EP1334208A2 - Verfahren zur markierung chemischer substanzen - Google Patents

Verfahren zur markierung chemischer substanzen

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Publication number
EP1334208A2
EP1334208A2 EP01971604A EP01971604A EP1334208A2 EP 1334208 A2 EP1334208 A2 EP 1334208A2 EP 01971604 A EP01971604 A EP 01971604A EP 01971604 A EP01971604 A EP 01971604A EP 1334208 A2 EP1334208 A2 EP 1334208A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
acid oligomer
receptor
units
complexes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01971604A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gerhard Hartwich
Michael Bandilla
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Original Assignee
Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH filed Critical Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Publication of EP1334208A2 publication Critical patent/EP1334208A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances

Definitions

  • the present invention relates to a method for labeling and detecting chemical substances.
  • proteome research The quantitative acquisition of all proteins of a cell of a certain organism at a certain point in time, often referred to as (cellular) proteome research or (cellular) proteomics, is the key to a functional understanding of the physiological, in a special case pathological state of the cell in question.
  • the "proteomic" information enriches both basic and applied research. It provides the molecular basis for the condition of a cell and offers the possibility of recording the change in the expression and modification pattern of the proteins in response to a specific disorder (e.g. a disease or the administration of a certain drug).
  • Proteome research is therefore of fundamental importance for target search and selection in biomedical research, i.e. the development of new drugs.
  • the (cellular or global) proteome can also be used to diagnose diseases and control therapy.
  • proteome research therefore pursues the same goals as genome research, namely the correlation of the state of an organism or a cell (of the phenotype) with basic molecular building blocks of this organism through the parallel analysis of as many such building blocks as possible (e.g. the mRNA or the proteins).
  • the proteome has a much larger amount of information than the genome. While the genome captures the inheritance pattern and the direct transcription pattern of the genes in the form of cDNA and mRNA qualitatively and quantitatively, the complexity of the transcription products, i.e. the proteins, increases through post-translational modifications of many proteins (phosphorylation, Glycosylation, proteolytic processing, etc.). The same genome therefore leads to different proteomes and thus different physiological (or pathological) conditions due to these post-translational variations and transport mechanisms that distribute transcribed gene products over the entire organism.
  • the proteome also has two main advantages with regard to target search and selection or the diagnosis of diseases compared to the genome: on the one hand, the correlation between proteome and phenotype is closer, and on the other hand, the proteome can (at least partially) be typical clinical samples such as serum, cerebrospinal fluid or urine can be examined. These easily accessible samples do not contain DNA, but do contain proteins, so that the samples can be examined for potential proteomic markers of a disease, but not for genomic markers.
  • proteome In comparison to genome research, however, the analysis of the proteome is much more difficult to carry out because - in contrast to the principle of hybridization of DNA, cDNA or mRNA in the genome - there is no simple, universally applicable and unambiguous detection principle for proteins.
  • the isolation and separation as well as the actual detection must be individually adapted to the biochemical properties (e.g. hydrophobicity, hydrophilicity, acidophilia, thermophilia) of the respective proteins or protein groups.
  • the analysis of the proteome can be divided into the following steps (cf. F. Lott Acid, "Proteom Analysis: A Pathway to the Functional Analysis of Proteins", Angewandte Chemie International Edition, 1999, Vol. 38, 2476-2492): Determination of the Start parameters, sample preparation, protein separation, protein quantification and data analysis.
  • the starting parameters are intended to guarantee that the material that is subjected to a proteome analysis can be produced reproducibly.
  • Sample preparation includes cell cultivation and cell disruption under denaturing or non-denaturing conditions. Since proteins do not have uniform physical and chemical properties, sample preparation requires an exact protocol to ensure reproducibility.
  • the currently most common, high-resolution method of protein separation is 2D gel electrophoresis, in which proteins are separated according to (i) charge (using isoelectric focusing, IEF gel) and (ii) size (using SDS-PAGE gel electrophoresis) become.
  • the problem with this method also lies in the reproducibility, in this case in the reproducibility of the two-dimensional patterns on the gel. External parameters such as the protein transfer from the first, IEF-gel dimension to the second, SDS-PAGE-gel dimension, the electrophoresis device, the gel composition, the electrophoresis duration for IEF gels, staining methods, operating personnel etc. can become clear Variation of the pattern.
  • Protein identification and quantification is usually done. by mass spectrometric methods, which require a transfer of the gel-separated proteins from the gel to other environments (e.g. organic matrices in MALDI mass spectroscopy, MALDI-MS). This transfer to another environment can also lead to modifications of the proteins and thus to misinformation or loss of information.
  • mass spectrometric methods which require a transfer of the gel-separated proteins from the gel to other environments (e.g. organic matrices in MALDI mass spectroscopy, MALDI-MS). This transfer to another environment can also lead to modifications of the proteins and thus to misinformation or loss of information.
  • the antibody chip strategy has the disadvantages of unspecific fluorescence and, owing to the two-dimensional readout method of fluorescence by, for. B. CCD cameras in combination with cofocal microscope optics extremely expensive detection method.
  • the unification of the reaction to bind the fluorescent dye to the various proteins represents an unsolved problem.
  • Proteome analysis thus has the potential to develop into an extremely helpful technique in biomedical research and medical diagnostics.
  • problems described above must be overcome, namely the insufficient reproducibility, the low degree of parallelization and the enormous amount of preparative work, highly qualified personnel and expensive technical equipment. Presentation of the invention
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for marking chemical substances which does not have the disadvantages of the prior art.
  • Functional genome research generally includes the expression and behavior of gene products. Within the "functional genomics” the areas of cellular transcriptome research, cellular proteome research, global proteome research and metabolome research are distinguished. As cellular transcriptome research (cellular transcriptomics), the comparative investigation of the mRNA exposure profiles with the help of e.g. B. DNA chips. The quantitative isolation and identification of all proteins in a cell is known as cellular proteomics research. In global proteome research (global proteomics), all encoded proteins of the entire genome are analyzed, without any definition of a specific cell type or specific growth conditions (physiological state of the cell). The proteome itself is a building block of the metabolome or metabolome research (metabolomics), i.e. the understanding of the entire metabolism of an organism.
  • Affinity chromatographic method in which specific graphical bonds between a tag and its binding partner are used to purify a substance. Either the tag or the binding partner on the substance to be purified is modified and the binding partner or the tag is immobilized on the chromatography material.
  • a combination of tag and binding partner are a specific anti-hapten antibody as a binding partner and a hapten as a tag, or Protein A (or Protein G) as a binding partner and a specific IgG antibody as a tag.
  • protein G or protein A has a special position as binding partner immobilized on the chromatography material, since this protein can quantitatively bind all secondary immune complexes, free F a b fragments, which are used in the nucleic acid oligomer receptor units become, but not bound. alkaline enzyme that cleaves phosphate groups from various phosphatase substrates
  • Alkynyl alkyl or alkenyl groups in which one or more of the C-C single or C C double bonds are replaced by C ⁇ C triple bonds.
  • alkyl denotes a saturated hydrocarbon group that is straight-chain or branched (eg ethyl, 2,5-dimethylhexyl or isopropyl etc.).
  • alkyl refers to a group with two available valences for covalent linkage (e.g. - CH 2 CH 2 -, -CH 2 C (CH 3 ) 2 CH 2 CH 2 C (CH 3 ) 2 CH 2 - or -CH 2 CH 2 CH 2 - etc.).
  • Preferred alkyl groups as substituents or side chains R are those of chain length 1-30 (longest continuous chain of atoms covalently bonded to one another).
  • anti-Fab-antibody antibodies b to the constant regions of the F a fragments are directed. This term is always understood to mean a whole set of antibodies which can bind all F a b fragments regardless of the isotype and species.
  • Antigen Specific binding partner of an antibody any substance, compound, biomolecule or molecule or combinations thereof which, due to its primary, secondary or tertiary structures, has a binding site for an antibody which enables specific binding of this antibody; the ability of a substance to act as an antigen is only restricted by the fact that the antigen-antibody interaction must have a certain affinity, so that the antibody can specifically recognize the substance.
  • Another peculiarity of antigens is to stimulate the production of certain antibodies in an organism (i.e. to stimulate an immune response).
  • An antigen can therefore also represent a complex mixture of chemical substances or entire organisms (such as pollen grains, killed bacteria, viruses, etc.).
  • anti-hapten antibody in the context of the present invention, is used for a group of antibodies which are specifically directed against a specific hapten or hapten analogue.
  • Preferred haptens are biotin or those in the form of the non-carrier-bound but with hapten analogs which specifically bind to the corresponding anti-hapten antibodies, such as FITC, digoxigenin, DNP and rhodamine (cf. also the definition of hapten).
  • anti-Ig antibodies anti-Ig antibodies are anti-immunoglobulin antibodies which are specific for individual isotypes, classes or subclasses of antibodies of a particular species.
  • anti-Ig antibodies are understood to mean those anti-Ig antibodies which, after affinity chromatography purification, are directed only against the constant regions on the F c fragment. Isotypic anti-Ig antibodies which are directed against constant regions of the Fab fragments are explicitly distinguished from them as anti-F a antibodies.
  • anti-Ig antibodies are understood to mean a complete set of anti-immunoglobulin antibodies, which includes all antibodies against all classes and subclasses, as long as the class or subclass is not specifically defined (in contrast to, for example, anti- IgG antibodies bearing the abbreviation of the subclass in the name).
  • the anti-Ig antibodies play an important role Role in the formation of secondary immune complexes: They bind to the specific antibodies of the primary immune complexes and initiate the formation of secondary immune complexes, ie an aggregation of the primary immune complexes into large complexes with an undefined composition, these secondary immune complexes via the anti-Ig antibodies can bind to protein A or protein G.
  • Antibody-specific group of proteins also called immunoglobulins, abbreviated as Ig
  • Ig immunoglobulins
  • B cells of the immune system of vertebrates.
  • Antibodies specifically recognize structural features, in particular the secondary or tertiary structure of any chemical substances (or complexes or aggregates of substances) and bind to them, the substances specifically binding to the antibodies being referred to as antigens.
  • Antibodies are made up of two (identical) H chains and two (identical) L chains, which assemble to form a Y-shaped protein with two arms, the antigen-binding domains, formed by the assembly of an L and an H Chain, also called F a t domain, and a stem region, the effector domain, formed by the C-terminal parts of the two H chains, also called F c domain, being combined.
  • the antigen binding domain has a constant region and a so-called variable region, formed from the N-terminal globular domain of an arm, which differs from antibody to antibody, is characteristic of each antibody and bears the specific binding site for a specific antigen.
  • the constant regions of the effector domains contain the binding regions for specific ones Binding partners of different Zeil lines and binding regions for the complement factor C1q, as well as for protein A and protein G.
  • Naturally occurring antibodies are made up of such a unit or from a complex of 2-5 such units and thus have between 2 and 10 identical ones antigen binding sites.
  • Antibodies are divalent or multivalent accordingly.
  • the B cell binding partners expressed on the cell surface of the B cells have the same structure, only with an additional domain that integrates the molecule into the cell membrane.
  • antibodies There are different classes and subclasses of antibodies: eg IgGI, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgD, IgM, IgA1, IgA2 and IgE in the mouse, which differ in the region of the constant regions.
  • the antibodies also differ in that there are different combinations of the H chain and different L chains (lamda and kappa). Antibodies with the same combination of H chain and L chain are called isotypes.
  • the individual antibodies are also defined according to their origin, ie according to the species from which the antibodies or the B cells for hybridoma cell fusion are obtained.
  • monoclonal antibodies usually come from mice or rats, in rare cases also from humans, and polyclonal antibodies come from mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, goats, sheep, cattle, horses, chicken and goose.
  • the specificity of 'polyclonal' antibodies is determined by the complexity of the antigens and can therefore include an indefinable number of epitopes on a number of different substances. In general, neither the Ig class, the subclass, the isotype nor the origin play a role in the specificity and affinity of the antibodies. Therefore, in the present invention in generally dispenses with this information.
  • Biotin Biotin (a cofactor of certain enzymes) can be covalently bound to proteins as a hapten or as a tag.
  • Biotin carboxylase protein that binds biotin as a cofactor - a peptide that contains a carrier protein domain of this protein is used as a tag to achieve in vivo biotinylation in E. coli of the proteins fused with the tag.
  • B-cells Cells of the immune system that are responsible for producing antibodies during an immune response.
  • Carrier A molecule which is a carrier material for another substance, the substance being bound specifically or nonspecifically, covalently or non-covalently, to the carrier.
  • a carrier can be any material regardless of the size and structure to which a substance can bind.
  • macromolecules are used as the carrier material, which, depending on the purpose for which the carrier is used, ideally has various additional properties, such as, for example Property of easily sedimenting or of being specifically or covalently bound by another substance, such as a protein that can be bound by an antibody.
  • carrier is used exclusively to refer to a compound which is capable of binding to a hapten analogue with only one epitope, without the properties of the epitope being changed and the complex of carrier and hapten analog in addition to the unchanged epitope of the hapten analog has at least one further epitope (on the carrier).
  • Chromatography equivalent also to carrier material. material cytoplasmic proteins that are located in the cytoplasm and can be isolated as soluble protein fractions
  • Detection markers chemical substances with any structure and composition, which are bound to the nucleic acid oligomer or its amplification products and via which the nucleic acid oligomer or its amplification products can be detected.
  • Typical detection markers are e.g. B. fluorescent dyes, radioactive isotopes and functional enzyme units.
  • any modification of a molecule that is suitable for simply connecting a detection marker can also be referred to as a detection marker, such as, for. B. a linked biotin to which the actual avidin-modified detection marker can be linked in a simple reaction.
  • Digoxigenin steroid used as a hapten analogue
  • DNAse enzymes break down the DNA
  • DNP 2,4-dinitrophenol is used as a hapten analogue or as a chromophore for labeling
  • Dot plot membrane Membranes that serve as carrier material for DNA or RNA. DNA or RNA samples are applied to the dot-plot membranes and immobilized as individual, mostly punctiform drops in a defined pattern. ds double strand (double strand)
  • ECM extracellular proteins of the extracellular matrix that are isolated as an insoluble matrix
  • Epitope Any structural feature of an antigen that is recognized by an antibody and that represents a binding site for a specific antibody.
  • F a b / F a b fragment After papain digestion, the proteolytic fragment of IgG antibodies, which contains the variable region that specifically recognizes the antigens, is obtained by papain digestion - the F ab fragment contains only one binding site for the antigen (monovalent) - genetically Antibodies produced are also monovalent depending on the design and are then referred to as F ab fragments in the context of this invention.
  • F ab fragment is also understood to mean the binding domains of other Ig classes which have been isolated using other methods.
  • F c F c fragment is the fragment after papain digestion of IgG antibodies, which contain the C-terminal constant domains (constant regions) of an IgG - in these regions are the binding sites for the components C1q of the complement, for protein A and protein G, as well as for the cellular receptor proteins, which are the constant Specifically recognize and bind regions of the antibodies.
  • F c - ⁇ receptor cellular receptor proteins for the F c region of IgG that specifically bind the antibodies as soon as they have formed an antigen-antibody complex
  • Fluorescein activated by an isothiocyanate side group which makes it possible to covalently bind fluorescein to other substances - fluorescein can be used as a simple fluorescence label, on the other hand it can be used as a hapten analogue, i. e. serve as a non-carrier-bound substance that specifically binds to the corresponding anti-hapten antibodies.
  • functional protein Protein in native or partially denatured form which is still able to perform at least one of the functions corresponding to one of the natural functions of the protein in the organism.
  • Gel electrophoresis Method for the electrophoretic separation of macromolecules such as polypeptides, proteins or nucleic acids, using a gel matrix (usually agarose or polyacrylamide).
  • Hapten Substance that elicits an immune response in the animal with antibody formation when bound to an immunogenic carrier eg a protein
  • immunogenic carrier eg a protein
  • immunogenic means that this carrier itself is an (ideally very well recognized) antigen.
  • the antibodies formed in the immune response against the carrier differ from the immune response against the hapten.
  • a substance is referred to as a hapten if it is bound to a carrier and serves as a binding partner for an antibody.
  • the substance which is the hapten in association with the carrier is generally also recognized and bound by the anti-hapten antibody if it is not bound to a carrier or to another carrier.
  • Hapten analogue A substance that, in conjunction with a carrier, represents hapten.
  • a hapten analogue is recognized and bound by the anti-hapten antibody, even if it is not bound to a carrier.
  • 0.1 mg / ml ssDNA from pBR322 plasmid 0.5 mg / ml acetylated BSA or 7% SDS, 500 mM Na phosphate buffer pH 7.5, 5 mM EDTA or
  • Hybridoma cells chimeric cell lines from B cells (predominantly from mouse and hybridoma cells rat) which, as immortalized cell lines, produce monoclonal antibodies with the specificity of the B cells.
  • IgA high affinity immunoglobulins that support the immune defense in the mucous membranes of the organism.
  • igE high-affinity immunoglobulins which are bound by certain cells of the immune system, occur when certain groups of pathogens and parasites are infected, but also form in the formation of allergies or play an important role in allergic reactions.
  • IgG high-affinity immunoglobulins which are formed in the case of an immune response and which can still be detected in the serum for a long time after an infection.
  • IgM low-affinity immunoglobulins which are formed during the development of the not yet fully differentiated B cells and represent the first immune response to an infection.
  • Immunoassay An assay (detection system) that uses the specific binding of the antibody to its antigen to detect the antigen - a distinction is made between different assays depending on the type of labeling and the detection method. Examples include: RIA (radioimmunoassay), RIST (radioimmunosorbent test) and RAST (radioallergosorbent test) for detection via radioactive labeling, EIA (enzyme linked immune assay) and ELISA (enzyme linked immumosorbent assay) for detection via an enzyme (in the Rule with alkaline phosphatase, ß-galactosidase or horseradish peroxidase) and quantification of the implementation of certain substrates by z. B. colorimetry or chemiluminescence, IF (immunofluorescence) when detected via fluorescent dyes, IP (immunoprecipitation) when detected via direct isolation of the precipitate.
  • RIA radioimmunoassay
  • Isoelectric method for electrophoretic separation of focusing (IEF) polypeptides and proteins according to their pl - i.e. depending on the surface charge, the amino acid composition and post-translational modifications of the polypeptides and proteins
  • Nuclear Proteins Proteins that are isolated with the nuclear fraction.
  • Complement-C1q A component of the complement system C1q that bind specifically to the F c region of IgG and IgM antibodies in an antigen-antibody complex.
  • linkers are commercially available as alkyl, alkenyl, alkynyl, hetero-alkyl, hetero-alkenyl or heteroalkynyl chains, the chain being derivatized at two points with (identical or different) reactive groups. These groups form a covalent chemical bond in simple / known chemical reactions with the corresponding reaction partners.
  • the reactive groups can also be photoactivatable, i. H. the reactive groups are only activated by light of certain or any wavelength.
  • Membrane proteins Proteins that are integrated in or attached to the membrane and can be isolated with the membrane fraction - membrane proteins can be made from these Membrane fractions can be extracted using detergents.
  • the two single strands hybridize in such a way that the base A (or C) of one strand forms hydrogen bonds with the base T (or G) of the other strand (in RNA, T is replaced by uracil) , Any other base pairing does not form correct hydrogen bonds, distorts the structure of the double strand and is referred to as "mismatch”.
  • Modified nucleic acid oligomer with attached receptor-nucleic acid oligomer unit The terms "modified nucleic acid oligomer” and “nucleic acid oligomer-receptor unit” are used equivalently.
  • Monoclonal Monoclonal antibodies are each produced from a single hybridoma cell clone, the antibodies produced from a cell clone all having the same defined antigen binding site and belonging to the same isotype. Accordingly, monoclonal antibodies show specificity against only one defined epitope.
  • Nucleic acid at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine).
  • the term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as. B. on the sugar-phosphate backbone of the DNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analog structures (e.g. phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone).
  • An essential feature of a nucleic acid in the sense of the present invention is that it can bind complementary nucleic acids in a sequence-specific manner.
  • Nucleic acid oligomer Nucleic acid of unspecified base length (e.g. nucleic acid octamer: a nucleic acid with any backbone in which 8 pyrimidine or purine bases are covalently bound to one another).
  • nucleic acid octamer a nucleic acid with any backbone in which 8 pyrimidine or purine bases are covalently bound to one another.
  • nucleic acid oligomer is used both as a name for a single molecule and as a name for any number of single molecules of a type of nucleic acid oligomer. The respective meaning is clear from the context.
  • Nucleic acid oligomer complex consisting of a receptor unit and a receptor unit.
  • Nucleic acid oligomer, the complex formation being able to be realized by direct or indirect linker-bridged, covalent or non-covalent, specific binding between nucleic acid oligomer and receptor unit and the complex composition corresponding to a defined stoichiometry.
  • Oligo Abbreviation for oligonucleotide Oligo Abbreviation for oligonucleotide.
  • Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer.
  • Oligonucleotide equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer e.g. B. a DNA, PNA or RNA fragment unspecified base length.
  • pBR322 plasmid E.co/. ' Cloning plasmid, which acts as ss-DNA to block non-specific binding sites on the blot membrane is used.
  • PBS Phosphate buffered saline buffer substance with a defined composition - composed in the context of the present invention from 10 mM Na phosphate, 135 mM NaCl, 5 mM KCI, pH 7.4
  • Phosphate wash- 50 mM potassium phosphate pH 7.5, 500 mM NaCI, 1 mM buffer EDTA photo-inducible Photo-inducible means that a certain property is only developed by irradiation with light of certain or any wavelength.
  • Phycoerythrin pigment-protein complex from cyanobacteria which is used as a fluorescence marker.
  • PNA Peptide nucleic acid synthetic DNA or RNA in which the sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid.
  • synthetic DNA or RNA synthetic DNA or RNA in which the sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid.
  • sugar-phosphate unit is replaced by the -NH- (CH 2 ) 2 -N (COCH 2 - base) -CH 2 CO - Unit hybridizes PNA with DNA.
  • Poly-dT (33) oligomer made up of 33 deoxy-thymidines.
  • polyclonal antibodies The term refers to a set of antibodies with a generally undefined composition, all of which Specifically recognize and bind the same antigen.
  • Polyclonal antibodies are produced by different B cells of an animal's immune system and are obtained from the sera of the immunized animals. So-called anti-sera do not correspond to purified polyclonal antibodies and are equivalent to them. Depending on the complexity of the antigen used for the immunization, polyclonal antibodies have a broad or more limited range of specificity. The specificity of polyclonal antibodies can be restricted to a portion of the epitopes of the antigen by affinity chromatography enrichment and / or purification, so that high specificity and high affinity can also be achieved with polyclonal antibodies.
  • Primary immune complex immune complex is understood to mean a complex of specific antibody and target, the specific antibody not forming a receptor unit, but being used as a tag for immobilizing the target.
  • Primer binding region Region of a nucleic acid that serves either directly as a primer binding region or as a primer binding region on the corresponding complementary strand of the nucleic acid.
  • Protein A Protein G Proteins that bind specifically to antibodies with an intact F c region of different subclasses (predominantly IgG) of immunoglobulins
  • PVDF membranes Polyvinylidene fluoride membranes with a hydrophobic surface, preferred for the immobilization of Proteins is used
  • Receptor unit any substance, every compound, every biomolecule or molecule or combinations thereof, which because of its primary, secondary or tertiary structures has a binding site for another substance (compound, biomolecule or molecule or combinations) that has a specific binding of these others Substance enables.
  • Receptor units are e.g. B. a protein or peptide, or one of the specific binding partners that bind to a protein or peptide, an antibody or an antigen.
  • Receptor protein Protein (or a functional peptide) whose natural function is to specifically bind one or a defined group of cofactors (binding partners) in order to perform its biologically relevant function.
  • a specific binding in the sense of the present invention is when a substance which is at least one molecule is bound by another conjugate, or a limited group of other conjugated substances which are at least one molecule, the primary , Secondary or tertiary structure of conjugated molecules make a significant contribution to this binding.
  • the specific bond thus differs in the sense of the present invention from a covalent chemical connection of two molecules.
  • the specific bond can be established by one or more ionic bonds, by hydrogen bonds, by van der Waals bridges, by ⁇ interaction, by coordination by means of electron pair donation and acceptance, or by encapsulation of matching molecular structures (e.g. Three-dimensionally designed binding pockets and fitted cofactors).
  • SSC 20 x stock solution 3 M NaCI, 300 mM Na citrate pH 7.0, which is used as a 2x and 0.4x solution for washing blots.
  • ß-galactosidase enzyme that hydrolytically cleaves ß-galactoside.
  • Tag any substance, compound, biomolecule or molecule or combination thereof that, due to its primary, secondary or tertiary structure, has a binding site for another substance (compound, biomolecule or molecule or combination) that enables specific binding of this other substance
  • the term “tag” is understood in a restrictive manner so that this substance does not function as a target or as a receptor unit and not as a detection marker.
  • the term is also to be understood in a restrictive manner so that the tag is covalently bound to another substance, in particular to the targets or carrier materials of the present invention, and serves to immobilize the substance associated with the specific tag binding partner.
  • Typical tags are e.g. B.
  • biotin e.g. HA-Tag, His-Tag, Flag-Tag, GST-Tag Z-Tag
  • functional enzymes such as e.g. AP, POD, ⁇ -galactosidase or luciferase.
  • Target receptor-specific or specific chemical substance every substance, every compound, every biomolecule or Molecule or combinations thereof which, due to its primary, secondary or tertiary structures, has a binding site for another substance (compound, biomolecule or molecule or combinations) which enables specific binding of this other substance.
  • Carrier material is a material that generally binds certain chemical substances while other chemical substances are not bound.
  • Carrier materials are e.g. modified or unmodified silica gel, cellulose, agarose material, nitrocellulose membranes, PVDF membranes, (modified or unmodified) nylon membranes.
  • Tris / HCI Tris where the pH is adjusted with HCI - Tris is equated with Tris / HCI
  • TRITC Tetramethyl-Rhodamine B-Isothiocyanate Tetramethyl-Rhodamine B activated by an isothiocyanate side group, which enables tetramethyl-Rhodamine B to be covalently bound to other substances - Tetramethyl-Rhodamine B can serve as a simple fluorescence label, on the other hand it can as a hapten analogue, i. e. serve as a non-carrier-bound substance that specifically binds to the corresponding anti-hapten antibodies.
  • Cell organelles constituents of different fractions of the cell disruption, which with gentle cell fractionation, mostly as intact membrane fractions with specific Combination of membrane proteins and soluble proteins can be obtained.
  • Examples of cell organelles are mitochondria, lysosomes and endosomes, ER vesicles and Golgi vesicles, peroxisomes and the cell nuclei
  • the present invention comprises a method for labeling chemical substances, comprising the steps: providing one or more chemical substances, providing one or more types of nucleic acid oligomer receptor units, the nucleic acid oligomer receptor units each consisting of a nucleic acid oligomer of a known sequence and in each case one of them connected receptor unit and the receptor unit can specifically bind a chemical substance, and bringing the chemical substances provided into contact with the nucleic acid oligomer receptor units provided, as a result of which complexes are formed from the nucleic acid oligomer receptor unit and the associated chemical substance.
  • the present invention also encompasses a method for the detection of chemical substances, comprising the steps of: providing one or more chemical substances, providing one or more types of nucleic acid oligomer receptor units, bringing the chemical substances into contact with the nucleic acid oligomer receptor units, thereby causing formation of complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance, binding of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance to a suitable chromatography material, whereby separation from the nucleic acid oligomer receptor units remaining in the eluate takes place, cleavage of one or more chemical Binding of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance bound to the chromatography material such that the nucleic acid oligomer component of the nucleic acid oligomer receptor unit is in the form of a nucleic acid oil igomers or in the form of any modified nucleic acid oligomer, which comprises the complete sequence information of the nucleic acid oligomer
  • the present invention also comprises a method for the detection of chemical substances, comprising the steps: providing one or more chemical substances, providing defined amounts of one or more types of nucleic acid oligomer receptor units, bringing the chemical substances into contact with the defined amounts of nucleic acid oligomer receptor Units, whereby a formation of complexes from nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance takes place, binding of the formed complexes from nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance to a suitable chromatography material, whereby a separation from the nucleic acid oligomer receptor units remaining in the eluate is carried out, the nucleic acid oligomer receptor units remaining in the eluate are washed out and the nucleic acid oligomer components of the nucleic acid oligomer receptor units are detected by a suitable method directly as a nucleic acid oligomer rec eptor unit or after cleavage of the nucleic acid oligomer component from the receptor unit as nucleic acid oligomer or
  • the present invention also comprises a method for the detection of chemical substances, comprising the steps: providing one or more chemical substances, binding the chemical substances to a chromatography material, providing one or more types of nucleic acid oligomer receptor units, bringing the nucleic acid oligomer receptor units into contact with the chemical substances bound to the chromatography material, which results in the formation of complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance and a separation from the nucleic acid oligomer receptor units remaining in the eluate, cleavage of one or more chemical bonds of the complexes bound to the chromatography material Nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance such that the nucleic acid oligomer component of the nucleic acid oligomer receptor unit in the form of a nucleic acid oligomer or in the form of any desired ized nucleic acid oligomer, which comprises the complete sequence information of the nucleic acid oligomer, is separated from the chromatography material, Washing out the nucleic acid
  • the present invention also comprises a method for the detection of chemical substances comprising the steps: providing one or more chemical substances, binding the chemical substances to a chromatography material, providing defined amounts of one or more types of nucleic acid oligomer receptor units, contacting the defined amounts of nucleic acid oligomer -Receptor units with the chemical substances bound to the chromatography material, as a result of which complexes are formed from the nucleic acid oligomer-receptor unit and chemical substance, washing out the nucleic acid oligomer-receptor units remaining in the eluate and detection of the nucleic acid oligomer constituents of the nucleic acid oligomer receptor.
  • nucleic acid oligomer receptor unit by a suitable method directly as a nucleic acid oligomer receptor unit or after cleavage of the nucleic acid oligomer component from the receptor unit as a nucleic acid oligomer or modified rst nucleic acid oligomer, which comprises the complete sequence information of the nucleic acid oligomer.
  • the present invention also comprises a method for the detection of chemical substances insoluble in aqueous media, comprising the steps:
  • nucleic acid oligomer receptor Providing one or more types of nucleic acid oligomer receptor
  • Nucleic acid oligomer receptor units whereby complexes are formed from the nucleic acid oligomer receptor unit and insoluble chemical substance
  • nucleic acid oligomer component of the nucleic acid oligomer receptor unit in the form of a nucleic acid oligomer or in
  • Form of any modified nucleic acid oligomer is separated from the insoluble chemical, separating the from the insoluble chemical Substance-separated nucleic acid oligomer components and detection of the nucleic acid oligomer components by a suitable method.
  • the present invention also comprises a method for the detection of chemical substances insoluble in aqueous media, comprising the steps: providing one or more types of insoluble chemical substances, providing defined amounts of one or more types of nucleic acid oligomer receptor units, contacting the insoluble chemical substances with the Defined amounts of nucleic acid oligomer receptor units, whereby a formation of complexes from nucleic acid oligomer receptor unit and insoluble chemical substance takes place, separation of the complexes from nucleic acid oligomer receptor unit and insoluble chemical substance, detection of the nucleic acid oligomer components of the insoluble chemical Substance-separated nucleic acid oligomer receptor units located in the supernatant by a suitable method.
  • the present invention also includes a method of detecting hapten analogs comprising the steps of: providing one or more hapten analogs, providing an excess relative to the hapten analogs of one or more types of nucleic acid oligomer receptor units, contacting the hapten Analogs with the nucleic acid oligomer receptor units, as a result of which complexes are formed from the nucleic acid oligomer receptor unit and the hapten analog, providing the hapten analogs in a modified form, the modification being in the binding of a carrier molecule to the hapten analogs exists, whereby a certain type of carrier molecule is bound to each type of hapten analogue, which satisfies the condition that there is no significant change in the specific binding capacity of the epitope of the hapten analogues due to the binding of the carrier molecule, contacting the modified Hapten analogues in excess with the g e formed mixture of excess nucleic acid oligomer receptor units and complexes formed from nucleic
  • the present invention further comprises a method for the detection of chemical substances, comprising the steps: providing one or more chemical substances, providing one or more types of nucleic acid oligomer receptor units in excess relative to the chemical substances, contacting the chemical substances with the nucleic acid oligomer Receptor units, whereby a formation of complexes from nucleic acid oligomer-receptor unit and chemical substance takes place, providing the chemical substances in modified form, the modification consisting in the connection of the chemical substances to a chromatography material, bringing the mixture of excess nucleic acid oligomer receptor into contact -Units and complexes formed from nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance with the chemical substances bound to the chromatography material, thereby forming complexes from excess nucleic acid oligomer receptor units and chemical substances bound to the chromatography material, washing out the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance remaining in the eluate and detection of the nucleic acid oligomer components of the complexes of
  • the present invention also comprises a method for the detection of chemical substances, comprising the steps: providing one or more types of nucleic acid oligomer receptor units, providing an excess relative to the one or more types of nucleic acid oligomer receptor units of one or more chemical substances, binding of the chemical substances to a chromatography material, bringing the nucleic acid oligomer receptor units into contact with the chemical substances bound to the chromatography material, thereby forming complexes of nucleic acid oligomer Receptor unit and chemical substance takes place, providing one or more types of second chemical substances, the second chemical substances being able to bind specifically to the chemical substances, bringing the one or more types of second chemical substances into contact with the complexes formed from nucleic acid oligomer-receptor.
  • the specific binding of the second chemical substances to the chemical substances means that at least some of the complexes formed from the nucleic acid oligomer receptor unit and the chemical substance into the inventory parts of the nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance are cleaved, whereby the nucleic acid oligomer receptor units are released into the eluate, washing out the released nucleic acid oligomer receptor units and detection of the nucleic acid oligomer components of the nucleic acid oligomer receptor units directly by a suitable method as a nucleic acid oligomer receptor unit or after the nucleic acid oligomer component has been split off from the receptor unit
  • Nucleic acid oligomer or modified nucleic acid oligomer comprising the complete sequence information of the nucleic acid oligomer.
  • the present invention also comprises a kit for carrying out one of the abovementioned methods, a kit for the marking of chemical substances, a kit for the detection of chemical substances, a kit for the detection of proteins or antigens, a kit for the detection of chemical substances which are insoluble in aqueous media , a kit for the detection of antibodies, a kit for the detection of haptens or hapten analogs, a kit for the detection of DNA- and / or RNA-binding proteins, a kit for the detection of the antagonists of enzymes or the antagonists of DNA- and / or RNA-binding proteins, a kit for screening hybridoma cells and a kit for screening hybridoma cells and simultaneous epitope mapping.
  • Each kit according to the invention comprises one effective amount of one or more types of nucleic acid oligomer receptor units.
  • the present invention relates to a method for labeling chemical substances, comprising the steps: providing one or more chemical substances, providing one or more types of nucleic acid oligomer receptor units, the nucleic acid oligomer receptor units each consisting of a nucleic acid oligomer of a known sequence and each have a receptor attached to it and the receptor can specifically bind a chemical substance, and bringing the chemical substances provided into contact with the nucleic acid oligomer receptor units provided, as a result of which complexes are formed from the nucleic acid oligomer receptor unit and the associated chemical substance.
  • the associated nucleic acid oligomer component of the nucleic acid oligomer receptor unit originally bound to this chemical substance can be used as evidence of the presence of the chemical substance instead of the specific chemical substance.
  • the nucleic acid oligomer component of the nucleic acid oligomer receptor unit thus serves as a universal coding molecule for the associated specific chemical substance, as long as a specific base sequence is assigned to a specific nucleic acid oligomer receptor unit and thus to the specific associated chemical substance.
  • this has the advantages (1) that it is generally easier to detect a nucleic acid oligomer than any chemical substance, especially if it is an undefined mixture of chemical substances with different chemical and physical properties (standardization and parallelization of the detection),
  • the coding nucleic acid oligomer can be amplified by suitable methods and thus even the smallest amounts of a chemical substance can be easily detected and
  • the contacting can take place using the highly specific interaction between the receptor and the associated chemical substance, but the subsequent manipulations and the final detection can also take place under conditions that change or destroy the original appearance of the chemical substances, and the stability between the receptor and chemical substance need not be considered as long as the sequence integrity of the nucleic acid oligomer component is preserved.
  • nucleic acid oligomers used in the method according to the invention are modified by chemical binding of a substance-specific receptor.
  • the preferred nucleic acid oligomer is a compound composed of at least two covalently linked nucleotides or of at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine) a DNA, RNA or PNA fragment is used.
  • nucleic acid oligomer refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as. B.
  • nucleic acid oligomer on the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analogous backbone structures, such as. B. a thio-phosphate, a dithio-phosphate or a phosphoramide backbone.
  • An essential feature of a nucleic acid oligomer in the sense of the present invention is that it can bind analogous nucleic acid oligomers in a base sequence-specific manner.
  • nucleic acid oligomer the terms “oligonucleotide”, “nucleic acid” or “oligomer” are used.
  • a “receptor-specific substance” is understood to mean any unit (any substance, any compound, any biomolecule or molecule or combinations thereof) which is specific to a conjugated receptor unit (substance, compound, biomolecule or molecule) or combinations thereof).
  • photolabile means that the cleavage of a group, that is to say its property of disintegrating into two or more fragments under certain external circumstances, is only developed by irradiation with light of a certain or any wavelength.
  • a prerequisite for the method according to the invention is the binding of a receptor to a nucleic acid oligomer.
  • a receptor is directly covalently bound to a nucleic acid oligomer through the reaction of the nucleic acid oligomer with the receptor or indirectly non-covalently through the formation of specific interactions between the (modified) nucleic acid oligomer and the (modified) receptor. This binding can be done in four different ways (ad):
  • a reactive group for binding formation on the nucleic acid oligomer As a reactive group for binding formation on the nucleic acid oligomer, a free phosphoric acid, thiophosphoric acid, thiol, carbonyl, sugar C-3-hydroxy,
  • Carboxylic acid or amine group of the oligonucleotide backbone in particular a group at one of the two ends of the oligonucleotide backbone, is used.
  • the free, terminal phosphoric acid, thiophosphoric acid, thiol, carbonyl, sugar, C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine groups have an increased reactivity and are therefore easy to carry out typical reactions such as e.g. B.
  • the coupling group (acid, amine, alcohol, thioalcohol or aldehyde function) required for the covalent attachment of the receptor unit is either naturally present on the receptor or is obtained by chemical modification of the receptor.
  • a nucleic acid oligomer-receptor unit is used, the coupling of the reactive groups between nucleic acid oligomer and receptor containing a group that can be cleaved after induction.
  • a group that can be cleaved after induction can be, for example, a disulfide group, which can be split reductively into the two thiol constituents after induction by a reducing agent such as DTT or ⁇ -mercaptoethanol, a -CHOH-CHOH group which can be obtained by adding an oxidizing agent such as e.g. B.
  • Nal0 4 or a -CO-0-CH 2 -CH 2 -0-CO- group which can be split by adding H 2 N-OH or a photolabile group such as.
  • B. the azo group (-N N group), which can be split after induction by irradiation of light of a suitable wavelength.
  • the nucleic acid oligomer is on a covalently attached part of the molecule (spacer) of any composition and chain length (longest continuous chain of atoms bound to each other), in particular the chain length 1 to 50 Oligonucleotide backbone or modified on a base with a reactive group. The modification is preferably carried out at one of the ends of the oligonucleotide backbone or at a terminal base.
  • spacer for example, an alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent can be used as spacer.
  • a nucleic acid oligomer-receptor unit in which the linker / spacer has a group which can be cleaved after induction after coupling of the reactive groups between linker / spacer and nucleic acid oligomer and between linker / spacer and receptor.
  • Suitable groups which can be cleaved by induction are, for example, a disulfide group which can be cleaved reductively, that is to say after induction by a reducing agent such as DTT or ⁇ -mercaptoethanol, into the two thiol constituents, a - CHOH-CHOH group which can be obtained by adding an oxidizing agent such as.
  • B. the azo group (-N N group), which can be split after induction by irradiation of light of a suitable wavelength.
  • a terminal base or a terminal nucleotide or terminal nucleoside is replaced by the receptor, a linker / spacer-modified (see b)) receptor or a linker / spacer with a reactive group (see b)) replaced.
  • the receptor or linker / spacer-modified receptor or linker / spacer can be linked with a reactive group completely or in parts of this unit with subsequent completion of the unit.
  • a nucleic acid oligomer receptor unit is used in which the linker / spacer after coupling the reactive Groups between linker / spacer and nucleic acid oligomer or between linker / spacer and receptor has a group which can be cleaved after induction.
  • the continuous chain between nucleic acid oligomer and receptor contains a group which can be cleaved by induction, for example a disulfide group, which is reductive, ie after induction by a reducing agent such as DTT or ⁇ -mercaptoethanol, can be split into the two thiol components, a - CHOH-CHOH group, which by adding an oxidizing agent such.
  • B Nal0 4 or a -CO-0-CH 2 -CH 2 -0-CO- group which can be cleaved by adding H 2 N-OH or a photolabile group such as.
  • B. the azo group (-N N group), which can be split after induction by irradiation of light of a suitable wavelength.
  • nucleic acid oligomer is indirectly noncovalently bound to the receptor.
  • z. B biotin directly or indirectly via a spacer / linker (cf. b)) bound to a nucleic acid oligomer and secondly avidin, in particular monovalent avidin and / or streptavidin, in particular monovalent streptavidin and / or anti-biotin antibody (or the F ab fragment thereof) to the receptor (directly or indirectly via a spacer / linker (cf. b)) or vice versa.
  • This modified nucleic acid oligomer unit is linked to the correspondingly modified receptor unit by coupling the two units due to the specific interactions between biotin and avidin (or biotin and streptavidin or biotin and anti-biotin antibody or between biotin and the F ab fragment of anti-biotin antibodies).
  • Further examples for the realization of the indirect noncovalent connection between nucleic acid oligomer and receptor generally result from direct or indirect connection (cf.b) of a (second) chemical substance to the nucleic acid oligomer, which represents a specific binding partner for a third chemical substance, this being third chemical substance is the one with which the receptor was modified.
  • Examples of such second chemical substances for binding to the nucleic acid oligomer are a hapten analogue (FITC, DNP, digoxigenin or rhodamine), an antigen, a His tag, a HA tag, a FLAG tag, a GST tag, a Z domain (monovalent functional domain of protein A), a functional protein, a chitin-binding protein, an avidin, is monovalent avidin, a streptavidin or monovalent streptavidin.
  • the matching specific binding partner i.e.
  • the third chemical substance is an antibody (specific binding partner for the hapten or antigen) or F a fragment (specific binding partner for the hapten or antigen), in particular an anti-FITC antibody (specific binding partner for FITC), an anti-DNP antibody (specific binding partner for DNP), an anti-digoxigenin antibody (specific binding partner for digoxigenin) or an anti-Rhodamine antibody, or an anti-His-Tag antibody (specific binding partner for His -Tag), an anti-HA-TAG antibody (specific binding partner for HA-TAG), an anti-Flag-Tag antibody (specific binding partner for FLAG-TAG), an anti-GST-Tag antibody or glutathione (specific Binding partner for GST-Tag), antibody Fc fragment (specific binding partner for the Z domain), biotin (specific binding partner for avidin, monovalent avidin, streptavidin, monovale ntes streptavidin, anti-biotin antibody or the F ab fragment of anti-biotin antibody) or the specific binding partner for the functional protein such as
  • the specific binding partner of the second chemical substance can also be bound to the nucleic acid oligomer, in which case a receptor which has been modified with the second chemical substance is used for the indirect binding formation between nucleic acid oligomer and receptor.
  • This type of connection has the advantage that, on the one hand, the receptor to be bound to the respective nucleic acid oligomer can be linked stoichiometrically in a simple, independent and separate reaction and, on the other hand, that the binding between nucleic acid oligomer and receptor or between several nucleic acid oligomers and receptors - if applicable Nucleic acid oligomer receptor compound, the identical pair of conjugated chemical substances was used - can be cleaved if necessary (e.g. after the complexes of target and nucleic acid receptor unit have been separated) by a specific antagonist acting on the conjugated chemical substances (or several such antagonists when using different conjugated chemical substances, each used in a significant excess if necessary).
  • a preferred embodiment of the present invention is as a receptor, an antigen, an antibody, particularly a monoclonal antibody, an F ab fragment of an antibody, a peptide or protein, a protein of a multiprotein complex, an allergen, an enzyme, an enzyme inhibitor, a hormone, a hormone receptor protein, ds-DNA (ss-DNA, ss-RNA) with a specific sequence for binding a DNA- (RNA-) binding protein, a DNA- or RNA-binding protein, a hapten analogue, an oligoglycoside or used a lectin.
  • an antigen an antibody, particularly a monoclonal antibody, an F ab fragment of an antibody, a peptide or protein, a protein of a multiprotein complex, an allergen, an enzyme, an enzyme inhibitor, a hormone, a hormone receptor protein, ds-DNA (ss-DNA, ss-RNA) with a specific sequence for binding a DNA- (RNA-) binding protein, a DNA- or
  • the receptor unit can be attached to one of the phosphoric acid units, to one of the thiophosphate units, to one of the thiol units, to one of the phosphoric acid amide units, to one of the sugar units, in particular to one Sugar-hydroxyl group, be attached to a carbonyl, carboxyl, amide or amine group, or to one of the bases of the nucleic acid oligomer component, in particular to a terminal 3 'or 5 ' unit.
  • the cleavable groups between the nucleic acid oligomer component and the receptor unit can also be part of a linker between the nucleic acid oligomer component and the receptor unit.
  • nucleic acid oligomer component of the nucleic acid oligomer receptor unit comprises at least any primer binding region
  • nucleic acid oligomer component of the nucleic acid oligomer receptor unit comprises any two primer binding regions.
  • primer segments that are 5 'of the coding sequence have identical sequence (preferably 8-24 bp long) and 3 'of the coding region have a sequence which is complementary to (one) primer (s) (preferably 8-24 bp long).
  • primer segments that are 5 'of the coding sequence have identical sequence (preferably 8-24 bp long) and 3 'of the coding region have a sequence which is complementary to (one) primer (s) (preferably 8-24 bp long).
  • Particularly advantageous effects result if the different types of nucleic acid oligomer receptor units in an analysis comprise identical primer binding regions.
  • This embodiment has the advantage that the nucleic acid oligomer components of the nucleic acid oligomer receptor unit, in particular those in the form of DNA, RNA or PNA, if necessary (for example after the complexes from the target and nucleic acid receptor unit and subsequent separation of the nucleic acid oligomer component) by PCR or other methods (synthesis using other DNA or RNA polymerases) can be amplified to z. B. also to detect small amounts of target and / or to provide the nucleic acid oligomer components with a detection marker.
  • a binding site for the T7, T3 or SP6 RNA polymerase is located 3 'next to the coding region or 3' next to the 3 'primer binding region, thereby resulting in an in vitro transcription of the coding sequence becomes possible.
  • the different types of nucleic acid oligomer receptor units have no mutually complementary nucleic acid oligomers and, in particular, no regions in the coding regions which are more than 75% complementary to the primer binding regions.
  • a nucleic acid oligomer receptor unit is used which, before, during or after the receptor has been linked, in one of the ways a) to d) additionally with a fluorescent dye and / or with a hapten and / or with biotin ( Avidin / streptavidin)), a uniform base sequence for binding a universal primer (when using cDNA or RNA as nucleic acid oligomer) and / or a reactive group (directly or linker / spacer-linked) is modified.
  • a specific bond is formed between a chemical substance and the receptor of the nucleic acid oligomer-receptor unit.
  • the substance specific for the respective receptor, the target is labeled in any substance mixture with the nucleic acid oligomer-receptor unit, whereby the receptor-modified nucleic acid oligomers can be used as pure substances (a modified nucleic acid oligomer) or mixtures (several different modified nucleic acid oligomers).
  • a prerequisite for the method according to the invention is the specific binding of a chemical substance to a receptor unit of the receptor-modified nucleic acid oligomers specific for this substance.
  • a substance-specific receptor with an associated specific chemical substance are:
  • Antigen including hapten
  • Antibodies monoclonal or polyclonal, antigen (including hapten) including F ab fragment
  • ds-DNA ss-DNA, ss-RNA
  • DNA- (RNA-) binding proteins of a specific sequence for binding DNA- (RNA-) binding proteins
  • RNA binding proteins ds-DNA binding proteins ds-DNA (ss-DNA, ds-RNA, ss-RNA) with a specific sequence for binding DNA (RNA) binding proteins ds-DNA (ss-DNA, ds-RNA, ss-RNA) with antagonists DNA- (RNA-) binding specific sequence for binding proteins DNA- (RNA-) binding proteins
  • Multiprotein complex Proteins of a multi-protein complex functional protein or peptide e.g. specific binding partner of a hormone receptor protein
  • a functional peptide e.g. the hormone
  • a functional peptide e.g. the hormone
  • its antagonist specific binding partner of a functional protein or peptide e.g. functional components
  • Protein or one of the hormone receptor protein) functional peptide e.g. hormone or its antagonist
  • antigens as receptors of the nucleic acid oligomer-receptor unit has the particular advantage that natural and artificially produced antibodies against this antigen can be identified. This method can also be used to detect extremely small amounts of naturally occurring antibodies (e.g. in the blood serum). In addition, a mixture with other related antigens can be tested and the positive results (antigen with bound antibody) can be separated quantitatively and in high concentration from the mixture, since the method does not require separation of the positive results in this critical phase. The antibodies can therefore also be bound in secondary immune complexes with anti-Ig antibodies, which significantly improves the quantitative immobilization with high avidity for all antibodies.
  • the conditions for the chromatographic purification can be optimized such that only the affinity of the individual antigens for the corresponding antibodies has to be taken into account. Elution can be done in fractions with increasing stringency in the washing conditions.
  • the use of antibodies as receptors of the nucleic acid oligomer-receptor unit has the particular advantage that the antibodies against the corresponding antigens have an extremely high specificity with high affinity, the spectrum of the antigens is arbitrarily broad and different physiological forms of the antigen can be distinguished. This ensures that the individual antigens can be identified quantitatively in a complex mixture without having to separate or separate them chromatographically.
  • substances which form hapten analogues can also be detected with the aid of the antibody receptors, the specificity with high affinity also allowing the differentiation of closely related (chemically similar) substances in a complex mixture with other substances which are difficult to separate chromatographically.
  • monoclonal antibodies or affinity-purified polyclonal antibodies which are only directed against a specific region or an epitope of the antigen is particularly preferred since these have an increased specificity, so that e.g. B. active and inactive isoforms, alternatively spliced, or proteolytically processed, or modified forms of the otherwise identical antigens can be distinguished.
  • the use of F ab fragments of the antibodies also has the advantage that only one antigen or hapten binds per F ab fragment and that the separation of the positive results (F ab fragment with associated antigen or hapten) is easier when using secondary immune complexes is because, unlike antibodies, F ab fragments do not bind to the affinity chromatography supports.
  • enzymes as receptors of the nucleic acid oligomer-receptor unit has the particular advantage that a known effective antagonist (or inhibitor or a group thereof) can be assigned to the previously unknown site of action (from a selection of any nucleic acid oligomer-encoded enzymes).
  • the enzymes used as receptors can be used for the quantitative detection of inhibitors, antagonists and cofactors that are not immunogenic.
  • enzymes can be indirectly linked to the nucleic acid oligomers via their cofactors. This allows e.g. B. a connection of a cofactor to the nucleic acid oligomer, which is generally not below physiological conditions must be carried out, since the cofactors are generally much more stable than the enzyme complex.
  • the cofactor can e.g. B. be bound directly to the nucleic acid oligomer during the solid phase synthesis and the nucleic acid oligomer receptor unit is subsequently completed by reconstitution (incubation with cofactor-free enzyme).
  • enzyme inhibitors and antagonists as receptors of the nucleic acid oligomer-receptor unit has the particular advantage that it is possible to search for research-relevant or therapeutically relevant inhibitors or antagonists of an enzyme (or a group of enzymes).
  • these enzyme inhibitors and antagonists used as receptors can be used for the quantitative detection of enzymes, the proportion of the active form of enzymes being selectively detected.
  • enzyme inhibitors and antagonists as long as they are simple chemical compounds, can be easily modified with nucleic acid oligomers because they i. a. do not have to be handled under physiological conditions and thus z. B. can be bound directly to the nucleic acid oligomer during solid phase synthesis.
  • ds-DNA ss-DNA, ss-RNA
  • RNA- DNA- binding proteins
  • such receptors can be used to search for previously unknown sequences which specifically bind to a DNA (RNA) binding protein (or a group of DNA (RNA) binding proteins), and from this information a consensus sequence of Binding site can be determined.
  • these nucleic acid receptor units can be used in combination with the associated targets to determine which of the complexes of ds-DNA (ss-DNA, ss-RNA) sequence and DNA- (RNA-) binding proteins is a potential antagonist acts, which not only determines a consensus binding site, but also has these functional sites a functional relevance.
  • RNA- binding proteins can be linked directly to the coding nucleic acid oligomer in solid phase synthesis. Also, these specific sequences for binding DNA- (RNA-) binding proteins do not necessarily have to be separated for detection (after formation and separation of the receptor-target complexes and possibly subsequent dissociation of the target unit).
  • DNA (RNA) binding proteins as receptors of the nucleic acid oligomer receptor unit has the particular advantage that known ds-DNA (ss-DNA, ds-RNA, ss-RNA) can be characterized with a specific sequence for binding in terms of the spectrum which DNA (RNA) binding proteins bind to these sequences. This is an important tool in promoter studies, alternative splicing and the determination of specific m-RNA transport factors. DNA and RNA binding proteins can also be used to qualitatively and quantitatively demonstrate the availability of binding sites that may be blocked due to a regulatory mechanism
  • proteins of a multiprotein complex as receptors of the nucleic acid oligomer-receptor unit has the particular advantage that multiprotein complexes can thus be detected qualitatively and quantitatively. They can also be used as so-called potential components to search for unknown binding partners for a specific protein or multiprotein complex.
  • multiprotein complexes as receptors of the nucleic acid oligomer-receptor unit has the particular advantage that it can be used to qualitatively and quantitatively detect proteins in physiologically active form that bind to a specific multiprotein complex.
  • functional protein or peptide e.g. a hormone receptor protein
  • a known effective binding partner e.g. a hormone
  • an antagonist to this binding partner or inhibitor or a group thereof
  • these proteins or peptides used as receptors for the quantitative detection of binding partners such as. B. hormones, antagonists to this binding partner (or inhibitors or cofactors) can be used, the proportion of the active form of binding partners being detected.
  • binding partners of a functional protein or a functional peptide e.g. a hormone
  • a potential antagonist as receptors of the nucleic acid oligomer-receptor unit
  • these binding partners can be used for the quantitative detection of the associated receptor proteins (e.g. the hormone receptor protein), the active form of the receptor proteins being detected with a free binding site.
  • lectins as receptors of the nucleic acid oligomer-receptor unit has the particular advantage that glycosylation patterns and / or pathological changes in the glycosylation pattern can be detected qualitatively and quantitatively.
  • lectins are particularly stable and can therefore be easily linked (under broad reaction conditions) to the nucleic acid oligomers.
  • oligoglycosides as receptors of the nucleic acid oligomer-receptor unit has the particular advantage that they serve as binding partners for various receptor proteins and so that these can be detected qualitatively and quantitatively, the active receptor proteins being detected.
  • oligoglycosides can be checked to see whether they serve as binding partners for a specific receptor protein.
  • the specific bond formation between one or more types of nucleic acid oligomer receptor units and one or more types of specific binding chemical substances (targets) can take place in any aggregate states of the nucleic acid oligomer receptor units and the targets, the targets in vitro or in vivo can be present.
  • the bond formation in a soluble environment is preferred, whereby one of the two binding partners, in particular the target (s), does not necessarily have to be in dissolved form. It can also be in the form of a precipitate, enclosed in permeable vesicles (cells), bound to / in (cell) membranes or suitable carrier materials or contained in the solution in the form of micelles.
  • the specific bond formation takes place between one or more types of nucleic acid oligomer receptor units and one or more types of specifically binding chemical substances (targets) by immobilizing the targets on a support and incubating the support-immobilized targets with the nucleic acid oligomer receptor units instead, the incubation taking place by adding the dissolved nucleic acid oligomer receptor units.
  • targets specifically binding chemical substances
  • the subsequent separation of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance from the remaining nucleic acid oligomer receptor units can be carried out by specific precipitation, filtration, centrifugation, by chromatographic methods (column chromatography, affinity chromatography, size exclusion (gel filtration), membrane chromatography etc.) or by gel electrophoresis.
  • carrier material or “chromatography material” refers to any stationary two-dimensional or three-dimensional material which, if necessary by appropriate derivatization, is suitable for one or more of the building blocks of the complex of nucleic acid oligomer. Bind receptor unit and chemical substance.
  • the chromatography material can also be bound to a "chromatography surface", the chromatography surface being understood to mean any material or surface that is applied stationary on a surface and that allows one or more of the building blocks of the complex of nucleic acid oligomer-receptor unit and chemical substance in one to bind according to the type of complexes of nucleic acid oligomer-receptor unit and chemical substance ordered grid, that is, in a defined spatially resolved arrangement of the different complexes of nucleic acid oligomer-receptor unit and chemical substance.
  • the chromatography material - if necessary after previous derivatization - is suitable, the receptor-specific substance, the target, or modifications of the receptor-specific substance (target complexes of receptor-specific substance and one or more further chemical substances which are not the nucleic acid oligomer receptor according to the invention Represent unit), as such or one or more of the building blocks of this target complex, while the non-target-occupied nucleic acid oligomer receptor units are not bound (or vice versa).
  • the targets are immobilized for incubating one or more types of targets with one or more types of nucleic acid oligomer receptor units and / or for separating the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and target from the remaining nucleic acid oligomer units.
  • Receptor units by binding to one
  • Binding to ion exchangers The target or the complex of nucleic acid oligomer receptor unit and target is bound to strong ion exchangers which have been optimized for the binding of the targets in such a way that the nucleic acid oligomer receptor units alone (without an associated target) are not bound become.
  • binding to specially modified chromatography material via two specific binding partners the target alone or the target in the complex of nucleic acid oligomer-receptor unit and target is modified with a further (second) chemical substance which represents a specific binding partner for a third chemical substance, this third chemical substance being the one with which the chromatography material has been modified.
  • Such further (second) chemical substances are e.g. B.
  • hapten analogue biotin, FITC, DNP, digoxigenin or rhodamine
  • an antigen a His tag, an HA tag, a flag tag, a GST tag, a Z domain (monovalent functional domain of Protein A), a functional protein, a chitin-binding protein, an avidin, monovalent avidin, a streptavidin or monovalent streptavidin.
  • an antibody specifically binding partner for the hapten analog, or the antigen
  • F a b fragment specifically binding partner for the hapten analog, or antigen
  • an anti- FITC antibody specifically binding partner for FITC
  • an anti-DNP antibody specifically binding partner for DNP
  • an anti-digoxigenin antibody specifically binding partner for digoxigenin
  • an anti-Rhodamine antibody or an anti-His-Tag -Antibody (specific binding partner for His-Tag)
  • an anti-HA-Tag antibody specifically binding partner for HA-Tag
  • an anti-Flag-Tag antibody specifically binding partner for Flag-Tag
  • an anti-GST Tag antibody or glutathione specifically binding partner for GST tag
  • antibody Fc fragment specifically binding partner for the Z domain
  • biotin specifically binding partner for avidin, monovalent avidi n, streptavidin, monovalent streptavidin, anti-biotin antibody or the F ab fragment of anti-biotin antibody
  • the specific binding partner of the second chemical substance can also be bound to the target alone or the target in the complex of nucleic acid oligomer-receptor unit and target, a chromatography material modified with the second chemical substance being used as the chromatography material.
  • the second and third chemical substances for connecting the target to the chromatography material are different from the second and third chemical substances for the indirect linking of Nucleic acid oligomer and receptor (see section "Binding a receptor to a nucleic acid oligomer"
  • a photocross linker which has an induction-cleavable group, such as. B. via a disulfide group, which can be cleaved reductively, ie after induction by a reducing agent (z. B.
  • DTT or ß-mercaptoethanol in the two thiol components, via a -CHOH-CHOH group, which by adding an oxidizing agent such as z. B Nal0 4 or via a -CO-0-CH 2 -CH 2 -0-CO- group, which can be cleaved by adding H 2 N-OH.
  • the chromatography material can also be modified with a photocrosslinker and the unmodified target is bound to the chromatography material before the complex of nucleic acid oligomer-receptor unit and target is formed by incubating the target with the chromatography material and irradiating light of a suitable wavelength.
  • Binding to the chromatography material via chemical binding The target alone is modified with a linker with a reactive group, in particular an activated linker, before formation of the complex of nucleic acid oligomer-receptor unit and target, such as. B. with a 4-azido group coupled by photocrosslinking to the target 4-azidobenzoic acid N-sulfosuccmimidyl ester sodium salt.
  • the connection to the chromatography material is carried out by bringing the modified target into contact with suitable chromatography material, that is to say with the necessary counter group to form a covalent chemical bond with the reactive group of the linker.
  • a linker which has a group which can be split by induction, such as, for. B. via a disulfide group, which can be cleaved reductively, ie after induction by a reducing agent (z. B. DTT or ß-mercaptoethanol) in the two thiol components, via a -CHOH-CHOH group, which by adding an oxidizing agent such as z. B Nal0 4 or via a -CO-0-CH 2 -CH 2 -0-CO- group, which can be cleaved by adding H 2 N-OH or via a photolabile group such as. B.
  • the chromatography material can also be modified with a chemical crosslinker and the unmodified target is bound to the chromatography material by incubating the target with the chromatography material before the complex of nucleic acid oligomer-receptor unit and target is formed.
  • Exist against target-occupied receptors in the complex of nucleic acid oligomer-receptor unit and target other binding partners such as.
  • B. receptor proteins such as F c - ⁇ receptors or compliment C1q, which act selectively against groups of target-occupied receptors, these can also be used to modify the column material.
  • Binding to a chromatography material modified with protein A, protein G or directed against the F c domain exist for the targets or the target in the complex of nucleic acid oligomer-receptor unit and target next to the Receptor-specific antibodies, or specific monoclonal or polyclonal antibodies (e.g. in the case of antigens or haptens as targets), the targets can be formed after the complexes of nucleic acid oligomer The receptor unit and target are incubated with the antibodies before binding these complexes to the chromatography material, as a result of which so-called primary immune complexes are formed and secondary antibodies after the addition of anti-Ig antibodies.
  • These (primary or) secondary immune complexes can be separated from the remaining non-target-occupied nucleic acid oligomer receptor units by means of chromatography material modified with protein A, protein G or with anti-Ig antibody directed against the F c domain.
  • the antibodies can also be brought into contact with the targets simultaneously with the bringing into contact with the nucleic acid oligomer-receptor units with the targets.
  • the chromatography material is saturated with the type or types of targets, e.g. B. analogous to methods a) to d) in the section "separation of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and target from non-target-occupied nucleic acid oligomer receptor units").
  • targets e.g. B. analogous to methods a) to d) in the section "separation of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and target from non-target-occupied nucleic acid oligomer receptor units"
  • the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and target are not separated from the remaining nucleic acid oligomer receptor units by binding to a chromatography material.
  • targets insoluble in aqueous media e.g. B. insoluble proteins as targets
  • the complex formation between nucleic acid oligomer receptor unit and target can be done by incubating a suspension of the targets with the dissolved nucleic acid oligomer receptor units.
  • aqueous medium is understood to mean all solutions with the main constituent water.
  • the soluble ones are not occupied Nucleic acid oligomer receptor units separated by centrifugation or filtration (pelleting of the complex, together with remaining insoluble material). Even with targets with a high molecular weight compared to the molecular weight of the nucleic acid oligomer receptor units, the soluble, unoccupied nucleic acid oligomer receptor units can be separated off by centrifugation after complex formation has taken place. In the case of targets which are large in comparison to the nucleic acid oligomer receptor units, the unoccupied nucleic acid oligomer receptor units can be separated off by size exclusion (gel filtration) or filtration.
  • target-filled nucleic acid oligomer-receptor units can be used as secondary immune complexes (cf. Method f) in the section "separation of the complexes of nucleic acid-oligomer-receptor unit and target from non-target-filled nucleic acid oligomer-receptor units") by filtration or centrifugation (Immunoprecipitation) from the remaining components of the test solution.
  • the present invention also comprises a method for the detection of chemical substances, comprising the steps (i) providing one or more chemical substances, (ii) providing one or more types of nucleic acid oligomer receptor units, (iii) contacting the chemical Substances with the nucleic acid oligomer receptor units, whereby complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance are formed, (iv) binding of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance to a suitable chromatography material, thereby separating them from the into the eluate non-target-occupied nucleic acid oligomer receptor units, (v) cleavage of one or more chemical bonds of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance bound to the chromatography material such that the nucleic acid oligomer component de r nucleic acid oligomer receptor unit in the form of a nucleic acid oligomer or in the form of any modified nucleic acid oligo
  • the soluble, unoccupied nucleic acid oligomer receptor units can be separated off by centrifugation after complex formation or in comparison to the nucleic acid oligomer -Receptor units large targets the unoccupied nucleic acid oligomer receptor units are separated by size exclusion (gel filtration).
  • the chemical substances can be detected by a method with the following steps: (i) providing one or more chemical substances, (ii) providing defined amounts of one or more types of nucleic acid oligomer receptor units, (iii) contacting the chemical substances with the defined amounts of nucleic acid oligomer receptor units, whereby complexes are formed from nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance, (iv) binding of the complexes from nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance to a suitable chromatography material, whereby a separation from the non-target-populated nucleic acid oligomer receptor units which pass into the eluate takes place, and finally (v) detection of the nucleic acid oligomer components of the non-target-populated nucleic acid oligomer receptor units located in the eluate directly as nucleic acid reoligomer-receptor unit or after cleavage of the nucleic acid oligomer component from the receptor unit as
  • Nucleic acid oligomer or modified nucleic acid oligomer comprising the complete sequence information of the nucleic acid oligomer by a suitable method.
  • the soluble, unoccupied nucleic acid oligomer receptor units can be separated off by centrifugation after complex formation has taken place, or in the case of large targets compared to the molecular weight of the nucleic acid oligomer receptor units Targets that are not occupied by nucleic acid oligomer receptor units are separated by size exclusion (gel filtration).
  • the chemical substances can be detected by a method with the following steps: (i) providing one or more chemical substances, (ii) binding the chemical substances to a chromatography material, (iii) providing one or more types of nucleic acid oligomer -Receptor units, (iv) bringing the nucleic acid oligomer receptor units into contact with the chemical substances bound to the chromatography material, as a result of which complexes are formed from the nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance and thus a separation from the non-target which passes into the eluate occupied nucleic acid oligomer receptor units, (v) cleavage of one or more chemical bonds of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance bound to the chromatography material such that the nucleic acid oligomer component of the nucleic acid eoligomer-receptor unit in the form of a nucleic acid oligomer or in the form of any modified nucleic acid oli
  • the chemical substances can be detected by a method with the following steps: (i) providing one or more chemical substances, (ii) binding the chemical substances to a chromatography material, (iii) providing defined amounts of one or more species of nucleic acid oligomer receptor units, (iv) contacting the defined amounts of nucleic acid oligomer receptor units with the chemical substances bound to the chromatography material, as a result of which complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance take place and thus a separation from the non-target-populated nucleic acid oligomer receptor units passing into the eluate, and finally (v) detection of the nucleic acid oligomer components of the non-target-populated nucleic acid oligomer receptor units present in the eluate directly as nucleic acid oligomer recipe tor unit or after the spin-off Nucleic acid oligomer component from the receptor unit as
  • Nucleic acid oligomer or modified nucleic acid oligomer comprising the complete sequence information of the nucleic acid oligomer by a suitable method.
  • the present invention also relates to a method for the detection of substances insoluble in aqueous media, in particular insoluble proteins, comprising the steps (i) providing one or more types of insoluble substances, in particular insoluble proteins, (ii) providing one or more types nucleic acid oligomer receptor units, contacting the insoluble proteins with the nucleic acid oligomer receptor units, thereby forming complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and insoluble protein, (iii) separating the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and insoluble protein of non-target-occupied nucleic acid oligomer receptor units, (iv) cleavage of one or more chemical bonds of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and insoluble protein in such a way that the nucleic acid oligomer component of the nucleic acid oligomer -Receptor unit in the form of a nucleic acid oligomer or in the form of any modified nucleic acid oli
  • steps (iii) separating the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and insoluble protein from non-target-occupied nucleic acid oligomer receptor units and (v) separating the dissolved nucleic acid oligomer separated from the insoluble protein Components carried out by centrifugation.
  • the unoccupied nucleic acid oligomer receptor units and / or in step (v) the dissolved nucleic acid oligomer components separated from the insoluble protein can be separated by size exclusion (gel filtration).
  • the present invention also relates to a method for the detection of hapten analogs comprising the steps of (i) providing one or more hapten analogs, (ii) providing an excess of one or more types of nucleic acid oligomer receptor units (relative to the hapten analogs provided in step (i)), (iii) contacting the provided hapten analogs with the nucleic acid oligomer receptor units, as a result of which complexes are formed from the nucleic acid oligomer receptor unit and the hapten analog, (iv) Providing an excess of the hapten analogs provided in step (i) in the form of carrier-modified hapten analogs, (v) contacting the modified hapten analogs provided in step (iv) with the mixture of excess nucleic acid oligomer formed in step (iii) -Receptor units and complexes formed from nucleic acid oligomer-receptor unit u nd hapten analog, resulting in complexes from
  • the modification of the modified hapten analogs provided in step (iv) consists in the attachment of a carrier molecule to the hapten analogs in which a specific type of carrier molecule is bound to each type of hapten analog which meets the condition that the binding of the carrier molecule does not result in a significant change in the specific binding capacity of the epitope of the hapten analogs for binding the receptor component of the nucleic acid oligomer-receptor unit.
  • step (vi) in the case of carriers with a high molecular weight compared to the molecular weight of the nucleic acid oligomer receptor units occupied with hapten analogue after complex formation, the complexes of carrier-modified hapten analogue and nucleic acid oligomer receptor unit can be centrifuged from the Complexes with hapten analogue and nucleic acid oligomer receptor unit are separated or, in the case of carriers which are large compared to the nucleic acid oligomer receptor units occupied with hapten analogue, the complexes of carrier-modified hapten analogue and nucleic acid oligomer receptor unit by size exclusion (Gel filtration) are separated from the complexes of hapten analogue and nucleic acid oligomer receptor units.
  • size exclusion Gal filtration
  • the present invention also comprises a method for the detection of chemical substances, comprising the steps (i) providing one or more chemical substances, (ii) providing one or more types of nucleic acid oligomer receptor units, (iii) contacting the chemical Substances with the nucleic acid oligomer receptor units, whereby complexes are formed from the nucleic acid oligomer receptor unit and chemical substance, (iv) binding of the nucleic acid oligomer receptor units to a chromatography material modified with the targets, thereby separating them from the eluate passing target-occupied nucleic acid oligomer receptor units, and finally (v) detection of the nucleic acid oligomer components of the target-containing nucleic acid oligomer receptor units located in the eluate directly as nucleic acid oligomer receptor unit or after cleavage of the nucleic acid oligo mer component of the receptor unit as a nucleic acid oligomer or modified nucleic acid oligomer, which comprises the complete sequence
  • the present invention also comprises a method for the detection of antagonists for binding partners of receptor proteins or enzymes, comprising the steps (i) providing one or more types of binding partners of receptor proteins or enzymes, (ii) providing one or more types of nucleic acid oligomer receptor -Units being the receptor represents a potential antagonist of the binding partners of receptor proteins or enzymes, (iii) providing an excess of chromatography material modified with the targets receptor proteins or enzymes (compared to the nucleic acid oligomer-receptor units), (iv) contacting the one provided in step (ii) or several types of nucleic acid oligomer receptor units with the target-modified chromatography material provided in step (iii), thereby forming complexes of nucleic acid oligomer-receptor unit and target-modified
  • nucleic acid oligomer receptor unit or after cleavage of the nucleic acid oligomer component from the receptor unit as
  • Nucleic acid oligomer or modified nucleic acid oligomer comprising the complete sequence information of the nucleic acid oligomer by a suitable method.
  • an elution step with a known antagonist is additionally carried out after the fractional elution with the binding partners, and the nucleic acid oligomer constituents obtained in this way are separately detected by a suitable method.
  • the step of cleaving one or more chemical bonds of the complexes of nucleic acid oligomer-receptor unit and modified chromatography material is additionally carried out in such a way that the nucleic acid oligomer component of the nucleic acid oligomer receptor unit is in the form of a nucleic acid oligomer or in the form of any modified nucleic acid oligomer separated from the target-modified chromatography material is inserted and the nucleic acid oligomer components thus obtained are separately detected by a suitable method.
  • an ion exchange material is used as the chromatography material, which has been optimized in this way for the binding of the targets that the nucleic acid oligomer receptor units alone (without an associated target) are not bound.
  • methods IA, IB, IIA, and IIB use chromatography material to immobilize the targets in the course of incubating one or more types of targets with one or more types of nucleic acid oligomer receptor units and / or in In the course of the separation of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and target from the remaining nucleic acid oligomer receptor units according to one of the steps b) to f) in the section "Separation of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and target from non-target-occupied nucleic acid oligomer -Receptor units "methods described.
  • one or more types of complexes of carrier-modified hapten analogue with one or more types of nucleic acid oligomer receptor units and / or in the course of incubation are used the separation of the complexes of carrier-modified hapten analog and nucleic acid oligomer receptor unit from the remaining complexes of hapten analog and nucleic acid oligomer receptor units according to one of the b) to f) in the section "separation of the complexes of nucleic acid oligomer receptor Unit and target of non-target-occupied nucleic acid oligomer receptor units "methods described, only in this case - in the methods described, the term "target” or grammatical equivalents is to be replaced by the term "carrier-modified target” or grammatical equivalents.
  • the target is applied according to one of the methods described under b) to f) in the section “separation of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and target from non-target-occupied nucleic acid oligomer receptor units” the chromatography material bound.
  • the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and target can be separated from the remaining nucleic acid oligomer receptor units by specific precipitation, filtration, centrifugation, by chromatographic methods or by gel filtration.
  • the subsequent identification and quantification of the receptor-specific substances bound to the respective receptors of the receptor-modified nucleic acid oligomers is carried out by an indirect method in which the receptor-specific substances (targets) are determined on the basis of the oligonucleotide tag on the receptor, which is clearly for a specific receptor and thus the corresponding one encoded receptor-specific substance.
  • target-populated nucleic acid oligomer receptor units are replaced by non-target-populated nucleic acid oligomer receptor units (process alternatives IA, IB, IIA, IIB, and III) or of nucleic acid oligomer receptor units which are occupied by a carrier-modified target (process alternative IV) or complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and target of nucleic acid oligomer receptor units which are bound to targets bound to chromatography material (process alternative V) separated.
  • either the dissolved, separated, non-target-occupied nucleic acid oligomer receptor units are detected on the basis of their nucleic acid oligomer components (see below), these dissolved, separated, non-target-occupied nucleic acid oligomer components Receptor units can be used directly or after separation of the nucleic acid oligomer component from the nucleic acid oligomer receptor unit, or the separated immobilized target-containing nucleic acid oligomer receptor units can be used after separation of the nucleic acid oligomer component from the immobilized complexes.
  • either the detached target-occupied nucleic acid oligomer receptor units are detected on the basis of their nucleic acid oligomer constituents (see below), these detached target-occupied nucleic acid oligomer receptor units detached directly or after the nucleic acid oligomer constituent has been separated from the nucleic acid oligomer -Receptor unit can be used.
  • nucleic acid oligomer components of the separated, non-target-containing nucleic acid oligomer receptor units are based on the difference between the originally used and finally separated, nucleic acid oligomer receptor units quantitatively and qualitatively representative of the specific chemical substance (the target), which was originally contained in the sample solution.
  • the nucleic acid oligomer components of the separated immobilized target occupy nucleic acid oligomer receptor units (method IA, IB, IIA, IIB and III) or the nucleic acid oligomer components of the separated complexes of target and nucleic acid oligomer receptor unit (method IV) or die the nucleic acid oligomer constituents of the separated, dissolved nucleic acid oligomer receptor units (method VI) represent, quantitatively and qualitatively, the specific chemical substance (the target) which was originally contained in the sample solution.
  • This separation of the nucleic acid oligomer constituents which is necessary or alternatively possible in the method, can be carried out in the following way:
  • Receptor units with guadinium hydrochloride components of these complexes are denatured so that these complexes dissociate and the nucleic acid oligomer component as such or in the form of any modified nucleic acid oligomer component which comprises the complete sequence information of the nucleic acid oligomer is separated ,
  • nucleic acid oligomer receptor unit When using nucleic acid oligomer receptor units which were formed according to one of the preferred embodiments of the binding types a) to c) in the section "binding a receptor to a nucleic acid oligomer", the nucleic acid oligomer receptor can Unit can be split into a nucleic acid oligomer and a receptor component by incubation with the necessary induction agent.
  • nucleic acid oligomer receptor unit When using nucleic acid oligomer receptor units which were formed according to one of the embodiments of the binding type d) in the section "binding a receptor to a nucleic acid oligomer", the nucleic acid oligomer receptor unit can be incubated with an antagonist of one of the two conjugated chemical substances, which were used for the indirect, non-covalent binding between receptor and nucleic acid oligomer are cleaved. If necessary, the incubation is carried out with a clear excess of the antagonist.
  • C) Cleavage of the bond between target and carrier Are the target-occupied nucleic acid oligomer receptor units in the method IA or IIA or the complexes of carrier-modified target and nucleic acid oligomer receptor unit according to one of the methods c) or d) in the section "Separation of the complexes of nucleic acid oligomer receptor unit and target from non-target-occupied nucleic acid oligomer receptor units" bound to chromatography material, the bound complex can be incubated with the necessary Induction agents are separated from the chromatography material.
  • the attached complex can be incubated with an antagonist of one of the two conjugated chemical substances that were used for the indirect, non-covalent connection to the chromatography material , are separated from the chromatography material. If necessary, the incubation is carried out with a clear excess of the antagonist.
  • the methods according to the present invention can be used to label or to detect one or more types of antigens and proteins.
  • the use for labeling or for detecting at least one type of native, denatured or partially denatured protein or antigen is particularly preferred.
  • the methods according to the invention are used for labeling or for the detection of antibodies, antigens or hapten analogues.
  • nucleic acid oligomer receptor units are provided which are selected by linking one or more identical or different functional chemical compounds selected from the group consisting of dye, in particular fluorescent dye, redox-active substance , in particular quinones and transition metal complexes, biotin, hapten, avidin, in particular monovalent avidin and streptavidin, in particular monovalent streptavidin, and / or are additionally modified by a radio label, in particular by 35 P, 32 S, 14 C or 3 H.
  • these nucleic acid oligomer receptor units cannot be provided in a modified form, but the modification can only take place during a method according to the invention.
  • the modification can before any step performed after the step of "providing one or more types of nucleic acid oligomer receptor units".
  • nucleic acid oligomer component of the nucleic acid oligomer receptor unit represents a DNA or RNA sequence and comprise at least any primer binding region are very particularly preferred.
  • an amplification of the nucleic acid oligomer components in particular by RNA polymerases or by DNA polymerases such as. B. in the polymerase chain reaction (PCR).
  • Embodiments are very particularly preferred according to which a defined amount of a nucleic acid oligomer is added before the joint amplification of the one or more types of nucleic acid oligomer components, the added nucleic acid oligomer comprising the same or the same primer sections as the nucleic acid oligomer components.
  • a primer is particularly preferably used which bears a detection marker.
  • the prerequisite for the method according to the invention is the identification and quantification of the receptor-specific substances (targets).
  • the detection of the chemical substances is carried out indirectly via the detection of the separated nucleic acid oligomer component (see above), the detection of the nucleic acid oligomer component via hybridization to a complementary nucleic acid oligomer being preferred.
  • the detection of the hybridization events is electrochemical, in particular amperometric, cyclovoltametric, impedance spectroscopic, potentiometric, by optical spectroscopy, in particular absorption or fluorescence measurement, by vibration spectroscopy, in particular IR, Raman, FTIR or FT- Raman spectroscopic, by total reflection methods, in particular attenuated total reflection, by quartz-crystal-micro-balance, by surface plasmon resonance, by chemiluminescence measurement or by radioactivity measurement.
  • the simultaneous detection of different nucleic acid oligomer constituents is particularly preferred by means of a uniform type of hybridization, as described in the previous paragraph, in particular the detection on so-called DNA chips or so-called dot plot membranes.
  • the present invention also includes a kit for labeling chemical substances, a kit for the detection of chemical substances, a kit for the detection of proteins, a kit for the detection of proteins insoluble in aqueous media, a kit for the detection of antibodies, a kit for the detection of antigens , a kit for the detection of hapten analogs, a kit for the detection of DNA and / or RNA binding proteins and a kit for the detection of the antagonists of DNA and / or RNA binding proteins, a kit for screening for antagonists for binding partners of Enzymes and receptor proteins and a kit for screening hybridoma cells with simultaneous epitope mapping.
  • kits according to the invention comprises an effective amount of one or more types of nucleic acid oligomer receptor units as used in the methods according to the present invention.
  • kits which additionally comprises primers are preferred, in particular primers modified with rhodamine or fluorescin.
  • each kit which additionally comprises the nucleotide building blocks dCTP, dGTP, dATP and dTTP is particularly preferred, a set of nucleotides which includes at least one type of fluorescent dye-modified nucleotide being particularly preferred.
  • kits which additionally comprises a chromatography cartridge for separating the target-containing nucleic acid oligomers is also particularly preferred.
  • the kits preferably additionally comprise a chromatography column coated with biotin.
  • a kit which additionally comprises a gel filtration cartridge is also particularly preferred.
  • a kit is very particularly preferred, the receptor unit being one or more of the types of nucleic acid oligomer receptor encompassed by the kit. Units contain an anti-Biotin-F ab fragment, a monovalent avidin or a monovalent streptavidin.
  • Kits comprising an effective amount of one or more types of nucleic acid oligomer receptor units as used in the methods according to the present invention are particularly preferred. Kits which additionally comprise biotinylated peptides, polypeptides or proteins are particularly preferred.
  • kits which contains an anti-biotin Fab fragment, a monovalent avidin or a monovalent streptavidin as the receptor of the one or more of the types of nucleic acid oligomer receptor units included in the kit.
  • a kit which additionally contains one or more types of biotinylated receptors is particularly preferred.
  • kits which contains an anti-digoxigenin Fab fragment as the receptor of the one or more of the types of nucleic acid oligomer receptor units included in the kit.
  • a kit which also contains one or more types of digoxigenin-labeled receptors is particularly preferred.
  • kits that contains an anti-FITC Fab fragment as the receptor of the one or more of the types of nucleic acid oligomer receptor units included in the kit.
  • a kit which additionally contains one or more types of FITC-labeled receptors is particularly preferred.
  • the one or more of the types of nucleic acid oligomer receptor units included in the kits according to the invention are dissolved in a solvent.
  • a phosphate buffer is particularly preferably contained as solvent.
  • L linker
  • P1 primer binding region
  • K coding sequence
  • P'2 primer binding region
  • R receptor unit
  • FIG. 3 flow chart of a variant of the method according to the invention (the
  • Abbreviation X corresponds to that in FIG. 1): Target 1 to 3 are modified in a first step "A” with identical tags, then in a second step “B” with different nucleic acid oligomer receptor units (receptor unit 2 to 4 with receptor-specific Affinity for target 2 to 4) for binding formation, then this mixture is added to a chromatographic column modified with the binding partner specific for the day (e.g.
  • the non-target-containing nucleic acid oligomer receptor unit being the receptor Unit 4 passes into the eluate and is thus separated from the target-occupied nucleic acid oligomer receptor unit receptor units 2 and 3; finally either the one remaining in the eluate Receptor unit 4 or - after step D, cleavage of functional group X (z. B. SS group) and elution of the nucleic acid oligomer components of receptor units 2 and 3 - the nucleic acid oligomer components of receptor units 2 and 3 using their coding sequence, in both detection variants it follows that the test solution contained the targets 2 and 3, but not the target 4, of the targets sought by the DNA receptors 2 to 4.
  • Example 1 Construction of the nucleic acid oligomer for solid phase synthesis, usable for labeling a receptor unit:
  • nucleic acid oligomer consists 5'-terminal of the universal sequence P1 (primer binding region, e.g. 12 bases long), which has the identical sequence as a universal primer, a sequence K, which is linked to a specific one Receptor unit represents the label specific for this receptor unit (the coding sequence), and 3'-terminally from a further universal sequence P'2 (primer binding region 2, for example 12 bases long), which can be used to sequence a universal one Primer 2 is complementary.
  • P1 primer binding region, e.g. 12 bases long
  • sequence K which is linked to a specific one Receptor unit represents the label specific for this receptor unit (the coding sequence)
  • P'2 primer binding region 2, for example 12 bases long
  • Regions P1 and P'2 are used for later amplification of the base sequence of the nucleic acid oligomer by PCR. If a complete target analysis is to be carried out on one and the same chip and the targets are present in extremely different concentrations, it is also possible to use different primer pairs for different groups, the respective primer binding regions P1 and P'2 passing through corresponding sequences, e.g. B. Primer binding region 2-1 and 2-'2 on nucleic acid oligomer receptor units for targets with low representation, and primer binding region 3-1 and 3-'2 on nucleic acid oligomer receptor units for targets with very low representation, so that these groups of nucleic acid oligomers can be selectively amplified.
  • the selection criteria for the construction of different primers is that they all have the same GC content and the same length, but differ from one another or from the complementary sequences in at least 60% of the bases.
  • the length of the specific region K (including adjacent bases of the primer binding regions), which is used for the detection by hybridization with probe nucleic acid oligomers (cf. Example 19), can vary depending on the GC content of the sequence, the length advantageously being so is chosen that the respective melting point T m of the hybridized nucleic acid oligomers (calculated according to Bolton and McCarthy, 1962) for all nucleic acid oligomers of an analysis do not differ by more than 0.5 ° C.
  • sequence of the coding region K is advantageously chosen such that each specific coding region K differs from any other specific coding region by at least 4 bp, the base mismatches being distributed over the whole molecule in a particularly favorable embodiment, none of the coding sequences to another or is complementary to the primer binding regions and the sequences are not palindromic over more than 75% of the coding sequence.
  • the nucleic acid oligomer is also provided directly or via a spacer with a reactive group, such as a covalently linked C6-NH 2 unit (hexyl-NH 2 ), which bridges the direct or via an additional linker bridged connection of a specific receptor unit (or certain group of receptor units) is used. Furthermore, the nucleic acid oligomer is modified with a detection marker such as rhodamine, which is used for the later detection of the nucleic acid oligomer (the choice of the detection marker being adapted to the type of nucleic acid oligomer detection method).
  • a detection marker such as rhodamine
  • Example 2 Linking a linker which can be cleaved by reduction to a synthetic nucleic acid oligomer:
  • the commercially available oligonucleotide from Example 1 is used as the synthetic nucleic acid oligomer, which carries a C6 linker with a functional NH 2 group at the 3 'end and a rhodamine (oligol) at the ⁇ ' end.
  • 50 ⁇ g of the nucleic acid oligomer and 50 ⁇ g dithio-bis- (sulfosuccinimidyl) propionate are dissolved in 100 ⁇ l potassium phosphate buffer (50mM, pH 8) and incubated for 2-4 hours in the dark at room temperature.
  • the incubation solution is placed on a Biogel PD6 column, which was previously equilibrated with MES buffer (10mM pH 6.0). The column is eluted with MES buffer (10mM pH 6.0).
  • the first fluorescent fraction contains the Oligo2 m ⁇ d-
  • the Oligo2 m0 d is cooled to 0 ° C by adding 5M NaCl ( ⁇ A of the elution volume of the Oligo2 m ⁇ d fraction, and ethanol (3 ⁇ A times the elution volume of the Oligo2 m0d fraction , cooled to -20 ° C.) and then centrifuged at 4 ° C. (30 min at 15000 ⁇ g), the precipitate is washed with ethanol at ⁇ 20 ° C. and dried.
  • Example 3 Linking a light-cleavable linker to a synthetic nucleic acid oligomer:
  • Oligonucleotide from Example 1 used which carries a C6 linker with a functional NH 2 group at the 3 'end and a rhodamine at the 5' end.
  • An azo compound is used as the linker, which is caused by the irradiation of light in the wavelength range can be split by 350 nm. Therefore, when connecting this linker to the nucleic acid oligomer, work must be carried out under dim light or red light.
  • 4 nmoles (approx. 50 ⁇ g) of the nucleic acid oligomer and 50 ⁇ g 4,4′-dihydroxyazobenzene-3,3'dicarboxylic acid are dissolved in 50 ⁇ l MES buffer (100 mM, pH 6.0) and combined.
  • the solution After adding 50 ⁇ g EDC and 70 ⁇ g NHS, the solution is incubated for 2 hours at room temperature and then for 12 hours at 4 ° C.
  • the incubation solution is placed on a Biogel PD6 column, which was previously equilibrated with MES buffer (10mM pH 6.0). The column is eluted with MES buffer (10mM pH 6.0).
  • the first fluorescent fraction contains the Oligo3 m ⁇ d-
  • the Oligo3 mod is added by adding 5M NaCl (% of the elution volume of the Oligo3 m ⁇ d fraction, cooled to 0 ° C), and ethanol (3 A times the elution volume of the Oligo3 m ⁇ d fraction, cooled to -20 ° C) and subsequent centrifugation at 4 ° C (30min at 15000 xg). The precipitate is washed with ethanol at -20 ° C. and dried.
  • the commercially available synthetic oligonucleotide from Example 1 is used as the synthetic nucleic acid oligomer, which carries at the 3 'end a C6 linker with a functional NH 2 group at the ⁇ ' end of a rhodamine (oligol).
  • An active ester (for binding to the oligol -NH 2 group) is used as linker, which additionally has a terminal azido group which can be bound to any other substance by irradiation with light in the wavelength range around 350 nm. Therefore, when connecting the ester to the Oligol -NH 2 group, work must be carried out under dim light or red light.
  • nucleic acid oligomer 50 nmol of the nucleic acid oligomer are taken up in 0.7 ml sterile water and mixed with 100 ⁇ l carbonate buffer (1M NaHC0 3 / Na 2 C0 3 , pH 9).
  • the linker 4-azidobenzoic acid N-sulfosuccinimidyl ester sodium salt 5 ⁇ mol is dissolved in 200 ⁇ l carbonate buffer (0.1 M NaHC0 3 / Na 2 CO 3 , pH 9) and added to the oligol solution. You react overnight.
  • the first fluorescent fraction contains the Oligo4 m0 d-
  • the Oligo4 m ⁇ d is cooled to 0 ° C by adding 5M NaCl (Y 4 of the elution volume of the Oligo4 m ⁇ d fraction) and ethanol (3 V times the elution volume of the Oligo4 m0 d fraction , cooled to - 20 ° C.) and subsequent centrifugation at 4 ° C. (30 min at 15000 ⁇ g), the precipitate is washed with ethanol at ⁇ 20 ° C. and dried.
  • Example 5 Linking a nucleic acid oligomer with an antibody as a receptor unit and determining the number of attached nucleic acid oligomers per antibody:
  • nucleic acid oligomer contains a fluorescent label or a photolabile group in the linker, you must work under dim light or red light.
  • nucleic acid oligomer now terminated with an activated ester is isolated and purified as described in Examples 2 and 3, respectively.
  • the nucleic acid oligomer is dissolved in 50 ⁇ l potassium phosphate buffer (50 mM, pH 7.2, 150 mM NaCl) and combined with a solution of 150 ⁇ g of the F ab fragment of a monoclonal antibody in 20 ⁇ l PBS.
  • the reaction solution is allowed to react for 4 hours at room temperature and for a further 14 hours at 4 ° C.
  • the reaction solution is then applied to a Sephacryl S200 column, which was previously equilibrated with PBS. It is eluted with PBS.
  • the first fluorescent fraction contains the nucleic acid oligomer-F a fragment complexes (approx. 60kDa), the second fluorescent fraction contains the nucleic acid oligomers not linked to the F ab fragment (approx. 13kDa).
  • the number of DNA units per F ab fragment is determined by the ratio of the concentration of the nucleic acid oligomer, determined from the rhodamine fluorescence at 575 nm, b to the concentration of F a fragments, ideally determined by immunoprecipitation with a radioactively labeled antigen, or with an enzyme-labeled antigen (RIA, or EIA) or an alternative method as in (iii ) described.
  • RIA enzyme-labeled antigen
  • Oligo4 mod from Example 4 is used as the nucleic acid oligomer.
  • Oligo4 m ⁇ d (0.5mg) is dissolved in 100 ⁇ l potassium phosphate buffer (50mM, pH 7.2, 150mM NaCI) and combined with a solution of 150 ⁇ g of the F ab fragment of a monoclonal antibody in 30 ⁇ l PBS. This solution is irradiated for 30 min with the light of a xenon lamp with a 330 to 350 nm interference filter attached.
  • the reaction mixture is then applied to a Sephacryl S200 column which was previously equilibrated with PBS. It is eluted with PBS.
  • the first fluorescent fraction contains the nucleic acid oligomer-F ab fragment complexes (approx. 60 kDa), the second fluorescent fraction contains those that are not linked to the F ab fragment
  • Nucleic acid oligomers (approx. 13kDa). The efficiency of the marking is determined as under (i).
  • (iii) Possibilities for determining the number of linked nucleic acid oligomers per Fab fragment
  • the amount of attached nucleic acid oligomers can be determined according to one of the known methods such as fluorescence, radioactivity, etc., depending on the detection marker of the nucleic acid oligomer (fluorophore, 35 P / 32 S, hapten etc.). If the nucleic acid oligomer does not have a detection marker, it can be quantified by hybridization with a labeled nucleic acid oligomer with a complementary sequence that bears a detection marker, or by a more detailed analysis of the absorption spectrum between 240nm and 300nm.
  • the amount of the F ab fragments is ideally carried out by immunoprecipitation with a radioactively labeled antigen, alternatively with an enzyme-labeled antigen:
  • a radioactively labeled antigen for this purpose, different defined amounts of the labeled antigen are added to a defined mega of the receptor unit and determines the maximum amount of antigen precipitated (radioactive detection or via enzyme-dependent chemiluminescence).
  • the advantage of this method is that it also proves that the isolated F ab fragments are intact.
  • an ELISA system with anti-F ab antibodies can be set up if the antigen is not available.
  • HeLa cells are mixed in PBS (in 9 times the volume of the cell pellet) with the additives PMSF (1mM) and EDTA (1mM), optionally with further protease inhibitors, and gently digested with a Potter.
  • the core fraction is then centrifuged (pelleted) together with the insoluble protein fraction (ECM / cytoskeleton) at 800 x g for 15 minutes.
  • the membrane fractions are then separated from the supernatant (centrifugation at 25,000 x g for 60 min and at 240,000 x g for 30 min). All manipulations are carried out at 4 ° C.
  • the supernatant contains the soluble cytoplasmic proteins and can be stored at -20 ° C to - 80 ° C.
  • individual membrane fractions with a specific composition can be isolated using sucrose density centrifugation).
  • the pellet of the membrane fractions at 4 ° C can be resuspended in PBS with PMSF (1mM) and further disrupted with ultrasound.
  • the membranes are centrifuged at 240,000 x g for 30 minutes.
  • the supernatant contains soluble proteins from cell organelles and can be stored at -20 ° C to -80 ° C.
  • the pellet contains the membrane proteins and some large protein complexes such as Ribosomes, and can be stored at -20 ° C to -80 ° C.
  • the pellet of core fraction and insoluble protein fraction is ultrasonically resuspended at 4 ° C.
  • the insoluble protein fraction is centrifuged out of the suspension at 800 x g for 15 min. It mainly contains cytoskeletal proteins and parts of the core membrane. The supernatant becomes the main core membrane fraction at 240,000 x g for 30 min. centrifuged. The supernatant contains soluble proteins from the cell nucleus.
  • Example 7 Isolation of proteins from HeLa cells under denaturing conditions:
  • Cells are taken up in PBS with 6M urea, 1% SDS and 1mM PMSF, briefly heated to 100 ° C (2 min) and treated with ultrasound for 3 min. The insoluble constituents are then centrifuged off at 240,000 ⁇ g for 30 min. The supernatant contains the soluble but denatured proteins. The pelleted insoluble constituents are resuspended in PBST using ultrasound and centrifuged again to remove urea and SDS (240,000 ⁇ g, 30 min). The pellet contains the insoluble protein fraction.
  • the advantage of this method is that almost all proteins are solubilized by this method, but the buffer conditions require a buffer change before adding antibodies (or F ab fragments).
  • the entire fraction of the soluble proteins is applied to a Biogel PD6 column, which has been equilibrated with RIPA buffer, eluted with RIPA buffer and the protein fractions collected.
  • the fraction can be bound to nitrocellulose: 90 ⁇ l of RIPA buffer and 40 ⁇ l of methanol are added to 10 ⁇ l of the fraction of soluble proteins, and an aliquot of 50 ⁇ l is bound to nitrocellulose and one PVDF membrane. The membranes are then washed with PBS, then with PBST (PBS with 0.1% Tween20). Finally, the remaining free binding sites are blocked with 1 mg of recombinant ⁇ -galactosidase in PBST and washed again with PBST.
  • Example 8 Immobilization of the Soluble Native Cytoplasmic Proteins from Example 6 on Chromatography Material:
  • each of the soluble native cytoplasmic protein fractions in PBS from Example 6 (from the first digestion - cytoplasmic proteins, soluble fraction from core and membrane fractions) are immobilized on RP18 or PVDF material or on nitrocellulose material (application of the supernatants).
  • the columns are then washed with PBS and then with PBST (PBS with 0.1% Tween20). Finally, the remaining free binding sites are blocked with 1 mg of recombinant ⁇ -galactosidase in PBST and washed again with PBST.
  • each of the desired nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments which were produced according to Example 5, are diluted in PBS in the smallest possible volume (or in a column volume) placed on the column or membrane.
  • the nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments are allowed to bind to the proteins immobilized on the chromatography material for 1 hour at room temperature and for a further 16 hours at 4 ° C., and washed with PBST and phosphate wash buffer (50 mM potassium phosphate pH 7.5, 500 mM NaCl).
  • the reaction solution is then placed on a Biogel PD6 column which was previously equilibrated with PBS, it is eluted with PBS and the protein fractions are collected (purification step).
  • 0.02 ⁇ g of the desired nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments, which were produced according to Example 5, are added to the combined protein fractions.
  • the nucleic acid oligomer-labeled F a fragments are then allowed to bind to the antigens for 1 hour at room temperature and for a further 16 hours at 4 ° C.
  • the entire sample (diluted in approximately one column volume) is placed on an affinity chromatography column which is coated with anti-FITC antibodies.
  • the FITC-labeled antigens are allowed to bind for about 1 hour at room temperature (and possibly for a further 12 hours at 4 ° C), washed with PBST, then with phosphate wash buffer (50 mM, pH 7.2, 500mM NaCI) and isolated the nucleic acid oligomer unit according to a method described in the following examples (17-19).
  • the washing steps remove the remaining free nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments from the column, and only complexes of these nucleic acid oligomer F ab fragments with the target remain on the column, so that the nucleic acid oligomer units isolated from the column correspond to the amount of target correspond.
  • the reaction tubes are rinsed with PBST and PBS before use.
  • 0.01 ⁇ g of the desired nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments which were prepared according to Example 5, are added to 5 ⁇ l of the soluble native cytoplasmic protein fractions in PBS.
  • a different epitope than the nucleic acid-labeled Fab fragments depending 12:05 micrograms specific antibodies, and allows for 1 hour at room temperature and another 16 hours at 4 ° C, the nucleic acid-labeled F from - Bind fragments and the antibodies to the antigens.
  • IgG antibodies are preferably used for this.
  • anti-Ig antibodies When using other antibodies such as IgE, IgM, or IgA, additional anti-Ig antibodies are added.
  • the entire sample (diluted in approximately one column volume) is placed on an affinity chromatography column which is coated with protein A, protein G or anti-IgG antibody (specifically only for the F c region).
  • the immune complexes of antibodies, antigens and nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments are allowed to bind for about 1 hour at room temperature (and possibly for a further 12 hours at 4 ° C), washed with PBST and then with phosphate wash buffer (50 mM , pH 7.2, 500mM NaCl) and then isolates the nucleic acid olomer units for the subsequent detection by one of the methods described in the following examples (17-19).
  • Example 12 Execution of a Process Variant According to the Invention Using Native Membrane Proteins Under Native Conditions (Intact Membranes)
  • the reaction tubes are rinsed with PBST and PBS before use.
  • the membrane fraction from Example 6 is resuspended in 9 times the volume of PBS. 0.02 ⁇ g of the desired nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments, which were produced according to Example 5, are added to 5 ⁇ l of this suspension.
  • the nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments are allowed to bind to the membrane antigens for 1 hour at room temperature and for a further 16 hours at 4 ° C.
  • the membranes are then pelleted at 4 ° C. by centrifugation at 25,000 ⁇ g for 60 minutes (or at 240,000 ⁇ g for 30 minutes).
  • the pellet is resuspended in PBS and transferred to a new reaction vessel. Pelleting and resuspending are then repeated three times as "washing steps". The remaining free nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments are removed by the washing steps, and only complexes of these F ab fragments remain bound to the target in the pellet of the membrane fraction, so that the nucleic acid oligomer units isolated from the column correspond to the amount of target. After the washing steps, the nucleic acid oligomer units are isolated and analyzed using one of the methods described in the following examples (17-19).
  • Example 13 Execution of a Process Variant According to the Invention Using Insoluble (Native or Denatured) Proteins:
  • the reaction tubes are rinsed with PBST and PBS before use.
  • the pellet fraction from Examples 6 or 7 is resuspended in 9 times the volume of PBS (if necessary using ultrasound treatment).
  • 0.02 ⁇ g of the desired nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments, which were produced according to Example 5, are added to 5 ⁇ l of this suspension.
  • the nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments are allowed to bind to the membrane antigens for 1 hour at room temperature and for a further 16 hours at 4 ° C.
  • the proteins are then pelleted at 4 ° C. by centrifugation at 25,000 ⁇ g for 60 minutes (or at 240,000 ⁇ g for 30 minutes).
  • the pellet is resuspended in PBS (possibly also PBST) and transferred to a new reaction vessel. Pelleting and resuspending are then repeated three times as "washing steps". The remaining free nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments are removed by the washing steps, and only complexes of these F a fragments remain bound to the target in the pellet of the membrane fraction, so that the nucleic acid oligomer units isolated from the column correspond to the amount of target. After the washing steps, the nucleic acid oligomer units are isolated and analyzed using one of the methods described in the following examples (17-19).
  • Example 14 Implementation of a method variant according to the invention for the detection of hapten analogs:
  • reaction tubes are rinsed with PBST and PBS before use.
  • 10 ⁇ l of 10 ⁇ PBS are added to manO ⁇ l of the solution to be examined (e.g. water-based sample from the food sector, which is to be examined for various aflatoxins and dioxins).
  • 0.1 ⁇ g each of the desired nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments are added, which were produced as described in Example 5 and are directed against the desired substances (such as aflatoxins and dioxins).
  • the nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments are allowed to bind to the chemical substances for 1 hour at room temperature and for a further 16 hours at 4 ° C.
  • nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments that are not associated with the chemical substances (here aflatoxins and dioxins) from the test solution
  • 0.1 ⁇ g of a complex of the chemical substance to be sought are then added, covalently linked to, for example, fluorescein-labeled alkaline phosphatase (FITC-AP) and 5 ⁇ g anti-AP antibody, with the chemical substance acting as a hapten analogue and AP as a carrier that can be immobilized.
  • FITC-AP fluorescein-labeled alkaline phosphatase
  • the remaining nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments are allowed to bind to the carrier-modified hapten analogs for 1 hour at room temperature and for a further 6 hours at 4 ° C.
  • 0.1 ⁇ g of a complex of DNP-AP and 0.05 ⁇ g of two control nucleic acid oligomers are used same structure with specific coding sequence added, one carrying an anti-DNP-F a b fragment, the second carrying an anti-FITC-F a fragment as a receptor unit, both of which can be immobilized quantitatively, and a specific nucleic acid oligomer that carries an anti-Taq-F ab fragment that can be eluted quantitatively.
  • the first two control nucleic acid oligomers only carry additional primer binding regions P k-1 and P k-2 specific for these control nucleic acid oligomers in order to be able to selectively amplify them.
  • the entire solution is placed on an affinity chromatography column (diluted in a column volume) on which protein G is immobilized.
  • the immune complexes consisting of nucleic acid oligomer-labeled F a fragments, the hapten analogue and the antibodies bound to AP are allowed to bind for 1 hour at room temperature. Then the affinity column is eluted with PBST.
  • the amount of AP is determined via the fluorescein fluorescence or enzyme-dependent chemofluorescence (correlating with AP) and determines the amount of control nucleic acid oligomers via selective PCR with the primers K-1 and K-2. If the background with AP or control nucleic acid oligomers is too high, the affinity chromatographic separation of the complexes of carrier-modified hapten analogue and nucleic acid oligomer receptor unit is repeated.
  • the eluate contains the complexes of nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments and sought chemical substances (receptor-target complexes). If necessary, these complexes can be concentrated using affinity chromatography. To this are added to the eluate anti-F a b antibodies labeled nucleic constant regions F ab - recognize fragments, complexes of nucleic acid-labeled F lets go - fragments and the sought chemical substances for 1 hour at room temperature and more Bind to the antibodies for 16 hours at 4 ° C. The solution is then applied to an affinity chromatography column which Protein G has bound, and allows the immune complexes to bind to Protein G for 1 hour at room temperature and for a further 16 hours at 4 ° C. with a closed pump circuit and constant slow flow. The nucleic acid oligomer units can be isolated from this column or directly from the eluate of the first column, as described in Example 17 below.
  • Example 15 Implementation of a variant of the method according to the invention for the detection of antibodies against antigens in serum or other extracellular liquids:
  • the detection of antibodies against certain antigens allows conclusions to be drawn about contact of the organism with these antigens, which provides important diagnostic information for antigens of pathogenic germs.
  • the detection of the antibodies is usually easier than the detection of the antigens that trigger the immune response. It is worked in dim light or with red light.
  • the reaction tubes are rinsed with PBST and PBS before use.
  • nucleic acid oligomer-labeled antigens which were prepared analogously to the method in Example 5
  • about 1 mg of anti-aliquot are added to 3 aliquots of 10 ⁇ l each of the serum of a patient (or another extracellular fluid) to be tested for antibodies human Ig antibodies (which only recognize the F c regions of the antibodies) against IgE (1st aliquot), IgM (2nd aliquot) or IgG (3rd aliquot), and possibly leaves them in the serum or extracellular fluid existing antibodies against these (nucleic acid oligomer-labeled) antigens or (nucleic acid oligomer-labeled) haptens to the
  • Bind nucleic acid oligomer-labeled antigens whereby the secondary immune complexes with the anti-Ig antibodies form in parallel (incubate for 1 hour at room temperature and for a further 16 hours at 4 ° C).
  • the solution is then applied to an affinity chromatography column (approx. In a column volume) that has bound protein G, and the immune complexes of nucleic acid oligomer-labeled antigen and specific antibody or nucleic acid oligomer-labeled hapten and specific antibody are left in for 1 hour Bind room temperature to Protein G for a further 16 hours at 4 ° C.
  • the affinity chromatography column with PBS and phosphate Wash buffer 50 mM, pH 7.2, 500mM NaCl washed.
  • the washing steps remove the remaining free nucleic acid oligomer-labeled antigens, and only the nucleic acid oligomer-labeled antigens that have been bound by the antibodies (targets) specific for the antigens remain on the column, so that the nucleic acid oligomer units isolated from the column of the amount are specific to specific antibodies against these antigens.
  • the nucleic acid oligomer units are isolated and analyzed using one of the methods described in the following examples (17-19).
  • Aliquotl provides information about the development of allergies or an infection with certain cell parasites
  • Aliquot2 provides information about an acute infection, since IgM antibodies are only formed during a short phase of the not fully differentiated B cells become.
  • Aliquot3 provides information about an infection, regardless of when the infection occurred (in particular, latent and insidious infections can be detected).
  • Example 16 Assay to identify allergy-causing reagents via IgE detection:
  • the reaction tubes are rinsed with PBST and PBS before use.
  • 0.05 ⁇ g of nucleic acid oligomer-labeled allergens (which were prepared analogously to the method in Example 5) are added, and the bind any antibodies to these (nucleic acid oligomer-labeled) allergens that may be present in the serum or extracellular fluid (incubate for 1 hour at room temperature and for a further 16 hours at 4 ° C).
  • the solution is then applied to an affinity chromatography column (approx.
  • One column volume which is coated with anti-human IgE antibodies, and leaves the immune complexes of nucleic acid oligomer-labeled allergen and specific antibody of the patient (target) for 1 hour at room temperature and a further 16 hours at 4 ° C. to the anti-human IgE antibodies immobilized on the column tie.
  • the affinity chromatography column is then washed with PBST and phosphate wash buffer (50 mM, pH 7.2, 500 mM NaCl) and the nucleic acid oligomer units are isolated and analyzed for the subsequent detection according to one of the methods described in Examples 17-19 below.
  • the washing steps remove the remaining free nucleic acid oligomer-labeled allergens from the column and only nucleic acid oligomer-labeled allergens that have been bound by specific antibodies remain on the column, so that the nucleic acid oligomer units isolated from the column are identical to the amount of the specific antibodies for these allergens.
  • Example 17 Separation of the nucleic acid oligomer from the receptor unit:
  • Nucleic acid oligomers which are bound to the receptor unit (and optionally also to the target or in the various immune complexes) (Examples 8 - 16), are added with 20mM sodium phosphate buffer pH 7.2, 6M guanidinium / HCl, 10mM DTT, 2% TritonX 100 prewarmed 90 ° C (approx. One column volume / approx. 3 times the volume with other isolates), elutes in the case of the column-bound complexes after 2-3 min with another 3 column volumes of the same buffer and collects the eluate in the case of the column-bound immune complexes.
  • the eluates are centrifuged briefly at 15,000 xg, 5 ⁇ g poly-dT (33) are added to the supernatant to support the precipitation, the sample is then mixed with half a volume of 3M potassium acetate pH 5.0 and four times the volume of ethanol (-20 ° C) and the DNA precipitated at 15,000 xg at 4 ° C for 40min.
  • the pellet is separated and washed with 70% ethanol (-20 ° C) and 100% ethanol (-20 ° C) and air dried.
  • 1/2 volume of ethanol and! Volume 3M potassium acetate pH 5.0 added and applied to a 'spin column' with an activated glass fiber membrane.
  • nucleic acid oligomers are finally eluted from the glass fiber membrane with 50 ⁇ l TE buffer (kits from Qiagen, Promega, etc.). For amplification the pellet is taken up in the PCR buffer (cf. Example 8), for direct detection without amplification in the hybridization buffer (cf. Example 19).
  • the eluates are briefly centrifuged at 15,000 x g. 5 ⁇ g of poly-dT (33) are added to the supernatant to support the DNA precipitation, the sample is then mixed with half a volume of 3M potassium acetate pH 5.0 and four times the volume of ethanol (-20 ° C.) and the DNA at 15,000 ⁇ g 4 ° C precipitated over 40min.
  • the pellet is separated and washed with 70% ethanol (-20 ° C) and 100% ethanol (-20 ° C) and air dried.
  • the pellet is taken up in the PCR buffer (cf. Example 18), for direct detection without amplification in the hybridization buffer (cf. Example 19).
  • the nucleic acid oligomers can also be purified over glass fiber membranes as described under (i). Like the methods described in iii) and iv), this method has the advantage that the DNA is separated from the protein and fewer proteins in the eluate are also washed out.
  • Example 18 Amplification and subsequent labeling of the nucleic acid oligomer:
  • nucleic acid oligomers bound to the receptor unit are DNA or RNA which have primer binding regions (such as, for example, the nucleic acid oligomer constructed in Example 1)
  • primer binding regions such as, for example, the nucleic acid oligomer constructed in Example 1
  • the nucleic acid oligomers used for all receptor-bound within a qualitative and / or quantitative target analysis (proteome analysis etc.) are identical
  • the nucleic acid oligomers present in the test solution which were separated using one of the methods (i) to (v) in Example 17, can be amplified by PCR.
  • Exponential amplification After separating the DNA from the complexes of nucleic acid oligomer-receptor unit and chemical substance (cf. Example 17), the DNA-containing pellet is dissolved in 10 mM Tris / HCl pH 8.0. An aliquot thereof (1 / 20-1 / 100) is used for amplification. So that the amplification rate can be determined exactly, a defined amount (10fg, 1pg, 50pg, 1ng) of 4 control nucleic acid oligomers (with their own specific coding regions and otherwise identical structure as the nucleic acid oligomers used for labeling) is used to isolate the nucleic acid oligomers before amplification added.
  • the two universal primers P1 and P2 (a primer preferably with a detection marker) and the nucleotide building blocks dCTP, dGTP, dATP and dTTP are added and, for example, a standard PCR with 11 to 18 cycles is carried out by approximately 1000-fold to achieve up to 100,000 times amplification.
  • a standard PCR with 11 to 18 cycles is carried out by approximately 1000-fold to achieve up to 100,000 times amplification.
  • primer groups each of which is universal in itself only for a certain group of nucleic acid oligomer receptor units (as in Example 1, primers 2-1, 2-2, 3-1 and 3-2) are used for each primer pair corresponding to 4 specific control nucleic acid oligomers added in a defined amount before the PCR, and the PCR optionally amplified in separate PCR reactions.
  • the pellet is dissolved in the hybridization buffer (see Example 19), for subsequent modification with a detection marker, linear amplification is then carried out with simultaneous incorporation of a detection marker as described in Example 18 ii) or a subsequent chemical modification with detection Markers as described in Example iii).
  • an additional chromatography step is introduced after the PCR in order to separate the unreacted primers from the amplified nucleic acid oligomers.
  • the entire batch is applied to a Sephacryl S100 column and the first fraction (approx. 25kDa) containing the amplification products is collected, the second fraction (approx. 4kDa) containing the primers is discarded.
  • the amplification step is that the nucleic acid oligomers to be detected are already present as ss-DNA.
  • the DNA can also be provided with a detection marker by adding nucleotides which carry a detection marker, via PCR or the RNA via in vitro transcription, and the detection marker can also be used analogously to the binding instructions of Examples 2-5 are subsequently attached to the nucleic acid oligomer.
  • test sites carry probe oligonucleotides covalently attached to a support material, which are complementary to the nucleic acid oligomers to be detected.
  • the probe oligonucleotides are dropped onto the modified nylon membrane in any but known pattern.
  • the membrane is then baked at 80 ° C. for 2 hours, as a result of which the probe oligonucleotides are firmly bound.
  • the probe oligonucleotide 3 'or 5' terminal ly carry a linker which has a reactive or activatable group via which the probe oligonucleotide is bound to a suitable support surface in a defined manner (e.g. an NH 2 group on the probe oligonucleotide and isothiocyanate group on the support).
  • a linker which has a reactive or activatable group via which the probe oligonucleotide is bound to a suitable support surface in a defined manner (e.g. an NH 2 group on the probe oligonucleotide and isothiocyanate group on the support).
  • Free binding sites on the membrane are incubated for 30 min at 45 ° C with hybridization buffer 1 (7% SDS, 500mM Na-phosphate buffer pH 7.5, 5mM EDTA, 0.1 mg / ml ssDNA from an organism with the lowest possible phylogenetic relationship, e.g. pBR322 E.coli, 0.5 mg / ml acetylated BSA) saturated (pre-hybridization).
  • hybridization buffer 1 7 SDS, 500mM Na-phosphate buffer pH 7.5, 5mM EDTA, 0.1 mg / ml ssDNA from an organism with the lowest possible phylogenetic relationship, e.g. pBR322 E.coli, 0.5 mg / ml acetylated BSA) saturated (pre-hybridization).
  • the 'dots' thus formed are overlaid by the hybridization solution which contains the nucleic acid oligomers isolated in Example 17 or their amplification products.
  • Double-stranded DNA nucleic acid oligomers which are obtained in the amplification according to Example 18 i) are previously denatured at 100 ° C. for 5 minutes and briefly chilled on ice before adding to the hybridization solution.
  • the probe oligonucleotides and nucleic acid oligomers of the solution are allowed to hybridize at approximately 40 ° C. for approximately 3 to 16 hours.
  • a chip e.g. a custom made Affymetrix GeneChip® (see Wodicka et al. 1997, Nature Biotechnology, 15, 1359ff) can be used.
  • the test sites carry probe oligonucleotides which are covalently bound to a carrier material and which are complementary to the nucleic acid oligomers to be detected.
  • the nucleic acid oligomers (or the amplification products) used for the target analysis contain a biotin as the primary detection marker.
  • nucleic acid oligomers 10 ⁇ g are used as ss nucleic acid oligomers in 250 ⁇ l (per chip used) hybridization buffer 3 (100mM MES, 1M NaCI, 20mM EDTA, 0.01% TWEEN 20, pH 6.5 - 6.7) together with 0.1 mg / ml Herings sperm ss - DNA and 0.5 mg / ml acetylated BSA taken up and put on the chip.
  • the mutually complementary nucleic acid oligomers are then allowed to hybridize at 43 ° C. for 16 h.
  • the kit contains a protocol for performing the assay (similar to that described in Examples 6-19, but adapted to the components supplied with the kit).
  • the kit contains modified nucleic acid oligomers with different coding regions to which a component of two conjugated chemical substances, optionally via a linker (which can be cleaved by induction), as described under d) in the section "Binding a receptor to a nucleic acid oligomer" (eg an anti-biotin F ab fragment), is bound (Oligo20-anti-Biotin-F ab , production analogous to Example 5).
  • About the component of two conjugated chemical substances can be modified with the corresponding binding partner of the component any receptor unit such.
  • a biotinylated receptor unit - can be carried out by the user according to his preferences.
  • the kit also contains a set of probe oligonucleotides which, depending on the protocol, are identical or complementary to the coding regions of the nucleic acid oligomers and which are optionally, depending on the complexity of the kit (number of different coding and corresponding probe nucleic acid oligomers) in defined patterns are immobilized on a dot blot membrane or on a DNA chip.
  • the kit can contain a set of primers 1 and / or primers 2, it being possible for the primer or one of the primers to additionally carry a detection marker (cf. Examples 1 and 19).
  • kit can be sets of suitably modified receptor units specially put together for specific applications, such as, for example, biotinylated antibodies or biotinylated F ab fragments (kit for detecting antigens) or biotinylated antigens (kit for detecting antibodies) which are used for Carrier-bound separation can also be modified.
  • suitable chromatography materials for the purification of the nucleic acid oligomer receptor units such as, for example, an affinity chromatography column coated with biotin
  • further antibodies which can be used to immobilize and separate the nucleic acid oligomer receptor units occupied by target such as specific antibodies against the same targets but against another epitope (antigen kit), anti-Ig antibodies which are directed against the F c region of the antibodies sought.
  • a unit adapted to the target analysis for separating the antigens bound to the nucleic acid oligomer-receptor complexes (antigen kit) or Antibodies (antibody kit) from one or more of the components: specific or group-specific antibodies for the antigen targets (for the antigen kit), specific anti-Ig antibodies directed against the F c regions (antibody kit) for Modification of the antigen targets (antigen kit, cf. Example 10) and suitably modified or unmodified carrier material, cf. Examples 8-16, optionally in the form of a disposable cartridge or as a 'spin column'.
  • buffers optionally in ready-to-use form (in particular incubation buffer, washing buffer and an elution buffer which contains the induction agent necessary for cleaving the cleavable linker, hybridization buffer and washing buffer for the detection units such as dot blot membranes, etc.).
  • other additives such.
  • the kit components for PCR amplification such.
  • the kit consists of one or more nucleic acid oligomers with attached Antibiotin-F ab fragment.
  • Nucleic acid oligomers are preferably used DNA, RNA or PNA, which are constructed analogously to Example 1, via a linker which can be cleaved after induction
  • nucleic acid oligomers with an identical antibiotin F ab fragment are offered with a protocol for handling and further use (analogous to the instructions in Example 25) and can be used with biotinylated antigens or biotinylated
  • Antibodies can be combined.
  • the kit comprises a regulation for the preparation of biotinylated F ab fragments and the preparation of the beginning of this example Modified nucleic acid oligomers mentioned (for example Oligo20-anti-Biotin-F a b) and at least one of the necessary components such as papain immobilized on agarose, protease buffer, PMSF as protease inhibitor to stop the proteolytic digestion, a gel filtration column for purification, a biotinylation Agent and the corresponding biotinylation buffer for biotinylation, and a further gel filtration column for separating the free biotin, a biotin affinity chromatography column for separating unreacted biotinylated nucleic acid oligomers and a protein G affinity column for separating non-proteolytically cleaved antibodies and free F c - Fragments, whereby the columns can be made available as single spin columns or disposable cartridges, as well as reaction vessels and other consumables.
  • the protocol comprises the steps: a) addition of buffer for proteolytic digestion and incubation with papain (immobilized on agarose) for 4 hours up to 16 hours (depending on the subclass of the antibody used), addition of PMFS and centrifugation to separate the papain, b ) Incubation of the purified antibody after addition of the incubation buffer with the activated biotin molecule, the molar ratio between antibody and biotin molecule should be approx.
  • Example 21 Kit for screening potential antagonists for an enzyme or a receptor protein:
  • the nucleic acid oligomer receptor units are put together by the user using the above kit (example 20) according to his preferences, the substances which are to be investigated as potential antagonists can be provided by the user himself as biotinylated forms.
  • Each substance is incubated in a specific buffer Nucleic acid oligomer with attached anti-biotin F ab fragment added, incubated for 1-4 h, the incubation solution placed on an affinity chromatography column occupied with biotin, incubated for a further 1-4 h to remove the unattached nucleic acid oligomer anti-Biotin F ab fragments separate.
  • reaction tubes are rinsed with PBST and PBS before use.
  • a protein enzyme, receptor protein or functional peptide with the active domain of these proteins
  • a suitable buffer 10mM potassium phosphate pH 8.0, 135mM potassium chloride, 2mM Mg sulfate
  • IgG antibody which is specifically directed against the protein (or peptide) but does not block the active centers.
  • the substances are allowed to bind to the protein or peptide (incubate for 1 hour at room temperature and for a further 16 hours at 4 ° C.), then the substrate or the natural binding partner is added in physiological concentration and the solution is added to an affinity chromatography column (approx. one column volume), which is covered with ProteinG.
  • the immune complexes of nucleic acid oligomer-labeled substance, protein (or peptide) and the specific antibody are allowed to bind to the ProteinG for 1 hour at room temperature and for a further 16 hours at 4 ° C.
  • the affinity chromatography column is then eluted with the buffer including the natural binding partner in physiological concentration (fraction 1), then including the natural binding partner in 50 times higher concentration (fraction 2) and then including a known high-affinity antagonist in high concentration (fraction 3) - the Fractions are collected separately.
  • the individual elution steps first remove unbound nucleic acid oligomer-labeled substances that cannot or only bind very weakly to the protein (fraction 1), then nucleic acid oligomer-labeled substances that act as low-affinity antagonists in the binding site of the natural binding partner (fraction 2) , then high affinity antagonists (fraction 3). Nucleic acid oligomer-labeled substances remaining on the column that remain bound to the protein or peptide (fraction 4). Fraction 4 contains Substances which are high affinity antagonists and therefore do not dissociate from the protein, but also antagonists or inhibitors which have bound to a binding site other than that of the natural binding partner or the known antagonist, or substances which have no effect on the protein or Have bound peptide.
  • the nucleic acid oligomer units of the substances still remaining on the column can be isolated as fraction 4 by one of the methods described in Example 17.
  • the reaction tubes are rinsed with PBST and PBS before use.
  • An oligo20-anti-biotin Fab (or a nucleic acid oligomer modified analogously with a component of two conjugated chemical substances, cf. Example 20) is used as the nucleic acid oligomer.
  • Peptides that are labeled with biotin are used as receptor units. In the simplest case, the biotinylation is achieved by in vivo labeling in E. coli via recombinant expression as a fusion product with a segment of the biotin carboxylase carrier protein (pin point vectors from Promega). The peptides are part of the antigen used in the immunization and carry one or more epitopes of this antigen.
  • the kit in this version allows the user to manufacture and use these receptor units according to individual preferences.
  • a specific biotinylated peptide is added in a molar ratio of approx. 1.5: 1 in PBS.
  • the nucleic acid oligomer is allowed to couple to the biotinylated peptide for 2 hours at room temperature.
  • the sample is then applied to an affinity column which is coated with biotin and allowed the unbound nucleic acid oligomers for 2 hours at room temperature over anti-biotin F ab - fragment bind to the biotin of the affinity column.
  • biotin-anti-biotin F a b linked ready-made nucleic acid labeled peptides are eluted (nucleic acid-labeled receptor unit).
  • 100 ⁇ l of the cell culture supernatant of a hybridoma cell line are then added to each O.O ⁇ g of a nucleic acid oligomer-labeled peptide and this is left for 2 hours at room temperature (and possibly a further 12 hours at 4 ° C.) of monoclonal antibodies Bind hybridoma cell lines.
  • the solution is then applied to an affinity chromatography column (approx. One column volume), which has bound protein G, and waits for approx.
  • the separation of free nucleic acid oligomer-labeled peptides and complexes of these peptides with the target, the monoclonal antibody (immobilized on the column material) is carried out by the elution and the washing steps, so that at the end of the washing steps the nucleic acid oligomer units according to one of those described in Example 17 Methods for amplification and detection can be isolated.
  • the kit contains fluorescence-labeled primers for amplification, depending on the complexity of the kit (number of different specific coding nucleic acid oligomers), dot blot strips or DNA chips, on which a whole set of probe oligonucleotides is bound in a defined pattern.
  • the advantage of this method is that the screening can start earlier and requires less material (especially antigen) than the usual methods.
  • the kit consists of nucleic acid oligomers with different coding regions, to which a specific DNA or RNA sequence (as ss- or ds-DNA or as ss- or ds- RNA) as a receptor unit for DNA-binding (or RNA-binding) biomolecules, in particular DNA- or RNA-binding proteins (e.g. the sequence ds- ⁇ '- CCAGGCCTGG-3 'for the DNA ( Cytosine- ⁇ ) -methyltransferase Haelll, the loxP site for CRE recombinase, promoter sequences that specifically bind various transcription factors and transcription regulators or RNA sequences bind the splice factors and hn-RNP).
  • DNA-binding or RNA-binding proteins
  • DNA or RNA sequences can also serve as receptor units for antagonists of DNA or RNA-binding proteins (e.g. the sequence ds- ⁇ '-ATGCAT-3 'as a binding site for DNA-binding proteins Topoisomerase II, but also as a binding site of an inhibitor for DNA-binding topoisomerase II such as LU-79 ⁇ 3, see Gallego & Reid, Biochemistry 1999, 38, 15104-15115).
  • the kit contains a protocol for handling the kit, as well as optional primers (P1 and / or P2) that are the same for all nucleic acid oligomers, optionally with a detection marker (e.g.
  • a rhodamine or flurescein that is used to cleave the cleavable linker necessary induction agents, suitable or any DNA-binding (or RNA-binding) biomolecules, their antagonists (suitable or any), which can be additionally modified for the carrier-bound separation, and a detection unit which is matched to the nucleic acid oligomers used (eg a ready-to-use dot-plot membrane with the probe oligonucleotides complementary to the nucleic acid oligomers to be detected and immobilized on coding sequence-specific spots, cf. Example 19).
  • the kit can have a unit adapted to the target analysis for separating the DNA-binding (or RNA-binding) biomolecules containing the target and bound to the nucleic acid oligomer-receptor complexes from the constituents specific antibodies for the DNA-binding (or RNA) -binding) biomolecules or their antagonists, reagent for modifying the DNA-binding (or RNA-binding) biomolecules or their antagonists, cf.
  • Example 24 Exemplary cellular proteome analysis:
  • tissue cells > 100 cells
  • the cell material of a biopsy is - after addition of RIPA buffer (1 ⁇ 0mM NaCI 1% NP-40, 0. ⁇ % deoxycholate, 0.1% SDS, ⁇ OmM Tris, pH 8.0, 10 ⁇ l per mg cell tissue, but at least 1 ⁇ l) unlocked in the microtip sonifier.
  • Example 6 ii A large part of the cellular proteome of the cells is dissolved as in Example 6 ii) under partially denaturing conditions (separation of the remaining insoluble protein fraction (ECM / cytoskeleton) at 800 ⁇ g / 4 ° C./1 ⁇ min and residues of the cell debris from the separated supernatant at 60,000 xg / 4 ° C / 30 min).
  • the RIPA-buffered supernatant contains the partially denatured soluble cytoplasmic proteins and a large part of the membrane proteins.
  • the proteins remaining in the pellet are discarded (or suitable receptor-nucleic acid complexes are bound to the insoluble proteins in the pellet and these target-receptor-nucleic acid oligomer complexes are further analyzed in a second step, as described in Example 13).
  • Nucleic acid oligomer 1 for binding receptor unit 1 has e.g. B.
  • positions 1, 2, 9 and 10 of the coding sequence being independent, positions 3, ⁇ and 7 being dependent on position 1 by the permutation rule G ⁇ A ⁇ C ⁇ T ⁇ G , so for a G at position 1 follows that position 3 is an A, position ⁇ is a C and position 7 is a T.
  • positions 4, 6 and 8 depend on the independent occupation of position 2, positions 11, 13 and 1 ⁇ on independent position 9 and positions 12, 14 and 16 on independent position 10;
  • Coding sequence any of the maximum of 192 nucleic acid oligomers generated above
  • linker dithio-bis-propionic acid sulfosuccinimidyl ester one separate batch of nucleic acid oligomer per antibody: 1 nmol of the nucleic acid oligomer is mixed with ⁇ O nmol dithio-bis-propionic acid sulfosuccinimidyl ester in approx. 100 .mu.l 100 mM NaHC0 3 / Na 2 C0 3 , pH 9 added, allowed to stand overnight in the dark at room temperature, isolated and separated the converted DNA in carbonate buffer analogous to the procedure in Example 3).
  • the Nucleic acid oligomer linker units of a reaction are then reacted with each type of F ab fragment and isolated (analogously to example ⁇ ) and the number of DNA units per F ab fragment z. B. determined on the ratio of the rhodamine fluorescence at ⁇ 7 ⁇ nm (proportional to the DNA) to the absorption at 28 ⁇ nm (proportional to the F a b fragments).
  • Target-receptor-unit coupling The F ab fragments of all batches dissolved in PBS and labeled with the nucleic acid oligomers are combined (approx. 10 ml) and 10 ⁇ l thereof are added to 10 ⁇ l solution of the partially denatured proteins in RIPA buffer ( corresponding to 1 mg cell material). The proteins are allowed to couple to the F a fragments for about 3 hours at room temperature and for about 24 hours at 4 ° C.
  • a cocktail of polyclonal antibodies is added in PBS which are specific for the same targets (proteins) as the F ab fragments (and optionally further anti-Ig antibodies which are specific for the F c regions of these antibodies ) and has the antibodies coupled to the proteins for a further approx. 3 h at room temperature and for approx. 12 h at 4 ° C.
  • the DNA obtained is then used as described in Example 18 i) and iii) with PCR using amplified exponentially from primer 2 and rhodamine-modified primer P1, the amplified DNA melted (heating for ⁇ min to 100 ° C., then cooled on ice), placed on a dot plot membrane provided with probe oligonucleotides complementary to the original coding sequences, hybridized and washed (as described in Example 19 i), and then the fluorescence of the Spots determined quantitatively (see Example 19 i).
  • a transplant requires an intensive diagnostic examination of the available tissue in the shortest possible time, since the organs should be transplanted as quickly as possible.
  • the blood groups and other polymorphic tissue markers in particular the components of the MHC (major histocompatibility complex), must be examined in order to be able to assess rejection reactions and to be able to select the suitable patients for the transplantation; at the same time, it is necessary to rule out a risk of infection via the transplanted tissue.
  • a kit comprises a set of complete nucleic acid oligomer-receptor units and a set of nucleic acid oligomer-anti-biotin-F ab units which are available to produce 20 additional receptor units, as required by the user, analogously to Example can .
  • the receptor units used are, in particular, F ab fragments against the components of the major histocompatibility complex (MHC - currently 1219 alleles), against blood group epitopes (to determine the polymorphic tissue markers), and in particular antigens which are typical of certain infectious diseases (to detect the existence of antibodies against these antigens) and antigens such as rheumatoid factors (to detect antibodies that are typical of an autoimmune disease).
  • MHC - currently 1219 alleles against blood group epitopes
  • antigens which are typical of certain infectious diseases to detect the existence of antibodies against these antigens
  • antigens such as rheumatoid factors
  • the detection of these antibodies is only possible via protein analysis.
  • the antibodies are also relatively easy to access because they are distributed throughout the body via the blood circulatory system. It is particularly important to detect infections caused by pathogens that are only a problem in immunodeficiency, infections by viral pathogens that can persist long after the infection has survived (HIV, herpes simplex, hepatitis A / B / C, cytomegalovirus, zoster, retroviruses , Mycoplasmas Among these antibodies are not easy to identify because the symptoms are difficult to classify (adenovirus, influenza, etc.) and infections caused by other pathogens that are often not recorded due to the gradual course of the disease ( Legionella, borelliosis, tuberculosis, syphilis etc.).
  • the kit can contain further components as described in Example 20.
  • the kit can also control nucleic acid oligomers that are built like all nucleic used and each has a specific coding sequence contained (positive binding controls in three different concentrations, for example with anti-human IgG F ab fragment as a receptor unit which is always bound in the secondary immune complexes; positive binding controls for checking the immobilization of different isotypic antibodies from different organisms, each with an intact antibody, the specificity of which is an antigen that is not found in the test solution, different isotypes or immunoglobulin Classes from different organisms such as IgGI, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4 and IgM from mouse, rabbit polyclonal antibodies are used; one or more negative binding controls to check the successful separation of the free nucleic acid oligomer receptor units, being antibodies against Proteins of phylogenetically unrelated organisms that do not appear in the test solution are selected, for example an anti-Taq-F ab fragment; a
  • the kit allows the following components to be analyzed in one approach: To determine the blood and tissue characteristics, nucleic acid oligomer-labeled F ab fragments of monoclonal antibodies against these tissue markers that are attached to the Bind antigens specifically and use antibodies with specificity against another epitope of these targets. To determine the antibodies, nucleic acid oligomer-labeled antigens of the pathogens are added to the same approach. These antibodies are bound as secondary immune complexes by adding anti-human IgG, anti-human IgM, anti-human IgA and anti-human IgE antibodies, which in turn can be immobilized via protein G affinity chromatography.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Markierung und zur Detektion von chemischen Substanzen beschrieben, die spezifisch an einen Rezeptor binden. Dabei dient die Sequenz eines DNA-, RNA- oder PNA-Oligomer-Einzelstrangs als eindeutige molekulare Markierung, die am jeweiligen Rezeptor angebracht wird. Nach Abtrennung der Komplexe aus chemischer Substanz und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit wird statt der chemischen Substanz der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil identifiziert und quantifiziert.

Description

Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Markierung und Detektion chemischer Substanzen.
Stand der Technik
Die quantitative Erfassung aller Proteine einer Zelle eines bestimmten Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt, oft als (zelluläre) Proteom-Forschung bzw. (cellular) Proteomics bezeichnet, ist der Schlüssel zu einem funktioneilen Verständnis des physiologischen, im Spezialfali pathologischen Zustands der betreffenden Zelle. Die "proteomische" Information bereichert sowohl die Grundlagen- als auch die angewandte Forschung. Sie liefert die molekulare Basis für den Zustand einer Zelle und bietet die Möglichkeit, die Änderung des Expressions- und Modifikationsmusters der Proteine als Antwort auf eine spezifische Störung (z. B. eine Krankheit oder die Verabreichung eines bestimmten Medikaments) aufzuzeichnen. Damit besitzt die Proteom-Forschung eine fundamentale Bedeutung für die Target-Suche und - Auswahl in der biomedizinischen Forschung, also der Entwicklung neuer Medikamente. Das (zelluläre oder globale) Proteom kann daneben auch zur Diagnose von Krankheiten und zur Therapiekontrolle eingesetzt werden. Somit verfolgt die Proteom-Forschung im Prinzip die gleichen Ziele wie die Genom-Forschung, nämlich die Korrelation des Zustands eines Organismus oder einer Zelle (des Phänotyps) mit grundlegenden molekularen Bausteinen dieses Organismus durch die parallele Analyse möglichst vieler solcher Bausteine (z. B. der mRNA bzw. der Proteine).
Das Proteom besitzt im Vergleich zum Genom einen wesentlich größeren Informationsgehalt. Während das Genom das Vererbungsmuster und das unmittelbare Transkriptionsmuster der Gene in Form der cDNA und mRNA qualitativ und quantitativ erfasst, wächst die Komplexität der Transkriptionsprodukte, also der Proteine, durch posttranslatorische Modifikationen vieler Proteine (Phosphorylierung, Glycosilierung, proteolytische Prozessierung etc.) weiter. Dasselbe Genom führt also aufgrund dieser posttranslatorischen Variationen und durch Transportmechanismen, die transkribierte Genprodukte über den ganzen Organismus verteilen zu unterschiedlichen Proteomen und somit verschiedenen physiologischen (bzw. pathologischen) Zuständen.
Das Proteom besitzt zudem im Hinblick auf die Target-Suche und -Auswahl bzw. die Diagnose von Krankheiten gegenüber dem Genom zwei wesentliche Vorteile: Zum einen ist die Korrelation zwischen Proteom und Phänotyp enger, zum anderen kann das Proteom (zumindest teilweise) in den typisch klinischen Proben wie Serum, cerebrospinale Flüssigkeit oder Urin untersucht werden. Diese einfach zugänglichen Proben enthalten keine DNA, aber Proteine, so dass die Proben zwar auf potentielle proteomische Marker einer Krankheit untersucht werden können, nicht aber auf genomische Marker.
Im Vergleich zur Genomforschung ist die Analyse des Proteoms allerdings wesentlich schwieriger durchzuführen, da - im Gegensatz zum Hybridisierungsprinzip der DNA, cDNA bzw. mRNA beim Genom - für Proteine kein einfaches, universell einsetzbares und eindeutiges Detektionsprinzip existiert. Sowohl die Isolierung und Auftrennung als auch die eigentliche Detektion müssen individuell an die biochemischen Eigenschaften (z.B. Hydrophobizität, Hydrophilie, Acidophilie, Thermophilie) der jeweiligen Proteine bzw. Proteingruppen angepasst werden.
Die Analyse des Proteoms kann in folgende Schritte eingeteilt werden (vgl. F. Lottspeich, "Proteom Analysis: A Pathway to the Functional Analysis of Proteins", Angewandte Chemie, International Edition, 1999, Vol. 38, 2476 - 2492): Bestimmung der Startparameter, Probenvorbereitung, Protein-Separierung, Protein-Quantifizierung und Datenanalyse. Die Startparameter sollen garantieren, dass das Material, das einer Proteom-Analyse unterzogen wird, reproduzierbar hergestellt werden kann. Die Probenvorbereitung umfasst u.a. Zellkultivierung und Zellaufschluss unter denaturierenden oder nichtdenaturierenden Bedingungen. Da Proteine keine einheitlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften besitzen, erfordert die Probenvorbereitung ein exaktes Protokoll, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Die zur Zeit gängigste, hochauflösende Methode der Protein-Separierung stellt die 2D-Gelelektrophorese dar, bei der Proteine nach (i) Ladung (mittels isoelektrischer Fokussierung, lEF-Gel) und (ii) Größe (mittels SDS-PAGE Gel-Elektrophorese) aufgetrennt werden. Auch bei dieser Methode liegt das Problem in der Reproduzierbarkeit, in diesem Fall in der Reproduzierbarkeit der zweidimensionalen Muster auf dem Gel. Äußere Parameter wie der Protein-Transfer von der ersten, IEF- Gel-Dimension in die zweite, SDS-PAGE-Gel-Dimension, das Elektrophoresegerät, die Gelkomposition, die Elektrophoresedauer bei lEF-Gelen, Anfärbemethoden, Bedienungspersonal usw. können zu einer deutlichen Variation der Muster führen.
Die Protein-Identifizierung und -Quantifizierung erfolgt i.d.R. durch massenspektrometrische Verfahren, die einen Transfer der gel-separierten Proteine vom Gel in andere Umgebungen (z. B. organische Matrizes bei MALDI- Massenspektroskopie, MALDI-MS) voraussetzen. Auch dieser Transfer in eine andere Umgebung kann zu Modifikationen der Proteine und somit zu Fehlinformation oder Informationsverlust führen.
Die abschließend notwendige Datenanalyse wird durch entsprechende Methoden der Bioinformatik bewerkstelligt.
Neben der begrenzten Reproduzierbarkeit stellen vor allen Dingen die sehr personal- und apparateintensive Probenbereitung und -analyse (MALDI-MS-Quantifizierung) wesentliche Nachteile der geschilderten Vorgehensweise zur Proteom-Analyse dar. Zudem wird nur ein geringer Parallelisierungsgrad erreicht, da von den ca. 20.000 bis 30.000 expremierten Proteinen einer Zelle auch in den aufwendigen 2D-Gelen nur wenige hundert verschiedene Proteine separiert und dann auch detektiert werden können. Die 2D-Gel Technik ist außerdem nicht automatisierbar und daher personal- und kostenintensiv.
Aus dem Stand der Technik bekannte Alternativen im Bereich der Probenvorbereitung und Separation sind die Immunoprezipitation und die chromatographische Auftrennung. Neben irreversibel gebundenem und damit für die Analyse verlorenem Protein stellt vor allem die geringe Trennkraft der verbreiteten chromatographischen Methoden ein wesentliches Problem dieser Alternativen dar. Im ersten chromatographischen Schritt kann das Proteom in wenige hundert Fraktionen mit unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen getrennt werden, die anschließend in erneuten chromatographischen Schritten, also seriell, weiter separiert werden müssen.
Zur Erhöhung des Parallelisierungsgrades wurden verschiedene Strategien zur, zumindest partiellen, chip-basierten Proteomanalyse vorgeschlagen (vgl. Alan Dove: "Proteomics: translating genomics into products?", Nature Biotechnology, 1999, Vol. 17, 232 - 236). So könnten z. B. "Separations-Chips", die mit verschiedener Protein- spezifischer Oberflächenchemie oder spezifischen Protein-Bindungspartner strukturiert sind, zur zweidimensionalen Auftrennung des Proteoms verwendet werden. Die fraktionierten Proteine sollen dann massenspektroskopisch analysiert werden. In einer verwandten Strategie wird vorgeschlagen, die Proteine des isolierten Proteoms zuerst (einheitlich) mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren, dann auf einem Antikörper-Chip-(Antibody-Array) zweidimensional aufzutrennen und schließlich anhand der Fluoreszenzintensität (z. B. über CCD-Kameras) zu quantifizieren. Dazu erforderlich ist eine sehr spezifische Antikörper-Bibliothek, wobei die Spezfizität/Selektivität der Antikörper extrem hoch sein muss. Zudem weist die Antibody-Chip-Strategie die Nachteile einer unspezifischen Fluoreszenz und einer aufgrund des zweidimensionalen Ausleseverfahrens der Fluoreszenz durch z. B. CCD-Kameras in Kombination mit kofokaler Mikroskop-Optik extrem teuren Detektionsmethode auf. Daneben stellt die Vereinheitlichung der Reaktion zur Anbindung des Fluoreszenzfarbstoffs an die verschiedenen Proteine (qualitativ und quantitativ) ein ungelöstes Problem dar.
Die Proteom-Analyse besitzt somit das Potential, sich zu einer äußerst hilfreichen Technik in der biomedizinischen Forschung und medizinischen Diagnostik zu entwickeln. Allerdings müssen dazu die oben geschilderten Probleme überwunden werden, nämlich die ungenügende Reproduzierbarkeit, der geringe Grad an Parallelisierung und der enorme Aufwand an präparativer Arbeit, an hochqualifiziertem Personal und teurer technischer Ausstattung. Darstellung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen bereitzustellen, welches die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß 'durch das Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen gemäß unabhängigen Patentanspruch 1 , die Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen gemäß unabhängigen Patentansprüchen 21 , 22, 35, 36, 71 und 79, die Verfahren zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen chemischen Substanzen gemäß unabhängigen Patentansprüchen 50 und 57, dem Verfahren zur Detektion von Hapten-Analoga gemäß unabhängigen Patentanspruch 59, sowie durch die Kits gemäß den unabhängigen Patentansprüchen 106 bis 115, 121 und 122 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:
Als Genom wird der komplette Satz genetischer Information bezeichnet, über den eine Zelle verfügt. Die funktioneile Genom-Forschung (functional genomics or phenomics) umfasst im allgemeinen die Expression und das Verhalten der Gen- Produkte. Innerhalb der "functional genomics" werden die Bereiche zelluläre Transkriptom-Forschung, zelluläre Proteom-Forschung, globale Proteom-Forschung und Metabolom-Forschung unterschieden. Als zelluläre Transkriptom-Forschung (cellular transcriptomics) wird die vergleichende Untersuchung der mRNA Expessionsprofile mit Hilfe von z. B. DNA-Chips bezeichnet. Die quantitative Isolierung und Identifikation aller Proteine einer Zelle ist als zelluläre Proteom- Forschung (cellular proteomics) bekannt. Bei der globalen Proteom-Forschung (global proteomics) werden alle encodierten Proteine des gesamten Genoms analysiert und zwar ohne Festlegung auf einen spezifischen Zelltypus oder spezifische Wachstumsbedingungen (physiologischer Zustand der Zelle). Das Proteom selbst stellt einen Baustein des Metaboloms bzw. der Metabolom-Forschung (metabolomics) dar, also des Verständnisses über den gesamten Metabolismus eines Organismus.
2D-Gelelektrophorese Sequentielle Kombination der Isoelektrischen Fokussierung (1. Elektrophoreseschritt) mit der SDS-PAGE (2. Elektrophoreseschritt) zur exakteren elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen in Abhängigkeit von deren Oberflächenladung und deren Größe
A Adenin
AffinitätschromatoChromatographische Methode, bei der spezifische graphie Bindungen zwischen einem Tag und dessen Bindungspartner genutzt werden, um eine Substanz aufzureinigen. Dabei wird entweder das Tag oder der Bindungspartner an die aufzureinigende Substanz modifiziert und der Bindungspartner oder das Tag am Chromatographiematerial immobilisiert.
Einige Beispiele für eine Kombination aus Tag und Bindungspartner sind ein spezifischer anti-Hapten- Antikörper als Bindungspartner und ein Hapten als Tag, oder Protein A (oder Protein G) als Bindungspartner und ein spezifischer IgG-Antikörper als Tag. Bei der affinitätschromatographischen Immobilisierung von Antigen- Antikörperkomplexen nimmt Protein G oder Protein A als am Chromatographiematerial immobilisierter Bindungspartner eine besondere Stellung ein, da dieses Protein quantitativ alle sekundären Immunkomplexe binden kann, freie Fab- Fragmente, die in den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten benutzt werden, aber nicht gebunden werden. alkalische Enzym, das Phosphatgruppen von verschiedenen Phosphatase Substraten abspaltet
Alkenyl Alkylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-C Einfachbindungen durch C=C Doppelbindungen ersetzt sind.
Alkinyl Alkyl- oder Alkenylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C≡C Dreifachbindungen ersetzt sind.
Alkyl Der Begriff "Alkyl" bezeichnet eine gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, die geradkettig oder verzweigt ist (z.B. Ethyl, 2,5-Dimethylhexyl oder Isopropyl etc.). Wenn "Alkyl" benutzt wird, um auf einen Linker oder Spacer zu verweisen, bezeichnet der Begriff eine Gruppe mit zwei verfügbaren Valenzen für die kovalente Verknüpfung (z. B. - CH2CH2-, -CH2C(CH3)2CH2CH2C(CH3)2CH2- oder -CH2CH2CH2- etc.). Bevorzugte Alkylgruppen als Substituenten oder Seitenketten R sind solche der Kettenlänge 1 - 30 (längste durchgehende Kette von kovalent aneinander gebundenen Atomen).
Allergen Antigen oder Hapten, das eine allergische Reaktion auslöst. anti-Fab-Antikörper Antikörper, die gegen die konstanten Regionen der Fab- Fragmente gerichtet sind. Unter diesem Begriff wird stets ein ganzer Satz an Antikörpern verstanden, die alle Fab- Fragmente unabhängig von Isotyp und Spezies binden können.
Antigen Spezifischer Bindungspartner eines Antikörpers; jede Substanz, jede Verbindung, jedes Biomolekül oder Molekül oder Kombinationen daraus, die aufgrund ihrer Primär-, Sekundär- oder Tertiärstrukturen eine Bindungsstelle für einen Antikörper besitzt, die eine spezifische Bindung dieses Antikörpers ermöglicht; die Eigenschaft einer Substanz als Antigen wirken zu können, wird lediglich dadurch eingeschränkt, daß die Antigen-Antikörper- Wechselwirkung eine gewisse Affinität aufweisen muß, damit der Antikörper die Substanz spezifisch erkennen kann. Eine weitere Eigenheit der Antigene ist es, in einem Organismus die Produktion bestimmter Antikörpern anzuregen (also eine Immunantwort zu stimmulieren). Ein Antigen kann daher auch eine komplexe Mischung von chemischen Substanzen oder ganze Organismen darstellen (wie z.B. Pollenkörner, abgetötete Bakterien, Viren etc.). anti-Hapten-Antikörper im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Begriff anti- Hapten-Antikörper für eine Gruppe von Antikörpern gebraucht, die spezifisch gegen ein bestimmtes Hapten oder Hapten-Analogon gerichtet sind. Bevorzugt eingesetzte Haptene sind Biotin oder die in Form der nicht Carrier- gebundenen aber mit an die entsprechenden anti-Hapten- Antikörpem spezifisch bindenden Hapten-Analoga wie FITC, Digoxigenin, DNP und Rhodamin (vgl. auch die Definition von Hapten). anti-lg-Antikörper anti-lg-Antikörper sind anti-lmmunglobulin-Antikörper, die spezifisch für jeweils einzelne Isotypen, Klassen oder Subklassen von Antikörpern einer bestimmten Spezies sind.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter anti-lg- Antikörper solche anti-lg-Antikörper verstanden, die nach affinitätschromatographischer Aufreinigung nur gegen die konstanten Regionen auf dem Fc-Fragment gerichtet sind. Isotypische anti-lg-AK, die gegen konstante Regionen der Fab-Fragmente gerichtet sind, werden explizit als anti-Fa - Antikörper von diesen unterschieden. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter anti-lg-Antikörpern ein ganzer Satz von anti-lmmunglobulin-Antikörpern verstanden, der alle Antikörper gegen alle Klassen und Subklassen mit einschließt, solange die Klasse oder Subklasse nicht speziell definiert wird (im Gegensatz zu z.B. anti-lgG-Antikörper, die die Abkürzung der Subklasse im Namen tragen). Die anti-lg-Antikörper spielen eine wichtige Rolle bei der Ausbildung sekundärer Immunkomplexe: Sie binden an die spezifischen Antikörper der primären Immunkomplexe und leiten die Bildung von sekundären Immunkomplexen ein, d.h. eine Aggregation der primären Immunkomplexe zu großen Komplexen mit nicht definierter Zusammensetzung, wobei diese sekundären Immunkomplexe über die anti-lg-Antikörper an Protein A oder Protein G binden können.
Antikörper bestimmte Gruppe von Proteinen (auch Immunglobuline, abgekürzt Ig, genannt), die speziell von sogenannten B- Zellen des Immunsystems von Wirbeltieren hergestellt werden. Antikörper erkennen spezifisch Strukturmerkmale, insbesondere der Sekundär- oder Tertiärstruktur beliebiger chemischen Substanzen (oder Komplexe oder Aggregate von Substanzen) und an diese binden, wobei die spezifisch an die Antikörper bindenden Substanzen als Antigene bezeichnet werden.
Antikörper sind aufgebaut aus je zwei (identischen) H-Ketten und zwei (identischen) L-Ketten, die sich so zusammenlagern, daß sich ein Y-förmiges Protein bildet, mit zwei Armen, den Antigenbindungsdomänen, gebildet durch Zusammenlagerung einer L und einer H-Kette, auch Fat,- Domäne genannt, und einer Stammregion, der Effektordomäne, gebildet durch Zusammenlagerung der C- terminalen Teile der beiden H-Ketten, auch Fc-Domäne genannt. Die Antigenbindungsdomäne besitzt eine konstante Region und eine sogenannte variable Region, gebildet von der N-terminale globulären Domäne eines Armes, die sich von Antikörper zu Antikörper unterscheidet, für jeden Antikörper charakteristisch ist und die spezifische Bindungsstelle für ein bestimmtes Antigen trägt. Die konstanten Regionen der Effektordomänen (Fc-Domäne) enthalten die Bindungsregionen für spezifische Bindungspartner verschiedener Zeil-Linien und Bindungsregionen für den Komplement-Faktor C1q, sowie für Protein A und Protein G. Natürlich vorkommende Antikörper sind aus einer solchen Einheit oder aus einem Komplex aus 2-5 solcher Einheiten aufgebaut und besitzen also zwischen 2 bis zu 10 identische Antigenbindungsstellen. Antikörper sind entsprechend divalent oder multivalent. Die gleiche Struktur, nur mit einer zusätzlichen Domäne, die das Molekül in die Zellmembran integriert, besitzen die an der Zelloberfläche der B-Zellen exprimierten B-Zell- Bindungspartner. Es gibt verschiedene Klassen und Subklassen von Antikörpern: z.B. IgGI , lgG2a, lgG2b, lgG3, lgG4, IgD, IgM, lgA1 , lgA2 und IgE bei der Maus, die sich im Bereich der konstanten Regionen unterscheiden. Die Antikörper unterscheiden sich zudem dadurch, dass unterschiedliche Kombinationen von H-Kette und unterschiedlichen L-Ketten (lamda und kappa) vorkommen. Antikörper mit gleicher Kombination aus H- Kette und L-Kette bezeichnet man als Isotyp. Daneben werden die einzelnen Antikörper auch nach der Herkunft, d.h. nach der Spezies, aus der die Antikörper oder die B- Zellen für die Hybridomzell-Fusion gewonnen werden, definiert. Üblicherweise stammen sogenannte monoklonale Antikörper von Maus oder Ratte, in seltenen Fällen auch vom Mensch und polyklonale Antikörper stammen von Maus, Ratte, Hamster, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziege, Schaf, Rind, Pferd, Huhn und Gans. Die Spezifität von 'polyklonalen' Antikörpern ist durch die Komplexität der Antigene bestimmt und kann daher eine undefinierbare Zahl von Epitopen auf einer ganzen Anzahl von unterschiedlichen Substanzen umfassen. Generell spielen weder die Ig-Klasse, die Subklasse, der Isotyp noch die Herkunft für die Spezifität und Affinität der Antikörper eine Rolle. Daher wird in der vorliegenden Erfindung im allgemeinen auf diese Angaben verzichtet. anti-Tag-Antikörper Gegen ein Tag gerichteter Antikörper
AP Abkürzung für alkalische Phosphatase
Avidin / Streptavidin Proteine, die mit hoher Affinität und Spezifität Biotin binden
Base A, G, T, C oder U
Bindungsassay- 10 mM Kaliumphosphat pH 7.6, 135 mM KCI, 2 mM Mg- Inkubationspuffer Sulfat
Biogel PD6-Säule Gelfiltrationschromatographiematerial mit einer Ausschlußgrenze von ca. 6 kDa
Biotin Biotin (ein Cofaktor bestimmter Enzyme) kann als Hapten oder als Tag kovalent an Proteine gebunden werden.
Biotin Carboxylase- Protein das Biotin als Cofaktor bindet - ein Peptid, das eine Carrier Protein Domäne dieses Proteins enthält, wird als Tag eingesetzt, um eine in vivo Biotinylierung in E.coli der mit dem Tag fusionierten Proteine zu erreichen. bp Basenpaar
BSA Bovine serum albumine
B-Zellen Zellen des Immunsystems, deren Aufgabe es ist, während einer Immunantwort Antikörper zu produzieren.
C Cytosin
Carrier ein Molekül, das für eine andere Substanz ein Trägermaterial darstellt, wobei die Substanz spezifisch oder unspezifisch, kovalent oder nicht kovalent, an den Carrier gebunden wird. Generell kann ein Carrier jedes Material unabhängig von der Größe und Struktur sein, an das eine Substanz binden kann. In der Regel werden Makromoleküle als Trägermaterial eingesetzt, die je nach Zweck, für den der Carrier eingesetzt wird, idealerweise verschiedene zusätzliche Eigenschaften mitbringt, wie z.B. die Eigenschaft, leicht zu sedimentieren oder von einer weiteren Substanz spezifisch oder kovalent gebunden zu werden, wie z.B. ein Protein, das über einen Antikörper gebunden werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "Carrier" ausschließlich dazu verwendet, eine Verbindung zu bezeichnen, die in der Lage ist, an ein Hapten-Analogon mit nur einem Epitop anzubinden, ohne das die Eigenschaften des Epitops verändert werden und der Komplex aus Carrier und Hapten-Analogon neben dem unveränderten Epitop des Hapten-Analogons mindestens ein weiteres Epitop (am Carrier) aufweist.
ChromatographieÄquivalent auch zu Trägermaterial. material cytoplasmatische Proteine, die sich im Cytoplasma befinden und als lösliche Proteine Fraktion isoliert werden können
Desoxycholat Steroid, das als Detergens eingesetzt wird
Detektions-Marker chemische Substanzen mit beliebiger Struktur und Zusammensetzung, die an das Nukleinsäureoligomer oder dessen Amplifikationsprodukte gebunden sind und über die das Nukleinsäureoligomer oder dessen Amplifizierungsprodukte detektiert werden kann. Typische Detektions-Marker sind z. B. Fluoreszenzfarbstoffe, radioaktive Isotope und funktioneile Enzym-Einheiten. In einer indirekten Form kann auch jede zur einfachen Anbindung eines Detektions-Markers geeignete Modifikation eines Moleküls als Detektionsmarker bezeichnet werden, wie z. B. ein angebundenes Biotin, an das in einer einfachen Reaktion der eigentliche Avidin-modifizierte Detektions- Marker angebunden werden kann.
Digoxigenin Steroid, das als Hapten-Analogon eingesetzt wird
DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure
DNAse Enzyme die DNA abbauen
DNP 2,4-Dinitrophenol wird als Hapten-Analogon oder als Chromophor für die Markierung benutzt
Dot-Plot-Membran Membranen, die als Trägermaterial für DNA oder RNA dienen. Auf die Dot-Plot-Membranen werden DNA oder RNA-Proben als einzelne, meist punktförmige Tropfen in definiertem Muster aufgetragen und immobilisiert. ds double Strand (Doppelstrang)
DTT Dithiothreitol ( ein Reduktionsmittel)
E.coli Escherichia coli- e Bakterium, das zur Klonierung von Genen eingesetzt wird
ECM (extracellular Proteine der extracellulären Matrix, die als unlösliche matrix) Fraktion von Geweben isoliert werden
EDC (3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid
EDTA Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz)
Epitop Beliebiges Strukturmerkmal eines Antigens, das von einem Antikörper erkannt wird und das eine Bindungsstelle für einen spezifischen Antikörper darstellt.
Fab / Fab-Fragment Nach Papain-Verdau erhaltendes proteolytisches Fragment von lgG-Antikörpern, das die variable Region enthält, die spezifisch die Antigene erkennt - das Fab-Fragment enthält nur eine Bindungsstelle für das Antigen (monovalent) - gentechnisch hergestellte Antikörper sind je nach Design ebenfalls monovalent und werden dann im Rahmen dieser Erfindung als Fab-Fragmente bezeichnet. Unter Fab- Fragment werden auch die Bindungsdomänen anderer Ig- Klassen verstanden, die über andere Methoden isoliert wurden.
Fc Fc-Fragment Das Fc-Fragment ist das Fragment nach Papain-Verdau von IgG-Antikörpern, das die C-terminalen konstanten Domänen (konstante Regionen) eines IgG enthält - in diesen Regionen sitzen die Bindungsstellen für die Komponenten C1q des Komplements, für Protein A und Protein G, sowie für die zellulären Rezeptoren-Proteine, die die konstanten Regionen der Antikörper spezifisch erkennen und binden.
Fc-γ-Rezeptor zelluläre Rezeptor-Proteine für die Fc-Region von IgG, die spezifisch die Antikörper binden, sobald diese einen Antigen-Antikörperkomplex gebildet haben
FITC Fluorescein-Isothiocyanat: Fluorescein aktiviert durch eine Isothiocyanate-Seitengruppe, die es ermöglicht, Fluorescein an andere Substanzen kovalent zu binden - Fluorescein kann als einfache Fluorescenz-Markierung benutzt werden, zum anderen kann es als Hapten-Analogon, i. e. als nicht Carrier-gebundene aber an die entsprechenden anti- Hapten-Antikörpem spezifisch bindende Substanz dienen. funktionelles Peptid Peptid, das einer funktionellen Domäne eines Proteins entspricht. funktionelles Protein Protein in nativer oder partiell denaturierrter Form, das noch in der Lage ist, mindestens eine der Funktion auszuführen, die einer der natürlichen Funktionen des Proteins im Orgamismus entspricht.
G Guanin
Gelelektrophorese Methode zur elektrophoretischen Auftrennung von Makromolekülen wie Polypeptiden, Proteinen oder Nukleinsäuren, bei der eine Gelmatrix (in der Regel Agarose oder Polyacrylamid) verwendet wird.
Hapten Substanz, die im Tier eine Immunantwort mit Antikörperbildung hervorruft, wenn sie an einen immunogenen Carrier (z.B. ein Protein) gebunden ist, wobei immunogen bedeutet, daß dieser Carrier selbst ein (im Idealfall sehr gut erkanntes) Antigen darstellt. Dabei unterscheiden sich in der Regel die bei der Immunantwort gegen den Carrier gebildeten Antikörper von der Immunantwort gegen das Hapten. Eine Substanz wird im Sinne der vorliegenden Erfindung als Hapten bezeichnet, wenn es an einen Carrier gebunden ist und als Bindungspartner für einen Antikörper dient. Die Substanz, die im Verbund mit dem Carrier das Hapten darstellt wird in der Regel auch vom anti-Hapten-Antikörper erkannt und gebunden, wenn sie nicht an einen Carrier oder an einen anderen Carrier gebunden vorliegt.
Hapten-Analogon Eine Substanz, die im Verbund mit einem Carrier das Hapten darstellt. Ein Hapten-Analogon wird vom anti- Hapten-Antikörper erkannt und gebunden, auch wenn sie nicht an einen Carrier gebunden vorliegt.
HEPES N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
Hetero-Alkenyl Alkenylgruppen, bei denen eine oder mehrere C-H Bindungen, C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=0, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkinyl Alkinylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen, C-C Einfach-, C=C Doppel- oder C≡C Dreifachbindung durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=0, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkyl Alkylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen oder C-C Einfachbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=0, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hybridisierungspuffer 7% SDS, 500 mM Na-Phosphatpuffer pH 7.5, 5 mM EDTA,
0.1 mg/ml ssDNA aus pBR322-Plasmid, 0.5 mg/ml acetyliertes BSA oder 7% SDS, 500 mM Na-Phosphatpuffer pH 7.5, 5 mM EDTA oder
100 mM MES, 1 M NaCI, 20 mM EDTA, 0.01 % TWEEN 20, pH 6.5 - 6.7
Hybridoma-Zellen, Chimäre Zellinien aus B-Zellen (überwiegend aus Maus und Hybridomzellen Ratte), die als immortalisierte Zellinien monoklonale Antikörper mit der Spezifität der B-Zellen produzieren.
IgA hoch affine Immunglobuline, die die Immunabwehr in den Schleimhäuten des Organismus unterstützen.
igE hoch affine Immunglobuline, die von bestimmten Zellen des Immunsystems gebunden werden, bei Infektion bestimmter Gruppen von Krankheitserregern und Parasiten auftreten, aber auch bei der Ausbildung von Allergien gebildet werden bzw. bei allergischen Reaktionen eine wichtige Rolle spielen.
IgG hoch affine Immunglobuline, die bei einer Immunantwort gebildet werden, und die auch noch nach einer Infektion lange Zeit im Serum nachweisbar sind.
IgM gering affine Immunglobuline, die während der Entwicklung der noch nicht vollständig differenzierten B-Zellen gebildet werden und die erste Immunantwort bei einer Infektion darstellen.
Immunoassay Ein Assay (Detektionssystem), das die spezifische Bindung des Antikörpers zu seinem Antigen nutzt, um das Antigen nachzuweisen - je nach Markierungsart und Nachweismethode unterscheidet man verschiedene Assays. Als Beispiele seien genannt: RIA (Radioimmunassay), RIST (Radioimmunosorbent test) und RAST (Radioallergosorbent test) bei Detektion über radioaktiver Markierung, EIA (enzyme linked immune assay) und ELISA (enzyme linked immumosorbent assay) bei Detektion über ein Enzym (in der Regel mit alkalischer Phosphatase, ß-Galactosidase oder Meerrettich-Peroxidase) und Quantifizierung der Umsetzung bestimmter Substrate durch z. B. Colorimetrie oder Chemilumineszenz, IF (Immunfluoreszenz) bei Detektion über Fluoreszenzfarbstoffen, IP (Immunopräzipitation) bei Detektion über direkte Isolierung des Präzipitats.
Isoelektrische Methode zur elektrophoretischen Auftrennung von Fokussierung (IEF) Polypeptiden und Proteinen nach deren pl - d.h. in Abhängigkeit von der Oberflächenladung, der Aminosäurezusammensetzung und posttranslationalen Modifikationen der Polypeptide und Proteine
Kernproteine Proteine, die mit der Zellkernfraktion isoliert werden.
Komplement-C1q Eine Komponente des Komplement-Systems C1q, die spezifisch an die Fc-Region von IgG und IgM-Antikörpern in einem Antigen-Antikörperkomplex binden.
Linker Molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Heteroalkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit den entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert.
MALDI-MS Matrix assisted laser desorption ionization - MS
Membranproteine Proteine, die in die Membran integriert oder an diese angelagert sind und mit der Membranfraktion isoliert werden können - Membranproteine können aus diesen Membranfraktionen mit Hilfe von Detergentien herausgelöst werden.
MES 2-Morpholinoethan-Sulfonsäure (Puffersubstanz)
Mismatch Zur Ausbildung der Watson Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine korrekten Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur des Doppelstrangs und wird als „Mismatch" bezeichnet. modifiziertes Nukleinsäureoligomer mit angebundener Rezeptor- Nukleinsäureoligomer Einheit. Die Begriffe "modifiziertes Nukleinsäureoligomer" und "Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit" werden äquivalent gebraucht. monoklonale Monoklonale Antikörper (in der Praxis überwiegend IgG- Antikörper Antikörper) werden jeweils von einem einzigen Hybridom- Zellklon hergestellt, wobei die von einem Zeilklon hergestellten Antikörper alle die gleiche definierte Antigenbindungsstelle besitzen und dem gleichen Isotyp angehören. Ensprechend zeigen monoklonale Antikörper eine Spezifität gegen nur ein definiertes Epitop.
MS Massenspektrometrie
NP-40 Detergens
Nukleinsäure wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Thio- Phosphat- oder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, dass sie komplementäre Nukleinsäuren sequenzspezifisch binden kann.
Nukleinsäureoligomer Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nukleinsäure-Oktamer: eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei dem 8 Pyrimidin- oder Purin- Basen kovalent aneinander gebunden sind).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "Nukleinsäureoligomer" sowohl als Bezeichnung für ein Einzelmolekül, als auch als Bezeichnung für beliebig viele Einzelmoleküle einer Art von Nukleinsäureoligomer gebraucht. Die jeweilige Bedeutung erschließt sich aus dem Kontext.
Nukleinsäureoligomer- Komplex aus einer Rezeptor-Einheit und einem Rezeptor-Einheit Nukleinsäureoligomer, wobei die Komplexbildung durch direkte oder indirekte Linker-verbrückte, kovalente oder nichtkovalente, spezifische Bindung zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor-Einheit verwirklicht sein kann und die Komplexzusammensetzung einer definierten Stöchiometrie entspricht.
Oligo Abkürzung für Oligonukleotid.
Oligomer Äquivalent zu Nukleinsäureoligomer.
Oligonukleotid Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäureoligomer, also z. B. ein DNA, PNA oder RNA Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge. pBR322-Plasmid E.co/.'-Klonierungsplasmid, die als ss-DNA zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen auf der Blot-Membran benutzt wird.
PBS Phosphat buffered saline: Puffersubstanz mit definierter Zusammensetzung - im Rahmen der vorliegenden Erfindung aus 10 mM Na-Phosphat, 135 mM NaCI, 5 mM KCI, pH 7.4 zusammengesetzt
PBST PBS mit 0.1% Tween20
PCR Polymerase chain reaction - zyklische DNA-Synthese- und Amplifizierungsmethode unter Verwendung thermostabiler DNA-Polymerasen
PCR-Puffer Puffer unterschiedlicher Zusammensetzung -jeweils angepaßt an die verwendete DNA-Polymerase
Peroxidase Enzym aus Meerrettich
Phosphat Wasch- 50 mM Kalium-Phosphat pH 7.5, 500 mM NaCI, 1 mM Puffer EDTA photoinduzierbar Photoinduzierbar bedeutet, dass eine gewisse Eigenschaft erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge entfaltet wird.
Phycoerythrin Pigment-Proteinkomplex aus Cyanobakterien, der als Fluoreszenz-Marker benutzt wird.
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid (Proteaseinhibitor)
PNA Peptidnukleinsäure (Synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker- Phosphat Einheit durch die -NH-(CH2)2-N(COCH2- Base)-CH2CO- Einheit hybridisiert PNA mit DNA.)
POD Abkürzung für Peroxidase (Peroxid-Dehydrogenase)
Poly-dT(33) Oligomer das aus 33 desoxy-Thymidinen aufgebaut ist. polyklonale Antikörper der Begriff bezeichnet einen Satz von Antikörpern mit im allgemeinen Undefinierter Zusammensetzung, die alle das gleiche Antigen spezifisch erkennen und binden.
Polyklonale Antikörper werden von unterschiedlichen B- Zellen des Immunsystems eines Tieres hergestellt, und aus den Seren der immunisierten Tiere gewonnen. Sogenannte anti-Seren entsprechen nicht weiter aufgereinigten polyklonalen Antikörpern und sind diesen gleichzusetzen. Polyklonale Antikörper besitzen je nach Komplexität des für die Immunisierung verwendeten Antigens ein weites oder stärker eingegrenztes Spektrum an Spezifität. Die Spezifität polyklonaler Antikörper kann über affinitätschromatographische Anreicherung und / oder Aufreinigung auf einen Teil der Epitope des Antigens eingeschränkt werden, so daß auch mit polyklonalen Antikörpern hohe Spezifität und hohe Affinität erreicht werden kann. primärerer Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter primärem Immunkomplex Immunkomplex ein Komplex aus spezifischem Antikörper und Target verstanden, wobei der spezifische Antikörper keine Rezeptor-Einheit bildet, sondern als ein Tag zur Immobilisierung des Targets eingesetzt wird.
Primer-Bindungsregion Region einer Nukleinsäure, die entweder direkt als Primer-Bindungsregion oder als Primer- Bindungsregion auf dem entsprechenden Komplementärstrang der Nukleinsäure dient.
Protein A / Protein G Proteine, die spezifisch an Antikörper mit intakter Fc-Region verschiedener Subklassen (überwiegend IgG) von Immunglobulinen binden
Proteine der Proteine die frei gelöst in anderen extracellulären extracelluläre Flüßigkeiten vorkommen
Flüßigkeiten
PVDF-Membranen Polyvinylidenfluorid-Membranen mit hydrophober Oberfläche, die bevorzugt für die Immobilisierung von Proteinen benutzt wird
Rezeptor-Einheit jede Substanz, jede Verbindung, jedes Biomolekül oder Molekül oder Kombinationen daraus, die aufgrund ihrer Primär-, Sekundär- oder Tertiärstrukturen eine Bindungsstelle für eine andere Substanz (Verbindung, Biomolekül oder Molekül oder Kombinationen) besitzt, die eine spezifische Bindung dieser anderen Substanz ermöglicht. Rezeptor-Einheiten sind z. B. ein Protein oder Peptid, oder einer der spezifischen Bindungspartner, die an ein Protein oder Peptid binden, ein Antikörper oder ein Antigen.
Rezeptor-Protein Protein (oder ein funktionelles Peptid), dessen natürliche Funktion es ist, einen oder eine definierte Gruppe von Kofaktoren (Bindungspartner) spezifisch zu binden, um seine biologisch relevante Funktion auszuüben.
RIPA-Puffer 150 mM NaC1 1 % NP-40, 0.5 % Desoxycholat, 0.1 % SDS, 50 mM Tris, pH 8.0
RNA Ribonukleinsäure
RP18-Material Chromatographiematerial, das eine hydrophobe Modifizierung der Oberflächen besitzt, wobei die Oberfläche mit Alkyl-Ketten der Länge C-18 modifiziert wurde.
Säulenvolumen Volumen einer Chromatographiesäule, das vom Puffer eingenommen wird - meist entspricht dieses Volumen ca. 80%-90% des Volumens, das von dem Chromatographiematerial gemeinsam mit Puffer eingenommen wird.
SDS Sodium (Natrium) dodecylsulfat (Detergens)
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese - spezielle Methode zur Auftrennung von Polypeptiden nach deren Größe unter denaturierenden Bedingungen sekundäre Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter Immunkomplexe sekundärem Immunkomplex der Komplex verstanden, der durch Aggregation primärer Immunkomplexe oder Rezeptor- Target-Komplexe nach Bindung von anti-lg-Antikörper oder anti-Hapten-Antikörper entsteht.
Sephacryl SIOO Gelfiltrationschromatographiematerial mit einem Trennbereich von 1 bis 100kDa
Sephacryl S200 Gelfiltrationschromatographiematerial mit einem Trennbereich zwischen 5 und 250 kDa
Serumproteine im Blutplasma gelöste Proteine
Spacer Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu verbindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. spezifische Bindung eine spezifische Bindung im Sinne der vorliegenden Erfindung liegt vor, wenn eine Substanz, die mindestens ein Molekül darstellt, von einer anderen konjugierten, oder einer begrenzten Gruppe von anderen konjugierten Substanzen, die mindestens ein Molekül darstellen, gebunden werden, wobei die Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur jeweils konjugierten Moleküle wesentlich zu dieser Bindung beitragen. Die spezifische Bindung unterscheidet sich somit im Sinne der vorliegenden Erfindung von einer kovalenten chemische Verbindung zweier Moleküle. Die spezifische Bindung kann durch eine oder mehrere ionische Bindungen, durch Wasserstoff-Brücken-Bindungen, van-der-Waals- Brücken, durch ππ- Wechselwirkung, durch Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation oder durch durch Verkapselung zueinander passender molekulare Strukturen (z. B. dreidimensional gestaltete Bindungstaschen und eingepassten Kofaktoren) vermittelt werden.
'spin column' Einweg-Säulen für kleine Mengen, die in ein Reaktionsgefäß eingehängt und über Zentrifugation eluiert werden können.
SS Single Strand (Einzelstrang)
SSC 20 x Vorratslösung: 3 M NaCI, 300 mM Na-Citrat pH 7.0, die als als 2x und 0.4x Lösung beim Waschen von Blots verwendet wird. ß-Galactosidase Enzym, das ß-Galactoside hydrolytisch spaltet. sulfo-NHS N-Hydroxysulfosuccinimid
T Thymin
Tag jede Substanz, jede Verbindung, jedes Biomolekül oder Molekül oder Kombinationen daraus, die aufgrund ihrer Primär-, Sekundär- oder Tertiärstrukturen eine Bindungsstelle für eine andere Substanz (Verbindung, Biomolekül oder Molekül oder Kombinationen) besitzt, die eine spezifische Bindung dieser anderen Substanz ermöglicht. Der Begriff "Tag" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung einschränkend so verstanden, dass diese Substanz nicht als Target oder als Rezeptor-Einheit und nicht als Detektions-Marker fungiert. Der Begriff wird zudem einschränkend so verstanden, daß das Tag kovalent an eine andere Substanz angebunden ist, insbesondere an die Targets oder Trägermaterialien der vorliegenden Erfindung, und der Immobilisierung der mit dem spezifischen Tag-Bindungspartner verbundenen Substanz dient. Typische Tags sind z. B. die kommerziell erhältlichen Substanzen Biotin, FITC, Digoxigenin, DNP und Rhodamin, eine Reihe von Peptiden wie HA-Tag, His-Tag, Flag-Tag, GST-Tag Z-Tag, funktionelle Enzyme wie z.B. AP, POD, ß- Galactosidase oder Luciferase.
Target Rezeptor-spezifische oder spezifische chemische Substanz; jede Substanz, jede Verbindung, jedes Biomolekül oder Molekül oder Kombinationen daraus, die aufgrund ihrer Primär-, Sekundär- oder Tertiärstrukturen eine Bindungsstelle für eine andere Substanz (Verbindung, Biomolekül oder Molekül oder Kombinationen) besitzt, die eine spezifische Bindung dieser anderen Substanz ermöglicht.
TE-Puffer 10 mM Tris/HCI pH 8.0, 1 mM EDTA
Trägermaterial Trägermaterial ist ein Material, das generell gewisse chemische Substanzen bindet während andere chemische Substanzen nicht gebunden werden. Trägermaterialien sind z.B. modifiziertes oder nicht modifiziertes Kieselgel-, Zellulose-, Agarose-Material, Nitrozellulose-Membranen, PVDF-Membranen, (modifiziert oder nicht modifizierte) Nylon-Membranen.
Tris Tris-(hydroxymethyl)-amminomethan (Puffersubstanz)
Tris/HCI Tris, wobei der pH mit HCI eingestellt wird - Tris ist mit Tris/HCI gleichgesetzt
TRITC Tetramethyl-Rhodamin B-Isothiocyanat: Tetramethyl- Rhodamin B aktiviert durch eine Isothiocyanate- Seitengruppe, die es ermöglicht, Tetramethyl-Rhodamin B an andere Substanzen kovalent zu binden - Tetramethyl- Rhodamin B kann als einfache Fluoreszenz-Markierung dienen, zum anderen kann es als Hapten-Analogon, i. e. als nicht Carrier-gebundene aber an die entsprechenden anti- Hapten-Antikörpem spezifisch bindende Substanz dienen.
Triton X100 Detergens
Tween20 Detergens
U Uracil
Zellorganellen Bestandteile verschiedener Fraktionen des Zellaufschlusses, die bei schonender Zellfraktionierung, meist als intakte Membranfraktionen mit spezifischer Kombination von Membranproteinen und löslichen Proteinen erhalten werden. Beispiele für Zellorganellen sind Mitochondrien, Lysosomen und Endosomen, ER-Vesikel und Golgi-Vesikel, Peroxisomen und die Zellkerne
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten, wobei die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten aus jeweils einem Nukleinsäureoligomer bekannter Sequenz und jeweils einer daran angebundenen Rezeptor-Einheit bestehen und die Rezeptor-Einheit eine chemische Substanz spezifisch binden kann, und Inkontaktbringen der bereitgestellten chemischen Substanzen mit den bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und zugehöriger chemischer Substanz erfolgt.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von chemischen Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der chemischen Substanzen mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, Bindung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz an ein geeignetes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, Spaltung einer oder mehrerer chemischer Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz derart, dass der Nukleinsäureoligomer- Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, von dem Chromatographiematerial getrennt wird, Auswaschen der von dem Chromatographiematerial getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile und Detektion der Nukleinsäureoligomer- Bestandteile durch ein geeignetes Verfahren.
Die vorliegende Erfindung umfasst daneben ein Verfahren zur Detektion von chemischen Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bereitstellen definierter Mengen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der chemischen Substanzen mit den definierten Mengen an Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz erfolgt, Bindung der- gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz an ein geeignetes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, Auswaschen der im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch ein geeignetes Verfahren direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor- Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial, Bereitstellen ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten mit den an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz und eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten erfolgt, Spaltung einer oder mehrerer chemischer Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz derart, dass der Nukleinsäureoligomer- Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, von dem Chromatographiematerial getrennt wird, Auswaschen der von dem Chromatographiematerial getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile und Detektion der Nukleinsäureoligomer- Bestandteile durch ein geeignetes Verfahren.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial, Bereitstellen definierter Mengen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der definierten Mengen an Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten mit den an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, Auswaschen der im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten durch ein geeignetes Verfahren direkt als Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen chemischen Substanzen umfassend die Schritte:
Bereitstellen einer oder mehrerer Arten unlöslicher chemischer Substanzen,
Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-
Einheiten, Inkontaktbringen der unlöslichen chemischen Substanzen mit den
Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz erfolgt,
Abtrennen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz, Spalten einer oder mehrerer chemischer Bindungen der
Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer
Substanz derart, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in
Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers von der unlöslichen chemischen Substanz getrennt wird, Abtrennen der von der unlöslichen chemischen Substanz getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile durch ein geeignetes Verfahren.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen chemischen Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer Arten unlöslicher chemischer Substanzen, Bereitstellen definierter Mengen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der unlöslichen chemischen Substanzen mit den definierten Mengen von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz erfolgt, Abtrennen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz, Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der von der unlöslichen chemischen Substanz getrennten, sich im Überstand befindenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch ein geeignetes Verfahren.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von Hapten-Analoga umfassend die Schritte: Bereitstellen eines oder mehrerer Hapten- Analoga, Bereitstellen eines Überschusses relativ zu den Hapten-Analoga von ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, Inkontaktbringen der Hapten-Analoga mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten- Analogon erfolgt, Bereitstellen der Hapten-Analoga in modifizierter Form, wobei die Modifikation in der Anbindung eines Carrier-Moleküls an die Hapten-Analoga besteht, wobei an jede Art von Hapten-Analogon eine bestimmte Art von Carrier-Molekül gebunden wird, welches der Bedingung genügt, dass durch die Anbindung des Carrier-Moleküls keine signifikante Änderung der spezifischen Bindungsfähigkeit des Epitops der Hapten-Analoga erfolgt, Inkontaktbringen der modifizierten Hapten- Analoga im Überschuss mit dem gebildeten Gemisch aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und modifiziertem Hapten-Analogon erfolgt, Bindung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und modifiziertem Hapten-Analogon an ein geeignetes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon erfolgt, Auswaschen der im Eluat verbleibenden Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon und Detektion der Nukleinsäureoligomer- Bestandteile der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten- Analogon durch ein geeignetes Verfahren direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bereitstellen von ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten im Überschuss relativ zu den chemischen Substanzen, Inkontaktbringen der chemischen Substanzen mit den Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, Bereitstellen der chemischen Substanzen in modifizierter Form, wobei die Modifikation in der Anbindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial besteht, Inkontaktbringen des Gemisches aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz mit den an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen, wodurch eine Bildung von Komplexen aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen erfolgt, Auswaschen der im Eluat verbleibenden Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz durch ein geeignetes Verfahren direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, Bereitstellen eines Überschusses relativ zu den ein oder mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten von ein oder mehreren chemischen Substanzen, Bindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial, Inkontaktbringen der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten mit den an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, Bereitstellen ein oder mehrerer Arten von zweiten chemischen Substanzen, wobei die zweiten chemischen Substanzen spezifisch an die chemischen Substanzen binden können, Inkontaktbringen der ein oder mehreren Arten von zweiten chemischen Substanzen mit den gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz, wobei durch die spezifische Bindung der zweiten chemischen Substanzen an die chemischen Substanzen zumindest ein Teil der gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz in die Bestandteile Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemische Substanz gespalten werden, wodurch die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in das Eluat freigesetzt werden, Auswaschen der freigesetzten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch ein geeignetes Verfahren direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als
Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem einen Kit zur Durchführung eines der oben genannten Verfahren, einen Kit zur zur Markierung chemischer Substanzen, einen Kit zur Detektion chemischer Substanzen, einen Kit zur Detektion von Proteinen oder Antigenen, einen Kit zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen chemischen Substanzen, einen Kit zur Detektion von Antikörpern, einen Kit zur Detektion von Haptenen oder Hapten-Analoga, einen Kit zur Detektion DNA- und/oder RNA-bindender Proteine, einen Kit zur Detektion der Antagonisten von Enzymen oder der Antagonisten von DNA- und/oder RNA-bindenden Proteinen, einen Kit zum Screenen von Hybridoma-Zellen und einen Kit zum Screenen von Hybridoma-Zellen und gleichzeitigem Epitop-Mapping. Jeder erfindungsgemäße Kit umfasst eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten.
In ihrer allgemeinsten Form betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wobei die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten aus jeweils einem Nukleinsäureoligomer bekannter Sequenz und jeweils einem daran angebundenen Rezeptor bestehen und der Rezeptor eine chemische Substanz spezifisch binden kann, und Inkontaktbringen der bereitgestellten chemischen Substanzen mit den bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und zugehöriger chemischer Substanz erfolgt. Die Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt nur, wenn der Rezeptor der Nukleinsäure-Rezeptor-Einheit die chemische Substanz spezifisch bindet. Diese(r) Komplex(e) aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und zugehöriger chemischer Substanz kann anschließend beliebigen Manipulationen ausgesetzt werden wie z. B. der Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und zugehöriger chemischer Substanz von nicht mit chemischen Substanzen komplexierten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten.
Nach Abschluss der für eine gewisse Aufgabenstellung notwendigen oder gewünschten Manipulationen kann - statt der spezifischen chemischen Substanz - der zugehörige Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der ursprünglich an diese chemische Substanz gebundenen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit als Nachweis für das Vorhandensein der chemischen Substanz verwendet werden. Der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit dient somit als universales Kodierungsmolekül für die zugehörige spezifische chemische Substanz, solange eine bestimmte Basensequenz einer bestimmten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und somit der bestimmten zugehörigen chemischen Substanz zugeordnet ist. Dies birgt u. a. die Vorteile, (1) dass es im allgemeinen einfacher ist ein Nukleinsäureoligomer nachzuweisen als eine beliebige chemische Substanz, vor allem wenn es sich um eine Undefinierte Mischung der chemischen Substanzen mit unterschiedlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften handelt (Vereinheitlichung und Parallelisierung der Detektion),
(2) dass es im allgemeinen einfacher ist ein Nukleinsäureoligomer nachzuweisen als eine beliebige chemische Substanz, vor allem wenn es sich um eine Undefinierte Mischung der chemischen Substanzen mit sehr ähnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften handelt und diese daher nur sehr schwer chromatographisch aufgetrennt werden können,
(3) dass in kleinen Volumen / hohen Konzentrationen der chemischen Substanzen gearbeitet werden kann,
(4) dass sekundäre Immunkomplexe zur besseren Abtrennung verwendet werden können, ohne dass der damit übliche Informationsverlust (Akklommeration verschiedener Rezeptor-Target-Einheiten) hingenommen werden muss,
(5) dass das kodierende Nukeinsäureoligomer durch geeignete Methoden amplifiziert werden kann und somit auch geringste Mengen einer chemischen Substanz einfach nachgewiesen werden können und
(6) dass das Inkontaktbringen unter Nutzung der hochspezifischen Wechselwirkung zwischen Rezeptor und zugehöriger chemischer Substanz stattfinden kann, die anschließenden Manipulationen und die schlussendliche Detektion aber auch unter Bedingungen stattfinden können, die die ursprüngliche Erscheinungsform der chemischen Substanzen verändert oder zerstört, und die Stabilität zwischen Rezeptor und chemischer Substanz nicht berücksichtigt werden muß, solange die Sequenzintegrität des Nukleinsäureoligomerbestandteils gewahrt bleibt.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäureoligomere sind durch chemische Bindung eines Substanz-spezifischen Rezeptors modifiziert. Als Nukleinsäureoligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA- Fragment, verwendet. In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff Nukleinsäureoligomer auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat- Strukturen, wie z. B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat- oder ein Phosphoramid-Rückgrat. Wesentliches Merkmal eines Nukleinsäureoligomers im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, dass sie analoge Nukleinsäureoligomere basensequenzspezifisch binden können. Alternativ zu dem Begriff "Nukleinsäureoligomer" werden die Begriffe "Oligonukleotid", "Nukleinsäure" oder "Oligomer" verwendet.
Unter einer "rezeptorspezifischen Substanz" (Target) wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Einheit (jede Substanz, jede Verbindung, jedes Biomolekül oder Molekül oder Kombinationen daraus) verstanden, die spezifisch an eine konjugierte Rezeptor-Einheit (Substanz, Verbindung, Biomolekül oder Molekül oder Kombinationen daraus) binden kann.
"Photolabil" heißt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Spaltung einer Gruppe, also deren Eigenschaft unter bestimmten äußeren Umständen in zwei oder mehrere Bruchstücke zu zerfallen, erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge entfaltet wird.
Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer
Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer. Ein Rezeptor wird an ein Nukleinsäureoligomer direkt kovalent durch die Reaktion des Nukleinsäureoligomers mit dem Rezeptor gebunden oder indirekt nichtkovalent durch Ausbildung spezifischer Wechselwirkungen zwischen dem (modifizierten) Nukleinsäureoligomer und dem (modifizierten) Rezeptor. Diese Bindung kann auf vier verschiedene Arten (a-d) durchgeführt werden:
a) Als reaktive Gruppe zur Bindungsbildung am Nukleinsäureoligomer wird eine freie Phosphorsäure-, Thiophosphorsäure-, Thiol-, Carbonyl-, Zucker-C-3-Hydroxy-,
Carbonsäure- oder Amin-Gruppe des Oligonukleotid-Rückgrats, insbesondere eine Gruppe an einem der beiden Enden des Oligonukleotid-Rückgrats, verwendet. Die freien, endständigen Phosphorsäure-, Thiophosphorsäure-, Thiol-, Carbonyl-, Zucker- C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen weisen eine erhöhte Reaktivität auf und gehen daher leicht typische Reaktionen wie z. B. eine Amidbildung mit (primären oder sekundären) Aminogruppen bzw. mit Säuregruppen, eine Esterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Alkoholen bzw. mit Säuregruppen, eine Thioesterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Thio-Alkoholen bzw. mit Säuregruppen, eine Disulfidbildung aus zwei Thiolgruppen oder die Kondensation von Amin und Aldehyd mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH2-NH Bindung ein. Die zur kovalenten Anbindung der Rezeptor-Einheit nötige Kopplungsgruppe (Säure-, Amin-, Alkohol-, Thioalkohol- oder Aldehydfunktion) ist entweder natürlicherweise an dem Rezeptor vorhanden oder wird durch chemische Modifikation des Rezeptors erhalten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit verwendet, wobei die Kopplung der reaktiven Gruppen zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor eine nach Induktion spaltbare Gruppe enthält. Dies kann z.B. eine Disulfidgruppe, die reduktiv, als nach Induktion durch ein Reduktionsmittel wie DTT oder ß-Mercaptoethanol, in die beiden Thiolbestandteile gespalten werden kann, eine -CHOH-CHOH- Gruppe, die durch Zugabe eines Oxidationsmittels wie z. B. Nal04 oder eine -CO-0-CH2-CH2-0-CO- Gruppe, die durch Zugabe von H2N-OH gespalten werden kann oder eine photolabile Gruppe wie z. B. die Azogruppe (-N=N-Gruppe), die nach Induktion durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge gespalten werden kann, sein.
b) Das Nukleinsäureoligomer ist über einen kovalent angebundenen Molekülteil (Spacer) beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge (längste durchgehende Kette von aneinander gebundenen Atomen), insbesondere der Kettenlänge 1 bis 50, am Oligonukleotid-Rückgrat bzw. an einer Base mit einer reaktiven Gruppe modifiziert. Die Modifikation erfolgt bevorzugt an einem der Enden des Oligonukleotid-Rückgrats bzw. an einer terminalen Base. Als Spacer kann z.B. ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinylsubstituent verwendet werden. Mögliche einfache Reaktionen zur Ausbildung der kovalenten Bindung zwischen Rezeptor-Einheit und des so modifizierten Nukleinsäureoligomers sind wie unter a) beschrieben, die Amidbildung aus Säure- und Amino-Gruppe, die Esterbildung aus Säure- und Alkohol-Gruppe, die Thioesterbildung aus Säure- und Thio-Alkohol- Gruppe, die Disulfidbildung aus zwei Thiolgruppen oder die Kondensation von Aldehyd und Amin mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH2-NH Bindung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit verwendet, bei der der Linker/Spacer nach Kopplung der reaktiven Gruppen zwischen Linker/Spacer und Nukleinsäureoligomer sowie zwischen Linker/Spacer und Rezeptor eine nach Induktion spaltbare Gruppe aufweist. Geeignete nach Induktion spaltbare Gruppen sind z.B. eine Disulfidgruppe, die reduktiv, also nach Induktion durch ein Reduktionsmittel wie DTT oder ß- Mercaptoethanol, in die beiden Thiolbestandteile gespalten werden kann, eine - CHOH-CHOH- Gruppe, die durch Zugabe eines Oxidationsmittels wie z. B Nal0 oder eine -CO-0-CH2-CH2-0-CO- Gruppe, die durch Zugabe von H2N-OH gespalten werden kann oder eine photolabile Gruppe wie z. B. die Azogruppe (-N=N-Gruppe), die nach Induktion durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge gespalten werden kann.
c) Bei der Synthese des Nukleinsäureoligomers wird eine terminale Base oder ein terminales Nukleotid bzw. terminales Nukleosid durch den Rezeptor, einen Linker/Spacer-modifizierten (vgl. b)) Rezeptor oder einen Linker/Spacer mit reaktiver Gruppe (vgl. b)) ersetzt. Die Anbindung des Rezeptors bzw. Linker/Spacer- modifizierten Rezeptors bzw. Linker/Spacers mit reaktiver Gruppe kann komplett oder in Teilen dieser Einheit mit anschließender Vervollständigung der Einheit erfolgen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit verwendet, bei der der Linker/Spacer nach Kopplung der reaktiven Gruppen zwischen Linker/Spacer und Nukleinsäureoligomer bzw. zwischen Linker/Spacer und Rezeptor eine nach Induktion spaltbare Gruppe aufweist. Neben den Kopplungsgruppen zur Anbindung an das Nukleinsäureoligomer bzw. an den Rezeptor befindet sich in der durchgehenden Kette zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor eine nach Induktion spaltbare Gruppe, z.B. eine Disulfidgruppe, die reduktiv, also nach Induktion durch ein Reduktionsmittel, wie DTT oder ß- Mercaptoethanol, in die beiden Thiolbestandteile gespalten werden kann, eine - CHOH-CHOH- Gruppe, die durch Zugabe eines Oxidationsmittels wie z. B Nal04 oder eine -CO-0-CH2-CH2-0-CO- Gruppe, die durch Zugabe von H2N-OH gespalten werden kann oder eine photolabile Gruppe wie z. B. die Azogruppe (-N=N-Gruppe), die nach Induktion durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge gespalten werden kann.
d) Das Nukleinsäureoligomer ist indirekt nichtkovalent an den Rezeptor gebunden. Dabei wird zum einen z. B. Biotin direkt oder indirekt über einen Spacer/Linker (vgl. b)) an ein Nukleinsäureoligomer gebunden und zum anderen Avidin, insbesondere monovalentes Avidin und/oder Streptavidin, insbesondere monovalentes Streptavidin und/oder anti-Biotin-Antikörper (bzw. das Fab-Fragment davon) an den Rezeptor (direkt oder indirekt über einen Spacer/Linker (vgl. b)) oder vice versa. Die Verknüpfung dieser modifizierten Nukleinsäureoligomer-Einheit mit dem entsprechend modifizierten Rezeptor-Einheit geschieht durch Kopplung der beiden Einheiten aufgrund der spezifischen Wechselwirkungen zwischen Biotin und Avidin (oder Biotin und Streptavidin oder Biotin und anti-Biotin-Antikörper oder zwischen Biotin und dem Fab-Fragment von anti-Biotin-Antikörper). Weitere Beispiele für die Realisierung der indirekten nichtkovalenten Verbindung zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor ergeben sich allgemein durch direkte oder indirekte Anbindung (vgl. b)) einer (zweiten) chemischen Substanz an das Nukleinsäureoligomer, die einen spezifischen Bindungspartner für eine dritte chemische Substanz darstellt, wobei diese dritte chemische Substanz diejenige ist, mit der der Rezeptor modifiziert wurde. Beispiele für solche zweite chemische Substanzen zur Bindung an das Nukleinsäureoligomer sind ein Hapten-Analogon (FITC, DNP, Digoxigenin oder Rhodamin), ein Antigen, ein His-Tag, ein HA-TAG, ein FLAG-TAG, ein GST-Tag, eine Z-Domäne (monovalente funktionelle Domäne des Protein A), ein funktionelles Protein, ein chitinbindendes Protein, ein Avidin, monovalentes Avidin, ein Streptavidin oder monovalentes Streptavidin ist. Der dazu passende spezifische Bindungspartner, also die dritte chemische Substanz ist ein Antikörper (spezifischer Bindungspartner für das Hapten oder das Antigen) oder Fa - Fragment (spezifischer Bindungspartner für das Hapten oder Antigen), insbesondere ein anti-FITC-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für FITC), ein anti-DNP- Antikörper (spezifischer Bindungspartner für DNP), ein anti-Digoxigenin-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für Digoxigenin) oder ein anti-Rhodamin-Antikörper, oder ein anti-His-Tag-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für His-Tag), ein anti- HA-TAG-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für HA-TAG), ein anti-Flag-Tag- Antikörper (spezifischer Bindungspartner für FLAG-TAG), ein anti-GST-Tag- Antikörper oder Glutathion (spezifische Bindungspartner für GST-Tag), Antikörper Fc- Fragment (spezifischer Bindungspartner für die Z-Domäne), Biotin (spezifischer Bindungspartner für Avidin, monovalentes Avidin, Streptavidin, monovalentes Streptavidin, anti-Biotin-Antikörper oder dem Fab-Fragment von anti-Biotin-Antikörper) oder dem spezifischen Bindungspartner für das funktioneile Protein wie z. B. Chitin als spezifischen Bindungspartner für das chitinbindende Protein. Statt der zweiten chemischen Substanz kann auch der spezifische Bindungspartner der zweiten chemischen Substanz an das Nukleinsäureoligomer gebunden werden, wobei dann zur indirekten Bindungsbildung zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor ein Rezeptor verwendet wird, der mit der zweiten chemischen Substanz modifiziert wurde.
Diese Anbindungsform birgt den Vorteil, dass zum einen der an das jeweilige Nukleinsäureoligomer anzubindenden Rezeptor in einer einfachen, unabhängigen und separaten Reaktion stöchiometrisch eindeutig angebunden werden kann und zum anderen, dass die Bindung zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor bzw. zwischen mehreren Nukleinsäureoligomeren und Rezeptoren - sofern zur Nukleinsäureoligomer-Rezeptorverbindung das identische Paar konjugierter chemischer Substanzen verwendet wurde - bei Bedarf gespalten werden kann (z. B. nach der Abtrennung der Komplexe aus Target und Nukleinsäure-Rezeptor-Einheit), indem ein spezifischer Antagonist auf die konjugierten chemischen Substanzen einwirkt (bzw. mehrere solcher Antagonisten bei Verwendung verschiedener konjugierter chemischer Substanzen, nötigenfalls jeweils im deutlichen Überschuss eingesetzt). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als Rezeptor ein Antigen, ein Antikörper, insbesondere ein monoklonaler Antikörper, ein Fab-Fragment eines Antikörpers ein Peptid oder Protein, ein Protein eines Multiproteinkomplexes, ein Allergen, ein Enzym, ein Enzym-Inhibitor, ein Hormon, ein Hormonrezeptorprotein, ds-DNA (ss-DNA, ss-RNA) mit spezifischer Sequenz zur Anbindung eines DNA- (RNA-) bindenden Proteins, ein DNA- oder RNA-bindendes Protein, ein Hapten-Analogon, ein Oligoglycosid oder ein Lectin verwendet.
Die Rezeptor-Einheit kann gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung an eine der Phosphorsäure-Einheiten, an eine der Thiophosphat-Einheiten, an eine der Thiol-Einheiten, an eine der Phosphorsäureamid-Einheiten, an eine der Zucker-Einheiten, insbesondere an eine Zucker-Hydroxy-Gruppe, an eine Carbonyl-, Carboxyl-, Amid- oder Amin-Gruppe, oder an eine der Basen des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils angebunden sein, insbesondere an eine endständige 3'- oder 5'-Einheit.
Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen die Rezeptor-Einheit über eine durch Induktion spaltbare Gruppe an den Nukleinsäureoligomer-Bestandteil angebunden ist, und darunter insbesondere die Ausführungsformen, in denen die Rezeptor-Einheit über eine -CHOH-CHOH- Gruppe, eine -CO-0-CH2-CH2-0-CO- Gruppe, eine -S-S- Gruppe, eine -N=N- Gruppe, über Psoralen oder über zwei spezifisch bindende konjugierte chemische Substanzen (siehe Punkt (d) im Abschnitt Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer) angebunden ist. Die spaltbaren Gruppen zwischen Nukleinsäureoligomer-Bestandteil und Rezeptor-Einheit können auch Bestandteil eines Linkers zwischen dem Nukleinsäureoligomer- Bestandteil und der Rezeptor-Einheit sein.
Bevorzugt sind außerdem Ausführungsformen, gemäß denen der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit wenigstens eine beliebige Primer-Bindungsregion umfasst, insbesondere Ausführungsformen, gemäß denen der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit zwei beliebige Primer-Bindungsregionn umfasst. Bevorzugt sind hierbei Primerabschnitte, die 5' von der Codierungssequenz identische Sequenz aufweisen (bevorzugt 8 - 24 bp lang) und 3' von der Codierungsregion eine Sequenz aufweisen, die komplementär zu (einem) Primer(n) (bevorzugt 8 - 24 bp lang) ist. Besonders vorteilhafte Effekte ergeben sich, wenn die verschiedenen Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten einer Analyse identische Primer-Bindungsregionen umfassen. Diese Ausführungsform birgt den Vorteil, dass die Nukleinsäureoligomer- Bestandteile der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit, insbesondere solche in Form von DNA, RNA oder PNA, bei Bedarf (z. B. nach der Abtrennung der Komplexe aus Target und Nukleinsäure-Rezeptor- Einheit und nachfolgender Abtrennung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils) durch PCR oder andere Methoden (Synthese mit Hilfe anderer DNA- oder RNA- Polymerasen) amplifiziert werden können, um z. B. auch geringe Targetmengen zu detektieren und/oder die Nukleinsäureoligomerbestandteile mit einem Detektionsmarker zu versehen. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung befindet sich 3' neben der Codierungsregion oder 3' neben der 3'-Primer-Bindungsregion eine Bindungsstelle für die T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase, wodurch eine in vitro Transskription der Codierungssequenz möglich wird.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die verschiedenen Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten keine zueinander komplementären Nukleinsäureoligomere auf und insbesondere in den Kodierungsregionen keine Bereiche auf, die zu mehr als 75% komplimentär zu den Primer-Bindungsregionen sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit verwendet, die vor, während oder nach Anbindung des Rezeptors nach einer der Möglichkeiten a) bis d) zusätzlich mit einem Fluoreszenzfarbstoff und / oder mit einem Hapten und / oder mit Biotin (Avidin/Streptavidin)), einer einheitlichen Basensequenz zur Anbindung eines universellen Primers (bei Verwendung von cDNA oder RNA als Nukleinsäureoligomer) und / oder einer reaktiven Gruppe (direkt oder Linker- / Spacer-gebunden) modifiziert wird. In dem erfindungsgemäßen Verfahren findet eine spezifische Bindungsbildung zwischen einer chemischen Substanz und dem Rezeptor der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit statt. Die für den jeweiligen Rezeptor spezifische Substanz, das Target, wird in einem beliebigen Substanzgemisch mit der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit markiert, wobei die rezeptormodifizierten Nukleinsäureoligomere als Reinsubstanzen (ein modifiziertes Nukleinsäureoligomer) oder Gemische (mehrere verschiedene modifizierte Nukleinsäureoligomere) eingesetzt werden können.
Spezifische Bindungsbildung zwischen chemischer Substanz und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit
Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die spezifische Bindung einer chemischen Substanz an eine für diese Substanz spezifische Rezeptor-Einheit der rezeptormodifizierten Nukleinsäureoligomere. Als Beispiele eines substanzspezifischen Rezeptors mit zugehöriger spezifischer chemischer Substanz seien genannt:
Rezeptor zugehörige spezifische chemische Substanz
Antigen (inklusive Hapten) Antikörper
Antikörper (monoklonal oder polyklonal, Antigen (inklusive Hapten) inklusive Fab-Fragment)
Enzym Inhibitor, Antagonist oder Kofaktor eines Enzyms
Inhibitor, Antagonist oder Kofaktor eines Enzym Enzyms ds-DNA (ss-DNA, ss-RNA) mit DNA- (RNA-) bindender Proteine spezifischer Sequenz zur Anbindung DNA- (RNA-) bindender Proteine
DNA- (RNA-) bindender Proteine ds-DNA (ss-DNA, ds-RNA, ss-RNA) mit spezifischer Sequenz zur Anbindung DNA- (RNA-) bindender Proteine ds-DNA (ss-DNA, ds-RNA, ss-RNA) mit Antagonisten DNA- (RNA-) bindender spezifischer Sequenz zur Anbindung Proteine DNA- (RNA-) bindender Proteine
Proteine eines Multi-Proteinkomplexes Multiproteinkomplex
Multiproteinkomplex Proteine eines Multi-Proteinkomplexes funktionelles Protein oder Peptid (z. B. spezifischer Bindungspartner eines Hormonrezeptorprotein) funktionellen Proteins oder eines funktioneilen Peptids (z. B. das Hormon) oder dessen Antagonist spezifischer Bindungspartner eines funktionelles Protein oder Peptid (z. B. funktioneilen Proteins oder eines der Hormonrezeptorprotein) funktioneilen Peptids (z. B. Hormon) oder dessen Antagonist
Lectin (Oligo-)Glycosid
(Oligo-)Glycosid Rezeptorprotein, Lectin
Die Verwendung von Antigenen als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass damit natürliche und künstlich hergestellte Antikörper gegen dieses Antigen identifiziert werden können. Dabei können mit dieser Methode auch extrem geringe Mengen natürlich vorkommender Antikörper (z. B. im Blutseren) nachgewiesen werden. Daneben kann ein Gemisch mit anderen verwandten Antigenen ausgetestet werden und die positiven Ergebnisse (Antigen mit gebundenem Antikörper) können quantitativ und in hoher Konzentration aus der Mischung abgetrennt werden, da die Methode keine Auftrennung der positiven Ergebnisse in dieser kritischen Phase erfordert. Die Antikörper können deshalb auch in sekundären Immunkomplexen mit anti-lg-Antikörpern gebunden werden, wodurch die quantitative Immobilisierung mit hoher Avididät für alle Antikörper deutlich verbessert wird. Letztendlich können die Bedingungen für die chromatographische Aufreinigung so optimiert werden, dass allein die Affinität der einzelnen Antigene zu den entsprechenden Antikörpern berücksichtigt werden muß. Die Eluation kann in Fraktionen mit steigender Stringenz bei den Waschbedingungen erfolgen. Die Verwendung von Antikörpern als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass die Antikörper gegen die entsprechenden Antigene eine extrem hohe Spezifität bei hoher Affinität besitzen, das Spektrum der Antigene beliebig breit ist und verschiedene physiologische Formen des Antigens unterschieden werden können. Damit ist gewährleistet, dass man in einer komplexen Mischung die einzelnen Antigene quantitativ identifizieren kann, ohne diese chromatographisch ab- oder auftrennen zu müssen. Daneben können auch Substanzen, die Hapten-Analoga bilden, mit Hilfe der Antikörper-Rezeptoren detektiert werden, wobei auch hier die Spezifität bei hoher Affinität die Unterscheidung nahe verwandter (chemisch ähnlicher) Substanzen in einer komplexen Mischung mit anderen, chromatographisch schwierig abtrennbaren Substanzen erlaubt.
Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern oder affinitätsaufgereinigten polyklonalen Antikörpern, die nur gegen eine bestimmte Region oder ein Epitop des Antigens gerichtet sind, ist besonders bevorzugt, da diese eine erhöhte Spezifität aufweisen, damit z. B. aktive und inaktive Isoformen, alternativ gespleißte, oder proteolytisch prozessierte, oder modifizierte Formen der ansonsten gleichen Antigene unterschieden werden können. Die Verwendung von Fab-Fragmenten der Antikörper bietet zudem den Vorteil, dass pro Fab-Fragment nur ein Antigen oder Hapten bindet und dass die Abtrennung der positiven Ergebnisse (Fab-Fragment mit zugehörigem Antigen oder Hapten) bei Verwendung von sekundären Immunkomplexen einfacher ist, da Fab-Fragmente, im Gegensatz zu Antikörpern, nicht an die Affinitätschromatographie-Träger binden.
Die Verwendung von Enzymen als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass ein bekannter wirksamer Antagonist (oder Inhibitor bzw. einer Gruppe davon) dem bisher unbekannten Wirkort (aus einer Auswahl von beliebigen Nukleinsäureoligomer-kodierten Enzymen) zugeordnet werden kann. Daneben können die als Rezeptoren verwendeten Enzyme zum quantitativen Nachweis von Inhibitoren, Antagonisten und Cofaktoren verwendet werden, die nicht immunogen sind. Darüber hinaus können Enzyme indirekt über ihre Kofaktoren an die Nukleinsäureoligomere angebunden werden. Dies erlaubt z. B. eine Anbindung eines Kofaktors an das Nukleinsäureoligomer, die i. a. nicht unter physiologischen Bedingungen durchgeführt werden muss, da die Kofaktoren i. a. wesentlich stabiler sind als der Enzymkomplex. Der Kofaktor kann z. B. direkt während der Festphasensynthese an das Nukleinsäureoligomer gebunden werden und die Nukeinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit wird nachträglich, durch Rekonstitution (Inkubation mit Kofaktor-befreitem Enzym) vervollständigt.
Die Verwendung von potentiellen Enzym-Inhibitoren und -Antagonisten als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass nach forschungsrelevanten oder therapeutisch relevanten Inhibitoren oder Antagonisten eines Enzyms (oder einer Gruppe von Enzymen) gesucht werden kann. Daneben können diese als Rezeptoren verwendeten Enzym-Inhibitoren und Antagonisten zum quantitativen Nachweis von Enzymen verwendet werden, wobei selektiv der Anteil der aktiven Form von Enzymen detektiert wird. Darüber hinaus können Enzym-Inhibitoren und -Antagonisten, solange sie einfache chemische Verbindungen sind, leicht mit Nukleinsäureoligomeren modifiziert werden, da sie i. a. nicht unter physiologischen Bedingungen gehandhabt werden müssen und somit z. B. direkt während der Festphasensynthese an das Nukleinsäureoligomer gebunden werden können.
Die Verwendung von ds-DNA (ss-DNA, ss-RNA) mit spezifischer Sequenz zur Anbindung DNA- (RNA-) bindender Proteine als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit besitzt gegenüber den Antikörpern den besonderen Vorteil, dass damit der Anteil der aktiven Formen, also der bindenden Formen bekannter DNA- (RNA-) bindender Protein quantitativ oder qualitativ nachgewiesen werden kann.
Außerdem kann mit solchen Rezeptoren nach bisher nicht bekannten Sequenzen gesucht werden, die spezifisch an ein DNA- (RNA-) bindendes Protein (bzw. eine Gruppe DNA- (RNA-) bindender Proteine) binden, und aus diesen Informationen eine consensus-Sequenz der Bindungsstelle ermittelt werden. Daneben können diese Nukleinsäure-Rezeptor-Einheiten in Kombination mit den zugehörigen Targets benutzt werden, um festzustellen für welche der Komplexe aus ds-DNA (ss-DNA, ss- RNA)-Sequenz und DNA- (RNA-) bindender Proteine eine potentieller Antagonist wirkt, wodurch man nicht nur eine consensus-Bindungsstelle ermittelt, sondern diese Bindungsstellen auch eine funktionelle Relevanz besitzt.
Darüber hinaus können die spezifischen Sequenzen direkt in der Festphasensynthese an das Kodierungs-Nukleinsäureoligomer angebunden werden. Auch müssen diese spezifischen Sequenzen zur Anbindung DNA- (RNA-) bindender Proteine nicht notwendigerweise zur Detektion abgetrennt werden (nach Ausbildung und Abtrennung der Rezeptor-Target-Komplexe und gegebenenfalls anschließender Dissoziation der Target-Einheit).
Die Verwendung DNA- (RNA-) bindender Proteine als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass damit bekannte ds-DNA (ss-DNA, ds-RNA, ss-RNA) mit spezifischer Sequenz zur Anbindung charakterisiert werden können in Bezug auf das Spektrum welche DNA- (RNA-) bindende Proteine an diese Sequenzen binden. Dies ist bei Promotorstudien, bei alternativem Spleißen und bei der Bestimmung von spezifischen m-RNA- Transportfaktoren ein wichtiges Hilfsmittel. DNA- und RNA-bindende Proteine können auch herangezogen werden, um die Verfügbarkeit von Bindungsstellen, die aufgrund eines Regulationsmechanismus blockiert sein können, qualitativ und quantitativ nachzuweisen
Die Verwendung von Proteinen eines Multiproteinkomplexes als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass damit Multiproteinkomplexe qualitativ und quantitativ detektiert werden können. Sie können auch als sogenannte potentielle Komponenten dazu herangezogen werden, um nach unbekannten Bindungspartnern für ein bestimmtes Protein oder Multiproteinkomplex zu suchen.
Die Verwendung von Multiproteinkomplexen als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass damit Proteine in physiologisch aktiver Form qualitativ und quantitativ detektiert werden können, die an einen bestimmten Multiproteinkomplex binden.
Die Verwendung von funktionellem Protein oder Peptid (z. B. ein Hormon- Rezeptorprotein) als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass ein bekannter wirksamer Bindungspartner (z. B ein Hormon), ein Antagonist zu diesem Bindungspartner (oder Inhibitor bzw. einer Gruppe davon) dem bisher unbekannten Wirkort (aus einer Auswahl von beliebigen Nukleinsäureoligomer-kodierten funktioneilen Proteine oder Peptide) zugeordnet werden kann. Daneben können diese als Rezeptoren verwendeten Proteine oder Peptide zum quantitativen Nachweis von Bindungspartnern wie z. B. Hormonen, Antagonisten zu diesem Bindungspartner (oder Inhibitoren oder Cofaktoren) verwendet werden, wobei der Anteil der aktiven Form von Bindungspartnern detektiert wird.
Die Verwendung von potentiellen spezifischen Bindungspartners eines funktioneilen Proteins oder eines funktionellen Peptids (z. B. eines Hormons) oder eines potentiellen Antagonisten als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass nach forschungsrelevanten oder therapeutisch relevanten Inhibitoren oder Antagonisten des Bindungspartners eines bestimmten funktionellen Proteins oder Peptids (oder einer Gruppe von funktionellen Proteinen oder Peptiden) gesucht werden kann. Daneben können diese Bindungspartner zum quantitativen Nachweis der zugehörigen Rezeptor-Proteine (z. B. der Hormon- Rezeptorprotein) herangezogen werden, wobei die aktive Form der Rezeptor-Proteine mit freier Bindungsstelle detektiert wird.
Die Verwendung von Lectinen als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass Glycosylierungsmuster und / oder pathologische Veränderungen des Glycosylierungsmusters qualitativ und quantitativ erfasst werden können. Darüber hinaus sind Lectine besonders stabil und können daher einfach (unter breiten Reaktionsbedingungen) mit den Nukleinsäureoligomeren verbunden werden.
Die Verwendung von Oligoglykosiden als Rezeptoren der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit besitzt den besonderen Vorteil, dass sie als Bindungspartner für verschiedene Rezeptorproteine dienen und damit diese qualitativ und quantitativ erfasst werden können, wobei die aktiven Rezeptor-Proteine detektiert werden. Darüber hinaus können Oligoglykosiden daraufhin geprüft werden, ob sie als Bindungspartner für ein bestimmtes Rezeptorprotein dienen. Die spezifische Bindungsbildung zwischen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und einer oder mehrerer Arten von spezifisch bindenden chemischen Substanzen (Targets) kann in beliebigen Aggregatszuständen der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und der Targets erfolgen, wobei die Targets in vitro oder in vivo vorliegen können. Bevorzugt sind die Bindungsbildung in löslicher Umgebung, wobei auch einer der beiden Bindungspartner, insbesondere das/die Target(s), nicht notwendigerweise in gelöster Form vorliegen muss. Er kann auch in Form eines Präzipitats, in permeable Vesikel (Zellen) eingeschlossen, an/in (Zeil-) Membranen oder geeignete Trägermaterialien gebunden oder in Form von Mizellen in der Lösung enthalten sein. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung findet die spezifische Bindungsbildung zwischen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten und einer oder mehrerer Arten von spezifisch bindenden chemischen Substanzen (Targets) durch Immobilisieren der Targets auf einem Träger und Inkubation der Träger-immobilisierten Targets mit den Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten statt, wobei die Inkubation durch Zugabe der gelösten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten stattfindet.
Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten
Die nachfolgende Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz von den restlichen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten kann durch spezifische Präzipitation, Filtration, Zentrifugation, durch chromatographische Methoden (Säulenchromatographie, Affinitätschromatographie, Size-Exclusion (Gelfiltration), Membranchromatographie etc.) oder durch Gelelektrophorse erfolgen.
Als "Trägermaterial" oder "Chromatographiematerial" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedes stationäre zwei oder dreidimensionale Material bezeichnet, das - nötigenfalls durch entsprechende Derivatisierung - geeignet ist, einen oder mehrere der Bausteine des Komplexes aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz zu binden. Das Chromatographiematerial kann auch an eine "Chromatographieoberfläche" gebunden sein, wobei als Chromatographieoberfläche jedes stationär an einer Fläche aufgebrachte Material oder jede Oberfläche verstanden wird, die es erlaubt, einen oder mehrere der Bausteine des Komplexes aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz in einer nach der Art der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz geordnetem Raster zu binden, also in einer definierten ortsaufgelösten Anordnung der verschiedenen Komplexes aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz.
In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Chromatographiematerial - nötigenfalls nach vorhergehender Derivatisierung - geeignet, die rezeptorspezifische Substanz, das Target, oder Modifikationen der rezeptorspezifischen Substanz (Targetkomplexe aus rezeptorspezifischer Substanz und einer oder mehreren weiteren chemischen Substanzen, die nicht die erfindungsgemäße Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit darstellen), als solche oder einen oder mehrere der Bausteine dieses Targetkomplexes, zu binden, während die nicht targetbesetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten nicht gebunden werden (oder vice versa).
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Immobilisierung der Targets zur Inkubation einer oder mehrerer Arten von Targets mit einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und / oder zur Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von den restlichen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Bindung an ein
Chromatographiematerial. Diese Bindungsbildung zwischen Target und Chromatographiematerial kann folgendermaßen durchgeführt werden:
a) Bindung an Ionenaustauscher: Das Target oder der Komplex aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target wird an starke Ionenaustauscher gebunden, die so auf die Anbindung der Targets optimiert wurden, dass die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten alleine (ohne zugehöriges Target) nicht gebunden werden. b) Bindung an speziell modifiziertes Chromatographiematerial über zwei spezifische Bindungspartner: Das Target alleine oder das Target im Komplex aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target wird mit einer weiteren (zweiten) chemischen Substanz modifiziert, die einen spezifischen Bindungspartner für eine dritte chemische Substanz darstellt, wobei diese dritte chemische Substanz diejenige ist, mit der das Chromatographiematerial modifiziert wurde. Solche weiteren (zweiten) chemischen Substanzen sind z. B. ein Hapten-Analogon (Biotin, FITC, DNP, Digoxigenin oder Rhodamin), ein Antigen, ein His-Tag, ein HA-Tag, ein Flag-Tag, ein GST-Tag, eine Z-Domäne (monovalente funktioneile Domäne des Protein A), ein funktionelles Protein, ein chitinbindendes Protein, ein Avidin, monovalentes Avidin, ein Streptavidin oder monovalentes Streptavidin. Der dazu passende spezifischen Bindungspartner, also die dritte chemische Substanz, ist ein Antikörper (spezifischer Bindungspartner für das Hapten-Analogon oder das Antigen) oder Fab-Fragment (spezifischer Bindungspartner für das Hapten-Analogon oder Antigen) ist, insbesondere ein anti-FITC-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für FITC), ein anti-DNP-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für DNP) ein anti-Digoxigenin- Antikörper (spezifischer Bindungspartner für Digoxigenin), oder ein anti-Rhodamin- Antikörper, oder ein anti-His-Tag-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für His- Tag), ein anti-HA-Tag-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für HA-Tag), ein anti- Flag-Tag-Antikörper (spezifischer Bindungspartner für Flag-Tag), ein anti-GST-Tag- Antikörper oder Glutathion (spezifische Bindungspartner für GST-Tag), Antikörper Fc- Fragment (spezifischer Bindungspartner für die Z-Domäne), Biotin (spezifischer Bindungspartner für Avidin, monovalentes Avidin, Streptavidin, monovalentes Streptavidin, anti-Biotin-Antikörper oder dem Fab-Fragment von anti-Biotin-Antikörper) oder der spezifische Bindungspartner für das funktioneile Protein wie z. B. Chitin als spezifischer Bindungspartner für das chitinbindende Protein. Statt der zweiten chemischen Substanz kann auch der spezifische Bindungspartner der zweiten chemischen Substanz an das Target alleine oder das Target im Komplex aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target gebunden werden, wobei als Chromatographiematerial ein mit der zweiten chemischen Substanz modifiziertes Chromatographiematerial verwendet wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die zweite und dritte chemische Substanz zur Anbindung des Targets an das Chromatographiematerial verschieden von der zweiten und dritten chemischen Substanz zur indirekten Verknüpfung von Nukleinsäureoligomer und Rezeptor (siehe Abschnitt "Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer")
c) Bindung an Chromatographiematerial über Photocrosslinking: Das Target wird vor Bildung des Komplexes aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target mit einem Photocrosslinker modifiziert. Die Anbindung an das Chromatographiematerial wird durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge induziert. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Photocrosslinker verwendet, der über eine nach Induktion spaltbare Gruppe verfügt, wie z. B. über eine Disulfidgruppe, die reduktiv, also nach Induktion durch ein Reduktionsmittel (z. B. DTT oder ß-Mercaptoethanol), in die beiden Thiolbestandteile gespalten werden kann, über eine -CHOH-CHOH- Gruppe, die durch Zugabe eines Oxidationsmittels wie z. B Nal04 oder über eine -CO-0-CH2-CH2-0-CO- Gruppe, die durch Zugabe von H2N-OH gespalten werden kann. Die spaltbare Gruppe kann auch eine photolabile Gruppe wie z. B. die Azogruppe (-N=N-Gruppe) sein, die nach Induktion durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge gespalten werden kann, wobei eine photolabile Gruppe besonders bevorzugt ist, die zur Spaltung Licht anderer Wellenlänge braucht als der Photocrosslinker zur Aktivierung. Alternativ kann auch das Chromatographiematerial mit einem Photocrosslinker modifiziert sein und das unmodifizierte Target wird vor Bildung des Komplexes aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target an das Chromatographiematerial durch Inkubation des Targets mit dem Chromatographiematerial und Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge angebunden.
d) Bindung an das Chromatographiematerial über chemische Bindung: Das Target alleine wird vor Bildung des Komplexes aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target mit einem Linker mit reaktiver Gruppe, insbesondere einem aktivierten Linker modifiziert wie z. B. mit einem über die 4-Azido-Gruppe durch Photocrosslinking an das Target gekoppeltes 4-Azidobenzoesäure-N- sulfosuccmimidylester Natriumsalz. Die Anbindung an das Chromatographiematerial erfolgt durch Inkontaktbringen des modifizierten Targets mit geeignetem Chromatographiematerial, also solchem mit der nötige Gegengruppe zur Ausbildung einer kovalenten chemischen Bindung mit der reaktiven Gruppe des Linkers. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Linker verwendet der über eine nach Induktion spaltbare Gruppe verfügt, wie z. B. über eine Disulfidgruppe, die reduktiv, also nach Induktion durch ein Reduktionsmittel (z. B. DTT oder ß-Mercaptoethanol), in die beiden Thiolbestandteile gespalten werden kann, über eine -CHOH-CHOH- Gruppe, die durch Zugabe eines Oxidationsmittels wie z. B Nal04 oder über eine -CO-0-CH2-CH2-0-CO- Gruppe, die durch Zugabe von H2N-OH gespalten werden kann oder über eine photolabile Gruppe wie z. B. die Azogruppe (- N=N-Gruppe), die nach Induktion durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge gespalten werden kann. Alternativ kann auch das Chromatographiematerial mit einem chemischen Crosslinker modifiziert sein und das unmodifizierte Target wird vor Bildung des Komplexes aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und Target an das Chromatographiematerial durch Inkubation des Targets mit dem Chromatographiematerial angebunden.
e) Bindung an ein mit Antikörpern oder mit Rezeptor-Proteinen modifiziertes Chromatographiematerial: Existieren für die Targets bzw. das Target im Komplex aus
Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target neben dem Rezeptor spezifische Antikörper, wie z.B. anti-lgA-Antikörper, anti-lgG-Antikörper, anti-IgM-Antikörper, anti- IgE-Antikörper und anti-lgD-Antikörper, spezifische Fab-Fragmente, oder spezifische monoklonale oder polyklonale Antikörper (z. B. im Falle von Antigenen oder Haptenen als Targets) kann das Chromatographiematerial mit diesen Antikörpern und / oder Fab-Fragmenten und / oder monoklonale und / oder polyklonale Antikörpern modifiziert werden, um die Targets oder Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target an den Träger zu binden. Existieren gegen Target-besetzte Rezeptoren im Komplex aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target andere Bindungspartner wie z. B. Rezeptor-Proteine wie Fc-γ-Rezeptoren oder Kompliment- C1q, die selektiv gegen Gruppen von Target-besetzte Rezeptoren wirken, können auch diese zur Modifikation des Säulenmaterials verwendet werden.
f) Bindung an ein mit Protein A-, Protein G- oder gegen die Fc-Domäne gerichtete anti-lg-Antikόrper-modifiziertes Chromatographiematerial: Existieren für die Targets bzw. das Target im Komplex aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target neben dem Rezeptor spezifische Antikörper, oder spezifische monoklonale oder polyklonale Antikörper (z. B. im Falle von Antigenen oder Haptenen als Targets) können die Targets nach Ausbildung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und Target aber vor Anbindung dieser Komplexe an das Chromatographiematerial mit den Antikörpern inkubiert werden, wodurch sich aus den Komplexen sogenannte primäre und nach Zugabe von anti-lg-Antikörpern sekundäre Immunkomplexe bilden. Diese (primären oder) sekundären Immunkomplexe können über Chromatographiematerial, das mit Protein A, Protein G oder mit gegen die Fc- Domäne gerichtete anti-lg-Antikörper modifiziert ist, von den verbleibenden nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten abgetrennt werden. In einer besonderen Ausführungsform, bei der der Rezeptor und die eingesetzten Antikörper verschiedene Regionen oder Epitope erkennen, kann die Inkontaktbringung der Antikörper mit den Targets auch gleichzeitig mit dem Inkontaktbringung der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten mit den Targets erfolgen.
g) Bindung an mit Target modifiziertem Chromatographiematerial: Das Chromatographiematerial wird mit der oder den Arten von Targets abgesättigt, z. B. analog zu den Methoden a) bis d) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten"). Nach Inkontaktbringen der Nukleinsäure- Rezeptor-Einheiten und Targets und Bindungsbildung zwischen Nukleinsäure- Rezeptor-Einheiten und Targets wird die Mischung mit so modifiziertem Chromatographiematerial in Kontakt gebracht, wobei die nicht Target-besetzten Nukleinsäure-Rezeptor-Einheiten immobilisiert werden und die Target-besetzten Nukleinsäure-Rezeptor-Einheiten im Eluat verbleiben.
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von den restlichen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten nicht durch Bindung an ein Chromatographiematerial. Bei in wässrigen Medien unlöslichen Targets, z. B. unlöslichen Proteinen als Targets, kann die Komplexbildung zwischen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target durch Inkubation einer Suspension der Targets mit den gelösten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter dem Ausdruck "wässriges Medium" alle Lösungen mit dem Hauptbestandteil Wasser verstanden. Nach erfolgter Komplexbildung werden die löslichen nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt (Pelletierung der komplexe, gemeinsam mit verbleibendem unlöslichem Material). Auch bei Targets mit hohem Molekulargewicht im Vergleich zum Molekulargewicht der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten können nach erfolgter Komplexbildung die löslichen nicht besetzten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten durch Zentrifugation abgetrennt werden. Bei im Vergleich zu den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten großen Targets können die nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Size-Exclusion (Gelfiltration) oder Filtration abgetrennt werden. Weiterhin können die Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten als sekundären Immunkomplexe (vgl. Methode f) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten") durch Filtration oder Zentrifugation (Immunpräzipitation) von den restlichen Bestandteilen der Untersuchungslösung abgetrennt werden.
Verfahrensalternative I A: Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von chemischen Substanzen, umfassend die Schritte (i) Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, (ii) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, (iii) Inkontaktbringen der chemischen Substanzen mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, (iv) Bindung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz an ein geeignetes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den ins Eluat übergehenden nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, (v) Spaltung einer oder mehrere chemische Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz derart, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, von dem Chromatographiematerial getrennt wird, und schließlich (vi) Auswaschen der von dem Chromatographiematerial getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile und deren (vii) Detektion durch ein geeignetes Verfahren. Alternativ zu den Schritten (iv) und (vi) können bei Targets mit hohem Molekulargewicht im Vergleich zum Molekulargewicht der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten nach erfolgter Komplexbildung die löslichen nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Zentrifugation abgetrennt werden oder bei im Vergleich zu den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten großen Targets die nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Size- Exclusion (Gelfiltration) abgetrennt werden.
Verfahrensalternative IB: Alternativ können die chemischen Substanzen durch ein Verfahren mit den nachfolgend genannten Schritten detektiert werden: (i) Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, (ii) Bereitstellen definierter Mengen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, (iii) Inkontaktbringen der chemischen Substanzen mit den definierten Mengen von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, (iv) Bindung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz an ein geeignetes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den ins Eluat übergehenden nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, und schließlich (v) Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der im Eluat befindlichen, nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als
Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren.
Alternativ zum Schritt (v) können bei Targets mit hohem Molekulargewicht im Vergleich zu den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten nach erfolgter Komplexbildung die löslichen nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten durch Zentrifugation abgetrennt werden oder bei im Vergleich zum Molekulargewicht der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten großen Targets die nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Size-Exclusion (Gelfiltration) abgetrennt werden. Verfahrensalternative HA: Alternativ können die chemischen Substanzen durch ein Verfahren mit den nachfolgend genannten Schritten detektiert werden: (i) Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, (ii) Bindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial, (iii) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, (iv) Inkontaktbringen der Nukleinsäureoiigomer-Rezeptor-Einheiten mit den an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz stattfindet und somit eine Trennung von den ins Eluat übergehenden nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, (v) Spaltung einer oder mehrerer chemischer Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz derart, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, von dem Chromatographiematerial getrennt wird, und schließlich (vi) Auswaschen der von dem Chromatographiematerial getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile und deren Detektion durch ein geeignetes Verfahren.
Verfahrensalternative IIB: Alternativ können die chemischen Substanzen durch ein Verfahren mit den nachfolgend genannten Schritten detektiert werden: (i) Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, (ii) Bindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial, (iii) Bereitstellen definierter Mengen ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, (iv) Inkontaktbringen der definierten Mengen an Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten mit den an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz stattfindet und somit eine Trennung von den ins Eluat übergehenden nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten erfolgt, und schließlich (v) Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der im Eluat befindlichen, nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als
Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren.
Verfahrensalternative III: Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen Substanzen, insbesondere unlöslicher Proteine umfassend die Schritte (i) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten unlöslicher Substanzen, insbesondere unlöslicher Proteine, (ii) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten, Inkontaktbringen der unlöslichen Proteine mit den Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und unlöslichem Protein erfolgt, (iii) Abtrennen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslichem Protein von nicht-Target- besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, (iv) Spaltung einer oder mehrerer chemischer Bindungen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und unlöslichem Protein derart, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers von dem unlöslichen Protein getrennt wird, (v) Abtrennen der von dem unlöslichen Protein getrennten gelösten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile und schließlich (vi) Detektion der von dem unlöslichen Protein getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile durch ein geeignetes Verfahren.
In einer besonderen Ausführungsform der Verfahrensalternative III werden die Schritte (iii) Abtrennen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslichem Protein von nicht-Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten und (v) Abtrennen der von dem unlöslichen Protein getrennten gelösten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile durch Zentrifugation durchgeführt. Alternativ dazu können im Schritt (iii) die nicht besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und / oder im Schritt (v) die von dem unlöslichen Protein getrennten gelösten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile durch Size-Exclusion (Gelfiltration) abgetrennt werden. Verfahrensalternative IV: Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem ein Verfahren zur Detektion von Hapten-Analoga umfassend die Schritte (i) Bereitstellen einer oder mehrerer Hapten-Analoga, (ii) Bereitstellen eines Überschusses von ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten (relativ zu den in Schritt (i) bereitgestellten Hapten-Analoga), (iii) Inkontaktbringen der bereitgestellten Hapten-Analoga mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten- Analogon erfolgt, (iv) Bereitstellen eines Überschusses der im Schritt (i) bereitgestellten Hapten-Analoga in Form von mit Carrier modifizierten Hapten- Analoga, (v) Inkontaktbringen der im Schritt (iv) bereitgestellten modifizierten Hapten- naloga mit den in Schritt (iii) gebildeten Gemisch aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon, wodurch Komplexe aus verbliebenen nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und modifizierter Hapten-Analogon erfolgt, (vi) Anbinden der in Schritt (v) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und modifizierter Hapten- Analogon an ein geeignetes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den ins Eluat übergehenden Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten-Analogon erfolgt und schließlich (vii) Detektion der ins Eluat übergegangenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Hapten- Analogon direkt als Komplex aus chemischer Substanz und Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens IV besteht die Modifikation der in Schritt (iv) bereitgestellten modifizierten Hapten-Analoga in der Anbindung eines Carrier-Moleküls an die Hapten-Analoga bei der an jede Art von Hapten-Analogon eine spezifische Art von Carrier-Molekül gebunden wird, welches der Bedingung genügt, dass durch die Anbindung des Carrier-Moleküls keine signifikante Änderung der spezifischen Bindungsfähigkeit des Epitiops der Hapten-Analoga zur Anbindung des Rezeptor-Bestandteils der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit erfolgt. Alternativ zum Schritt (vi) können bei Carriern mit hohem Molekulargewicht im Vergleich zu dem Molekulargewicht der mit Hapten-Analogon besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten nach erfolgter Komplexbildung die Komplexe aus mit Carrier modifiziertem Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit durch Zentrifugation von den Komplexen mit Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit abgetrennt werden oder bei im Vergleich zu den mit Hapten-Analogon besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten großen Carriern die Komplexe aus mit Carrier modifiziertem Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit durch Size-Exclusion (Gelfiltration) von den Komplexen aus Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten abgetrennt werden.
Verfahrensalternative V: Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von chemischen Substanzen, umfassend die Schritte (i) Bereitstellen einer oder mehrerer chemischer Substanzen, (ii) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, (iii) Inkontaktbringen der chemischen Substanzen mit den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, (iv) Bindung der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten an ein mit den Targets modifiziertes Chromatographiematerial, wodurch eine Trennung von den ins Eluat übergehenden Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, und schließlich (v) Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der im Eluat befindlichen, Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten direkt als Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren.
Verfahrensalternative VI: Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Detektion von Antagonisten für Bindungspartner von Rezeptorproteinen oder Enzymen umfassend die Schritte (i) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Bindungspartnern von Rezeptorproteinen oder Enzymen, (ii) Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wobei der Rezeptor einen potentiellen Antagonisten der Bindungspartner von Rezeptorproteinen oder Enzymen darstellt, (iii) Bereitstellen eines Überschusses an mit den Targets Rezeptorproteinen oder Enzymen modifizierten Chromatographiematerial (im Vergleich zu den Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten), (iv) Inkontaktbringen der in Schritt (ii) bereitgestellten einen oder mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten mit dem in Schritt (iii) bereitgestellten Target-modifizierten Chromatographiematerial, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target-modifizierten
Chromatographiematerial erfolgt, (v) fraktionierte Eluation der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten mit einer allmählich steigenden Konzentration der in Schritt (i) bereitgestellten Bindungspartner der Rezeptorproteine oder Enzyme, wodurch eine Trennung von den ins Eluat übergehenden nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt, und schließlich (v) separate Detektion der in den einzelnen Fraktionen vorhandenen Nukleinsäureoligomer- Bestandteile der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten direkt als
Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit oder nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als
Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren.
In einer besonderen Ausführungsform der Verfahrensvariante VI wird zusätzlich nach der fraktionierten Eluation mit den Bindungspartnern ein Eluationsschritt mit einem bekannten Antagonisten durchgeführt und die so erhaltenen Nukleinsäureoligomer- Bestandteile werden durch ein geeignetes Verfahren separat detektiert.
In einer besonderen Ausführungsform der Verfahrensvariante VI wird zusätzlich nach der fraktionierten Eluation der Schritt Spaltung einer oder mehrerer chemischer Bindungen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und modifiziertem Chromatographiematerial derart durchgeführt, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers vom Target-modifizierten Chromatographiematerial getrennt wird, eingefügt und die so erhaltenen Nukleinsäureoligomer-Bestandteile werden durch ein geeignetes Verfahren separat detektiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird in den Verfahren IA, IB, IIA, IIB, IV, V und VI bei Verwendung von Chromatographiematerial zur Immobilisierung der Targets im Zuge der Inkubation einer oder mehrerer Arten von Targets mit einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptoreinheiten und / oder im Zuge der Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von den restlichen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten ein lonenaustauscher- Material, eine RP-Material oder ein Membran-Material als Chromatographiematerial verwendet, das so auf die Anbindung der Targets optimiert wurde, dass die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten alleine (ohne zugehöriges Target) nicht gebunden werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird in den Verfahren IA, IB, IIA, und IIB bei Verwendung von Chromatographiematerial zur Immobilisierung der Targets im Zuge der Inkubation einer oder mehrerer Arten von Targets mit einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und / oder im Zuge der Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von den restlichen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten gemäß einer der unter b) bis f) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten" beschriebenen Methoden durchgeführt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird im Verfahren IV bei Verwendung von Chromatographiematerial zur Immobilisierung der Carrier im Zuge der Inkubation einer oder mehrerer Arten von Komplexen aus mit Carrier modifizierter Hapten-Analogon mit einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten und / oder im Zuge der Abtrennung der Komplexe aus mit Carrier modifizierter Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit von den restlichen Komplexen aus Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten gemäß einer der unter b) bis f) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten" beschriebenen Methoden durchgeführt, wobei sich - ausschließlich in diesem Fall - in den beschriebenen Methoden der Begriff "Target" oder grammatische Äquivalente durch den Begriff "Carrier- modifiziertes Target" oder grammatische Äquivalente zu ersetzen ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird im Verfahren V und VI das Target gemäß einer der unter b) bis f) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten" beschriebenen Methoden an das Chromatographiematerial gebunden.
Abtrennung und Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile:
Die Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von den restlichen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten kann, wie oben erwähnt, durch spezifische Präzipitation, Filtration, Zentrifugation, durch chromatographische Methoden oder durch Gelfiltration erfolgen. Die anschließende Identifizierung und Quantifizierung der an die jeweiligen Rezeptoren der rezeptormodifizierten Nukleinsäureoligomere gebundenen rezeptorspezifischen Substanzen erfolgt durch ein indirektes Verfahren, bei dem die rezeptorspezifischen Substanzen (Targets) anhand des Oligonukleotid-Tags am Rezeptor bestimmt werden, das eindeutig für einen bestimmten Rezeptor und damit die entsprechende rezeptorspezifische Substanz kodiert.
Bei den oben genannten Verfahrensalternativen IA, IB, IIA, IIB und III bis VI werden Target-besetzte Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten (Verfahrensalternativen IA, IB, IIA, IIB, und III) bzw. von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, die mit einem Carrier- modifizierten Target besetzt sind (Verfahrensalternativen IV) bzw. Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten, die an Chromatographiematerial-gebundenen Targets gebunden sind (Verfahrensalternativen V) abgetrennt. Anschließend werden in den Verfahrensalternativen IA, IB, IIA, IIB, III und VI entweder die gelösten abgetrennten nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten anhand ihrer Nukleinsäureoligomer-Bestandteile detektiert (siehe unten), wobei diese gelösten abgetrennten nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten direkt oder nach Abtrennung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils aus der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit eingesetzt werden können oder es werden die abgetrennten immobilisierten Targetbesetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten nach Abtrennung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils aus den immobilisierten Komplexen eingesetzt. Im Verfahren IV und V werden entweder die gelösten abgetrennten Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten anhand ihrer Nukleinsäureoligomer- Bestandteile detektiert (siehe unten), wobei diese gelösten abgetrennten Targetbesetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten direkt oder nach Abtrennung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils aus der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit eingesetzt werden können.
Die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der abgetrennten gelösten nicht Targetbesetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten (Verfahren IA, IB, IIA, IIB und III) bzw. die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der immobilisierten und danach Komplexe aus Carrier-modifizierten Targets bzw. Target und Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit (Verfahren IV, V) stehen anhand der Differenz zwischen ursprünglich eingesetzten und schließlich abgetrennten, Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten quantitativ und qualitativ stellvertretend für die spezifische chemische Substanz (das target), welche ursprünglich in der Probenlösung enthalten war. Die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der abgetrennten immobilisierten Targetbesetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten (Verfahren IA, IB, IIA, IIB und III) bzw. die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der abgetrennten gelösten Komplexe aus Target und Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit (Verfahren IV) bzw. die die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der abgetrennten gelösten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten (Verfahren VI) stehen quantitativ und qualitativ stellvertretend für die spezifische chemische Substanz (das Target), welche ursprünglich in der Probenlösung enthalten war. Diese in den Verfahren erforderliche oder als Alternative mögliche Abtrennung der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile kann auf folgende Weise durchgeführt werden:
A) Harnstoff-Behandlung: Bei Inkubation der Target-besetzten, nicht Target- besetzten oder mit Carrier-modifiziertem Target besetzten Nukleinsäureoligomer-
Rezeptor-Einheiten mit Guadiniumhydrochlorid werden Bestandteile dieser Komplexe, insbesondere die Protein- oder Peptidbestandteile denaturiert, so dass diese Komplexe dissoziieren und der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil als solcher oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomer-Bestandteils, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, abgetrennt werden.
B) Spaltung der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit: Bei Verwendung von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, die gemäß einer der bevorzugten Ausführungsformen der Bindungsarten a) bis c) im Abschnitt "Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer" gebildet wurden kann die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit durch Inkubation mit dem nötigen Induktionsmittel in einen Nukleinsäureoligomer und einen Rezeptor-Bestandteil gespalten werden. Bei Verwendung von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, die gemäß einer der Ausführungsformen der Bindungsart d) im Abschnitt "Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer" gebildet wurden, kann die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit durch Inkubation mit einem Antagonisten einer der beiden konjugierten chemischen Substanzen, die für die indirekte, nichtkovalente Bindung zwischen Rezeptor und Nukleinsäureoligomer verwendet wurden, gespalten werden. Nötigenfalls wird die Inkubation mit einem deutlichen Überschuss des Antagonisten durchgeführt.
C) Spaltung der Bindung zwischen Target und Träger: Werden die Targetbesetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in den Verfahren IA oder IIA bzw. die Komplexe aus Carrier-modifizierten Target und Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit gemäß einer der Methoden c) oder d) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Targetbesetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten" an Chromatographiematerial gebunden, kann der angebundene Komplex durch Inkubation mit dem nötigen Induktionsmittel vom Chromatographiematerial abgetrennt werden. Werden die Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in den Verfahren IA oder IIA bzw. die Komplexe aus Carrier-modifizierten Target und Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit gemäß einer der Methoden b) oder e) oder f) im Abschnitt "Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und Target von nicht Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten" an Chromatographiematerial gebunden, kann der angebundene Komplex durch Inkubation mit einem Antagonisten einer der beiden konjugierten chemischen Substanzen, die für die indirekte, nichtkovalente Anbindung an das Chromatographiematerial verwendet wurden, vom Chromatographiematerial abgetrennt werden. Nötigenfalls wird die Inkubation mit einem deutlichen Überschuss des Antagonisten durchgeführt.
In besonders vorteilhafter Weise können die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Markierung oder zur Detektion von einer oder mehrerer Arten von Antigenen und Proteinen angewandt werden. Insbesondere bevorzugt wird die Anwendung zur Markierung oder zur Detektion wenigstens einer Art von nativen, denaturiertem oder partiell denaturiertem Protein oder Antigen. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren zur Markierung oder zur Detektion von Antikörpern, Antigenen oder Hapten-Analoga angewandt.
In sämtlichen erfindungsgemäßen Verfahren werden die Ausführungsformen besonders bevorzugt, gemäß denen eine oder mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten bereitgestellt werden, die durch Anbindung einer oder mehrerer gleicher oder unterschiedlicher funktioneller chemischer Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Farbstoff, insbesondere Fluoreszenzfarbstoff, redoxaktive Substanz, insbesondere Chinone und Übergangsmetallkomplexe, Biotin, Hapten, Avidin, insbesondere monovalentes Avidin und Streptavidin, insbesondere monovalentes Streptavidin modifiziert sind und/oder zusätzlich durch ein Radiolabel, insbesondere durch 35P, 32S, 14C oder 3H modifiziert sind. Alternativ können diese Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten nicht in modifizierter Form bereitgestellt werden, sondern es kann die Modifikation erst während eines erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen. Die Modifikation kann dabei vor einem beliebigen Schritt, der nach dem Schritt "Bereitstellen einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten" durchgeführt wird, erfolgen.
Ganz besonders bevorzugt werden die Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren, in denen der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit eine DNA oder RNA-Sequenz darstellt und wenigstens eine beliebige Primer-Bindungsregion umfasst. In diesem Fall wird vor der Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile eine Amplifizierung der Nukleinsäureoligomer- Bestandteile, insbesondere durch RNA-Polymerasen oder durch DNA-Polymerasen wie z. B. bei der Polymerase-Chain-Reaction (PCR), durchgeführt. Ganz besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, gemäß denen vor der gemeinsamen Amplifizierung der einen oder mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer- Bestandteilen eine definierte Menge eines Nukleinsäureoligomers zugegeben wird, wobei das zugegebene Nukleinsäureoligomer den selben oder die selben Primer- Abschnitte wie die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile umfasst. Besonders bevorzugt wird ein Primer verwendet, der einen Detektions-Marker trägt.
Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Identifizierung und Quantifizierung der rezeptorspezifischen Substanzen (Targets). Die Detektion der chemischen Substanzen wird indirekt über die Detektion des abgetrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteils (siehe oben) durchgeführt, wobei die Detektion des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils über die Hybridisierung an ein komplementäres Nukleinsäureoligomer bevorzugt ist.
Besonders bevorzugt werden die Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren, in denen die Detektion der Hybridisierungsereignisse elektrochemisch, insbesondere amperometrisch, cyclovoltametrisch, impedanzspektroskopisch, potentiometrisch, durch optische Spektroskopie, insbesondere Absorptions oder Fluoreszenzmessung, durch Schwingungsspektroskopie, insbesondere IR-, Raman-, FTIR- oder FT-Raman-spektroskopisch, durch Totalreflexionsmethoden, insbesondere Attenuated total reflection, durch Quarz-Crystal-Micro-Balance, durch Surface Plasmon Resonanz, durch Chemilumineszenzmessung oder durch Radioaktivitätsmessung erfolgt. Besonders bevorzugt wird die gleichzeitige Detektion verschiedener Nukleinsäureoligomer-Bestandteile durch eine einheitliche der im vorigen Absatz beschriebenen Hybridisierungs-Detektionsart, insbesondere die Detektion auf sogenannten DNA-Chips oder sogenannten Dot-Plot-Membranen.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem einen Kit zur Markierung chemischer Substanzen, einen Kit zur Detektion chemischer Substanzen, einen Kit zur Detektion von Proteinen, einen Kit zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen Proteinen, einen Kit zur Detektion von Antikörpern, einen Kit zur Detektion von Antigenen, einen Kit zur Detektion von Hapten-Analoga, einen Kit zur Detektion DNA- und/oder RNA-bindender Proteine und einen Kit zur Detektion der Antagonisten von DNA- und/oder RNA-bindenden Proteinen, einen Kit zum Screenen nach Antagonisten für Bindungspartner von Enzymen und Rezeptorproteinen und einen Kit zum Screenen von Hybridomazellen unter gleichzeitigem Epitopmapping.
Jeder erfindungsgemäße Kit umfasst eine effektive Menge einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten wie sie in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bevorzugt wird ein Kit, der zusätzlich Primer umfasst, insbesondere mit Rhodamin oder Fluorescin modifizierte Primer. Besonders bevorzugt wird außerdem jeder Kit, der zusätzlich die Nukleotid-Bausteine dCTP, dGTP, dATP und dTTP umfasst, wobei ein Satz von Nukleotiden, bei dem wenigstens eine Art von Fluoreszenzfarbstoff- modifizierten Nukleotiden beinhaltet ist, besonders bevorzugt ist.
Besonders bevorzugt wird auch ein Kit der zusätzlich eine Chromatographiekartusche zur Abtrennung der Target-besetzten Nukleinsäureoligomere umfasst. Bevorzugt umfassen die Kits zusätzlich eine mit Biotin belegte Chromatographiesäule.
Besonders bevorzugt wird auch ein Kit der zusätzlich eine Gelfiltrationskartusche umfasst.
Ganz besonders bevorzugt wird ein Kit, wobei als Rezeptor-Einheit der einen oder der mehreren der von dem Kit umfassten Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten ein anti-Biotin-Fab-Fragment, ein monovalentes Avidin oder ein monovalentes Streptavidin enthalten ist.
Kits, die eine effektive Menge einer oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten, wie sie in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen sind ganz besonders bevorzugt. Besonders bevorzugt werden Kits, die zusätzlich biotinylierte Peptide, Polypeptide oder Proteine umfassen.
Insbesondere bevorzugt wird ein Kit, der als Rezeptor der einen oder der mehreren der von dem Kit umfassten Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten ein anti-Biotin-Fab-Fragment, ein monovalentes Avidin oder ein monovalentes Streptavidin enthält. Insbesondere bevorzugt wird ein Kit, der daneben eine oder mehrere Arten von biotinylierten Rezeptoren enthält.
Insbesondere bevorzugt wird ein Kit, der als Rezeptor der einen oder der mehreren der von dem Kit umfassten Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten ein anti-Digoxigenin-Fab-Fragment enthält. Insbesondere bevorzugt wird ein Kit, der daneben eine oder mehrere Arten von Digoxigenin-markierten Rezeptoren enthält.
Insbesondere bevorzugt wird ein Kit, der als Rezeptor der einen oder der mehreren der von dem Kit umfassten Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten ein anti-FITC-Fab-Fragment enthält. Insbesondere bevorzugt wird ein Kit, der daneben eine oder mehrere Arten von FITC-markierten Rezeptoren enthält.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegen die eine oder die mehrere der von den erfindungsgemäßen Kits umfassten Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in einem Lösungsmittel gelöst vor. Besonders bevorzugt ist als Lösungsmittel ein Phosphat-Puffer enthalten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen Fig. 1 Schematischer Aufbau verschiedener Realisierungsmöglichkeiten einer
Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit, DM = Detektionsmarkierung, L = Linker, P1 = Primer-Bindungsregion, K = Kodierungssequenz, P'2 = Primer-Bindungsregion, R = Rezeptor-Einheit, U, V, X, Y, Z sind funktioneile Gruppen wie z. B. eine Amid-Gruppe, eine Ester-Gruppe, eine Thioester-Gruppe, eine CH2-NH-Gruppe, eine CHOH-CHOH- Gruppe, eine -CO-0-CH2-CH2-0-CO- Gruppe, eine -S-S- Gruppe, eine -N=N- oder repräsentieren eine indirekte nichtkovalente Bindung wie unter d) im Abschnitt "Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer" dargestellt;
Fig. 2 (a) schematischer Aufbau eines Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit mit angebundener rezeptorspezifischer chemischer Substanz, (b) schematischer Aufbau eines Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit mit angebundener rezeptorspezifischer chemischer Substanz, die zusätzlich mit einem Antikörper (Ak) modifiziert ist; (c) schematischer Aufbau eines Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit mit angebundener rezeptorspezifischer chemischer Substanz, die zusätzlich mit einem Tag (z.B. His-Tag) modifiziert ist. Die Abkürzungen DM, L, P1 , K, P'2, R, U, V, X, Y, Z entsprechen denen in Figur 1.
Fig. 3 Ablaufschema einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens (die
Abkürzung X entspricht der in Figur 1): Target 1 bis 3 werden in einem ersten Schritt "A" mit identischen Tags modifiziert, dann in einem zweiten Schritt "B" mit verschiedenen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten (Rezeptor-Einheit 2 bis 4 mit rezeptorspezifischer Affinität zu Target 2 bis 4) zur Bindungsbildung inkubiert, anschließend wird diese Mischung auf eine mit zum Tag spezifischen Bindungspartner (z. B. dem anti-Tag-Antikörper) modifizierte Chromatigraphiesäule gegeben, wobei die nicht Target-besetzte Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit Rezeptor-Einheit 4 ins Eluat übergeht und so von den Target-besetzten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit Rezeptor-Einheit 2 und 3 getrennt wird; schließlich können entweder die im Eluat verbliebene Rezeptor-Einheit 4 oder - nach Schritt D, Spaltung der funktionellen Gruppe X (z. B. S-S-Gruppe) und Eluation der Nukleinsäureoligomer- Bestandteile der Rezeptor-Einheiten 2 und 3 - die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Rezeptor-Einheiten 2 und 3 anhand ihrer Kodierungssequenz detektiert werden, in beiden Detektionsvarianten ergibt sich, dass in der Untersuchungslösung von den durch die DNA-Rezeptoren 2 bis 4 gesuchten Targets die Targets 2 und 3, nicht aber Target 4, enthalten war.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Beispiel 1 : Konstruktion des Nukleinsäureoligomers für die Festphasensynthese, verwendbar zur Markierung einer Rezeptor-Einheit:
Eine Ausführungsform des Nukleinsäureoligomers besteht 5'-terminal aus der universellen Sequenz P1 (Primer-Bindungsregionl , z. B. 12 Basen lang), die die identische Sequenz wie ein universal einsetzbarer Primerl besitzt, einer Sequenz K, die ein nach Anbindung an eine bestimmte Rezeptor-Einheit das für diese Rezeptor- Einheit spezifische Label (die Kodierungsequenz) darstellt, und 3'-terminal aus einer weiteren universellen Sequenz P'2 (Primer-Bindungsregion 2 z. B. 12 Basen lang), die zur Sequenz eines universal einsetzbaren Primer 2 komplementär ist. Daneben kann sich zwischen einer der Primer-Bindungsregionen und der Kodierungsregion eine weitere Region befinden, die spezifisch DNA- bzw. RNA-bindende Proteine bindet, insbesondere 3'terminale Regionen, die als Promotoren für die Anbindung von T3, T7 oder SP6-RNA-Polymerasen dienen. Die Regionen P1 und P'2 dienen der späteren Amplifizierung der Basensequenz des Nukleinsäureoligomers durch PCR. Wenn eine vollständige Target-Analyse auf ein und demselben Chip durchgeführt werden soll, und die Targets in extrem unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen, ist es auch möglich, für verschiedene Gruppen unterschiedliche Primer-Paare einzusetzen, wobei die jeweiligen Primer-Bindungsregionen P1 und P'2 durch entsprechende Sequenzen, z. B. Primer-Bindungsregion 2-1 und 2-'2 auf Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten für Targets mit geringer Repräsentanz, und Primer-Bindungsregion 3-1 und 3-'2 auf Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten für Targets mit sehr geringer Repräsentanz, ersetzt werden, so dass diese Gruppen von Nukleinsäureoligomeren selektiv amplifiziert werden können. Auswahlkriterien für die Konstruktion unterschiedlicher Primer ist, dass sie alle gleichen GC-Gehalt und gleiche Länge aufweisen, sich aber untereinander oder zu den Komplementärsequenzen in mindestens 60% der Basen unterscheiden.
Die Länge der spezifischen Region K (einschließlich benachbarter Basen der Primer- Bindungsregionen), die für die Detektion durch Hybridisierung mit Sonden- Nukleinsäureoligomeren benutzt wird (vgl. Beispiel 19), kann je nach GC-Gehalt der Sequenz variieren, wobei die Länge günstigerweise so gewählt wird, dass der jeweilige Schmelzpunkt Tm der hybridisierten Nukleinsäureoligomere (berechnet nach Bolton and McCarthy, 1962) für alle Nukleinsäureoligomere einer Analyse um nicht mehr als 0.5°C voneinander abweichen. Daneben ist die Sequenz der Kodierungsregion K günstigerweise so gewählt, dass jede spezifische Kodierungsregion K sich um mindestens 4 bp von jeder anderen spezifischen Kodierungsregion unterscheidet, wobei die Basenfehlpaarungen in einer besonders günstigen Ausführungsform über das ganze Molekül verteilt sind, keine der Kodierungssequenzen zu einer anderen oder zu den Primer-Bindungsregionen komplementär ist und die Sequenzen nicht über mehr als 75% der Kodierungssequenz palindromisch aufgebaut sind.
Das Nukleinsäureoligomer ist weiterhin direkt oder über einen Spacer mit einer reaktiven Gruppe, wie z.B. einer kovalent angebundenen C6-NH2-Einheit (Hexyl-NH2) versehen, die der direkten oder über einen zusätzlichen Linker verbrückten Anbindung einer bestimmten Rezeptor-Einheit (bzw. bestimmten Gruppe von Rezeptor-Einheiten) dient. Weiterhin ist das Nukleinsäureoligomer mit einem Detektions-Marker wie z.B. Rhodamin modifiziert, der der späteren Detektion des Nukleinsäureoligomers dient (wobei die Wahl des Detektionsmarkers an die Art der Nukleinsäureoligomer-Detektionsmethode angepasst wird).
Somit ist folgendes Nukleinsäureoligomer ein typischer Vertreter eines Nukleinsäureoligomers zur Anbindung an einer Rezeptor-Einheit: Rhodamin-δ'-GAGGACGAGACCGACCrcrGGr-AGCrCGCACCAGAGCAG-S'-Hexyl-NHz mit dem Detektions-Marker Rhodamin, der Primersequenz P1 (= GAGGACGAGACC), der für die Rezeptor-Einheit (bzw. bestimmte Gruppe von Rezeptor-Einheiten) spezifischen Kodierungssequenz K (= GACCTCTGGTAGCTC) und der dem Primer P2 komplementären Basensequenz P'2 (= GCACCAGAGCAG) sowie einer Einheit (Hexyl-NH2) zur direkten oder linkerverbrückten Anbindung der bestimmten Rezeptor- Einheit (bzw. Gruppen von bestimmten Rezeptor-Einheiten).
Beispiel 2: Anknüpfung eines durch Reduktion spaltbaren Linkers an ein synthetisches Nukleinsäureoligomer:
Als synthetisches Nukleinsäureoligomer wird das kommerziell erhältliche Oligonukleotid aus Beispiel 1 verwendet, das am 3' Ende einen C6-Linker mit funktioneller NH2-Gruppe und am δ'-Ende ein Rhodamin trägt (Oligol). 50μg des Nukleinsäureoligomers und 50μg Dithio-bis-(sulfosuccinimidyl-) propionat werden in 100μl Kaliumphosphat-Puffer (50 mM, pH 8) gelöst und 2-4 Stunden bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert. Zur Isolierung und Aufreinigung des mit dem spaltbaren Linker Dithio-bis-propionat modifizierten Nukleinsäureoligomers (Oligo2m0d) wird die Inkubationslösung auf eine Biogel PD6-Säule gegeben, die vorher mit MES- Puffer (10mM pH 6.0) equilibriert wurde. Die Säule wird mit MES-Puffer (10mM pH 6.0) eluiert. Die erste fluoreszierende Fraktion enthält das Oligo2mθd- Das Oligo2m0d wird durch Zugabe von 5M NaCI (ΛA des Eluationsvolumens der Oligo2mθd-Fraktion, auf 0°C gekühlt, und Ethanol (3 ΛA faches Eluationsvolumens der Oligo2m0d-Fraktion, auf -20°C gekühlt) und anschließender Zentrifugation bei 4°C (30min bei 15000 x g) gefällt. Das Prezipitat wird mit -20°C kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet.
Beispiel 3: Anknüpfung eines durch Licht spaltbaren Linkers an ein synthetisches Nukleinsäureoligomer:
Als synthetisches Nukleinsäureoligomer wird das kommerziell erhältliche synthetische
Oligonukleotid aus Beispiel 1 verwendet, das am 3' Ende einen C6 Linker mit funktioneller NH2-Gruppe und am 5'-Ende ein Rhodamin trägt. Als Linker wird eine Azo-Verbindung verwendet, die durch Einstrahlen von Licht im Wellenlängenbereich um 350 nm gespalten werden kann. Deshalb muss bei der Anknüpfung dieses Linkers an das Nukleinsäureoligomer unter Dämmerlicht oder Rotlicht gearbeitet werden. 4nMol (ca. 50μg) des Nukleinsäureoligomers und 50μg 4,4'- Dihydroxyazobenzol-3,3'dicarbonsäure werden in je 50μl MES-Puffer (100 mM, pH 6.0) gelöst und vereinigt. Nach Zusatz von 50μg EDC and 70μg NHS wird die Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur und anschließend 12 Stunden bei 4°C inkubiert. Zur Isolierung und Aufreinigung des mit 4,4'-Dihydroxyazobenzol-3,3'dicarbonsäure modifizierten Nukleinsäureoligomers (Oligo3m0d) wird die Inkubationslösung auf eine Biogel PD6-Säule gegeben, die vorher mit MES-Puffer (10mM pH 6.0) equilibriert wurde. Die Säule wird mit MES-Puffer (10mM pH 6.0) eluiert. Die erste fluoresziernde Fraktion enthält das Oligo3mθd- Das Oligo3mod wird durch Zugabe von 5M NaCI (% des Eluationsvolumens der Oligo3mθd-Fraktion , auf 0°C gekühlt), und Ethanol (3 A faches Eluationsvolumens der Oligo3mθd-Fraktion, auf -20°C gekühlt) und anschließender Zentrifugation bei 4°C (30min bei 15000 x g) gefällt. Das Prezipitat wird mit -20°C kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet.
Beispiel 4: Anknüpfung eines Linkers mit photoreaktiver Endgruppe an ein synthetisches Nukleinsäureoligomer:
Als synthetisches Nukleinsäureoligomer wird das kommerziell erhältliche synthetische Oligonukleotid aus Beispiel 1 verwendet, das am 3' Ende einen C6 Linker mit funktioneller NH2-Gruppe am δ'-Ende ein Rhodamin trägt (Oligol). Als Linker wird ein aktiver Ester (zur Anbindung an die Oligol -NH2-Gruppe) verwendet, der zusätzlich eine terminale Azido-Gruppe besitzt, die durch Einstrahlen von Licht im Wellenlängenbereich um 350 nm an eine beliebige andere Substanz gebunden werden kann. Deshalb muss bei der Anknüpfung des Esters an die Oligol -NH2- Gruppe unter Dämmerlicht oder Rotlicht gearbeitet werden. 50nMol des Nukleinsäureoligomers werden in 0.7 ml sterilem Wasser aufgenommen und mit 100μl Carbonat-Puffer (1M NaHC03/Na2C03, pH 9) versetzt. Der Linker 4- Azidobenzoesäure-N-sulfosuccinimidylester Natriumsalz (5 μMol) wird in 200 μl Carbonat-Puffer (0.1 M NaHC03/Na2C03, pH 9) gelöst und zur Oligol -Lösung gegeben. Man lässt über Nacht reagieren. Zur Isolierung und Aufreinigung des mit 4-Azidobenzoesäure gekoppeltem Nukleinsäureoligomers (Oligo4m0d) wird die Inkubationslösung auf eine Biogel PD6-Säule gegeben, die vorher mit MES-Puffer (10mM pH 6.0) equilibriert wurde. Die Säule wird mit MES-Puffer (10mM pH 6.0) eluiert. Die erste fluoreszierende Fraktion enthält das Oligo4m0d- Das Oligo4mθd wird durch Zugabe von 5M NaCI (Y4 des Eluationsvolumens der Oligo4mθd-Fraktion, auf 0°C gekühlt, und Ethanol (3 Vz faches Eluationsvolumens der Oligo4m0d-Fraktion, auf - 20°C gekühlt) und anschließender Zentrifugation bei 4°C (30min bei 15000 x g) gefällt. Das Prezipitat wird mit -20°C kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet.
Beispiel 5: Verknüpfung eines Nukleinsäureoligomers mit einem Antikörper als Rezeptor-Einheit und Bestimmung der Zahl der angebundenen Nukleinsäureoligomere pro Antikörper:
Enthält das Nukleinsäureoligomer eine Fluoreszenzmarkierung oder eine photolabile Gruppe im Linker muss unter Dämmerlicht oder Rotlicht gearbeitet werden.
(i) Verknüpfung über Kopplung eines aktivierten Ester am Nukleinsäureoligomer an eine freie Aminogruppe des Antikörpers: Als Nukleinsäureoligomer wird Oligo2mθd aus Beispiel 2 oder Oligo3m0d aus Beispiel 3 verwendet. Beide enthalten am Nukleinsäureoligomer eine (über Linker angebundene) COOH-Gruppe. Das COOH- terminierte Nukleinsäureoligomer Oligo2m0d bzw. Oligo3mod (4nMol / ca. 50μg) wird in 50μl MES-Puffer (100 mM, pH 5.0) gelöst, 50μg EDC and 70μg NHS zugeben und für 15-30min bei Raumtemperatur inkubiert, um aus der COOH-Gruppe einen NHS- aktivierten Ester zu erzeugen. Das nun mit aktiviertem Ester terminierte Nukleinsäureoligomer wird, wie in Beispiel 2 bzw. 3 beschrieben, isoliert und gereinigt. Zur Verknüpfung mit dem Antikörper wird das Nukleinsäureoligomer in 50μl Kaliumphosphat-Puffer (50 mM, pH 7.2, 150mM NaCI) gelöst und mit einer Lösung aus 150μg des Fab-Fragments eines monoklonalen Antikörpers in 20μl PBS vereinigt. Diese Lösung lässt man für 4 h bei Raumtemperatur und für weitere 14 Stunden bei 4 °C reagieren. Anschließend wird die Reaktionslösung auf eine Sephacryl S200-Säule aufgetragen, die vorher mit PBS equilibriert wurde. Es wird mit PBS eluiert. Die erste fluoreszierende Fraktion enthält die Nukleinsäureoligomer-Fa -Fragment-Komplexe (ca 60kDa), die zweite fluoreszierende Fraktion die nicht mit Fab-Fragment verknüpften Nukleinsäureoligomere (ca. 13kDa). Die Anzahl der DNA-Einheiten pro Fab-Fragment wird über das Verhältnis der Konzentration des Nukleinsäureoligomers, ermittelt über die Rhodamin-Fluoreszenz bei 575 nm, zur Konzentration an Fab- Fragmenten, idealerweise ermittelt über Immunpräzipitation mit einem radioaktiv markierten Antigen oder mit einem Enzym-markierten Antigen (RIA, bzw. EIA) oder eine alternative Methode wie in (iii) beschrieben, erhalten.
(ii) Verknüpfung über Photocrosslinking einer terminalen photoreaktiven Gruppe am Nukleinsäureoligomer an eine freie Aminogruppe des Antikörpers: Als Nukleinsäureoligomer wird Oligo4mod aus Beispiel 4 verwendet. Oligo4mθd (0.5mg) wird in 100μl Kaliumphosphat-Puffer (50 mM, pH 7.2, 150mM NaCI) gelöst und mit einer Lösung aus 150μg des Fab-Fragments eines monoklonalen Antikörpers in 30μl PBS vereinigt. Diese Lösung wird für 30 min mit dem Licht einer Xenon-Lampe mit aufgesetztem 330 bis 350 nm Interferenzfilter bestrahlt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf eine Sephacryl S200-Säule aufgetragen, die vorher mit PBS equilibriert wurde. Es wird mit PBS eluiert. Die erste fluoreszierende Fraktion enthält die Nukleinsäureoligomer-Fab-Fragment-Komplexe (ca 60kDa), die zweite fluoreszierende Fraktion die nicht mit Fab-Fragment verknüpften
Nukleinsäureoligomere (ca. 13kDa). Die Effizienz der Markierung wird wie unter (i) bestimmt.
(iii) Möglichkeiten zur Bestimmung der Zahl der angeknüpften Nukleinsäureoligomere pro Fab-Fragment Die Menge angebundener Nukleinsäureoligomere kann nach einer der bekannten Methoden wie Fluoreszenz, Radioaktivität, etc. bestimmt werden, abhängig von dem Detektions-Marker des Nukleinsäureoligomers (Fluorophor, 35P/32S, Hapten etc.). Besitzt das Nukleinsäureoligomer keinen Detektionsmarker, ist eine Quantifizierung über Hybridisierung mit einem gelabelten Nukleinsäureoligomer mit komplemetärer Sequenz, das einen Detektionsmarker trägt, oder über eine detailliertere Analyse des Absorptionsspektrums zwischen 240nm und 300nm möglich. Die Menge der Fab-Fragmente (Rezeptor-Einheit) wird idealerweise über Immunpräzipitation mit einem radioaktiv markierten Antigen, alternativ mit einem Enzym-markierten Antigen, durchgeführt: Hierzu gibt man unterschiedliche definierte Mengen des markierten Antigens zu einer definierten Mege der Rezeptor-Einheit und bestimmt die maximal präzipitierte Menge an Antigen (radioaktive Detektion oder über Enzym-abhängige Chemolumineszenz). Diese Methode hat den Vorteil, dass gleichzeitig der Nachweis erbracht wird, dass die isolierten Fab-Fragmente intakt sind. Alternativ kann ein ELISA-System mit anti-Fab-Antikörpem aufgebaut werden, falls das Antigen nicht zur Verfügung steht.
Beispiel 6: Isolierung nativer Proteine aus HeLa-Zellen:
(i) Isolierung von Proteinen aus HeLa-Zellen unter nichtdenaturierenden
Bedingungen:
HeLa-Zellen werden in PBS (in 9fachem Volumen des Zellpellet) mit den Additiven PMSF (1mM) und EDTA (1mM), optional mit weiteren Protease-Inhibitoren, versetzt und schonend mit einem Potter aufgeschlossen. Anschließend wird die Kernfraktion gemeinsam mit der unlöslichen Protein-Fraktion (ECM / Cytoskelett) bei 800 x g während 15min abzentrifugiert (pelletiert). Danach werden aus dem Überstand die Membranfraktionen abgetrennt (zentrifugieren bei 25.000 x g für 60 min und bei 240.000 x g für 30 min). Alle Manipulationen werden bei 4°C ausgeführt. Der Überstand enthält die löslichen cytoplasmatischen Proteine und kann bei -20°C bis - 80°C aufbewahrt werden. (Optional können einzelne Membranfraktionen mit spezifischer Zusammensetzung über Saccharose-Dichtenzentrifugation isoliert werden). Das Pellet der Membranfraktionen bei 4°C kann in PBS mit PMSF (1mM) resuspendiert und mit Ultraschall weiter aufgeschlossen werden. Die Membranen werden bei 240.000 x g 30 min lang abzentrifugiert. Der Überstand enthält lösliche Proteine von Zellorganellen und kann bei -20°C bis -80°C aufbewahrt werden. Das Pellet enthält die Membranproteine und einige große Proteinkomplexe, wie z.B. Ribosomen, und kann bei -20°C bis -80°C aufbewahrt werden. Das Pellet aus Kernfraktion und unlöslicher Proteinfraktion (siehe oben) wird bei 4°C in PBS mit PMSF (1mM) und EDTA (1mM) kurz (2 min.) im Ultraschall resuspendiert und weiter aufgeschlossen. Aus der Suspension wird die unlösliche Proteinfraktion bei 800 x g während 15min abzentrifugiert. Sie enthält überwiegend Cytoskellet-Proteine und Teile der Kernmembran. Aus dem Überstand wird die Haupt-Kernmembranfraktion bei 240.000 x g für 30 min. abzentrifugiert. Der Überstand enthält lösliche Proteine des Zellkerns.
(ii) Isolierung von Proteinen aus HeLa-Zellen unter partiell denaturierenden Bedingungen: Bei Verwendung von RIPA-Puffer (150mM NaC1 1% NP-40, 0.5% Desoxycholat, 0.1% SDS, 50mM Tris, pH 8.0) statt PBS mit den Additiven PMSF und EDTA können die Proteine anhand der Vorschrift in Beispiel 6 i) (bei ansonsten gleicher Vorgehensweise) unter partiell denaturierenden Bedingungen isoliert werden. Die unter diesen partiell denaturierenden Bedingungen erhaltenen Proteinisolate besitzen den Vorteil, dass die in der löslichen Fraktion abgetrennten Proteine neben den cytoplasmatischen Proteinen auch einen (großen) Teil der Membranproteine und der Kernproteine enthält. Der Puffer ist geeignet, die Antigen-Antikörper-Kopplung trotz des Detergensanteils im gleichen Puffersystem durchzuführen, so dass keine zusätzlichen Manipulationen wegen eines Pufferwechsels notwendig sind.
Beispiel 7: Isolierung von Proteinen aus HeLa-Zellen unter denaturierenden Bedingungen:
Zellen werden in PBS mit 6M Harnstoff, 1% SDS und 1mM PMSF aufgenommen, kurz auf 100°C erhitzt (2 min) und 3 min mit Ultraschall behandelt. Anschließend werden die unlöslichen Bestandteile bei 240.000 x g für 30 min abzentrifugiert. Der Überstand enthält die löslichen aber denaturierten Proteine. Die pelletierten unlösliche Bestandteile werden mit Ultraschall in PBST resuspendiert und zum Entfernen von Harnstoff und SDS erneut abzentrifugiert (240.000 x g, 30 min). Das Pellet enthält die unlösliche Proteinfraktion. Vorteil der Methode ist, dass durch diese Methode fast alle Proteine solubilisiert werden, die Pufferbedingungen erfordern jedoch einen Pufferwechsel vor Zugabe von Antikörpern (oder Fab-Fragmenten). Dazu wird die gesamte Fraktion der löslichen Proteine auf eine Biogel PD6-Säule aufgetragen, die mit RIPA-Puffer equilibriert wurde, mit RIPA-Puffer eluiert und die Proteinfraktionen gesammelt. Alternativ dazu kann die Fraktion an Nitrozellulose gebunden werden: Zu 10μl der Fraktion der löslichen Proteine gibt man 90μl RIPA-Puffer und 40μl Methanol und bindet jeweils ein Aliquot von 50μl an Nitrocellulose- und an eine PVDF- Membran. Die Membranen werden anschließend jeweils mit PBS, danach mit PBST (PBS mit 0.1% Tween20) gewaschen. Schließlich werden die verbleibenden freien Bindungsstellen mit 1mg rekombinanter ß-Galactosidase in PBST blockiert und nochmals mit PBST gewaschen. Beispiel 8: Immobilisierung der löslichen nativen cytoplasmatischen Proteine aus Beispiel 6 an Chromatographiematerial:
Je 5μl der löslichen nativen cytoplasmatischen Protein-Fraktionen in PBS von Beispiel 6 (aus dem erstem Aufschluss - cytoplasmatische Proteine, lösliche Fraktion aus Kern und Membranfraktionen) werden auf RP18 oder PVDF-Material bzw. auf Nitrocellulose-Material immobilisiert (Auftragen der Überstände). Die Säulen werden anschließend jeweils mit PBS, danach mit PBST (PBS mit 0.1% Tween20) gewaschen. Schließlich werden die verbleibenden freien Bindungsstellen mit 1mg rekombinanter ß-Galactosidase in PBST blockiert und nochmals mit PBST gewaschen.
Beispiel 9: Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante mit auf Chromatographiematerial immobilisierten Antigenen:
Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Auf die mit PBS oder PBST gewaschenen Säulen oder Membranen (Beispiel 8) werden je 0.1 μg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente, die gemäß Beispiel 5 hergestellt wurden, in PBS in einem möglichst geringen Volumen (bzw. in einem Säulenvolumen verdünnt) auf die Säule oder die Membran gegeben. Man lässt die Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die auf dem Chromatographiematerial immobilisierten Proteine binden, und wäscht mit PBST und Phosphat-Waschpuffer (50mM Kaliumphosphat pH 7.5, 500mM NaCI). Durch die Waschschritte werden die verbleibenden nicht gebundenen Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente entfernt, und auf dem Säulenmaterial oder der Membran bleiben nur die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten zurück, die an das Target gebunden wurden. Die Nukleinsäuroligomer-Einheit kann nach einer der in den untenstehenden Beispielen (17-19) beschriebenen Methoden isoliert und weiter analysiert werden. Beispiel 10: Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante mit Immobilisierung der löslichen Proteine (Targets) aus Beispiel 6 an anti- Fluorescein-Antikörper modifiziertem Chromatographiemateriai:
Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. 5μl der löslichen nativen cytoplasmatischen Protein-Fraktionen als Target-Fraktion in PBS aus Beispiel 6 (cytoplasmatische Proteine, lösliche Fraktion aus Kern- und Membranfraktionen) werden auf eine Biogel PD6-Säule gegeben, die vorher mit Carbonat-Puffer (50mM NaHC03/Na2C03, pH 9.5, 150mM NaCI) equilibriert wurde. Es wird mit Carbonatpuffer eluiert und die Proteinfraktion werden gesammelt (Reinigungsschritt und Pufferwechsel). Zu den gesammelten und vereinigten Proteinfraktionen wird 0.2mg FITC (20mg/ml in DMSO) gegeben. Man lässt für 30 min bei Raumtemperatur reagieren. Anschließend wird die Reaktionslösung auf eine Biogel PD6-Säule gegeben, die vorher mit PBS equilibriert wurde, es wird mit PBS eluiert und die Proteinfraktionen gesammelt (Reinigungsschritt). Zu den vereinigten Proteinfraktionen werden je 0.02 μg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente gegeben, die gemäß Beispiel 5 hergestellt wurden. Danach lässt man die Nukleinsäureoligomer- markierten Fa -Fragmente für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4 °C an die Antigene binden. Die gesamte Probe (in ca. einem Säulenvolumen verdünnt) wird auf eine Affinitätschromatographie-Säule gegeben, die mit anti-FITC- Antikörpern belegt ist. Man lässt die FITC-markierten Antigene für ca. 1 Stunde bei Raumtemperatur (und evt. für weitere 12 Stunden bei 4 °C) anbinden, wäscht mit PBST, danach mit Phosphat-Waschpuffer (50 mM, pH 7.2, 500mM NaCI) und isoliert nach einer in den folgenden Beispielen (17-19) beschriebenen Methoden die Nukleinsäureoligomer-Einheit. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer markierten Fab-Fragmenten von der Säule entfernt, und auf der Säule bleiben nur Komplexe dieser Nukleinsäureoligomer-Fab-Fragmente mit dem Target, so daß die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer-Einheiten der Menge an Target entsprechen. Beispiel 11 : Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante mit Immobilisierung der löslichen nativen cytoplasmatischen Proteine (Targets) aus Beispiel 6 durch Bildung von Immunkomplexen mit spezifischen Antikörpern und Abtrennung der Immunkomplexe über Protein G-Affinitätschromatographie:
Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Zu 5μl der löslichen nativen cytoplasmatischen Protein-Fraktionen in PBS wird je 0.01 μg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente gegeben, die gemäß Beispiel 5 hergestellt wurden. Dazu gibt man weiterhin je 0.05 μg spezifische Antikörper, die die gleichen Antigene, aber ein anderes Epitop als die Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente erkennen und lässt für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C die Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente und die Antikörper an die Antigene anbinden. Bevorzugt werden hierfür IgG-Antikörper verwendet. Bei Verwendung anderer Antikörper wie IgE, IgM, oder IgA werden zusätzlich anti-lg-Antikörper zugegeben. Die gesamte Probe (in ca. einem Säulenvolumen verdünnt) wird auf eine Affinitätschromatographie-Säule gegeben, die mit Protein A, Protein G oder anti-lgG-Antikörper (spezifisch nur für die Fc-Region) belegt ist. Man lässt die Immunkomplexe aus Antikörper, Antigenen und Nukleinsäureoligomer-markiertem Fab-Fragmenten für ca. 1 Stunde bei Raumtemperatur (und evt. für weitere 12 Stunden bei 4°C) anbinden, wäscht mit PBST und danach mit Phosphat-Waschpuffer (50 mM, pH 7.2, 500mM NaCI) und isoliert danach nach einer der in den folgenden Beispielen (17-19) beschriebenen Methoden die Nukleinsäureologomer-Einheiten für die anschließende Detektion. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer markierten Fab-Fragmenten von der Säule entfernt, und auf der Säule bleiben nur Komplexe dieser Fab-Fragmente mit dem Target zurück, so daß die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer-Einheiten der Menge an Target entsprechen. Beispiel 12: Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante mit nativen Membranproteinen unter nativen Bedingungen (intakte Membranen)
Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Die Membranfraktion aus Beispiel 6 wird in 9fachen Volumen PBS resuspendiert. Zu 5μl dieser Suspension werden je 0.02 μg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente, die gemäß Beispiel 5 hergestellt wurden, gegeben. Man lässt die Nukleinsäureoligomer- markierten Fab-Fragmente für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die Membran-Antigene binden. Anschließend pelletiert man bei 4°C die Membranen durch Zentrifugation bei 25.000 x g für 60 min (bzw. bei 240.000 x g für 30 min). Das Pellet wird in PBS resuspendiert und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Pelletieren und Resuspendieren werden als "Waschschritte" anschließend dreimal wiederholt. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer markierten Fab-Fragmenten entfernt, und im Pellet der Membranfraktion bleiben nur Komplexe dieser Fab-Fragmente mit dem Target gebunden, so daß die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer-Einheiten der Menge an Target entsprechen. Nach den Waschschritten isoliert und analysiert man die Nukleinsäureoligomer-Einheiten nach einer der in den folgenden Beispielen (17 - 19) beschriebenen Methoden.
Beispiel 13: Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante mit unlöslichen (nativen oder denaturierten) Proteinen:
Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Die Pelletfraktion aus den Beispielen 6 oder 7 wird in 9fachen Volumen PBS (gegebenenfalls über Ultraschallbehandlung) resuspendiert. Zu 5μl dieser Suspension werden je 0.02 μg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente, die gemäß Beispiel 5 hergestellt wurden, gegeben. Man lässt die Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die Membran- Antigene binden. Anschließend pelletiert man bei 4°C die Proteine durch Zentrifugation bei 25.000 x g für 60 min (bzw. bei 240.000 x g für 30 min). Das Pellet wird in PBS (gegebenenfalls auch PBST) resuspendiert und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Pelletieren und Resuspendieren werden als "Waschschritte" anschließend dreimal wiederholt. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer markierten Fab-Fragmenten entfernt, und im Pellet der Membranfraktion bleiben nur Komplexe dieser Fa -Fragmente mit dem Target gebunden, so daß die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer- Einheiten der Menge an Target entsprechen. Nach den Waschschritten isoliert und analysiert man die Nukleinsäureoligomer-Einheiten nach einer der in den folgenden Beispielen (17-19) beschriebenen Methoden.
Beispiel 14: Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante zum Nachweis von Hapten-Analoga:
Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Zu ΘOμl der zu untersuchenden Lösung gibt man 10μl 10 x PBS zu (z. B. zu wässrige Probe aus dem Lebensmittelbereich, die auf verschiedene Aflatoxine und Dioxine untersucht werden soll). Danach werden je 0.1 μg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente gegeben, die wie in Beispiel 5 geschildert hergestellt wurden und gegen die gewünschten Substanzen (wie z. B. Aflatoxine und Dioxine) gerichtet sind. Man lässt die Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die chemischen Substanzen binden. Um die verbleibenden, nicht mit den chemischen Substanzen (hier Aflatoxine und Dioxine) assoziierten Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente von der Untersuchungslösung abtrennen zu können, gibt man anschließend je 0.1 μg eines Komplexes aus der zu suchenden chemischen Substanz (Aflatoxine und Dioxine), kovalent angebunden an z.B. fluoreszeinmarkierte alkalische Phosphatase (FITC-AP) und 5μg anti-AP-Antikörper zu, wobei die chemische Substanz als Hapten-Analogon fungiert und AP als Carrier, der immobilisiert werden kann. Man lässt die verbleibenden Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 6 Stunden bei 4°C an die Carrier-modifizierten Hapten- Analoga binden. Als Kontrolle wird bei diesem Schritt weiterhin 0.1 μg eines Komplexes aus DNP-AP und je 0.05μg von zwei Kontroll-Nukleinsäureoligomere gleicher Struktur mit spezifischer Kodierungssequenz zugegeben, wobei eine ein anti- DNP-Fab-Fragment, die zweite ein anti-FITC-Fa -Fragment als Rezeptor-Einheit trägt, die beide quantiativ immobilisiert werden können, sowie ein spezifisches Nukleinsäureoligomer, das ein anti-Taq-Fab-Fragment trägt, und das quantitativ eluiert werden kann. Die ersten beiden Kontroll-Nukleinsäureoligomere tragen nur für diese Kontroll-Nukleinsäureoligomere spezifische zusätzliche Primer-Bindungsregionen P k- 1 und P k-2, um diese selektiv amplifizieren zu können.
Die gesamte Lösung wird auf eine Affinitätschromatographie-Säule gegeben (in einem Säulenvolumen verdünnt), auf der Protein G immobilisiert ist. Man lässt die Immunkomplexe aus Nukleinsäureoligomer-markierten Fa -Fragmenten, dem Hapten- Analogon und den an AP gebundenen Antikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur binden. Danach eluiert man die Affinitätssäule mit PBST.
Da die gesuchten chemischen Substanzen meist in nur geringen Konzentrationen in der Probenlösung vorkommen, und deshalb die Hapten-Analoga-gebundenen Komplexe quantitativ von den mit der chemischen Substanz belegten Komplexe abgetrennt werden müssen, bestimmt man die Menge an AP über die Fluoreszein- Fluoreszenz oder die enzymabhängige Chemofluoreszenz (korrelierend mit AP) und bestimmt die Menge an Kontroll-Nukleinsäureoligomeren über selektive PCR mit den Primern K-1 und K-2. Bei zu hohem Hintergrund mit AP oder Kontroll- Nukleinsäureoligomeren wiederholt man die affinitätschromatographische Abtrennung der Komplexe aus Carrier-modifiziertem Hapten-Analogon und Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit.
Das Eluat enthält bei effizienter Abtrennung die Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- markierten Fab-Fragmenten und gesuchten chemischen Substanzen (Rezeptor- Target-Komplexe). Gegebenenfalls können diese Komplexe über Affinitätschromatographie aufkonzentriert werden. Dazu gibt man zum Eluat anti-Fab- Antikörper, die die konstanten Regionen der Nukleinsäureoligomer-markierten Fab- Fragmente erkennen, lässt die Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-markierten Fab- Fragmenten und den gesuchten chemischen Substanzen für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die Antikörper binden. Anschließend trägt man die Lösung auf eine Affinitätschromatographie-Säule auf, die Protein G gebunden hat, und lässt die Immunkomplexe für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C bei geschlossenem Pumpkreislauf und ständigem langsamen Fluß an Protein G binden. Die Nukleinsäureoligomer- Einheiten können von dieser Säule oder direkt aus dem Eluat der ersten Säule, wie im folgenden Beispiel 17 beschrieben, isoliert werden.
Beispiel 15: Durchführung einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante zum Nachweis von Antikörpern gegen Antigene im Serum oder anderen extrazellulären Flüssigkeiten:
Der Nachweis von Antikörpern gegen bestimmte Antigene lässt Rückschlüsse auf einen Kontakt des Organismus mit diesen Antigenen zu, was bei Antigenen pathogener Keime wichtige diagnostische Information liefert. Der Nachweis der Antikörper ist dabei meist einfacher als der Nachweis der die Immunantwort auslösenden Antigene. Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Zu 3 Aliquots von je 10 μl des Serums eines Patienten (oder einer anderen extrazellulären Flüssigkeit), das auf Antikörper untersucht werden soll, gibt man 0.05 μg Nukleinsäureoligomer-markierte Antigene (die analog zur Methode in Beispiel 5 hergestellt wurden) sowie ca 1mg anti-human Ig-Antikörper (die jeweils nur die Fc- Regionen der Antikörper erkennen) gegen IgE (1.Aliquot), IgM (2.Aliquot) oder IgG (3.Aliquot), und lässt die möglicherweise im Serum bzw. der extrazellulären Flüssigkeit vorhandenen Antikörper gegen diese (Nukleinsäureoligomer-markierten) Antigene bzw. (Nukleinsäureoligomer-markierten) Haptene an die
Nukleinsäureoligomer-markierten Antigene anbinden, wobei sich parallel dazu die sekundären Immunkomplexe mit den anti-lg-Antikörpern bilden (für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C inkubieren). Danach wird die Lösung auf eine Affinitätschromatographie-Säule (ca. in einem Säulenvolumen) aufgetragen, die Protein G gebunden hat, und man lässt die Immunkomplexe aus Nukleinsäureoligomer-markierten Antigen und spezifischem Antikörper bzw. Nukleinsäureoligomer-markierten Hapten und spezifischem Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an Protein G binden. Anschließend wird die Affinitätschromatographie-Säule mit PBS und Phosphat- Waschpuffer (50 mM, pH 7.2, 500mM NaCI) gewaschen. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer markierten Antigene entfernt, und auf der Säule bleiben nur die Nukleinsäureoligomer-markierten Antigene, die von den für die Antigene spezifischen Antikörper (Targets) gebunden wurden, so daß die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer-Einheiten der Menge an spezifischen Antikörpern gegen diese Antigene proportional sind. Nach den Waschschritten isoliert und analysiert man die Nukleinsäureoligomer-Einheiten nach einer der in den folgenden Beispielen (17-19) beschriebenen Methoden.
Die Isolate aus den verschiedenen Aliquots geben unterschiedliche Informationen: Aliquotl gibt Auskunft über die Entwicklung von Allergien oder eine Infektion mit bestimmten Zellparasiten, Aliquot2 gibt Auskunft über eine akute Infektion, da IgM- Antikörper nur während einer kurzen Phase der nicht vollkommen differenzierten B- Zellen gebildet werden. Aliquot3 gibt Auskunft über eine Infektion, unabhängig davon, wann die Infektion stattgefunden hat (dabei können vor allem latente und schleichende Infektionen detektiert werden).
Beispiel 16: Assay zur Identifizierung allergieauslösender Reagentien über IgE- Nachweis:
Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Zu 10 μl des Serums (oder einer anderen extrazellulären Flüssigkeit), eines Allergie-Patienten, das auf Antikörper gegen Allergene untersucht werden soll, gibt man je 0.05 μg Nukleinsäureoligomer- markierter Allergene (die analog zur Methode in Beispiel 5 hergestellt wurden) und lässt die möglicherweise im Serum bzw. der extrazellulären Flüssigkeit vorhandenen Antikörper gegen diese (Nukleinsäureoligomer-markierten) Allergene anbinden (für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C inkubieren). Danach wird die Lösung auf eine Affinitätschromatographie-Säule (ca. ein Säulenvolumen) aufgetragen, die mit anti-human IgE-Antikörpern belegt ist, und lässt die Immunkomplexe aus Nukleinsäureoligomer-markierten Allergen und spezifischem Antikörper des Patienten (Targets) für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die an der Säule immobilisierten anti-human IgE-Antikörper binden. Anschließend wird die Affinitätschromatographie-Säule mit PBST und Phosphat-Waschpuffer (50 mM, pH 7.2, 500mM NaCI) gewaschen und die Nukleinsäureoligomer-Einheiten werden für die anschließende Detektion nach einer der in den folgenden Beispielen 17 - 19 beschriebenen Methoden isoliert und analysiert. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer markierten Allergene von der Säule entfernt, und auf der Säule bleiben nur Nukleinsäureoligomer-markierte Allergene, die von spezifischen Antikörpern gebunden wurden, so dass die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer-Einheiten identisch zu der Menge der spezifischen Antikörper für diese Allergene ist.
Beispiel 17: Abtrennung des Nukleinsäureoligomers von der Rezeptor-Einheit:
(i) Denaturierung mit Guanidiniumhydrochlorid: Zu den im Eluat isolierten, im Pellet gebundenem, membrangebundenen oder säulengebundenen
Nukleinsäureoligomeren, die die Rezeptor-Einheit (und gegebenenfalls zudem an das Target oder in den verschiedenen Immunkomplexen) gebunden sind (Beispiele 8 - 16), gibt man 20mM Natriumphosphatpuffer pH 7.2, 6M Guanidinium/HCI, 10mM DTT, 2% TritonX 100 vorgewärmt auf 90°C (ca. ein Säulenvolumen/ ca 3 faches Volumen bei anderen Isolaten), eluiert im Fall der säulengebundenen Komplexe nach 2-3 min mit weiteren 3 Säulenvolumen des gleichen Puffers und sammelt im Fall der säulengebundenen Immunkomplexe das Eluat. Die Eluate werden kurz bei 15.000 x g zentrifugiert, zum Überstand werden 5μg Poly-dT(33) zur Unterstützung der Präzipitation gegeben, die Probe wird anschließend mit einem halben Volumens 3M Kaliumacetat pH 5.0 und dem vierfachen Volumens Ethanol (-20°C) versetzt und die DNA bei 15.000 x g bei 4°C über 40min präzipitiert. Das Pellet wird abgetrennt und mit 70% Ethanol (-20°C) und 100% Ethanol (-20°C) gewaschen und an der Luft getrocknet. Alternativ wird nach Zugabe der Carrier-DNA 1/2 Volumen Ethanol und ! Volumen 3M Kaliumacetat pH 5.0 zugegeben und auf eine 'spin column' mit einer aktivierten Glasfasermembran aufgetragen. Nach 10 min, nachdem die Lösung sich abgekühlt hat, wird zentrifugiert, mit dem gleichen Puffer, und anschließend mit Ethanol gewaschen, Die Nukleinsäureoligomere werden schließlich mit 50μl TE-Puffer von der Glasfasermembran eluiert (Kits von Qiagen, Promega, u.a.). Zur Amplifikation wird das Pellet im PCR-Puffer aufgenommen (vgl. Beispiel 8), zur direkten Detektion ohne Amplifikation im Hybridisierungspuffer (vgl. Beispiel 19).
(ii) Spaltung des Linkers nach Reduktion: Zur Spaltung der RS-SR' Einheit (im Linker zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor-Einheit, vgl. Beispiel 2) gibt man zu den im Eluat isolierten, im Pellet gebundenem, membrangebundenen oder säulengebundenen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, die gegebenenfalls an das Target oder in den verschiedenen Immunkomplexen gebunden sind (Beispiele 8 - 16), 10mM DTT in PBS (ein Säulenvolumen oder 1-3 Volumen der Probe), lässt für 15 min einwirken, eluiert mit 1-2 Säulenvolumen des gleichen Puffers und sammelt im Fall der säulengebundenen Komplexe das Eluat. Die Eluate werden kurz bei 15.000 x g zentrifugiert. Zum Überstand werden 5μg Poly-dT(33) zur Unterstützung der DNA- Präzipitation gegeben, die Probe wird anschließend mit einem halben Volumens 3M Kaliumacetat pH 5.0, und dem vierfachen Volumens Ethanol (-20°C) versetzt und die DNA bei 15.000 x g bei 4°C über 40min präzipitiert. Das Pellet wird abgetrennt und mit 70% Ethanol (-20°C) und 100% Ethanol (-20°C) gewaschen und an der Luft getrocknet. Zur Amplifikation wird das Pellet im PCR-Puffer aufgenommen (vgl. Beispiel 18), zur direkten Detektion ohne Amplifikation im Hybridisierungspuffer (vgl. Beispiel 19). Alternativ können die Nukleinsäureoligomere wie unter (i) beschrieben auch über Glasfasermembranen aufgereinigt werden. Diese Methode hat wie die in iii) und iv) beschriebenen Methoden den Vorteil, daß die DNA vom Protein getrennt und weniger Proteine im Eluat mit ausgewaschen werden.
(iii) Spaltung des Linkers nach Oxidation: Zur Spaltung der RC(OH)-C(OH)R' Einheit (im Linker zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor-Einheit) gibt man zu den isolierten freien oder säulengebundenen Komplexen (Beispiele 8 - 16) 10mM Nal04 in PBS (ein Säulenvolumen oder das gleiche Volumen der Eluationslösung), lässt für 15 min einwirken, eluiert mit 1-2 Säulenvolumen PBS und sammlet im Fall der säulengebundenen Komplexe das Eluat. Zum Eluat werden 5μg Poly-dT(33) zur Unterstützung der DNA-Präzipitation gegeben, und es wird wie unter (i) beschrieben, über Ethanol-Präzipitation oder über Glasfasermembran isoliert.
(iv) Photolytische Spaltung des Linkers: Zur Spaltung der RN=NR' Einheit (im Linker zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor-Einheit, vgl. Beispiel 3) bestrahlt man die isolierten freien oder in einem Becherglas suspendierten säulengebundenen Komplexe (Beispiele 8 - 16) in PBS unter Rühren für 10 min mit dem Licht einer 500 W Xenon-Lampe mit aufgesetztem 330 bis 350 nm Interferenzfilter. Das Säulenmaterial wird filtriert, kurz mit PBS-Puffer nachgewaschen und das Filtrat gesammelt. Die vereinigten Filtrate werden mit 5μg Poly-dT(33) zur Unterstützung der DNA-Präzipitation versetzt, und wie unter (i) beschrieben über Ethanol-Präzipitation oder über Glasfasermembran isoliert.
Beispiel 18: Amplifizierung und nachträgliche Markierung des Nukleinsäureoligomers:
Handelt es sich bei den an den Rezeptor-Einheit gebundenen Nukleinsäureoligomeren um DNA bzw. RNA, die Primer-Bindungsregionen (wie z,B, das in Beispiel 1 konstruierte Nukleinsäureoligomer) besitzen, die für alle verwendeten Rezeptor-gebundenen Nukleinsäureoligomere innerhalb einer qualitativen und/oder quantitativen Targetanalyse (Proteomanalyse etc.) identisch sind, so können die in der Untersuchungslösung vorhandenen Nukleinsäureoligomere, die anhand einer der Methoden (i) bis (v) in Beispiel 17 abgetrennt wurden, durch PCR amplifiziert werden. Bei identischen Primern und identischer, bzw. nahezu identischer Länge aller Nukleinsäureoligomere und den Auswahlkriterien für die einzelnen Sequenzen, wie sie in Beispiel 24 beschrieben sind, ist eine Amplifikation über PCR möglich, ohne dass die Repräsentanz einzelner Nukleinsäureoligomere, bzw. die Zusammensetzung der Nukleinsäureoligomer- Mischung, sich verändert.
(i) Exponentielle Amplifikation: Nach Abtrennung der DNA aus den Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz (vgl. Beispiel 17) löst man das DNA-enthaltende Pellet in 10mM Tris/HCI pH 8.0. Ein Aliquot davon (1/20- 1/100) wird zur Amplifikation eingesetzt. Damit die Amplifizierungsrate exakt ermittelt werden kann wird vor der Amplifikation eine definierte Menge (10fg, 1pg, 50pg, 1ng) von 4 Kontroll-Nukleinsäureoligomeren (mit eigenen spezifischen Kodierungsregionen und ansonsten identischen Aufbau wie die zur Markierung verwendeten Nukleinsäureoligomere) zum Isolat der Nukleinsäureoligomere zugegeben. Man gibt die beiden universalen Primer P1 und P2 (ein Primer bevorzugt mit einem Detektions-Marker) und die Nukleotid-Bausteine dCTP, dGTP, dATP und dTTP zu und führt z.B. eine Standard-PCR mit 11 bis 18 Zyklen durch um eine in etwa 1000fache bis 100.000fache Amplifikation zu erreichen. Bei Verwendung von unterschiedlichen Primer-Gruppen, die jede für sich universal nur für eine bestimmte Gruppe von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten sind (wie in Beispiel 1 die Primer 2-1, 2-2, 3-1 und 3-2) werden für jedes Primer-Paar entsprechend 4 spezifische Kontroll-Nukleinsäureoligomere in definierter Menge vor der PCR zugegeben, und die PCR optional in separaten PCR-Reaktionen amplifiziert. Die Lösung wird nach erfolgter PCR-Synthese mit 5μg Poly-dT(33) zur Unterstützung der Präzipitation und mit 4 Volumen 6M Guanidiniumchlorid versetzt, um die Polymerase zu zerstören. Zu dieser Lösung wird anschließend ein halbes Volumen 3M Kaliumacetat pH 5.0 und das vierfache Volumen Ethanol (-20°C) gegeben und die DNA bei 15.000 x g bei 4°C über 40min präzipitiert. Das Pellet wird mit 70% Ethanol (- 20°C) und 100% EtOH (-20°C) gewaschen und an der Luft getrocknet. Zur direkten Detektion wird das Pellet im Hybridisierungspuffer gelöst (vgl. Beispiel 19), zur nachträglichen Modifikation mit Detektions-Marker führt man anschließend eine lineare Amplifikation mit gleichzeitigem Einbau eines Detektions-Markers wie in Beispiel 18 ii) beschrieben oder eine nachträgliche chemische Modifikation mit Detektions-Marker wie in Beispiel iii) beschrieben durch. Für die nachträgliche Modifikation mit einem Detektions-Marker wird nach der PCR ein zusätzlicher Chromatographieschritt eingeführt, um die nicht umgesetzten Primer von den amplifizierten Nukleinsäureoligomeren abzutrennen. Dazu wird der gesamte Ansatz auf eine Sephacryl S100-Säule aufgetragen und die erste Fraktion (ca. 25kDa), die die Amplifikationsprodukte enthalten, gesammelt, die zweite Fraktion (ca. 4kDa), die die Primer enthält, wird verworfen.
(ii) Lineare Amplifikation: Unter sonst gleicher Vorgehensweise wie unter Beispiel 18 i) erhält man bei Weglassen des Primers P1 (Zusatz von Primer P2, der einen DetektionsMarker wie z.B. Rhodamin trägt) bei Durchlaufen von 10 bis 40 Synthesezyklen (analog zur PCR) eine 10fache bis 40fache Amplifikation als ss-DNA, wobei die komplementäre Sequenz des Nukleinsäureoligomers als ss-DNA erhalten wird. Setzt man die Amplifikationsprodukte aus Beispiel 18(i) ein kann wahlweise auch mit Primer 1 (ebenfalls mit Detektions-Marker) spezifisch das Nukleinsäureoligomer als ss-DNA amplifiziert werden. Vorteil dieses
Amplifikationsschrittes ist, dass die zu detektierenden Nukleinsäureoligomere bereits als ss-DNA vorliegen.
(iii) Neben der beschriebenen Methode kann auch durch Zugabe von Nukleotiden, die einen Detektions-Marker tragen, über PCR die DNA oder über in-vitro Transskription die RNA mit einem Detektionsmarker versehen werden, daneben kann der Detektions-Marker analog zu den Anbind ungsvorschriften der Beispiele 2 - 5 an das Nukleinsäureoligomer nachträglich angebunden werden.
Beispiel 19: (Parallele) Detektion der Nukleinsäureoligomere über Fluoreszenz:
(i) Parallele Detektion mit Dot-Plot-Technik auf modifizierter Nylonmembran (Hybond N+) über Fluoreszenzdetektion: Die Testsites tragen an ein Trägermaterial kovalent angebunde Sonden-Oligonukleotide, die komplementär zu den zu detektierenden Nukleinsäureoligomeren sind. Die Sonden-Oligonukleotide werden in einem beliebigen aber bekannten Muster auf die modifizierte Nylonmembran getropft. Anschließend wird die Membran bei 80°C für 2 Stunden gebacken, wodurch eine feste Anbindung der Sonden-Oligonukleotide erfolgt. Alternativ dazu kann das Sonden-Oligonukleotid 3' oder 5' terminal einen Linker tragen, der eine reaktive oder aktivierbare Gruppe besitzt, über die das Sonden-Oligonukleotid auf eine geeignete Trägeroberfläche in definierter Weise gebunden wird (z. B. eine NH2-Gruppe am Sonden-Oligonukleotid und Isothiocyanat-Gruppe auf dem Träger).
Freie Bindungsstellen der Membran werden durch Inkubation für 30 min bei 45°C mit dem Hybridisierungspuffer 1 (7% SDS, 500mM Na-Phosphatpuffer pH 7.5, 5mM EDTA, 0.1 mg/ml ssDNA aus einem Organismus mit möglichst geringer phylogenetischer Verwandtschaft, z.B. pBR322 aus E.coli, 0.5 mg/ml acetyliertes BSA) abgesättigt (Prähybridisierung). Die so gebildeten 'Dots' (Testsites mit Sondenoligonukleotid) werden von der Hybridisierungslösung, die die in Beispiel 17 i- iv isolierten Nukleinsäureoligomere bzw. deren Amplifikationsprodukte, enthält, überschichtet. Doppelsträngige DNA-Nukleinsäureoligomere, die bei der Amplifikation entsprechend Beispiel 18 i) anfallen, werden vorher 5 min lang bei 100°C denaturiert und kurz auf Eis gekühlt, bevor sie zur Hybridisierungslösung zugegeben werden. Man lässt die Sonden-Oligonukleotide und Nukleinsäureoligomere der Lösung bei ca. 40°C für ca. 3 bis 16 h hybridisieren. Nach Entfernung der nicht-hybridisierten Bestandteile (nicht-stringentes Waschen mit 2 x SSC, 0.1% SDS, 1mM EDTA für 15 - 60 min bei 40°C und anschließend stringentes Waschen mit 0.4 x SSC, 0.1% SDS, 0.1 mM EDTA, für 5 min bei 50°C) werden anhand des Fluoreszenz-Musters die entsprechenden ss-Nukleinsäureoligomere aus der Targetanalyse detektiert (qualitative Analyse) und/oder quantitativ erfasst.
(ii) Parallele Detektion auf DNA-Chips über Fluoreszenzdetektion: Als Chip kann z.B. ein custom made Affymetrix GeneChip® (vgl. Wodicka et al. 1997, Nature Biotechnology, 15, 1359ff) verwendet werden. Die Testsites tragen an ein Trägermaterial kovalent angebunde Sonden-Oligonukleotide, die komplementär zu den zu detektierenden Nukleinsäureoligomeren sind. Die für die Targetanalyse eingesetzten Nukleinsäureoligomere (oder die Amplifikationsprodukte) enthalten entsprechend des Affymetrix-Protokolls ein Biotin als primären Detektions-Marker.
10μg der Nukleinsäureoligomere werden als ss-Nukleinsäureoligomere in 250 μl (pro verwendeten Chip) Hybridisierungs-Puffer 3 (100mM MES, 1M NaCI, 20mM EDTA, 0.01 % TWEEN 20, pH 6.5 - 6.7) gemeinsam mit 0.1 mg/ml Herings-Spermien ss- DNA und 0.5 mg/ml acetylierter BSA aufgenommen und auf den Chip gebracht. Anschließend lässt man die zueinander komplementären Nukleinsäureoligomere für 16 h bei 43 °C hybridisieren. Nach erfolgter Hybridisierung wird der Chip zur Entfernung der nicht-hybridisierten Bestandteile gewaschen (nicht-stringentes Waschen mit 900mM NaCI 60mM Na-Phosphat pH 7.6, 6mM EDTA, 0.05% Triton X100 für 1 h bei 40°C und anschließend stringentes Waschen mit 75mM NaCI 5mM Na-Phosphat pH 7.6, 0.5mM EDTA, 0.05% Triton X 00 für 15 min bei 40°C) und Anbindung des Detektionsmarkers Streptavidin-modifiziertes Phycoerithrin nach Affymetrix-Vorschrift wird anhand einer Standardmethode, z. B. mit konvokalem Fluoreszenzmikroskop und gekoppelter CCD-Kamera, ausgelesen. Anhand des Musters der Fluoreszenz können bestimmte Nukleinsäureoligomere detektiert (qualitative Analyse) oder auch quantitativ erfasst werden (quantitative Analyse). Beispiel 20: Kit zur Detektion von Antigenen und Antikörpern:
Der Kit enthält ein Protokoll für die Durchführung des Assays (ähnlich wie in Beispielen 6-19 beschrieben, aber angepaßt an die mit dem Kit gelieferten Komponenten). Der Kit beinhaltet modifizierte Nukleinsäureoligomere mit verschiedenen Kodierungsregionen, an die, gegebenenfalls über einen (nach Induktion spaltbaren) Linker eine Komponente zweier konjugierter chemischer Substanzen, wie unter d) im Abschnitt "Bindung eines Rezeptors an ein Nukleinsäureoligomer" beschrieben (z.B. ein anti-Biotin-Fab-Fragment), angebunden ist (Oligo20-anti-Biotin-Fab, Herstellung analog zu Beispiel 5). Über die Komponente zweier konjugierter chemischer Substanzen kann eine mit dem entsprechenden Bindungspartner der Komponente modifizierte beliebige Rezeptor-Einheit wie z. B. eine biotinylierte Rezeptoreinheit - vom Anwender nach dessen Präferenzen durchführbar - angekoppelt werden. Der Kit beinhaltet weiterhin einen Satz von Sonden-Oligonukleotiden, die, je nach Protokoll, identisch oder komplemetär zu den Kodierungsregionen der Nukleinsäuroligomeren sind, und die optional, je nach Komplexität des Kits (Anzahl unterschiedlicher Kodierungs- und entsprechend Sonden-Nukleinsäureoligomeren) in definierten Muster auf einer Dot-Blot-Membran oder auf einem DNA-Chip immobilisiert sind. Daneben kann der Kit einen Satz Primer 1 und / oder Primer 2 enthalten, wobei der Primer oder einer der Primer zusätzlich einen Detektions-Marker tragen kann (vgl. Beispiel 1 und 19). Weitere Komponenten des Kits können speziell für bestimmte Anwendungen zusammengestellte Sätze von passend modifizierten Rezeptor-Einheiten sein, wie z.B. biotinylierte Antikörper oder biotinylierte Fab-Fragmente (Kit zur Detektion von Antigenen) bzw. biotinylierte Antigene (Kit zur Detektion von Antikörpern), die zur Träger-gebundenen Abtrennung zusätzlich modifiziert sein können. Daneben passende Chromatographiematerialien für die Aufreinigung der Nukleinsäureoliogmer-Rezeptor-Einheiten (wie z.B. eine mit Biotin belegte Affinitätschromatographiesäule), weitere Antikörper, die zur Immobilisierung und zur Abtrennung der mit Target besetzten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten eingesetzt werden können, wie z.B. spezifische Antikörper gegen die gleichen Targets aber gegen ein anderes Epitop (Antigen-Kit), anti-lg-Antikörper, die gegen die Fc-Region der gesuchten Antikörper gerichtet sind. Daneben eine an die Targetanalyse angepasste Einheit zur Abtrennung der an die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Komplexe gebundenen Antigene (Antigen-Kit) bzw. Antikörper (Antikörper-Kit) aus einem oder mehreren der Bestandteile: spezifische oder gruppenspezifische Antikörper für die Antigen-Targets (für den Antigen-Kit), spezifische gegen die Fc-Regionen gerichtete anti-lg-Antikörper (Antikörper-Kit) Reagenzien zur Modifikation der Antigen-Targets (Antigen-Kit, vgl. Beispiel 10) und passend modifiziertes oder unmodifiziertes Trägermaterial, vgl. Beispiel 8 - 16, gegebenenfalls in Form einer Einmal-Kartusche oder als 'spin column'. Daneben verschiedenenste Puffer, gegebenenfalls in gebrauchsfertiger Form (insbesondere Inkubationspuffer, Waschpuffer und einen Eluationspuffer, der das zur Spaltung des spaltbaren Linkers notwendige Induktionsmittel enthält, Hybridisierungspuffer und Waschpuffer für die Detektions-Einheiten wie Dot-Blot-Membranen u.a.). Daneben andere Zusätze wie z. B. Oligo-dT(33) zur Unterstützung der Präzipitation von Nukleinsäureoligomeren, acetyliertes BSA oder ss-DNA sowie geeignete Reaktionsgefäße und Verbrauchsmaterialien. Daneben kann der Kit Komponenten für die PCR-Amplifikation wie z. B. eine Mischung aus Nukleotiden, PCR-Puffer und die entsprechenden Polymerasen, sowie z. B. Isolierungspuffer, Waschpuffer und eine geeignete 'spin column' mit einer modifizierten Glasfasermembran zur Abtrennung und Aufreinigung der Amplifikationsprodukte, enthalten.
In einer einfachen Version besteht der Kit aus einem oder mehreren Nukleinsäureoligomeren mit angebundenem Antibiotin-Fab-Fragment. Als
Nukleinsäureoligomere werden vorzugsweise DNA, RNA oder PNA verwendet, die analog zu Beispiel 1 konstruiert sind, ein über einen nach Induktion spaltbaren Linker
(z. B. Linker mit -S-S-Gruppe, vgl. Beispiel 2) kovalent angebundenes anti-Biotin-Fab-
Fragment besitzen (Herstellung analog zu Beispiel 5) und neben einer Kodierungsregion (konstruiert z. B. nach der Anweisung in Beispiel 25) gegebenenfalls zusätzlich einem (Fluoreszenz-) Farbstoff als Detektions-Marker und eine oder zwei Primer-Bindungsregionen zur späteren PCR-Amplifikation aufweisen.
Diese Nukleinsäureoligomere mit identischem Antibiotin-Fab-Fragment werden mit einem Protokoll zur Handhabung und Weiterverwendung (analog der Vorschrift in Beispiel 25) angeboten und können mit biotinylierten Antigenen oder biotinylierten
Antikörpern kombiniert werden.
In einer besonderen Ausführungsform umfasst der Kit eine Vorschrift zur Präparation von biotinylierten Fab-Fragmenten und der Präparation der Eingangs dieses Beispiels erwähnten modifizierte Nukleinsäureoligomere (z.B. Oligo20-anti-Biotin-Fab) sowie mindestens eine der dazu nötigen Komponenten wie Papain immobilisiert an Agarose, Protease-Puffer, PMSF als Proteaseinhibitor zum Abstoppen des proteolytischen Verdaus, eine Gelfiltrationssäule für die Aufreinigung, ein Biotinylierungs-Agens und den entsprechenden Biotinylierungs-Puffer für die Biotinylierung, und eine weiter Gelfiltrationssäule zur Abtrennung des freien Biotins, einer Biotin-Affinitätschromatographie-Säule zur Abtrennung nicht umgesetzter biotinylierter Nukleinsäureoligomere sowie eine Protein G-Affinitätssäule zur Abtrennung nicht proteolytisch gespaltener Antikörper und freier Fc-Fragmente, wobei die Säulen als Einmal 'spin columns' oder Einmalkartuschen zur Verfügung gestellt werden können, sowie Reaktionsgefäße und anderes Verbrauchsmaterial. Das Protokoll umfasst die Schritte: a) Zugabe von Puffer für den proteolytischen Verdau und Inkubation mit Papain (immobilisiert auf Agarose) für 4h bis zu 16h (je nach Subklasse des verwendeten Antikörpers), Zugabe von PMFS und Zentrifugation, um das Papain abzutrennen, b) Inkubation des gereinigten Antikörpers nach Zugabe des Inkubationspuffers mit dem aktivierten Biotin-Molekül, wobei das molare Verhältnis zwischen Antikörper und Biotin-Molekül ca 1 :1-1 :1.5 liegen sollte, c) Reinigung und Abtrennung des nicht umgesetzten Biotins über die Gelfiltrationssäule, d) Reinigung und Abtrennung des Fc-Fragmentes und nicht proteolytisch prozessierter Antikörper über ProteinG-Affinitätschromatographie, e) Inkubation je eines Nukleinsäureoligomers mit spezifischer Kodierungssequenz und angebundenem anti- Biotin-Fab-Fragment, Inkubation bei Raumtemperatur für 4 h und f) Abtrennung der nicht an die biotinylierten Rezeptoren angebundenen Nukleinsäureoligomer über Biotin-Affinitätschromatographie.
Beispiel 21 : Kit zum Screenen nach potentiellen Antagonisten für ein Enzym oder ein Rezeptor-Protein:
Die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten werden vom Anweder unter Verwendung des oben genannten Kits (Beispiel 20) nach dessen Präferenzen zusammengestellt, wobei die Substanzen, die als potentielle Antagonisten untersucht werden sollen, vom Anwender selbst als biotinylierte Formen zur Verfügung gestellt werden können. Jede Substanz wird in Inkubationspuffer zu je einem spezifischen Nukleinsäureoligomer mit angebundenem anti-Biotin-Fab-Fragment zugegeben, 1-4 h inkubiert, die Inkubationslösung auf eine mit Biotin belegte Affinitätschromatographiesäule gegeben, weitere 1-4 h inkubiert, um die nicht angebundenen Nukleinsäureoliogmer-anti-Biotin-Fab-Fragmente abzutrennen.
Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Zu 1-1 Oμg eines Proteins (Enzym, Rezeptor-Protein oder funktionelles Peptid mit der aktiven Domäne dieser Proteine) in 10μl eines geeigneten Puffers (10mM Kaliumphosphat pH 8.0, 135mM Kaliumchlorid, 2mM Mg-Sulfat) gibt man je 0.1 μg Nukleinsäureoligomer-markierte Substanzen, die auf ihr Potential als Antagonisten untersucht werden sollen (wobei diese analog zur Methode in Beispiel 5 hergestellt wurden) plus einen Antikörper (IgG), der gegen das Protein (bzw. Peptid) spezifisch gerichtet ist, aber nicht die aktiven Zentren blockiert. Man lässt die Substanzen an das Protein, bzw. Peptid anbinden (für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C inkubieren), gibt danach das Substrat oder den natürlichen Bindungspartner in physiologischer Konzentration zu und gibt die Lösung auf eine Affinitätschromatographie-Säule (ca. ein Säulenvolumen), die mit ProteinG belegt ist. Man lässt die Immunkomplexe aus Nukleinsäureoligomer-markierter Substanz, Protein (bzw. Peptid) und dem spezifischen Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an das ProteinG binden. Anschließend wird die Affinitätschromatographie-Säule mit dem Puffer inklusive dem natürlichen Bindungspartner in physiologischer Konzentration (Fraktion 1), dann inklusive dem natürlichen Bindungspartner in 50fach höherer Konzentration (Fraktion 2) und dann inklusive einem bekannten hochaffinen Antagonisten in hoher Konzentration (Fraktion3) eluiert - die Fraktionen werden separat gesammelt.
Durch die einzelnen Eluationsschritte werden zunächst nicht gebundene Nukleinsäureoligomer markierte Substanzen, die nicht oder nur sehr schwach an das Protein binden können, entfernt (Fraktion 1), dann Nukleinsäureoligomer markierte Substanzen, die als geringaffine Antagonisten in der Bindungsstelle des natürlichen Bindungspartners wirken (Fraktion 2), dann hochaffine Antagonisten (Fraktion 3). Auf der Säule verbleibenden Nukleinsäureoligomer-markierte Substanzen, die an das Protein, bzw. Peptid gebunden bleiben (Fraktion 4). Dabei enthält Fraktion 4 Substanzen, die hochaffine Antagonisten darstellen und deshalb nicht vom Protein abdissoziieren, aber auch Antagonisten oder Inhibitoren, die an einer anderen Bindungsstelle als die des natürlichen Bindungspartners oder des bekannten Antagonisten angebunden haben, oder aber Substanzen, die ohne jede Wirkung an das Protein, bzw. Peptid gebunden haben. Die Nukleinsäureoligomer-Einheiten der der noch auf der Säule verbliebenen Substanzen können nach einer der in Beispiel 17 beschriebenen Methoden als Fraktion 4 isoliert werden.
Beispiel 22: Kit zum Screenen nach Antikörpern von Hybridoma- Zellüberständen mit gleichzeitigem Epitop-Mapping:
Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. Als Nukleinsäureoligomer wird ein Oligo20- anti-Biotin-Fab (oder ein analog mit einer Komponente zweier konjugierter chemischer Substanzen modifiziertes Nukleinsäureoligomer, vgl. Beispiel 20) benutzt. Als Rezeptor-Einheiten werden Peptide eingesetzt, die mit Biotin markiert werden. Im einfachsten Fall erreicht man die Biotinylierung durch in vivo Markierung in E.coli über rekombinante Expression als Fusionsprodukt mit einem Segment des Biotin Carboxylase Carrier Proteins (Pin Point-Vektoren der Fa. Promega). Die Peptide stellen Teile des Antigens dar, das bei der Immunisierung verwendet wurde und tragen ein oder mehrere Epitope dieses Antigens. Der Kit in dieser Ausführung erlaubt es dem Anwender, diese Rezeptor-Einheiten nach individuellen Präferenzen herzustellen und einzusetzen.
Zu je 10μg eines spezifischen Oligo20-anti-Biotin-Fab wird je ein spezifisches biotinyliertes Peptid in einem molaren Verhältnis von ca. 1.5:1 in PBS zugegeben. Man lässt das Nukleinsäureoligomer an das biotinylierte Peptid für 2 Stunden bei Raumtemperatur koppeln. Die Probe wird anschließend auf eine Affinitätssäule gegeben, die mit Biotin belegt ist, und man lässt die nicht gebundenen Nukleinsäureoligomere für 2 Stunden bei Raumtemperatur über anti-Biotin-Fab- Fragment an das Biotin der Affinitätssäule binden. Danach werden die über Biotin- anti-Biotin-Fab verknüpften gebrauchsfertigen Nukleinsäureoligomer markierten Peptide eluiert (Nukleinsäureoligomer-markierte Rezeptor-Einheit). Zu je 100μl des Zellkultur-Überstands einer Hybridoma-Zell-Linie werden nun je O.Oδμg eines Nukleinsäureoligomer-markierten Peptids gegeben und man lässt diese für 2 Stunden bei Raumtemperatur (und evtl. weiteren 12 Stunden bei 4°C) an monoklonale Antikörper der Hybridoma-Zelllinien binden. Danach wird die Lösung auf eine Affinitätschromatographie-Säule (ca. ein Säulenvolumen) aufgetragen, die Protein G gebunden hat, und wartet ca. 2 h bei Raumtemperatur (und evtl. weiteren 12 Stunden bei 4°C) bis die Immunkomplexe aus Nukleinsäureoligomer-markierte Rezeptor-Einheit und den monoklonalen Antikörpern an das Protein G gebunden haben. Anschließend wird die Säule nacheinander mit PBST und Phosphat- Waschpuffer (50 mM, pH 7.2, δOOmM NaCI) gewaschen.
Die Trennung von freien Nukleinsäureoligomer-markierten Peptiden und Komplexen dieser Peptide mit dem Target, dem monoklonalen Antikörper (auf dem Säulenmaterial immobilisiert) erfolgt durch die Eluation und die Waschschritte, so daß am Ende der Waschschritte die Nukleinsäureoligomer-Einheiten nach einer der in Beispiel 17 beschriebenen Methoden für die Amplifikation und Detektion isoliert werden können.
Der Kit enthält hierfür jeweils fluoreszenzmarkierte Primer für die Amplifikation, je nach Komplexität des Kits (Anzahl unterschiedlicher spezifischer Kodierungs- Nukleinsäureoligomere) Dot-Blot-Streifen oder DNA-Chips, auf denen ein ganzen Satz an Sonden-Oligonukleotiden in definiertem Muster gebunden ist. Vorteil dieser Methode ist, daß das Screening früher einsetzen kann und weniger Material (insb. an Antigen) erfordert als die üblichen Methoden.
Beispiel 23: Kit zur Detektion von DNA-bindenden (bzw. RNA-bindenden) Biomolekülen, insbesondere DNA- bzw. RNA-bindenden Proteinen oder deren Antagonisten:
Der Kit besteht aus Nukleinsäureoligomeren mit verschiedenen Kodierungsregionen, an die sich, gegebenenfalls über einen (nach Induktion spaltbaren) Linker, jeweils eine spezifische DNA- bzw. RNA-Sequenz (als ss- oder ds-DNA bzw. als ss- oder ds- RNA) als Rezeptor-Einheit für DNA-bindende (bzw. RNA-bindende) Biomoleküle, insbesondere DNA- bzw. RNA-bindende Proteine anschließt (z. B. die Sequenz ds-δ'- CCAGGCCTGG-3' für die DNA-(Cytosine-δ)-methyltransferase Haelll, das loxP-site für CRE-Rekombinase, Promotorsequenzen, die spezifisch verschiedene Transskriptionsfaktoren und Transskriptionsregulatoren binden oder RNA-Sequenzen die Splice-Faktoren und hn-RNP binden). Diese zusätzlich angebundenen DNA- bzw. RNA-Sequenzen können auch als Rezeptor-Einheiten für Antagonisten von DNA- bzw. RNA-bindende Proteinen dienen (z. B. die Sequenz ds-δ'-ATGCAT-3' als Bindungsstelle für DNA-bindende Topoisomerase II, aber auch als Bindungsstelle eines Inhibitors für DNA-bindenden Topoisomerase II wie LU-79δδ3, vgl. Gallego & Reid, Biochemistry 1999, 38, 15104 - 15115). Daneben enthält der Kit eine Protokoll zur Handhabung des Kits, sowie optional für alle Nukleinsäureoligomere gleiche Primer (P1 und/oder P2), die wahlweise mit einem Detektions-Marker (z. B. einem Rhodamin oder Flurescein), das zur Spaltung des spaltbaren Linkers notwendige Induktionsmittel, passende oder beliebige DNA-bindende (bzw. RNA-bindende) Biomoleküle, deren Antagonisten (passend oder beliebig), die zur Träger-gebundenen Abtrennung zusätzlich modifiziert sein können, und eine Detektions-Einheit, die auf die verwendeten Nukleinsäureoligomere abgestimmt ist (z. B. eine gebrauchsfertige Dot-Plot Membran mit den zu den zu detektierenden Nukleinsäureoligomeren komplementären, auf kodierungssequenzspezifischen Spots immobilisierten Sonden- Oligonukleotiden, vgl. Beispiel 19). Daneben kann der Kit eine an die Targetanalyse angepasste Einheit zur Abtrennung der mit Target besetzten und an die Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Komplexe gebundenen DNA-bindenden (bzw. RNA- bindenden) Biomoleküle aus den Bestandteilen spezifische Antikörper für die DNA- bindenden (bzw. RNA-bindende) Biomoleküle oder deren Antagonisten, Reagenz zur Modifikation der DNA-bindenden (bzw. RNA-bindende) Biomoleküle oder deren Antagonisten, vgl. Beispiel 10 und passend modifiziertes oder unmodifiziertes Trägermaterial, vgl. Beispiel 8 - 16, gegebenenfalls in Form einer Einmal-Kartusche bzw. einzelne Bestandteile der Abtrennungseinheit, enthalten. Beispiel 24: Exemplarische zelluläre Proteomanalyse:
(i) Proteinaufschluss: Gewebezellen (> 100 Zellen), z. B. das Zellmaterial einer Biopsie, wird - nach Zugabe von RIPA-Puffer (1δ0mM NaCI 1% NP-40, 0.δ% Desoxycholat, 0.1% SDS, δOmM Tris, pH 8.0, 10μl pro mg Zellgewebe, mindestens jedoch 1 μl) im Mikrotip-Sonifier aufgeschlossen. Ein Großteil des zellulären Proteoms der Zellen wird wie in Beispiel 6 ii) unter partiell denaturierenden Bedingungen in Lösung gebracht (Abtrennen der verbleibenden unlöslichen Protein-Fraktion (ECM / Cytoskelett) bei 800 x g / 4 °C / 1δ min und Reste des Zelldetritus aus dem abgetrennten Überstand bei 60.000 x g / 4 °C / 30 min). Der RIPA-gepufferte Überstand enthält die partiell denaturierten löslichen cytoplasmatischen Proteine und einen Großteil der Membranproteine. Die im Pellet verbliebenen Proteine werden verworfen (oder es werden geeignete Rezeptor-Nukleinsäure-Komplexe an die unlöslichen Proteine im Pellet gebunden und diese Target-Rezeptor- Nukleinsäureoligomer-Komplexe in einem 2. Arbeitsgang, wie in Beispiel 13 geschildert, weiteranalysiert).
(ii) Konstruktion der Rezeptor-Nukleinsäureoligomer-Komplexe: Als Rezeptor- Einheiten werden z.B. biotinylierte Fab-Fragmente der Antikörper aus Beispiel 24 verwendet (i.a. hängt die Auswahl der Rezeptor-Einheiten von der Fragestellung der Proteomanalyse ab und die Rezeptor-Einheiten werden entsprechend ausgewählt). Als Nukleinsäureoligomer wird eine synthetische ss-DNA der Sequenz
Rhodomin-5'-TTT-GACGAGACGTCATGG- y6-CTCACCAGAGCTTCG-TTT-3,-hexyl-NH2 mit der Primer-Bindungsregion P1 (= GACGAGACGTCATGG), der dem Primer P2 komplementären Basenregion P'2 (= CTCACCAGAGCTTCG), der für einen Rezeptor-Einheit (bzw. eine bestimmte Rezeptor-Einheitgruppe) spezifischen 16 Basen langen Kodierungssequenz K16, siehe unten, sowie einer 3'-terminalen TTT- Hexyl-NH2-Einheit und einer δ'-terminalen Rhodamin-TTT-Einheit, die in der Festphasensynthese kovalent gebunden wurden, benutzt. Nukleinsäureoligomer 1 zur Anbindung von Rezeptor-Einheit 1 besitzt z. B. die Kodierungssequenz 5 -GTTCCAAGCATGGTTC-3', wobei die Positionen 1 , 2, 9 und 10 der Kodierungssequenz unabhängig sind, die Positionen 3, δ und 7 durch die Permutationsvorschrift G → A → C → T → G von Position 1 abhängig ist, also für ein G an Position 1 folgt, dass Position 3 ein A, Position δ ein C und Position 7 ein T ist. Analog sind durch die gleiche Permutationsvorschrift die Positionen 4, 6 und 8 von der unabhängigen Besetzung der Position 2 abhängig, sowie die Positionen 11 , 13 und 1δ von der unabhängigen Position 9 sowie die Positionen 12, 14 und 16 von der unabhängigen Position 10; durch diese einfache Permutationvorschrift ergeben sich aufgrund der 4 frei wählbaren Positionen 44 = 2δ6 verschiedene Kodierungssequenzen, die berücksichtigen, dass (a) der GC-Gehalt der Kodierungssequenz (δ0%) erhalten bleibt und dass sich (b) die einzelnen Kodierungssequenzen um mindestens 4 Basen unterscheiden. Will man zusätzlich gewährleisten, dass (c) nicht mehr als zwei der Basen eines Basenpaares (T und/oder A bzw. G und/oder C) benachbart sind, ist innerhalb dieser Besetzungsvorschrift einzig Position 8 nicht mehr völlig frei wählbar, also bedingt abhängig, so dass sich für Position 8 nur noch 3 Besetzungsmöglichkeiten ergeben und somit von den ursprünglichen 44 = 2δ6 nur noch 43 x 3 = 192 verschiedenen Kodierungssequenzen verbleiben, die definitiv den Bedingungen (a) bis (c) genügen (von den 16 Besetzungsmöglichkeiten für die Basen 7 und 8 gibt es 8 Möglichkeiten, da 2 Basen eines Basenpaares benachbart sind, die dann nur noch 2 Wahlmöglichkeiten für die Position 9 erlauben, während für die anderen 8 Möglichkeiten, die keine 2 Basen eines Basenpaares benachbart aufweisen weiterhin alle 4 Wahlmöglichkeiten verbleiben, so dass für Base 9 rechnerisch statt 4 nur 3 Wahlmöglichkeiten bleiben; für eine längere Kodierungssequenz aus beliebigen Vielfachen einer 8er Sequenz, i. e. aus n x 8 Basen ergeben sich analog (42(n"1) x 3n"1) Kodierungssequenzen, die den Bedingungen (a) bis (c) bzw. 42π Kodierungssequenzen, die den Bedingungen (a) und (b) genügen).
Zur Anbindung der Fab-Fragmente werden alle für die verschiedenen Antikörper notwendigen Nukleinsäureoligomer-Bestandteile mit unterschiedlicher
Kodierungssequenz (beliebige aus den oben generierten maximal 192 Nukleinsäureoligomere) mit dem Linker Dithio-bis-propionsäure-sulfosuccinimidylester gekoppelt (je ein getrennter Ansatz Nukleinsäureoligomer pro Antikörper: 1 nMol des Nukleinsäureoligomers werden mit δO nMol Dithio-bis-propionsäure- sulfosuccinimidylester in ca. 100 μl 100 mM NaHC03/Na2C03, pH 9 aufgenommen, man lässt über Nacht bei Raumtemperatur im Dunklen stehen, isoliert und trennt die umgesetzte DNA in Carbonat-Puffer analog zur Vorschrift in Beispiel 3 ab). Die Nukleinsäureoligomer-Linker-Einheiten einer Reaktion werden anschließend mit je einer Art Fab-Fragmente umgesetzt und isoliert (analog Beispiel δ) und die Anzahl der DNA-Einheiten pro Fab-Fragment z. B. über das Verhältnis der Rhodamin-Fluoreszenz bei δ7δ nm (proportional der DNA) zur Absorption bei 28δ nm (proportional den Fab- Fragmenten) ermittelt.
(iii) Target-Rezeptor-Einheit-Kopplung: Die in PBS gelösten und mit den Nukleinsäureoligomeren markierten Fab-Fragmente aller Ansätze werden vereinigt (ca. 10 ml) und 10μl davon zu 10μl Lösung der partiell denaturierten Proteine in RIPA- Puffer gegeben (entsprechend 1 mg Zellmaterial). Man lässt die Proteine für ca. 3 h bei Raumtemperatur und für ca. 24 h bei 4 °C an die Fa -Fragmente koppeln. Man gibt 1 μg eines Cocktails aus polyklonalen Antikörpern in PBS zu, die für dieselben Targets (Proteine) spezifisch sind wie die Fab-Fragmente, (und optional weitere anti- lg-Antikörper, die gegen die Fc-Regionen dieser Antikörpern spezifisch sind) und lässt die Antikörper für weitere ca. 3 h bei Raumtemperatur und für ca. 12 h bei 4 °C an die Proteine koppeln.
(iv) Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäure-markiertem Rezeptor, Target und Target-spezifischem Antikörper: Eine mit Protein G belegte Agarose-Säule wird mit PBST, pH 7.5 equilibriert, die Lösung mit den Komplexen aus Nukleinsäure- markiertem Rezeptor, Target und Target-spezifischem Antikörper zur Immobilisierung der Immunkomplexe auf die Säule gegeben und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, damit die Immunkomplexe binden können. Danach wird die Säule mit PBS eluiert (das Eluat wird verworfen oder zur späteren Kontrolle aufbewahrt), und gewaschen (vergl. Beispiel 11).
(v) Abtrennung, Amplifizierung und Quantifizierung der DNA aus den Trägerimmobilisierten Antikörper-Target-Rezeptor-DNA-Immunkomplexen: Zur Spaltung der -S-S- Einheit im Linker zwischen DNA und Fab-Fragment wird ein Säulenvolumen 30 mM DTT in PBS zugegeben, man lässt die Säule für ca. 1δ min stehen, eluiert mit PBS und isoliert und reinigt die DNA im Eluat analog zur Vorschrift in Beispiel 3 oder Beispiel 17. Anschließend wird die erhaltene DNA wie unter Beispiel 18 i) und iii) beschrieben mit PCR unter Verwendung von Primer 2 und Rhodamin-modifizierten Primer P1 exponentiell amplifiziert, die amplifizierte DNA aufgeschmolzen (Erhitzen für δ min auf 100 °C, danach auf Eis abgekühlt), auf eine mit zu den ursprünglichen Kodierungssequenzen komplementären Sonden-Oligonukleotiden versehenen Dot- Plot-Membran gegeben, hybridisiert und gewaschen (wie in Beispiel 19 i beschrieben), und danach die Fluoreszenz der Spots quantitativ bestimmt (vgl. Beispiel 19 i).
Beispiel 25: Kit zur diagnostischen Untersuchung von Gewebematerial:
Eine Transplantation erfordert eine intensive diagnostische Untersuchung der zur Verfügung stehenden Gewebe in möglichst kurzer Zeit, da die Organe möglichst rasch transplantiert werden sollen. Untersucht werden müssen insbesondere die Blutgruppen und andere polymorphe Gewebsmarker, insbesondere die Komponenten des MHC (major histocompatibility complex), um Abstoßungsreaktionen abschätzen zu können und die geeigneten Patienten für die Transplantation auswählen zu können; gleichzeitig ist es notwendig, eine Infektionsgefahr über das transplantierte Gewebe auszuschließen.
Ein Kit umfasst einen Satz von kompletten Nukleinsäureoligomere-Rezeptor-Einheiten sowie einen Satz von Nukleinsäureoligomere-anti-Biotin-Fab-Einheiten, die zur Verfügung stehen, um analog Beispiel 20 zusätzliche Rezeptor-Einheiten, je nach Bedarf vom Anwender zusammengestellt, herstellen zu können .
Als Rezeptor-Einheiten kommen insbesondere Fab-Fragmente gegen die Komponenten des major histocompatibility complex (MHC - derzeit 1219 Allele bekannt), gegen Blutgruppen-Epitope (um die polymorphen Gewebemarker zu bestimmen), sowie insbesondere Antigene, die typisch für bestimmte Infektionskrankheit sind (um über die Existenz von Antikörpern gegen diese Antigene eine Infektion nachzuweisen), und Antigene wie z.B. Rheumafaktoren (um Antikörper zu detektieren, die typisch sind für eine Autoimmunkrankheit) in Frage.
Die Erfassung dieser Antikörper ist ausschließlich über die Proteinanalytik möglich. Die Antikörper sind zudem relativ einfach zugänglich, da sie über das Blut- Kreislaufsystem im ganzen Organismus verteilt sind. Besonders wichtig ist der Nachweis von Infektionen durch Krankheitserreger, die nur bei Immundefizienz ein Problem darstellen, von Infektionen durch virale Krankheitserreger, die noch lange nach überstandener Infektion persistieren können (HIV, Herpes simplex, Hepatitis A/B/C, Cytomegalovirus, Zoster, Retroviren, Mycoplasmen...), von Infektionen durch virale Krankheitserreger, die nicht einfach zu erkennen sind, da die Symptome nur schwer zuzuordnen sind (Adenovirus, Influenca etc.) sowie Infektionen durch andere Krankheitserreger, die oft aufgrund des schleichenden Krankheitsverlaufs nicht erfasst werden (Legionellose, Borelliose, Tuberkulose, Syphilis etc.).
Der Kit kann weitere Komponenten, wie in Beispiel 20 beschrieben, enthalten. Der Kit kann zudem Kontroll-Nukleinsäureoligomere, die wie alle eingesetzten Nukleinsäureoligomere aufgebaut sind und jeweils eine spezifische Kodierungssequenz besitzen, enthalten (Positiv-Bindungs-Kontrollen in drei verschiedenen Konzentrationen, z.B. mit anti-Human lgG-Fab-Fragment als Rezeptor- Einheit, das stets in den sekundären Immunkomplexen gebunden wird; Positiv- Bindungs-Kontrollen für die Überprüfung der Immobilisierung unterschiedlicher isotypischer Antikörper aus unterschiedlichen Organismen, wobei jeweils ein intakter Antikörper, dessen Spezifität ein Antigen ist, das nicht in der Untersuchungslösung vorkommt, verschiedener Isotypen oder Immunglobulin-Klassen aus verschiedenen Organismen wie z.B. IgGI , lgG2a, lgG2b, lgG3, lgG4 und IgM aus Maus, polyklonale Kaninchen-Antikörper verwendet wird; eine oder mehrere Negativ-Bindungs- Kontrollen zur Überprüfung der erfolgreichen Abtrennung der freien Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, wobei Antikörper gegen Proteine phylogenetisch nicht verwandter Organismen gewählt werden, die nicht in der Untersuchungslösung vorkommen, also z.B. ein anti-Taq-Fab-Fragment; eine Positiv/Negativ-Bindungs-Kontrolle mit einem der Antikörper, der für die Negativ- Kontrolle verwendet wurde und ein Tag trägt, das für die Immobilisierung verwendet wird wie z.B. ein mit Digoxigenin markiertes anti-Taq-Fab-Fragment).
Der Kit erlaubt es, die folgenden Komponenten in einem Ansatz zu analysieren: zur Bestimmung der Blut- und Gewebemerkmale werden Nukleinsäureoligomer-markierte Fab-Fragmente monoklonaler Antikörper gegen diese Gewebemarker, die an die Antigene spezifisch binden und Antikörper mit Spezifität gegen ein anderes Epitop dieser Targets eingesetzt. Zur Bestimmung der Antikörper werden Nukleinsäureoligomer-markierte Antigene der Krankheitserreger zum gleichen Ansatz zugegeben. Diese Antikörper werden durch Zugabe von anti-human IgG-, anti-human IgM-, anti-human IgA- und anti-human IgE-Antikörper als sekundäre Immunkomplexe gebunden, die wiederum über Protein G-Affinitätschromatographie immobilisiert werden können.

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit bestehend aus einem Nukleinsäureoligomer bekannter Sequenz und einer daran angebundenen
Rezeptor-Einheit, wobei die Rezeptor-Einheit eine chemische Substanz spezifisch binden kann und die Rezeptor-Einheit über eine durch Induktion spaltbare Gruppe an den Nukleinsäureoligomer-Bestandteil angebunden ist, nämlich über eine -CHOH-CHOH- Gruppe, eine -CO-0-CH2-CH2-0-CO- Gruppe, eine -S-S- Gruppe, eine -N=N- Gruppe oder über Psoralen.
2. Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit nach Anspruch 1 , wobei als Rezeptor- Einheit ein Antigen, ein Antikörper, ein gentechnisch hergestellter Antikörper, ein Fab-Fragment, insbesondere ein gentechnisch modifiziertes Fab-Fragment, ein Protein, insbesondere ein DNA- oder RNA-bindendes Protein, ein Peptid, ein Allergen, ein Enzym, ein Enzym-Antagonist, ein Hormon, ein Hormonrezeptor, ein Hapten, ein Oligoglycosid oder ein Lectin verwendet wird.
3. Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil ein Desoxyribonukleinsäureoligomer, ein Ribonukleinsäureoligomer, ein Peptidnukleinsäureoligomer oder ein Nukleinsäureoligomer mit strukturell analogem Rückgrat ist, wobei der
Nukleinsäureoligomer-Bestandteil ein anderes Nukleinsäureoligomer mit komplementärer Basensequenz sequenzspezifisch unter Ausbildung von Basenpaaren binden kann.
4. Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit nach Anspruch 3, wobei die Rezeptor- Einheit an eine der Phosphorsäure-Einheiten, an eine der Thiophosphat-
Einheiten, an eine der Phosphorsäureamid-Einheiten, an eine der Zucker- Einheiten, insbesondere an eine Zucker-Hydroxy-Gruppe, an eine Carbonyl-, Carboxyl-, Amid- oder Amin-Gruppe, oder an eine der Basen des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils angebunden ist, insbesondere an eine endständige 3'- oder δ'-Einheit. δ. Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Rezeptor-Einheit an einen verzweigten oder unverzweigten Molekülteil beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge angebunden ist und der verzweigte oder unverzweigte Molekülteil alternativ an eine der Phosphorsäure- Einheiten, an eine der Thiophosphat-Einheiten, an eine der Phosphorsäureamid-
Einheiten, an eine der Zucker-Einheiten, insbesondere an eine Zucker-Hydroxy- Gruppe, an eine Carbonyl-, Carboxyl-, Amid- oder Amin-Gruppe, oder an eine der Basen des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils gebunden ist, insbesondere an eine endständige 3'- oder δ'-Einheit und der verzweigte oder unverzweigte Molekülteil wenigstens eine durch Induktion spaltbare Gruppe enthält, nämlich wenigstens eine -CHOH-CHOH- Gruppe, eine -CO-0-CH2-CH2-0-CO- Gruppe, eine -S-S- Gruppe, eine -N=N- Gruppe oder Psoralen, wobei sich die durch Induktion spaltbare Gruppe in dem die Rezeptor-Einheit und den Nukleinsäureoligomer-Bestandteil verbindenden Molekülteil befindet.
6. Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der
Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit wenigstens eine beliebige Primer- Bindungsregion oder RNA-Polymerase-Bindungsregion umfasst.
7. Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit nach Anspruch 6, wobei der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit bis zu drei spezielle Regionen aufweist, wobei die bis zu drei Regionen beliebige Primer-Bindungsregionen, RNA-Polymerase-Bindungsregionen oder deren Kombinationen sind.
8. Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Primer-Bindungsregion das Kettenende des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit darstellt.
9. Verfahren zur Detektion von chemischen Substanzen umfassend die Schritte
a) eine oder mehrere chemische Substanzen werden bereitgestellt, b) eine oder mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 werden bereitgestellt,
c) die in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen werden mit den in Schritt b) bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus
Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt,
d) die in Schritt c) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz werden an ein geeignetes Chromatographiematerial gebunden, wodurch eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten erfolgt,
e) eine oder mehrere chemische Bindungen der an das Chromatographiematerial gebundenen Komplexe aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz werden so gespalten, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, von dem Chromatographiematerial getrennt wird,
f) die von dem Chromatographiematerial getrennten Nukleinsäureoligomer- Bestandteile werden ausgewaschen und durch ein geeignetes Verfahren detektiert.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei nach Schritt c) der Schritt
die in Schritt c) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz werden mit ein oder mehreren Arten von Antikörpern und mit anti-lg-Antikörpern in Kontakt gebracht, wodurch eine
Bildung sekundärer Immunkomplexe bestehend aus ein oder mehreren Antikörpern und ein oder mehreren Komplexen aus Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt, und als Schritt d) der Schritt
die sekundären Immunkomplexe werden an ein mit Protein A und/oder Protein G modifiziertes Chromatographiematerial gebunden, wodurch eine Trennung von den im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten erfolgt
durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei in Schritt
b) definierte Mengen ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 bereitgestellt werden,
und anstelle der Schritte e) und f) der Schritt
e0) die im Eluat verbleibenden Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten werden ausgewaschen und deren Nukleinsäureoligomer-Bestandteile werden nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des
Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren detektiert
durchgeführt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Bindung in Schritt d) über an das Chromatographiematerial gebundene, für die zu detektierende chemische Substanz spezifische Bindungspartner, insbesondere über an das
Chromatographiematerial gebundene, für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifische Antikörper, über an das Chromatographiematerial gebundene, für den Komplex aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz spezifische Bindungspartner, über an das Chromatographiematerial gebundene, für mehrere
Arten von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz spezifische Bindungspartner oder deren Mischungen erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei als für die zu detektierende eine oder mehreren chemischen Substanzen spezifischer Antikörper, anti-lgA-Antikörper, anti-lgG-Antikörper, anti-IgM-Antikörper, anti-lgE-Antikörper, anti-lgD-Antikörper und deren Mischungen verwendet werden.
14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei als für mehrere Arten von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz spezifische Bindungspartner Fc-γ-Rezeptoren, Kompliment-C1q und deren Mischungen verwendet werden.
1δ. Verfahren zur Detektion von in wässrigen Medien unlöslichen chemischen Substanzen umfassend die Schritte
a) eine oder mehrere Arten unlöslicher chemischer Substanzen werden bereitgestellt,
b) eine oder mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 werden bereitgestellt,
c) die in Schritt a) bereitgestellten unlöslichen chemischen Substanzen werden mit den in Schritt b) bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz erfolgt,
d) die in Schritt c) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit und unlöslicher chemischer Substanz werden abgetrennt,
e) eine oder mehrere chemische Bindungen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und unlöslicher chemischer Substanz werden so gespalten, dass der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit in Form eines Nukleinsäureoligomers oder in Form eines beliebig modifizierten Nukleinsäureoligomers von der unlöslichen chemischen Substanz getrennt wird,
f) die von der unlöslichen chemischen Substanz getrennten Nukleinsäureoligomer-Bestandteile werden abgetrennt und durch ein geeignetes Verfahren detektiert.
16. Verfahren zur Detektion chemischer Substanzen umfassend die Schritte
a) eine oder mehrere chemische Substanzen werden bereitgestellt,
b) ein Überschuss relativ zu den in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen von ein oder mehreren Arten von Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 werden bereitgestellt,
c) die in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen werden mit den in Schritt b) im Überschuss bereitgestellten Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheiten in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt,
d) die in Schritt a) bereitgestellten chemischen Substanzen werden in modifizierter Form bereitgestellt, wobei die Modifikation in der Anbindung der chemischen Substanzen an ein Chromatographiematerial besteht,
e) das in Schritt c) gebildete Gemisch aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und gebildeten Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz werden mit den in Schritt d) an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus überschüssigen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten und an das Chromatographiematerial gebundenen chemischen Substanzen erfolgt,
f) die im Eluat verbleibenden, in Schritt c) gebildeten Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz werden ausgewaschen und deren Nukleinsäureoligomer-Bestandteile werden nach Abspaltung des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit als Nukleinsäureoligomer oder modifiziertes Nukleinsäureoligomer, das die vollständige Sequenzinformation des Nukleinsäureoligomers umfasst, durch ein geeignetes Verfahren detektiert.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei die Spaltung der einen oder der mehreren chemischen Bindungen der Komplexe aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz und/oder die Abspaltung des Nukleinsäureoligome-Bestandteils von der Rezeptor-Einheit durch Zugabe eines Oxidationsmittels, durch Zugabe eines Reduktionsmittels, durch Zugabe einer zur Spaltung einer Amid-Bindung geeigneten Säure oder durch Einstrahlung von Licht erfolgt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Spaltung durch Zugabe eines zur Spaltung einer -S-S- Gruppe, zur Spaltung einer -CHOH-CHOH- Gruppe oder zur Spaltung einer -CO-0-CH2-CH2-0-CO- Gruppe geeigneten Reduktions- oder
Oxidationsmittels erfolgt, insbesondere durch Zugabe von Nal0 , durch Zugabe von H2N-OH, durch Zugabe von DTT oder durch Zugabe von ß- Mercaptoethanol.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, wobei die eine oder mehreren Arten von bereitgestellten Nukieinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch
Anbindung einer oder mehrerer gleicher oder unterschiedlicher funktioneller chemischer Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Farbstoff, insbesondere Fluoreszenzfarbstoff, redoxaktive Substanz, insbesondere Chinone und Übergangsmetallkomplexe, Biotin, Hapten, Antigen, Avidin und Streptavidin modifiziert ist und/oder zusätzlich durch ein Radiolabel, insbesondere durch 35P, 32S, 14C oder 3H modifiziert ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 19, wobei vor einem beliebigen der nach dem Schritt
ein oder mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten werden bereitgestellt durchgeführten Schritte der Schritt
modifizieren der einen oder mehreren Arten bereitgestellter Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten durch Anbindung einer oder mehrerer gleicher oder unterschiedlicher funktioneller chemischer Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Farbstoff, insbesondere Fluoreszenzfarbstoff, redoxaktive Substanz, insbesondere Chinone und Übergangsmetallkomplexe, Biotin, Hapten, Avidin und Streptavidin oder modifizieren der bereitgestellten Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheit durch Einführung eines Radiolabels, insbesondere durch Einführung von 35P, 32S, 14C oder 3H
durchgeführt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 20, wobei die Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile oder deren Amplifikate über die Hybridisierung an dazu komplementäre Nukleinsäureoligomere erfolgt.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , wobei die Detektion amperometrisch, cyclovoltametrisch, impedanzspektroskopisch, oder potentiometrisch erfolgt.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 22, wobei eine oder mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten gemäß den Ansprüchen 6 bis 8 bereitgestellt werden und vor der Detektion der Nukleinsäureoligomer- Bestandteile der Schritt
Amplifizierung der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile mit Hilfe von DNA- und/oder RNA-Polymerase
durchgeführt wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei vor dem Schritt
Amplifizierung der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile mit Hilfe von DNA- und/oder RNA-Polymerase der Schritt
Zugabe einer definierte Menge eines Nukleinsäureoligomers, wobei das zugegebene Nukleinsäureoligomer den selben oder die selben Primer- Abschnitte wie die Nukleinsäureoligomer-Bestandteile umfasst
durchgeführt wird.
2δ. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei mehrere Arten von Nukleinsäureoligomer-Bestandteilen gleichzeitig detektiert werden.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 2δ, wobei die verschiedenen Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten keine zu mehr als 7δ% zueinander komplementären Nukleinsäureoligomere aufweisen.
27. Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß den Ansprüchen 9 bis 26 umfassend eine effektive Menge ein oder mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 und 19.
28. Kit nach Anspruch 27, wobei der Kit zusätzlich Primer umfasst, insbesondere mit Rhodamin oder Fluorescein modifizierte Primer.
29. Kit nach Anspruch 27 oder 28, wobei der Kit zusätzlich die Nucleotid-Bausteine dCTP, dGTP, dATP und dTTP umfasst.
30. Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei der Kit zusätzlich wenigstens einen mit Rhodamin oder Fluorescin modifizierten Nucleotid-Baustein dCTP, dGTP, dATP oder dTTP umfasst.
31. Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei der Kit zusätzlich eine Gelfiltrationskartusche umfasst.
32. Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 31 , wobei der Kit zusätzlich eine Chromatographiesäule umfasst.
3. Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 32, wobei der Kit zusätzlich eine mit geeigneten Sondenoligonukleotid-Arten vorbelegte Dot-Plot-Membran zur Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Nukleinsäureoligomer- Rezeptor-Einheiten umfasst.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10156329A1 (de) * 2001-07-17 2003-02-06 Frieder Breitling Verfahren und Anordnung zum Anbringen von in Transportmittel immobilisierten Substanzen sowie Monomerpartikel
DE10200374A1 (de) * 2002-01-08 2003-07-24 Friz Biochem Gmbh Verfahren zur qualitativ und quantitativ vergleichenden Detektion chemischer Substanzen
US7341837B2 (en) * 2003-09-02 2008-03-11 Lawton Robert L Soluble analyte detection and amplification
WO2006002382A2 (en) * 2004-06-24 2006-01-05 The Scripps Research Institute Arrays with cleavable linkers
CZ2014527A3 (cs) * 2014-08-05 2016-02-17 Ústav Organické Chemie A Biochemie Akademie Věd Čr, V.V.I. Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů
CN115436622B (zh) * 2022-09-26 2024-03-08 重庆医科大学国际体外诊断研究院 一种单分子蛋白的检测方法及其试剂盒和应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4748111A (en) * 1984-03-12 1988-05-31 Molecular Diagnostics, Inc. Nucleic acid-protein conjugate used in immunoassay
DE3732145A1 (de) * 1987-09-24 1989-04-06 Merck Patent Gmbh Verfahren und reagenz zur durchfuehrung von hybridisierungsreaktionen
US6083689A (en) * 1990-10-16 2000-07-04 Bayer Corporation Sensitive immunoassays utilizing antibody conjugates with replicable DNA templates
US5665539A (en) * 1991-07-12 1997-09-09 The Regents Of The University Of California Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection
CA2075858C (en) * 1991-08-15 1998-05-19 Scott J. Eisenbeis Detection of complementary nucleotide sequences
US5985548A (en) * 1993-02-04 1999-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Amplification of assay reporters by nucleic acid replication
US5635602A (en) * 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
AT407160B (de) * 1998-06-04 2001-01-25 Immuno Ag Verfahren zur bestimmung von antigenen
AU779491B2 (en) * 1999-06-01 2005-01-27 Bristol-Myers Squibb Company Methods for producing 5'-nucleic acid-protein conjugates

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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