JP2009240249A - 核酸配列の検出方法及び核酸配列検出用基板 - Google Patents

Abstract

【課題】検出すべき特定の標的核酸配列の簡便な核酸増幅法を提供すること，またその増幅法を用いた高感度な検出が可能な核酸検出方法を提供すること。
【解決手段】一対のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとし，その一方の末端を基板表面に固定化し，固定化したオリゴヌクレオチド鎖それぞれと相補的な配列を有する標的核酸配列（１本鎖）を結合させ，この状態で増幅反応を繰り返す増幅方法，及びこの増幅反応を繰り返して，基板上に高密度の架橋状態の架橋体を形成させる増幅方法，及びこの方法を用いて作成した拡散配列検出用基板。前記架橋体により微細な網目状空間を作り出し，この網目状空間にリガンドを取り込み，或いは核酸伸長反応の基質に標識化リガンドを添加し伸長反応させてリガンドを鋳型鎖及び/又は非鋳型鎖に取り込み，前記リガンドと反応する活性物質で前記リガンドを発色又は発光させるようにした。
【選択図】図１

Description

本発明は核酸配列の検出方法及び核酸配列検出用基板に係り，特に検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかどうかを高感度で，しかも簡易かつ低コストで検出するための技術に関する。

従来，検体固有の核酸配列を標的として検出する方法としては，基板上に固定化させたオリゴヌクレオチド鎖に標的核酸配列を結合させ，結合した標的核酸配列に蛍光物質を標識した，異なるオリゴヌクレオチド鎖を結合させる。そして，特定波長の光（レーザー光等）を当てることで，標識蛍光物質の蛍光シグナルを検出・増幅することで特定の核酸配列が検体サンプル中に存在するかどうかを検出する。

別の検出方法としては，基板上に固定化したオリゴヌクレオチド鎖に，標的核酸配列を結合させ，オリゴヌクレオチド鎖をプライマーとし，結合した標的核酸配列を鋳型として伸長反応させ，その際に取り込まれる塩基物質に蛍光物質を標識する。そして，特定波長の光（レーザー光等）を当てることで，標識蛍光物質の蛍光シグナルを検出・増幅する。

しかし，これらの検出方法は，蛍光物質を検出しなくてはならないため，特定波長光を出す特殊な検出装置を必要とし，検出装置が高価となり，一部の研究機関や大学機関等に使用が限定されている状況である。したがって，例えば水処理現場等において，水（検体サンプル）中におけるノロウイルス，クリプトスポリジウム等の病原微生物を簡易に検出する手法としては，操作が繁雑なうえ分析装置が高価な為，採用できないという問題がある。

このような背景から，例えば水処理等の検出を行う現場において低コストで簡便に特定の核酸配列を標的として検出する方法として，特許文献１，特許文献２，非特許文献１に記載されるＭＰＥＸ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ ＥＸｔｅｎｓｉｏｎ 法）が開発されている。この検出方法は，ＤＮＡ基板上に固定化したオリゴヌクレオチド鎖が標的ＤＮＡに結合し，相補的な標識化ＤＮＡを増幅する手法である。本手法は，蛍光物質のみならず発色色素を標識に用い，吸光度装置，イメージスキャナ等の一般的装置で検出可能であり，更には可視化されることで目視により簡便に検出できる。

特許文献３には，基板上の電極上に２つのオリゴヌクレオチドプローブを固定し，標的核酸配列を持つ試料と接触させてプローブとハイブリダイズさせ，プローブ間に流れる電流を検出して標的核酸配列を検出することが記載されている。

特許文献４には，基板に一端を固定したカーボンナノチューブに金属を結合し，導電性のバイオ化合物を金属に結合した電子センサデバイスが記載されている。

又，特許文献５には，基板上に２つの電極を設け，電極間をＤＮＡでブリッジした構造を持つナノデバイスが開示されている。

特開２００６−１７４７８８号公報 特開２００７−２２２０１０号公報 米国特許第６，５９３，０９０号明細書 米国特許第６，９５８，２１６号明細書 米国特許第７，２１６，７９２号明細書 ：Ｋ．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｏｎ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｓｔｉｃ ＤＮＡ ａｒｒａｙ ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１，２００７，ｐｐ．ｅ３

しかしながら，発色又は色素は蛍光物質に比べて検出シグナルの増幅感度が劣るため，例えばノロウイルス，クリプトスポリジウム等のように，水（検体サンプル）中に極微量のオーダでしか存在せず，しかも培養により増殖できない病原微生物を，ＭＰＥＸ法を用いて検出するには，高感度な検出ができないという課題がある。ＭＰＥＸ法により高感度で検出するには標識を増やす必要があり，そのためにはＰＣＲ法等により標的核酸配列の濃度を高める工程が必要となるため，結果が得られるまでに長時間を要するという欠点がある。

したがって，ノロウイルス，クリプトスポリジウム等のように，水中に極微量のオーダでしか存在せず，しかも培養により増殖できない病原微生物を，ＭＰＥＸ法を用いて検出するには更なる改良が必要となる。

また，たとえ蛍光物質を使用したとしても，上記の病原微生物のように検出すべき特定の遺伝子が極めて微量である場合には，検出感度の不安定化を招き，精度のよい検出ができない。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので，検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても，高感度な検出が可能であり，しかも低コスト・短時間での検出が可能である核酸配列の検出方法及びその方法を用いた核酸配列検出基板を提供することを目的とする。

本発明において，請求項１〜１４記載の発明は，核酸検出方法にかかわり，請求項１５〜１８に係る発明は，前記核酸検出法に使用される基板である。

本発明は，標的核酸配列に対して相補的または相同的な核酸配列を有する一対のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端または５’末端を基板上に固定化した前記一対のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列の相補的部分を結合させ微細な網目状空間を有する架橋構造体を形成する工程と，
前記架橋構造体を形成する核酸配列に発色又は発光物質を取り込み，又は前記網目状空間にリガンドを取り込む工程と，
前記取り込んだ発色又は発光物質に反応する活性物質を用いて発色又は発光させる工程と，
前記発色又は発光信号を検出することにより前記標的核酸配列を検出する検出工程と，を備えたことを特徴とする核酸配列の検出方法を提供するものである。

更に本発明は，基板表面に５’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖１に標的核酸配列をハイブリダイズする工程１と，
前記オリゴヌクレオチド鎖１をプライマーとし，標的核酸配列が第１の鋳型鎖となる核酸伸長反応により第１の伸長反応鎖を形成する工程２と，
前記第１の鋳型鎖の５’末端側と解離した第１の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，基板表面に５’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖２にハイブリダイズする工程３と，
前記オリゴヌクレオチド鎖２をプライマーとし，前記第１の伸長反応鎖が第２の鋳型鎖となる鎖置換型核酸伸長反応により第２の伸長反応鎖を形成する工程４と，
前記オリゴヌクレオチド鎖１側と解離した前記第２の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，前記基板表面に５’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖３にハイブリダイズする工程５と，
前記オリゴヌクレオチド鎖３をプライマーとし，前記第２の伸長反応鎖が第３の鋳型鎖となる鎖置換型核酸伸長反応により第３の伸長反応鎖を形成する工程６と，
前記オリゴヌクレオチド鎖２側と解離した前記第３の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，基板表面に５’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖４にハイブリダイズしてブリッジを形成する工程７と
を有する核酸増幅方法を提供するものである。

更に本発明は，上記核酸検出方法に適した基板を提供するものである。

本発明に係る核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板によれば，検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても，高感度な検出が可能であり，しかも低コスト・短時間での検出が可能である。

本発明において，標的核酸配列とは，検出標的の塩基配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡをいう。本発明の請求項１にかかわる発明によれば，基板表面に複数のオリゴヌクレオチド鎖の一方の末端を固定化して立設し，固定化したオリゴヌクレオチド鎖と相補的な配列を有する標的核酸配列（１本鎖）を結合させる。

ここで，標的核酸配列の情報は，ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ），ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），ＧｅｎＢａｎｋ）等を利用してインターネット等により知ることができる。したがって，標的核酸配列の２箇所の部位において検体固有の核酸配列を探し出し，２つの固有核酸配列を，第１のオリゴヌクレオチド鎖と第２のオリゴヌクレオチド鎖とにそれぞれ割り当てればよい。

本発明において，鋳型鎖またはオリゴヌクレオチド鎖の５’末端側と伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が解離するが，これは４５〜６５℃の伸長反応温度環境下では二本鎖核酸は部分的に解離するためである。

前記オリゴヌクレオチド鎖が５種類以上有り，前記工程７の後に工程４，５，６及び７を複数回繰り返すことによって，オリゴヌクレオチド鎖と標的核酸配列の相補部分を結合させて，架橋構造を形成することを特徴とする前記核酸増幅方法が提供される。基板上に架橋状態の架橋体を形成させることにより微細な網目状空間を作り出し，この網目状空間に発光又は発色物質例えばリガンド又は蛍光物質を例えば物理的な吸着作用で取り込み，リガンドに反応する活性物質で発色又は発光を検出し，あるいは同位元素の放射線を感光フィルム等により記録するようにした。

このように，検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在する場合には，基板上に網目状空間が形成されるようにし，この網目状空間に発色させるため発色関係物質の構成成分であるリガンドを例えば物理的な吸着作用で取り込まれるようにした。その結果，発色関係物質の構成成分でリガンドに反応する活性物質を投入することで，発色形成物質を網目状空間に高濃度に取り込むことができる。これにより，検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても，高感度な検出が可能である。また，架橋構造が形成されていれば伸長反応を必要としないので，検出に要する時間を短時間で行うことができる。更には，蛍光色素のほかに，発色色素を使用することもできるため，高価な検出装置等が必要なくなり，低コストでの検出を行うことができる。

本発明は，前記オリゴヌクレオチド鎖１および前記オリゴヌクレオチド鎖３の配列が同じであり，前記オリゴヌクレオチド鎖２および前記オリゴヌクレオチド鎖４の配列が同じであるものに適用することができる。

本発明は，前記工程７の後に工程４，５，６及び７を複数回繰り返すことを特徴とする前記核酸増幅方法を提供する。この繰り返し工程によってオリゴヌクレオチドと核酸配列の相補部分の結合により，多数の架橋構造を基板上に形成することができる。

本発明によれば，前記核酸伸長反応の基質となるｄＮＴＰに予めリガンド修飾をし，伸長反応産物である前記鋳型鎖および非鋳型鎖にリガンドを取り込み，このリガンドに活性物質を反応させることを特徴とする前記核酸増幅方法が提供される。この方法により，核酸増幅と同時にリガンドを鋳型鎖及び／又は非鋳型鎖に取り込むことができる。このリガンドは，核酸配列の検出のための標識となる。

本発明はまた，前記工程３，５及び７のハイブリダイゼーションにより，前記基板表面に架橋状態の核酸配列構造を形成させることで微細な網目状空間を作り出し，該空間へリガンドを吸着又は侵入効果により取り込み，このリガンドに活性物質を反応させることで検出可能な伸長反応産物を得ることができる。

前記リガンドはビオチン，アビジン，ストレプトアビジン，抗原，抗体，オリゴヌクレオチド，酵素よりなる群から選ばれたいずれかである。また，前記リガンドはビオチン化酵素，アビジン化酵素，ストレプトアビジン化酵素，酵素標識抗体，酵素標識オリゴヌクレオチドよりなる群から選ばれた，いずれかである。前記リガンドに反応する活性物質としては酵素標識レセプター，蛍光物質標識レセプター，基質よりなる群から選ばれたいずれかがある。

本発明は，前記核酸伸長反応の基質となるｄＮＴＰに予め蛍光物質，またはラジオアイソトープを修飾し，伸長反応産物である前記鋳型鎖および非鋳型鎖に蛍光物質，またはラジオアイソトープを取り込み，この蛍光物質，またはラジオアイソトープを活性化させ発光もしくは感光させることで伸長反応産物を検出することを特徴とする核酸検出方法を提供する。

本発明は，前記核酸増幅方法に続いて，発色，発光を検出し，或いは放射線を感光させることを特徴とする核酸検出方法を提供する。本発明は，前記リガンドと前記活性物質を反応させることにより発色もしくは発光信号を得ることを特徴とする核酸配列検出方法を提供する。

本発明により，前記核酸増幅方法によりオリゴヌクレオチド鎖と標的核酸の相補部分を結合させて架橋した網目構造の空間にリガンドを取り込ませ，活性物質を添加して発色又は発光させ，これを検出することを特徴とする核酸検出方法が提供される。

更に，核酸伸長反応の基質となるｄＮＴＰに予めリガンドを修飾し，伸長反応産物である前記鋳型鎖および非鋳型鎖にリガンドを取り込み，請求項６記載の核酸増幅方法によりオリゴヌクレオチド鎖と標的核酸の相補部分を結合させた後，前記リガンドに活性物質を反応させ発色又は発光させ，これを検出することを特徴とする核酸検出方法が提供される。

一対のオリゴヌクレオチド鎖は，熱変性により１本鎖となった標的核酸配列に対してそれぞれ相補的な配列部分を有するように設計されていることから，発色関係物質の構成成分であるリガンドを含む反応系においてハイブリダイゼーション反応を行うことにより，請求項１に示す架橋構造体が多数形成される。そして，この架橋体またはその架橋体によって形成される空間内にリガンドが多数取り込まれることにより，強い発色又は発光シグナルを発生することができ，高感度な検出が可能となる。

本発明において，網目状空間を前述の方法とは異なる形成することができる。即ち，基板表面に５’末端を固定化した第１のオリゴヌクレオチド鎖と標的核酸配列とを相補的に結合させた後，第１のオリゴヌクレオチド鎖がプライマーとなると共に標的核酸配列を鋳型として伸長反応することにより形成され，標的核酸配列と相補的な核酸配列である第１の伸長反応鎖の３’末端核酸配列が解離する。そして，解離した第１の伸長反応鎖の３’末端核酸配列と，基板表面に５’末端を固定化した第２のオリゴヌクレオチド鎖とを相補的に結合させた後，第２のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に第１の伸長反応産物を鋳型として鎖置換活性を有する核酸合成酵素をもちいて伸長反応させることにより第２の伸長反応鎖を形成し，それと同時に第２の伸長反応鎖から第１の鋳型鎖である標的核酸配列を引き剥がす。

これにより，基板上には，鎖置換型伸長反応及び解離反応，によって核酸配列による架橋構造が多数形成され，この多数の架橋構造体が複雑に絡み合うことにより，基板上に網目状空間を形成することができる。

本発明によれば，以下の核酸配列検出用基板が提供される。

（１）基板上に，標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む多数のオリゴヌクレオチド鎖の一方の末端が固定され、リガンドがオリゴヌクレオチドに取り込まれていることを特徴とする核酸配列検出用基板。

（２）基板上に，標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む複数のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端又は３’末端が固定され，オリゴヌクレオチド鎖の伸長反応生産物にリガンドを含有することを特徴とする核酸配列検出用基板。

（３）基板上に，標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む複数のオリゴヌクレオチド鎖の一方の末端が固定され，標的核酸配列もしくはオリゴヌクレオチド鎖の伸長反応生産物が固定化されたオリゴヌクレオチド鎖間を架橋していることを特徴とする核酸配列検出用基板。

（４）オリゴヌクレオチド鎖間の架橋構造体の空間内にリガンドが取り込まれていることを特徴とする核酸配列検出用基板。

本発明は，請求項１の架橋工程，または請求項４の繰返し架橋工程により，架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間を形成する網目状空間形成し，前記網目状空間にリガンドを例えば物理的な吸着作用により取り込む取込み，前記取り込んだリガンドに対して，該リガンドに反応する活性物質を用いて発色させ，前記発色した発色シグナルを検出することにより前記標的核酸配列を検出することを備えたことを特徴とする核酸配列の検出方法を提供する。

本発明の請求項７は，請求項１と同様に，請求項３において，網目状空間にリガンドまたは蛍光物質を取り込み，リガンドと反応する活性物質により発色又は発光させるものである。

このように，検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在する場合には，基板上に網目状空間が形成されるようにし，この網目状空間に発色させるため発色関係物質の構成成分であるリガンドを取り込まれるようにし，このリガンドに対する活性物質を投入することで，発色又は発光形成物質を網目状空間に高濃度に取り込むことができる。これにより，検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても，高感度に検出できる。また，発色シグナル量は伸長反応量に大きく依存しない為，検出に要する時間を短時間で行うことができ，高価な検出装置等が必要なくなるので，低コストでの検出を行うことができる。

本発明の他の態様によれば，以下の工程のいずれかを含む核酸検出方法が提供される
（１）基板表面に５’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖１に標的核酸配列をハイブリダイズさせ，前記オリゴヌクレオチド鎖１をプライマーとし，標的核酸配列が第１の鋳型鎖となる核酸伸長反応により第１の伸長反応鎖を形成し，前記第１の鋳型鎖の５’末端側と解離した第１の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，基板表面に５’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖２にハイブリダイズし第１の架橋構造を形成する工程。

このとき，標的核酸配列は２本鎖でもよく，その場合，標的核酸配列の３’末端側核酸配列が部分的に解離して前記オリゴヌクレオチド鎖１にハイブリダイズし，鎖置換型伸長反応により第１の伸長反応鎖が形成される。
（２）前記オリゴヌクレオチド鎖２をプライマーとし，前記第１の伸長反応鎖が第２の鋳型鎖となる第１の鎖置換型核酸伸長反応により標的核酸配列を第１の伸長反応鎖から引き剥がすのと同時に第２の伸長反応鎖を形成し，前記オリゴヌクレオチド鎖１側と解離した前記第２の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，前記基板表面に５’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖３にハイブリダイズし第２の架橋構造を形成する工程。
（３）前記オリゴヌクレオチド鎖３をプライマーとし，前記第２の伸長反応鎖が第３の鋳型鎖となる第２の鎖置換型核酸伸長反応により第１の伸長反応鎖を第２の伸長反応鎖から引き剥がすのと同時に第３の伸長反応鎖を形成し，前記オリゴヌクレオチド鎖２側と解離した前記第３の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，基板表面に５’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖４にハイブリダイズし第３の架橋構造を形成する工程。
（４）第１，第２と第３の架橋工程と同時に進行する第１，第２の鎖置換型核酸伸長反応により形成された１本鎖伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，オリゴヌクレオチド鎖１，２，３または４にハイブリダイズし第４と第５の架橋構造を形成する工程。
（５）多数の前記オリゴヌクレオチド鎖１，２，３及び４の間で行われる第１，第２，第３，第４及び第５の架橋構造を形成する工程を繰り返す，繰返し架橋工程を含む。

伸長反応後に昇温処理すれば，前記伸長反応鎖と前記鋳型を，鎖置換反応を用いずに解離させることが可能となり，効率的に架橋構造を形成することができる
繰返し架橋工程により基板上には網目状空間を形成することができる。そのため，標的核酸配列の濃度が更に小さい場合でも高感度の検出が可能となる。また，仮に第１のオリゴヌクレオチド鎖が標的核酸配列に結合できなくとも，代わりに第３のオリゴヌクレオチド鎖が結合できれば反応は進行するため，検出感度の安定化を図ることができる。

また，前記繰返し架橋工程後において，設定温度をオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション温度にするハイブリダイゼーション工程を行うことができる。これにより，前記繰返し架橋工程後において，架橋反応できていない伸長反応鎖を基板上に５’末端固定したオリゴヌクレオチド鎖と結合させ，より多くの架橋構造が多数形成され，この多数の架橋構造体が複雑に絡み合うことにより，より高い感度での検出が可能となる。

前記基板表面には親水性ポリマーからなる層と，アミノ基と反応する官能基とを有することが望ましい。また，このような基板表面構成とすることでオリゴヌクレオチド鎖の非特異的結合を抑制する性質と，オリゴヌクレオチド鎖を基板上に強固に固定化することができる。

核酸配列検出基板において，前記基板上にオリゴヌクレオチド鎖がスポットされていることが望ましい。即ち，標的核酸配列を検出するための検体サンプルを，本発明の核酸配列検出基板にスポット（滴下）し，基板と反応させることにより，目視により，検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを高感度で検出することができる。

以下，添付図面を用いて本発明に係る核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板の好ましい実施形態について詳説する。
［第１の実施形態］
図１は，本発明による核酸配列の検出方法の第１の実施形態のメカニズムを概念的に示した概念図である。

図１におけるＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔは，核酸配列を構成する塩基を示し，Ａ：アデニン，Ｃ：シトシン，Ｇ：グアニン，Ｔ：チミンである。

本発明の核酸配列の検出方法の第１の実施の形態は，主として，設計工程と，固定化工程と，架橋工程による網目状空間形成工程と，取込み工程と，発色工程と，検出工程とで構成される。

予め，検体サンプル中の検出標的である標的核酸配列（例えば標的ＤＮＡ）１０を一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４に架橋させるためのオリゴヌクレオチド鎖１２，１４の核酸配列の設計を行う（設計工程）。ここで，架橋される標的核酸配列１０は，熱変性により２本鎖から１本鎖になったものを指す。

即ち，インターネット等によりＤＮＡデータバンクに保管されている情報の中から，検出しようとする標的核酸配列１０の核酸配列を予め調べておき，その核酸配列の２箇所の部位と一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４とがそれぞれ相補的に結合するように一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４の核酸配列を設計する。

図１（Ａ）の左下側のオリゴヌクレオチド鎖１２の核酸配列を基板１６側から３’−ＴＡＧＧＣＡ−５’として，標的核酸配列１０の一方端の配列部分５’−ＡＴＣＣＧＴ−３’と相補性を有するように設計する。また，図１（Ａ）の右下側のオリゴヌクレオチド鎖１４の核酸配列を基板１６側から５’−ＴＣＴＧＴＣ−３’として，標的核酸配列１０の他方端の配列部分３’−ＡＧＡＣＡＧ−５’と相補性を有するように設計する。即ち，標的核酸配列１０の２箇所の部位において相補性を有する核酸配列を，一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４にそれぞれ割り当てる。尚，設計するオリゴヌクレオチド鎖１２，１４の塩基数は，６〜３０の範囲であることが好ましい。

オリゴヌクレオチド鎖１２，１４の設計において，検体サンプル中に含まれる標的核酸配列１０以外の核酸配列（例えば，動物，植物，人等のＤＮＡ）が一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４に結合されないように，標的核酸配列１０固有の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド鎖１２，１４を設計する。

一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４は，核酸配列が同じものでもよく，あるいは異なっていてもよいが，標的核酸配列１０が一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４，標的核酸配列の間で架橋を形成可能なように，それぞれのオリゴヌクレオチド鎖１２，１４に対応する標的核酸配列１０の２箇所の部位が離れていることが必要である。但し，２箇所の部位が標的核酸配列１０の両端に位置することは必須ではない。

次に，図１（Ａ）に示すように，基板１６上に，一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４の５’末端と３’末端のうちの一方の末端を固定化することにより，一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４を基板上に立たせる（固定化工程）。図１（Ａ）では，一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４のみを示したが，基板１６上には一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４が多数組立設される。尚，一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４が多数組とは，オリゴヌクレオチド鎖１２とオリゴヌクレオチド鎖１４とが完全に等量関係にあることを意味するものではない。

上記の如く準備された基板１６上に，標的核酸配列１０を含む検体サンプルをスポット（滴下して投入）して，増幅工程〜架橋工程〜検出工程までを行う。即ち，図１（Ｂ）に示すように，一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４のそれぞれと，標的核酸配列１０の相補的部分が結合し，架橋状態の架橋体１８を形成する。

この架橋工程において，検体サンプルに含まれる標的核酸配列１０以外の核酸配列は，一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４と相補的な関係にはないので，架橋体１８を形成することはない。

この一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４の多数組について架橋工程を行うことにより，基板１６上には，図２に示すように，架橋体１８が多数複雑に絡み合った微細な網目状空間２０を形成する（網目状空間形成工程）。尚，図２では分かり易いように，網目状空間１８を簡素化して図示したが，実際には架橋体１８が複雑に絡み合って密集した網目状空間を形成する。網目状空間が形成されることは，例えば電子顕微鏡で直接的に確認可能である。また，一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４について，標的核酸配列１０と相補性を小さくするように核酸配列を設計することで，発色工程での発色シグナルが小さくなり，オリゴヌクレオチド鎖のどちらか一方を排除すると，発色シグナルが得られないことから，架橋構造の形成を間接的に確認することができる。

この網目状空間２０に，図１（Ｃ）に示すように，発色関係物質の構成成分である多数のリガンド２２を例えば物理的な吸着作用により取り込むことができる（取込み工程）。尚，図１（Ｃ）では分かり易いように，１つの架橋体１８で示してあるが，実際には図２に示したように，多数の架橋体１８が複雑に絡み合った網目状空間２０にリガンド２２が取り込まれる。ここで物理的な吸着作用とは，小さい孔には小さな化学物質が入り込み易いことを利用したもので，特定の化学物質に特定の化学物質が結合し易いのとは異なり，非特異的な作用を意味する。しかし，本発明におけるリガンドの取込作用が，物理的な吸着であるということは断定できる段階にない。

したがって，取り込んだ多数のリガンド２２に対して，該リガンド２２に反応する発色関係物質の構成成分である活性物質（図示せず）を用いて発色させ（発色工程），発色した発色シグナルを検出すれば，高感度の検出を行うことができる。また，発色シグナルの検出は，吸光度装置，イメージスキャナ等の汎用装置を使用することができるだけでなく，発色色素により可視化されることで目視により簡便に検出することができる。

リガンド２２としては，ビオチン，アビジン，抗原，抗体，オリゴヌクレオチド，酵素よりなる群から選ばれた何れかを使用するのが好ましい。更に，リガンドとして，ビオチン化酵素，アビジン化酵素，ストレプトアビジン化酵素，酵素標識体，酵素標識オリゴヌクレオチドよりなる群から選ばれた何れかを使用することができる。また，活性物質としては，酵素標識レセプター，蛍光物質標識レセプター，基質よりなる群から選ばれた何れかを使用するのが好ましい。

発色工程を，リガンドとしてビオチンを用い，リガンドと反応する活性物質としてアルカリフォスファターゼ標識アビジンを用いた例で説明すると，ビオチンはアビジンと反応（ビオチン反応）して，特異的に強固な結合を形成する。したがって，網目状空間２０にビオチンを取り込み，アルカリフォスファターゼ標識アジビンをビオチンに反応させることで，たくさんのアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）がビオチンに結合する。結合割合は，アジビン１に対してビオチン４の割合である。そして，アルカリフォスファターゼは，ＢＣＩＰ／ＮＢＴという基質に反応（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ反応）して青紫色になるので，この色を検出する。

ＢＣＩＰ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸
ＮＢＴ：ニトロブルーテトラゾリウム
したがって，本発明のように網目状空間２０にリガンド２２であるビオチンを多量に取り込むことで，ビオチン反応と，アルカリフォスファターゼに対するＢＣＩＰ／ＮＢＴ反応とが増幅され，強い発色シグナルが形成される。

ビオチンの代わりに，薬用植物ジギタリスから得られる強心配糖体のジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を用いる方法もある。この場合アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体にて免疫反応を行わせる。これをビオチンの場合と同様にＢＣＩＰ／ＮＢＴで青紫色に発色させる。これにより，高感度な検出が可能になる。

本発明の実施の形態において使用される基板１６表面には，親水性ポリマーからなる層及びアミノ基と反応する官能基が存在することが好ましい。親水性ポリマーからなる層は，主としてオリゴヌクレオチド鎖の非特異的結合を抑制する役割を果たし，アミノ基と反応する官能基はオリゴヌクレオチド鎖を化学的に基板上に固定化する役割を果たす。特に，オリゴヌクレオチド鎖は，アミノ基と反応する官能基の部位で共有結合することによって，当該基板１６の表面に強固に固定化される。

本実施の形態で使用する親水性ポリマーとしては，親水性基を主鎖又は側鎖に有する高分子物質が挙げられ，ポリアルキレンオキシド，ポリエチレンオキシド，ポリプロピレンオキシド，ポリアクリルアミド及びこれらの共重合体のいずれかを構造中に含むものであることが好ましい。特にポリアクリルアミドを光架橋性化合物等で３次元架橋した網目構造を有するポリアクリルアミドゲルが好ましい。

また，本実施の形態に使用するアミノ基と反応する官能基としては，アルデヒド基，活性エステル基等が挙げられるが，活性エステル基が好ましい。活性エステル基は，カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり，Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。活性化されたカルボン酸誘導体としては，例えば，カルボン酸であるアクリル酸，メタクリル酸，クロトン酸，マレイン酸，フマル酸などのカルボキシル基が，酸無水物，酸ハロゲン化物，活性エステル，活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。

活性エステル基としては，例えばｐ−ニトロフェニルエステル基，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基，コハク酸イミドエステル基，フタル酸イミドエステル基，５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル基，等が好ましく，ｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基がより好ましい。

アミノ基と反応する官能基は，基板表面に直接導入されていても良いし，親水性ポリマー構造の主鎖又は側鎖に有していても良い。
（第１の実施形態の検出方法を行う操作手順）
次に，図３のフローチャートにより，第１の実施形態の検出方法を行う操作手順のフローを説明する。尚，基板１６は，基板表面に，親水性ポリマーからなる層，及びアミノ基と反応する官能基が存在する場合で説明する。

Ｓ１では，上記したように，一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４の間に標的核酸配列１０が架橋するように，標的核酸配列１０の２箇所の部位に対して，それぞれ相補的な関係を有する一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４を設計する。

次に，Ｓ２において，基板１６上に一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４を固定化する。固定化する方法としては，基板１６上の表面に存在する，又は親水性ポリマーに含まれるアミノ基と反応する官能基のうち，少なくとも一部のアミノ基と反応する官能基とオリゴヌクレオチド鎖１２，１４とを反応させて共有結合を形成させることにより，基板１６表面でオリゴヌクレオチド鎖１２，１４を固定化する。

続いて，オリゴヌクレオチド鎖１２，１４を固定化した以外の基板１６表面のアミノ基と反応する官能基を不活性化する。即ち，残りのアミノ基と反応する官能基を不活性化することにより，オリゴヌクレオチド鎖１２，１４を基板１６の表面に固定することができる。基板１６表面に固定化されなかったオリゴヌクレオチド鎖１２，１４を除去するため，純水や緩衝液で洗浄してもよい。洗浄後はオリゴヌクレオチド鎖１２，１４を固定化した以外の基板１６表面のアミノ基と反応する官能基の不活性化処理をアルカリ化合物，あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。

Ｓ３では，標的核酸配列１０を含む検体サンプルと発色関係物質の構成成分であるリガンド２２（例えばビオチン）とを混合した混合液を調製する。

次に，Ｓ４では，標的核酸配列が一本鎖か，二本鎖かが判断され，ＮＯであれば，Ｓ５において，検体サンプルを投入した反応系の温度を，標的核酸配列１０の融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：Ｔｍ）以上，例えば９０〜９５℃に上昇させる。加熱時間は１〜１０分程度が好ましい。これにより，２本鎖の標的核酸配列１０を解離して１本鎖の標的核酸配列１０にする。また，一本鎖であっても，複雑な二次構造等を形成している場合は，熱変性処理を行う。ＹＥＳであれば，Ｓ６へ進む。

Ｓ６では，基板１６及び検体サンプルとリガンドの混合液をハイブリダイゼーション温度に調節して，混合液を基板へ投入（滴下）する。ハイブリダイゼーション温度は，オリゴヌクレオチド鎖１２，１４の融解温度（Ｔｍ）よりも２〜８℃低い値が好ましい。

Ｓ７では，オリゴヌクレオチド鎖１２，１４の融解温度（Ｔｍ）よりも２〜８℃低い温度でハイブリダイゼーション反応を行う。反応時間としては，６０分以上であることが好ましい。これにより，上記の如く設計された一対のオリゴヌクレオチド鎖１２，１４と，標的核酸配列１０の相補的部分（２箇所）とがそれぞれ相補的に結合し，架橋状態の架橋体１８を形成する。かかる架橋体１８が多数形成され，複雑に絡み合うことで網目状空間２０が形成される。そして，この網目状空間２０に投入したリガンド２２が物理的な吸着作用で取り込まれることにより，多数のリガンド２２を取り込むことができる。

次に，Ｓ８では，基板１６反応液を捨てて，基板１６を洗浄液，例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄する。

次に，Ｓ９では，活性物質（例えばアルカリフォスファターゼ標識アビジン）を基板１６上に投入して，網目状空間２０に取り込まれたリガンド２２との反応により結合させる。反応温度及び反応時間としては，反応温度が２０〜４０℃の範囲が好ましく，反応時間が５〜６０分の範囲が好ましい。

次のＳ１０では，前記したＳ９の反応を更に続けるか否かが判断され，反応が十分であり，ＮＯであれば次のＳ１１に進み，反応が未だ不十分であり，ＹＥＳであればＳ８に戻り，洗浄工程を経て，Ｓ９で，活性物質（例えばＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を基板１６上に投入して，網目状空間２０に取り込まれたリガンド２２と反応した活性物質に，更に反応させる。反応温度及び反応時間としては，反応温度が２０〜４０の範囲が好ましく，反応時間が５〜６０の範囲が好ましい。

Ｓ１１では，再び基板１６の洗浄を行い，Ｓ１２で発色シグナルの検出を行う。例えば，リガンド２２としてビオチンを用い，活性物質としてアルカリフォスファターゼ標識アビジン用いた場合には，ＢＣＩＰ／ＮＢＴ試薬中に基板１６を浸漬して青紫色のスポットを発色させる。発色させた発色シグナルは，目視で検出してもよく，あるいは発色画像をイメージスキャナでパソコンに取り込んで解析してもよく，更には吸光度測定装置で発色度合いを測定してもよい。

このように，検体サンプル中に標的核酸配列１０が存在する場合には，網目状空間２０が形成され，網目状空間２０に発色関係物質に構成成分であるリガンド２２が多数保持されることになるので，強い発色シグナルを発色することが可能になる。これにより，検体サンプル中に標的核酸配列１０が存在する場合には，高感度な検出が可能となる。
［第２の実施形態］
図４aＡ，図４bは，本発明による核酸配列の検出方法に関する第２の実施形態のメカニズムを概念的に示した図であり，図５に示す網目状空間２０を第１の実施の形態とは別の方法で形成する。尚，第１の実施の形態と同じものについては同符号を付して説明する。

本発明による核酸配列の検出方法に関する第２の実施形態は，主として，固定化工程と，第１の伸長反応工程と，第１の解離工程と，第１の架橋工程と，第２の伸長反応工程と，第２の解離工程と，第２の架橋工程と，繰返し架橋工程と，ハイブリダイゼーション工程と，網目状空間形成工程と，取込み工程と，発色工程と，検出工程とで構成される。

予め，標的核酸配列１９と，第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と，第２のオリゴヌクレオチド鎖２６との各核酸配列の関係において，伸長反応により産出された伸長反応産物２８，３６が架橋構造を形成するように，第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６の核酸配列を設計する（設計工程）。即ち，標的核酸配列１９と第１のオリゴヌクレオチド鎖２４とが相補的に結合した後に，第１のオリゴヌクレオチド鎖２４をプライマーとすると共に標的核酸配列１９を鋳型として第１の伸長反応をさせて形成される第１の伸長反応鎖３０が標的核酸配列１９から解離して，相補的な核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖２６と結合できるように，第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６を設計する。標的核酸配列１９の核酸配列については，第１の実施の形態と同様にＤＮＡデータバンクから情報を得ることができる。

図４a（Ａ）の左下側の第１のオリゴヌクレオチド鎖２４の核酸配列を基板１６側から５’−ＴＡＧＧＣＡ−３’として，標的核酸配列１９の片端の配列部分３’−ＡＴＣＣＧＴ−５’と相補性を有するように設計する。また，図４a（Ａ）の右下側の第２のオリゴヌクレオチド鎖２６の核酸配列を基板１６側から５’−ＡＧＡＣＡＧ−３’として，第１の伸長反応産物２８の片端の配列部分３’−ＵＣＵＧＵＣ−５’と相補性を有するように設計する。尚，伸長反応に使用された塩基Ｕ（ウラシル）にはビオチンが付けられた場合を示してある。ビオチン非標識時は塩基Ｔを使用する。Ｕは本来ＲＮＡを構成する塩基であるが，ビオチンを標識することで化学構造的にＴに近くなる為，ＤＮＡポリメラーゼでの伸長反応が可能となる。

次に，図４a（Ａ）に示すように，基板１６上に，第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６の５’末端を固定化することにより，一対のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６を基板上に立たせる（固定化工程）。この場合，オリゴヌクレオチド鎖が相互に接触しない程度に離して固定することが望ましい。あまりオリゴヌクレオチド鎖が接近すると，形成されるブリッジ（架橋構造体）の空間が狭すぎることが懸念されるからである。

図４a（Ａ）では，第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６をそれぞれ１本ずつのみを示したが，基板１６上には第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６が多数立設される。

上記の如く準備された基板１６上に，標的核酸配列１９を含む検体サンプルをスポット（滴下により投入）し，第１の伸長反応工程〜検出工程までを行う。即ち，第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と，熱変性により解離した１本鎖の標的核酸配列１９の相補的部分が結合した後，標的核酸配列１９を鋳型とし，第１のオリゴヌクレオチド鎖２４をプライマーとして伸長反応を行うと，従来のＭＰＥＸ法と同様に図４a（Ｂ）のような二本鎖核酸配列が形成される（第１の伸長反応工程）。しかし，伸長反応を第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６のＴｍ温度領域で行った場合，伸長反応産物２８のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６と相補的な領域は，常に一本鎖に解離する可能性があり，また，基板１６上には，伸長反応産物２８と相補的に結合するよう予め設計された第２のオリゴヌクレオチド２６が固定化されているため，伸長反応産物２８の一部は，標的核酸配列１９と解離した後に（第１の解離工程），第２のオリゴヌクレオチド鎖２６と結合し，架橋状態を形成する（第１の架橋工程）。

即ち，第１の伸長反応により伸長する第１の伸長反応産物２８のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６と相補的な領域は，Ｔｍ温度領域という不安定なエネルギー状態において，分子構造的に安定した状態を目指すため，相補的な配列を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖２６と結合することとなる。尚，検体サンプルに含まれる標的核酸配列１９以外の核酸配列のものは，第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と相補的な関係にはないので，第１のオリゴヌクレオチド鎖２４に結合して伸長反応を行うことはない。

図４a，図４bに示した「ブリッジング」とは，２つ以上の一端が固定化されたオリゴヌクレオチド間を標的核酸配列が架橋することを意味する。そうした意味で，図に示した第１の実施形態のように一対のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６に標的核酸配列１０が架橋することもブリッジングである。以上のようにして図５に示す架橋網目構造が形成される。図５の構造は図２に示したものとほぼ同じである。

第１の伸長反応の際，使用する酵素には，ＤＮＡポリメラーゼ，ＲＮＡポリメラーゼ又は双方を混合したものが含まれる。

次に，第２のオリゴヌクレオチド鎖２６をプライマーとすると共に第１の伸長反応産物２８を鋳型として図４b（Ｄ）に示すような伸長反応が起こる（第２の伸長反応工程）。尚，図４b（Ｄ）では，図を簡素化するために，標的核酸配列１９は図示していないが，このとき標的核酸配列１９は第１のオリゴヌクレオチド鎖２４から解離し，別の第１のオリゴヌクレオチド鎖と結合する。

第２以降の伸長反応の際，酵素は鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用する。この時，ＤＮＡポリメラーゼはｐｏｌＩ型のもの（例えば，Ｔａｑ（タカラバイオ製）），耐熱性α型のもの（例えば，ＫＯＤ（ＴＯＹＯＢＯ製））でも可能であるが，鎖置換活性を有するものを使用することがより好ましい。鎖置換活性を有することにより，鋳型ＤＮＡもしくはｃＤＮＡに二本鎖を形成している箇所が存在しても，水素結合を切断しながら伸長反応を進めることが容易となる。鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては，Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント），Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ，大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント，Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの），ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）およびＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ，好ましくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。反応温度は前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６のＴｍ値以上，６７℃未満が好ましく，反応時間は２０〜９０分が好ましい。

前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６は多数を基板１６上に固定化している。そこで，第２の伸長反応工程で伸長した第２の伸長反応産物３６が，第１の伸長反応産物２８から解離し（第２の解離工程），前記第１のオリゴヌクレオチド鎖２４とは別であり，かつ，同じ核酸配列の第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と結合し，架橋状態を形成する（第２の架橋工程）。この状態から，第１のオリゴヌクレオチド鎖２４がプライマーとなるため，第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６，の間で第１と第２の架橋工程が繰り返されることとなる（繰返し架橋工程）。その後，設定温度をオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション温度にすることで（ハイブリダイゼーション工程），基板１６上に，より多くの架橋構造体を形成させることとなる。ハイブリダイゼーション温度は，オリゴヌクレオチド鎖２４，２６の融解温度（Ｔｍ）よりも２〜８℃低い温度が好ましい。これにより，架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間２０が形成され（網目状空間形成工程），第１の実施の形態と同様に，網目状空間２０に取り込んだ多数のリガンド２２に対して（取込み工程），該リガンド２２に反応する活性物質を用いて発色させ（発色工程），発色した発色シグナルを検出すれば，高感度の検出を行うことができる。

（第２の実施形態における検出方法を行う操作手順）
次に，図６のフローチャートにより，第２の実施の形態の検出方法を行う操作手順のフローを説明する。尚，基板１６は，基板表面に，親水性ポリマーからなる層，及びアミノ基と反応する官能基が存在する場合で説明する。

Ｓ１では，上記したように，標的核酸配列１９と，第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と，第２のオリゴヌクレオチド鎖２６との各核酸配列の関係において，伸長反応により産出された第１の伸長反応産物２８，３６が架橋構造を形成するように，第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６の核酸配列を設計する。
Ｓ２では，基板１６上に，設計した第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６を固定化する。固定化する方法としては第１の実施の形態で説明したので省略する。

Ｓ３では，標的核酸配列１９を含む検体サンプルと，発色関係物質の構成成分であるリガンド２２（例えばビオチン標識ｄＵＴＰ）とを混合した混合液を調製する。

次に，Ｓ４では，標的核酸配列が一本鎖か，二本鎖かが判断され，ＮＯであれば，Ｓ５において，検体サンプルを投入した反応系の温度を，標的核酸配列１０の融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：Ｔｍ）以上，例えば９０〜９５℃に上昇させる。加熱時間は１〜１０分程度が好ましい。これにより，２本鎖の標的核酸配列１０を解離して１本鎖の標的核酸配列１０にする。また，一本鎖であっても，複雑な二次構造等を形成している場合は，熱変性処理を行う。ＹＥＳであれば，Ｓ６へ進む。Ｓ６では，基板１６及び検体サンプルとリガンドの混合液を基板へ投入（滴下）する。

次に，Ｓ７では，第１の伸長反応工程と，第１の解離工程と，第１の架橋工程と，第２の伸長反応工程と，第２の解離工程と，第２の架橋工程と，繰返し架橋工程と，ハイブリダイゼーション工程と，網目状空間形成工程と，取込み工程と，を実施する。即ち，第１の伸長反応工程において，標的核酸配列１９を鋳型とし，第１のオリゴヌクレオチド鎖２４をプライマーとして伸長反応を行い，第１の解離工程において，伸長反応産物２８を，標的核酸配列１９と解離させ，第１の架橋工程において，第２のオリゴヌクレオチド鎖２６と結合させ，架橋状態を形成させる。

次に，第２の伸長反応工程において，第２のオリゴヌクレオチド鎖２６をプライマーとすると共に第１の伸長反応産物２８を鋳型として伸長反応させ，第２の解離工程において，第２の伸長反応工程で伸長した第２の伸長反応産物３６を，第１の伸長反応産物２８から解離させ，第２の架橋工程において，前記第１のオリゴヌクレオチド鎖２４とは別であり，かつ，同じ核酸配列の第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と結合させ，架橋状態を形成させる。その後，繰返し架橋工程において，第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６，の間で第１と第２の架橋工程を繰り返させ，その後，ハイブリダイゼーション工程において，設定温度をオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション温度にし，基板１６上に，より多くの架橋構造体を形成させる。これにより，基板１６上に架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間２０が形成される（網目状空間形成工程）。

網目状空間２０が形成された後は，第１の実施の形態と同様に，Ｓ８〜Ｓ１２を実施することで，標的核酸配列１９を高感度に検出することができる。

なお，Ｓ３において，標的核酸配列１０とリンガド２２の混合液を調製したが，リガンド２２はＳ６とＳ７との間で投入してもよい。

［第３の実施形態］
上記説明した本発明の第２の実施形態では，第１及び第２の，２種類のオリゴヌクレオチド鎖２４，２６を用いることで説明したが，３種類以上のオリゴヌクレオチド鎖を使用することもできる。

例えば，３種類のオリゴヌクレオチド鎖の例で説明すると，第２の実施形態における第２の解離工程で解離した第２の伸長反応産物３６が，該第２の伸長反応産物３６と相補的な核酸配列を有するように設計された第３のオリゴヌクレオチド鎖に結合する。結合した後は，同様に伸長反応させ，伸長反応産物を解離し，第１のオリゴヌクレオチド鎖に結合し，基板１６上に，架橋構造を形成する。これら第１から第３の繰返し架橋工程を経て微細な網目状空間を形成させる。

したがって，次々に解離される伸長反応産物と相補的な関係のオリゴヌクレオチド鎖を予め設計することで３種類以上のオリゴヌクレオチド鎖についても本発明の第２の実施形態を適用することができる。これが第３の実施形態である。

第３の実施形態において，基板１６表面には，親水性ポリマーからなる層，及びアミノ基と反応する官能基が存在することが好ましい。これにより，伸長反応による２本鎖の伸長反応鎖が熱変性処理により解離し，解離した伸長反応産物が別のオリゴヌクレオチド鎖と結合して再び伸長反応する。

以下において，本発明の実施例により本発明を詳細に説明する。

［実施例１］
［核酸配列検出基板］
上述した第１及び第２の実施形態において，オリゴヌクレオチド鎖を基板に固定化した核酸配列検出基板を製作し，この核酸配列検出基板に，例えば標的核酸配列を含む検体サンプルをスポット（投入）するだけで，検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを高感度で検出することができる。

次に，本発明による第１の実施形態による検出方法の実施例を説明する。標的核酸配列としては，ノロウイスル固有の核酸配列を用い，この標的核酸配列を検出する例で説明する。

即ち，以下の手法により，標的核酸配列に対して相補的な一対のオリゴヌクレオチド鎖をプラスチック基板表面に固定化することで，検体サンプルとして標的核酸配列を投入した際に，基板上の一対のオリゴヌクレオチド鎖と結合し架橋状態の核酸配列構造を形成させ，その構造下に微細な網目状空間を作り出した。そして，その網目状空間に発色関係物質の構成成分であるリガンドを物理的な吸着作用で多量に取り込むことができ，これによって，標的核酸配列を高感度に検出した。

即ち，標的核酸配列を，ノロウイルスｃＤＮＡのＰＣＲ産物として実験を行った。このＰＣＲ産物は，ノロウイルスの構造蛋白質であるカプシド蛋白質をコードしている領域ＯＲＦ２を対象とした。また，ノロウイルスはＧ１とＧ２の２つのグループに分けられるため，ＰＣＲ産物は，Ｇ１とＧ２の２種類を準備して実験を行った。

（標的核酸配列の調整）
糞便をリン酸緩衝液に溶解し，１０％乳剤を作製し，１２，０００ｒｐｍで冷却遠心後，遠心上清からＲＮＡの抽出を行った。遠心上清を室温に戻し，ＲＮＡ抽出精製キット（ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ））を用いＲＮＡ抽出精製した。その後，ＲＮＡ抽出液２４μＬに対し５倍濃縮したＲＴ−ＰＣＲ用Ｂｕｆｆｅｒ３μＬ，滅菌水１μＬ，ＤＮａｓｅ（１Ｕ／μＬ）２μＬ（ＤＮａｓｅ Ｉ（タカラバイオ製））を加え，３７℃−３０分，７５℃−５分を経て氷冷した。

得られたＲＮＡをランダムプライマー（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ Ｈｅｘａｍｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ製））とＲＴ反応キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｒｎａｓｅ Ｈ− Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製））を用いｃＤＮＡへ逆転写し（４２℃−１時間（１サイクル），９９℃−５分（１サイクル），４℃），そのｃＤＮＡを鋳型として，プライマー１（２５μＭ）とプライマー２（２５μＭ），プライマー３（２５μＭ），プライマー４（２５μＭ）と，ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ製））とを用いたＰＣＲ反応（９４℃−３分（１サイクル），９４℃−１分，５０℃−１分，７２℃−２分（４０サイクル），７２℃−１５分（１サイクル））によりＧ１のＰＣＲ産物，Ｇ２のＰＣＲ産物をそれぞれ準備し，電気泳動で増幅を確認し精製後，標的核酸配列として実験に用いた。

（使用したプラスチック基板）
プライマーを固定する基板といては種々の材料が知られており，プラスチック，金属，シリコン，ガラスなどがあるが，以下においてはプラスチック基板を用いた例を説明する。

市販のＤＮＡアレイプラスチック基板（住友ベークライト製Ｓ−ＢＩＯ（登録商標）ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標））を実験に用いた。この基板は，実施の形態で述べた親水性ポリマーからなる層，及びアミノ基と反応する官能基を表面に有するプラスチック製の基板である。図７（Ａ）〜（Ｃ）に示すように，横４（１〜４）×縦６（Ａ〜Ｆ）の合計２４箇所のスポット領域があり，各スポット領域で，各核酸配列の有無を評価した。本実験では，Ｇ１のＰＣＲ産物検出用スポット領域を１２箇所，Ｇ２のＰＣＲ産物検出用スポット領域を１２箇所のプラスチック基板を作製して使用した。

（オリゴヌクレオチド鎖の固定）
Ｇ１のＰＣＲ産物検出のため，下記に示す核酸配列で構成された一対のオリゴヌクレオチド鎖１及びオリゴヌクレオチド鎖２を合成した。それぞれのオリゴヌクレオチド鎖１，２は，Ｇ１のＰＣＲ産物と相補的な配列となるようにした。オリゴヌクレオチド鎖１は，５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり，これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）で溶解し，１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。

一方，オリゴヌクレオチド鎖２は，３’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり，これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）で溶解し，１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。

そして，オリゴヌクレオチド鎖１の溶液と，オリゴヌクレオチド鎖２の溶液とを混合し，スポッタ（日立ソフトウェア−エンジニアリング製Ｍａｒｋｓ−Ｉ）を用い，１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。即ち，図７（Ｃ）に示すプラスチック基板の横１〜４×縦Ａ〜Ｃで区画される１２個のスポット領域にスポットした（スポット領域１〜１２）。そして，オリゴヌクレオチド鎖をスポットした各基板を，８０℃で１時間加熱して，各オリゴヌクレオチド鎖を固定化させた。

また，Ｇ２のＰＣＲ産物検出のため，下記に示す核酸配列のオリゴヌクレオチド鎖３及びオリゴヌクレオチド鎖４を合成した。それぞれのオリゴヌクレオチド鎖３，４は，Ｇ２のＰＣＲ産物と相補的な配列となるようにした。オリゴヌクレオチド鎖３は，５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり，これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）で溶解し，１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。

一方，オリゴヌクレオチド鎖４は，３’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２３塩基鎖）であり，これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）で溶解し，１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。

そして，オリゴヌクレオチド鎖３の溶液と，オリゴヌクレオチド鎖４の溶液とを混合し，スポッタ（日立ソフトウェア−エンジニアリング製Ｍａｒｋｓ−Ｉ）を用い，１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。即ち，図７（Ｂ）に示すプラスチック基板の横１〜４×縦Ｄ〜Ｆで区画される１２個のスポット領域にスポットした（スポット領域１３〜２４）。そして，オリゴヌクレオチド鎖をスポットした各基板を，８０℃で１時間加熱して，各オリゴヌクレオチド鎖を固定化させた。

上記したＧ１及びＧ２のＰＣＲ産物を調製したときのプライマー１〜４の核酸配列，及びプラスチック基板に固定化したオリゴヌクレオチド鎖１〜４の核酸配列は次のとおりである。
・プライマー１（ＣＯＧ１Ｆ）：５’−ＣＧＹＴＧＧＡＴＧＣＧＮＴＴＹＣＡＴＧＡ−３’
・プライマー２（Ｇ１−ＳＫＲ）：５’−ＣＣＡＡＣＣＣＡＲＣＣＡＴＴＲＴＡＣＡ−３’
・プライマー３（ＣＯＧ２Ｆ）：５’−ＣＡＲＧＡＲＢＣＮＡＴＧＴＴＹＡＧＲＴＧＧＡＴＧＡＧ−３’
・プライマー４（Ｇ２−ＳＫＲ）：５’−ＣＣＲＣＣＮＧＣＡＴＲＨＣＣＲＴＴＲＴＡＣＡＴ−３’
・オリゴヌクレオチド鎖１（Ｇ１ＳＫＦ）：５’−ＣＴＧＣＣＣＧＡＡＴＴＹＧＴＡＡＡＴＧＡ−３’
・オリゴヌクレオチド鎖２（Ｇ１−１’）：５’−ＣＣＡＡＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＣ−３’
・オリゴヌクレオチド鎖３（ＲＩＮＧ２ＡＬ−ＴＰ）：５’−ＴＧＧＧＡＧＧＧＳＧＡＴＣＧＣＲＡＴＣＴ−３’
・オリゴヌクレオチド鎖４（Ｇ２ＳＫＲｒｃ）５’−ＡＴＧＴＡＹＡＡＹＧＧＤＹＡＴＧＣＮＧＧＹＧＧ−３’
上記核酸配列において，ＡＧＣＴ以外の記号はＩＵＢ Ｃｏｄｅｓ（Ｃｏｄｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に従い，Ｒ＝Ａ ｏｒ Ｇ；Ｂ＝Ｃ，Ｇ ｏｒ Ｔ；Ｙ＝Ｃ ｏｒ Ｔ；Ｄ＝Ａ，Ｇ ｏｒ Ｔ；Ｋ＝Ｇ ｏｒ Ｔ；Ｈ＝Ａ，Ｃ ｏｒ Ｔ；Ｍ＝Ａ ｏｒ Ｃ；Ｖ＝Ａ，Ｃ ｏｒ Ｇ；Ｓ＝Ｇ ｏｒ Ｃ；Ｗ＝Ａ ｏｒ Ｔ；Ｎ＝ａｎｙ ｂａｓｅである。

（ハイブリダイゼーション）
上記の如く一対のオリゴヌクレオチド鎖（オリゴヌクレオチド鎖１とオリゴヌクレオチド鎖２の一対，オリゴヌクレオチド鎖３とオリゴヌクレオチド鎖４の一対）を固定化したプラスチック基板に，準備した標的核酸配列を５９μｍと，ハイブリバッファを１３μＬと，８μＬのビオチンを混合した混合液を投入した。

尚，図７（Ａ）の基板は，上記の如く各オリゴヌクレオチド鎖を固定化した基板に，標的核酸配列を含まない検体サンプルを投入した場合である。

そして，基板上の反応系を９５℃，８分間の加熱条件で加熱することにより，標的核酸配列の２本鎖を熱変性して解離させて１本鎖にし，更に反応系を５４℃に保ち，９０分間ハイブリダイズさせた。

次に，洗浄後，０．０１ｍｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識ストレフトアビジンを基板上へ投入し，カバーガラスで覆い，反応系を３７℃で３０分反応させた。その後，洗浄を行い，ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＫＰＬ））発色試薬中に基板を浸漬し，３７℃で３０分間反応させて洗浄し，青紫色のスポットを発色させた。発色画像はイメージスキャナ（キヤノン製，ＰＩＸＵＳ ＭＰ４７０）でパソコンへ取り込み，画像解析ソフト（住友ベークライト製，誰でもＤＮＡアレイ解析ソフト）で発色強度を数値化した。発色画像を図７に示す。また，数値化結果の平均Ｓ／Ｎ比（Ｓｉｇｎａｌ ｔｏ Ｎｏｉｓｅ Ｒａｔｉｏ）を式１から求め，図８の表１に示す。

Ｓ／Ｎ比 ＝ Ｓ／（Ｓ＋Ｎ） ・・・・式１
Ｓ／Ｎ：非測定時に対する測定時の発色強度の比率；最大値１．０
Ｓ：測定時の発色シグナル強度
Ｎ：非測定時の発色ノイズ強度
その結果，Ｇ１のＰＣＲ産物を標的核酸配列とした場合，図７（Ｃ）から分かるように，スポット領域１〜１２のみが発色した。一方，Ｇ２のＰＣＲ産物を標的核酸配列とした場合，図７（Ｂ）から分かるように，スポット領域１３〜２４のみが発色した。

比較対象としてＰＣＲ産物（標的核酸配列）を加えなかった場合は，図７（Ａ）から分かるように，オリゴヌクレオチド鎖１，２を固定化した場合，及びオリゴヌクレオチド鎖３，４を固定化した場合のいずれについても発色が得られなかった。

尚，図示しなかったが，ＤＮＡアレイプラスチック基板のオリゴヌクレオチド鎖の固定において，Ｇ１のＰＣＲ産物検出の為のスポットがオリゴヌクレオチド鎖１のみ（スポット領域１〜６），オリゴヌクレオチド鎖２のみ（スポット領域７〜１２），Ｇ２のＰＣＲ産物検出の為のスポットがオリゴヌクレオチド鎖３のみ（スポット領域１３〜１８），オリゴヌクレオチド鎖４のみ（スポット領域１９〜２４）のものを１８枚作製した。そして，Ｇ１のＰＣＲ産物，Ｇ２のＰＣＲ産物をそれぞれ６枚ずつ前記方法でハイブリダイズさせ，同時にビオチンを投入し，洗浄後，アルカリフォスファターゼ標識アビジンを基板上へ投入し，カバーガラスで覆い３７℃で３０分放置した後，洗浄を行い，ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色試薬中に基板を浸漬し，３７℃で３０分間反応させ洗浄し，青紫色のスポットを発色させた。

発色画像はイメージスキャナ（キヤノン製，ＰＩＸＵＳ ＭＰ４７０）でパソコンへ取り込み，画像解析ソフト（住友ベークライト製，誰でもＤＮＡアレイ解析ソフト）で発色強度を数値化した。

その結果，スポット領域１〜２４のいずれにおいても発色は確認されず，比較対象としてＰＣＲ産物を加えなかった６枚のＤＮＡアレイプラスチック基板においても，発色が得られなかった。

また，図８の表１から分かるように，図７（Ｃ）のスポット１〜１２に示したＧ１のＰＣＲ産物の発色シグナル強度（Ｓ）の平均値と，図７（Ａ）での発色ノイズ強度（Ｎ）の平均値との，Ｓ／Ｎ比は０．９７と極めて高感度な検出を行うことができた。

同様に，図７（Ｂ）のスポット１３〜２４に示したＧ２のＰＣＲ産物の発色シグナル（Ｓ）の平均値と，図７（Ａ）での発色ノイズ（Ｎ）の平均値とのＳ／Ｎ比は０．９８と極めて高感度な検出を行うことができた。
［実施例２］
次に，本発明における第２の実施形態の検出方法による実施例を説明する。標的核酸配列としては，実施例１と同様に，ノロウイスル固有の核酸配列を標的核酸配列として検出する例で説明する。

即ち，以下の手法により基板表面に５’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖１に標的核酸配列をハイブリダイズさせ，前記オリゴヌクレオチド鎖１をプライマーとし，標的核酸配列が第１の鋳型鎖となる核酸伸長反応により第１の伸長反応鎖を形成し，前記第１の鋳型鎖の５’末端側と解離した第１の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，基板表面に５’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖２にハイブリダイズし第１の架橋構造を形成する。

そして，オリゴヌクレオチド鎖２をプライマーとし，第１の伸長反応鎖が第２の鋳型鎖となる第２の伸長反応鎖を形成し，前記オリゴヌクレオチド鎖１側と解離した前記第２の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，前記オリゴヌクレオチド鎖１とは異なるが同じ配列のオリゴヌクレオチド鎖１−１（前記基板表面に５’末端を固定化）にハイブリダイズし第２の架橋構造を形成する。そして，このオリゴヌクレオチド鎖１−１をプライマーとし，前記第２の伸長反応鎖が第３の鋳型鎖となる第３の伸長反応鎖を形成し，前記オリゴヌクレオチド鎖２側と解離した前記第３の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，前記オリゴヌクレオチド鎖２とは異なるが同じ配列のオリゴヌクレオチド鎖２−１（前記基板表面に５’末端を固定化）にハイブリダイズし第３の架橋構造を形成する。これを繰り返すことで基板上に微細な網目状空間を作り出し，該網目状空間にリガンドを物理的な吸着効果により取り込み，リガンドに反応する活性物質を用いることで，標的核酸配列を検出した。

（標的核酸配列の調整）
実施例１の調製方法で調整したノロウイルスｃＤＮＡのＧ１のＰＣＲ産物，Ｇ２のＰＣＲ産物をそれぞれ準備し精製後，１０^０，１０^１，１０^２，１０^４，１０^６，１０^８ｃｏｐｉｅｓ／μＬとなるよう濃度調整し，標的核酸配列として実験に用いた。

（プラスチック基板）
実施例１で示した市販のプラスチック基板のＭＰＥＸ法対応基板を使用し，基板表面へ各種オリゴヌクレオチド鎖の一端を固定化し，実験に用いた。

（比較評価）
実施例２における検出の比較対照として，実施例１での検出を同様に行った。また，バックグラウンドとしては，滅菌水を添加したもので実施した。
（オリゴヌクレオチド鎖の固定）
実施例２では，Ｇ１のＰＣＲ産物検出の為，下記に示すオリゴヌクレオチド鎖５及びオリゴヌクレオチド鎖６を合成した。オリゴヌクレオチド鎖５は，Ｇ１のＰＣＲ産物と相補的な配列となるようにした。また，オリゴヌクレオチド鎖５は，５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり，これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し，１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。

一方，オリゴヌクレオチド鎖６も５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（１９塩基鎖）であり，これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し，１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。

また，Ｇ２のＰＣＲ産物検出の為，オリゴヌクレオチド鎖７及びオリゴヌクレオチド鎖８を合成した。オリゴヌクレオチド鎖７は，Ｇ２のＰＣＲ産物と相補的な配列となるようにした。また，オリゴヌクレオチド鎖７は，５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２６塩基鎖）であり，これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し，１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。

一方，オリゴヌクレオチド鎖８も５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり，これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し，１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。

そして，実施例２では，前記のオリゴヌクレオチド鎖５とオリゴヌクレオチド鎖６の溶液を混合し，スポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Ｍａｒｋｓ−Ｉ）を用い１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした（スポット領域１〜８）。同様に前記のオリゴヌクレオチド鎖５とオリゴヌクレオチド鎖６の溶液を混合し，プラスチック基板の表面上にスポットした（スポット領域９〜１６）。スポット領域１７〜２４には０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）をスポットした。上記の基板を基板２とした。基板の配置図は示さないが，図７と同様である。

一方，比較対照である実施例１も同様に，オリゴヌクレオチド鎖１と２の混合液をプラスチック基板の表面上にスポットし（スポット領域１〜８），オリゴヌクレオチド３と４の混合液もプラスチック基板の表面上にスポットした（スポット領域９〜１６）。スポット領域１７〜２４には０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）をスポットした。上記の基板を基板１とした。

そして，基板２と基板１のそれぞれを，８０℃で１時間加熱して，各オリゴヌクレオチド鎖を固定化させた。

上記したプラスチック基板に固定化したオリゴヌクレオチド鎖５〜８の核酸配列は次のとおりである。
・オリゴヌクレオチド鎖５（ＲＩＮＧ１−ＴＰ（ａ））：５’−ＡＧＡＴＹＧＣＧＡＴＣＹＣＣＴＧＴＣＣＡ−３’
・オリゴヌクレオチド鎖６（Ｇ１ＳＫＲ）：５’−ＣＣＡＡＣＣＣＡＲＣＣＡＴＴＲＴＡＣＡ−３’
・オリゴヌクレオチド鎖７（ＣＯＧ２Ｆ）：５’−ＣＡＲＧＡＲＢＣＮＡＴＧＴＴＹＡＧＲＴＧＧＡＴＧＡＧ−３’
・オリゴヌクレオチド鎖８（ＲＩＮＧ２ＡＬ−ＴＰ ｒｃ）：５’−ＡＧＡＴＹＧＣＧＡＴＣＷＣＣＣＴＣＣＣＡ−３’
上記核酸配列のＡＧＣＴ以外の記号は，ＩＵＢ Ｃｏｄｅｓ（Ｃｏｄｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に従い，その内容は，Ｒ＝Ａ ｏｒ Ｇ ； Ｂ＝Ｃ， Ｇ ｏｒ Ｔ ； Ｙ＝Ｃ ｏｒ Ｔ ； Ｄ＝Ａ， Ｇ ｏｒ Ｔ ； Ｋ＝Ｇ ｏｒ Ｔ ； Ｈ＝Ａ， Ｃ ｏｒ Ｔ ； Ｍ＝Ａ． ｏｒ Ｃ ； Ｖ＝Ａ， Ｃ ｏｒ Ｇ ； Ｓ＝Ｇ ｏｒ Ｃ ； Ｗ＝Ａ ｏｒ Ｔ ； Ｎ＝ａｎｙ ｂａｓｅである。

そして，基板２に，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８.０）；２０ｍＭ，ＫＣｌ；１０ｍＭ，(ＮＨ４)２ＳＯ４；８ｍＭ，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；０．１０％，ｂｅｔａｉｎ；０.８Ｍ，ｄＮＴＰｓ（ビオチン標識−ｄＵＴＰ）；５.６ｍＭ（各１.４ｍＭ），Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏＬｙｍｅｒａｓｅ；２５.６U，標的核酸配列；０〜１０８ ｃｏｐｉｅｓ／μＬとなるように混合した混合液を80μL投入した。

次に，基板上にカバーガラスをかけ，２００μＬの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中において，６５℃で９０分間反応させた。

次に，カバーガラスをはずして洗浄後，０．０１ｍｇ／ｍＬ濃度のアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを８μＬ，１０×ＭＰＥＸバッファＡを８．０μＬ，２×ＭＰＥＸバッファＢを４０μＬ，滅菌水を２４μＬの割合で混合した混合液をプラスチック基板へ投入した。

次に，カバーガラスをかけ，２００μＬの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中において，３７℃で３０分間反応させた。それから基板を洗浄後，ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＫＰＬ製））に浸漬し，３７℃で３０分間反応させてから基板を洗浄し，青紫色のスポットを発色させた。

発色画像はイメージスキャナ（キヤノン製，ＰＩＸＵＳ ＭＰ４７０）でパソコンへ取り込み，画像解析ソフト（住友ベークライト製，誰でもＤＮＡアレイ解析ソフト）で発色を検出し，強度を数値化した。

基板１についての検出方法は，実施例１と同様に行った。

上記検出した発色を，標的核酸配列の濃度が０，１０^０，１０^１，１０^２，１０^４，１０^６，１０^８ｃｏｐｉｅｓ／μＬの７水準の濃度について実施した（０ｃｏｐｉｅｓ／μＬはバックグラウンド）。

そして，実施例２と実施例１での上記各濃度における発色シグナル量を比較した。比較結果を図９に示す。その結果，図９から分かるように，実施例１の基板１を用いた結果では，Ｇ１及びＧ２それぞれの標的核酸配列を検出する為には標的核酸配列濃度が１０^８ｃｏｐｉｅｓ／μＬ以上が特に好ましいことが分かった。

これに対して，実施例２の基板２を用いた結果では，Ｇ１及びＧ２それぞれの標的核酸配列を検出する為には標的核酸配列濃度が１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ以上あれば十分であり，極めて低濃度の標的核酸配列であっても検出が可能であることを確認した。

本発明における核酸配列の検出方法に関する第１の実施形態のフローの概念を示したフロー図。 本発明における第１の実施形態で形成される網目状空間の概念を示す基板の斜視図。 本発明による第１の実施形態の操作手順を示すフローチャート。 本発明の第２の実施形態による核酸配列の検出方法のメカニズムを概念的に示した概念図の前半部分。 本発明の第２の実施形態による核酸配列の検出方法のメカニズムを概念的に示した概念図の後半部分。 本発明の第２の実施形態で形成される網目状空間の概念を示す基板の斜視図。 本発明の第２の実施の操作手順を示すフローチャート。 実施例１における基板上に発色した発色画像の説明図。 発色画像を数値化した結果の平均Ｓ／Ｎ比を示す表。 第２の実施例の結果を説明する説明図。

符号の説明

１０…標的核酸配列，１２…オリゴヌクレオチド鎖，１４…オリゴヌクレオチド鎖，１６…基板，１８…架橋体，２０…網目状空間，２２…リガンド，２４…第１のオリゴヌクレオチド鎖，２６…第２のオリゴヌクレオチド鎖，２８…第１の伸長反応産物，３０…第１の伸長反応鎖（２本鎖），３４…第２の伸長反応鎖（２本鎖），３６…第２の伸長反応産物

Claims (18)

1. 標的核酸配列に対して相補的または相同的な核酸配列を有する一対のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端または５’末端を基板上に固定化した前記一対のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列の相補的部分を結合させ微細な網目状空間を有する架橋構造体を形成する工程と，
   前記架橋構造体を形成する核酸配列に発光又は発色物質を取り込み，又は前記網目状空間にリガンドを取り込む工程と，
   前記取り込んだ発光又は発色物質に反応する活性物質を用いて発色又は発光させる工程と，
   前記発色又は発光信号を検出することにより前記標的核酸配列を検出する検出工程と，を備えたことを特徴とする核酸配列の検出方法。
2. 前記標的核酸は隣接する固定化オリゴヌクレオチド鎖の距離同程度の長さを有する請求項１記載の核酸検出方法。
3. 基板表面に５’末端又は３’を固定化したオリゴヌクレオチド鎖１に標的核酸配列をハイブリダイズする工程１と，
   前記オリゴヌクレオチド鎖１をプライマーとし，標的核酸配列が第１の鋳型鎖となる核酸伸長反応により第１の伸長反応鎖を形成する工程２と，
   前記第１の鋳型鎖の５’末端側と解離した第１の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，基板表面に５’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖２にハイブリダイズする工程３と，
   前記オリゴヌクレオチド鎖２をプライマーとし，前記第１の伸長反応鎖が第２の鋳型鎖となる鎖置換型核酸伸長反応により第２の伸長反応鎖を形成する工程４と，
   前記オリゴヌクレオチド鎖１側と解離した，前記第２の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，前記基板表面に５’末端又は３’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖３にハイブリダイズする工程５と，
   前記オリゴヌクレオチド鎖３をプライマーとし，前記第２の伸長反応鎖が第３の鋳型鎖となる鎖置換型核酸伸長反応により第３の伸長反応鎖を形成する工程６と，
   前記オリゴヌクレオチド鎖２側と解離した前記第３の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，基板表面に５’末端または３’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖４にハイブリダイズしてブリッジを形成する工程７と，
   前記ブリッジ又はそのブリッジによって形成される空間内に発色又は発光物質を存在させる工程と
   を有する核酸検出方法。
4. 前記オリゴヌクレオチド鎖が５種類以上有り，前記工程７の後に工程４，５，６及び７を複数回繰り返すことを特徴とする請求項３の記載の核酸検出方法。
5. 前記オリゴヌクレオチド鎖１および前記オリゴヌクレオチド鎖３の配列が同じであり，前記オリゴヌクレオチド鎖２および前記オリゴヌクレオチド鎖４の配列が同じであることを特徴とする請求項３記載の核酸検出方法。
6. 前記伸長反応後に昇温処理することで，前記伸長反応鎖と前記鋳型を，鎖置換反応を用いずに解離させることを特徴とする請求項３，４及び５のいずれかに記載の核酸検出方法。
7. 前記核酸伸長反応の基質となるｄＮＴＰに予めリガンドを修飾し，伸長反応産物である前記第１の鋳型鎖および第１の非鋳型鎖にリガンドを取り込み，このリガンドに活性物質を反応させることを特徴とする請求項１又は３〜６のいずれかに記載の核酸検出方法。
8. 前記工程３，５及び７のハイブリダイゼーションにより，前記基板表面に架橋状態の核酸配列構造を形成させることにより微細な網目状空間を形成し，該空間へリガンドを取り込み，このリガンドに活性物質を反応させて伸長反応産物を検出することを特徴とする請求項３〜７のいずれかに記載の核酸検出方法。
9. 前記リガンドがビオチン，アビジン，ストレプトアビジン，抗原，抗体，オリゴヌクレオチド，酵素よりなる群から選ばれた何れかである請求項７又は８に記載の核酸検出方法。
10. 前記リガンドがビオチン化酵素，アビジン化酵素，ストレプトアビジン化酵素，酵素標識抗体，酵素標識オリゴヌクレオチドよりなる群から選ばれた何れかである請求項７又は８に記載の核酸検出方法。
11. 前記リガンドに反応する活性物質が，酵素標識レセプター，蛍光物質標識レセプター及び基質よりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の核酸配列検出方法。
12. 前記リガンドと前記活性物質を反応させることで発色もしくは発光信号を得ることを特徴とする請求項７〜１１のいずれかに記載の核酸配列検出方法。
13. 請求項３に記載の前記核酸伸長反応の基質となるｄＮＴＰに予め蛍光物質，またはラジオアイソトープを修飾し，伸長反応産物である前記鋳型鎖および非鋳型鎖に蛍光物質，またはラジオアイソトープを取り込み，この蛍光物質またはラジオアイソトープを活性化させ発光もしくは感光させることで伸長反応産物を検出することを特徴とする核酸検出方法。
14. 基板表面に５’末端又は３’を固定化したオリゴヌクレオチド鎖１に標的核酸配列をハイブリダイズする工程１と，
    リガンド修飾したｄNTPの存在下で、前記オリゴヌクレオチド鎖１をプライマーとし，標的核酸配列が第１の鋳型鎖となる核酸伸長反応により第１の伸長反応鎖を形成するとともにリガンドを取り込む工程２と，
    前記第１の鋳型鎖の５’末端側と解離した第１の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，基板表面に５’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖２にハイブリダイズする工程３と，
    前記オリゴヌクレオチド鎖２をプライマーとし，前記第１の伸長反応鎖が第２の鋳型鎖となる鎖置換型核酸伸長反応により第２の伸長反応鎖を形成する工程４と，
    前記オリゴヌクレオチド鎖１側と解離した，前記第２の伸長反応鎖の３’末端側核酸配列が，前記基板表面に５’末端又は３’末端を固定化したオリゴヌクレオチド鎖３にハイブリダイズする工程５と，
    前記オリゴヌクレオチド鎖３をプライマーとし，前記第２の伸長反応鎖が第３の鋳型鎖となる鎖置換型核酸伸長反応により第３の伸長反応鎖を形成する工程６と，
    オリゴヌクレオチド鎖と標的核酸の相補部分を結合させた後，前記リガンドに活性物質を反応させ発色又は発光させ，これを検出することを特徴とする核酸検出方法。
15. 基板上に，標的核酸配列に対して相補的な核酸配列を含む多数のオリゴヌクレオチド鎖と相同的な核酸配列を含む多数のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端又は３’末端が固定化され、該オリゴヌクレオチド鎖にリガンドが取り込まれていることを特徴とする核酸配列検出用基板。
16. 基板上に，標的核酸配列に対して相補的な核酸配列を含む多数のオリゴヌクレオチド鎖と相同的な核酸配列を含む多数のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端が固定化され，オリゴヌクレオチド鎖の伸長反応生産物にリガンドを含有することを特徴とする請求項１５記載の核酸配列検出用基板。
17. 基板上に，標的核酸配列に対して相補的な核酸配列を含む多数のオリゴヌクレオチド鎖と相同的な核酸配列を含む多数のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端固定化され，オリゴヌクレオチド鎖の伸長反応生産物が他方オリゴヌクレオチド鎖に架橋してその空間内にリガンドが取り込まれていることを特徴とする請求項１５又は１６記載の核酸配列検出用基板。
18. 前記伸長反応生産物が基板上で架橋していることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の核酸配列検出用基板。

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