JP2003516129A

JP2003516129A - ポリヌクレオチド配列を解析する方法および装置

Info

Publication number: JP2003516129A
Application number: JP2001535610A
Authority: JP
Inventors: ステファンクウェイク; ウェインボルクマス; マークアンガー
Original assignee: California Institute of Technology CalTech
Current assignee: California Institute of Technology CalTech
Priority date: 1999-11-04
Filing date: 2000-11-06
Publication date: 2003-05-13
Also published as: CA2388528A1; EP1228244A4; WO2001032930A1; AU1471001A; WO2001032930A9; EP1228244A1

Abstract

(57)【要約】高速で高処理能力のポリヌクレオチド配列の解析法、および該方法を実施する装置が本発明で提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願の相互参照本非仮特許出願は、以前に出願した特許出願：１９９９年１１月４日に出願さ
れた、米国仮特許出願第６０／１６３，７４２号、および２０００年６月２７日
に出願された米国特許出願第０９／６０５，５２０号（これは次いで１９９９年
６月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／１４１，５０３号、１９９９年
８月３日に出願された米国仮特許出願第６０／１４７，１９９号、および２００
０年３月３日に出願された米国仮特許出願第６０／１８６，８５６号の恩典を請
求する）の恩典を請求する。これらの以前に出願された特許出願の文書は参照に
より本明細書に組み込むものとする。

【０００２】米国政府支援研究および開発のもとで作成された本発明の権利に関する記述本明細書に記載の研究は、一部には、ＮＩＨ助成金ＨＧ−０１６４２−０２に
より支援される。したがって、米国政府は本発明にある一定の権利を有し得る。

【０００３】技術分野本発明は、高速で高流量のポリヌクレオチド配列の解析法、およびこのような
方法を実施するための装置に関する。

【０００４】発明の背景伝統的なＤＮＡシークエンス技術は、配列決定へのそのアプローチにおいて、
３つの不可欠な段階を共有する。第一に、シークエンスすることが意図されるＤ
ＮＡ種から複数のＤＮＡ断片を作成する。これらの断片は、シークエンスするＤ
ＮＡ種の不完全なコピーである。目的は、各々前の断片より１塩基長い、ＤＮＡ
断片のラダーを作成することである。例えば、サンガー法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３、１９７７）で
は、標的ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼの鋳型として使用して、多くの不完全な
クローンを作成する。次いで、これらの断片（これは、それぞれの長さが１塩基
異なる）を、１塩基のサイズの差異を解像できる装置上で分離する。第三および
最終段階は、各断片の末端での塩基の性質の決定である。終結する断片のサイズ
順に並べると、これらの塩基は、元のＤＮＡ種の配列を示す。

【０００５】トネガッゾ（Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ）ら、６Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４６
０、１９８８；カンバラ（Ｋａｎｂａｒａ）ら、６Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
８１６、１９８８；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１３Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．
Ｒｅｓ．１３：２３９９、１９８５；米国特許第４，７０７，２３７号（１９８
７）に考察したようにＤＮＡ配列解析用の自動システムが開発されている。しか
し、これらの方法は全部、ゲル浸透手順によるＤＮＡ産物の分離、およびその後
、ゲル中での浸透軸または移動軸に沿って相互に比較したその位置の検出を必要
とする。これらの方法に使用されるこれらの装置は正確には自動シークエンサー
ではない。それらは単に自動ゲル解読器であり、これには、試料をゲルにのせる
前に標準的なシークエンス反応の実施が必要である。

【０００６】上記の方法の欠点は多い。大半の重大な問題は、ポリアクリルアミドゲル上で
ＤＮＡ断片をサイズ分離する必要性により引き起こされる。この工程は時間がか
かり、大量の高価な化学物質を使用し、ゲルの分解能の限界により、任意の１つ
の実験でシークエンスできる塩基の数がかなり制限される。サンガージデオキシ
配列決定法は、約５００ｂｐの解読長を有し、これはゲル電気泳動により制限さ
れる処理量である（約０．２％）。

【０００７】ポリヌクレオチド配列を解析する他の方法は、より近年に開発された。合成に
よるシークエンスと広く称されるこれらのいくつかの方法では、鋳型配列を、鋳
型をプライムし、その後一連の１塩基プライマー伸長反応を行うことにより決定
する（例えば、国際公開公報第９３／２１３４０号、国際公開公報第９６／２７
０２５号、および国際公開公報第９８／４４１５２号に記載される）。これらの
方法の基本的スキームは、ゲル上でのポリヌクレオチドの分離をもはや必要とし
ないが、大量の高価な試薬の消費、各段階後の試薬の除去の困難さ、長い交換時
間による誤った取込み、取り込んだヌクレオチドから標識を除去する必要性、お
よび標識が除去されていない場合にはさらなる取込みを検出する困難さなどの種
々の他の問題に遭遇する。これらの困難の多くは、使用した巨視的流体工学の限
界から直接派生する。しかし、少量の流体工学は使用できない。結果として、こ
れらの方法は、実際には伝統的なゲルを用いたシークエンススキームの代用とな
っていない。当業者は、大体において、依然としてゲルを用いたシークエンス法
に依拠している。

【０００８】従って、使用可能な走査および検出技術を使用して自動化できる、高速で高流
量のより長いポリヌクレオチド配列の解析用の方法および装置が当技術分野で必
要である。本発明は、この必要性および他の必要性を満たす。

【０００９】発明の概要本発明の１つの局面において、標的ポリヌクレオチドの配列の解析法が提供さ
れる。これらの方法は、（ａ）微細加工合成チャネルに連結した開始標的ポリヌ
クレオチドを提供する段階、（ｂ）標的ポリヌクレオチドの鋳型として作用する
相補的ヌクレオチドが存在する場合に、第一ヌクレオチドがプライマーに付着す
る条件下で、合成チャネルを通じて第一ヌクレオチドを流す段階、（ｃ）シグナ
ルの存在または非存在、ここでのシグナルの存在は、第一ヌクレオチドがプライ
マーに取込まれることを示し、よって標的ポリヌクレオチドの鋳型として作用す
る相補的塩基の実体を決定する段階、（ｄ）存在する場合には、シグナルを除去
または減少する段階、および（ｅ）第一ヌクレオチドと同じまたは異なるさらな
るヌクレオチドを用いて段階（ｂ）〜（ｄ）を繰返し、これにより、さらなるヌ
クレオチドがプライマーまたはプライマーにあらかじめ取り込まれたヌクレオチ
ドに付着する段階を含む。

【００１０】いくつかの方法では、段階（ａ）は、異なる合成チャネルに連結した複数の異
なる開始標的ポリヌクレオチドを提供することを含み、段階（ｂ）は、合成チャ
ネルの各々を通じて第一ヌクレオチドを流すことを含み、かつ段階（ｃ）は、チ
ャネルの各々におけるシグナルの存在または非存在、ここで合成チャネル中のシ
グナルの存在は、第一ヌクレオチドが合成チャネル中のプライマーに取り込まれ
たことを示し、よって合成チャネル中の標的ポリヌクレオチドの鋳型として作用
する相補的塩基の実体を決定することを含む。いくつかの方法では、複数の異な
る開始標的ポリヌクレオチドが各合成チャネルに連結される。

【００１１】いくつかの方法は、合成チャネルを洗い流し、取り込まれていないヌクレオチ
ドを除去するさらなる段階を含む。いくつかの方法では、段階（ｂ）〜（ｄ）を
、少なくとも４回、４つの異なる型のヌクレオチドを用いて実施する。いくつか
の方法では、段階（ｂ）〜（ｄ）を、標的ポリヌクレオチドの各塩基の実体が同
定されるまで実施する。

【００１２】いくつかの方法では、ヌクレオチドを標識する。標識は、蛍光染料であり得、
シグナルは光学的に検出できる。標識はまた放射標識であり得、シグナルは、放
射性検出器を用いて検出できる。いくつかの方法では、ヌクレオチドの取込みは
、ピロホスフェート放出の測定により検出する。

【００１３】いくつかの方法では、合成チャネルは、ミクロ流体チップを平坦な基質に結合
することにより形成される。これらの方法のいくつかでは、標的ポリヌクレオチ
ドを、合成チャネルの基質の内部表面に固定する。これらのいくつかの方法では
、内部表面は、多価電解質多層（ＰＥＭ）で覆膜されている。これらのいくつか
の方法では、ミクロ流体チップは、ＲＴＶシリコンなどのエラストマー物質で加
工されている。

【００１４】本発明の別の局面において、標的ポリヌクレオチドを解析する方法は、（ａ）
基質の表面を前処理して、ポリヌクレオチド付着および配列解析を容易にする表
面化学を形成すること、（ｂ）表面に付着した開始標的ポリヌクレオチドを提供
すること、（ｃ）標的ポリヌクレオチドの鋳型として作用する相補的ヌクレオチ
ドが存在する場合、標識第一ヌクレオチドを、標識第一ヌクレオチドがプライマ
ーに付着する条件下で付着標的ポリヌクレオチドに提供すること、（ｄ）プライ
マーからのシグナルの存在または非存在、ここでシグナルの存在は、標識第一ヌ
クレオチドがプライマーに取り込まれたことを示し、よって標的ポリヌクレオチ
ドの鋳型として作用する相補的塩基の実体を決定すること、および（ｅ）第一標
識ヌクレオチドと同じまたは異なる標識されたさらなるヌクレオチドを用いて段
階（ｃ）〜（ｄ）を繰返し、これにより、標識されたさらなるヌクレオチドは、
プライマーまたはプライマーにあらかじめ取り込まれたヌクレオチドに付着する
ことを包含する。

【００１５】これらの方法のいくつかでは、基質はガラスであり、表面は多価電解質多層（
ＰＥＭ）で覆膜されている。いくつかの方法では、ＰＥＭは、ポリアニオンで終
結している。いくつかの方法では、ポリアニオンは、カルボン酸基で終結してい
る。いくつかの方法では、標的ポリヌクレオチドはビオチニル化され、ＰＥＭ覆
膜表面はさらに、ビオチンおよび次いでストレプトアビジンで覆膜されている。

【００１６】本発明のさらに別の局面において、（ａ）開始標的ポリヌクレオチドを提供す
る段階、（ｂ）標的ポリヌクレオチドの鋳型として作用する相補的ヌクレオチド
が存在する場合、第一ヌクレオチドがプライマーに付着する条件下で画分が標識
されている、第一の型のヌクレオチドを提供する段階、（ｃ）プライマーからの
シグナルの存在または非存在、ここでシグナルの存在は、第一ヌクレオチドがプ
ライマーに取り込まれたことを示し、よって標的ポリヌクレオチドの鋳型として
作用する相補的塩基の実体を決定する段階、（ｄ）画分が同じように標識され、
第一の型のヌクレオチドと同じまたは異なる、さらなる型のヌクレオチドを用い
て段階（ｂ）〜（ｃ）を繰返し、これにより、さらなるヌクレオチドが、プライ
マーまたはプライマーにあらかじめ取り込まれたヌクレオチドに付着する段階を
含む、標的ポリヌクレオチドを解析する方法が提供される。

【００１７】これらの方法のいくつかでは、使用する標識は、蛍光標識である。これらのい
くつかの方法では、除去または減少段階は、光退色により実施する。これらのい
くつかの方法では、標識ヌクレオチドの画分は、１０％未満、１％未満、０．１
％未満、または０．０１％未満である。

【００１８】本発明の別の局面において、ポリヌクレオチドの配列を解析する装置が提供さ
れる。これらの装置は、（ａ）少なくとも１つの微細加工合成チャネルを有する
フローセル、および（ｂ）フローセルと液体伝達し、デオキシヌクレオシド三リ
ン酸およびヌクレオチドポリメラーゼなどの流体をフローセル中におよびフロー
セルを通じて流す、入口ポートおよび出口ポートを有する。装置のいくつかは、
さらに、（ｃ）合成チャネルの表面で光を指向する光源、および（ｄ）表面から
のシグナルを検出する検出器を有する。

【００１９】いくつかの装置では、合成チャネルは、ミクロ流体チップを平坦な基質に結合
することにより形成される。いくつかの装置では、ミクロ流体チップはまた、合
成チャネルを含む統合システムで微細加工バルブおよび微細加工ポンプを含む。
これらの装置のいくつかでは、反応試薬を保存する複数のリザーバも存在し、微
細加工バルブおよびポンプがリザーバに接続している。いくつかの装置では、検
出器は光子計測カメラである。いくつかの装置では、ミクロ流体チップは、ＲＴ
Ｖシリコーンなどのエラストマー物質で加工されている。いくつかの装置の基質
は、ガラスカバースリップである。いくつかの装置の合成チャネルの横断面は、
１００μｍ×１００μｍ未満、１０μｍ×１００μｍ未満、１μｍ×１０μｍ未
満、または０．１μｍ×１μｍ未満の線形寸法を有する。

【００２０】詳細な説明Ｉ．概要本発明は、ポリヌクレオチド配列を解析するための方法および装置を提供する
。

【００２１】いくつかの方法では、シークエンス装置は、ポリヌクレオチド鋳型が付着する
微細加工フローチャネルを含む。選択的に、装置は、複数の微細加工チャネルを
含み、多様なポリヌクレオチド鋳型は各チャネルに付着できる。装置はまた、種
々の反応試薬を保存する複数のリザーバ、および試薬の流れを制御するポンプお
よびバルブを有してもよい。フローセルはまた、光学調査の可能な窓を有し得る
。

【００２２】これらの方法では、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型をプライマーと共に、微細加
工チャネルの表面に、または、微細加工フローチャネルに沿って配置された反応
チャンバーの表面に、例えばストレプトアビジン−ビオチン連結を用いて固定す
る。鋳型の固定後、ポリメラーゼおよび４つのヌクレオチド三リン酸の１つを、
フローセルに流し、鋳型と共にインキュベートし、流出する。シグナルが検出さ
れなければ、工程を、異なる型のヌクレオチドを用いて繰返す。

【００２３】これらの方法は、以前に考察した他の合成法によるシークエンスよりも有利で
ある。第一に、微細加工シークエンス装置の使用により、試薬の消費が減少する
。それにより、試薬交換率および配列解析速度も増加する。さらに、微細加工装
置は、平行化を提供し、多くの合成チャネルを、同じ基質上に構築できる。これ
により、複数の多様なポリヌクレオチド配列を同時に解析できる。さらに、解析
中の異なる段階間の試薬を交換する時間およびデッドボリュームの減少により、
誤取込みが大きく減少する。さらに、ポリメラーゼが違うヌクレオチドを取込む
時間が少なくなり、ポリメラーゼが鋳型から外れる可能性が低くなるために、解
読長も向上する。これらの全ての利点が、高速で高流量の配列解析の形態となる
。

【００２４】本発明のいくつかの方法では、基質の表面（例えばガラスカバースリップ）を
前処理して、ポリヌクレオチド鋳型付着およびその後の配列解析を容易にする最
適な表面化学を形成する。これらの方法のいくつかでは、基質表面は多価電解質
多層（ＰＥＭ）で覆膜する。ＰＥＭ覆膜後、ビオチンをＰＥＭに塗布でき、次い
でストレプトアビジンを塗布できる。次いで、基質表面を使用して、ビオチニル
化鋳型を付着できる。ＰＥＭ覆膜基質は、鋳型ポリヌクレオチドの固定、および
、ポリメラーゼ伸長反応における実質的な利点を提供する。第一に、ＰＥＭは、
カルボン酸を有するポリマーで容易に終結できるので、ポリヌクレオチドを付着
することは容易である。第二に、付着した鋳型は、ポリメラーゼによる伸長に活
性であり、最も可能性が高いのは、類似の荷電の反発により、鋳型が基質上に「
置かれる」ことを防ぐ。最後に、陰性荷電はヌクレオチドをはじき、非特異的結
合は低い。

【００２５】本発明のいくつかの他の方法では、伸長反応に存在するほんの僅かな比率の各
型のヌクレオチドを、例えば、蛍光染料で標識する。結果として、比較的小数の
取込みヌクレオチドが、蛍光標識され、エネルギー移行の干渉は最小限であり、
ポリメラーゼは、鋳型から抜け落ちる可能性は低いか、または２つの標識ヌクレ
オチドの連続的取込みにより「つまる」ようである。選択的に、取り込まれた蛍
光シグナルは、光退色により消失する。光退色戦略を用いることによって、段階
数を減らすことが出来る（例えば、各伸長サイクル後に標識の除去を実施する必
要はないであろう）。これらの利点により、取込みシグナルのより正確な検出、
ポリメラーゼのより効率的な消費、および迅速なシークエンス法が得られる。

【００２６】ＩＩ．定義特記しない限り、本明細書に使用した全ての技術的および科学的用語は、本発
明が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文
献は、当業者に、本発明に使用した多くの用語の一般的定義を提供する：シング
レトン（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ）ら、「微生物分子生物学辞典（ＤＩＣＴＩＯＮＡ
ＲＹＯＦＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯ
ＬＯＧＹ）」（第２版、１９９４）；「科学技術ケンブリッジ辞典（ＴＨＥＣ
ＡＭＢＲＩＤＧＥＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹＯＦＳＣＩＥＮＣＥＡＮＤＴ
ＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）」（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）編、１９８８）；および
ヘイルおよびマーハン（Ｈａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ）、「生物学のハーパーコリー
ンズ辞典（ＴＨＥＨＡＲＰＥＲＣＯＬＬＩＮＳＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹＯ
ＦＢＩＯＬＯＧＹ）」（１９９１）。本明細書に記載したものと類似または等
価な任意の方法および物質を、本発明の実施または試験に使用できるが、好まし
い方法および物質が記載されている。以下の定義は、読者が本発明を実施するの
を支援するために提供する。

【００２７】「核酸」または「核酸分子」という用語は、一本鎖または二本鎖形のデオキシ
リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、特記しない限り、
天然ヌクレオチドと類似の方法で機能できる、既知の天然ヌクレオチド類似体を
包含し得る。

【００２８】「ヌクレオシド」とは、リボヌクレオシドおよび２’−デオキシリボヌクレオ
シド、並びに、修飾塩基または糖骨格を有するヌクレオシド類似体をはじめとす
る、天然ヌクレオシドを含む。

【００２９】「塩基」または「塩基型」とは、ヌクレオシド塩基の特定の型、例えば、アデ
ニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−メチルシトシン、５−ブロ
モウラシル、２−アミノプリン、デオキシイノシン、Ｎ^４−メトキシデオキシシ
トシン等を意味する。

【００３０】「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリ
ボヌクレオチドまたはヌクレオチドサブユニットからなる分子を意味する。ヌク
レオシドサブユニット間の結合は、ホスフェート、ホスホネート、ホスホラミダ
イト、ホスホロチオエートなどにより、または当技術分野で公知のような非ホス
ホネート基、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）に使用されるペプトイド型の統合に
より提供され得る。統合基は、キラルまたは非キラルであり得る。オリゴヌクレ
オチドまたはポリヌクレオチドは、２個のヌクレオシドサブユニットから、数百
または数千個のヌクレオシドサブユニット長の範囲であり得る。オリゴヌクレオ
チドは好ましくは５〜１００サブユニット長であり、より好ましくは５〜６０サ
ブユニット長であり、ポリヌクレオチドの長さははるかに大きくあり得る（例え
ば１００Ｋｂまで）。

【００３１】特異的ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下での、特定のヌ
クレオチド配列のみへの分子への結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズを意
味する。ストリンジェントな条件は、プローブがその標的サブ配列にハイブリダ
イズできるが、他の配列にはハイブリダイズできない条件である。ストリンジェ
ントな条件は配列依存的であり、異なる環境では異なる。より長い配列は、より
高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、
規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列において融点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃低
く選択される。Ｔ_ｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配
列にハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下の）温度
である。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３での少な
くとも約０．０１〜１．０ＭＮａイオン濃度（または他の塩）の塩濃度を含み
、温度は、短いプローブ（例えば１０〜５０個のヌクレオチド）では少なくとも
約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドまたはテトラア
ルキルアンモニウム塩などの脱安定化剤の添加により達成できる。例えば、５Ｘ
ＳＳＰＥ（７５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａホスフェート、５ｍＭＥ
ＤＴＡ、ｐＨ７．４）および温度２５〜３０℃の条件が、対立遺伝子特異的プロ
ーブハイブリダイゼーションに適している（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クロー
ニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）」、１９８９参照）。

【００３２】「鋳型のポリヌクレオチド配列の解析」により、試料断片中の少なくとも３個
の連続した塩基サブユニットの配列、または、単一塩基型についての配列情報が
入手可能である場合、断片に連続的な順で存在する少なくとも３個のサブユニッ
トの同一塩基型の相対位置を決定することを意味する。後者の意味の例は、決定
された配列「ＡＸＸＡＸＡ」（５’＞３’）であり、ここでは一連の３個のアデ
ニン（Ａ）塩基が、試料断片中で、２つの他の塩基型、次いで１つの他の塩基型
分離れていることが見出される。

【００３３】「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が
誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドおよび誘導物質、例えばＤＮＡポリ
メラーゼの存在下で、適切な温度およびｐＨ）に置いた場合に合成開始点として
作用できる、精製制限消化物中のように天然または合成的に作成した、オリゴヌ
クレオチドを意味する。プライマーは、好ましくは、増幅の最大効率のためには
一本鎖であるが、また、二本鎖でもよい。二本鎖である場合、プライマーを最初
に処理して、伸長産物の調製に使用する前にその鎖を分離する。好ましくは、プ
ライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導物質の
存在下で伸長産物の合成を開始するのに十分長くなくてはならない。プライマー
の正確な長さは、温度、プライマー源、および方法の用途を含む、多くの要因に
依存する。

【００３４】プライマーは、鋳型の特異的配列鎖に「実質的に」相補的であるように選択す
る。プライマーは、プライマー伸長が起こるために、鋳型鎖とハイブリダイズす
るに十分相補的でなければならない。プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反
映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片はプライマーの５’末端
に付着でき、プライマー配列の残りは、実質的に鎖に相補的である。非相補的塩
基またはより長い配列は、プライマー中に分散できるが、ただし、プライマー配
列は、ハイブリダイズし、プライマーの伸長産物の合成のために鋳型プライマー
複合体を形成するために、鋳型の配列と十分な相補性を有する。

【００３５】「プローブ」という用語は、目的の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ
できる、精製制限酵素消化物中のように天然または合成、組換えまたはＰＣＲ増
幅により作成した、オリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）を意味す
る。プローブは一本鎖でも二本鎖でもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検
出、同定および単離に有用である。本発明に使用した任意のプローブは、任意の
「レポーター分子」で標識でき、よって、蛍光、酵素（例えばＥＬＩＳＡ、並び
に、酵素を用いた組織化学的アッセイ法）、放射能、量子ドット、および発光シ
ステムを含むがこれに限定されない、任意の検出システムで検出可能であると考
えられる。本発明は、いかなる特定の検出システムまたは標識に限定されるもの
ではない。

【００３６】「鋳型」という用語は、ポリメラーゼと混合する核酸などの、作用を受ける核
酸を意味する。ある場合では「鋳型」とは、他の核酸配列とは分別されるとする
。「実質的に一本鎖の鋳型」とは、完全に一本鎖（二本鎖領域を有さない）また
は比例的に小領域の二本鎖核酸（例えば、ハイブリダイズしたプライマーにより
規定される領域、または、分子内結合により規定される領域）を除き一本鎖であ
る、核酸である。「実質的に二本鎖の鋳型」とは、完全に二本鎖（一本鎖領域を
有さない）または比例的に小領域の一本鎖核酸を除き二本鎖である、核酸である
。

【００３７】ＩＩＩ．シークエンス装置Ａ．装置の基本特徴装置は、シークエンスするポリヌクレオチド鋳型が付着する微細加工チャネル
を含む。選択的に、装置は、反応試薬を流すための配管構成部品（例えばポンプ
、バルブおよび接続チャネル）を含む。装置は、反応試薬を保存するリザーバの
アレイも含み得る（例えば、ポリメラーゼ、各種のヌクレオチド、および他の試
薬を各々、異なるリザーバに保存できる）。

【００３８】装置の微細加工構成部品は全て、基本的な「フローチャネル」構造を有する。
「フローチャネル」または「微細加工フローチャネル」という用語は、液体また
は気体の流れを含み得る、構造の凹部を意味する。ポリヌクレオチド鋳型は、合
成が起こる微細加工チャネルの内部表面に付着している。一貫性および明瞭性の
ために、フローチャネルは、このような特定の用途に言及する場合、「合成チャ
ネル」と称される。微細加工フローチャネルはまた、装置の配管構成部品（例え
ばマイクロポンプ、マイクロバルブ、または接続チャネル）として機能するよう
に作動できる。

【００３９】いくつかの適用において、微細加工フローチャネルは、チップ（例えばエラス
トマーチップ）上に鋳造されている。合成チャネルは、チャネルをシールする平
坦な基質（例えばガラスカバースリップ）に、チップを結合することにより形成
される。従って、合成チャネルの片側は、平坦な基質により提供される。典型的
には、ポリヌクレオチド鋳型は、合成チャネル内の基質の内部表面に付着してい
る。

【００４０】配管構成部品は、本発明に記載のように微細加工できる。例えば、装置は、統
合システムに、複数の合成チャネルが存在するフローセル、およびフローセルに
入るおよびフローセルから出る試薬の流れを制御する流体構成部品（例えばマイ
クロポンプ、マイクロバルブ、および接続チャネル）を含み得る。また、本発明
のシークエンス装置は、ズデブリック（Ｚｄｅｂｌｉｃｋ）ら、「小型電気流体
バルブ、固形状態トランスデューサーおよびアクチュエーターの第４回国際会議
紀要（ＡＭｉｃｒｏｍｉｎｉａｔｕｒｅＥｌｅｃｔｒｉｃ−ｔｏ−Ｆｌｕｉ
ｄｉｃＶａｌｖｅ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅ４ｔｈＩｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＳｏｌｉｄＳｔａｔｅ
ＴｒａｎｓｄｕｃｅｒｓａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒｓ）」、１９８７；ショ
ージ（Ｓｈｏｊｉ）ら、「統合化学解析システム用の最も小さいデッドボリュー
ムのマイクロバルブ、トランスデューサー紀要９１年（ＳｍａｌｌｅｓｔＤｅ
ａｄＶｏｌｕｍｅＭｉｃｒｏｖａｌｖｅｓｆｏｒＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ＣｈｅｍｉｃａｌＡｎａｌｙｚｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓｏｆＴｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ ’９１）」、サンフランシスコ、１９
９１；ヴィーダー（Ｖｉｅｉｄｅｒ）ら、「流体処理シムテムとの統合用のシリ
コーンゴムを備えた空気作用性マイクロバルブ、トランスデューサー紀要９５年
（ＡＰｎｅｕｍａｔｉｃａｌｌｙＡｃｔｕａｔｅｄＭｉｃｒｏＶａｌｖ
ｅｗｉｔｈａＳｉｌｉｃｏｎＲｕｂｂｅｒＭｅｍｂｒａｎｅｆｏｒ
ＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｗｉｔｈＦｌｕｉｄＨａｎｄｌｉｎｇＳｙｓ
ｔｅｍｓ、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＴｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ ’９５）
」、ストックホルム、１９９５に記載の配管装置を用いる。

【００４１】上記したように、装置の構成部品の少なくともいくつかは、微細加工されてい
る。微細加工合成チャネルおよび／または微細加工配管構成部品の使用は、デッ
ドボリュームを有意に減少させ、試薬の交換に必要な時間を短縮し、よって流量
は増加する。微細加工は、マイクロレベルでの主な寸法を意味し、微細加工構造
の少なくとも１つの寸法は１０００μｍ未満である。いくつかの装置では、合成
チャネルのみが微細加工されている。いくつかの装置では、合成チャネルに加え
て、バルブ、ポンプおよび接続チャネルも微細加工されている。特記しない限り
、微細加工に関する以下の考察を、シークエンス装置の全ての微細加工構成部品
の作成に適用可能である（例えば、シークエンス反応が起こる合成チャネル、お
よびバルブ、ポンプ、および、合成チャネルへの試薬の流れを制御する接続チャ
ネル）。

【００４２】種々の物質を使用して、微細加工構成部品を加工できる（例えば、Ｕｎｇｅｒ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８８：１１３〜１１６、２０００参照）。好ましくは、
エラストマー物質を使用する。従って、いくつかの装置では、統合（すなわちモ
ノリシック）ミクロ構造は、共に結合した種々のエラストマー層からなる。これ
らの種々のエラストマー層を共に結合することにより、種々のエラストマー層に
沿って伸長する凹部は、得られたモノリシックな統合エラストマー構造を通じて
フローチャネルを形成する。

【００４３】一般に、微細加工構造（例えば合成チャネル、ポンプ、バルブ、および接続チ
ャネル）は、約０．０１〜１０００μｍの幅を有し、幅対深さの比は０．１：１
〜１００：１である。好ましくは、幅は１０〜２００μｍの範囲であり、幅対深
さの比は３：１から１５：１である。

【００４４】Ｂ．エラストマー物質を用いた微細加工１．基本的な微細加工法種々の方法を使用して、本発明のシークエンス装置の微細加工構成部品を作成
できる。ミクロチャネル、バルブ、ポンプの加工は、参照により本明細書に組み
込むものとする、ウンガー（Ｕｎｇｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８８：１１３
〜１１６、２０００に記載のとおりに実施できる。いくつかの方法では（図１〜
７Ｂ）、予め硬化したエラストマー層を会合し、結合させて、フローチャネルを
作成する。図１に示したように、第一のミクロ機械加工された型１０を提供する
。ミクロ機械加工された型１０は、フォトリソグラフィ、イオンエッチング、お
よび電子ビームリソグラフィーを含むがこれに限定されない、多くの慣用的なシ
リコン処理法により加工できる。ミクロ機械加工された型１０は、高くした線ま
たはそれに沿って伸長する突出部１１を有する。第一エラストマー層２０は、第
一の凹部２１が、示したように、エラストマー層２０の下表面に形成され得るよ
うに型１０の上に鋳造される（凹部２１は、突出部１１の寸法に対応する）。

【００４５】図２から分かるように、それに沿って伸長する高くした突出部１３を有する、
第二のミクロ機械加工された型１２も提供される。第二エラストマー層２２を、
示したように、凹部２３が、突出部１３の寸法に対応する底表面に形成され得る
ように型１２の上に鋳造する。

【００４６】図３および４で示されている連続的段階で分かるように、その後、第二のエラ
ストマー層２２を型１２から取り出し、第一エラストマー層２０の上に配置する
。分かるように、第二のエラストマー層２２の底表面に沿って伸長する凹部２３
は、フローチャネル３２を形成する。

【００４７】図５を参照し、別々の第一および第二エラストマー層２０および２２（図４）
を共に結合して、統合された（すなわちモノリシック）エラストマー構造２４を
形成する。

【００４８】図６および７Ａの連続的段階で分かるように、その後、エラストマー構造２４
を、型１０から取り出し、平面基質１４の上に配置する。図７Ａおよび７Ｂで分
かるように、エラストマー構造２４がその底表面で平面基質１４にシールされて
いる場合、凹部２１はフローチャネル３０を形成する。

【００４９】本発明のエラストマー構造は、ほぼ全ての平滑な平面基質と可逆性の溶接シー
ルを形成する。シールをこのように形成する利点は、エラストマー構造を剥がし
、洗浄し、再使用できることである。いくつかの装置では、平面基質１４はガラ
スである。ガラスを使用するさらなる利点は、ガラスが透明であり、エラストマ
ーチャネルおよびリザーバの光学的調査が可能であることである。または、エラ
ストマー構造は、上記と同じ方法により、平らなエラストマー層に結合でき、永
久的かつ高い強度の結合を形成する。これは、高い逆圧を使用する場合に有利で
あることが証明し得る。

【００５０】いくつかの方法では、微細加工は、「所定の場所で」各層のエラストマーを硬
化することに関与する（図８〜１８）。これらの方法では、フローおよび制御チ
ャネルは、最初にエラストマー層の表面（または他の基質、これはガラスを含み
得る）上で犠牲層のパターンを形成し、チャネルが望まれる犠牲層の高くした線
を残すことにより規定される。次に、エラストマーの第二層をその上に加え、第
二犠牲層を、第二層のエラストマー上でパターン形成し、チャネルが望まれる犠
牲層の高くした線を残す。第三層のエラストマーをその上に堆積する。最後に、
犠牲層を、それを適切な溶媒を用いてエラストマーから溶解し出すことにより除
去し、犠牲層の除去により形成される空隙は、基質を通過するフローチャネルと
なる。

【００５１】最初に図８を参照すると、平面基質４０を提供する。次いで、第一のエラスト
マー層４２を、平面基質４０の上に堆積および硬化する。図９を参照すると、そ
の後、第一犠牲層４４Ａを、エラストマー層４２の上に堆積する。図１０を参照
すると、第一のラインの犠牲層４４Ｂが示したように残るように犠牲層４４Ａの
一部が除去される。図１１を参照すると、その後、第二のエラストマー層４６を
、第一エラストマー層４２の上に、および、示したように第一のラインの犠牲層
４４Ｂの上に堆積し、これにより、第一エラストマー層４２と第二エラストマー
層４６の間の第一のラインの犠牲層４４Ｂを包む。図１２を参照すると、その後
、エラストマー層４６を、層４２上で硬化し、共に層を結合し、モノリシックな
エラストマー基質４５を形成する。

【００５２】図１３を参照すると、その後、第二の犠牲層４８Ａをエラストマー構造４５の
上に堆積する。図１４を参照すると、第二の犠牲層４８Ａの一部を除去し、示し
たようなエラストマー構造４５の上に第二の犠牲層４８Ｂのみが残る。図１５を
参照すると、第三のエラストマー層５０を示したようにエラストマー構造４５（
第二のエラストマー層４２および第一のラインの犠牲層４４Ｂからなる）および
第二の犠牲層４８Ｂの上に堆積し、これにより、エラストマー構造４５と第三の
エラストマー層５０の間の第二のラインの犠牲層４８Ｂを包む。

【００５３】図１６を参照すると、第三エラストマー層５０およびエラストマー構造４５（
共に結合した第一エラストマー層４２および第二エラストマー層４６を含む）を
その後、共に結合し、示したようにそれを通過している犠牲層４４Ｂおよび４８
Ｂを有するモノリシックなエラストマー構造４７を形成する。図１７を参照する
と、犠牲層４４Ｂおよび４８Ｂをその後、除去し（例えば溶媒により）、よって
、エラストマー構造４７を通過している、第一フローチャネル６０および第二フ
ローチャネル６２がその場に提供される。最後に、図１８を参照すると、平面基
質４０は、統合されたモノリシック構造の底から除去できる。

【００５４】２．多層構築柔らかいリソグラフィック結合を使用して、複数のフローチャネルを含む統合
システムを構築できる。異なる層が異なる化学である、異種結合を使用できる。
例えば、それぞれのエラストマー層を共に結合するのに使用した結合工程は、２
つのＲＴＶ６１５シリコーン層を共に結合することを含み得る。ＲＴＶ６１５シ
リコーンは、２部の付加硬化シリコーンゴムである。Ａ部は、ビニル基および触
媒を含み、Ｂ部は水素化ケイ素（Ｓｉ−Ｈ）基を含む。ＲＴＶ６１５の慣用的な
比は１０Ａ：１Ｂである。結合では、ある層は３０Ａ：１Ｂ（すなわち過剰のビ
ニル基）で製造でき、ある層は３Ａ：１Ｂ（すなわち過剰のＳｉ−Ｈ基）で製造
できる。各層は別々に硬化する。２つの層を接触させ、高温で加熱した場合、そ
れらは不可逆的に結合し、モノリシックエラストマー基質を形成する。

【００５５】全ての層が同じ化学である、均一な結合も使用できる。例えば、エラストマー
構造を、Ｓｙｌｇａｒｄ１８２、１８４または１８６または脂肪族ウレタンジア
クリレート、例えば（しかしこれに限定されない）ＵＣＢケミカルのＥｂｅｃｒ
ｙｌ２７０またはＩｒｒ２４５を使用して形成される。例えば、２層のエラス
トマー構造を、純粋なアクリル化ウレタンＥｂｅ２７０から加工した。薄い底層
を８０００ｒｐｍで１５秒間１７０℃で回転覆膜した。上および底の層を最初に
、紫外線光下で１０分間窒素下で、エレクトロライト（Ｅｌｅｃｔｒｏｌｉｔｅ
）社製のモデルＥＬＣ５００装置を使用して硬化した。組み立てられた層をその
後、さらに３０分間硬化した。反応は、チバガイギーケミカルズ（Ｃｉｂａ−Ｇ
ｅｉｇｙＣｈｅｍｉｃａｌｓ）製のＩｒｇａｃｕｒｅ５００の０．５％体積／
体積混合物により触媒した。得られたエラストマー物質は、中程度の弾性および
ガラスへの粘着を示した。

【００５６】いくつかの適用において、２層エラストマー構造は、薄い底の層として２５％
Ｅｂｅ２７０／５０％Ｉｒｒ２４５／２５％イソプロピルアルコールと、一番上
の層として純粋なアクリル化ウレタンＥｂｅ２７０の組合せから加工した。薄い
底の層は、最初に５分間硬化し、一番上の層は最初に１０分間、紫外線光下で、
窒素下で、エレクトロライト社製のモデルＥＬＣ５００装置を使用して硬化した
。組み立てられた層はその後、さらに３０分間硬化した。反応は、チバガイギー
ケミカルズ製のＩｒｇａｃｕｒｅ５００の０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ混合物により
触媒した。得られたエラストマー物質は、中程度の弾性およびガラスへの粘着を
示した。

【００５７】犠牲層の封入を使用して、図８〜１８で上記したようなエラストマー構造を加
工する場合、連続的なエラストマー層の結合は、非硬化エラストマーを、あらか
じめ硬化したエラストマー層に注ぐことにより行なうことができ、任意の犠牲物
質がその上にパターン形成できる。エラストマー層の間の結合は、非硬化エラス
トマー層のポリマー鎖と、硬化エラストマー層のポリマー鎖の相互浸透および反
応により起こる。その後のエラストマー層の硬化により、エラストマー層の間に
結合が形成され、モノリシックなエラストマー構造が形成される。

【００５８】図１〜７Ｂの第一の方法を参照すると、ＲＴＶ混合物を、微細加工型１２上で
２０００ｒｐｍで３０秒間回転覆膜し、厚さ約４０μｍとすることにより第一の
エラストマー層２０を形成できる。第二のエラストマー層２２は、ＲＴＶ混合物
を微細加工型１１上で回転覆膜することにより形成できる。層２０および２２の
両方を、約８０℃で１．５時間別々に焼くまたは硬化できる。第二のエラストマ
ー層２２は、第一のエラストマー層２０に約８０℃で約１．５時間結合できる。

【００５９】ミクロ機械加工された型１０および１２は、シリコンウエハ上にパターン形成
した犠牲層であり得る。例示的な局面において、マスクとして高分解能透明フィ
ルムでパターン形成したＳｈｉｐｌｅｙＳＪＲ５７４０犠牲層を、２０００ｒ
ｐｍで回転し、その後展開すると、約１０μｍの高さの逆チャネルを生じた。約
２００℃で約３０分間焼くと、犠牲層は再度流れ、逆チャネルは丸くなる。好ま
しい局面において、型を、シリコーンゴムの粘着を防ぐためにそれぞれ使用前に
、トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）蒸気で約１分間処理できる。

【００６０】３．適切な物質アルコック（Ａｌｌｃｏｃｋ）ら、「現代のポリマー化学（Ｃｏｎｔｅｍｐｏ
ｒａｒｙＰｏｌｙｍｅｒＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第２版は、一般に、その
ガラス遷移温度と液化温度の間の温度を示すポリマーとしてのエラストマーを記
載する。ポリマー鎖は容易に、ねじれ運動を受け、力に応答して骨格鎖のコイル
戻しが可能となり、骨格鎖は、力の非存在下で前の形状を推定するように再度コ
イル化するのでエラストマー物質はエラストマー特性を示す。一般に、力がかか
るとエラストマーは変形するが、その後、力を除去するとその最初の形状に戻る
。エラストマー物質により示される弾性は、ヤング率により特徴づけることがで
きる。約１Ｐａ〜１ＴＰａ、より好ましくは約１０Ｐａ〜１００Ｇｐａ、より好
ましくは約２０Ｐａ〜１ＧＰａ、より好ましくは約５０Ｐａ〜１０ＭＰａ、より
好ましくは約１００Ｐａ〜１ＭＰａのヤング率を有するエラストマー物質が本発
明に有用であるが、これらの範囲外のヤング率を有するエラストマー物質も、特
定の用途の必要性に応じて使用できる。

【００６１】本発明のシステムは、多種多様のエラストマーから加工できる。例えば、エラ
ストマー層２０、２２、４２、４６、および５０は、好ましくは、シリコーンゴ
ムから加工できる。いくつかの適用において、本発明のシステムのミクロ構造は
、ＧＥＲＴＶ６１５（配合）、ビニル−シラン架橋（型）シリコーンエラスト
マー（族）などのエラストマーポリマーから加工する。好ましい加工法の重要な
必要条件は、エラストマーの複数の層を共に結合できることである。多層の軟ら
かいリソグラフィーの場合、エラストマーの層を別々に硬化し、その後、共に結
合する。このスキームは、硬化した層が共に結合する十分な反応性を有すること
を必要とする。層は同じ型であり得、それ自体に結合できるか、または、２つの
異なる型であり得、互いに結合できる。他の可能性は、層間の粘着剤の使用およ
び熱硬化性エラストマーの使用を含む。

【００６２】ポリマー化学、前駆体、合成法、反応条件、および可能性ある添加剤の甚だし
い多様性から、モノリシックなエラストマーミクロ構造の製造に使用できる莫大
な数の可能性あるエラストマーシステムが存在する。最も可能性の高い使用され
る物質の多様性は、特定の物質特性、すなわち、溶媒抵抗性、剛性、ガス浸透性
、または温度安定性の必要性により派生する。

【００６３】一般的なエラストマーポリマーは、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリク
ロロプレン、ポリイソブチレン、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、ポ
リウレタン、およびシリコーンを含むがこれに限定されない。以下は、本発明に
関連して使用できるエラストマー物質の非排除的なリストである：ポリイソプレ
ン、ポリブタジエン、ポリクロロプレン、ポリイソブチレン、ポリ（スチレン−
ブタジエン−スチレン）、ポリウレタン、およびシリコーンポリマー；またはポ
リ（ビス（フルオロアルコキシ）ホスファゼン）（ＰＮＦ、Ｅｙｐｅｌ−Ｆ）、
ポリ（カルボラン−シロキサン）（デキシル（Ｄｅｘｓｉｌ））、ポリ（アクリ
ロニトリル−ブタジエン）（ニトリルゴム）、ポリ（１−ブテン）、ポリ（クロ
ロトリフルオロエチレン−ビニリデンフルオリド）コポリマー（Ｋｅｌ−Ｆ）、
ポリ（エチルビニルエーテル）、ポリ（ビニリデンフルオリド）、ポリ（ビニリ
デンフルオリド−ヘキサフルオロプロピレン）コポリマー（バイトン（Ｖｉｔｏ
ｎ））、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）のエラストマー組成物、ポリスルホン、
ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、およびポリテトラ
フルオロエチレン（テフロン（登録商標））。

【００６４】さらに、クロロシランまたはメチルシラン、エチルシラン、およびフェニルシ
ラン、およびポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、例えばドゥケミカル（Ｄ
ｏｗＣｈｅｍｉｃａｌ）社、Ｓｙｌｇａｒｄ１８２、１８４または１８６な
どのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、または脂肪族ウレタンジアクリレー
ト、例えば（これに限定されない）ＵＣＢケミカル（ＵＣＢＣｈｅｍｉｃａｌ
）のＥｂｅｃｒｙｌ２７０またはＩｒｒ２４５などの物質を取り込んだポリマ
ーも使用できる。

【００６５】いくつかの方法では、エラストマーはまた、同じクラスの架橋不可能なポリマ
ー鎖で「ドープ処理」できる。例えばＲＴＶ６１５は、ＧＥＳＦ９６−５０シ
リコーン液体で希釈できる。これは、非硬化エラストマーの粘度を減少するよう
に作用し、硬化エラストマーのヤング率を減少させる。実質的に、架橋可能なポ
リマー鎖は、「不活性」ポリマー鎖の付加によりさらに別れて広まり、よってこ
れは「希釈」と呼ばれる。ＲＴＶ６１５は、９０％までの希釈で硬化し、ヤング
率の劇的な減少を伴う。

【００６６】エラストマー物質をドープ処理する他の例は、電気伝導または磁気種の導入を
含み得る。望ましい場合、エラストマー物質（すなわち、シリカ、ダイヤモンド
、サファイア）とは異なる屈折係数を有する微細な物質の粒子でドープ処理する
ことも、物質の屈折係数を変化するためのシステムと考えられる。強く吸収また
は不透明粒子を加えて、入射照射に対してエラストマーを着色または不透明とす
る。これは考えられるところでは、光学的にアドレス可能なシステムで有益であ
り得る。

【００６７】４．微細加工構造の寸法いくつかのフローチャネル（３０、３２、６０および６２）は好ましくは、幅
対深さの比が約１０：１である。本発明による幅対深さの比の他の範囲の非排除
的リストは、０．１：１〜１００：１、より好ましくは１：１〜５０：１、より
好ましくは２：１〜２０：１、最も好ましくは３：１〜１５：１である。例示的
な局面において、フローチャネル３０、３２、６０および６２は、約１〜１００
０μｍの幅を有する。本発明によるフローチャネルの幅の他の範囲の非排除的リ
ストは、０．０１〜１０００μｍ、より好ましくは０．０５〜１０００μｍ、よ
り好ましくは０．２〜５００μｍ、より好ましくは１〜２５０μｍ、最も好まし
くは１０〜２００μｍである。例示的チャネル幅は、０．１μｍ、１μｍ、２μ
ｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、
７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０
μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０
μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍ、２３０μｍ、２４０μｍ、および
２５０μｍを含む。

【００６８】フローチャネル３０、３２、６０および６２は、約１〜１００μｍの深さを有
する。本発明によるフローチャネルの深さの他の範囲の非排除的リストは、０．
０１〜１０００μｍ、より好ましくは０．０５〜５００μｍ、より好ましくは０
．２〜２５０μｍ、より好ましくは１〜１００μｍ、より好ましくは２〜２０μ
ｍ、最も好ましくは５〜１０μｍである。例示的チャネル深さは、０．０１μｍ
、０．０２μｍ、０．０５μｍ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．５μｍ、１μｍ
、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、７．５μｍ、１０μｍ、１２．５μｍ、１
５μｍ、１７．５μｍ、２０μｍ、２２．５μｍ、２５μｍ、３０μｍ、４０μ
ｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、および２５０
μｍを含む。

【００６９】フローチャネルは、上記の特定の寸法範囲および例に限定されず、図２１と合
わせて以下の長さで考察したように膜を偏向するのに必要な力の大きさに影響を
及ぼすために幅が変化し得る。例えば、０．０１μｍのオーダーの幅を有する極
めて狭いフローチャネルが、以下に詳細に考察したように、光学および他の適用
に有用であり得る。上記したよりもさらに大きなチャネルを有する部分を含むエ
ラストマー構造も、本発明により考えられ、このようなより幅の広いフローチャ
ネルを使用する適用例は、液体リザーバおよびチャネル構造の混合を含む。

【００７０】エラストマー層２２は、機械的安定性のために厚く鋳造できる。例示的態様に
おいて、層２２は５０μｍ〜数センチメートルの厚さであり、より好ましくは約
４ｍｍの厚さである。本発明の他の態様によるエラストマー層の厚さの範囲の非
排除的リストは、約０．１μｍ〜１０ｃｍ、１μｍ〜５ｃｍ、１０μｍ〜２ｃｍ
、１００μｍ〜１０ｍｍである。

【００７１】従って、フローチャネル３０および３２を分離している図７Ｂの膜２５は、約
０．０１〜１０００μｍ、より好ましくは０．０５〜５００μｍ、より好ましく
は０．２〜２５０、より好ましくは１〜１００μｍ、より好ましくは２〜５０μ
ｍ、最も好ましくは５〜４０μｍの典型的な厚さである。従って、エラストマー
層２２の厚さは、エラストマー層２０の厚さの約１００倍である。例示的な膜厚
は、０．０１μｍ、０．０２μｍ、０．０３μｍ、０．０５μｍ、０．１μｍ、
０．２μｍ、０．３μｍ、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、５μｍ、７．
５μｍ、１０μｍ、１２．５μｍ、１５μｍ、１７．５μｍ、２０μｍ、２２．
５μｍ、２５μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、１
５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、７
５０μｍ、および１０００μｍを含む。

【００７２】同じように、第一のエラストマー層４２は、エラストマー層２０または２２の
それとほぼ等しい好ましい厚さを有し得、第二のエラストマー層４６は、エラス
トマー層２０のそれとほぼ等しい好ましい厚さを有し得、第三のエラストマー層
５０は、エラストマー層２２のそれとほぼ等しい好ましい厚さを有し得る。

【００７３】Ｃ．微細加工構成部品の操作図７Ｂおよび７Ｃは共に、第二フローチャネルの加圧により第一フローチャネ
ルを閉じることを示し、図７Ｂ（対応する図７Ａでフローチャネル３２を通って
切断した正面断面図）は開口した第一フローチャネル３０を示し、図７Ｃは、第
二フローチャネル３２の加圧により閉じた第一フローチャネル３０を示す。図７
Ｂを参照すると、第一フローチャネル３０および第二フローチャネル３２が示さ
れる。膜２５はフローチャネルを分離し、第一フローチャネル３０の上および第
二フローチャネル３２の底を形成する。分かるように、フローチャネル３０は「
開口」している。

【００７４】図７Ｃから分かるように、フローチャネル３２の加圧（それに導入した気体ま
たは液体のいずれかにより）により、膜２５は、下方に偏向し、これにより、フ
ローチャネル３０を通過するフローＦを減らす。従って、チャネル３２の圧力を
変化させることにより、線形に可動するバルブシステムが、フローチャネル３０
が所望のように膜２５を移動することにより開けるか閉めることができるように
提供される。

【００７５】正確に同じバルブ開口および閉じる方法を、フローチャネル６０および６２を
用いて達成できることが理解される。このようなバルブは、チャネル自体の屋根
を移動することにより可動し（すなわち膜２５を動かすことにより）、この技術
により作成したバルブおよびポンプは、真にゼロのデッドボリュームを有し、こ
の技術により作成したスイッチングバルブは、例えば約１００×１００×１０μ
ｍ＝１００ｐＬの、バルブの活動容量にほぼ等しいデッドボリュームを有する。
膜を動かすことにより消費されるこのようなデッドボリュームおよび面積は、公
知の慣用的なマイクロバルブよりも約２次数少ない。より小さくより大きなバル
ブおよびスイッチングバルブが本発明に考えられ、デッドボリュームの範囲の非
排除的リストは、１ａＬ〜１ｕＬ、１００ａＬ〜１００ｎＬ、１ｆＬ〜１０ｎＬ
、１００ｆＬ〜１ｎＬ、および１ｐＬ〜１００ｐＬを含む。

【００７６】本発明によるポンプおよびバルブにより送達できる極めて少ない容量は、実質
的な利点を示す。特に、手動で定量できる公知の最も少ない液体の容量は約０．
１μｌである。自動システムにより定量できる公知の最も少ない液体の容量は約
１０倍多い（１μｌ）。本発明のポンプおよびバルブを使用して、１０ｎｌ以下
の液体容量を、慣用的には定量または分配できる。本発明により可能となる極め
て少ない容量の液体の正確な定量は、診断試験およびアッセイ法を含む、多くの
生物学的適用に極めて価値がある。

【００７７】図２１ａおよび２１ｂは、１００μｍ幅の第一フローチャネル３０および５０
μｍ幅の第二フローチャネル３２のバルブ開口対印加圧力を示す。この装置の膜
は、約３０μｍの厚さおよび約７５０ｋＰａのヤング率を有するジェネラル・エ
レクトリック・シリコーンＲＴＶ６１５の層により形成される。図２１ａおよび
２１ｂは、印加圧力のほとんどの範囲にわたって実質的に線形である、バルブ開
口の範囲を示す。

【００７８】空気圧を印加して、外直径０．０２５’’、内直径０．０１３’’の２５ｍｍ
片のステンレス鋼皮下チューブに接続した、外直径０．０２５’’の１０ｃｍ長
のプラスチックチューブ片を通して装置の膜を可動する。このチューブは、制御
チャネルに対して正常な方向で、エラストマーブロックへの挿入により制御チャ
ネルと接触するように配置された。空気圧を、リー（Ｌｅｅ）社製の外部ＬＨＤ
Ａ小型ソレノイドバルブからの皮下チューブに印加した。

【００７９】本発明のバルブの応答は、ヒステリシスが最小で、その移動範囲の大部分にお
いてほぼ完全に線形である。バルブおよびポンプは開いたり閉じたりするのに線
形可動を必要とせず、線形応答により、バルブは、定量装置としてより容易に使
用できるようになる。いくつかの適用では、バルブの開口を使用して、既知の閉
じ度合いまで実際に可動することにより、流速を制御する。線形バルブ可動によ
り、所望の閉じ度合いまでバルブを閉じるのに必要な可動力の量を決定すること
がより容易になる。線形可動の別の利点は、バルブ可動に必要な力を、フローチ
ャネルの圧力から容易に決定できることである。可動が線形である場合、フロー
チャネルの圧力増加は、同じ圧力（単位面積あたりの力）をバルブの可動部に加
えることにより対抗できる。

【００８０】Ｄ．エラストマー装置の概略図例示的なシークエンスシステムを図２５に示す。４つのリザーバ１５０Ａ、１
５０Ｂ、１５０Ｃおよび１５０Ｄは、その中にそれぞれ配分した標識ヌクレオチ
ドＡ、Ｃ、ＴおよびＧを有する。４つのフローチャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ
および３０Ｄは、リザーバ１５０Ａ、１５０Ｂ、１５０Ｃおよび１５０Ｄに接続
している。４つの制御ライン３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃおよび３２Ｄ（仮想線で示
す）をそれと交差して配分し、制御ライン３２Ａは、制御ライン３２Ａを加圧し
た場合、フローチャネル３０Ａを通ってのみ流れることが可能となる（すなわち
、フローチャネル３０Ｂ、３０Ｃおよび３０Ｄを封じる）。同様に、制御ライン
３２Ｂにより、加圧した場合に、フローチャネル３０Ｂを通ってのみ流れること
が可能となる。従って、制御ライン３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃおよび３２Ｄの選択
的加圧により、連続的に、所望のリザーバ（１５０Ａ、１５０Ｂ、１５０Ｃまた
は１５０Ｄ）からの所望のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＴまたはＧ）が選択される。
次いで、液体は、フローチャネル１２０を通って通過し、複合チャネルフロー制
御装置１２５へと入り、これは次いで液体流を、固相合成を実施できる複数の合
成チャネルまたは反応チャンバー１２２Ａ、１２２Ｂ、１２２Ｃ、１２２Ｄまた
は１２２Ｅの１つまたはそれ以上に導く。

【００８１】図２６は、図２５に示したシステムのさらなる拡張を示す。それは複数のリザ
ーバＲ１〜Ｒ１３を有する。これらのリザーバは標識ヌクレオチド、ヌクレオチ
ドポリメラーゼ、または合成チャネルの表面を覆膜およびポリヌクレオチド鋳型
を付着するための試薬を含むことができる（以下のさらなる考察参照）。リザー
バは、図２５に示したようなシステム２００に接続されている。システム２００
は、複合チャネルフロー制御装置１２５に接続され、これは次いで、複数の合成
チャネルまたは反応チャンバーに接続されている。このシステムの利点は、「閉
じた水平」および「閉じた垂直」制御ライン（１６０および１６２、仮想線）も
提供される場合、複合チャネルフロー制御装置１２５および液体選択システム２
００の両方を、同じ圧力インプット１７０および１７２により制御できることで
ある。

【００８２】いくつかの装置は、フローチャネルに沿って配分された、複数の選択的にアド
レス可能な反応チャンバーを含む。これらの装置では、ポリヌクレオチド鋳型を
、フローチャネルの表面の代わりに、反応チャンバーの表面に付着できる。この
ような装置の例示的態様を図２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃおよび２２Ｄに示す。これ
は、フローチャネルに沿って配置された複数の反応チャンバーの１つまたはそれ
以上へと液体流を選択的に導くシステムである。

【００８３】図２２Ａは、それに沿って配置された複数の反応チャンバー８０Ａおよび８０
Ｂを有するフローチャネル３０の平面図を示す。好ましくは、フローチャネル３
０および反応チャンバー８０Ａおよび８０Ｂは、共に凹部として、エラストマー
の第一層１００の底表面へと形成される。

【００８４】図２２Ｂは、各々一般的に狭い２つの制御ライン３２Ａおよび３２Ｂを有する
が、その凹部として広く伸長した部分３３Ａおよび３３Ｂを有する、別のエラス
トマー層１１０の底面図を示す。

【００８５】図２２Ｃの分解図および図２２Ｄの組立図から分かるように、エラストマー層
１１０を、エラストマー層１００の上に置く。層１００および１１０をその後共
に結合し、統合システムは、以下のように、液体流Ｆを（フローチャネル３０を
通って）反応チャンバー８０Ａおよび８０Ｂの一方または両方に選択的に導くよ
うに作動する。制御ライン３２Ａの加圧により膜２５（すなわち、伸長部分３３
Ａの下に位置し、反応チャンバー８０Ａの領域８２Ａの上に位置する、エラスト
マー層１００の薄い部分）は押し下げられ、これにより、領域８２Ａの液体流通
過は遮断され、フローチャネル３０からの反応チャンバー８０は効果的に封じら
れる。これもまた分かるように、伸長部分３３Ａは、制御ライン３２Ａの残部よ
りも広い。従って、制御ライン３２Ａの加圧により、制御ライン３２Ａはフロー
チャネル３０を封じない。

【００８６】理解されるように、制御ライン３２Ａおよび３２Ｂの一方または両方を一度に
可動できる。両方の制御ライン３２Ａおよび３２Ｂを共に加圧した場合、フロー
チャネル３０の試料フローは、反応チャンバー８０Ａにも８０Ｂにも侵入しない
。

【００８７】フローラインに沿って配置した種々のアドレス可能な反応チャンバーへの液体
導入を選択的に制御する概念（図２２）は、複数の平行フローラインの１つまた
はそれ以上を通る液体流を選択的に制御する概念と合わせることができ（図２１
）、液体試料または試料群が、反応チャンバーのアレイ中の任意の特定の反応チ
ャンバーに送ることのできるシステムが得られる。このようなシステムの例を図
２３に提供し、ここでは、伸長部分３４（全て仮想線で示す）を有する平行制御
チャネル３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃは、上記に説明したような、反応ウェル８
０Ａ、８０Ｂ、８０Ｃまたは８０Ｄのアレイのいずれかに、液体流Ｆ１およびＦ
２を選択的に導き、制御ライン３２Ｃおよび３２Ｄの加圧は、選択的にそれぞれ
フローＦ２およびＦ１を遮断する。

【００８８】さらに別の態様において、平行フローチャネル間の液体通過が可能である。図
２４を参照すると、側通路３５（平行フローチャネル３０Ａおよび３０Ｂ）を通
る液体流動が可能であるように制御ライン３２Ａまたは３２Ｄの一方または両方
を加圧する。本発明のこの局面において、制御ライン３２Ｃおよび３２Ｄの加圧
は、３５Ａと３５Ｂの間のフローチャネル３０Ａを遮断し、また側通路３５Ｂも
遮断する。従って、フローＦ１として侵入するフローは、３０Ａ、３５Ａを通り
連続的に運行し、フローＦ４として３０Ｂを去る。

【００８９】Ｅ．非エラストマーを用いた装置上記に考察したように、エラストマーは、本発明のシークエンス装置を加工す
るのに好ましい物質であるが、非エラストマーを用いたミクロ流体装置も、本発
明の装置に使用できる。いくつかの適用では、シークエンス装置は、慣用的なミ
クロエレクトロ機械システム（ＭＥＭＳ）技術に基づいたミクロ流体を使用する
。バルクマイクロマシンおよび表面マイクロマシンなどの、慣用的なＭＥＭＳミ
クロ流体システムを製造する方法は、例えば、テリー（Ｔｅｒｒｙ）ら、「シリ
コンウエハ上に加工したガスクロマトグラフィー空気解析器（ＡＧａｓＣｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃＡｉｒＡｎａｌｙｚｅｒＦａｂｒｉｃａｔｅ
ｄｏｎａＳｌｉｃｏｎＷａｆｅｒ）」、ＩＥＥＥＴｒａｎｓ．、Ｅｌ
ｅｃｔｒｏｎＤｅｖｉｃｅｓ、ｖ．ＥＤ−２６、ｐｐ．１８８０〜１８８６、
１９７９；およびバーグ（Ｂｅｒｇ）ら、「全マイクロ解析システム（Ｍｉｃｒ
ｏＴｏｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍｓ）」、ニューヨーク、Ｋｌ
ｕｗｅｒ、１９９４に記載されている。

【００９０】大量ミクロ機械加工は、１つの結晶シリコンがリソグラフィック的にパターン
化され、次いでエッチングし３次元構造を形成する、サブトラクティブ微細加工
方法である。例えば、大量ミクロ機械加工技術（これは、ガラスウエハ処理、シ
リコン対ガラスウエハ結合の使用を含む）は、一般に、個々のミクロ流体構成部
品の加工に使用される。このガラス結合技術も、ミクロ流体システムの加工に使
用されている。

【００９１】表面ミクロ機械加工は、ポリシリコン、窒化ケイ素、二酸化ケイ素、および種
々の金属などの半導体層を連続的に加え、パターン化して３次元構造を作成する
、追加方法である。表面ミクロ機械加工技術を使用して、個々の流体構成部品、
並びに、オンチップ電子工学を用いたミクロ流体システムを加工できる。さらに
、結合型装置とは異なり、密封チャネルを、ポリシリコン（例えば、Ｗｅｂｓｔ
ｅｒら、「チップ上の検出器を備えるモノリシックキャピラリーゲル電気泳動ス
テージ（ＭｏｎｏｌｉｔｈｉｃＣａｐｉｌｌａｒｙＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓＳｔａｇｅｗｉｔｈＯｎ−ＣｈｉｐＤｅｔｅｃｔｏｒ
）」、マイクロ電子機械システムに関する国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＭｉｃｒｏＥｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉ
ｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＭＳ９６、ｐｐ．４９１〜４９６、１９９６
）、窒化ケイ素（例えば、Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏら、「真空で封じたケイ素ミ
クロ機械加工白熱光源（Ｖａｃｕｕｍ−ＳｅａｌｅｄＳｉｌｉｃｏｎＭｉｃ
ｒｏｍａｃｈｉｎｅｄＩｎｃａｎｄｅｓｃｅｎｔＬｉｇｈｔＳｏｏｕｒｃ
ｅ）」、国際電気装置会議（Ｉｎｔｌ．ＥｌｅｃｔｒｏｎＤｅｖｉｃｅｓＭ
ｅｅｔｉｎｇ）」、ＩＤＥＭ８９、ｐｐ．５０３〜５０６、１９８９）および
二酸化ケイ素からなるチャネル壁を使用して、比較的簡単な方法で構築できる。

【００９２】いくつかの適用では、動電フローによるミクロ流体を、本発明のシークエンス
装置に使用できる。簡潔には、これらのシステムは、電場の試薬への印加により
、内部接続チャネルおよび／またはチャンバー含有構造内の試薬フローを導く。
動電システムは同時に、少なくとも２つの交差チャネルを横切って適用した電圧
勾配を調節する。このようなシステムは、例えば国際公開公報第９６／０４５４
７および米国特許第６，１０７，０４４号に記載されている。

【００９３】例示的な動電フローによるミクロ流体装置は、少なくとも２つの交差チャネル
または液体経路、例えば相互接続された囲まれたチャンバー（このようなチャネ
ルは少なくとも３つの交差していない末端を含む）を含む、本体構造を有し得る
。２つのチャネルの交差点は、２つまたはそれ以上のチャネルが、互いに液体伝
達している点を意味し、「Ｔ」交差、交わる交差、複数のチャネルの「荷馬車の
車輪」交差、または、２つまたはそれ以上のチャネルがこのような液体伝達にあ
る任意の他のチャネル幾何を包含する。交差していないチャネルの末端は、チャ
ネルがそのチャネルと別のチャネルの交差、例えば「Ｔ」交差の結果として終結
する点である。

【００９４】いくつかの動電フローを用いた装置では、少なくとも４つの交差していない末
端を有する少なくとも３つの交差チャネルが存在する。１つの水平チャネルが、
１つの垂直チャネルと交差および交わる、基本的な交差チャネル構造では、制御
した動電輸送は、交差部での他のチャネルからのフローを束縛することにより、
交差を通る試薬のフローを導くように作動する。交差部でのこの試薬の単純な動
電フローは、水平チャネルの長さを横切る電圧勾配を印加する、すなわち、第一
電圧をこのチャネルの左末端に印加し、第二のより低い電圧を、このチャネルの
右末端に印加することにより、または、右末端を浮かせる（電圧を全く印加しな
い）ことにより行なうことができる。

【００９５】いくつかの他の適用では、装置は、外部ミニフルイディクを有する微細加工フ
ローセルを含む。このような装置を図２７に示す。ガラスカバースリップは、フ
ローセルの表面に陽極に結合できる。調査領域は１００μｍ×１００μｍ×１０
０μｍであり、インプットおよびアウトプットチャネルは１００μｍ×１００μ
ｍ×１００μｍである。配管付着の穴は、チャネルの末端でエッチングする。こ
のような装置では、フルイディクは外部であり得る。配管は、例えばアップチャ
ーチ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ）およびハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）の標準的なＨ
ＰＬＣ成分を用いて実施できる。調査領域において、ポリヌクレオチド鋳型を、
標準的なアビジン−ビオチン化学反応により表面に付着する。複数のコピーの鋳
型を装置に付着できる。例えば、７ｋｂの鋳型では、回転半径は約０．２μｍで
ある。したがって、約１０^５個の分子を、分子が接触することを防ぎつつ付着で
きる。試薬切り換えは、例えば、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ６ポート注入バルブを用いて
行なうことができ、例えばＴｈａｒＤｅｓｉｇｎｓモーターにより駆動できる
。液体はシリンジポンプを用いてポンピングできる。検出システムは、外部光学
顕微鏡であり得、対物レンズはガラスカバースリップに近い。

【００９６】ＩＶ．ポリヌクレオチド配列の解析Ａ．鋳型調製および合成チャネル表面への付着１．一般的スキームいくつかの適用では、解析すべきポリヌクレオチドを最初に、一本鎖Ｍ１３プ
ラスミドにクローニングする（例えば、「分子生物学の現在のプロトコル（Ｃｕ
ｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
）」、Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＪｏｎｈＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、１９９５；お
よびＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、実験マニュアル、コールドスプリ
ングハーバープレス、１９８９参照）。一本鎖プラスミドは、５’−ビオチニル
化プライマー（例えば米国特許第５，４８４，７０１号参照）により開始し、そ
の後、二本鎖プラスミドを合成できる。その後、二本鎖の環を直線化し、ビオチ
ニル化鎖を精製する。いくつかの方法では、約１００ｂｐ長の鋳型を解析する。
いくつかの方法では、シークエンスされる鋳型は約１ｋｂ長である。他の方法で
は、解析できる鋳型は、約３ｋｂ、１０ｋｂ、または２０ｋｂの長さを有する。

【００９７】プライマーアニーリングは、配列特異性を達成するのに十分であるが、許容さ
れる速度で安定なハイブリッドの形成を可能とするには依然として十分ではない
ストリンジェントな条件下で実施する。プライマーアニーリングに必要な温度お
よび時間は、プライマーの塩基組成、長さおよび濃度、使用する溶媒の性質、例
えばＤＭＳＯ、ホルムアミド、またはグリセロールの濃度、およびマグネシウム
などの対イオンを含むいくつかの要因に依存する。典型的には、合成ポリヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションは、アニーリング溶媒中での標的−プライマ
ーハイブリッドの融解温度よりも約５〜１０℃低い温度で実施する。好ましくは
、アニーリング温度は、５５〜７５℃の範囲であり、プライマー濃度は約０．２
μＭである。これらの好ましい条件下で、アニーリング反応は、僅か数秒間で完
了し得る。

【００９８】解析する一本鎖ポリヌクレオチド鋳型は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。それら
は、天然およびまたは非天然ヌクレオチドを含み得る。本発明に記載の解析に適
した鋳型は、種々のサイズであり得る。例えば、鋳型は、１００ｂｐ、２００ｂ
ｐ、５００ｂｐ、１ｋｂ、３ｋｂ、１０ｋｂ、または２０ｋｂの長さであり得る
。

【００９９】いくつかの方法では、鋳型を合成チャネルの表面に固定する（例えば図２５の
１２２Ａ〜１２２Ｅ）。鋳型を固定することにより、非取り込みヌクレオチドを
、合成チャネルから、洗浄段階により除去できる。鋳型は、プライマーへのハイ
ブリダイゼーションの前に、表面に固定できる。鋳型はまた、最初にプライマー
にハイブリダイズし、その後、表面に固定してもよい。または、プライマーを表
面に固定し、鋳型を合成チャネルにプライマーへのハイブリダイゼーションによ
り付着する。

【０１００】種々の方法を、鋳型またはプライマーを合成チャネルまたは反応チャンバーの
表面に固定するのに使用できる。固定は、表面への鋳型の直接的または間接的結
合により行なうことができる。結合は、共有結合であり得る。ジョース（Ｊｏｏ
ｓ）ら、「分析生化学（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」
２４７：９６〜１０１、１９９７；オースカー（Ｏｒｏｓｋａｒ）ら、Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｅｍ．４２：１５４７〜１５５５、１９９６；およびカーンジャン（Ｋ
ｈａｎｄｊｉａｎ）、Ｍｏｌｅ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐ．１１：１０７〜１１５、１９
８６参照。結合はまた非共有結合であり得る。例えば、ビオチン−ストレプトア
ビジン（Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２４：１４
４３、１９９１）およびジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン（Ｓｍｉｔｈら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：１１２２、１９９２）は、ポリヌクレオチドを表面
およびパラレルに付着するための一般的な道具である。または、結合は、疎水性
鎖を脂質単層または二重層に固定することにより達成できる。

【０１０１】ビオチン−ストレプトアビジン連鎖を使用して鋳型を固定する場合、鋳型をビ
オチニル化し、合成チャネルの１つの表面を、ストレプトアビジンで覆膜する。
ストレプトアビジンはテトラマーであるので、それは、１分子あたり４つのビオ
チン結合部位を有する。従って、ストレプトアビジンで表面を覆膜するために、
表面を最初にビオチニル化し、その後、ストレプトアビジンの４つの結合部位の
１つを使用して、タンパク質を表面に固定すると、ビオチニル化鋳型に結合して
いない他の部位が残る（Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙ
ｓ．２４：１４４３、１９９１）。このような処理により、合成チャネルの表面
上に高密度のストレプトアビジンが得られ、対応する高い密度で鋳型を覆うこと
ができる。表面をビオチニル化する試薬は、例えばベクターラボラトリーズから
得ることができる。

【０１０２】いくつかの適用では、基質または合成チャネルを前処理し、ポリヌクレオチド
鋳型の付着およびその後の合成反応を容易にする表面化学を形成する。いくつか
の方法では、表面を、多価電解質多層（ＰＥＭ）で覆膜する。鋳型のＰＥＭ覆膜
表面への付着は、光指示空間付着により達成できる（例えば、米国特許第５，５
９９，６９５号、第５，８３１，０７０号および第５，９５９，８３７号）。ま
たは、鋳型をＰＥＭ覆膜表面に完全に化学的に付着できる（詳細については以下
参照）。いくつかの方法では、非ＰＥＭによる表面化学を、鋳型付着前に形成で
きる。

【０１０３】２．単一チャネルに対する多様な鋳型の付着多様なポリヌクレオチド鋳型を、別々の合成チャネルに固定し、シークエンス
できるが、複数の鋳型も、１つのミクロ流体合成チャネルでシークエンスできる
。後者のシナリオでは、鋳型を、チャネルのフロー路に沿って異なる位置に付着
する。これは、基質上の異なる点に固定したオリゴヌクレオチドへのプライマー
捕獲配列のハイブリダイゼーション、および鋳型固定に向けてチャネルの下の異
なる点の連続的活性化を含む、種々の異なる方法により行なうことができる。

【０１０４】オリゴヌクレオチドアレイを用いて表面を形成する方法は、米国特許第５，７
４４，３０５号、第５，８３７，８３２号および第６，０７７，６７４号に記載
されている。このような表面は、ミクロ流体チップに結合し、合成チャネルを形
成する、基質として使用する。開始ドメインおよび捕獲ドメインの２つのドメイ
ンを有するプライマーを使用して、鋳型を基質に固定できる。開始ドメインは標
的鋳型に相補的である。捕獲ドメインは、開始配列の非伸長部位上に存在する。
それは標的鋳型には相補的ではないが、むしろ基質上に存在する特異的オリゴヌ
クレオチド配列に特異的である。標的鋳型は、そのプライマーを用いて別々にハ
イブリダイズできるか、または（開始配列が異なる場合）同じ溶液中で同時にハ
イブリダイズできる。ハイブリダイゼーション条件下でのフローチャネル中のプ
ライマー／鋳型の二本鎖のインキュベートにより、各鋳型の独特な場所への付着
が可能となる。複数の合成チャネルに、このように同時に鋳型を装填できる。

【０１０５】単一チャネル中で複数の鋳型を付着する別の方法は、基質の一部を連続的に活
性化し、鋳型をそれらに付着することである。基質の活性化は、光学的または電
気的手段のいずれかにより行なうことができる。光学的照明を使用して、鋳型の
表面への付着を可能とする光化学脱保護反応を開始できる（例えば米国特許第５
，５９９，６９５号、第５，８３１，０７０号、および第５，９５９，８３７号
参照）。例えば、基質表面を、光に曝露した後にのみアビジンに結合できるよう
になる、市販のビオチンの誘導体である「かご形ビオチン」で誘導体化できる。
その後、部位を光に曝露し、チャネルをアビジン溶液で充填し、洗浄し、その後
、ビオチニル化鋳型をチャネルに流すことにより鋳型を付着できる。別の変形は
、アビジン化基質および鋳型を、かご形ビオチン部分を有するプライマーと共に
調製することであり、その後、鋳型を、チャネルに流し、所望の領域の上で溶液
を照射することにより固定できる。その後、活性化鋳型／プライマー二本鎖を、
拡散した第一壁に付着すると、拡散の限定された点が生じる。

【０１０６】電気手段も使用して、鋳型を、チャネル中の特定の点に指向できる。チャネル
中の１つの電極を陽性に荷電化し、他方を陰性に荷電化することにより、鋳型を
単一電極に駆動する（そこで付着できる）磁場勾配を形成できる（米国特許第５
，６３２，９５７号、第６，０５１，３８０号および第６，０７１，３９４号参
照）。または、それは、表面の領域を電気化学的に活性化し、電極に印加した電
圧を変化することにより行なうことができる。

【０１０７】Ｂ．鋳型を付着するための例示的表面化学：ＰＥＭ覆膜いくつかの方法では、合成チャネルの表面を、鋳型（またはプライマー）付着
の前にＰＥＭで覆膜する。このような付着スキームは、エキソサイチュー工程ま
たはインサイチュー工程の両方であり得る。エキソサイチュープロトコルでは、
平坦な基質の表面を最初にＰＥＭで覆膜し、次いで鋳型を付着する。その後、エ
ラストマーミクロ流体チップを基質に結合し、合成チャネルを形成および封じる
。インサイチュープロトコルでは、ミクロ流体チップを最初に平坦な基質に付着
し、その後、ＰＥＭをチャネル中で作成する。その後、鋳型をチャネル内に付着
する。さらにいくつかの他の適用において、ミクロ流体チップを、鋳型付着工程
中の任意の点で平坦な基質に結合させ得、残りの段階を、ミクロ流体チャネル内
で完了できる。

【０１０８】好ましくは、インサイチュープロトコルを使用する。ここに記載の方法により
、標識（例えば蛍光染料で）ヌクレオチドの低い非特異的結合およびミクロ流体
構成部品および合成チャネルの良好な封止がもたらされる。ミクロ流体構成部品
と合成チャネルの間の良好な封止により、より高い圧力の使用が可能となり、こ
れにより流速は増加し、交換時間は減少する。鋳型を合成チャネルの表面に付着
するための種々の方法が以下に詳細に考察されている。

【０１０９】エキソサイチュープロトコルの例示的スキームは以下のとおりである。第一に
、ガラスカバースリップの表面を清浄にし、その後、多価電解質多層（ＰＥＭ）
で覆膜する。カルボン酸基のビオチニル化後、その後、ストレプトアビジンを塗
布して、ビオチニル化分子を捕獲できる表面を作成する。その後、ビオチニル化
ポリヌクレオチド鋳型を、付着のために覆膜カバーガラスに加える。このように
形成した表面化学は特に、蛍光ヌクレオチドを用いた合成によるシークエンスに
適する。その理由は、それは、陰性荷電ヌクレオチドに反発する強く陰性荷電し
た表面を生じるからである。ガラスカバースリップを清浄にする、多価電解質多
層の覆膜および鋳型の付着の詳細な手順を以下に考察する。

【０１１０】ＰＥＭ形成は、ポリカチオンおよびポリアニオンの連続的添加により進行し、
これはそれぞれ多くの陽性または陰性荷電を有するポリマーである。ポリカチオ
ンを陰性荷電表面に添加すると、ポリカチオンは表面上に堆積し、薄いポリマー
層が形成され、表面荷電は逆転する。同様に、陽性荷電表面上に堆積したポリア
ニオンは、ポリマーの薄層を形成し、陰性荷電表面を残す。ポリ（＋）およびポ
リ（−）への交互の曝露により、加えた最後の多価電解質により決定される表面
荷電を有する、多価電解質多重層構造を生じ、不完全に荷電した表面の場合、多
層堆積はまた、十分規定された安定なレベルまで表面荷電を増加させる傾向があ
る。ＰＥＭ形成は、Ｄｅｃｈｅｒらにより記載されている（「薄い固形膜（Ｔｈ
ｉｎＳｏｌｉｄＦｉｌｍｓ）、２１０：８３１〜８３５、１９９２）。

【０１１１】カルボン酸基は、ｐＨ７で陰性に荷電し、共有結合形成に一般的な標的である
。表面をカルボン酸基で終結することにより、強く陰性荷電であり化学的に反応
性である表面を作成できる。特に、アミンをそれらに連結して、アミド結合を形
成でき、この反応は、カルボジイミドにより触媒できる。一端にビオチン、親水
性スペーサー、および他端にアミンを有する分子を使用して、ビオチンで表面を
終結する。

【０１１２】アビジン分子は、４つまでのビオチン分子と結合できる。これは、アビジンお
よびその誘導体のストレプトアビジンが、ビオチン終結表面を、ビオチンを捕獲
できる表面に変換できる。僅かに陰性荷電を有するストレプトアビジンを使用し
て、解析すべきポリヌクレオチド鋳型を、ビオチニル化プライマーを使用するこ
とにより表面に付着する。高い濃度の多価塩を有する緩衝液を使用して、陰性荷
電ＤＮＡの陰線荷電表面の反発をスクリーニングする。

【０１１３】多価電解質多層を覆膜するために、ガラスカバースリップを最初にＨＰＨ_２Ｏ（１８．３ＭＯｈｍ−ｃｍまで脱イオン化し、０．２μｍまでろ過したＨ_２Ｏ
）およびＲＣＡ溶液（ＨＰＨ_２Ｏ、（３０％ＮＨ_４ＯＨ）および（３０％Ｈ_２Ｏ_２）の６：４：１混合物）で清浄にする。その後、カバースリップを２％ミク
ロ９０界面活性剤中で２０分間超音波処理する。ＨＰＨ_２Ｏでよく濯いだ後、
カバースリップを、穏やかに煮沸しているＲＣＡ溶液中で少なくとも１時間撹拌
し、再度ＨＰＨ_２Ｏで濯いだ。

【０１１４】清浄後、カバーガラスを、ＰＡ１１溶液（ポリ（アリルアミン）（ＰＡ１１、
＋）、ｐＨ７．０に調整したＨＰＨ_２Ｏ中２ｍｇ／ｍｌ）に浸漬し、少なくと
も１０分間撹拌する。その後、カバースリップをＰＡ１１から取り出し、少なく
とも３回、撹拌しながらＨＰＨ_２Ｏ中に浸漬することによりＨＰＨ_２Ｏで洗
浄する。処理は、ＰＡｃｒ溶液（ポリ（アクリル酸）（ＰＡｃｒ、−）、ｐＨ７
．０に調整したＨＰＨ_２Ｏ中２ｍｇ／ｍｌ）中で撹拌により少なくとも１０分
間続け、ＨＰＨ_２Ｏで洗浄する。その後、処理段階を１回繰返す。

【０１１５】ＰＥＭ覆膜後、ＰＥＭ覆膜ガラスを、ＥＤＣ／ＢＬＣＰＡ溶液と共に３０分間
インキュベートする。ＥＤＣ／ＢＬＣＰＡ溶液を、等量の５０ｍＭＥＤＣ溶液
（ＭＥＳ緩衝液中）および５０ｍＭＢＬＣＰＡ（ＭＥＳ緩衝液中）を混合し、
ＭＥＳ緩衝液中５ｍＭまで希釈することにより調製する。その後、ガラスを、１
０ｍＭトリス−ＮａＣｌで濯ぎ、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン溶液と
共に１時間インキュベートする。１０ｍＭトリス−ＮａＣｌで洗浄後、ガラスを
、ポリヌクレオチド鋳型（トリス１００ｍＭＭｇＣｌ_２中１０^−７Ｍ）を含
む溶液と共に３０分間インキュベートする。ガラスを再度、１０ｍＭトリス−Ｎ
ａＣｌでよく濯ぐ。

【０１１６】インサイチュー付着では、ミクロ流体基質を、ＨＣｌ補助結合によりガラスカ
バースリップに結合させる。本質的に、チップは最初に界面活性剤（例えば、最
初にＨＰＨ_２Ｏで、その後０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中、その後再度ＨＰＨ_２Ｏで濯ぐ）で洗浄する。その後、洗浄したミクロ流体チップを、数マイクロリッ
トルの希ＨＣｌ（例えばＨＰＨ_２Ｏ中１％ＨＣｌ）を用いてカバースリップに
置き、続いて３７℃で１〜２時間焼く。このような処理は、非特異的吸着を増加
することなく、ガラスへの結合強度を増強する（例えば＞２０ｐｓｉ圧力）。

【０１１７】ＨＣｌ処理後、ＰＥＭ形成、ビオチニル化、ストレプトアビジン化、および鋳
型付着を、溶液を、基質表面上に単に分注する代わりに、圧力によりチャネルを
通して注入することを除き、エキソサイチュー付着について上記したのと実質的
に同じ試薬および方法を使用して実施できる。

【０１１８】マイクロチャネル表面をＰＥＭ技術で覆膜することは、本発明に記載のポリヌ
クレオチド配列の解析に意義がある。一般に、鋳型を表面に付着するのに使用す
る方法は、合成によるシークエンス適用に有用であるために、いくつかの必要条
件を満たすべきである。第一に、妥当な量のポリヌクレオチド鋳型を付着できな
ければならない。さらに、付着した鋳型は、ポリメラーゼ作用について依然とし
て活性であるべきである。さらに、蛍光ヌクレオチドの非特異的結合は非常に低
くあるべきである。

【０１１９】不十分な数の鋳型分子が結合する場合、技術のシグナル対ノイズの比は低すぎ
て、有用なシークエンスが不可能である。プライマー／標的二本鎖がポリメラー
ゼにより伸長できない場合、大量の鋳型の結合は不十分である。これは、アミン
を有する表面を構築することに基づいた表面化学に関する問題である：アミンは
通常のｐＨで正に荷電している。これは、陰性荷電ＤＮＡ骨格は、表面に比特異
的に粘着し、ポリメラーゼは、ヌクレオチドを添加することから立体的に妨害さ
れることを意味する。最後に、表面への蛍光ヌクレオチドの有意な非特異的結合
が存在する場合、取込みによるシグナルと、非特異的結合によるシグナルを識別
することは不可能となる。

【０１２０】ヌクレオチドを蛍光標識すると、それらは、一般に、多くの表面への比較的強
い非特異的結合を有する。その理由は、それらは、強い極性部分（ヌクレオチド
、および特に三リン酸）および比較的疎水性部分（蛍光染料）の両方を有するか
らである。陽性荷電基（すなわちアミン）を普遍的に有する表面は、陽性荷電ア
ミンへの三リン酸基（これは強く陰性に荷電している）の引き付けによる、非常
に高い非特異的結合を有する。中性表面は、一般に、界面活性剤としての蛍光ヌ
クレオチドの作用により、強い非特異的結合を有する（すなわち、水層中の非荷
電（より疎水性）表面および極性末端に向けて非極性部分と組み合わせる）。陰
性荷電を有する表面は、陰性荷電蛍光ヌクレオチドと反発し、よって、それは、
最も低い非特異的結合を有する。ガラスはこのような表面であるが、水中でのそ
の陰性荷電を与える表面シラノールは、ＤＮＡを直接付着するには困難な標的で
ある。典型的なＤＮＡ付着プロトコルは、鋳型を付着するためにシラン化（しば
しばアミノシランを用いて）を使用する、以前に考察したように、アミノ基は、
許容不可能なレベルの非特異的結合をもたらす。

【０１２１】カルボン酸を有するポリマーで終結した多価電解質多層は、３つの全ての規準
を満たす。第一に、ポリヌクレオチドを付着するのは容易である。なぜなら、カ
ルボン酸は、共有結合形成に良好な標的であるからである。第二に、付着した鋳
型は、ポリメラーゼによる伸長に活性であり、最も確率の高いのは、類似の荷電
の反発が、表面上で鋳型が「置かれる」ことを防ぐ。最後に、陰性荷電は蛍光ヌ
クレオチドを反発し、非特異的結合は低い。

【０１２２】ここに記載の付着スキームの一般化は容易である。修飾せずに、生じるＰＥＭ
／ビオチン／ストレプトアビジン表面を使用して、任意のビオチニル化分子を捕
獲または固定できる。僅かな修飾は、別の捕獲対の使用であり得、すなわち、ジ
ゴキシゲニン（ｄｉｇ）をビオチンで置換え、固定すべき分子を抗ジゴキシゲニ
ン（抗ｄｉｇ）で標識する。アミンのビオチニル化またはｄｉｇ標識用の試薬は
、全て商業的に入手できる。

【０１２３】別の一般化は、化学反応は、ほぼ支持体の表面化学反応と独立していることで
ある。例えば、ガラスは、陽性または陰性ポリマーで終結したＰＥＭ、およびそ
のいずれかのための多種多様の化学反応を支持できる。しかし、ガラスのように
強く荷電していない、他の基質、例えばシリコーン、ポリスチレン、ポリカーボ
ネート等も依然としてＰＥＭを支持できる。弱く荷電した表面上のＰＥＭの最後
の層の荷電は、ＰＥＭが十分に多くの層を有する限り、強く荷電した表面上での
ＰＥＭのそれと同じ位に高くなる。例えば、Ｏ_２プラズマ処理シリコーンゴム上
でのＰＥＭ形成は、本発明者らにより実証された。これは、ガラス／ＰＥＭ／ビ
オチン／ストレプトアビジン／ビオチン−ＤＮＡ表面化学反応の全ての利点を他
の基質に適用できることを意味する。

【０１２４】上記の考察は、フローチャネルの表面への、またはフローチャネルに沿って配
置した反応チャンバーの表面への付着による、ポリヌクレオチド鋳型の固定を記
載するが、他の鋳型固定法も、本発明の方法に使用できる。いくつかの方法では
、鋳型は、ミクロ流体システム内に配置できる、マイクロビーズに付着できる。
例えば、予め規定した表面化学を有する、市販で入手できるラテックスミクロス
フェアを使用できる。ポリヌクレオチド鋳型は、マイクロビーズをミクロ流体シ
ステムに導入する前または後に付着できる。ビーズを加える前の鋳型の付着によ
り、システムの複雑性およびセットアップ時間の減少が可能となる（多くの鋳型
を、異なるアリコートのビーズに同時に付着できるので）。インサイチューでの
鋳型のビーズへの付着により、表面化学の操作はより容易になる（ビーズ表面化
学は、バルクでおよびミクロ流体装置に外的に操作できる）。ビーズは、この技
術が効果的であるために、フローシステム内で定場所に保持されなければならな
い。これを達成する方法は、例えば、ビーズを、流れるには小さすぎる穴に流す
こと（それらは「くさびで止める」ようになる）、「マイクロスクリーン」の形
成（すなわちビーズがそれを通過するには小さすぎる孔を有するチャネル中のバ
リア）、および、単純なファンデルワールス力により固定されるチャネル中の中
空へのビーズの挿入を含む。

【０１２５】Ｃ．プライマー伸長反応一旦、鋳型が合成チャネルの表面に固定されると、プライマー伸長反応を実施
する（Ｅ．Ｄ．Ｈｙｍａｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７４、ｐ．４２３
、１９８８）。鋳型配列の一部が既知である場合、特異的プライマーを作成し、
鋳型にハイブリダイズできる。または、リンカーを未知の配列の鋳型にライゲー
トし、プライマーのハイブリダイゼーションが可能になる。プライマーは、鋳型
の合成チャネル表面への固定の前または後に鋳型にハイブリダイズできる。

【０１２６】いくつかの方法では、プライマーは、単一の型の標識ヌクレオチドの存在下で
核酸ポリメラーゼにより伸長される。標識は、反応に加えた標識ヌクレオチドが
、プライマーの３’末端に隣接する鋳型上のヌクレオチドに相補的である場合に
のみ、鋳型／プライマー複合体に取り込まれる。鋳型をその後洗浄して、任意の
非取込み標識を除去し、あらゆる取込み標識の存在を決定する。放射性標識は、
計測または当技術分野で公知のあらゆる他の方法により決定でき、一方、蛍光標
識は、例えば励起により蛍光に誘導できる。

【０１２７】本発明のいくつかの適用では、標識および非標識ヌクレオチドの組合せを解析
に使用する。合成チャネルの表面上に固定された複数のコピーの各鋳型分子が存
在するので、少ない比率の標識ヌクレオチドが、検出装置による検出に十分であ
る（以下参照）。例えば、蛍光標識ヌクレオチドでは、標識ヌクレオチドの比率
は、各型のヌクレオチドについて全標識および非標識ヌクレオチドの２０％未満
、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、またはさ
らには０．００１％未満であり得る。

【０１２８】１．標識ヌクレオチドいくつかの方法では、少なくとも１つ、通常全ての型のデオキシリボヌクレオ
チド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ／ｄＴＴＰ）または
ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰ）を標識する。容易に検出
される種々の標識は、放射性標識、光学的に検出可能な標識、分光標識等を含む
。好ましくは、蛍光標識を使用する。異なる型のヌクレオチドを、同じ種類の標
識で標識できる。または、異なる種類の標識を使用して、各異なる型のヌクレオ
チドを標識できる。

【０１２９】いくつかの方法では、蛍光標識を使用する。蛍光標識は、多くの異なる部分の
いずれかから選択できる。好ましい部分は、検出が極めて感度の高い蛍光基であ
る。例えば、フルオレセインまたはローダミン標識ヌクレオチド三リン酸が使用
可能である（例えばＮＥＮデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）から）。

【０１３０】蛍光標識ヌクレオチド三リン酸はまた、例えばカンバラ（Ｋａｍｂａｒａ）ら
（１９８８）「蛍光検出を使用したＤＮＡシークエネーターにおけるパラメータ
の最適化（ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＰａｒａｍｅｔｅｒｓｉｎＤ
ＮＡＳｅｑｕｅｎａｔｏｒＵｓｉｎｇＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＤｅｔ
ｅｃｔｉｏｎ）」Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．６：８１６〜８２１；スミス（Ｓｍ
ｉｔｈ）ら（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１３：２３９９〜２４
１２；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：６７
４〜６７９に記載のような、種々の蛍光標識技術により製造できる。特に高い破
壊係数を示す蛍光標識も、非特異的バックグラウンドシグナルを破壊するのに有
用であり得る。

【０１３１】２．遮断剤いくつかの方法では、プライマー伸長段階中に、鎖伸長阻害剤を反応に使用で
きる（例えばＤｏｗｅｒら、米国特許第５，９０２，７２３号参照）。鎖伸長阻
害剤は、鎖自体に取り込まれることにより、鎖の３’末端にヌクレオチドをポリ
メラーゼによりさらに付加することを防ぐ、鎖終結因子である、ヌクレオチド類
似体である。いくつかの方法では、鎖伸長阻害剤はジデオキシヌクレオチドであ
る。鎖伸長阻害剤が成長しているポリヌクレオチド鎖に取り込まれると、異なる
標識ヌクレオチドを使用して進行するシークエンス反応を可能とするために、標
識ヌクレオチドの取込みが検出された後に除去すべきである。いくつかの３’−
５’エキソヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩは、ジデオキシヌク
レオチドを除去できる。

【０１３２】鎖伸長阻害剤以外に、遮断剤または遮断基を、標識ヌクレオチドのデオキシリ
ボース基の３’部分に使用して、非特異的取込みを防止できる。最適には、遮断
剤は、温和な条件下で除去でき（例えば光感受性、弱酸不安定性、または弱塩基
不安定基）、これにより、次の合成サイクルでプライマー鎖のさらなる伸長が可
能となるべきである。遮断剤がまた蛍光標識も含む場合、二重遮断および標識機
能は、別々の部分で別々の反応の必要なく行なわれる。例えば、標識ヌクレオチ
ドを、デオキシリボース基の３’部分への蛍光染料の付着により標識でき、標識
は、ヌクレオチドから蛍光染料を切断し、３’ヒドロキシル基を作成することに
より除去する。蛍光染料は好ましくは、化学的または酵素的手段により容易に切
断されるリンカーアームにより、デオキシリボースに連結している。

【０１３３】遮断剤の例は、とりわけ、光感受性基、例えば６−ニトロベラトリルオキシカ
ルボニル（ＮＶＯＣ）、２−ニトロベンジルオキシカルボニル（ＮＢＯＣ）、α
，α−ジメチル−ジメトキシベンジルオキシカルボニル（ＤＤＺ）、５−ブロモ
−７−ニトロインドリニル、ｏ−ヒドロキシ−２−メチルシンナモイル、２−オ
キシメチレンアントラキノン、およびｔ−ブチルオキシカルボニル（ＴＢＯＣ）
を含む。他の遮断試薬は、例えば米国特許出願第０７／４９２，４６２号；パト
コーニック（Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋ）（１９７０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．９２：６３３３；およびアミット（Ａｍｉｔ）ら（１９７４）Ｊ．Ｏｒｇ
．Ｃｈｅｍ．３９：１９２に考察されている。種々の標識および遮断剤を有する
ヌクレオチドは容易に合成できる。標識部分は、例えばガイト（Ｇａｉｔ）（１
９８４）「オリゴヌクレオチド合成：実践的なアプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃ
ｈ）」、ＩＲＬプレス、オックスフォードに記載のような化学反応および条件を
使用してヌクレオチド上の適切な部位に付着する。

【０１３４】３．ポリメラーゼ鋳型に応じて、ＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼを、伸長反応に
使用できる。ＤＮＡ鋳型の解析のために、多くのＤＮＡポリメラーゼが使用可能
である。適切なＤＮＡポリメラーゼの例は、シークエナーゼ２．０ＲＴＭ、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ断片、またはＶｅｎ
ｔポリメラーゼを含むがこれらに限定されない。いくつかの方法では、３’→５
’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポリメラーゼを使用できる（例えばＴ７Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）またはＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ
断片（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）。いくつかの方法では、ポリ
メラーゼが校正活性を有することが望ましい場合、３’→５’エキソヌクレアー
ゼ活性を欠失したポリメラーゼを使用しない。いくつかの方法では、熱安定性ポ
リメラーゼ、例えばサーモシークエナーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ）
（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）またはタクエナーゼ（Ｔａｑｕｅｎａｓｅ）（商
標）（ミズーリ州セントルイス所在ＳｃｉｅｎＴｅｃｈ）を使用する。

【０１３５】方法に使用したヌクレオチドは、選択したポリメラーゼと適合性であるべきで
ある。適切なヌクレオチドおよびポリメラーゼ組合せを選択する手順は、ルース
（Ｒｕｔｈ）ら（１９８１）「分子薬理学（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａ
ｃｏｌｏｇｙ）」２０：４１５〜４２２；クタテラッソ（Ｋｕｔａｔｅｌａｄ
ｚｅ，Ｔ）ら（１９８４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：１６７１〜１６
８６；チャッジアヴェージ（Ｃｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅ，Ｚ）ら（１９８５）Ｆ
ＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、１８３：２７５〜２７８から適合できる。

【０１３６】ポリメラーゼは、装置中の別々のリザーバに保存でき、各伸長反応サイクル前
に合成チャネルに流すことができる。酵素は、他の反応物質（例えばヌクレオチ
ド三リン酸）と共に保存できる。または、ポリメラーゼを、ポリヌクレオチド鋳
型と共に、合成チャネルの表面上に固定できる。

【０１３７】４．遮断基および標識の除去取込みが検出されるまで、取込みおよび標識検出段階を繰返すことにより、プ
ライマーの３’末端に隣接する鋳型上のヌクレオチドを同定できる。一旦これが
達成されると、標識は、工程の反復前に除去し、次のヌクレオチドの実体を発見
すべきである。標識の除去は、３’−５’エキソヌクレアーゼを使用した標識ヌ
クレオチドの除去および非標識ヌクレオチドでのその後の置換により行なうこと
ができる。または、標識基をヌクレオチドから除去できる。さらなる代替法にお
いて、標識が蛍光標識である場合、それを照射で退色することにより標識を中和
できる。光退色は、例えばヤコブセン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）ら、「細胞生物学の
問題への蛍光光退色技術の適用に関する国際ワークショップ（Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌＷｏｒｋｓｈｏｐｏｎｔｈｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓｔｏＰｒｏｇｒａｍｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ）」Ｆｅｄ
ｅｒａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、４２：７２〜７９、１９７３；オカ
ベ（Ｏｋａｂｅ）ら、ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１２０：１１７７〜８６、１９
９３；およびクローズ（Ｃｌｏｓｅ）ら、ＲａｄｉａｔＲｅｓ５３：３４９
〜５７、１９７３に記載のような方法に従って実施できる。

【０１３８】鎖終結因子または３’遮断基を使用する場合、これらは、次のサイクルを行な
い得る前に除去すべきである。３’遮断基を、ヌクレオチドから遮断基の化学的
または酵素的切断により除去できる。例えば、鎖終結因子は、３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて除去する。一旦標識お
よび終結因子／遮断基が除去されると、サイクルを繰返して、次のヌクレオチド
の実体を発見する。

【０１３９】遮断基の除去は、標識が除去可能である場合には不必要であり得る。このアプ
ローチでは、遮断ヌクレオチドを取り込んだ鎖は永久的に終結し、もはや伸長工
程には参与しない。これらの遮断ヌクレオチドが標識工程から除去される限り、
各サイクル中の低い比率の永久的損失は耐えることができる。

【０１４０】いくつかの方法では、標識ヌクレオチド以外に、ヌクレオチド取込みは、ピロ
リン酸放出の検出によりモニタリングする（例えば国際公開公報第９８／１３５
２３号、国際公開公報第９８／２８４４０号、およびＲｏｎａｇｈｉら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２８１：３６３、１９９８参照）。例えば、ピロリン酸検出酵素カス
ケードを、反応混合物に含め、化学発光シグナルを生じる。また、デオキシヌク
レオチドまたはジデオキシヌクレオチドの代わりに、ポリメラーゼの基質として
作用できるが、ピロリン酸検出酵素の基質としては作用できない、ヌクレオチド
類似体を使用する。ピロリン酸は、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌク
レオチドの取込み時に放出され、これは酵素的に検出できる。この方法は、連続
的な試薬の添加に依拠する代わりに、洗浄段階を全く使用しない。

【０１４１】Ｄ．取り込まれたシグナルの検出および走査システム１．光学的検出挿入染料で標識したＤＮＡの単一分子を可視化する方法は、例えば、ハウシー
ル（Ｈｏｕｓｅａｌ）ら、ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ５６：５
０７、１９８９に記載のような蛍光顕微鏡を含む。通常、複数の分子由来のシグ
ナルは、本発明のシークエンス法を用いて検出するが、単一蛍光染料分子からの
蛍光も検出できる。例えば、多くの方法を、この目的に使用できる（例えばＮｉ
ｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：１０１３、１９９４；Ｆｕｎａｔｓｕら、Ｎａ
ｔｕｒｅ３７４：５５５、１９９５；Ｍｅｒｔｚら、ＯｐｔｉｃｓＬｅｔｔ
ｅｒｓ２０：２５３２、１９９５；およびＵｎｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ２７：１００８、１９９９参照）。それが光退色する前に単一分子の
蛍光スペクトルおよび寿命さえ測定できる（Ｍａｃｋｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７２：２５５、１９９６）。光増幅チューブまたはアバランシェフォトダイ
オードなどの標準的な検出器を使用できる。２段階イメージ強度ＣＣＤカメラを
用いた完全な磁場イメージングも使用できる（Ｆｕｎａｔｓｕら、前掲）。

【０１４２】シグナルまたは標識の検出システムはまた、使用する標識にも依存し得、これ
は入手可能な化学により規定できる。光学シグナルでは、光ファイバーまたは電
荷結合素子（ＣＣＤ）の組合わせを検出段階に使用できる。マトリックス自体が
、使用するその照射に透明である環境では、入射光ビームは基質を通過すること
が可能であり、検出器はポリヌクレオチドからの基質とは反対側に位置する。電
気磁気標識では、種々の形の分光システムを使用できる。検出システムの種々の
物理的配向が使用可能であり、重要な設計パラメータの考察は、例えばジョビン
（Ｊｏｖｉｎ）、Ａｄｖ．ｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｌｙｍｓに提供され
る。

【０１４３】取り込まれたシグナルは、合成チャネルの走査により検出できる。合成チャネ
ルは、使用する走査法に応じて、同時または連続的に走査できる。シグナルは、
イェルシェフ（Ｙｅｒｓｈｏｖ）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
９３：４９１３、１９９６）に記載のような、適切な光学（Ｐｌｏｅｍ，Ｊ．Ｓ
．、「生物活性のための蛍光および発光プローブ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａ
ｎｄＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、Ｍａｓｏｎ，Ｔ．Ｗ．編、アカデミックプレス、ロン
ドン、１〜１１ページ、１９９３）と共にＣＣＤカメラ（ＴＥ／ＣＣＤ５１２Ｓ
Ｆ、ニュージャージー州トレントン所在プリンストン・インストルメンツ（Ｐｒ
ｉｎｃｅｔｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を使用して走査できるか、または
、ＴＶモニタリングによりイメージングできる（Ｋｈｒａｐｋｏら、「ＤＮＡシ
ークエンシング（ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」、１：３７５、１９９１）
。放射性シグナル（例えば^３２Ｐ）では、ホスホイメージャー装置を使用できる
（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｒ．Ｆら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ
ｅｓｉｓ１１：３５５、１９９０；およびＤｒｍａｎａｃら、Ｄｒｍａｎａｃ
，Ｒら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１３：５６６、１９９２）。これら
の方法は、複数のプローブ領域の同時走査を行なうために特に有用である。

【０１４４】蛍光標識のために、合成チャネルを、１つずつまたは列ごとに、米国特許第６
，０９４，２７４号、第５，９０２，７２３号、第５，４２４，１８６号および
第５，０９１，６５２号に記載のような、蛍光顕微鏡装置を使用して連続的に走
査できる。いくつかの方法では、ＳＩＴおよびイメージ強化ＣＣＤカメラなどの
標準的な低い光レベルのカメラを使用する（Ｆｕｎａｔｓｕら、Ｎａｔｕｒｅ
３７４、５５５、１９９５参照）。ＩＣＣＤは、その良好な時間分割のために、
冷却ＣＣＤカメラであるのが好ましい。これらの装置は、商業的に入手できる（
例えばハママツ（Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ）から）。

【０１４５】また、ハママツ（Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ）またはＤＥＰからの強化単位のみを
使用し、他のより安価なまたは家庭で構築したカメラに取込む。必要であれば、
増強管を冷却できる。例えば、ＣＣＤカメラを、低価格の低ノイズ（１ピクセル
あたり４０電子解読ノイズ）モデルを提供した、フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐ
ｓ）から購入できる。家庭で構築したカメラにより、構成部品の選択の柔軟性の
向上およびより高い性能の装置が可能である。アバランシェ・フォトダイオード
の代わりにカメラを使用する利点は、全視野をイメージできることである。この
外部空間情報により、新しいノイズ減少技術の開発が可能である。例えば、ノイ
ズを拒絶するために、シグナルを特定の空間位置（すなわちポリヌクレオチド鋳
型を付着する）から期待されるという事実を使用できる。

【０１４６】いくつかの適用では、蛍光励起を、ＫＨｚ繰返し率を有する、Ｑ−スイッチ頻
度二倍ＮｄＹＡＧレーザーを用いて高め、１秒あたりに多くの試料を採取でき
る。例えば、５３２ｎｍの波長が、ローダミンの励起に理想的である。単一分子
検出スキームで使用する標準的な装置である（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５３：１１２２、１９９２）。パルス・レーザにより時間分割実験が可能とな
り、これは、外来のノイズの拒絶に有用である。いくつかの方法では、励起は、
水銀ランプを用いて実施でき、取り込まれたヌクレオチドからのシグナルは、安
価なＣＣＤカメラを用いて検出できる（例えばＵｎｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ２７：１００８、１９９９参照）。

【０１４７】走査システムは、装置中の合成チャネルを復元的に走査できるべきである。適
当な場合、例えば、合成チャネルをその位置に局在する２次元基質では、走査シ
ステムは、それに付着した合成チャネルを位置的に規定し、システムを再現的に
協調する。合成チャネルの位置同定は、連続的な走査段階で反復可能であること
は重要である。

【０１４８】種々の走査システムを、本発明の装置に使用できる。例えば、米国特許第５，
１４３，８５４号に記載の電気光学走査デバイスは、本発明の装置での使用に適
切である。システムは、写真走査、デジタイザーまたはさらにはコンパクトディ
スク解読デバイスの多くの特徴を示し得る。例えば、ニューポート社（Ｎｅｗｐ
ｏｒｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製のモデル番号ＰＭ５００−Ａ１ｘ−ｙ換算
表を検出単位に付着できる。ｘ−ｙ換算表は、ＩＢＭＰＣ／ＡＴまたはＡＴコ
ンパチブルコンピュータなどの適切にプログラム化されたデジタルコンピュータ
ーに接続し制御する。検出システムは、スタンフォード・リサーチ・システムズ
製のモデル番号ＳＲ４４０などのプリアンプに、および、スタンフォード・リサ
ーチ・システムズ（ＳｔａｎｄｆｏｒｄＲｅｓｅａｒｃｈＳｙｓｔｅｍｓ）
製のＳＲ４３０などの光子計測器、またはマルチチャネル検出デバイスに付着し
た、ハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）製のモデル番号Ｒ９４３−０２写真増強管
チューブであり得る。デジタルシグナルが通常好ましくあり得るが、類似シグナ
ルが有利である環境が存在し得る。

【０１４９】走査における位置的局在の安定性および復元性は、大部分、２次元基質上に近
接して位置したポリヌクレオチドクラスターを分離するための分割を決定する。
所定の位置での連続的なモニタリングは、ポリヌクレオチドの位置的にマッピン
グしたクラスターに対する反応サイクルのその効果に対する結果をマッピングす
る能力に依存する。分割が増加すると、単一のマトリックス上でシークエンスで
きる可能なポリヌクレオチドの数の上限も増加する。粗走査システムは、１００
０μｍのオーダーでのみ分割でき、精密化された走査システムは、１００μｍの
オーダーで分割でき、より精密化されたシステムは、約１０μｍのオーダーで分
割でき、光学拡大システムでは、１．０μｍのオーダーでの分割が使用可能であ
る。分割に関する制限は、回折限界であり得、利点は、蛍光走査段階ではより短
い波長の照射の使用から生じ得る。しかし、分割の増加と共に、マトリックスを
完全に走査するに必要な時間は増加し得、速度と分割の間の妥協を選択できる。
より短い走査時間で高い分割能を提供する平行検出デバイスは、複数の検出器を
平行で移動する場合に適用可能である。

【０１５０】いくつかの適用では、分割は、あまり重要でないことが多く、感度が強調され
る。しかし、シグナルの確実度は、光子を計測し、シグナル強度がより低い位置
でより長期間計測し続けることにより予め選択できる。これは走査速度を減少さ
せるが、シグナル決定の確実度を増加し得る。種々のシグナル検出およびプロセ
シングアルゴリズムを、検出システムに取込むことができる。いくつかの方法で
は、シグナルの領域におよぶシグナルのピクセル強度の分布を評価し、強度の分
布は時間肯定的シグナルに対応するかどうかを決定する。

【０１５１】２．非光学検出蛍光標識ヌクレオチドおよび光学検出デバイス以外に、質量分析を使用して反
応産物を解析、放射標識ヌクレオチドの使用、および「ワイヤー酵素」を用いた
反応産物の検出を含む、ヌクレオチド取込みを検出する他の方法も、本発明にお
いて考慮される。

【０１５２】いくつかの方法では、質量分析を使用して、プライマー伸長反応においてヌク
レオチド取込みを検出する。プライマー伸長反応は、ヌクレオチド三リン酸を消
費し、１塩基をプライマー／鋳型二本鎖に加え、副産物としてピロリン酸を産生
する。質量分析を使用して、ヌクレオチドを鋳型およびポリメラーゼと共にイン
キュベートした後に、洗浄流中でピロリン酸を検出できる。ピロリン酸の非存在
により、ヌクレオチドは取り込まれなかったことを示し、一方、ピロリン酸の存
在は取込みを示す。ピロリン酸放出に基づいた検出は、例えば、国際公開公報第
９８／１３５２３号；国際公開公報第９８／２８４４０号；およびロナジー（Ｒ
ｏｎａｇｈｉ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１：３６３、１９９８に記載されてい
る。

【０１５３】いくつかの方法では、放射標識ヌクレオチドを使用する。ヌクレオチドは、糖
、塩基または三リン酸基で放射標識できる。放射能を検出するために、小さな放
射能センサーを、ミクロ流体チップを搭載した基質に取込むことができる。例え
ばＣＣＤピクセルは、いくつかの放射崩壊工程の良好な検出器として作用する。
糖または塩基の放射標識は、追加のシグナルを生じ、各取込みは、プライマー−
鋳型二本鎖中の放射標識の量を増加させる。ヌクレオチドをピロリン酸（例えば
β−^３２Ｐまたはγ−^３２Ｐを有するｄＮＴＰ）として遊離した部分において標
識する場合、放射性ピロリン酸を洗浄流中で検出できる。この放射能標識は、各
々の試みたヌクレオチド添加について、相加的ではなく、むしろ二元的であり、
よってその後の添加は、解読長限界を課さなかった。試薬の消費が少なく、ミク
ロ流体の性質が含まれることにより、このようなシステムに使用される全放射能
は比較的最小限であり、封じ込めは比較的単純である。

【０１５４】いくつかの方法では、ピロリン酸放出の非光学的検出は、例えばヒーラー（Ｈ
ｅｌｌｅｒ）ら、「分析化学（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」
６６：２４５１〜２４５７、１９９４；およびオーハラ（Ｏｈａｒａ）ら、「
分析化学（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」６５：３５１２〜
３５１７、１９９３に記載のような「ワイヤー酸化還元酵素」を使用する。簡潔
には、酵素は、荷電を輸送できる酸化還元活性基を含む、ヒドロゲルマトリック
スに共有結合している。検出される被検体は、酸化還元酵素により直接作用する
か（電子を放出または消費）、または、酸化還元酵素により還元または酸化され
る基質を生じる酵素的カスケードの試薬として消費する。電子の産生または消費
は、ヒドロゲルと接触した金属電極で検出する。ピロリン酸の検出のために、ピ
ロリン酸、マルトースホスホリラーゼ、およびグルコースオキシダーゼを使用し
た酵素カスケードを使用できる。ピロリン酸は、ピロリン酸をリン酸に変換し、
マルトースホスホリラーゼはマルトースを（リン酸の存在下で）グルコース１−
リン酸とグルコースに変換する。その後、グルコースオキシダーゼは、グルコー
スをグルコノラクトンおよびＨ２Ｏ２に変換し、この最終反応は、電極での検出
可能な電流を生じる酸化還元段階である。この原理に基づいたグルコースセンサ
ーは当技術分野で公知であり、ここに記載したような酵素カスケードは以前に実
証されている。ここに示した特定の例以外の他の酵素カスケードも本発明におい
て考慮される。この型の検出システムにより、各反応チャンバーでのヌクレオチ
ド取込みの電気的取込みが可能となり、平行化が容易になる。

【０１５５】Ｅ．蛍光光退色シークエンスいくつかの方法では、ポリヌクレオチド配列を、蛍光光退色法を用いて解析す
る。この方法では、蛍光標識ヌクレオチドをプライマー伸長に使用する。取り込
まれたヌクレオチドからのシグナルは、次の伸長サイクルが始まる前に光退色に
より除去する。

【０１５６】ポリヌクレオチド鋳型は、上記のように調製できる（例えばその一本鎖Ｍ１３
プラスミドにクローニング）。ビオチニル化鋳型を、上記に考察したようにＰＥ
Ｍ技術で前処理しておいた合成チャネルの表面に付着する。開始後、一本鎖ＤＮ
Ａを、フローセル中の合成チャネルに固定する。ポリメラーゼおよび１つのヌク
レオチド三リン酸、例えばｄＡＴＰを、フローセル中に流す。エキソヌクレアー
ゼ校正能の全くない高忠実度のポリメラーゼが好ましい。いくつかの方法では、
各型のヌクレオチド三リン酸の１画分のみ（例えば１０％、５％、１％、０．１
％、０．０１％、または０．００１％未満）を蛍光標識する（例えばＮＥＮデュ
ポンのローダミン標識ヌクレオチド三リン酸）。例えば、プライマーの次のＤＮ
Ａ配列の第一塩基がＴである場合、ポリメラーゼはｄＡＴＰを取込み、ＤＮＡ分
子のいくつかの画分は蛍光標識されるようになる。第一塩基がその他のものであ
る場合、蛍光分子は取り込まれない。その後、試薬をフローセルから流出し、Ｄ
ＮＡの蛍光を測定する。蛍光が検出されない場合、手順を、他のヌクレオチド三
リン酸の１つを用いて繰返す。蛍光が検出されれば、配列中の第一塩基の実体を
決定する。蛍光シグナルを光退色し、消光し、その後、手順を鋳型配列の次の塩
基について繰返す。

【０１５７】蛍光を、例えばＱ−スイッチ頻度倍化ＮｄＹＡＧレーザ（Ｓｍｉｔｈら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２５３：１１２２、１９９２）を用いて励起できる。これは、光
退色する前に、単一分子の蛍光スペクトルおよび寿命を測定する、単一分子検出
スキームに使用される標準的なデバイスである。それはｋＨｚ繰返し率を有し、
１秒あたりに多くの試料を採取できる。波長は、ローダミンの励起に理想的な例
えば５３２ｎｍであり得る。パルスレーザーにより、時間分割実験が可能となり
、外来ノイズの拒絶に有用である。

【０１５８】取り込まれた標識の検出は、標準的な低光標識カメラ、例えばＳＩＴまたはイ
メージ強化ＣＣＤカメラ（Ｆｕｎａｔｓｕら、前掲）を用いて実施できる。強化
ＣＣＤ（ＩＣＣＤ）カメラは、その良好な時間分割により、冷却ＣＣＤカメラよ
り好ましい。これらのデバイスは、例えばハママツ（Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ）か
ら入手できる。しかし、これらのカメラは極めて高価であるので、検出デバイス
は、ハママツ（Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ）からの増強管をＣＣＤカメラに単に構築
することにより製造できる。選択的に、増強管を冷却できる。ＣＣＤカメラはフ
ィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）から入手でき、例えば低価格で低ノイズのモデ
ル（１ピクセルあたり４０電子解読ノイズ）である。カスタム構築されたカメラ
により、構成部品の選択の柔軟性の向上およびより高い性能デバイスが可能とな
る。アバランシェ・フォトダイオードの代わりにカメラを使用する利点は、全視
野をイメージできることである。この余分な空間情報により、新しいノイズ減少
技術の開発が可能である。例えば、シグナルは特定の空間位置（すなわちＤＮＡ
が付着した場所）から期待されるという事実を使用して、ノイズを拒絶できる。

【０１５９】Ｆ．他の見解因子の組合せが、本発明に記載のシークエンス解析の解読長および処理能力に
影響を及ぼす。第一に、全ての非取り込み標識ヌクレオチドを、各サイクル後に
、合成チャネルまたは反応チャンバーから除去すべきである。比較的少数の取込
み染料分子が検出されるべきであるので、試薬交換は、検出すべきヌクレオチド
数よりも、実質的に少ない非取り込み標識ヌクレオチドを残すべきである。第二
に、試薬交換速度は、流体機械的見解により限定される。効果的な試薬交換を保
持するために乱流を回避すべきであり、液体流剪断力は、ＤＮＡを破壊または酵
素を混乱させないために十分小さくなければならない。第三に、ヌクレオチド取
込みおよび酵素−ＤＮＡ複合体形成の動力学を考えるべきである。

【０１６０】本発明は、装置中の液体の許容可能な流速の決定法を教示する。本発明によれ
ば、１００μｍの深さの微細加工フローチャネルを有する装置中の流速は典型的
には０．１〜１ｃｍ／秒である。１０μｍの深さの微細加工フローチャネルでは
、流速は通常、１〜１０ｃｍ／秒の範囲である。装置中の液体流は、レイノルド
数がＲ＝ρντ／η＜＜１（ここで、ρは液体の密度であり、νは速度であり、
τはチャンバーの寸法であり、かつηは粘度である）である限り、層流を維持す
る（例えば、Ｌａｎｄａｕら、「流体工学（ＦｌｕｉｄＭｅｃｈａｎｉｃｓ）
」、ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８９）。限界速度
は、１００μｍチャネルの深さで１ｃｍ／秒のオーダーである。１０μｍの深さ
のマイクロチャネルでは、限界は１０ｃｍ／秒である。

【０１６１】液体を交換できる速度に対する究極の限界は、ポリヌクレオチド鋳型およびポ
リメラーゼに対する抵抗および剪断流の効果により決定される。拘束した流れの
速度プロファイルは放物線（ｖ（τ）−ｖ_ａｖｅ（１−（τ／Ｒ）^２）））であ
り、剪断力を引き起こす。二本鎖ＤＮＡを有する単一分子実験により、ＤＮＡを
分解またはＤＮＡに対する不可逆的な損傷を引き起こすことなく、Ｆ＝５０ｐＮ
までの力を印加できることが示され（例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７１：７９５、１９９６；およびＣｌｕｚｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：
７９２、１９９６）、類似のオーダーの大きさが、一本鎖ＤＮＡに期待される。
ＤＮＡの抵抗係数α＝６πＲ_５を、回転半径Ｒ_５＝０．３μｍから推定できる。
その後、許容可能な最大液体粘度は式：ｖ_max(R-R_g)=F/α を解くことにより決定する。ＤＮＡ剪断が問題となる前の最大平均速度は、１４
０ｃｍ／秒である。

【０１６２】別の見解は、ポリメラーゼが鋳型から外れる、または損傷を受けることを防ぐ
。ＲＮＡポリメラーゼを用いて、不可逆的な損傷を受け得る、ＲＮＡポリメラー
ゼの失速力は１４ｐＮであることが示された（Ｙｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７
０：１６５３、１９９５）。一旦ＤＮＡポリメラーゼの抵抗係数をそのサイズか
ら推定できると、ＤＮＡ剪断に関する類似の計算により、５００ｃｍ／秒の最大
速度がもたらされる。

【０１６３】全ての遊離ヌクレオチドを除去する時間は、液体流の流体力学計算への拡散の
効果を含めることにより計算できる。非常に小さいデッドボリュームを有する電
気スイッチバルブを含む、非常に多様な製品が入手可能である。例えば、タール
デザインズ（ＴｈａｒＤｅｓｉｇｎｓ）の電気モーターを有するアップチャ
ーチ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ）の６ポートバルブは、デッドボリューム２μｌおよび
スイッチ時間１６６ｍ秒を有する。０．００２５’’Ｉ．Ｄ．チューブおよび推
定１μｌ容量の微細加工フローセルと組合わせて、４μｌの物質を、工程の各段
階で交換すべきである。シリンジまたは蠕動ポンプは非常に速い流速を生じ得、
限界因子は低いレイノルド数である。全てのヌクレオチドを排除する逆速度定数
は、 τ =(LR/ｖ_ave)^2/3(D)^-1/3 （式中、Ｌはデバイスの線形寸法であり、Ｄはヌクレオチドの拡散定数である）
である。適切な数で埋めるとτ＝１５秒の時間が得られる。１検出領域あたりマ
イクロモルから１標識ヌクレオチドのオーダーのヌクレオチド濃度を減少するた
めに、これは約１０^−７の減少である。デバイスを完全に流す時間はｌｎ（１０ ^−７）τ＝４分である。

【０１６４】１０μｍの微細加工フローチャネル深さおよびチップ上に取り込まれた微細加
工バルブを有する装置では、デッドボリュームは減少し、処理能力は増大する。
バルブは、本質的にゼロのデッドボリュームおよび１０ｍ秒のスイッチ時間を提
供し得る。デバイスのこれおよび減少した寸法により、処理能力の劇的な増大が
生じ、システムからの試薬（例えばヌクレオチド）が流れる時間は０．８秒に減
少する。全体の処理能力は１秒あたり約１塩基である。表１は、１００μｍまた
は１０μｍの深さの微細加工フローチャネルを有する装置の処理能力に影響を及
ぼす種々の因子を要約する。

【０１６５】

【表１】シークエンス装置の処理能力に影響を及ぼすパラメータ装置Ｉでは、限界因子は、乱流を引き起こす液体速度であることを留意のこと。
装置ＩＩでは、ＤＮＡに対する剪断力も限界となる。試薬交換時間は、装置ＩＩ
において因子を１００向上すると期待される。

【０１６６】ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡから外れ得る。酵素を補充する場合、酵素が遊離
ＤＮＡ部位を発見し結合するのに時間を要する。これは、装置の処理能力に影響
を及ぼし得る。ポリメラーゼの漸減速度は、当技術分野に記載の方法に従って決
定できる。例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの動力学を名目値として使用して（
Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２４：１４４３、１
９９１）、１１μＭ^−１秒^−１の速度が得られた。従って、１μＭの濃度の酵素
により、１１秒^−１の速度が得られ、１秒後、９９．３％のＤＮＡがポリメラー
ゼに結合した。ヌクレオチドの非存在下で（例えば、蛍光測定中）、ポリメラー
ゼは、時間定数０．２秒^−１で、ＤＮＡから外れる（Ｙｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７０：１６５３，１９９５）。言いかえると、ヌクレオチドの非存在下で５
秒後、これは漸減源となり得る。それは、デバイスの各シークエンスサイクル毎
に新しいポリメラーゼを添加することにより捕捉できる。

【０１６７】高い処理能力のデバイス（例えば表Ｉの装置ＩＩ）では、試薬交換は、外れる
ポリメラーゼが処理能力に対して有意な作用を示さないのに十分なほど速い。ま
た、ポリメラーゼによるヌクレオチドの取込み速度は、典型的には、１秒あたり
約３００塩基である。これは、デバイス処理能力に関する速度限界因子である。

【０１６８】シークエンス解析の解読長は、種々の因子により影響を受け得る。しかし、光
退色は、次の塩基の付着を防ぐポリヌクレオチド鋳型へのいかなる化学的変化を
引き起こさないようである。光退色中、染料分子は、リンカーアーム上のＤＮＡ
から離れ、相互作用の断面が無視できる非常に少ない光子を放出する。標識ヌク
レオチドのいかなる漸減も、いかなる有意な問題を提示しない。光退色スキーム
の統計は、標識ヌクレオチドのいかなる漸減にも関わらずシークエンスを続ける
に十分なほど頑強である。例えば、塩基の０．１％を標識する場合、標識ヌクレ
オチドの取込みが、鎖伸長を完全に終結する場合、３０００塩基後に漸減は９５
％である。言いかえると、１０^５個の分子で開始する場合、第一塩基上で、１０
０個の染料分子から蛍光シグナルを得ることを期待する。３０００番目の塩基に
より、シグナルは僅か５個の染料分子まで減少する。これは、依然として検出可
能である。なぜなら検出下限は１染料分子であるからである。

【０１６９】上記に考察したような漸減は極端なシナリオであることを注意すべきである。
その理由は、各々の取り込まれた塩基についての全漸減を期待する理由はほとん
どないからである。漸減は、ポリメラーゼが２つの連続した標識ヌクレオチドを
取込む場合に生じる可能性がより高いようである。塩基の１％を標識すると、互
いに隣の２つの標識ヌクレオチドを取込む確率は１％^２＝０．０１％である。そ
の後、３０００塩基後の漸減速度は２５％である。言いかえると、シグナルは３
０００番目の塩基までに２５％しか減少しない。従って、漸減は、このシークエ
ンススキームに問題を引き起こさない。

【０１７０】解読長に影響を及ぼし得る別の因子は誤取込みである。ＤＮＡポリメラーゼに
適切なヌクレオチドが不足している場合、誤ヌクレオチドを取込むことができる
。誤取込み効率は、適切なヌクレオチド取込みについての効率より３〜５のオー
ダーが低いと測定された（Ｅｃｈｏｌｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
６０：４７７、１９９１）。誤取込みは、適切なヌクレオチドの取込みに必要な
時間、ＤＮＡポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体をヌクレオチドに曝露することのみに
より最小限にできる。高い忠実度のＤＮＡポリメラーゼでは、誤取込みは、約１
０^−４の頻度で起こる。誤取込みによる位相ずれを、全ての漸減として処理する
場合、漸減は３ｋｂ後に僅か２５％であり、すなわち、シグナルはその最初の７
５％まで減少する。従って、誤取込みは、３ｋｂまたはそれ以上長い解読長を妨
げない。

【０１７１】本発明の多くの修飾および変形を、その精神および範囲から逸脱することなく
実施できる。本明細書に記載の特定の態様は単に説明のためであり、いずれにし
ても本発明を限定するものではない。

【０１７２】本明細書に引用した全刊行物、図面、特許および特許出願は、各々を個々に示
したのと同じように、全ての目的のために、ここに明確に参照して組み込まれる
。

【図面の簡単な説明】

【図１】ミクロ機械加工された型の上に形成された第一エラストマー層の
図である。

【図２】ミクロ機械加工された型の上に形成された第二エラストマー層の
図である。

【図３】ミクロ機械加工された型から取り出し、図１のエラストマー層の
上に配置した、図２のエラストマー層の図である。

【図４】図３に対応するが、第一エラストマー層の上に配置した第二エラ
ストマー層を示す図である。

【図５】図４に対応するが、共に結合した第一および第二エラストマー層
を示す図である。

【図６】図５に対応するが、取り出した第一のミクロ機械加工された型お
よびその場所に配置した平面基質を示す図である。

【図７Ａ】図６に対応するが、平面基質上にシールしたエラストマー構造
を示す図である。

【図７Ｂ】開口フローチャネルを示す、図７Ａに対応する正面断面図であ
る。

【図７Ｃ】図７Ａに対応するが、第二フローチャネルの圧力により閉じた
第一フローチャネルを示す。

【図８】平面基質上に堆積した第一エラストマー層の図である。

【図９】図８の第一エラストマー層の上に堆積した第一犠牲層を示す図で
ある。

【図１０】図９のシステムを示すが、第一犠牲層の一部を除去し、第一の
ラインの犠牲層のみが残った図である。

【図１１】図１０の第一のラインの犠牲層の第一のライン上の第一エラス
トマー層の上に塗布し、それにより第一および第二エラストマー層の間の犠牲層
を包む、第二エラストマー層を示す図である。

【図１２】図１１に対応するが、第一および第二エラストマー層が共に結
合した後に生じる統合されたモノリシック構造を示す。

【図１３】図１２の統合されたエラストマー構造の上に堆積した第二犠牲
層を示す図である。

【図１４】図１３のシステムを示しているが、第二犠牲層の一部が除去さ
れ、第二のラインの犠牲層のみが残った図である。

【図１５】第二エラストマー層の上および図１４の犠牲層の第二のライン
の上に塗布した第三エラストマー層を示し、これにより、犠牲層の第二のライン
を、図１２のエラストマー構造と第三のエラストマー層の間に封入する。

【図１６】図１５に対応するが、あらかじめ結合した第一および第二エラ
ストマー層からなるモノリシックな構造に結合するように硬化した第三エラスト
マー層を示す。

【図１７】図１６に対応するが、統合したエラストマー構造を通過する２
つの垂直の重複しているが横切らないフローチャネルを提供するように除去され
た第一および第二のラインの犠牲層を示す。

【図１８】図１７のシステムを示した図であるが、その下の平面基質が除
去されている。

【図１９】種々のフローチャネルについてのバルブ開口対印加圧力を示す
。

【図２０】１００μｍ×１００μｍ×１０μｍのＲＴＶマイクロバルブの
時間応答を示す。

【図２１】種々のチャネルを通る流れを可能とするように適合した複合シ
ステムの概略図である。

【図２２Ａ】アドレス可能な反応チャンバー構造の流動層の平面図である
。

【図２２Ｂ】アドレス可能な反応チャンバー構造の制御チャネル層の底面
図である。

【図２２Ｃ】図２２Ｂの制御チャネル層を、図２２Ａの流動層の上に結合
することにより形成された、アドレス可能な反応チャンバー構造の分解斜視図で
ある。

【図２２Ｄ】図２２Ｃの線２８Ｄ−２８Ｄで切り取った、図２２Ｃに対応
する断面立面図である。

【図２３】反応ウェルのアレイのいずれかへの、流体流を選択的に導くよ
うに適合したシステムの概要である。

【図２４】平行フローチャネルの間の選択可能な側面流に適合したシステ
ムの概略である。

【図２５】ポリヌクレオチド配列を解析するための統合システムの概略で
ある。

【図２６】ポリヌクレオチド配列を解析するためのさらに統合したシステ
ムの概要である。

【図２７】シークエンス装置の概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 27/62 Ｖ 27/62 33/53 Ｍ 33/53 Ｕ 33/566 33/566 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ボルクマスウェインアメリカ合衆国カリフォルニア州カラバサスエルエンカント 3620 (72)発明者アンガーマークアメリカ合衆国カリフォルニア州サウスサンフランシスコアダムスコート 2555 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA13 FB01 FB02 FB05 FB07 FB12 GC15 2G054 CA22 EA03 EA07 GA04 4B024 AA19 AA20 CA01 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 FA15 4B063 QA13 QA20 QQ08 QQ43 QQ89 QR08 QR42 QR56 QR62 QR66 QS02 QS25 QS34 QS39 QX02 QX07 QX10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）微細加工合成チャネルに付着した開始標的ポリヌクレ
オチドを提供すること、（ｂ）標的ポリヌクレオチドの鋳型として作用する相補的ヌクレオチドが存在
する場合、第一ヌクレオチドがプライマーに付着する条件下で合成チャネルを通
じて第一ヌクレオチドを流すこと、（ｃ）シグナルの存在または非存在、ここでのシグナルの存在は、第一ヌクレ
オチドがプライマーに取り込まれたことを示し、よって標的ポリヌクレオチドの
鋳型として作用する相補的塩基の実体を決定すること、（ｄ）存在する場合、シグナルを除去または減少すること、および（ｅ）第一ヌクレオチドと同じまたは異なるさらなるヌクレオチドを用いて段
階（ｂ）〜（ｄ）を繰返し、これによりさらなるヌクレオチドがプライマーまた
はプライマーにあらかじめ取り込まれたヌクレオチドに付着することを含む、標
的ポリヌクレオチドを解析する方法。
【請求項２】段階（ａ）が、異なる合成チャネルに付着した複数の異なる
開始標的ポリヌクレオチドを提供することを含み、段階（ｂ）が、合成チャネルの各々を通じて第一ヌクレオチドを流すことを含
み、かつ段階（ｃ）が、チャネルの各々におけるシグナルの存在または非存在、ここで
の合成チャネル中のシグナルの存在は、第一ヌクレオチドが合成チャネル中のプ
ライマーに取り込まれたことを示し、よって合成チャネル中の標的ポリヌクレオ
チドの鋳型として作用する相補的塩基の実体を決定することを含む、請求項１記
載の方法。
【請求項３】段階（ａ）が、各合成チャネルに付着した複数の異なる開始
標的ポリヌクレオチドを提供することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】第一ヌクレオチドおよびさらなるヌクレオチドが標識されて
いる、請求項１記載の方法。
【請求項５】合成チャネルを洗い流し、取り込まれていない第一またはさ
らなる標識ヌクレオチドを除去することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】段階（ｂ）〜（ｄ）が、少なくとも４回、４つの異なる型の
標識ヌクレオチドを用いて実施される、請求項４記載の方法。
【請求項７】段階（ｂ）〜（ｄ）が、標的ポリヌクレオチドの各塩基の実
体が同定されるまで実施される、請求項４記載の方法。
【請求項８】合成チャネルが、ミクロ流体チップを平坦な基質に結合する
ことにより形成される、請求項４記載の方法。
【請求項９】標的ポリヌクレオチドが、合成チャネル中の基質の内部表面
に固定されている、請求項８記載の方法。
【請求項１０】内部表面が、多価電解質多層（ＰＥＭ）で覆膜されている
、請求項９記載の方法。
【請求項１１】ミクロ流体チップが、エラストマー物質で加工されている
、請求項８記載の方法。
【請求項１２】エラストマー物質が、ＲＴＶシリコーンである、請求項１
１記載の方法。
【請求項１３】標識ヌクレオチドの少なくとも１つが、標識および非標識
形のヌクレオチドの混合物を含む、請求項４記載の方法。
【請求項１４】合成チャネルの横断面が、１００μｍ×１００μｍ未満、
１０μｍ×１００μｍ未満、１μｍ×１０μｍ未満、または０．１μｍ×１０μ
ｍ未満の線形寸法を有する、請求項４記載の方法。
【請求項１５】標識が蛍光標識である、請求項４記載の方法。
【請求項１６】除去または減少が光退色による、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】標識が放射標識である、請求項４記載の方法。
【請求項１８】除去または減少が、標識の化学的または酵素的放出による
、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】標識が質量分析標識である、請求項４記載の方法。
【請求項２０】除去または減少が、標識の化学的または酵素的放出による
、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】シグナルが、非光学的シグナルである、請求項１記載の方
法。
【請求項２２】非光学的シグナルが、ピロホスフェート放出である、請求
項２１記載の方法。
【請求項２３】ピロホスフェート放出が、質量分析を用いて検出される、
請求項２２記載の方法。
【請求項２４】ピロホスフェート放出が、酵素反応を用いて検出される、
請求項２２記載の方法。
【請求項２５】酵素反応が、酸化還元酵素反応である、請求項２４記載の
方法。
【請求項２６】（ａ）基質の表面を予め処理して、ポリヌクレオチド付着
および配列解析を容易にする表面化学を形成すること、（ｂ）基質の表面に付着した開始標的ポリヌクレオチドを提供すること、（ｃ）標的ポリヌクレオチドの鋳型として作用する相補的ヌクレオチドが存在
する場合、標識第一ヌクレオチドがプライマーに付着する条件下で、標識第一ヌ
クレオチドを付着標識ポリヌクレオチドに提供すること、（ｄ）シグナルの存在または非存在、ここでのシグナルの存在は、標識第一ヌ
クレオチドがプライマーに取り込まれたことを示し、よって標的ポリヌクレオチ
ドの鋳型として作用する相補的塩基の実体を決定すること、および（ｅ）第一標識ヌクレオチドと同じまたは異なる、標識されたさらなるヌクレ
オチドを用いて段階（ｃ）〜（ｄ）を繰返し、これにより、標識されたさらなる
ヌクレオチドが、プライマーまたはプライマーにあらかじめ取り込まれたヌクレ
オチドに付着することを含む、標識ポリヌクレオチドを解析する方法。
【請求項２７】基質がガラスであり、表面が多価電解質多層（ＰＥＭ）で
覆膜されている、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】ＰＥＭが、ポリアニオンで終結している、請求項２７記載
の方法。
【請求項２９】ポリアニオンが、突出カルボン酸基を有する、請求項２８
記載の方法。
【請求項３０】標的ポリヌクレオチドがビオチニル化されており、表面が
ストレプトアビジンで覆膜されている、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】表面が、ストレプトアビジンで覆膜する前にビオチンで覆
膜されている、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】表面が、ビオチン付着前に、カルボン酸基で終結した多価
電解質多層（ＰＥＭ）で覆膜されている、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】表面が、ＰＥＭで覆膜する前に、ＲＣＡ溶液で前処理され
ている、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】（ａ）開始標的ポリヌクレオチドを提供すること、（ｂ）標的ポリヌクレオチドの鋳型として作用する相補的ヌクレオチドが存在
する場合、第一ヌクレオチドを、第一ヌクレオチドがプライマーに付着する条件
下で提供し、第一ヌクレオチドの画分が標識されていること、（ｃ）プライマーからのシグナルの存在または非存在、ここでのシグナルの存
在は、第一ヌクレオチドがプライマーに取り込まれたことを示し、よって標的ポ
リヌクレオチドの鋳型として作用する相補的塩基の実体を決定すること、および（ｄ）第一ヌクレオチドと同じまたは異なるさらなるヌクレオチドを用いて段
階（ｂ）〜（ｃ）を繰返し、これにより、さらなるヌクレオチドが、プライマー
またはプライマーにあらかじめ取り込まれたヌクレオチドに付着し、さらなるヌ
クレオチドの画分が標識されていることを含む、標的ポリヌクレオチドの解析法
。
【請求項３５】標識が蛍光標識である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】除去または減少が光退色による、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】第一ヌクレオチドの画分およびさらなるヌクレオチドの該
画分が、１０％未満である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】第一ヌクレオチドの画分およびさらなるヌクレオチドの該
画分が１％未満である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】第一ヌクレオチドの画分およびさらなるヌクレオチドの該
画分が、０．１％未満である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】第一ヌクレオチドの画分およびさらなるヌクレオチドの該
画分が０．０１％未満である、請求項３４記載の方法。
【請求項４１】（ａ）少なくとも１つの微細加工合成チャネルを含むフロ
ーセル、および（ｂ）液体をフローセル中におよびフローセルを通じて流動するために、該フ
ローセルと液体伝達している、入口ポートおよび出口ポートを含む、ポリヌクレ
オチド配列を解析するための装置。
【請求項４２】表面からのシグナルを検出する検出器をさらに含む、請求
項４１記載の装置。
【請求項４３】合成チャネルの表面を照射する光源をさらに含む、請求項
４２記載の装置。
【請求項４４】シグナルが蛍光シグナルである、請求項４２記載の装置。
【請求項４５】シグナルが電気化学シグナルである、請求項４２記載の装
置。
【請求項４６】合成チャネルが、基質へのミクロ流体チップの結合により
形成される、請求項４１記載の装置。
【請求項４７】ミクロ流体チップが、微細加工合成チャネルと統合したシ
ステムで、微細加工バルブおよび微細加工ポンプをさらに含む、請求項４６記載
の装置。
【請求項４８】反応試薬の保存用の複数のリザーバをさらに含み、微細加
工バルブおよび微細加工ポンプがリザーバに接続している、請求項４７記載の装
置。
【請求項４９】合成チャネルの横断面が、１００μｍ×１００μｍ未満、
１０μｍ×１００μｍ未満、１μｍ×１０μｍ未満、または０．１μｍ×１μｍ
未満の線形寸法を有する、請求項４１記載の装置。
【請求項５０】検出器が、光子計測カメラである、請求項４２記載の装置
。
【請求項５１】ミクロ流体チップが、エラストマー物質で加工されている
、請求項４６記載の装置。
【請求項５２】エラストマー物質がＲＴＶシリコーンである、請求項５１
記載の装置。
【請求項５３】基質がガラスカバースリップである、請求項５２記載の装
置。
【請求項５４】ヌクレオチドが合成チャネルに連結するようになる場合に
、ヌクレオチドの実体を記録する、適切にプログラム化したコンピュータをさら
に含む、請求項４１記載の装置。