CN104204187B - 用于蛋白结晶和生物技术的微孔板和方法的改进 - Google Patents

Abstract

用于人工和高通量蛋白晶体生长以及其他生物或有机晶体生长的设备和方法。一微孔板包含多个单元格，以及一限定微孔板中单元格的边框。在每个单元格中至少存在一个上部开口的孔。单元格中的每个孔底部可以封闭，或者其底部是开口的，但孔底部由一独立部件封闭，其可以为独立的膜或板(例如塑料、玻璃或金属)或一模制部件。

Description

用于蛋白结晶和生物技术的微孔板和方法的改进

相关申请的引用

本申请要求美国临时申请S/N 61/617,102的优先权，其申请日为2012年3月29日，其主题内容通过引用结合进本文中。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明属于微孔板的改进，包括那些用于蛋白晶体生长的微孔板。

背景技术

生物科学和生物技术的许多领域使用微孔板进行筛选和其他实验。微孔板一般包括大量的(例如24、96、386或1536个)以一规则(通常为矩形)阵列排列的相同单元格。每个单元格都会包含一个或多个孔或储液器，用于将液体或其它目标样品分配到其中。微孔板通常通过注塑塑料制成。在将样品分配到各孔后，微孔板的顶部通常会密封，使实验不受环境的影响。大多数的微孔板设计符合由生物分子科学学会(SBS)建立的ANSI标准。

微孔板的一特定应用是在结构生物学和X射线晶体学领域，其中，它们用于蛋白、核酸、病毒和其他生物大分子复合物的晶体生长，以及用于探索在不同溶液中的蛋白溶解性。在确定生物大分子结构方面，获得大小和质量合适的晶体用于X射线衍射研究仍然是一大瓶颈。提供晶体生长的溶液条件(pH、盐类型和浓度、蛋白质含量、低温防护剂和其他添加剂的浓度)必须确定，并优化以生产衍射分辨率足以用于确定结构的晶体。

图1显示了一种典型的蛋白结晶微孔板，图1(c)显示了这种微孔板的典型单元格。微孔板中的每个单元格通常具有一个或多个用于蛋白溶液的小孔，以及用于“存储”溶液的大孔。

蒸汽扩散是最常用的方法，用于培养蛋白、病毒和生物分子组件以及可作为药物使用的小分子化合物的晶体生长。在蒸汽扩散生长中，每个储液器孔装有无蛋白溶液，并且一滴蛋白溶液置于一个小孔的底部。然后使用塑料膜将微孔板(以及每个单元格)密封。存储液的典型体积是20-200微升，蛋白溶液的典型体积是0.2-2微升。在任意给定单元格内，储液器和蛋白孔上部空间是相通的，允许蒸汽在它们之间流动。存储液最初的蒸汽压比蛋白液滴小。水从蛋白液滴蒸发并在储液器中冷凝直至蒸汽压达到平衡。蛋白液滴中的水蒸发使其中的蛋白浓度逐渐增加。在有利的环境下,这将导致晶体成核和增长。

一些蛋白结晶板的制造商包括Greiner Bio-One International(奥地利)、康宁(康宁，纽约州)，Art Robbins Instruments(加利福尼亚桑尼维尔)、Hampton Research(加利福尼亚索维耶荷市)、Neuroprobe(马里兰州盖瑟斯堡)和腾泉生命科技有限公司(TTPlabtech)(英国)。总共超过200种不同设计可用于晶体板。

高通量蛋白结晶的其他方法正在研究中。例如，富鲁达公司(加利福尼亚旧金山市)和Emerald Biosystems(华盛顿州班布里治岛)具有基于微流体芯片的商业化平台。虽然这些允许少量的结晶，但是这种芯片与传统微孔板相比价格昂贵，它们需要特定的和昂贵的硬件上样，并且芯片-硬件结合在结晶实验设计方面灵活性更低。它们也不符合SBS标准。

最近几年的一个重要的方向是开发使用X射线检验晶体而不用将晶体从其生长的板或设备上移动的方法。液滴被分配到尼龙环中、薄膜上或X射线透明玻璃毛细管中，生长出的晶体直接通过透过膜、环或毛细管的X射线检测而不用移动晶体。Oxford Diffraction(自从被安捷伦收购)开发了一种特殊X射线机器，带有垂直X射线束用于检测在常规SBS微孔板中的晶体。Greiner Bio-One与NatXray(法国)合作开发了具有薄(250微米)窗口的微孔板以降低这类应用中的背景散射。

当前微孔板技术的问题

在液体分配和日常使用时，微孔板是水平放置的。如果现有蛋白结晶微孔板旋转为垂直方向或者如果它们颠倒了，每个单元格内的孔中的内含物将散出并混合。同样，如果板经历急剧加速，也会发生混合。这种混合会破坏实验。在蛋白结晶时，存储液和蛋白溶液的早期混合会导致大量不适合的小晶体析出并成核。因此，目前大多数微孔板必须接近水平放置并轻轻的处理。

这种处理限制了当前模板的使用，原因有如下几种。

第一，由于目前微孔板不能翻转，只能在“坐滴”配置中进行结晶。在重力影响下，在蛋白液滴内部成核的晶体将沉淀到支撑表面上。它们往往粘附到该表面，取回比较困难。如果该板可以翻转到“悬滴”配置，晶体则可沉淀到液滴-空气界面，可以容易的从该处收获晶体进行后续研究。

第二，由于板不能轻易翻转到垂直状态以免去混合孔内含物的风险，使用X射线和其他电磁探针检验是非常困难的。用于结晶学的几乎所有的X-射线源(包括射线管和旋转阳极实验室源和同步辐射源)产生水平的X射线束，使板必须旋转至垂直，用于每个单元格内容的X射线检查。红外光和紫外光质谱仪运行时通常也使用水平照明。蛋白结晶中,蛋白液滴经常包含沉淀物和盐晶体，并经常被“外皮”覆盖，该“外皮”由聚乙二醇或变性蛋白形成。通过目测识别结晶蛋白，特别是当晶体大小仅为微米级时，是非常困难的。使用X射线原位检查提供了最可靠的晶体探测和晶体质量评估方法。

第三，具有足够透X射线的板材料，在有利情况下，可在驻留于板上的晶体上原位进行X射线晶体学研究和结构确定。但是，这种情况通常需要晶体以及板绕轴旋转一般60或90度，该轴垂直于X射线束。而现有板仅当晶体具有特定方向时才可实现。

第四，由于误操作，在几乎所有非自动操作微孔板中普遍会出现意外摇晃和其他大幅度加速。由此产生的实验破坏往往需要重新进行实验。

最后，一旦它们充满溶液，现有板运输不容易，例如，在附近楼宇之间运输，或者在汽车或飞机中从主实验室运输到另一个实验室或一同步辐射X射线源。现有板不能通过邮递或私人快递公司从一个位置运送至另一个位置。在运输和装卸过程中板倾斜和脉冲式加速造成每个单元格中的液体溅出。这会使液体分散，增加其总表面积，这对每个孔中的液体之间的气相扩散速率、晶体成核和生长速率，以及发生在气-液界面的蛋白/生物分子氧化、降解和/或晶体成核具有较大影响。板倾斜和脉冲式加速也会造成一个单元格中的多个孔之间的溶液混合，破坏实验。在蛋白质晶体学中，生长片段的X射线数据收集是远程进行的。放置于特殊支撑器上的晶体冷冻到接近T＝77K，运送到同步辐射源进行测量。目前，将晶体微孔板运送到同步辐射源进行远程数据收集是不可行的。

除了上述问题，用于结晶的现有微孔板还存在其他问题。当液体分配到存储孔时，其通常不会均匀的填满孔，尤其如果孔在一个方向上比另一个方向长很多。细节行为取决于液体溶液如何润湿用于形成孔的塑料或其他材料，即取决于接触角和接触角滞后。如果接触角很大，液体可能“起球”，其驻留于孔的中心并避开角落。它可能被吸引到孔的一角落并将其润湿。如果接触角很小(对于包含醇的溶液)，其可能爬上孔的两侧。在所有的情况下，这往往会减少液体的总体积，这些液体能容易的分配到给定尺寸的孔中而不会溢出，并且在板封装过程中，这些液体不会接触顶部封膜。对于相同体积的液体而言，这也导致无法复制的液-气界面面积。由于暴露表面的面积影响表面的蒸发速率，这可影响孔与孔之间的蒸汽扩散速率并因而造成结晶的不可复制性。

不完全填满储液孔也导致需要使用超出需要的更深或更高的孔。因为微孔板的最小厚度是通过储液孔高度/深度确定，这继而限制了板的最小厚度。最大程度地减少板厚度是可取的，其最大程度地降低微孔板的存储要求。这也便于在商用X射线结晶装置和在同步辐射X射线源上进行X射线检查，因为这种结构的板的可用空间通常是非常有限的。

目前可用的结晶微孔板都不包括解决这些问题的特征。

发明内容

本发明教导了用于人工和高通量蛋白晶体生长和其他生物和有机晶体生长的设备和方法，以及用于其他生物技术应用的设备和方法。在一种实施方式中，一微孔板包含多个单元格，以及一限定微孔板中单元格的边框。在每个单元格中至少存在一个上部开口的孔。单元格中的每个孔底部可以封闭，或者其底部是开口的，但孔底部由一独立部件封闭，其可以为独立的膜或板(例如塑料、玻璃或金属)或一模制部件。用于蛋白结晶的现有微孔板的每个单元格通常包含2-4个孔。

本发明提供了一方法，用于在允许同一单元格中的孔之间的蒸汽交流的同时阻止孔之间的液体转移。这种用于蒸汽交流的方法也允许对蒸汽转移速率和孔与孔之间的平衡进行一些控制。

本发明提供了一方法，用于促进液滴扩散，完全的、更均匀的将孔填充到给定高度，可用于具有多种表面张力和接触角的液体。

本发明因此提供了一方法，用于在给定孔区域最大程度的增大液体体积，并用于最大程度的增加孔高度以在给定区域支撑给定体积。这使底板高度最小化。对板的存储要求也因此可以降低。

在微孔板中，一个或多个孔底部或底部封膜是透X射线的，本发明允许的板高度越小，允许入射的传输X射线衍射角在越大的角度范围，不用拦截X射线的微孔板材料。

较小的孔高度也最大程度地扩大收获角范围，从该角范围晶体或其他样品可从置于孔中的液滴取回，该孔的底部与板的底表面重合。

本发明还可防止液体爬上孔的侧壁到达孔壁的顶部。这使得板的顶表面封装更可靠和安全。

本发明提供了一方法，在当板倾斜、翻转或加速时，能阻止液体移动和顶部封装表面的液体接触。这继而允许板翻转，用于悬滴结晶，也允许更粗鲁的处理，以及允许运输而不出现板内溶液的混合。

本发明允许实现这些特征，同时提供使用标准液体处理器和移液器方便的填充所有孔的方法，并且分配模式与填充现有商用板类似。

每个单元格中的孔通过微孔板顶表面的交流通道相连。这些通道的横截面足够小，使得当至少一个孔填充有液体时，微孔板旋转至任意方向时产生的静液压力不足以驱动液体通过通道从一个孔流向另一个孔。交流通道也足够小，使得在日常操作或典型误操作中在孔内产生的液体飞溅和液压不会驱动大量液体通过通道流动。通道可以是直的。它们也可以是弯曲的。它们可具有突出部分、屏障或分支，阻止溅出的液体通过它们移动。本发明进一步由液体保留壁架或脊或开口组成，其沿着一个或多个孔的内部边缘延伸，并从孔壁朝孔中心突起。所述开口的开口区域具有一直径，其小于孔直径，但足够长和宽以允许标准直径/轮廓的移液器吸口端和其他液体分配器端部插入孔内并与孔底部接触。

在液体分配和孔填充过程中，液体润湿壁架的下表面和由壁架形成的液体保留开口的内边界限定的接触线便于液体穿过孔底部分散并均匀的填充孔。

如果没有壁架，接触角接近90度的液体(通常为塑料上的不含乙醇的水溶液)往往在孔底部形成半球形液滴。该液滴仅会填充孔体积的一部分，尤其是那些矩形或椭圆形的孔，并向上突起，靠近孔的顶表面，在此处，其可接触用于将其封装的膜。任何这种接触能阻止对板的顶表面的合适的膜封装，必须予以消除。

具有该壁架时，随着液体分配，半球形液体高度增加，直至其接触壁架底表面。然后，在孔被填满，液体最终从液体保留开口出现之前，液体在壁架下方横向扩散，更加均匀地填充壁架下的空间。对于高表面张力液体如水和含盐水缓冲液而言，可以最大程度增加分配到给定高度和底面积的孔中的总液体体积。

孔的高度是微孔板设计的重要参数。孔高限制了板的最小高度，并因此决定了板的储存容量要求。小的孔高度使得将液体分配到孔底部以及取回更容易，例如在分配到孔底部的液滴中生长的晶体。它们也增加了可能的入射和衍射X射线束角范围，该角度在原位X射线检查孔内容物时不会拦截板材料。在此描述的壁架/开口允许可分配到给定孔体积的液体体积增加，并因而允许用于给定液体体积的孔高度减小。

当孔被填充到液体接触壁架的底表面时，液体扩散穿过开口。孔中的液体暴露于上部空气的表面积因此由所述开口限制，而不是由较大的或者不可重现的液滴形状(通常由分配液体形成)限制。这可导致孔与孔之间的可重现更高的平衡以及可重现性更高的结晶结果。

在开口内表面限定的润湿和接触线，以及在壁架下部几乎完全填满空间会在微孔板倾斜或加速时强烈抑制液体流过该开口并流出孔。液体流出液体保留开口需要空气进入其中，这被小的液体保留开口孔径和液体表面张力强烈抑制。在微孔板顶部表面的下部有限距离处放置保留壁架/开口的顶表面，这样可在倾斜、翻转和加速过程中阻止膨胀通过开口的液体接触封装膜并扩散。结合在一起，孔内部的保留壁架/保留开口和连接到孔的交流通道的结合强力阻止了液体在孔之间转移。这允许微孔板在任意方向旋转，而不会造成液体转移，以适应日常操作和误操作，并可运输和装货，不会造成液体转移。

该保留壁架/保留开口和交流通道因此允许生产具有额外功能的微孔板并使得使用微孔板的新方法产生。

附图说明

图1(a)和(b)显示了用于蛋白结晶的96孔板(由Swissci生产)的顶部和侧面视图；图1(c)显示了这种微孔板的一个单元格的原理图，该板在左边具有一小的蛋白液滴孔，并在右边具有一更大的储存溶液孔；

图2(a)显示了本发明一种实施方式中的微孔板的顶部视图；图2(b)和(c)显示了在这种实施方式中的微孔板的单个单元格的顶部和横截面侧视图，其具有交流通道17，液体保留开口15和液体保留壁架16；

图3显示了本发明中在单个单元格内部连接孔的交流通道的替代实例；

图4(a)和(c)显示了本发明中具有液体保留壁架和液体保留开口的孔的两种可替代实施方式的侧面原理图；图4(b)和(d)显示了微孔板中的单元格的渲染视图，每个单元格中的右边孔具有液体保留壁架；孔底部使用单独的部件封装，其可以是膜、板或单独模制部件。图4(e)显示的微孔板与图4(b)相似，但其每个孔具有整体的封装底部。图4(f)和4(g)显示了4(e)的各种变体，其中左边孔深度比右边孔深度小；

图5(a)示例性显示了在填充常规微孔板中的孔时水如何扩散；图5(b)显示了本发明一种实施方式中，在填充具有液体保留壁架和液体保留开口的孔时水如何扩散；

图6(a)显示了在填充标准市售微孔板的孔过程中水扩散的影像图；图6(b)显示了本发明一种实施方式中，在填充具有液体保留壁架和液体保留开口的微孔板过程中水扩散的影像图；

图7显示了本发明一种实施方式中翻转的包含液体的一种孔；

图8显示了本发明中微孔板的孔中的液体保留壁架和液体保留开口的替代实施方式。

具体实施方式

本发明由微孔板的变形组成，例如那些用于蛋白结晶和筛选的微孔板，其强力阻止了液体在微孔板的每个单元格中的孔之间的转移，而允许孔与孔之间的蒸汽交流。这允许在任意方向使用微孔板，并在操作、运输或装运过程中不会使相连的孔之间的液体混合。这也允许储存孔体积和高度最小化，并增加储存液体表面积的一致性。

蒸汽交流通道。

如图1所示，在目前的晶体微孔板中，在每个单元格中，用于储存溶液5和蛋白液滴10的孔是相互开放的，允许储存孔和蛋白孔之间的蒸汽自由交换。这可通过在屏障顶部或孔之间的壁与微孔板顶部表面7之间留缝隙12实现，如图1(c)所示，在装载微孔板后使用塑料膜封装顶表面。该缝隙的典型尺寸为：高约为1mm，宽度约为8mm。在微孔板倾斜、翻转或撞击时，这种较大的缝隙允许液体轻易的在孔与孔之间流动。

有许多方法可减少液体转移并允许孔与孔之间的蒸汽交流。例如，可用微孔材料(如过滤材料)屏障填充屏障臂顶部和微孔板顶部表面之间的缝隙。我们的更优选的实施方式，示例性描述于图2中，其涉及将给定单元格内的蛋白液滴孔20和储液孔15之间的屏障壁顶部延伸到微孔板顶部，并在板的顶表面形成小横截面的交流通道17，该顶表面提供单元格的密封表面。图3阐明了通道的替代实施方式。在图3(a)中，有一单个的交流通道25置于储液孔的一个末端，使得孔与孔之间发生的任何液体转移都远离液滴，该液滴可置于相邻孔中心附近。可以存在多个交流通道30(图3(b))，并且各通道35可具有一定角度(图3(c))，以引导进入通道的任何液体远离相邻孔中的液滴。交流通道40可以是突出部分、屏障、分支或凹位41以及可以围绕屏障41改向(图3(d))，以阻止在脉冲式加速过程中液体的冲击运动。

这些通道的尺寸、形状和位置决定了它们允许蒸汽交流并抑制或阻止液体转移的有效性。

当具有交流通道的微孔板从水平方向倾斜，使得液体流动与屏障壁的一侧的交流通道开口接触，液体中的静液压力以及与表面张力有关的压力将驱动任何液体移动通过交流通道。为了在小通道中的水溶液持续流动，雷诺数(Reynold's number)较小且流体是粘性的。体积流率与压力差Δp、通道半径r(近似圆形横截面通道)、通道长度L和流体粘度η通过Q＝πr⁴Δp/8ηL关联，平均流速是v_av＝r²Δp/8ηL。假设η＝8.9×10^-4Pa·s(纯水)，典型值适于96孔SBS标准结晶微孔板，其L～1mm，Δp_静液压力～ρgh～50Pa(h为0.5cm，一典型的孔高)。r～75微米(可以方便地注塑成型特征尺寸)，平均流速为～4cm/s，流速为～0.7μl/s。在这种情况下，微孔板以加速度a进行加速，而不进行倾斜，最大Δp～ρah，若a>>g,流速能更大。如果加速时瞬时的(例如，由于撞击)，即使a较大，总流量也能够较小。空气粘度为1.78×10^-5Pa·s，其比水粘度小50倍，因此对于给定压差流速大得多。

用于减少孔与孔之间的液体转移的第二个且更重要的影响是通过固体表面限定液体接触线。通过固体表面的气-液界面形成的接触角θ由液体和表面的性能决定。在通道或管道中，这导致弯曲液体弯月面的形成。对于具有给定接触角θ的弯月面，液体和弯月面另一侧的空气之间的压差为Δp＝2γcos(θ)/r，其中γ是液体表面张力，r是通道或管道的半径。液体接触线和弯月面将在θ_min和θ_max之间的一定θ值范围内会保持受到限制；这些极端角之间的差值是接触角静液压力，由壁面粗糙度等因素决定。这种接触角静液压力是模拟液体接触线的静摩擦力。因此，需要液体中的一个最小压力来引导流体通过通道或管道，由Δp_min＝2γcos(θ_max)/r确定。使用典型的θ_max～140°，γ＝0.0728N/m(水)和r＝75微米，得出Δp_min＝1500Pa。因此，对于足够小的通道，需要产生流动的压差将比微孔板倾斜或翻转时产生的静液压力差更大。对于150微米宽的通道，将会大于大概30倍，表明微孔板加速达到～30g时将不会引起流体运动。

已经在96孔SBS标准微孔板原型上进行了实验，其具有矩形和梯形横截面交流通道。通道尺寸范围从0.5×0.25mm至0.25×0.075mm。孔大约4毫米深。在所有情况下，即使当储液孔完全填满液体时，当微孔板倾斜至任意方向，也不会发生液体转移，这与上述计算一致。这些尺寸的交流通道仅仅对比例具有较小影响，在该比例下，蒸汽压在由这些通道隔开的孔中的溶液之间达到平衡；这种平衡率主要由液体表面的蒸发率决定，该蒸发率取决于暴露于空气的表面积。因为在误操作过程中的加速(例如，板掉落)是临时性的，在孔与孔之间转移的任何液体体积往往非常小。可通过在交流通道的入口或出口前端放置一小的屏障或“防溅罩”在某种程度上阻止这种转移；以及通过变形、弯折或围绕屏障改向通道来延伸通道的长度而阻止这种转移。在加速过程中产生的过度的压力必须首先驱动流体通过通道的整个长度。如果这种交流通道宽度足够小且路径足够长，该液体在加速和相关的压力过度期间将不会到达其他孔。然而，重复的大量加速可最终驱动非常少量的流体流出交流通道并进入相邻孔。

除了使液体转移体积最小化，合适布置的交流通道也可使少量液体转移的影响最小化，尤其是那些由于粗暴处理和冲击力而发生的转移。例如，通道可以布置成使从储液孔流入它们并随后流出到蛋白/相邻孔的任何液体不太可能接触孔底部的蛋白液滴。这一点可以通过将交流通道出口定向成远离液滴来实现。例如，如图3(a-c)所示，当蛋白液滴置于远离孔的末端，通道可置于这些末端并定向成远离蛋白液滴。置于通道出口的防护装置可用于将液体转向到沿孔壁向下。

蒸汽交流通道也可提供对蒸汽转移速率以及相连接孔之间的蒸汽平衡进行一些控制。孔中的液体的可挥发性组分(包括水和乙醇)的转移速率取决于液体-空气界面每单位面积的蒸发速率和液体-空气界面的表面积的蒸发速率，以及蒸汽扩散和对流的速率。交流通道通过限制扩散发生的区域影响蒸汽扩散，并影响对流，因为在通道内的对流在足够小的通道中(例如上述的那些原型)受到强烈抑制。孔与孔之间的可挥发性组分的净转移率的调整决定于哪种过程最慢：液体表面的蒸发、每个孔内的对流和扩散运输或通过通道的扩散运输。对于高挥发性组分如乙醇，通道的影响是主要的；但是对于蒸发慢的溶液，如含30％聚乙二醇的水缓冲液，蒸发率可能收到限制。在任何情况下，减小通道横截面尺寸并增加它们的长度应该能最终使传输通过通道成为限制性步骤。这种通道尺寸和通道的总数量可用于控制，尤其相对于大面积通道限制，用于降低孔与孔之间的蒸汽传输和平衡速率。将通道填满油或其他非挥发性材料可用于进一步降低通过通道的扩散并因此进一步降低蒸汽平衡率。在蛋白结晶中，通常需要更慢的平衡，因为这可产生更少的晶核和更大的晶体。

液体保留壁架/液体保留开口

如图4(a)-(d)所示，以其最简单的形式，液体保留壁架/液体保留开口通过在孔的顶部和底部之间的某个位置从孔的壁45(具有顶表面50)向外突起的壁架55形成。壁架的参数是其厚度、该厚度与孔深度的比例、内部开口60的尺寸(或者壁架从孔壁向外突起的程度)和在孔底部之上的高度。也显示了第一孔200、第二孔202和分隔壁。该壁架可向上或向下倾斜。其可具有矩形横截面(图4(a)和(b))。其也可具有一底表面，例如，该表面弯曲与臂相遇(图4(c)和(d))。其也可突起的或上升边缘，紧紧与壁架相邻以控制该处的接触线限制。在一给定孔中可能具有多个开口。由壁架形成的开口的形状和尺寸应该优化，以当板倾斜、翻转或粗暴处理时阻止液体运动通过壁架，并且也应该允许使用标准液体处理器和移液器方便的填充。孔底部可以是开口的，通过一单独部件密封，如图4(b)和(d)所示；或者一个单元格中的一个或所有孔具有封闭的底部，如图4(e-g)所示。在一个单元格中的孔可具有相同的深度(图4(b)和(d))，或者它们具有不同的深度(图4(e-g))。

当前用于蛋白结晶的96孔板的储液孔体积约为40-200微升。因为大多数板符合SBS尺寸，随着板单元格的数量增加，孔体积减小。具有低水蒸汽透过塑料如环烯烃共聚物(COC)，孔体积可减小到约10微升用于持续一个月的实验，以及减小到更小的体积用于更短期的实验，而不会由于单元格失水而产生很大的影响。

用于常规注塑模制微孔板的塑料往往在某种程度上是疏水的。如图5(a)所示，当水溶液分配到常规的平面或曲面底部孔中，它们往往在孔75的底部形成半球形圆顶90而不会润湿孔并均匀扩散到整个孔。该液体可能仅驻留在通常为矩形的或细长的孔的中心附近，或者被吸引到角落。因此，对于固定体积，液体的暴露的表面积会变化，改变每个孔中的液体的平衡率。这也使得完全填满一个孔而不让其流出，或者当板密封时不让液体接触顶部密封膜85变得更困难。图6(a)显示了填充市售蛋白结晶微孔板的储液孔过程中获得的一系列图像。随着添加液体，该液体经常累积在孔的一侧，在液体最终扩散到整个孔的底部之前，液面上升到那一侧的孔的顶部。不让液体接触顶部密封表面的同时完全填满孔通常是不可能的，液体接触顶部密封表面会组织板的密封。如果不使用密封膜，当板倾斜到90度或翻转时，大部分或所有的液体将流出孔。而使用顶部密封膜，倾斜或翻转将通常导致大量液体在孔与孔之间进行转移。

如图5(b)所示，通过添加液体保留壁架125和开口115，随着液体注入孔，液体顶表面110最终接触并润湿保留壁架的底表面。然后，随着添加另外的液体，该液体在壁架下横向扩散(120)。表面张力阻止液体扩散通过并流出开口，因此液体将在壁架下横向展开直到壁架下的空间几乎完全填满(箭头)。

为了使液体不会上升到板的顶部表面，需要的壁架从孔壁向外的最小突起(并接触密封膜)取决于填充过程中孔底部形成的液滴形状、孔深度与孔宽度的比例、壁架相对于孔底部的垂直位置以及板的填充方式。液滴形状取决于其体积、表面张力和孔底部的接触角。如果深度-宽度比较小和/或接近孔顶部放置壁架，如图5(b)所示，该壁架必须相对较宽，而如果深度-宽度比较大或更靠近孔底部放置壁架，该壁架可相对较小。对于矩形或其他细长的孔，相对于孔的较宽侧，可在孔的较窄侧缩小壁架宽度，因为在较宽侧的壁架将主要决定液体保留。如果液体在孔的中心不分散但分配到一侧，壁架突起可减小并仍有效包含液体。

使用原型96孔板的实验已经确认液体保留壁架引起液体扩散并更均匀的用水和各种水溶液和包含乙醇、乙烯和聚乙二醇、甘油、盐类、洗涤剂和其他常用于蛋白结晶的有机化合物的混合物(“屏幕”)填充孔。图6(a)显示了将液体加到市售96孔板的常规孔的一系列图像。该液体扩散并在继续扩散到右侧末端之前，在板的左侧末端上升到板的顶表面(使得当板密封时其将接触密封膜)。当板倾斜时，液体自由的从孔流出。图6(a)显示了第一孔300、第二孔302和液体(水滴)304。图6(b)显示了本发明原型板中的相应的一系列图像。也显示了第一孔200，第二孔202和液体(水滴)206。随着加入液体，该液体迅速接触壁架的底表面，并然后在壁架的下面均匀扩散，直到壁架下面的整个空间被填满(可能除了一些小气泡)。即使不使用密封膜，该板可倾斜至任意方向或翻转，而液体不会通过开口流出孔。使用如图6(b)的孔尺寸，从孔侧壁具有不同宽度/延伸性的壁架的实验表面在促进液体扩散和更均匀填充孔方面，使用壁架主要对壁架宽度不敏感，宽度至少为0.2mm。

当微孔板倾斜或翻转时，液体保留壁架/开口通过几种机制抑制液体通过开口流出。第一，如图7所示，由于液体165通过由壁架160形成的开口开始膨胀，其一定会增加表面积，因此有一表面张力相关的压力对抗这种膨胀。这种对抗压力随着膨胀程度增加到最大，其大概由p_max＝2γcosθ_max/r确定，其中γ是液体-空气界面的表面张力，r是开口半径，θ_max是相对于开口顶部表面的液体-空气界面的最大稳定接触角。这种压力(在1mm半径开口中的水约为150Pa)能超过浅孔中的液体中的静液压力，并阻止其移动。为了从这种影响中获得最大的益处，微孔板的顶部密封表面155必须足够远离使得例如在板填满后翻转时，液体通过开口膨胀不会接触密封该顶部表面的密封膜。

第二，液体是不可压缩的。因此，液体移入开口并随后膨胀出开口，在未填满空间170中的气体体积在开口“填满”的一侧一定会增加，在该空间产生压力降，对抗移动。如果起始气体体积很小，即使较小的位移也会产生较大的压力降。例如，如果在40微升孔中，开口下面未填满体积是4微升(10％)，1毫米直径的半球形液体膨胀通过开口产生6500Pa的压力降，或者大约比静液压力大130倍。

几种设计可增加填满的体积部分，该部分由液体保留环下面的不可压缩性液体占据，这些设计也能使由可压缩空气占据的未填充体积部分最小化。从上部看，该孔可制成更接近方形或圆形。孔的角落70可以是圆形的(图4(c)和(d))以减少对气泡的捕获，尤其在壁架的底表面。

图8(a)-(e)显示了第一孔200、第二孔202、壁架55、分隔壁204和开口210。更宽的壁架倾向于在矩形孔的任意一端的壁架下面捕获空气。可通过降低壁架的宽度来减小这种捕获。对于矩形或其他的细长孔，宽度仅在孔末端可减小(图8(b))，以使空气捕获最小化而使开口宽度最小化。小直径(例如150微米)“通气”开口可置于孔任意一端的壁架内，允许空气在填充时通过它们逃离中心。然后这种壁架可延伸通过孔以形成连续的板，具有小孔用于填充和通气(图8(c))。该填充开口可置于孔的一端并且单个通气开口置于另外一端(图8(d))。填充开口可置于中间，细小的裂缝从其一端延伸(如图8(e)所示)，以允许空气在填充过程中逃离但是在处理和加速过程中使流出流体最少化(例如与图8(a)和(b)中的开口相比)。第三，在例如微孔板旋转到垂直或翻转方向过程中，为了使液体流出开口，必须使空气通过其流入。如果开口下的孔部分被填满，在旋转过程中，开口将保持被液体覆盖，因此会形成起泡并且移动通过开口，以使液体流出。因为较大的压力增量(其抑制了均匀液体移动出开口)，这可能涉及在开口的一部分产生外凸的气泡而在另一部分产生内凸的气泡。需要产生这些气泡的表面张力相关的压力与气泡直径成反比。因此，通过将开口制作得足够小在其所有尺寸都是可行的，从而抑制任何形成这些气泡的倾向。最小的尺寸受到市售液体处理器和移液枪的分配器端部的尺寸限制，也受到端部相对于板的放置位置的精确度和准确度限制。在图8(c)中，提供一中央开口用于液体填充，两个更小的通气开口在孔的任意一端，在填充过程中允许空气逃离。

最终，在一时标上发生的任何液体移动，尤其是上述的气泡形成，其由液体粘度决定。这种粘度因此抑制了气泡形成和液体流出开口，应对冲击和其他短期扰动。

在具有3-4mm深的储液孔和填充有20-40微升体积的液体保留壁架/开口的微孔板原型上的实验表明，在普通人工板处理过程中，在旋转和翻转过程中，以及当板保持垂直和翻转方向一段时间，包括没有顶部膜密封孔时，壁架/开口阻止所有液体移动出孔。这与没有壁架的原型孔(如现有微孔板中使用的)中的液体行为相比，没有壁架时当板倾斜或翻转时液体容易流出储液器并混合。当板经历强烈的冲击力时(例如在板从一高度掉落时发生的冲击，例如从两尺高掉落到一硬表面上)，液体仅仅流出通过开口。

在我们的实验中，使用了具有液体保留壁架的孔，该壁架产生了宽度2mm的开口，该宽度由液体分配移液器吸口端～1mm的典型尺寸以及相对于分配器端部，微孔板放置位置中的容差。使用在微孔板顶表面下面以不同距离放置的壁架的实验表明约0.5mm的距离给出了较好的结果，对于3-4mm深的孔来说，液体没有接触并在顶部密封表面扩散的趋势。可使用更小的开口以在加速中增强流动抑制性，但限制可用于填充板的液体分配器端部的种类和相对于分配器端部，微孔板放置位置的准确度。如果孔的底部也在相同步骤中注塑模制，如所有市售的用于蛋白结晶的微孔板，注塑模制液体保留壁架是非常困难的。一种更简单的方法是在模制后用单独的塑料膜或板或模制部件密封孔底部。模制和从模子中取出都是非常简单的，降低了成本。

结合了蒸汽交流通道和液体保留壁架的板

在具有液体保留壁架/开口和150微米宽的交流通道的96孔板(单元格如图4(b)所示)原型实验表明，当将填充有大约40微升的水(高表面张力)或30％异丙醇的水溶液(低表面张力)的储液孔置于单个标准气泡袋内，它们可从六尺的高度掉落到混凝土地面上，只有很少的液体在储液孔好蛋白液滴孔之间转移。

微孔板储存和运输组件/系统

在一些应用中，需要能够在实验室之间通过传统邮递或快递服务进行运输微孔板。例如，需要将板从大学或工业实验室运输到同步辐射X射线源上进行X射线检查。这种运输需要(1)使平均温度之间的差异最小化以阻止冻结、沉淀和其他可损坏板中的样品的影响；(2)整个板的温度梯度最小化以阻止蒸发和冷凝；以及(3)峰值加速度最小化以使液体在孔之间的转移最小化。(1)和(2)可通过使用标准的市售运输容器实现，例如那些由绝缘Styrofoam盒组成的，在其内部具有高热容凝胶包以维持温度。(3)可通过使用气泡布、空气枕、泡沫或其他在冲击中可压缩的材料，这些可压缩材料对于压缩具有非弹性(损耗)效应，使得能减少峰值加速并因此减小施加于包含在期内的物体的峰值力。一市售的微孔板系统用于例如蛋白结晶、运输和X射线检测，然后包括一具有液体保留壁架/开口和狭窄蒸汽交流通道的微孔板；一纸箱两旁放置减震泡沫；一内部热绝缘的Styrofoam容器；高热容凝胶包；以及另外的泡沫或气泡包装以进一步减小Styrofoam容器内部的板的加速度。

在运输过程中，微孔板也可经历减小的环境压力。具有蒸汽交流通道和液体保留壁架，以及具有使用单独聚合膜密封的顶部和底部表面的微孔板原型在以下条件室内进行测试：空气压力22.2英寸汞柱(75kPa或大约海平面大气压的3/4)。这种压力对应于商业航班的货舱中的最小压力。这些测试显示了在减小的压力和大气压之间进行重复循环不会导致孔之间的液体转移问题或其他问题。

在标准的使用中，板底部是密封的，在注塑模制中密封或通过结合单独的膜或板或注塑模制部件密封。使用手动移液器或自动液体处理器分配储液孔液体通过液体保留开口到下部的孔中，尽可能完全的填充液体保留壁架下的孔。蛋白溶液然后以液滴的形式分配到相邻蛋白孔的底部表面上。微孔板的顶部表面然后使用不透蒸汽的密封膜密封。该板然后旋转到一期望的方向(通常在其原始水平方向或者一翻转方向)用于晶体生长。该板然后旋转到另一方向(通常是垂直的)以使用X射线、紫外线或可见光或其他探针检验每个单元格中的内容物。该板也可在填满后立即旋转至一垂直方向，允许在实验过程中垂直储存和检测。如果在实验中板在垂直方向检测多次，在水平方向储存是优选的。

上述描述已经陈述了几个替代实施方式。本发明不限于用于蛋白结晶的微孔板或者不限于微孔板。其可用于任何类型的微孔板。其也可用于任何设备，这些设备在两个或多个孔或腔室中需要有蒸汽交流通道并易于从顶部表面填充孔和从孔中移除材料，同时在微孔板旋转或加速过程中阻止孔之间的液体转移，并允许在任何方向使用设备。

所有引用材料，包括在此引用的公开文献、专利申请和专利通过引用以达到允许的程度将其整体结合到本文中，并且每份引用材料单独引用或经特殊说明通过引用结合，并以整体陈述。

使用术语“一”、“一个”和“该”以及描述本发明的相似指示词(尤其在下述权利要求的情形下)被解释成包括单数和复数，除非该处另有说明或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”解释为开放式术语(即解释为包括但不限制)除非另有说明。术语“连接”解释为部分或整体包含在内、连接到或结合在一起，即使有物质介入时。

本文的所有范围值详述仅仅用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，除非本文另有标明，并且每个单独值结合到说明书中，如本文中单独叙述的那样。

本文描述的所有方法可以任何合适顺序执行，除非另有说明或显然与上下文矛盾。使用的任何和所有实例，或者本文提供的例性语言(例如“例如”)仅用于更好的阐述本发明的实施方式，并不用于限制本发明的范围，除非另有要求。

说明书中的任何语言都不解释为表明任何非要求的为实践本发明必须的元素。

本领域技术人员可很容易地领会到，在不违背本发明的精神和范围的前提下，本发明可进行各种不同的修改和变化。说明书并不旨在将本发明限制于特定形式或公开的某些形式，相反，旨在覆盖落入本发明精神和范围的所有修改、替代性说明和等同物，如所附权利要求所限定的。因此，它的意图是，使本发明覆盖所有修改和变化，只要他们落入所附权利要求和它们的等同物的范围内。

Claims (19)

1.一种微孔板，包括：

一边框，所述边框包括一平的顶表面、一底表面并包括多个形成于其中的多个单元格，每个单元格包括：

一第一孔具有在第一平面上延伸的顶表面，包含10-200微升之间的静止流体；

一第二孔通过在第一平面上延伸的顶表面的预定宽度与第一孔分隔，包含等于或小于10微升的静止流体；

其中所述第一孔和所述第二孔通过分隔壁分隔，该分隔壁在第一方向从所述边框的底表面向顶表面延伸，其中分隔壁的顶表面在第一平面上延伸，并在一第二方向沿着纵向轴延伸，以及第一孔和第二孔之间的整个预定宽度；

其中所述第一孔和所述第二孔通过至少一个蒸汽交流通道连接，该通道构造成允许所述第一孔和所述第二孔之间的蒸汽交流，并构造成当至少一个单元格包含液体并且所述边框从水平位置倾斜或者所述边框经历脉冲式加速时，有助于阻止所述第一孔和所述第二孔之间的液体转移；以及

其中所述分隔壁的顶表面包括一中心点和两个端点，其中所述至少一个蒸汽交流通道位于所述分隔壁顶表面中,(i)在所述分隔壁顶表面的中心点和两个端点中的一个之间的位置；(ii)与所述纵向轴成一角度；或者(iii)围绕屏障改向；以及

其中当微孔板水平放置时，第一孔和第二孔中的液体填充所述孔至一低于所述至少一个蒸汽交流通道的位置的水平面。

2.根据权利要求1所述的微孔板，其中所述至少一个蒸汽交流通道与所述分隔壁顶表面的两个端点中的一个相邻。

3.根据权利要求1所述的微孔板，其中所述至少一个蒸汽交流通道是非线性的。

4.根据权利要求1所述的微孔板，其中所述至少一个蒸汽交流通道的宽度为0.075毫米至0.25毫米之间。

5.根据权利要求1所述的微孔板，进一步包括多个蒸汽交流通道，该通道构造成允许所述第一孔和所述第二孔之间的蒸汽交流，并构造成当至少一个单元格包含液体并且所述边框从水平位置倾斜或者所述边框经历脉冲式加速时，有助于抑制阻止所述第一孔和所述第二孔之间的液体转移，其中多个蒸汽交流通道中的每一个都刻在所述边框的顶表面。

6.根据权利要求1所述的微孔板，进一步包括一液体保留壁架，所述液体保留壁架连接到并围绕在边框顶表面下面一预定距离处的所述第一孔和第二孔中的一个的内部边界的至少一部分延伸，并且该液体保留壁架从内部边界突起，形成一开口，该开口的直径小于所述第一孔和第二孔中的一个的内部直径。

7.根据权利要求6所述的微孔板，其中所述液体保留壁架构造成在添加液体时便于将液体均匀填充到所述第一孔和所述第二孔中的一个，并且便于阻止其中形成气泡。

8.根据权利要求7所述的微孔板，其中所述液体保留壁架构造成当液体添加到所述第一孔和第二孔中的一个时，限定液体接触线，因而在添加液体过程中便于阻止液体上升到液体保留脊水平以上。

9.根据权利要求8所述的微孔板，其中所述液体保留壁架在距离所述第一孔和所述第二孔中的一个的内部边界至少0.2毫米处向外突起。

10.根据权利要求6所述的微孔板，其中所述液体保留壁架构造成当所述边框从水平位置倾斜或当边框经历脉冲式加速时，便于阻止液体流出所述第一孔和所述第二孔中的一个。

11.根据权利要求10所述的微孔板，其中所述液体保留壁架包括一矩形横截面。

12.根据权利要求10所述的微孔板，其中所述液体保留壁架包括一弯曲的底部，其中所述液体保留壁架的所述弯曲底部构造成在用液体填充所述第一孔和所述第二孔中的一个的过程中，便于阻止捕捉气泡。

13.根据权利要求12所述的微孔板，其中所述液体保留壁架构造成形成多个开口。

14.根据权利要求13所述的微孔板，其中所述多个开口中的第一个形成于所述第一孔和所述第二孔中的一个的内部边界附近。

15.根据权利要求14所述的微孔板，其中所述多个开口中的第二个形成于所述第一孔和所述第二孔中的一个的中心位置。

16.根据权利要求15所述的微孔板，其中所述多个开口中的所述的第一个和第二个是圆形的。

17.根据权利要求16所述的微孔板，其中所述多个开口的所述第二个的直径大于所述多个开口的所述第一个的直径。

18.根据权利要求17所述的微孔板，其中所述多个开口的所述第一个的直径为150微米。

19.根据权利要求6所述的微孔板，其中所述第一孔和所述第二孔中的包括液体保留壁架的一个进一步包括具有圆角的底部。