 커버(336)는 플로우 채널(344)을 획정하는 평탄한 외부 표면 및 평탄한 내부 표면을 갖는 실질적으로 직사각형인 블록으로 구성될 수 있다. 블록은 측벽(338, 340) 상에 장착될 수 있다. 대안적으로, 플로우 셀(302)은 플로우 커버(336) 및 측벽(338, 340)을 획정하도록 에칭될 수 있다. 예를 들어, 투명한 재료 내에 리세스(recess)가 에칭될 수 있다. 에칭된 재료가 샘플링 디바이스(304)에 장착되는 경우, 리세스는 플로우 채널(344)이 될 수 있다.
샘플링 디바이스(304)는 예를 들어, 복수의 적층된 기재 층(320 내지 326)을 포함하는 집적 회로와 유사할 수 있다. 기재 층(320 내지 326)은 베이스 기재(320), 고체-상태 영상화기(322) (예를 들어, CMOS 영상 센서), 필터 또는 광-관리 층(324), 및 부동태화 층(326)을 포함할 수 있다. 상기는 단지 예시이며, 다른 실시형태는 더 적거나 또는 추가의 층을 포함할 수 있다는 것을 주목해야 한다. 더욱이, 기재 층(320 내지 326) 각각은 복수의 하위-층을 포함할 수 있다. 하기에 보다 상세하게 기재될 바와 같이, 샘플링 디바이스(304)는 집적 회로, 예컨대, CMOS 영상 센서 및 CCD를 제조하는 데 사용되는 것과 유사한 공정을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 기재 층(320 내지 326) 또는 이의 부분은 성장, 침착, 에칭 등이 수행되어 샘플링 디바이스(304)를 형성할 수 있다.
부동태화 층(326)은 플로우 채널(344)의 유체 환경으로부터 필터 층(324)을 차폐하도록 구성된다. 일부 경우에, 부동태화 층(326)은 또한 생물분자 또는 관심대상 다른 분석물이 상부에 고정되는 것을 허용하는 고체 표면(즉, 샘플 표면(334)을 제공하도록 구성된다. 예를 들어, 반응 부위 각각은 샘플 표면(334)에 고정된 생물분자의 클러스터를 포함할 수 있다. 따라서, 부동태화 층(326)은 반응 부위가 고정되는 것이 가능한 재료로부터 형성될 수 있다. 부동태화 층(326)은 또한 목적하는 형광 광에 적어도 투과적인 재료를 포함할 수 있다. 예의 방식에 의해서, 부동태화 층(326)은 질화규소(Si3N4) 및/또는 실리카(SiO2)를 포함할 수 있다. 그러나, 다른 적합한 물질(들)이 사용될 수 있다. 도시된 실시형태에서, 부동태화 층(326)은 실질적으로 평탄할 수 있다. 그러나, 대안적인 실시형태에서, 부동태화 층(326)은 리세스, 예컨대, 피트(pit), 웰, 홈(groove) 등을 포함할 수 있다. 도시된 실시형태에서, 부동태화 층(326)은 약 150 내지 200nm, 보다 특별하게는 약 170nm인 두께를 갖는다.
필터 층(324)은 광의 전파에 영향을 미치는 다양한 특징부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필터 층(324)은 다양한 기능을 수행할 수 있다. 예를 들어, 필터 층(324)은 (a) 원치 않는 광 신호, 예컨대, 여기광원으로부터의 광 신호를 필터하도록 구성되거나; (b) 반응 부위로부터의 방출 신호를, 반응 부위로부터의 방출 신호를 검출하도록 구성된 대응하는 센서(306, 308, 310, 312 및 314)를 향해서 안내하도록 구성되거나; 또는 (c) 인접한 반응 부위로부터의 원치 않는 방출 신호의 검출을 차단 또는 예방하도록 구성될 수 있다. 이와 같이, 필터 층(324)은 또한 광-관리 층이라고도 지칭될 수 있다. 도시된 실시형태에서, 필터 층(324)은 약 1 내지 5㎛, 보다 특별하게는 약 3 내지 4㎛인 두께를 갖는다. 대안적인 실시형태에서, 필터 층(324)은 마이크로렌즈 또는 다른 광학 성분의 어레이를 포함할 수 있다. 마이크로렌즈 각각은 연관된 반응 부위로부터의 방출 신호를 센서에 안내하도록 구성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 고체-상태 영상화기(322) 및 베이스 기재(320)가 미리 구축된 고체-상태 영상화 디바이스(예를 들어, CMOS 칩)로서 함께 제공될 수 있다. 예를 들어, 베이스 기재(320)는 규소 웨이퍼일 수 있고, 고체-상태 영상화기(322)가 상부에 장착될 수 잇다. 고체-상태 영상화기(322)는 반도체 재료(예를 들어, 규소)의 층 및 센서(306, 308, 310, 312 및 314)를 포함한다. 도시된 실시형태에서, 센서는 광을 검출하도록 구성된 광다이오드이다. 다른 실시형태에서, 센서는 광 검출기를 포함한다. 고체-상태 영상화기(322)는 CMOS-기반 제조 공정을 통해서 단일 칩으로서 제조될 수 있다.
고체-상태 영상화기(322)는 플로우 채널(344) 내부로부터 또는 이를 따르는 목적하는 반응을 나타내는 활성도를 검출하도록 구성된 센서(306, 308, 310, 312 및 314)의 조밀한 어레이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 센서는 약 1 내지 3제곱 마이크로미터(㎛²)인 픽셀 면적(또는 검출 면적)을 갖는다. 어레이는 500,000개의 센서, 5백만 개의 센서, 1천만 개의 센서, 또는 심지어는 1억3천만 개의 센서를 포함할 수 있다. 센서(306, 308, 310, 312 및 314)는 목적하는 반응을 나타내는 광의 미리 결정된 파장을 검출하도록 구성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플링 디바이스(304)는 마이크로회로 배열, 예컨대, 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제7,595,883호에 기재된 마이크로회로 배열을 포함한다. 보다 구체적으로, 샘플링 디바이스(304)는 센서(306, 308, 310, 312 및 314)의 평탄한 어레이를 갖는 집적 회로를 포함할 수 있다. 센서(306, 308, 310, 312 및 314)의 어레이는 행 디코더 및 열 증폭기 또는 디코더에 통신 가능하게 커플링될 수 있다. 열 증폭기는 또한 칼럼 아날로그-디지털 변환기(column analog-to-digital converter)(Column ADC/Mux)에 통신 가능하게 커플링될 수 있다. 디지털 신호 프로세서 및 메모리를 비롯한 다른 회로가 상기 성분에 커플링될 수 있다. 샘플링 디바이스(304) 내에 형성된 회로는 신호 증폭, 디지털화, 저장 및 처리 중 적어도 하나를 위해서 구성될 수 있다. 회로는 검출된 형광 광을 수렴 및 분석하고, 검출 데이터를 신호 프로세서(138)와 통신하기 위한 픽셀 신호(또는 검출 신호)를 생성시킬 수 있다. 회로는 또한 샘플링 디바이스(304)에서 추가의 아날로그 및/또는 디지털 신호 처리을 수행할 수 있다. 샘플링 디바이스(304)는 신호 라우팅(routing)을 수행하는 (예를 들어, 픽셀 신호를 신호 프로세서(138)에 전송하는) 전도성 바이어스(330)를 포함할 수 있다. 픽셀 신호는 또한 샘플링 디바이스(304)의 전기 접촉부(332)를 통해서 전송될 수 있다.
그러나, 샘플링 디바이스(304)는 상기 구조 또는 상기에 기재된 바와 같은 용도에 제한되지 않는다. 대안적인 실시형태에서, 샘플링 디바이스(304)는 다른 형태를 가질 수 있다. 예를 들어, 샘플링 디바이스(304)는 플로우 셀에 커플링되거나 또는 내부에 반응 부위를 갖는 플로우 셀과 접속하도록 이동되는 CCD 디바이스, 예컨대, CCD 카메라를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 샘플링 디바이스(304)는 화학 감응성 전계 효과 트랜지스터(chemFET), 이온-감응성 전계 효과 트랜지스터(ISFET), 및/또는 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터(MOSFET)를 비롯한 CMOS-제조된 센서일 수 있다. 이러한 실시형태는 반응 챔버 내의 전기적 특성의 변화를 검출하도록 구성될 수 있는 전계 효과 트랜지스터(FET)의 어레이를 포함할 수 있다. 예를 들어, FET는 다양한 분석물의 존재 및 농도 변화 중 적어도 하나를 검출할 수 있다. 예의 방식에 의해서, FET의 어레이는 수소 이온 농도의 변화를 모니터링할 수 있다. 이러한 샘플링 디바이스는 이러한 FET 어레이의 용도에 대해서 전문이 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2009/0127589호에 보다 상세하게 기재되어 있다.
도 4는 각종 실시형태에서 사용될 수 있는 바이오센서(400)의 단면도를 도시한다. 바이오센서(400)는 염기 콜링 주기 동안 하나를 초과하는 클러스터를 각각 보유할 수 있는 웰(406, 408, 410, 412 및 414)을 갖는다(예를 들어, 웰당 2개의 클러스터). 샘플 표면(334)은 도 3에 도시된 바와 같이 실질적으로 평탄할 수 있다. 그러나, 대안적인 실시형태에서, 샘플 표면(334)은 각각의 웰이 하나 이상의 반응 부위를 갖는 웰(또는 반응 챔버)를 획정하도록 하는 형상일 수 있다. 웰은 예를 들어, 인접한 웰의 반응 부위(들)로부터 하나의 웰의 반응 부위(들)을 효과적으로 분리시키는 웰 벽에 의해서 획정될 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 웰(406, 408, 410, 412 및 414)은 샘플 표면(334)을 따르는 패턴으로 분포될 수 있다. 예를 들어, 웰(406, 408, 410, 412 및 414)은 마이크로어레이와 유사한 방식으로 샘플 표면(334)을 따르는 열 및 행에 위치될 수 있다. 그러나, 웰(406, 408, 410, 412 및 414)의 다양한 패턴이 사용될 수 있음이 이해된다. 특정 실시형태에서, 웰(406, 408, 410, 412 및 414) 각각은 샘플 표면(334) 상에 고정된 생물분자(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)의 하나를 초과하는 클러스터를 포함한다. 예를 들어, 웰(406)은 클러스터 쌍(306AB)을 보유하고, 웰(408)은 클러스터 쌍(308AB)을 보유하고, 웰(410)은 클러스터 쌍(310AB)을 보유하고, 웰(412)은 클러스터 쌍(312AB)을 보유하고, 웰(414)은 클러스터 쌍(314AB)을 보유한다.
센서는 웰 내로부터 방출된 광 신호를 검출하도록 구성된다. 특정 실시형태에서, 픽셀 면적(306', 308', 310', 312' 및 314')은 또한 샘플 표면(334) 상의 대응하는 웰(406, 408, 410, 412 및 414)과 연관될 수 있어서, 웰(406, 408, 410, 412 및 414)로부터 방출된 광은 연관된 픽셀 면적(306', 308', 310', 312' 및 314')에 의해서 수신되고, 대응하는 센서(306, 308, 310, 312 및 314)에 의해서 캡처된다.
실시형태에서, 샘플 표면(334)은, 웰(406, 408, 410, 412 및 414)이 적어도 하나의 미리 결정된 센서(또는 픽셀)에 대해서 공지된 공간적인 위치를 갖도록, 샘플링 디바이스(304)에 대해서 고정된 위치를 갖는다. 적어도 하나의 미리 결정된 센서는 위에 놓인 웰로부터의 목적하는 반응의 활성도를 검출한다. 이와 같이, 웰(406, 408, 410, 412 및 414)은 센서(306, 308, 310, 312 및 314) 중 적어도 하나에 배정될 수 있다. 결국, 샘플링 디바이스(304)의 회로는 미리 결정된 센서(306, 308, 310, 312 및 314)에 의해서 제공되는 픽셀 신호(또는 검출 신호)를 배정된 웰(406, 408, 410, 412 및 414)과 자동 방식으로 연관시키는 커넬을 포함할 수 있다. 예의 방식에 의해서, 픽셀 신호가 도 4에 도시된 센서(306)에 의해서 생성되는 경우, 픽셀 신호는 도 4에 도시된 웰(406)과 자동 방식으로 연관될 것이다. 이러한 구성은 검출 데이터의 처리 및 분석을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 하나의 웰로부터의 픽셀 신호는 행 방식 및/또는 열 방식 디코딩을 기반으로 어레이 상의 특정 위치에서 자동 방식으로 위치될 수 있다.
일부 실시형태에서, 센서(또는 픽셀)는 클러스터 아래에 또는 하부에 존재한다. 다른 실시형태에서, 센서(또는 픽셀)는 클러스터 위에 또는 상부에 존재한다. 추가의 다른 실시형태, 센서(또는 픽셀)는 클러스터의 측면에(예를 들어, 우측 및/또는 좌측에) 존재한다.
센서(또는 픽셀)당 다수의 클러스터 염기 콜
실시형태에서, 개시된 기술은 염기 콜링 주기에서 콜링되는 다수의 클러스터 염기보다 더 적은 센서(또는 픽셀)로부터의 픽셀 신호를 사용함으로써 바이오센서(300)의 처리율을 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 바이오센서(300)가 N개의 능동 센서를 갖는 경우, 개시된 기술은 N개의 능동 센서로부터의 픽셀 신호를 사용하여, N + M개의 클러스터를 염기 콜링하며, 여기서 M은 양의 정수이다. 실시형태에서, 이것은 하기에 기재된 바와 같은, 센서(또는 픽셀)당 다수의 클러스터를 염기 콜링함으로써 달성된다.
실시형태에서, 샘플 표면(334) 상의 센서(또는 픽셀)는 적어도 2개의 클러스터로부터의 발광을 수신하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 센서는 적어도 2개의 클러스터로부터의 발광을 동시에 수신한다.
특정 실시형태에서, 2개의 클러스터의 각각의 발광의 강도는 상당히 상이하여 2개의 클러스터 중 하나는 "밝은" 클러스터이고, 나머지는 "어두운" 클러스터이다. 실시형태에서, 강도 값은 염기 콜링 주기 사이에서 달라지고, 따라서 밝은 것 및 어두운 것의 분류는 주기 사이에서 또한 변화될 수 있다. 다른 실시형태에서, 밝은 클러스터는 "주" 또는 "지배" 클러스터라고 지칭되며, 어두운 클러스터는 "부" 또는 "종속" 클러스터라고 지칭된다. 밝은 클러스터와 어두운 클러스터 간의 방출 강도 값 비의 일부 예는 0.55:0.45, 0.60:0.40, 0.65:0.35, 0.70:0.30, 0.75:0.25, 0.80:0.20, 0.85:0.15, 0.90:0.10, 및 0.95:0.05를 포함한다
추가의 다른 실시형태에서, 적어도 2개의 클러스터는 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터가 아니지만, 대신에 클러스터는 상이한 강도를 갖거나 또는 클러스터는 상이한 유형의 신호를 생성시킨다.
각각의 샘플링 사건(예를 들어, 각각의 조명 단계 또는 각각의 영상 획득 단계) 동안, 신호 프로세서(138)는 적어도 2개의 클러스터 (예를 들어, 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터 둘 다)에 대한 공통의 단일 픽셀 신호를 수신한다. 각각의 샘플링 사건에서 생성된 공통의 단일 픽셀은 적어도 2개의 클러스터(예를 들어, 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터 둘 다)에 대한 또는 이로부터의 광 방출/강도 신호/캡처된 광/감지된 정보를 포함한다/나타낸다/반영한다/보유한다. 다시 말해서, 적어도 2개의 클러스터(예를 들어, 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터 둘 다)는 각각의 샘플링 사건에서 생성된 공통의 단일 픽셀로 인한 것이다. 따라서, 적어도 2개의 클러스터(예를 들어, 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터 둘 다)로부터의 발광은 각각의 샘플링 사건에서 동시에 검출되고, 공통의 단일 픽셀은 적어도 2개의 클러스터(예를 들어, 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터 둘 다)로부터의 발광을 반영한다.
예를 들어, 도 3 및 도 4에서, 클러스터 쌍(306AB)은 센서(306)를 공유하는 2개의 클러스터(306A 및 306B)를 포함한다. 이와 같이, 클러스터(306A)는 각각의 강도 값에 따라서 어두운 클러스터일 수 있고, 클러스터(306B)는 밝은 클러스터일 수 있다. 이어서 신호 프로세서(138)는 염기 콜링 알고리즘을 사용하여 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터로부터의 픽셀 신호를 하기에 기재된 바와 같이 16개의 분포 중 하나로 분류한다. 특정 실시형태에서, 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터는 웰, 예컨대, 웰(406)을 함께 점유한다. 따라서, 클러스터 짝지움은 공유된 픽셀 면적 또는 공유된 웰, 또는 둘 다를 기반으로 정의될 수 있다.
도 5A 및 도 5B는 일 실시형태에 따라서 공유된 센서에 의해서 검출된 각각의 픽셀 신호를 사용한 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터의 염기 콜링을 도시한 산포도(500A 및 500B). 산포도(500A 및 500B)의 X-축은 뉴클레오타이드 염기 A 및 T를 나타내는 주어진 클러스터로부터의 조명을 유도하는 샘플링 사건의 제2 조명 단계 동안 검출된 AT 픽셀 신호를 나타낸다. 산포도(500A 및 500B)의 Y-축은 뉴클레오타이드 염기 C 및 T를 나타내는 주어진 클러스터로부터의 조명을 유도하는 샘플링 사건의 제1 조명 단계 동안 검출된 CT 픽셀 신호를 나타낸다.
산포도(500A)는 신호 프로세서(138)가 밝은 클러스터로부터의 픽셀 신호를 분류하는 4개의 분포(502, 504, 506 및 508)를 나타낸다. 도시된 실시형태에서, 분포(502)는 밝은 클러스터 내의 뉴클레오타이드 염기 C를 나타내고, 분포(504)는 밝은 클러스터 내의 뉴클레오타이드 염기 T를 나타내고, 분포(506)는 밝은 클러스터 내의 뉴클레오타이드 염기 G를 나타내고, 분포(508)는 밝은 클러스터 내의 뉴클레오타이드 염기 A를 나타낸다.
산포도(500B)는 신호 프로세서(138)가 어두운 클러스터로부터의 픽셀 신호를 분류하는 16개의 하위-분포(또는 분포)(502A-D, 504A-D, 506A-D 및 508A-D)를 나타내는데, 산포도(500A)의 4개의 분포 각각(502, 504, 506 및 508)에 대해서 4개의 하위 분포를 갖는다. 도시된 실시형태에서, 문자 "A"로 표시한 하위 분포는 어두운 클러스터 내의 뉴클레오타이드 염기 C를 나타내고, 문자 "B"로 표시한 하위 분포는 어두운 클러스터 내의 뉴클레오타이드 염기 T를 나타내고, 문자 "C"로 표시한 하위 분포는 어두운 클러스터 내의 뉴클레오타이드 염기 G를 나타내고, 문자 "D"로 표시한 하위 분포는 어두운 클러스터 내의 뉴클레오타이드 염기 A를 나타낸다. 다른 실시형태에서, 염기의 상이한 암호가 사용될 수 있다. 신호 프로세서가 어두운 클러스터로부터의 픽셀 신호를 16개의 하위 분포 중 하나로 분류하는 경우, 대응하는 밝은 클러스터의 분류는 어두운 클러스터의 하위 분포를 포함하는 분포에 의해서 결정된다. 예를 들어, 어두운 클러스터가 하위 분포(508B)(뉴클레오타이드 염기 T)로 분류되는 경우, 대응하는 밝은 클러스터에 대한 분포는 (508)(뉴클레오타이드 염기 A)이다. 그 결과, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 A로, 어두운 클러스터를 T로 염기 콜링한다.
도 6은 일 실시형태에 따라서 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터의 클러스터 쌍으로부터의 강도 값에 의해서 생성된 16개의 분포(또는 빈)를 도시한 산포도(600)이다. 실시형태에서, 16개의 빈이 복수의 염기 콜링 주기에 걸쳐서 생성된다. 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터로부터의 픽셀 신호를 조합하고, 그것을 16개의 빈 중 하나에 맵핑한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(612)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 C로 그리고 어두운 클러스터를 C로 염기 콜링한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(614)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 C로 그리고 어두운 클러스터를 T로 염기 콜링한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(616)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 C로 그리고 어두운 클러스터를 G로 염기 콜링한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(618)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 C로 그리고 어두운 클러스터를 A로 염기 콜링한다.
조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(622)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 T로 그리고 어두운 클러스터를 C로 염기 콜링한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(624)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 T로 그리고 어두운 클러스터를 T로 염기 콜링한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(626)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 T로 그리고 어두운 클러스터를 G로 염기 콜링한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(628)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 T로 그리고 어두운 클러스터를 A로 염기 콜링한다.
조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(632)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 G로 그리고 어두운 클러스터를 C로 염기 콜링한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(634)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 G로 그리고 어두운 클러스터를 T로 염기 콜링한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(636)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 G로 그리고 어두운 클러스터를 G로 염기 콜링한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(638)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 G로 그리고 어두운 클러스터를 A로 염기 콜링한다.
조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(642)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 A로 그리고 어두운 클러스터를 C로 염기 콜링한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(644)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 A로 그리고 어두운 클러스터를 T로 염기 콜링한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(646)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 A로 그리고 어두운 클러스터를 G로 염기 콜링한다. 조합된 픽셀 신호가 염기 콜링 주기에 대해서 빈(648)에 맵핑되는 경우, 신호 프로세서(138)는 밝은 클러스터를 A로 그리고 어두운 클러스터를 A로 염기 콜링한다.
도 7A는 일 실시형태에 따른 하나의 염료 및 2개의 조명 단계 서열분석 프로토콜에 대한 염기 콜링 도식을 도시한 검출표(700A)이다. 하나의 형광 염료(또는 동일하거나 또는 유사한 여기/방출 스펙트럼의 2개 이상의 염료)를 사용한 서열분석 반응에서 뉴클레오타이드 혼입을 검출하기 위한 상이한 전략을 구별하는 하나의 방법은, 서열분석 주기 동안 일어나는 형광 전이의 존재 또는 상대적인 부재 또는 그 사이의 수준의 측면에서의 혼입을 특징으로 한다. 이와 같이, 서열분석 전략은 서열분석 주기에 대한 형광 프로파일에 의해서 예시될 수 있다. 본 명세서에 개시된 전략의 경우, "1" 및"0"은 뉴클레오타이드가 신호 상태(예를 들어, 형광에 의해서 검출 가능함)로 존재하는 형광 상태 또는 뉴클레오타이드가 암(dark) 상태(예를 들어, 영상화 단계에서 검출되지 않거나 최소한으로 검출됨)로 존재하는 지의 여부를 나타낸다. "0" 상태는 신호의 전체 결여 또는 부재를 반드시 지칭하는 것은 아니다. 제1 조명 사건에서부터 제2 조명 사건(또는 그 역)에서의 형광 변화가 신뢰할 수 있게 구별될 수 있는 한, 최소 또는 감소된 형광 신호(예를 들어, 배경 신호)는 또한 "0" 상태의 범주에 포함되는 것으로 고려된다. 일 실시형태에서, 하나의 형광 염료(또는 동일하거나 또는 유사한 여기/방출 스펙트럼의 2개의 염료) 및 2개의 조명 사건을 사용하여 서열분석 반응에서 뉴클레오타이드 혼입을 검출 및 결정하기 위한 예시적인 전략이 검출 표(700A)에 예시되어 있다.
도시된 실시형태에서, 제1 조명 단계(AT 신호) 동안, 뉴클레오타이드 염기 A는 표지되거나 또는 온(on)(비트 1로 나타냄)이고, 뉴클레오타이드 염기 C는 표지되지 않거나 오프(off)(비트 0으로 나타냄)이고, 뉴클레오타이드 염기 G는 표지되지 않거나 오프(비트 0으로 나타냄)이고, 뉴클레오타이드 염기 T는 표지되거나 온(비트 1로 나타냄)이다. 제2 조명 단계(CT 신호) 동안, 뉴클레오타이드 염기 A는 표지되지 않거나 또는 오프(비트 0으로 나타냄)이고, 뉴클레오타이드 염기 C는 표지되거나 온(비트 1로 나타냄)이고, 뉴클레오타이드 염기 G는 표지되거나 온(비트 0로 나타냄)이고, 뉴클레오타이드 염기 T는 표지되거나 온(비트 1로 나타냄)이다.
도 7B는 일 실시형태에 따라서 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터의 클러스터 쌍으로부터의 조합된 픽셀 신호(각각의 픽셀 신호는 정보를 포함함)를 16개의 빈 중 하나로 분류하기 위한 분류 도식을 나타낸 염기 콜링 표(700B)이다.
개시된 기술은 공유된 센서의 픽셀 면적 내의 다수의 클러스터 모두로부터 감지된 정보를 나타내는 픽셀 신호를 생성시킨다. 이어서, 일련의 이러한 범(pan)-클러스터 픽셀 신호는 빈에 맵핑되어 클러스터 모두를 염기 콜링한다. 따라서, 각각의 클러스터에 대한 별개의 구별되는 픽셀 신호가 생성되지 않는다. 이것은 영상 획득에서 멀티폴드(multifold) 감소의 이점을 갖기 때문에 서열분석 시간을 줄이고 서열 처리을 가속화시킨다.
픽셀 면적 내에 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터가 염기 콜링되는 도 7B를 고려하기 바란다. 각각의 주기에서, 2개의 픽셀 신호가 샘플링된다: AT 신호 및 CT 신호. 제1 샘플링 사건 동안, 2개의 별개의 AT 신호, 즉, 밝은 클러스터에 대한 것 하나 및 어두운 클러스터에 대한 또 다른 것에 상반되게, 형광 표지된 아데닌(A) 및 티민(T)에 대한 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터 둘 다로부터의 발광은 AT 신호로서 기록된다. 유사하게, 제2 샘플링 사건 동안, 2개의 별개의 CT 신호, 즉, 밝은 클러스터에 대한 것 하나 및 어두운 클러스터에 대한 또 다른 것에 상반되게, 형광 표지된 사이토신(C) 및 티민(T)에 대한 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터 둘 다로부터의 발광은 CT 신호로서 기록된다.
두 클러스터로부터의 이러한 방식의 발광이 단일 샘플링 사건 동안 수신되고, 공통의 단일 픽셀 신호를 산출한다. 따라서, 각각의 샘플링 사건에 대해서, 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터 둘 다로부터의 방출은 공통의 단일 픽셀 신호로 함께 표현된다.
추가로, 공통의 단일 일련의 픽셀 신호를 사용하여 각각의 주기에서 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터 둘 다를 함께 염기 콜링한다. 도 7B에서, AT 및 CT 신호는 함께 공통의 단일 일련의 픽셀 신호를 형성한다. 따라서, 개시된 기술은 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터를 별개로 염기 콜링하기 위해서, 2개의 별개의 일련의 픽셀 신호, 즉, 밝은 클러스터에 대한 것 하나 및 어두운 클러스터에 대한 또 다른 것을 사용하지 않는다. 이것은 신호 처리에서 멀티폴드 감소의 이점을 갖기 때문에 서열분석 시간을 줄이고 서열 처리을 가속화시킨다.
개시된 염기 콜링은 공통의 단일 일련의 픽셀 신호를 빈에 맵핑하는 것을 포함한다. 예를 들어, 도 7B에서, 값 1 및 0을 사용하여, 일련의 AT 및 CT 신호는 빈 1에 맵핑되고, 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터는 각각 염기 콜링 A 및 A에 배정된다.
도 7B에 도시된 예에서, 0.7:0.3의 결정적인 밝은 클러스터 대 어두운 클러스터 강도 비가 사용된다. 실시형태에서, 강도 비는 미결정적이며, 따라서, 그것은 픽셀 면적을 공유하거나 웰을 공유하거나 또는 둘 다인 검출 가능한 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터를 생성시킨다.
0.7:0.3인 강도비(즉, 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터로부터의 발광의 강도 값이 상이함)의 결과로서, 복수의 염기 콜링 주기에 걸친 2개의 조명 단계 동안 공유된 센서로부터의 픽셀 신호 판독은 16개의 빈(701)(빈 1 내지 16)을 생성시킨다. 각각의 빈은 픽셀 신호 값의 고유한 쌍(예를 들어, 빈 1의 경우 고유한 쌍(710))을 갖고, 그 쌍은 제1 조명 단계에서 2개의 클러스터에 대한 제1 픽셀 신호 값(706)(AT 신호) 및 제2 조명 단계에서 2개의 클러스터에 대한 제2 픽셀 신호 값(708)(CT 신호)을 포함한다.
각각의 픽셀 신호 값(706 또는 708)는 결국 2개의 신호 부분(706A 및 706B) 또는 (708A 및 708B)으로 구성되는데, 이것은 상가적으로 조합되어 상응하는 픽셀 신호 값(706 또는 708)을 생성시킨다. 따라서, 공통의 단일 픽셀 신호가 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터 둘 다에 대해서 생성된다.
각각의 픽셀 신호 값(706 또는 708)의 경우, 제1 신호 부분(706A 또는 708A)은 제1 클러스터에 의한 발광의 강도 값으로부터 결정되고, 제2 신호 부분(706B 또는 708B)은 제2 클러스터에 의한 발광의 강도 값으로부터 결정된다. 염기 콜링 표(700B)에 제시된 예에서, 제1 클러스터는 밝은 클러스터(702)이고, 제2 클러스터는 어두운 클러스터(704)이다.
강도 비가 0.7:0.3이기 때문에, 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호는 4개의 가능한 값 - 1, 0, 0.7 또는 0.3 중 하나를 가질 수 있다. 추가로, 밝은 클러스터가 "온" 비트를 생성시키는 경우, 그의 기여 또는 신호 부분(706A, 708A)은 0.7이다. 이에 반해서, 어두운 클러스터가 "온" 비트를 생성시키는 경우, 그의 기여 또는 신호 부분(706B, 708B)은 0.3이다. "오프" 비트를 나타내는 기여 또는 신호 부분은 두 클러스터 다에 대해서 0에 의해서 식별된다. 4개의 가능한 값 1, 0, 0.7 및 0.3의 16개의 고유한 조합은 16개의 빈(701)을 생성시킨다.
16개의 빈(701)이 복수의 염기 콜링 주기에 걸쳐서 공유된 센서 또는 웰 위에 놓인 밝은-어두운 클러스터 쌍에 대해서 신호 프로세서(138)에 의해서 식별되면, 신호 프로세서(138)는 염기 콜링 표(700B)를 사용하여 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터를 연속적인 염기 콜링 주기로 염기 콜링한다. 일 실시형태에서, 식별은 웰을 하나 초과의 클러스터(즉, 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터)를 보유하는 것으로서 분류한다. 따라서, 연속적인 염기 콜링 주기에서, 신호 프로세서는 제1 조명 단계에 대해서 공유된 센서의 제1 픽셀 판독(AT 신호)을 수행한다. 이러한 제1 픽셀 판독은 제1 픽셀 신호를 생성시킨다. 유사하게, 제2 조명 단계에 대한 제2 픽셀 판독(CT 신호)은 제2 픽셀 신호를 생성시킨다. 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호는 강도 값을 생성시키고 이것은 조합되어 값 쌍을 형성한다. 이러한 값 쌍은 염기 콜링 표(700B)의 16개의 고유한 값 쌍 중 하나와 비교될 수 있다. 이러한 비교를 기반으로, 16개의 빈 중 하나가 선택된다. 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터에 대한 염기 콜은 선택된 빈에 배정된 뉴클레오타이드 염기에 따라서 수행된다. 이러한 과정은 후속 염기 콜링 주기에 대해서 반복되어 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터의 각각의 뉴클레오타이드 서열에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별한다.
따라서, 개시된 기술은 상대적인 강도와 무관하게, 모든 클러스터로부터의 방출을 염기 콜링에 유용한 것으로서 간주한다. 이는, 더 약한 방출을 갖는 클러스터(예를 들어, 어두운 클러스터)가 별개로 염기 콜링되지 않고; 대신에 그것은 더 강한 방출 및 더 약한 방출 둘 다를 보유하는 공통의 단일 일련의 픽셀 신호를 사용하여 더 강한 방출을 갖는 클러스터(예를 들어, 밝은 클러스터)와 함께 염기 콜링되기 때문이다.
상기에 논의된 바와 같이, 공유된 센서는 2개의 상이한 클러스터(예를 들어, 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터)로부터의 광자를 캡처한다. 일부 실시형태에서, 신호 부분은 공유된 센서로부터의 신호 해석을 디콘볼루션하여 클러스터 각각에 의해서 생성된 개별 신호 부분을 구별함으로써 검출된다.
도 8은 일 실시형태에 따라서 픽셀 면적을 공유한 복수의 클러스터에 의해서 방출된 픽셀 신호의 분석에 의한 염기 콜링의 방법(800)을 도시한다. 작업(802)에서, 염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적 내의 다수의 클러스터로부터 수렴된 광을 나타내는 제1 픽셀 신호가 검출된다. 일부 실시형태에서, 제1 픽셀 면적은 샘플 표면(334) 상의 연관된 웰로부터의 광을 수신한다. 다른 실시형태에서, 제1 픽셀 면적은 샘플 표면(334) 상의 하나를 초과하는 연관된 웰로부터 광을 수신한다.
작업(804)에서, 염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적 내의 다수의 클러스터로부터 수렴된 광을 나타내는 제2 픽셀 신호가 검출된다.
실시형태에서, 제1 픽셀 면적은 제1 픽셀 면적을 공유하는 복수의 클러스터 아래에 존재한다. 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호는 제1 센서에 의해서 제1 픽셀 면적으로부터 수렴될 수 있다. 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호는 제1 센서에 의해서 수렴된 픽셀 신호를 처리하도록 구성된 신호 프로세서(138)에 의해서 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 조명 단계는 제1 클러스터 및 제2 클러스터로부터의 조명을 유도하여 표지된 뉴클레오타이드 염기 A 및 T로부터 방출을 생성시킬 수 있고, 제2 조명 단계는 제1 클러스터 및 제2 클러스터로부터의 조명을 유도하여 표지된 뉴클레오타이드 염기 C 및 T로부터 방출을 생성시킬 수 있다.
작업(806)에서, 방법은 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 조합을 사용하여 염기 콜링 주기 동안 복수의 클러스터의 각각의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 이것은 제1 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하고, 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및 염기 콜링을 위해서 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 조합하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 방법(800)을 적용하여 염기 콜링 주기 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별한다. 실시형태에서, 방법(800)을 연속적인 염기 콜링 주기에 걸쳐서 반복하여 염기 콜링 주기 각각 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별한다.
일부 실시형태에서, 염기 콜링 주기 각각에 대해서, 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터에 의해서 방출된 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호가 검출 및 저장된다. 염기 콜링 주기 후에, 제1 픽셀 신호와 제2 픽셀 신호의 조합을 사용하여 이전 염기 콜링 주기 각각 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별한다.
도 9는 일 실시형태에 따라서 바이오센서(300)의 샘플 표면(334) 상에 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 픽셀 면적을 식별하고, 식별된 픽셀 면적에서 클러스터를 염기 콜링하는 방법(900)이 제공된다. 작업(902)에서, 복수의 염기 콜링 주기가 수행된다. 각각의 염기 콜링 주기는 제1 조명 단계 및 제2 조명 단계를 갖는다.
작업(904)에서, 샘플 표면(334)의 픽셀 면적과 연관된 센서는 - (a) 염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 생성된 제1 세트의 강도 값, 및 (b) 염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 생성된 제2 세트의 강도 값을 캡처한다. 실시형태에서, 강도 값은 정규화된다. 또한, 일부 실시형태에서, 픽셀 면적은 샘플 표면(334) 상의 연관된 웰로부터의 광을 수신한다.
작업(906)에서, 신호 프로세서(138)는 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값을 이러한 예에서 16개의 분포를 포함하는 분포 세트 중 하나(여기서 분포는 도 6의 2차원 플롯의 면적임)에 피팅시키고(도 6에 도시됨), 피팅을 기초로, 픽셀 면적을 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 것으로서 분류한다. 실시형태에서, 신호 프로세서(138)는 16개의 분포를 피팅하기 위해서 하나 이상의 알고리즘을 사용한다. 알고리즘의 예는 k-평균 군집화 알고리즘, k-평균-유사 군집화 알고리즘, 기댓값 최대화 알고리즘 및 히스토그램 기반 알고리즘을 포함한다
작업(908)에서, 연속적인 염기 콜링 주기에 대해서, 신호 프로세서(138)는 픽셀 면적에서 클러스터 군에 대한 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값을 검출한다. 작업(910)에서, 신호 프로세서(138)는 16개의 분포 중에서 클러스터 군에 대한 분포를 선택한다. 분포는 클러스터 군의 각각의 클러스터에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별한다.
일부 실시형태에서, 강도 비는 상당히 상이한 발광을 생성시키는 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터의 내재하는 특성이다. 다른 실시형태, 클러스터 간의 강도 비 및 상당히 상이한 발광은, 하기 실시형태, 예컨대, 편평한 표면 상의 클러스터의 불균일 분포, 센서(또는 픽셀)당 이중 웰 및 탈축 조명에 의해서 거동된다.
불균일하게 분포된 클러스터의 편평한 표면-기반 공간 분석
도 10은 일 실시형태에 따라서 복수의 클러스터(원으로 도시됨)가 불균일하게 분포된 픽셀 면적(사각형으로 도시됨)을 갖는 샘플 표면(334)의 평면도(1000)를 도시한다. 표면 웰(334) 상의 클러스터의 위치는 센서(또는 픽셀)의 위치에 상대적인 웰에 의해서 경계지어지지 않을 수 있다. 샘플 표면(334) 상의 클러스터의 이러한 배열은 불균일 분포라고 지칭된다. 특정 실시형태에서, 클러스터는 웰을 포함하지 않는 샘플 표면(334)의 "편평한" 구성 상에 불균일하게 분포된다. 이러한 편평한 표면 실시형태에서, 픽셀 면적은 중첩될 수 있다.
도시된 실시형태에서, 4개의 픽셀 면적(A, B, C 및 D)을 공유하는 2개의 예시적인 클러스터(1002 및 1004)를 고려하기 바란다. 픽셀 면적 A, B, C 및 D의 중심에 대한 클러스터의 상대적인 위치에 따라서, 대응하는 센서(또는 픽셀)는 상이한 발광 양을 수신한다. 이것은 서열분석 실시의 복수의 염기 콜링 주기에 걸쳐서 클러스터(1002 및 1004) 사이에 차등 크로스스톡을 생성시키는 조명 패턴을 생성시키고, 이것을 사용하여 하기에 기술된 바와 같이, 샘플 표면(334) 상에 클러스터 위치의 맵을 구축할 수 있다. 차등 크로스스톡은 하나의 픽셀 신호의 2개 이상의 클러스터로부터의 정보로서 픽셀 신호에 내재된다.
신호 프로세서(138)는 클러스터에 대한 복수의 일련의 픽셀 신호의 시간 순서 및 공간 분석을 실행하여 샘플 표면(334) 상에 불균일하게 분포된 개별 클러스터에 대응하는 조명의 패턴을 검출한다. 복수의 일련의 픽셀 신호는 픽셀 면적 상의 불균일 분포로부터 발생된 적어도 2개의 클러스터 간의 차등 크로스스톡을 암호화한다.
공간 분석은 픽셀 면적의 군으로부터 수렴된 일련의 픽셀 신호를 사용하여 샘플 표면(334) 상의 주어진 클러스터의 위치를 비롯한, 주어진 클러스터의 공간적 특징을 결정하는 것을 포함한다. 클러스터 위치 및 이의 조명 패턴이 복수의 염기 콜링 주기에 걸쳐서 식별된 후, 클러스터는 상기에 논의된 서열분석 프로토콜 중 하나를 사용하여 신호 프로세서(138)에 의해서 염기 콜링될 수 있다.
공간 분석 실시형태에서, 개시된 기술은 N개의 센서(또는 픽셀)를 사용하여 샘플 표면(334) 상에 N + M개(여기서 M은 양의 정수임)의 불균일하게 분포된 클러스터를 위치시키고, 염기 콜링함으로써 바이오센서(300)의 처리율을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, M은 N과 동일하거나 N과 거의 동일하다. 다른 실시형태에서, 픽셀 면적 및/또는 웰을 공유(또는 함께 점유)하는 2개의 클러스터가 강도 값의 부적절한 차이로 인해서 별개로 검출 가능하지 않은 경우, M은 N과 동일하지 않을 수 있거나 심지어는 N보다 더 작을 수 있다.
센서(또는 픽셀)당 이중 웰
도 11A는 일 실시형태에 따라서 지배(또는 주요) 웰 및 종속(또는 부수적인) 웰을 포함하는, 픽셀 면적당 2개의 웰을 갖는 샘플 표면의 측면도(1100A)를 도시한다. 도 11B는 도 11A의 샘플 표면의 평면도(1100B)를 도시한다.
도시된 실시형태에서, 공유된 센서(1106)(또는 픽셀)는 샘플 표면(334) 상의 2개의 웰(1102 및 1104)에 대응한다. 지배 웰은 종속 웰의 픽셀 면적보다 더 넓은 단면을 가질 수 있다. 웰(1104)은 지배 웰이고, 웰(1102)은 종속 웰인데, 그 이유는 웰(1104)이 센서(1106)보다 픽셀 면적에 걸쳐서 더 넓은 단면을 갖기 때문이다.
실시형태에서, 2개의 웰은 픽셀 면적(1106')의 중심에 대해서 상이한 오프셋을 갖는다. 도시된 실시형태에서, 지배 웰(1104)은 종속 웰(1102)보다 픽셀 면적 중심(1106A)에 더 가깝다(즉, 지배 웰(1104)은 종속 웰(1102)보다 픽셀 면적 중심(1106A)에 대해서 더 작은 오프셋을 갖는다).
차등 단편 커버리지 및 상대적인 오프셋 결과로 인해서, 센서(1106)는 염기 콜링 주기(또는 샘플링 사건)의 조명 단계 동안 2개의 웰로부터 상이한 양의 조명을 수신한다. 웰(1102 및 1104) 각각이 대응하는 클러스터(1102A 및 1104A)를 보유하기 때문에, 상이한 양의 조명은 클러스터 중 하나를 밝은 것(또는 주요)으로서 그리고 나머지 것을 어두운 것(또는 부수적인)으로서 식별하는 것을 가능하게 한다. 도시된 실시형태에서, 지배 웰(1102) 내의 클러스터(1102A)는 밝은 클러스터로서 식별되고, 종속 웰(1104) 내의 클러스터(1104A)는 어두운 클러스터로서 식별된다. 실시형태에서, 센서(1106)는 종속 웰(1104) 내의 어두운 클러스터(1104A)로부터 수신된 조명의 양보다 더 많은 밝은 클러스터(1102A)로부터의 조명의 양을 수신한다.
밝은 클러스터 및 어두운 클러스터가 식별된 후, 그들은 상기에 논의된 서열분석 프로토콜 중 하나를 사용하여 신호 프로세서(138)에 의해서 염기 콜링될 수 있다. 센서(또는 픽셀) 당 일부 이중 웰 실시형태에서, 개시된 기술은, 하나의 공유된 센서(1106)를 사용하여 2개의 대응하는 웰(1102 및 1104)에 의해서 보유된 2개의 클러스터(1102A 및 1102B)를 염기 콜링함으로써 바이오센서(300)의 처리율을 증가시킨다. 다른 센서(또는 픽셀)당 이중 웰 실시형태에서, 개시된 기술은 N개의 센서를 사용하여 샘플 표면(334)의 대응하는 N + M개의 웰 상의 N + M개의 클러스터를 염기 콜링함으로써 바이오센서(300)의 처리율을 증가시킨다(여기서 M은 양의 정수임). 일부 실시형태에서, M은 N과 동일하거나 N과 거의 동일하다. 다른 M은 N과 동일하지 않을 수 있거나 심지어는 N보다 더 작을 수 있다.
탈축 조명
도 12A 및 도 12B는 샘플 표면의 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 탈축 조명(1200A 및 1200B)를 나타낸다. 조명 시스템(109)은 염기 콜링 주기의 조명 단계 동안 상이한 각도의 조명 신호(1201 및 1211)를 사용하여 (센서(1204 및 1214)와 연관된) 픽셀 면적(1204' 및 1214')을 조명하도록 구성된다. 그 결과, 웰(1202 및 1212)은 탈축 또는 비-직교 조명 신호로 조명된다. 이것은 각각의 웰 내의 명암 색조 면적으로 도 12A 및 도 12B에 도시된, 웰(1202 및 1212) 각각의 비대칭적으로 조명되는 웰을 생성시킨다. 비대칭적으로 조사된 웰의 웰 영역은 적어도 지배 웰 영역(1202B' 또는 1212A'(더 밝은 색조로 도시됨))및 종속 웰 영역(1202A' 또는 1212 B'(더 어두운 색조로 도시됨)을 포함할 수 있어서, 염기 콜링 주기 동안 지배 웰 영역은 종속 웰 영역보다 더 많이 조사된다.
각각의 웰은 염기 콜링 주기 동안 하나를 초과하는 클러스터를 보유하도록 구성되며, 지배 웰 영역 및 종속 웰 영역 각각은 클러스터를 포함한다. 도시된 실시형태에서, 웰(1202)은 종속 웰 영역(1202A') 내의 클러스터(1202A) 및 지배 웰 영역(1202B') 내의 클러스터(1202B)인, 2개의 클러스터(1202A 및 1202B)를 보유한다. 웰(1212)은 지배 웰 영역(1212A') 내의 클러스터(1212A) 및 종속 웰 영역(1202B') 내의 클러스터(1212B)인 2개의 클러스터(1212A 및 1212B)를 보유한다.
탈축 조명으로 인해서, 웰(1202 및 1212)의 픽셀 면적(1204' 및 1214')은 웰의 지배 영역 및 종속 영역으로부터 상이한 양의 조명을 수신하다. 그 결과, 염기 콜링 주기 동안, 지배 웰 영역 내의 클러스터는 종속 웰 영역 내의 클러스터보다 더 많은 양의 조명을 생성시킨다. 각각의 웰의 경우, 이것은 클러스터 중 하나를 밝은 것(또는 주요)으로서 그리고 나머지 것을 어두운 것(또는 부수적인)으로서 식별하는 것을 가능하게 한다. 도시된 실시형태에서, 웰(1202)의 경우, 지배 웰 영역(1202B') 내의 클러스터(1202B)는 밝은 클러스터로서 식별되고, 종속 웰 영역(1202A') 내의 클러스터(1202A)는 어두운 클러스터로서 식별된다. 웰(1212)의 경우, 지배 웰 영역(1212A') 내의 클러스터(1212A)는 밝은 클러스터로서 식별되고, 종속 웰 영역(1212B') 내의 클러스터(1212B)는 어두운 클러스터로서 식별된다.
밝은 클러스터 및 어두운 클러스터가 각각의 웰에 대해서 식별된 후, 그들은 상기에 논의된 서열분석 프로토콜 중 하나를 사용하여 신호 프로세서(138)에 의해서 염기 콜링될 수 있다. 탈축 조명 실시형태에서, 개시된 기술은 N개의 센서(또는 픽셀)를 사용하여 샘플 표면(334) 상의 N개의 비직교적으로 조명되는 웰 내의 N + M개(여기서 M은 양의 정수임)의 클러스터를 염기 콜링함으로써 바이오센서(300)의 처리율을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, M은 N과 동일하거나 N과 거의 동일하다. 다른 실시형태에서, 픽셀 면적 및/또는 웰을 공유(또는 함께 점유)하는 2개의 클러스터가 강도 값의 부적절한 차이로 인해서 별개로 검출 가능하지 않은 경우, M은 N과 동일하지 않을 수 있거나 심지어는 N보다 더 작을 수 있다.
일 실시형태에서, 탈축 조명은 45도 각이다. 일부 실시형태에서, 픽셀 면적당 하나의 웰이 위에 놓인다. 다른 실시형태, 픽셀 면적당 2개의 웰이 위에 놓인다.
도 12C는 일 실시형태에 따라서 도 12A 및 도 12B의 축외 조명에 의해서 생성된 비대칭적으로 조명되는 웰 영역(1200C)을 도시한다. 도 12C에 나타낸 바와 같이, 웰 영역(1220)은 웰 영역(1230)보다 더 많이 조명된다.
조항
본 개시내용은 또한 하기 조항을 포함한다:
1. 염기 콜링용 디바이스로서;
용기 및 바이오센서로서, 용기는 바이오센서를 보유하고, 바이오센서는,
일련의 샘플링 사건 동안 복수의 클러스터를 보유하는 샘플 표면,
복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 구성된 센서의 어레이로서, 어레이는 N개의 능동 센서를 갖고, 어레이 내의 센서는 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 샘플 표면에 대해서 배치되는, 상기 센서의 어레이, 및
복수의 일련의 픽셀 신호를 출력해 내는 통신 포트
를 갖는, 상기 용기 및 바이오센서; 및
용기에 커플링되고, 복수의 일련의 픽셀 신호를 수신 및 처리하여, 복수의 일련의 픽셀 신호를 사용하여 N개의 능동 센서로부터의 복수의 클러스터 내의 N + M개의 클러스터(여기서 M은 양의 정수임)에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하는 것을 비롯한, 복수의 클러스터 내의 클러스터에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하도록 구성되는, 신호 프로세서를 포함하는, 염기 콜링용 디바이스.
2. 조항 1에 있어서, 일련의 샘플링 사건의 결과는 클러스터 내의 뉴클레오타이드 염기에 대응하는, 디바이스.
3. 조항 1 또는 조항 2에 있어서, 샘플링 사건은 시간 순서의 2개의 조명 단계를 포함하고, 복수의 일련의 픽셀 신호에서 일련의 픽셀 신호는 각각의 샘플링 사건에 대한 신호 샘플의 세트를 포함하고, 세트는 2개의 조명 단계 각각으로부터의 적어도 하나의 픽셀 신호를 포함하는, 디바이스.
4. 조항 3에 있어서, 신호 프로세서는 센서의 어레이 내의 단일 센서로부터의 일련의 픽셀 신호로부터 2개의 클러스터에 대한 결과를 분류하기 위한 로직을 포함하는, 디바이스.
5. 조항 4에 있어서, 2개의 클러스터에 대한 결과를 분류하기 위한 로직은 특정 센서로부터의 샘플링 사건에 대한 신호 샘플의 세트의 제1 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하고, 샘플링 사건으로부터의 신호 샘플의 세트의 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 논리적으로 조합하여 두 클러스터에 대한 결과를 분류하는 단계를 포함하는, 디바이스.
6. 조항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 센서의 어레이 내의 센서는 광 검출기를 포함하는, 디바이스.
7. 조항 1 또는 조항 6에 있어서, 샘플링 사건은 시간 순서의 2개의 조명 단계를 포함하고, 복수의 일련의 픽셀 신호에서 일련의 픽셀 신호는 각각의 샘플링 사건에 대한 신호 샘플의 세트를 포함하고, 세트는 2개의 조명 단계 각각으로부터의 적어도 하나의 픽셀 신호를 포함하고, 제1 조명 단계는 뉴클레오타이드 염기 A 및 T를 나타내는 주어진 클러스터로부터 조명을 유도하고, 제2 조명 단계는 뉴클레오타이드 염기 C 및 T를 나타내는 주어진 클러스터로부터 조명을 유도하고, 상기 분류 결과는 뉴클레오타이드 염기 A, C, T 또는 G 중 하나를 콜링하는 것을 포함하는, 디바이스.
8. 조항 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 샘플 표면은 픽셀 면적 상에 불균일하게 분포되는 클러스터를 보유하고, 신호 프로세서는 복수의 일련의 픽셀 신호의 시간 순서 및 공간 분석을 실행하여 샘플 표면 상의 개별 클러스터에 대응하는 조명의 패턴을 검출하고, 개별 클러스터에 대한 샘플링 사건의 결과를 분류하되, 복수의 일련의 픽셀 신호는 픽셀 면적 상의 불균일 분포로부터 발생된 적어도 2개의 클러스터 간의 차등 크로스스톡을 암호화하는, 디바이스.
9. 조항 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 샘플 표면은 픽셀 면적당 2개의 웰을 포함하는 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함하되, 픽셀 면적당 2개의 웰은 지배 웰 및 종속 웰을 포함하고, 지배 웰은 종속 웰의 픽셀 면적보다 더 넓은 단면을 갖는, 디바이스.
10. 조항 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 샘플 표면은 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함하고, 샘플링 사건은 K개의 조명 단계를 갖는 적어도 하나의 화학적 단계를 포함하되, K는 양의 정수이며, K개의 조명 단계의 조명 단계는 픽셀 면적을 상이한 각의 조명으로 조명하고, 일련의 픽셀 신호는 각각의 샘플링 사건에 대한 신호 샘플의 세트를 포함하고, 세트는 샘플링 사건의 적어도 하나의 화학적 단계에 대해서 K개의 픽셀 신호를 포함하는, 디바이스.
11. 조항 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 샘플 표면은 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함하고, 샘플링 사건은 K개의 조명 단계를 갖되, K는 양의 정수이고, K개의 조명 단계의 조명 단계는 픽셀 면적을 상이한 각의 조명으로 조명하는 제1 화학적 단계, 및 J개의 조명 단계를 갖되, J는 양의 정수인 제2 화학적 단계를 가지며, 제1 화학적 단계의 상기 K개의 조명 단계 및 제2 화학적 단계의 J개의 조명 단계의 조명 단계는 웰의 어레이 내의 웰을 상이한 각의 조명으로 조명하고, 일련의 픽셀 신호는 각각의 샘플링 사건에 대한 신호 샘플의 세트를 포함하고, 세트는 제1 화학적 단계에 대해서 K개의 픽셀 신호 및 샘플링 사건의 제2 화학적 단계에 대해서 J개의 픽셀 신호를 포함하는, 디바이스.
12. 염기 콜링용 바이오센서로서,
샘플링 디바이스로서, 상기 샘플링 디바이스는 픽셀 면적의 어레이를 갖는 샘플 표면 및 센서의 어레이를 갖는 고체-상태 영상화기를 포함하고, 각각의 센서는 각각의 염기 콜링 주기에서 픽셀 신호를 생성시키고, 각각의 픽셀 신호는 샘플 표면의 대응하는 픽셀 면적으로부터 수렴된 광을 나타내는, 상기 샘플링 디바이스; 및
염기 콜링 주기에서 상기 염기 콜링용 센서로부터 상기 픽셀 신호를 수신 및 처리하며, 염기 콜링 주기에서 염기 콜링된 다수의 클러스터보다 더 적은 센서로부터의 픽셀 신호를 사용하는 상기 샘플링 디바이스에 대한 연결을 위해서 구성된 신호 프로세서
를 포함하는, 바이오센서.
13. 조항 12에 있어서, 픽셀 면적은 샘플 표면 상의 웰로부터 광을 수신하고, 웰은 염기 콜링 주기 동안 하나를 초과하는 클러스터를 보유하도록 구성되는, 바이오센서.
14. 조항 13에 있서서, 클러스터는 동일한 핵산 서열을 갖는 복수의 단일-가닥의 데옥시리보핵산(약칭 DNA) 단편을 포함하는, 바이오센서.
15. 염기 콜링의 컴퓨터 구현 방법으로서,
합성에 의한 서열분석(약칭 SBS)의 염기 콜링 주기 실시를 위해서, 통신 포트로부터
복수의 일련의 픽셀 신호를 수신하는 단계로서, 복수의 일련의 픽셀 신호는 센서의 어레이에 의해서 생성되고, 어레이는 N개의 능동 센서를 갖고, 어레이 내의 센서는 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 샘플 표면에 대해서 배치되는, 상기 수신하는 단계; 및
복수의 일련의 픽셀 신호를 처리하여, 복수의 일련의 픽셀 신호를 사용하여 N개의 능동 센서로부터의 복수의 클러스터 내의 N + M개의 클러스터(여기서 M은 양의 정수임)에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하는 것을 비롯하여, 복수의 일련의 픽셀 신호를 사용하여 복수의 클러스터 내의 클러스터에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하는 것을 비롯한, 복수의 클러스터 내의 클러스터에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하는 단계를 포함하는, 방법.
16. 조항 15에 있어서,
염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적으로부터 수렴된 광을 나타내는 제1 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하고, 염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적으로부터 수렴된 광을 나타내는 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및
제1 픽셀 신호 및 상기 제2 픽셀 신호의 맵핑을 조합하여 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 더 포함하는, 방법.
17. 조항 15 또는 조항 16에 있어서, 방법을 적용하여 염기 콜링 주기 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 더 포함하는, 방법.
18. 조항 17에 있어서, 방법을 연속적인 염기 콜링 주기에 걸쳐서 반복하여 염기 콜링 주기 각각 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 더 포함하는, 방법.
19. 조항 18에 있어서,
염기 콜링 주기 각각에 대해서, 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터에 의해서 방출된 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호를 검출 및 저장하는 단계, 및
염기 콜링 주기 후에, 제1 픽셀 신호와 제2 픽셀 신호의 조합을 사용하여 이전 염기 콜링 주기 각각 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
20. 조항 16 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 제1 픽셀 면적은 샘플 표면 상의 연관된 웰로부터 광을 수신하는, 방법.
21. 조항 20에 있어서, 제1 픽셀 면적은 샘플 표면 상의 하나를 초과하는 연관된 웰로부터 광을 수신하는, 염기 콜링 방법.
22. 조항 16 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호는 제1 센서에 의해서 제1 픽셀 면적으로부터 수렴되는, 방법.
23. 조항 22에 있어서, 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호는 제1 센서에 의해서 수렴된 픽셀 신호를 처리하도록 구성된 신호 프로세서에 의해서 검출되는, 방법.
24. 조항 15 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 제1 조명 단계는 제1 클러스터 및 제2 클러스터로부터 조명을 유도하여 표지된 뉴클레오타이드 염기 A 및 T로부터 방출을 생성시키고, 제2 조명 단계는 제1 클러스터 및 제2 클러스터로부터 조명을 유도하여 표지된 뉴클레오타이드 염기 C 및 T로부터 방출을 생성시키는, 방법.
25. 조항 15 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기 콜링은 조항 1 내지 11 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 디바이스를 사용하는 것을 포함하는, 방법.
26. 바이오센서의 샘플 표면 상에 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 픽셀 면적을 식별하고, 식별된 픽셀 면적에서 클러스터를 염기 콜링하는 방법으로서,
복수의 염기 콜링 주기를 수행하는 단계로서, 각각의 염기 콜링 주기는 제1 조명 단계 및 제2 조명 단계를 갖는, 상기 복수의 염기 콜링 주기를 수행하는 단계;
샘플 표면의 픽셀 면적과 연관된 센서에서,
염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 생성된 제1 세트의 강도 값, 및
염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 생성된 제2 세트의 강도 값을 캡처하는 단계;
신호 프로세서를 사용하여 16개의 분포를 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값에 피팅시키고, 피팅을 기초로, 픽셀 면적을 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 것으로서 분류하는 단계; 및
연속적인 염기 콜링 주기에 대해서,
신호 프로세서를 사용하여 픽셀 면적에서 클러스터 군에 대한 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값을 검출하는 단계, 및
클러스터 군에 대한 분포를 선택하는 단계로서, 분포는 클러스터 군의 각각의 클러스터에 존재하는 뉴클레타이드 염기를 식별하는, 상기 선택하는 단계
를 포함하는, 방법.
27. 조항 26에 있어서, 상기 피팅은 k-평균 군집화 알고리즘, k-평균-유사 군집화 알고리즘, 기댓값 최대화 알고리즘 및 히스토그램 기반 알고리즘을 비롯한, 하나 이상의 알고리즘을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
28. 조항 26 또는 27에 있어서, 강도 값을 정규화시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
29. 조항 26 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 픽셀 면적은 샘플 표면 상의 연관된 웰로부터 광을 수신하는, 방법.
30. 조항 26 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 식별 및 상기 염기 콜링은 조항 1 내지 11 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 디바이스 또는 조항 12 내지 14 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 바이오센서를 사용하는 것을 포함하는, 방법.
31. 염기 콜링의 컴퓨터 구현 방법으로서,
합성에 의한 서열분석(약칭 SBS) 실시의 염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적으로부터 수렴된 광을 나타내는 제1 픽셀 신호 및 상기 SBS 실시의 상기 염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 상기 제1 픽셀 면적으로부터 수렴된 광을 나타내는 제2 픽셀 신호를 제공하는 단계로서, 제1 픽셀 면적은 제1 픽셀 면적을 공유하는 제1 클러스터 및 제2 클러스터 아래에 존재하는, 상기 제공하는 단계;
적어도 상기 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호를 처리하도록 구성된 신호 프로세서를 제공하는 단계;
상기 신호 프로세서를 사용하여 제1 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하고, 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계; 및
제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 논리적으로 조합하여 상기 염기 콜링 주기 동안 상기 제1 클러스터 및 제2 클러스터 각각 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계
를 포함하는, 방법.
32. 바이오센서의 샘플 표면 상에 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 픽셀 면적을 식별하고, 식별된 픽셀 면적에서 클러스터를 염기 콜링하는 컴퓨터 구현 방법으로서,
염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 생성된 제1 세트의 강도 값, 및 염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 생성된 제2 세트의 강도 값을 제공하는 단계로서, 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값은 샘플 표면의 픽셀 면적과 연관된 센서에서 수렴된 광의 강도를 나타내는, 상기 제공하는 단계;
신호 프로세서를 사용하여 16개의 분포를 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값에 피팅시키고, 피팅을 기초로, 픽셀 면적을 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 것으로서 분류하는 단계; 및
연속적인 염기 콜링 주기에 대해서,
신호 프로세서를 사용하여 픽셀 면적에서 클러스터 군에 대한 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값을 제공하는 단계, 및
클러스터 군에 대한 분포를 선택하는 단계로서, 분포는 클러스터 군의 각각의 클러스터에 존재하는 뉴클레타이드 염기를 식별하는, 상기 선택하는 단계
를 포함하는, 방법.
33. 조항 32에 있어서, 상기 피팅은 k-평균 군집화 알고리즘, k-평균-유사 군집화 알고리즘, 기댓값 최대화 알고리즘 및 히스토그램 기반 알고리즘을 비롯한, 하나 이상의 알고리즘을 사용하는 것을 포함하는, 컴퓨터 구현 방법.
34. 염기 콜링용 디바이스로서;
용기 및 바이오센서로서, 용기는 바이오센서를 보유하고, 바이오센서는,
일련의 샘플링 사건 동안 복수의 클러스터를 보유하도록 구성된 샘플 표면으로서, 샘플 표면은 N개의 픽셀 면적을 포함하고, 샘플링 사건은 시간 순서의 2개의 조명 단계를 포함하는, 상기 샘플 표면,
각각의 픽셀 면적 및 조명 단계에 대해서 적어도 하나의 픽셀 신호를 포함하는 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 구성된 광 검출기를 포함하는 센서의 어레이로서, 어레이는 N개의 픽셀 면적의 대응하는 픽셀 면적과 각각 연관되고, 연관된 픽셀 면적으로부터 수렴된 발광을 검출하도록 구성된 N개의 능동 센서를 가져서, 대응하는 픽셀 면적으로부터 수렴된 발광을 나타내는 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키고, 여기서 샘플 표면은 적어도 하나의 능동 센서가 복수의 클러스터의 클러스터 쌍을 형성하는 적어도 2개의 클러스터로부터의 발광을 검출하도록 구성되고, 2개의 클러스터의 각각의 발광의 강도는 상당히 상이한, 상기 센서의 어레이, 및
복수의 일련의 픽셀 신호를 출력해 내는 통신 포트
를 갖는, 상기 용기 및 바이오센서; 및
용기에 커플링되고, 복수의 일련의 픽셀 신호를 수신 및 처리하여, 센서의 어레이 내의 적어도 하나의 능동 센서로부터의 일련의 픽셀 신호로부터 클러스터 쌍을 형성하는 2개의 클러스터에 대한 결과를 분류함으로써, 복수의 일련의 픽셀 신호를 사용하여 N개의 능동 센서로부터의 복수의 클러스터 내의 N + M개의 클러스터(여기서 M은 양의 정수임)에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하는 것을 비롯한, 복수의 클러스터 내의 클러스터에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하도록 구성되는, 신호 프로세서를 포함하는, 디바이스.
35. 조항 34에 있어서, 일련의 샘플링 사건의 결과는 클러스터 내의 뉴클레오타이드 염기에 대응하고, 바람직하게는 제1 조명 단계는 뉴클레오타이드 염기 A 및 T를 나타내는 주어진 클러스터로부터 조명을 유도하고, 제2 조명 단계는 뉴클레오타이드 염기 C 및 T를 나타내는 주어진 클러스터로부터 조명을 유도하고, 상기 분류 결과는 뉴클레오타이드 염기 A, C, T 또는 G 중 하나를 콜링하는 것을 포함하는, 디바이스.
36. 조항 34 또는 35에 있어서, 2개의 클러스터에 대한 결과를 분류하기 위한 로직은 특정 센서로부터의 샘플링 사건에 대한 신호 샘플의 세트의 제1 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하고, 샘플링 사건으로부터의 신호 샘플의 세트의 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 논리적으로 조합하여 두 클러스터에 대한 결과를 분류하는 단계를 포함하는, 디바이스.
37. 조항 34 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 샘플 표면은 픽셀 면적 상에 불균일하게 분포되는 클러스터를 보유하고, 신호 프로세서는 복수의 일련의 픽셀 신호의 시간 순서 및 공간 분석을 실행하여 샘플 표면 상의 개별 클러스터에 대응하는 조명의 패턴을 검출하고, 개별 클러스터에 대한 샘플링 사건의 결과를 분류하되, 복수의 일련의 픽셀 신호는 픽셀 면적 상의 불균일 분포로부터 발생된 적어도 2개의 클러스터 간의 차등 크로스스톡을 암호화하는, 디바이스.
38. 조항 34 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 샘플 표면은 픽셀 면적당 2개의 웰을 포함하는 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함하되, 픽셀 면적당 2개의 웰은 지배 웰 및 종속 웰을 포함하고, 지배 웰은 종속 웰의 픽셀 면적보다 더 넓은 단면을 갖는, 디바이스.
39. 조항 34 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 샘플 표면은 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함하고, 샘플링 사건은 K개의 조명 단계를 갖는 적어도 제1 화학적 단계를 포함하되, K는 양의 정수이며, K개의 조명 단계의 조명 단계는 픽셀 면적을 상이한 각의 조명으로 조명하고, 일련의 픽셀 신호는 각각의 샘플링 사건에 대한 신호 샘플의 세트를 포함하고, 세트는 샘플링 사건의 적어도 하나의 화학적 단계에 대해서 K개의 픽셀 신호를 포함하고, 여기서 바람직하게는 샘플링 사건은 J개의 조명 단계를 갖는 제2 화학적 단계를 더 포함하되, J는 양의 정수이고, 여기서 제1 화학적 단계의 K개의 조명 단계 및 제2 화학적 단계의 J개의 조명 단계의 조명 단계는 웰의 어레이 내의 웰을 상이한 각의 조명으로 조명하고, 신호 샘플의 세트는 샘플링 사건의 제2 화학적 단계에 대해서 J개의 픽셀 신호를 더 포함하는, 디바이스.
40. 조항 34 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 센서의 어레이는 고체 상태 영상화기에 포함되는, 디바이스.
41. 조항 34 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 픽셀 면적은 샘플 표면 상의 웰로부터 광을 수신하고, 웰은 염기 콜링 주기 동안 하나를 초과하는 클러스터를 보유하도록 구성되고, 여기서 클러스터는 바람직하게는 동일한 핵산 서열을 갖는 복수의 단일-가닥 데옥시리보핵산(약칭 DNA) 단편을 포함하는, 디바이스.
42. 염기 콜링의 컴퓨터 구현 방법으로서,
합성에 의한 서열분석(SBS)의 염기 콜링 주기 실시를 위해서, 통신 포트로부터
복수의 일련의 픽셀 신호를 수신하는 단계로서, 복수의 일련의 픽셀 신호는 광 검출기를 포함하는 센서의 어레이에 의해서 샘플 표면의 N개의 픽셀 면적에 의해서 보유된 복수의 클러스터에 의해서 방출된 광을 기반으로, 시간 순서의 2개의 조명 단계를 포함하는 일련의 샘플링 사건에 대해서 생성되고, 어레이는 N개의 픽셀 면적의 대응하는 픽셀 면적과 각각 연관되고, 연관된 픽셀 면적으로부터 수렴된 발광을 검출하도록 구성된 N개의 능동 센서를 갖고, 센서는 일련의 샘플링 사건 동안 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키고, 일련의 픽셀 신호는 각각의 픽셀 면적 및 조명 단계에 대해서 적어도 하나의 픽셀 신호를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 능동 센서는 복수의 클러스터의 클러스터 쌍을 형성하는 적어도 2개의 클러스터로부터의 발광을 검출하고, 여기서 2개의 클러스터의 각각의 발광의 강도는 상당히 상이한, 상기 수신하는 단계; 및
복수의 일련의 픽셀 신호를 처리하여, 센서의 어레이 내의 적어도 하나의 능동 센서로부터의 일련의 픽셀 신호로부터 클러스터 쌍을 형성하는 2개의 클러스터에 대한 결과를 분류함으로써, 복수의 일련의 픽셀 신호를 사용하여 N개의 능동 센서로부터의 복수의 클러스터 내의 N + M개의 클러스터(여기서 M은 양의 정수임)에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하는 것을 비롯하여, 복수의 일련의 픽셀 신호를 사용하여 복수의 클러스터 내의 클러스터에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하는 것을 비롯한, 복수의 클러스터 내의 클러스터에 대한 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하는 단계
를 포함하는, 방법.
43. 조항 42에 있어서,
염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적으로부터 수렴된 광을 나타내는 제1 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하고, 염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적으로부터 수렴된 광을 나타내는 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계, 및
제1 픽셀 신호 및 상기 제2 픽셀 신호의 맵핑을 조합하여 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계
를 더 포함하는, 방법.
44. 조항 42 또는 조항 43에 있어서, 방법을 적용하여 염기 콜링 주기 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 더 포함하고, 바람직하게는 방법을 연속적인 염기 콜링 주기에 걸쳐서 반복하여 염기 콜링 주기 각각 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 더 포함하고, 보다 바람직하게는,
염기 콜링 주기 각각에 대해서, 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터에 의해서 방출된 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호를 검출 및 저장하는 단계, 및
염기 콜링 주기 후에, 제1 픽셀 신호와 제2 픽셀 신호의 조합을 사용하여 이전 염기 콜링 주기 각각 동안 복수의 픽셀 면적에서 복수의 클러스터 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계
를 더 포함하는, 컴퓨터 구현 방법.
45. 조항 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 하기 중 적어도 하나가 적용되는, 컴퓨터 구현 방법:
제1 픽셀 면적은 샘플 표면 상의 연관된 웰로부터 광을 수신하는 것; 바람직하게는 샘플 표면 상의 하나를 초과하는 연관된 웰로부터 광을 수신하는 것;
제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호는 제1 픽셀 면적으로부터 제1 센서에 의해서 수렴되고, 여기서 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호는 바람직하게는 제1 센서에 의해서 수렴된 픽셀 신호를 처리하도록 구성된 신호 프로세서에 의해서 검출되는 것;
제1 조명 단계는 제1 클러스터 및 제2 클러스터로부터의 조명을 유도하여 표지된 뉴클레오타이드 염기 A 및 T로부터 방출을 생성시키고, 제2 조명 단계는 제1 클러스터 및 제2 클러스터로부터의 조명을 유도하여 표지된 뉴클레오타이드 염기 C 및 T로부터 방출을 생성시키는 것.
46. 조항 42 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기 콜링은 조항 34 내지 41 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 디바이스를 사용하는 것을 포함하는, 컴퓨터 구현 방법.
47. 바이오센서의 샘플 표면 상에 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 픽셀 면적을 식별하고, 식별된 픽셀 면적에서 클러스터를 염기 콜링하는 방법, 바람직하게는 항목 34 내지 46 중 어느 하나의 방법으로서,
복수의 염기 콜링 주기를 수행하는 단계로서, 각각의 염기 콜링 주기는 제1 조명 단계 및 제2 조명 단계를 갖는, 상기 복수의 염기 콜링 주기를 수행하는 단계;
샘플 표면의 픽셀 면적과 연관된 센서에서,
염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 생성된 제1 세트의 강도 값, 및
염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 생성된 제2 세트의 강도 값을 캡처하는 단계;
신호 프로세서를 사용하여 16개의 분포를 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값에 피팅시키고, 피팅을 기초로, 픽셀 면적을 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 것으로서 분류하는 단계; 및
연속적인 염기 콜링 주기에 대해서,
신호 프로세서를 사용하여 픽셀 면적에서 클러스터 군에 대한 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값을 검출하는 단계, 및
클러스터 군에 대한 분포를 선택하는 단계로서, 분포는 클러스터 군의 각각의 클러스터에 존재하는 뉴클레타이드 염기를 식별하는, 상기 선택하는 단계
를 포함하고,
바람직하게는 하기 중 적어도 하나를 적용하는, 방법:
피팅은 k-평균 군집화 알고리즘, k-평균-유사 군집화 알고리즘, 기댓값 최대화 알고리즘 및 히스토그램 기반 알고리즘을 비롯한, 하나 이상의 알고리즘을 사용하는 것을 포함함;
방법은 강도 값을 정규화시키는 단계를 추가로 포함함;
픽셀 면적은 샘플 표면 상의 연관된 웰로부터 광을 수신함; 및
상기 식별 및 염기 콜링은 조항 34 내지 41 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 디바이스를 사용하는 것을 포함함.
48. 염기 콜링의 컴퓨터 구현 방법, 바람직하게는 조항 42 내지 46 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 방법은,
합성에 의한 서열분석(약칭 SBS) 실시의 염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적으로부터 수렴된 광을 나타내는 제1 픽셀 신호 및 상기 SBS 실시의 염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 제1 픽셀 면적으로부터 수렴된 광을 나타내는 제2 픽셀 신호를 제공하는 단계로서, 제1 픽셀 면적은 제1 픽셀 면적을 공유하는 제1 클러스터 및 제2 클러스터 아래에 존재하는, 상기 제공하는 단계;
적어도 상기 제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호를 처리하도록 구성된 신호 프로세서를 제공하는 단계;
상기 신호 프로세서를 사용하여 제1 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하고, 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 단계; 및
제1 픽셀 신호 및 제2 픽셀 신호의 맵핑을 논리적으로 조합하여 염기 콜링 주기 동안 제1 클러스터 및 제2 클러스터 각각 상에 혼입된 뉴클레오타이드 염기를 식별하는 단계를 포함하거나, 또는 상기 방법은 바이오센서의 샘플 표면 상에 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 픽셀 면적을 식별하고, 식별된 픽셀 면적에서 클러스터를 염기 콜링하는 방법이며,
염기 콜링 주기의 제1 조명 단계 동안 생성된 제1 세트의 강도 값, 및 염기 콜링 주기의 제2 조명 단계 동안 생성된 제2 세트의 강도 값을 제공하는 단계로서, 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값은 샘플 표면의 픽셀 면적과 연관된 센서에서 수렴된 광의 강도를 나타내는, 상기 제공하는 단계;
신호 프로세서를 사용하여 16개의 분포를 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값에 피팅시키고, 피팅을 기초로, 픽셀 면적을 하나를 초과하는 클러스터를 갖는 것으로서 분류하는 단계; 및
연속적인 염기 콜링 주기에 대해서,
신호 프로세서를 사용하여 픽셀 면적에서 클러스터 군에 대한 제1 세트의 강도 값 및 제2 세트의 강도 값을 제공하는 단계, 및
클러스터 군에 대한 분포를 선택하는 단계로서, 분포는 클러스터 군의 각각의 클러스터에 존재하는 뉴클레오타이드 염기를 식별하는, 상기 선택하는 단계
를 포함하고, 여기서 피팅은 바람직하게는 k-평균 군집화 알고리즘, k-평균-유사 군집화 알고리즘, 기댓값 최대화 알고리즘 및 히스토그램 기반 알고리즘을 비롯한, 하나 이상의 알고리즘을 사용하는 것을 포함하는, 컴퓨터 구현 방법.

Claims (18)

  1. 염기 콜링용 디바이스(device for base calling)로서,
    바이오센서를 보유하도록 구성된 용기로서, 상기 바이오센서는,
    픽셀 면적을 포함하는 샘플 표면으로서, 클러스터가 상기 픽셀 면적 위에 불균일하게 분포되게끔 일련의 샘플링 사건 동안 복수의 클러스터를 보유하는, 상기 샘플 표면,
    복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 구성된 센서의 어레이로서, 상기 어레이는 N개의 능동 센서를 갖고, 상기 어레이 내의 센서는 상기 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 상기 샘플 표면에 대해서 배치되는, 상기 센서의 어레이, 및
    상기 복수의 일련의 픽셀 신호를 출력하는 통신 포트(communication port)를 갖는, 상기 용기; 및
    상기 용기에 커플링된 신호 프로세서로서, 상기 복수의 일련의 픽셀 신호의 시간 순서 및 공간 분석을 실행하여 상기 N개의 능동 센서로부터의 상기 샘플 표면 상의 N + M개의 개별 클러스터(M은 양의 정수임)에 대응하는 조명의 패턴을 검출하고, 상기 N + M개의 개별 클러스터에 대한 상기 일련의 샘플링 사건의 결과를 분류하도록 구성되는, 상기 신호 프로세서
    를 포함하는, 염기 콜링용 디바이스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신호 프로세서는, 검출된 상기 조명 패턴을 사용하여 상기 N개의 능동 센서로부터 상기 샘플 표면 상에 상기 N + M개의 개별 클러스터를 위치시키는, 염기 콜링용 디바이스.
  3. 염기 콜링용 디바이스로서,
    바이오센서를 포함하되, 상기 바이오센서는, 픽셀 면적 및 픽셀 면적당 2개의 웰을 포함하며 상기 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함하는 샘플 표면을 갖고, 상기 픽셀 면적당 2개의 웰은 지배 웰(dominant well) 및 종속 웰(subordinate well)을 포함하고, 상기 지배 웰은 상기 종속 웰보다 픽셀 면적에서 더 넓은 단면을 갖는, 염기 콜링용 디바이스.
  4. 제3항에 있어서, 상기 바이오센서는,
    복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 구성되는 센서 어레이로서, 상기 어레이는 N개의 능동 센서를 갖고, 상기 어레이 내의 센서는 상기 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 상기 샘플 표면에 대해서 배치되는, 상기 센서의 어레이, 및
    상기 복수의 일련의 픽셀 신호를 출력하는 통신 포트
    를 포함하는, 염기 콜링용 디바이스.
  5. 제3항에 있어서, 상기 2개의 웰은 상기 픽셀 면적의 중심에 대해서 상이한 오프셋을 갖는, 염기 콜링용 디바이스.
  6. 제5항에 있어서, 샘플링 사건 동안, 상기 픽셀 면적에 상기 2개의 웰로부터 상이한 양의 조명을 수신하는, 염기 콜링용 디바이스.
  7. 제6항에 있어서, 상기 2개의 웰 각각은 상기 샘플링 사건 동안 적어도 하나의 클러스터를 보유하는, 염기 콜링용 디바이스.
  8. 제7항에 있어서, 상기 샘플링 사건 동안, 상기 픽셀 면적에 상기 종속 웰 내의 어두운 클러스터(dim cluster)로부터 수신된 조명의 양보다 더 많은 상기 지배 웰 내의 밝은 클러스터(bright cluster)로부터의 조명의 양을 수신하는, 염기 콜링용 디바이스.
  9. 제8항에 있어서, 상기 바이오센서는 신호 프로세서에 커플링되되, 상기 신호 프로세서는 상기 복수의 일련의 픽셀 신호를 수신 및 처리하여, 상기 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터에 대해서,
    상기 샘플링 사건의 제1 조명 단계 동안 상기 픽셀 면적에 대응하는 센서에 의해서 생성된 제1 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈(bin)에 맵핑(mapping)하고,
    상기 샘플링 사건의 제2 조명 단계 동안 상기 센서에 의해서 생성된 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하고,
    상기 제1 픽셀 신호 및 상기 제2 픽셀 신호의 상기 맵핑을 논리적으로 조합하여 상기 밝은 클러스터 및 상기 어두운 클러스터에 존재하는 상기 염기를 식별하는 것
    을 포함하는, 상기 N개의 능동 센서로부터의 N + M개의 클러스터에 존재하는 염기를 식별하도록 구성되는, 염기 콜링용 디바이스.
  10. 염기 콜링용 디바이스로서,
    픽셀 면적 및 상기 픽셀 면적 위에 놓인 웰의 어레이를 포함하는 샘플 표면을 갖는 바이오센서; 및
    상기 바이오센서에 커플링되고, 일련의 샘플링 사건에서의 샘플링 사건에 대해서, 웰 각각을 탈축(off-axis) 조명으로 조명하는 것을 포함하여, 상기 일련의 샘플링 사건 동안 상기 픽셀 면적을 상이한 각의 조명으로 조명하여 상기 웰 각각에 비대칭적으로 조명되는 웰 영역을 생성시키는 조명 시스템
    을 포함하는, 염기 콜링용 디바이스.
  11. 제10항에 있어서, 상기 바이오센서는,
    복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 구성된 센서의 어레이로서, 상기 어레이는 N개의 능동 센서를 갖고, 상기 어레이 내의 센서는 상기 샘플 표면의 N개의 대응하는 픽셀 면적으로부터 일련의 샘플링 사건 동안 각각의 픽셀 신호를 생성시켜 상기 복수의 일련의 픽셀 신호를 생성시키도록 상기 샘플 표면에 대해서 배치되는, 상기 센서의 어레이 및
    상기 복수의 일련의 픽셀 신호를 출력하는 통신 포트
    를 포함하는, 염기 콜링용 디바이스.
  12. 제10항에 있어서, 상기 비대칭적으로 조명되는 웰의 영역은 적어도 지배 웰 영역 및 종속 웰 영역을 포함하여, 상기 샘플링 사건 동안 상기 지배 웰 영역은 상기 종속 웰 영역보다 더 많이 조명되는, 염기 콜링용 디바이스.
  13. 제12항에 있어서, 상기 웰은 상기 샘플링 사건 동안 하나를 초과하는 클러스터를 보유하고, 상기 지배 웰 영역 및 상기 종속 웰 영역 각각은 클러스터를 포함하는, 염기 콜링용 디바이스.
  14. 제13항에 있어서, 상기 샘플링 사건 동안, 상기 웰 위에 놓인 픽셀 면적은 상기 종속 웰 영역 내의 어두운 클러스터로부터 수신된 조명의 양보다 더 많은 상기 지배 웰 영역 내의 밝은 클러스터로부터의 조명의 양을 수신하는, 염기 콜링용 디바이스.
  15. 제14항에 있어서, 상기 바이오센서는 신호 프로세서에 커플링되고, 상기 신호 프로세서는 상기 복수의 일련의 픽셀 신호를 수신 및 처리하여, 상기 밝은 클러스터 및 어두운 클러스터에 대해서,
    상기 샘플링 사건의 제1 조명 단계 동안 상기 픽셀 면적에 대응하는 센서에 의해서 생성된 제1 픽셀 신호를 적어도 4개 빈에 맵핑하는 것,
    상기 샘플링 사건의 제2 조명 단계 동안 상기 센서에 의해서 생성된 제2 픽셀 신호를 적어도 4개의 빈에 맵핑하는 것 및
    상기 제1 픽셀 신호 및 상기 제2 픽셀 신호의 맵핑을 논리적으로 조합하여 상기 밝은 클러스터 및 상기 어두운 클러스터에 존재하는 상기 염기를 식별하는 것
    을 포함하는, 상기 N개의 능동 센서로부터의 N + M개의 클러스터에 존재하는 염기를 식별하도록 구성되는, 염기 콜링용 디바이스.
  16. 제10항에 있어서, 상기 탈축 조명은 45도 각인, 염기 콜링용 디바이스.
  17. 제10항에 있어서, 픽셀 면적당 하나의 웰이 위에 놓인, 염기 콜링용 디바이스.
  18. 제10항에 있어서, 픽셀 면적당 2개의 웰이 위에 놓인, 염기 콜링용 디바이스.
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