DE19808003A1

DE19808003A1 - Verfahren zur Beschleunigung der Dissoziation von Komplexen

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Publication number: DE19808003A1
Application number: DE1998108003
Authority: DE
Inventors: Weller; Winklmair; Schuetz; Niesner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-02-26
Filing date: 1998-02-26
Publication date: 1999-09-09
Anticipated expiration: 2018-02-27
Also published as: DE19808003C2

Description

1. Einleitung

Viele Verfahren zur Reinigung, Entfernung, Anreicherung, Trennung oder Analyse von Stoffen und Stoffgemischen verwenden als Prinzip die Verteilung eines Stoffes zwischen einer stationären und einer mobilen Phase. Oft werden in diesen Verfahren Stoffe aus einer mobilen Phase an einen Bindungspartner auf einer festen Phase gebunden. Je nach Zielsetzung kann es nötig sein, den gebundenen Stoff im Laufe des Verfahrens von der festen Phase zu entfernen, sei es, um den gebundenen Stoff zu isolieren, oder um die feste Phase wiederverwenden zu können. In diesen Fällen geschieht die Verankerung des zu bindenden Stoffes meist durch Komplexbildung mit einem Bindungspartner auf der festen Phase. Solche Komplexe sind meist leichter dissoziierbar als kovalente Bindungen. Sie sind daher besser geeignet, wenn die Aktivität der festen Phase bei der Dissoziation der gebundenen Stoffe nicht verloren gehen soll oder sehr empfindliche Stoffe durch die Bindung an die feste Phase isoliert werden sollen. Der Vorgang, eine feste Phase nach ihrem Einsatz möglichst ohne Aktivitätsverlust wieder ihren den Ausgangszustand zurückzuversetzen, wird als Regenerierung bezeichnet. Bei der Regenerierung einer festen Phase müssen während des Verfahrens gebundene Stoffe oder Stoffgemische dissoziiert werden, ohne daß dabei die für die Durchführung des Verfahrens benötigte Aktivität dieser festen Phase zerstört wird. Werden sehr labile, empfindliche Substanzen als Bausteine einer solchen festen Phase verwendet, kann deren Regenerierung unter Erhalt ihrer Aktivität sehr schwierig oder unmöglich sein.

Beispiele für Schwierigkeiten bei der Regenerierung fester Phasen finden sich in vielen Bereichen der Analytik oder Trenntechnik von Stoffen. Stellvertretend sei hier die Gruppe der heterogenen Biosensoren erwähnt: An diese Sensoren werden hinsichtlich Regenerierbarkeit hohe Ansprüche gestellt. Die schlechte Regenerierbarkeit vieler Biosensoren wirkt sich oftmals limitierend auf ihren Einsatzbereich und die Reproduzierbarkeit der gewonnenen Meßdaten aus. Durch drastische Reaktionsbedingungen bei der Regenerierung werden empfindliche Komponenten von Biosensoren, die auf der festen Phase immobilisiert sind, in ihren Eigenschaften verändert oder verlieren ihre Aktivität ganz.

Die Dissoziation von Komplexen, bei denen ein Bindungspartner auf einer festen Phase immobilisiert ist, ist ein komplizierter Vorgang. Je schneller diese Dissoziation abläuft, desto einfacher und leichter ist es, die Aktivität des immobilisierten Bindungspartners zu erhalten. Die Dissoziationsgeschwindigkeit des nicht permanent immobilisierten Stoffes hängt von mehreren Faktoren ab:

1. Affinität des Stoffes zu den Bindungspartnern, die auf der festen Phase immobilisiert sind.
2. Größe des Stoffes. In der Regel dissoziiert ein gebundener Stoff um so schneller, je kleiner er ist.
3. Möglichkeiten der unspezifischen Wechselwirkung des gebundenen Stoffes mit der festen Phase. Je stärker die unspezifischen Wechselwirkungen sind, die der gebundene Stoff mit der festen Phase ausbildet, desto langsamer dissoziiert er. In der Regel nehmen die unspezifischen Wechselwirkungen des gebundenen Stoffes mit seiner Größe zu.

Das in der Anmeldung vorgestellte Verfahren beschreibt eine neue, schonende Methode zur Dissoziation von Komplexen, bei denen ein Bindungspartner permanent auf einer festen Phase immobilisiert ist. Das Verfahren nützt dabei die Möglichkeit der gezielten Auswahl von Bedingungen, die diese Dissoziation beschleunigen und erleichtern können. Dadurch kann die Regenerierung der festen Phase vereinfacht werden und ihre Aktivität bleibt länger erhalten.

2. Stand der Technik

Viele Verfahren zur Reinigung, Entfernung, Anreicherung, Trennung oder Analyse von Stoffen und Stoffgemischen bedienen sich relativ labiler, auf einer festen Phase immobilisierter Stoffe (Rezeptoren), die während des Verfahrens nicht zerstört werden dürfen. So sind beispielsweise in vielen Biosensoren die bioorganischen Substanzen, die zur spezifischen Erkennung der Analyten oder zur Signalgenerierung eingesetzt werden, auf einer festen Phase immobilisiert. Um diese feste Phase wiederverwenden zu können, muß der Sensor nach jedem Meßzyklus regeneriert werden. Viele dieser bioorganischen Substanzen, wie etwa Antikörper oder Enzyme, sind unter den Bedingungen, die zur Regenerierung nötig sind, instabil und verlieren ihre Aktivität. Dieses Problem tritt besonders bei Immunsensoren auf, also bei Biosensoren, die zur spezifischen Erkennung der Analyten Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen benutzen. Diese Immunsensoren müssen oftmals zur Regenerierung mit Lösungen behandelt werden, die beim Antikörper Konformationsänderungen bewirken und damit die Dissoziation der Anti körper-Analyt- sowie Antikörper-Tracer-Komplexe beschleunigen sollen. Dazu werden stark proteindenaturierend wirkende Substanzen wie Harnstoff oder Natriumdodecylsulfat [T. A. Betts et al.], Lösungen mit niedrigen pH-Wert [M. A. González-Martinez et al.], auch in Verbindung mit anderen chaotropen Reagenzien [P. Oroszlan et al.], eingesetzt. Die Regenerierung unter drastischen Reaktionsbedingungen ist aber problematisch, da die im Antikörper induzierten Konformationsänderungen häufig nicht reversibel sind. Durch irreversible Denaturierung der Antikörper verliert der Immunsensor an Aktivität. Dieses Problem tritt bei allen Sensoren auf, die zur Regenerierung mit Lösungen behandelt werden müssen, die für die wiederverwendbaren Sensor-Komponenten schädlich sein können.

Ein anderes Gebiet, in dem empfindliche, labile feste Phasen eingesetzt werden, ist die Chromatographie. Bei chromatographischen Verfahren ist es wünschenswert, das oft sehr teure Säulenmaterial (die feste Phase), so oft wie möglich wiederverwenden zu können. In der Chromatographie binden die zu trennenden Stoffe mit unterschiedlicher Affinität an immobilisierte Bindungspartner. Speziell in der Affinitätschromatographie werden dabei Komplexe hoher Affinität zwischen den selektiven Bindungsreagenzien des Säulenmaterials und dem zu isolierenden Stoff gebildet. Oft können bei der Regenerierung der Säule diese Komplexe nur unter Bedingungen dissoziiert werden, die das Säulenmaterial rasch zerstören. In der präparativen Chromatographie müssen die Elutionsbedingungen überdies so gewählt werden, daß der zu isolierende Stoff selbst dabei nicht zerstört wird.

In allen Bereichen der Analytik, Separation und Reinigung von Stoffen finden sich Beispiele für Probleme bei der Dissoziation von Komplexen, bei denen ein Bindungspartner auf einer festen Phase immobilisiert ist. Durch das in der in der Anmeldung vorgestellte Prinzip lassen sich viele der auftretenden Probleme lösen.

3. Genaue Darstellung des Verfahrens

Das in dieser Anmeldung beschriebene Verfahren beschäftigt sich mit der Beschleunigung der Dissoziation von Komplexen, bei denen ein Bindungspartner ein natürliches oder synthetisches Rezeptormolekül ist. Bei einem solchen Rezeptormolekül handelt es sich um ein Bindungsmolekül, das zur spezifischen Komplexbildung mit einer anderen Substanz fähig ist [F. Scheller et al.]. Beispiele für solche Rezeptormoleküle sind Antikörper, Enzyme, Hormonrezeptoren, Nucleinsäuren oder andere Makromoleküle mit biologischer Aktivität.

Die meisten herkömmlichen Verfahren zur Dissoziation festphasengebundener Komplexe zielen darauf ab, durch bestimmte Bedingungen oder Reagenzien die Affinität der Bindungspartner zueinander zu senken, etwa durch Zugabe von Substanzen, die die Konformation des immobilisierten Rezeptormoleküls oder die des an ihn gebundenen Stoffes ändern. Die anderen Faktoren, die die Dissoziationsgeschwindigkeit beeinflussen, werden dabei jedoch nicht gezielt verändert. Das neue Verfahren beruht auf der Idee, die von den immobilisierten Rezeptormolekülen komplexierten Stoffe vor der Dissoziation zu verkleinern. Dadurch verringert sich deren Größe und ihre Möglichkeiten zur unspezifischen Wechselwirkung mit der festen Phase sowie Chelateffekte nehmen ab. Die Verkleinerung der komplexierten Stoffe trägt zur Beschleunigung der Dissoziation bei und ermöglicht es in vielen Fällen, auf denaturierende Substanzen bei der Regenerierung verzichten zu können. Die Verkleinerung der komplexierten Stoffe geschieht durch Spaltung unter speziellen Bedingungen, unter denen die Aktivität der auf der festen Phase immobilisierten Rezeptormoleküls weitgehend erhalten bleibt. Abb. 1 zeigt dieses Prinzip: Im Rahmen eines beliebigen Verfahrens zur Stofftrennung oder -analyse bindet ein Stoff (Komponente B) an ein immobilisiertes Rezeptormolekül (Komponente A). Komponente A, der auf der festen Phase immobilisierte Komplexbindungspartner, weist eine bestimmte Affinität zur Komponente B auf. Die Komponente B enthält 3 für das vorgestellte Prinzip wesentliche Bestandteile: Einem Anteil, der eine bestimmte Affinität zu Komponente A aufweist und mit dieser einen Komplex zu bilden vermag, einem weiteren Anteil, der unter speziellen, von der Art der Spaltstelle abhängenden Bedingungen spaltbar ist und einem dritten Anteil, der eine beliebige Funktion erfüllen kann, z. B. als Marker oder Bindungsreagens. Der spaltbare Anteil der Komponente B (z. B. ein Spacer) verbindet die beiden anderen Anteile miteinander. In Schritt 1 ist die Bindung der Komponente B über Komponente A an die feste Phase dargestellt. Zur Beschleunigung und Vereinfachung der Dissoziation wird zunächst diese Komponente B gespalten, so daß nur noch ein kleines Fragment dieses Bindungspartners von Komponente A komplexiert und somit gebunden bleibt. Schritt 2 zeigt schematisch diese Spaltung, und zwar an der definierten Spaltungsstelle. Wichtig ist, daß zu dieser Spaltung der Komponente B Bedingungen angewandt werden, die möglichst geringen Einfluß auf die Aktivität der Komponente A und der gesamten festen Phase haben. Durch Dissoziation des noch komplexierten Fragments der Komponente B wird die feste Phase in ihren Ausgangszustand zurückgeführt (Schritt 3). Die in Schritt 2 gezeigte Spaltung der Komponente B kann an einer bereits in Komponente B vorhandenen Spaltungsstelle vorgenommen werden, oder es kann, wenn die Anwendung es erlaubt, gezielt eine Spaltstelle in Komponente B eingeführt werden. Besonders vorteilhaft für das vorgestellte Konzept sind Spacer, die mehrere solcher Spaltungsstellen besitzen. Solche Spacer können nach der Spaltung noch weiter abgebaut werden. Abb. 2 zeigt mehrere Möglichkeiten solcher Spaltungen sowie des weiteren Abbaus.

Das neue Verfahren soll am Beispiel von Immunsensoren detaillierter erklärt werden. In Immunsensoren werden als Rezeptormoleküle Antikörper verwendet. Viele Inununsensoren verwenden das kompetitive Assayformat zur Quantifizierung eines Analyten. Beim kompetitiven Assayformat konkurrieren die Analytmoleküle mit einem Tracer um die zur Verfügung stehenden Antikörperbindungsstellen. Bei vielen Immunsensoren, die das kompetitive Assayformat anwenden, werden die Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert. Vor Beginn der Messung müssen freie Antikörperbindungsstellen verfügbar sein, durch die Regenerierung soll der Sensor in diesen Ausgangszustand rückgeführt werden. Zu diesem Zweck müssen die Komplexe zwischen Antikörper und Analyt bzw. Antikörper und Tracer dissoziiert werden. Im Sinne der Anmeldung entsprechen bei Immunsensoren also die Antikörper den permanent auf der festen Phase immobilisierten Komplexbindungspartnern, die Analyt- und Tracermoleküle den nicht permanent gebundenen. Die Dissoziationsgeschwindigkeit des Analyten hängt von mehreren Faktoren ab: Zum einen von der Affinität des Antikörpers zu diesem Analyt, zum anderen von dessen Größe. Auch die Möglichkeiten des Analyten zur unspezifischen Wechselwirkung mit den Antikörpern oder dem festen Trägermaterial des Sensors können die Dissoziationsgeschwindigkeit beeinflussen. Je höher die Affinität des Antikörpers zum Analyten, desto kleiner ist dessen Dissoziationsgeschwindigkeit. Je größer ein Analytmolekül ist und je stärker seine Wechselwirkungen, um so langsamer dissoziiert es.

Bei einem Tracer handelt es sich um ein Konjugat aus einer analytähnliche Substanz und einem detektierbaren Marker (Label). Bei solch einem Marker kann es sich beispielsweise um ein Enzym, ein Latex-Partikel oder ein Liposom handeln. Viele kompetitive Immunsensoren sind auf die Analytik von kleinen Substanzen mit geringem Molekulargewicht ausgelegt, also Substanzen, die selbst keine Immunantwort hervorrufen können (Haptene). Hapten und Marker können entweder direkt oder über einen geeigneten Spacer miteinander verbunden sein. Der Tracer wird durch die Konjugation des detektierbaren Markers größer als der Analyt und weist oftmals mehr Möglichkeiten zur unspezifischen Wechselwirkung auf. Daher ist die Dissoziation des Tracers fast immer langsamer als die des Analyten. Dies gilt jedoch nur bei vergleichbarer Affinität des Antikörpers zum Analyt als auch zum Hapten des Tracers.

Das vorgestellte Verfahren zur Regenerierung zielt darauf ab, nach der Detektion des Meßsignals den nun nicht mehr benötigten Tracer in einer Weise zu verändern, daß seine Dissoziation ähnlich schnell wie die der Analytmoleküle erfolgt.

Bezogen auf Abb. 1 entspricht beim kompetitiven Immunsensor der Tracer der Komponente B. Das Hapten stellt denjenigen Anteil der Komponente B dar, der mit Komponente A (hier der immobilisierte Antikörper) einen Komplex zu bilden vermag (B1), bei dem funktionellen Anteil der Komponente B handelt es sich um den Marker (B3). Die Wirkung des vorgestellten neuen Verfahrens besteht darin, den Tracer vor oder während der Regenerierung des Sensors zu spalten und damit zu verkleinern. Dabei wird der Marker abgespalten, so daß nur noch das Hapten oder ein kurzes Hapten-Spacerfragment von den immobilisierten Antikörpern komplexiert bleibt. Dies hat zwei Effekte: Zum einen kann der abgespaltene Marker einfach aus dem Sensor entfernt werden und verfälscht nachfolgende Messungen nicht, zum anderen ist die Dissoziationsgeschwindigkeit des noch gebundenen Hapten-Spacerfragments wesentlich höher als die des intakten Tracers. Die vollständige Regenerierung des Sensors, also die Dissoziation der Analyten sowie der noch gebundenen Haptene bzw. Hapten-Spacer-Fragmente, kann durch geeignete Waschlösungen, milde Reagenzien oder sonstige Bedingungen erreicht werden, die keine starke Aktivitätseinbuße der Antikörper zur Folge haben. Abb. 3 zeigt das Prinzip der Regenerierung eines kompetitiven Immunsensors. Zuerst wird die feste Phase eines heterogenen Immunsensors nach der Messung der Kompetition von Analyt und Tracer gezeigt. In dieser Situation befindet sich der Immunsensor vor Beginn des Regenerationsschrittes. Dann wird der Marker abgespalten und es resultiert der in der Mitte von Abb. 3 dargestellte Zustand der Sensoroberfläche. Hier sind Analyten und Hapten-Spacerfragmente noch teilweise gebunden, ihre Dissoziation beginnt jedoch bereits im Schritt der Spacerspaltung. Als letzter Schritt der Regenerierung kann die Dissoziation der Hapten-Spacer-Fragmente sowie der Analyten von den immobilisierten Antikörpern erfolgen, hervorgerufen durch milde Reagenzien und/oder Waschpuffer. Nach vollständiger Regenerierung wird der unten in Abb. 3 dargestellte Zustand erreicht, der Sensor steht für eine neue Messung zur Verfügung.

Welcher Gewinn durch diese Spaltung des Tracers vor der Regenerierung erreicht wird, ist für jeden Biosensor individuell verschieden. Es können jedoch folgende Anhaltspunkte gegeben werden:

1. Die Abspaltung des Markers beschleunigt die Dissoziation des noch gebundenen Fragments um so mehr, je größer der Marker ist und je mehr Möglichkeiten der unspezifischen Wechselwirkung er aufweist.
2. Je kleiner das nach der Abspaltung des Markers verbleibende Hapten-Spacer-Fragment ist, desto schneller dissoziiert es.
3. Je kleiner die Affinität des nach der Abspaltung des Markers noch gebundenen Haptens zum selektiven Bindungsreagens des Biosensors ist, desto schneller dissoziiert es.

Aus diesen Regeln ist ersichtlich, daß das vorgestellte Prinzip bei einer Vielzahl von Biosensoren wirkungsvoll zur Verbesserung der Regenerierung angewandt werden kann. Besonders hervorzuheben sind jedoch Biosensoren, die auf kleine Analyten gerichtet sind, denn hier ist die Beschleunigung der Regenerierung durch eine Abspaltung des detektierbaren Markers am größten. Genannt seien umweltrelevante Schadstoffe wie Pestizide, Nitroaromaten wie Trinitrotoluol (TNT), polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAKs), polychlorierte Biphenyle (PCBs), Phenole, daneben aber auch biologisch wirksame Substanzen wie Steroide, andere Hormone, Zucker, oder Lebensmittelzusatzstoffe, Konservierungsmittel, pharmazeutische Stoffe und andere. Ein besonders guter Effekt wird erzielt, wenn als Marker Enzyme, wie etwa der in der Biosensorik sehr weit verbreitete Marker Peroxidase, zum Einsatz kommen. Solche Konjugate aus einem Enzym und einem kleinen Hapten weisen oft eine um mehrere Größenordnungen langsamere Dissoziationsgeschwindigkeit als die Analyten auf.

Dieses neuartige Regenerationsprinzip für Biosensoren verlangt, daß die Spaltungsbedingungen die Aktivität der verwendeten Antikörper oder anderer permanent auf der festen Phase immobilisierter Rezeptormoleküle möglichst nicht negativ beeinflussen. Dazu bietet sich eine Konjugation des Markers via spaltbarem Spacer an. Dabei kann prinzipiell jeder Spacer verwendet werden, der durch eine chemische Reaktion oder durch definierte Reaktionsbedingungen selektiv gespalten werden kann. Besonders geeignet hierfür sind enzymatische Reaktionen, wenn der Spacer ein Substrat des verwendeten Enzyms darstellt. Enzymatische Reaktionen haben den Vorteil hoher Substratspezifität. Das bedeutet, daß durch die Verwendung eines Enzyms, das keinerlei Aktivität gegenüber den verwendeten immobilisierten Bindungsreagenzien oder anderen Bestanteilen der festen Phase zeigt, eine Spacerspaltung des Tracers möglich ist, die die Aktivität des Biosensors in keiner Weise negativ berührt. Aber auch nicht-enzymatische Systeme können verwendet werden.

Einige Beispiele für solche Systeme zeigt die folgende Tabelle:

Spaltbare Gruppe des Spacers
Spaltungsreagens
1. Enzymatische Systeme@	Oligo- oder Polypeptid	geeignete Protease
Oligo- oder Polysaccharid	geeignete Hydrolase
Oligonucleotid oder Nucleinsäure	geeignete Nuclease
2. Nicht-enzymatische Systeme@	Disulfid	2-Mercaptoethanol
Dithioerythrit@	Diol	Perjodat
Ester	Säuren oder Basen

Die Vorgehensweise zur Auffindung geeigneter Systeme ist vergleichbar mit der Anwendung der Schutzgruppentechnik in synthetischen Chemie: Dort wird versucht, eine Schutzgruppe zu finden, die sich durch Reaktionsbedingungen abspalten läßt, die das Produkt der Synthese bzw. andere Schutzgruppen in intaktem Zustand beläßt. Viele Methoden der Schutzgruppentechnik sollten daher auf das vorgestellte Prinzip übertragbar sein.

Das Prinzip der Erfindung ist auch für Analyten anwendbar, die nach der Messung sehr langsam dissoziieren. Wenn man Bedingungen findet, unter denen diese Analyten ohne Zerstörung der Sensoraktivität noch in gebundenem Zustand gespalten oder verkleinert werden können, so wirkt sich dies ebenfalls beschleunigend und vereinfachend auf die Regenerierung des Biosensors aus.

Wenn es zur Regenerierung des Biosensors genügt, den gebundenen Marker zu entfernen, kann auf eine vollständige Dissoziation der noch gebundenen Analyten sowie Haptene oder Hapten-Spacer-Fragmente verzichtet werden, z. B. wenn die immobilisierten selektiven Bindungsreagenzien des Sensors in großem Überschuß vorliegen. Es genügt dann, den Marker abzuspalten, zu zerstören oder zu inaktivieren, um den Sensor für eine neue Bestimmung bereit zu machen. Bei vielen herkömmlichen Techniken, bei denen auch bei der Regenerierung der Marker am Tracer verbleibt, können schon kleine Spuren von nicht regeneriertem Tracer bei nachfolgenden Messungen zu falschen Resultaten führen. Dies sei kurz am Beispiel eines kompetitiven Immunsensors erläutert: Wenn zur Kalibration ein Nullwert (die Matrix ohne Analyt) bestimmt wird, so erhält man das größtmögliche Meßsignal, da ja alle Antikörperbindungsstellen für den Tracer frei zugänglich sind. Wird der Sensor regeneriert und nachfolgend eine Probe gemessen, so können kleinste Mengen des Tracers, die nach der Regenerierung noch gebunden sind, das Meßergebnis verfälschen, sofern der Marker nach der Regenerierung noch aktiv ist. Bei dem in der Anmeldung vorgestellten Regenerationsverfahren wird aber zunächst der Marker vollständig abgespalten. Das bedeutet, daß selbst bei eventuell unvollständiger Dissoziation der noch gebundenen Haptene oder, gegebenenfalls, Hapten-Spacer-Fragmente kein Restsignal der vorhergehenden Messung oder Nullwert-Bestimmung detektiert wird.

Ein modifiziertes System für einen Tracer mit selektiv spaltbarem Spacer zeigt Abb. 4. Dieser Tracer besteht aus einem Hapten-Oligonucleotid-Konjugat und einem Marker-Oligonucleo tid-Konjugat. Wenn die beiden Oligonucleotide komplementäre Basensequenzen aufweisen, besteht die Möglichkeit, die beiden Stränge zu hybridisieren. Der Unterschied zu allen vorher genannten Tracertypen besteht darin, daß der Spacer die beiden funktionellen Bestandteile eines Tracers, Hapten und detektierbaren Marker, nur durch die Wasserstoffbrückenbindungen der beiden komplementären Oligonucleotide verbindet. Dabei können sich die Längen der Komplementärstränge durchaus voneinander unterscheiden, es muß nur sichergestellt werden, daß die Wasserstoffbrückenbindungen der Komplementärstränge unter den Meßbedingungen des Biosensors die beiden Stränge zusammenhalten.

Ein Tracer mit nicht-kovalentem Spacer weist für die Regenerierung ideale Voraussetzungen auf: Durch die Wahl der Länge der Komplementärstränge oder durch den Einbau gezielter Basenfehlpaarungen läßt sich die Stärke der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden Strängen einfach einstellen. Somit besitzt man durch die Auswahl der verwendeten Oligonucleotide sowie deren Länge die Möglichkeit, einen für jeden Sensortyp ideal geeigneten Tracer maßzuschneidern. Zur Regenerierung eines Biosensors, der einen solchen Tracer verwendet, können alle bekannten Techniken verwendet werden, mit denen Doppelstränge von Oligonucleotiden gespalten werden können. Unter vielen Möglichkeiten seien genannt: Temperaturerhöhung, Erhöhung der Salzkonzentration, spezielle chaotrope Substanzen, Zugabe organischer Solventien, Änderung des pH-Wertes.

Werden die doppelsträngigen Oligonucleotide eines solchen Tracers nach der Detektion des Meßsignals mit einer dieser Methoden gespalten, so bleibt nur das Hapten mit dem daran gekoppelten Oligonucleotid an das Rezeptormolekül gebunden, das Marker-Oligonucleo tid-Konjugat dagegen wird abgespalten. Dieser Vorgang stellt die Umkehrung der Hybridisierung der Einzelstränge dar. Bei der Regenerierung muß dann nur noch das Hapten-Oligonucleo tid-Konjugat dissoziiert werden, was wesentlich einfacher ist, als den gesamten Tracer zu dissoziieren.

Eine andere Möglichkeit, den detektierbaren Marker eines Tracers nach Abb. 4 abzuspalten, besteht in der Verwendung von geeigneten Nucleasen. Die enzymatische Spaltung des Tracers besitzt den Vorteil, daß sie noch schonender für den zu regenerierenden Sensor sind als z. B. pH-Wert-Änderungen oder Temperaturerhöhungen. Außerdem kann durch Verwendung von geeigneten Nucleasen das verbleibende, ans Hapten gekoppelte, Oligonucleotid sogar noch weiter abgebaut werden, so daß sich, wie in Abb. 2 schematisch dargestellt, die Länge des ans Hapten gekoppelten Basenstranges noch verkürzt. Dies bedeutet einen weiteren Gewinn an Dissoziationsgeschwindigkeit für die Regenerierung.

Bestimmte neuere Biosensoren zielen darauf ab, anstelle einer Einzelstoffbestimmung mehrere Analyten parallel im selben Kompartiment des Sensors zu detektieren. Durch diese Parallelisierung können aber Probleme entstehen, die bei Einzelstoff-Sensoren nicht auftreten. Beispielsweise muß für jede einzelne Substanzklasse, auf die der Sensor gerichtet ist, ein eigener Tracer zur Verfügung stehen. Daher muß anstelle eines einzigen Tracers ein Gemisch aller benötigten Tracer eingesetzt werden. Dabei summieren sich die einzelnen Tracerkonzentrationen zur Gesamt-Tracerkonzentration. Das bedeutet aber, daß auch die Gesamtmenge an Marker sich aufsummiert. Bei Markern mit Tendenz zu nicht ganz vermeidbarer unspezifischer Adsorption verschlechtert sich die Nachweisgrenze des Verfahrens, außerdem resultieren Messungen mit geringem dynamischen Bereich sowie mangelnder Reproduzierbarkeit.

Der oben beschriebene Tracer (Seite 9 und Abb. 4) mit einem doppelsträngigen Oligonucleotid als Spacer kann eine deutliche Verbesserung bringen. Anstelle eines Gemisches aus vollständigen Tracern werden hier nur die entsprechenden Hapten-Oligonucleotid-Konjugate im Gemisch eingesetzt. Dazu bedarf es lediglich einer kleinen Änderung in der Durchführung der Messung: In dem Schritt, in dem bei der Messung der Tracer zugegeben wird, werden nun die als Tracer zu verwendenden Hapten-Oligonucleotid-Konjugate anstelle des gesamten Tracers inklusive detektierbarem Marker zugegeben. Diese Hapten-Oligonucleotid-Konjugate konkurrieren mit den Analyten um freie Bindungsstellen der immobilisierten Rezeptormoleküle. In einem nachfolgenden Schritt wird nun das komplementäre Marker-Oligonucleotid-Konjugat zugegeben. Die komplementären Oligonucleotide können dann zum selektiv gebundenen Tracer hybridisieren. Zum Sichtbarmachen der Kompetition ist, unabhängig von der Anzahl der zu detektierenden Komponenten, dieselbe Konzentration an Marker-Oligonucleotid-Konjugat nötig. Daher kann mit diesem Verfahren das Problem der Vervielfachung der unspezifischen Adsorption des Markers bei Parallelisierung eines Sensors vermieden werden. Abb. 5 zeigt den Ablauf einer parallelen Bestimmung von zwei Komponenten mit diesem Verfahren. Im Regenerierungsschritt können alle Marker unter einheitlichen Reaktionsbedingungen abgespalten werden.

4. Abgrenzung zu bestehenden Techniken

Sclavo Inc. hat 1988 ein Patent angemeldet, das den Nutzen von abspaltbaren Markern für Immunoassays beschreibt (US 4 780 421). Es wird ein neuer Immunoassay-Typ vorgestellt, bei dem der Marker vor der Detektion des Meßsignals abgespalten werden soll. In diesem Verfahren dient die Abspaltung des Markers zur Verbesserung der Detektion. Bei dem in der vorliegenden Anmeldung dargestellten Verfahren hingegen dient die Abspaltung des nicht notwendigerweise aktiven Markers zur Verbesserung der Regenerierbarkeit, z. B. eines Biosensors.

In US 4 921 788 wird eine Methode zur Durchführung eines kompetitiven Immunoassays beschrieben, bei der der Tracer aus einem Hapten-Oligonucleotid-Konjugat besteht, das dann zur Signaldetektion mit einem Komplementärstrang hybridisiert wird und die entstehenden Doppelstränge mit Fluoreszenzmarkern sichtbar gemacht werden. Auch in diesem Patent dient die Hybridisierung von komplementären Nucleinsäuresträngen zur Signalgenerierung und betrifft nicht die Regenerierung einer auf der festen Phase immobilisierten Komponente des Sensors.

Zwei ähnliche Patente beschäftigen sich mit der Freisetzung festphasengebundener Substanzen. In US 5 141 648 werden spaltbare Konjugate beschrieben, deren Linker eine labile Bindung enthalten, die unter einer Reihe von Bedingungen spaltbar ist. Die Spaltung dieses Linkers kann zur Freisetzung von Verbindungen führen, die mit diesem Linker an eine feste Phase gebunden sind. Dieses Verfahren beinhaltet zwar die Spaltung von Linkern zum Zweck der Freisetzung verschiedener Verbindungen, jedoch spielt die Regenerierung der festen Phase dabei keine Rolle. Das Interesse der Erfindung dient ausschließlich der Freisetzung der gebundenen Substanz, nicht jedoch dem Erhalt der festen Phase und ist daher von der vorliegenden Anmeldung eindeutig abgrenzbar. Ähnliche Zielsetzungen bestehen auch in US 5 665 582, worin eine Methode zur reversiblen Verankerung von biologischem Material auf einer festen Phase beschrieben wird. Das Interesse gilt auch in dieser Erfindung nur dem gebundenen biologischen Material, eine Vereinfachung der Dissoziation dieses gebundenen biologischen Materials durch Spaltung eines Bindungspartners oder des Linkers ist in diesem Patent nicht vorgesehen.

Beckman Instruments Inc. hält ein Patent, das die Anwendung von spaltbaren Nuclein säure-Doppelsträngen zur Immobilisierung von Immunoassay-Komponenten beschreibt (US 5 648 213). Dabei ist ein Oligonucleotid an eine feste Phase gebunden, ein zu diesem immobilisierten Oligonucleotid komplementäres Oligonucleotid enthält eine spezifische Komponente des Assay-Systems. Die Hybridisierung der komplementären Nucleinsäurestränge dient dazu, die spezifische Komponente aus einer flüssigen Phase zu entfernen und an eine feste Phase zu binden. Die Möglichkeit der Regenerierung solcher Systeme ist nur angedeutet und beschränkt sich darauf das festphasengebundene Oligonucleotid mit üblichen Methoden zu regenerieren. Das in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Verfahren ist nicht betroffen, da diese Regenerierung, sofern überhaupt vorgesehen, nicht durch eine vorhergehende Spaltung eines der beteiligten Bindungspartners vereinfacht werden soll.

Die reversible Immobilisierung von Proteinen wird in einem Verfahren (US 4 284 553) beschrieben, bei dem Proteinlösungen zunächst kovalent auf einer aktivierten Oberfläche gebunden werden und dann durch Spaltung der Ankergruppe auf der Oberfläche entfernt werden können. Die Regenerierung der Oberfläche wird nicht erwähnt und ist auch nicht Ziel des Verfahrens. Außerdem handelt es sich durchwegs um kovalente Bindungen, die Dissoziation eines Komplexes wird nicht erwähnt, daher betrifft diese Patentschrift die vorliegende Anmeldung nicht.

5. Ausführungsbeispiele 5.1 Ausführungsbeispiel 1

Dieses Ausführungsbeispiel zeigt am Beispiel eines kompetitiven Immunoassays die Möglichkeit, einen Tracer mit doppelsträngigem Oligonucleotid-Spacer nicht vor der Durchführung des Assays zu hybridisieren, sondern die beiden Einzelkomponenten (Abb. 6.1, Komponenten 1a und 1b) nacheinander zuzugeben. Dabei wird nur das Hapten-Oligonucleo tid-Konjugat (Abb. 6.1, Komponente 1a) als eigentlicher kompetitiver Tracer eingesetzt. Das Marker-Oligonucleotid-Konjugat (Abb. 6.1, Komponente 1b) dient nur zum Sichtbarmachen der Kompetition. Dieses Beispiel soll die Durchführbarkeit des auf Seite 9 (Zeile 37) bis Seite 10 (Zeile 17) beschriebenen Verfahrens illustrieren.

5.1.1. Darstellung der Tracer

An ein 14 Basen langes, 5'-aminomodifiziertes Oligonucleotid (CyberSyn, Inc., PA, USA) wurde an das aminomodifizierte 5'-Ende ein Triazin-Hapten gekoppelt (Abb. 6.1, Komponente 1a). Dazu wurde das Hapten nach Standardmethoden in einen reaktiven N-Hydroxy-succini mid-Ester (NHS-Ester) übergeführt und in 25-fachem molarem Überschuß unter Rühren bei Raumtemperatur mit dem Oligonucleotid (100 nmol in 200 µL 0,1 M Boraxpuffer, pH 8,5) umgesetzt. Nach 8 Stunden Reaktionsdauer wurde die Reaktionslösung 10 min bei 17000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurde das derivatisierte Oligonucleotid mit einer Gelchromatographie-Säule (Sephadex G-25M NAP 5; Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg) gereinigt. Ein Oligonucleotid mit 29 Basen Länge, wobei die ersten 14 dieser 29 Basen vom 3'-Ende zum 5'-Ende hin komplementär zu den 14 Basen des Oligonucleotides der Komponente Ia sind, wurde an seinem 5'-Ende mit dem Marker Meerrettich-Peroxidase gekoppelt (CyberSyn, Inc., PA, USA; Abb. 6.1, Komponente 1b).

Ein herkömmlicher Tracer wurde dargestellt, indem dasselbe Triazin-Hapten direkt an den Peroxidasemarker gekoppelt wurde (Abb. 6.2 Komponente b; Meerrettich-Peroxidase (E.C. 1.11.1.7) von Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim). Dazu wurde das Hapten nach Standardmethoden in einen reaktiven NHS-Ester übergeführt und in 50-fachem molarem Überschuß unter Rühren bei Raumtemperatur mit der Peroxidase (2 mg in 300 µl 50 mM Boraxpuffer, pH 8,5) umgesetzt. Nach zwei Stunden Reaktionsdauer wurde die Reaktionslösung 10 min bei 17000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurde der Tracer mit einer Gelchromatographie-Säule (Sephadex G25-M PD-10; Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg) gereinigt.

Die beiden beschriebenen Tracer unterscheiden sich also lediglich im partiell doppelsträngigen Oligonucleotid-Spacer. Die Sequenzen und Längen der Oligonucleotide sind in sehr weitem Bereich frei wählbar, solange ausreichende Komplementarität gewährleistet ist. Die gewählte Orientierung der Oligonucleotide ist zwar zweckmäßig, aber nicht zwingend.

5.1.2. Versuchsdurchführung

Ein monoklonaler Antikörper (4A54, Connex GmbH, Martinsried; Konzentration an IgG: 1 mg/mL) gegen das Pestizid Terbuthylazin wird in basischem Carbonatpuffer (Natriumcarbonat 15 mM, Natriumhydrogencarbonat 25 mM; pH 9,6) im Volumenverhältnis 1 : 10000 gelöst. Dann wird eine Mikrotiterplatte mit je 100 µL pro Kavität über Nacht bei 4°C mit dieser Antikörperlösung gecoatet. Am nächsten Tag wird die Mikrotiterplatte gewaschen und es werden je 100 µl verschieden konzentrierter Kalibrationslösungen von Terbuthylazin (Konzentrationsbereich: 1000 µg/L bis 0.001 µg/L, Verdünnungsfaktor der einzelnen Lösungen jeweils 10) in destilliertem Wasser in die einzelnen Kavitäten pipettiert. Jeder gewonnene Kalibrationspunkt stellt den Median aus drei Replikaten dar. Die in Abb. 7 angegebenen Fehlerbalken geben die Spannweite dieser drei Replikate wieder. Das Hapten-Oligonucleotid (Abb. 6.1, Komponente 1a; Konzentration 50 nmol/mL) wird im Volumenverhältnis 1 : 300000 in 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5, 50 mM NaCl, 3 mM EDTA) gelöst. Nach einer Inkubationsdauer der Kalibrationslösungen von 25 min werden in jeweils drei Kavitäten einer Kalibrationslösung je 50 µL des verdünnten Hapten-Oligonucleotids pipettiert. Das Marker-Oligonucleotid (Abb. 6.1, Komponente 1b; Konzentration an Peroxidase 10 nmol/ml) wird im Volumenverhältnis 1 : 2000 in 10 mM Tris-Puffer (pH 8,0, 50 mM NaCl, 3 mM EDTA) gelöst. Nach 10 min Inkubationsdauer des Hapten-Oligonucleotids werden diese Kavitäten gewaschen, nicht jedoch die als Referenz mit dem herkömmlichen Tracer zu verwendenden Kavitäten. Nach dem Waschschritt werden diejenigen Kavitäten, die mit Hapten-Oligonucleotid inkubiert wurden, mit 100 µL des verdünnten Marker-Oligonucleotids gefüllt. Durch die Hybridisierung der beiden Oligonucleotid-Stränge wird der Marker (Peroxidase) selektiv gebunden und somit kann, wie auch bei herkömmlichen Tracern, die Kompetition quantifiziert werden. Als Referenz wird ein herkömmlicher Tracer (Abb. 6.2, Komponente b; Konzentration an Peroxidase ca. 6 nmol/mL; im Volumenverhältnis 1 : 25000 verdünnt in Phosphat-Puffer (Natriumdihydrogenphosphat 10 mM, Di-Natriumhydrogenphosphat 70 mM), pH 7,5) verwendet. Dieser Tracer wird in diejenigen Kavitäten gefüllt, die im vorherigen Waschschritt nicht mitgewaschen wurden und als Referenz dienen. In diesen Kavitäten beträgt die Inkubationsdauer der Kalibrationslösungen 40 min. Nach 10 min Inkubationsdauer des herkömmlichen Tracers sowie des Peroxidase-Oli gonucleotids wird die gesamte Mikrotiterplatte gewaschen. Anschließend werden die Kavitäten der Mikrotiterplatte mit jeweils 200 µL Substratlösung gefüllt. Die Substratlösung besteht aus einer Lösung von 300 µL 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-Stammlösung (0,375 g 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin in 5 mL Dimethylsulfoxid (vorgelöst, auf 25 mL mit Methanol aufgefüllt) und 100 µL Wasserstoffperoxid Stammlösung (1 Volumenprozent Wasserstoff peroxid in destilliertem Wasser) in 25 mL Citratpuffer (200 mM Kaliumdihydrogencitrat; pH 3,7). Nach etwa 15 min wird die Entwicklung des Substrats mit 100 µL pro Kavität an verdünnter Schwefelsäure (5 Volumenprozent konzentrierte Schwefelsäure (95%) in destilliertem Wasser) gestoppt. Dann wird die Mikrotiterplatte in einem Photometer bei 450 nm vermessen.

Abb. 7 zeigt die Kalibrationskurven für Terbuthylazin, die mit der sequentiellen Zugabe der beiden Tracerkomponenten (Abb. 6.1, Komponenten 1a und 1b) sowie mit dem Referenztracer (Abb. 6.1, Komponente b) ermittelt wurden. Man sieht, daß mit beiden Verfahren gut auswertbare Kalibrationskurven erhalten werden. Bei Parallelbestimmung von Analyten mehrerer Substanzklassen, die unterschiedliche Tracer in ein und demselben Kompartiment erfordern, kann dieses Verfahren mit besonderem Vorteil angewandt werden (siehe Seite 9, Zeile 37 bis Seite 10 Zeile 17).

5.2 Ausführungsbeispiel 2

Dieses Ausführungsbeispiel zeigt die Möglichkeit der schonenden Regenerierung von Biosensoren durch Spaltung des Tracers am Beispiel eines Immunoassays.

5.2.1. Darstellung der Tracer

Als Tracerkomponenten werden die beiden unter Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Verbindungen (5.1.1. Darstellung der Tracer; Abb. 6.1, Komponenten 1a und 1b) eingesetzt. Äquimolare Mengen (10 nmol/mL) beider Komponenten 1a und 1b wurden in 10 mM Tris-Puffer (pH 8,0; 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) gelöst und vereinigt. Dabei hybridisieren die beiden komplementären Stränge und es entsteht der in Abb. 6.1 dargestellte Tracer (Komponente a).

5.2.2. Versuchsdurchführung

Ein monoklonaler Antikörper (4A54, Connex GmbH, Martinsried; Konzentration an IgG: 1 mg/mL) gegen das Pestizid Terbuthylazin wird in basischem Carbonatpuffer (Natriumcarbonat 15 mM, Natriumhydrogencarbonat 25 mM; pH 9.6) in einer Volumenverdünnung von 1 : 10000 gelöst. Dann wird eine Mikrotiterplatte mit je 100 µl pro Kavität über Nacht bei 4°C mit dieser Antikörperlösung gecoatet. Wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, kann mit einer solchen antikörpergecoateten Mikrotiterplatte ein kompetitiver Immunoassay durchgeführt werden. Wenn es danach gelingt, Tracer und Analyt zu entfernen und dabei die Aktivität der Antikörper zu erhalten, so kann auf derselben Mikrotiterplatte ein neuer Assay durchgeführt werden. Dies kann als Beispiel für einen einfachen Immunsensor für Terbuthylazin betrachtet werden. Dabei muß nur beachtet werden, daß die Zugabe von Stopplösung (5 Volumenprozent konzentrierte Schwefelsäure (95%) in destilliertem Wasser) die immobilisierten Antikörper denaturiert, daher muß die Mikrotiterplatte ohne Abstoppen vermessen werden. Aus Vorversuchen ist bekannt, daß die Dissoziation eines herkömmlichen Enzymtracers (Abb. 6.2, Komponente b) durch Waschen mit Waschpuffer auch nach mehreren Stunden nicht vollständig ist. Das bedeutet, daß mit diesem Tracer kein regenerierbarer Immunsensor realisiert werden kann. Die Mikrotiterplatte wird zur Entfernung der Coatinglösung gewaschen und jede Kavität mit 100 µL des Tracers (Volumenverdünnung 1 : 50000 in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,5, NaCl 50 mM, 3 mM EDTA) gefüllt. Nach 10 min Inkubationsdauer wird die Mikrotiterplatte zur Entfernung des nicht gebundenen Tracers gewaschen. Dann wird eine Hälfte der Mikrotiterplatte mit je 200 µL Citratpuffer (200 mM Kaliumdihydrogencitrat; pH 3,7) pro Kavität gefüllt. Bei diesem pH-Wert werden die hybridisierten Oligonucleotidstränge des Tracers voneinander gespalten. Die andere Hälfte der Mikrotiterplatte wird als Referenz verwendet und nur mit je 200 µL Tris-Puffer (10 mM, pH 8,0, 50 mM NaCl, 3 mM EDTA) pro Kavität gefüllt. Nach 15 min wird die Mikrotiterplatte gewaschen. Anschließend werden alle Kavitäten der Mikrotiterplatte mit jeweils 200 µL Substratlösung (genaue Angaben siehe Ausführungsbeispiel 1; 5.1.2. Versuchsdurchführung) gefüllt. Nach 15 min wird die Mikrotiterplatte ohne Abstoppen im Photometer bei 620 nm vermessen. Dann wird die Substratlösung durch Waschen entfernt und erneut die ganze Mikrotiterplatte mit dem Tracer (Abb. 6.1, Komponente a, Volumenverdünnung 1 : 50000 in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,5, NaCl 50 mM, 3 mM EDTA) inkubiert. Nach 10 min Inkubationsdauer wird die Mikrotiterplatte erneut gewaschen, noch einmal entwickelt und im Reader bei 450 nm vermessen.

Abb. 8 zeigt das Ergebnis des Experiments: Man sieht, daß die mit Citratpuffer behandelten Kavitäten fast kein Signal aufweisen. Das Signal dieser Kavitäten wurde dabei auf die als Referenz benutzten Kavitäten (nur mit Tris-Puffer gefüllt) normiert. Der Oligonucleotid-Spacer des Tracers wurde durch den niedrigen pH des Citratpuffers gespalten und das freie Peroxidase-Oli gonucleotid-Konjugat beim nachfolgenden Waschen entfernt. Das zeigt, daß das Konzept des spaltbaren Spacers erfolgreich angewandt werden kann.

Das zweite Experiment diente zur Feststellung, ob nach der Regenerierung der Antikörper die Antikörperbindungsstellen wieder frei zugänglich sind und noch genügend Bindungsaktivität aufweisen. Auch hier wurde der nicht regenerierte Teil der Kavitäten als Referenz benutzt und das Signal der regenerierten Kavitäten darauf normiert. Das Ergebnis ist ebenfalls in Abb. 8 dargestellt. Man sieht, daß für die regenerierten wie auch die unregenerierten Kavitäten nahezu gleiche Signale erhalten werden. Das bedeutet, daß die Regenerierung tatsächlich dazu führt, daß die Antikörper zu einer weiteren Messung zur Verfügung stehen. Aus dem Versuchsergebnis ist ersichtlich, daß durch das in dieser Anwendung beschriebene Konzept eines abspaltbaren Markers der beschriebene Immunoassay regenerierbar wird.

5.3 Ausführungsbeispiel 3

Dieses Ausführungsbeispiel zeigt die Möglichkeit der schonenden Regenerierung von Biosensoren durch enzymatische Spaltung des Tracers am Beispiel eines Immunoassays.

5.3.1. Darstellung des Tracers

Als Tracerkomponenten wurden die unter Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Verbindungen (Abb. 6.1 Komponenten 1a und 1b) eingesetzt. Äquimolare Mengen (10 nmol/mL) beider Komponenten 1a und 1b wurden in 10 mM Tris-Puffer (pH 8,0; 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) gelöst und vereinigt. Dabei hybridisieren die beiden komplementären Stränge und es entsteht der in Abb. 6.1 dargestellte Tracer (Komponente b).

5.3.2. Darstellung der Enzymlösung

Es wurden verschieden konzentrierte Lösungen von Desoxyribonuclease I (E.C 3.1.21.1; Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg) in Tris-Puffer (50 mM; pH 8,0; 10 mM MgCl₂; 10 mM CaCl₂) hergestellt. Die Enzymaktivitäten in den einzelnen Lösungen betrugen 1000, 100, 10, 1 und 0,1 Units/mL. Als Referenz wurde die reine Pufferlösung ohne Enzymzusatz verwendet. Die Definition der verwendeten Einheiten des Enzyms lautet: Eine Einheit (Unit) des Enzyms baut 1 µg pBR322 DNS in 10 Minuten bei 37°C in 20 µL Assay Puffer (40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl₂, 10 mM MgCl₂) ab (Angabe des Herstellers).

4.3.3. Versuchsdurchführung

Die Versuchsdurchführung entspricht bis zum Regenerationsschritt genau der in Anwendungsbeispiel 3 ausgeführten (siehe 5.3.2 Versuchsdurchführung). Allerdings wurde auf eine Vergleichsmessung mit einem herkömmlichen Tracer verzichtet.

In diesem Versuch wurde der Oligonucleotid-Spacer des Tracers (Abb. 6.1, Komponente a) vor der Regenerierung enzymatisch gespalten. Auch in diesem Versuch wurde ein Teil der Kavitäten als Referenz für die Spaltung benutzt, indem sie, statt mit Enzymlösungen, nur mit der entsprechenden enzymfreien Pufferlösung gefüllt wurden. Die Meßdaten wurden auf die Absorptionswerte dieser Referenzkavitäten normiert. Nach der Spaltung wurden alle Kavitäten gründlich mit Waschpuffer (Phosphatpuffer (Natriumdihydrogenphosphat 10 mM, Di-Natriumhydrogenphosphat 70 mM) pH 7,5; NaCl 15 mM; Tween 0,05%) gewaschen. Während dieses Waschschrittes dissoziieren die noch gebundenen Hapten-Spacer-Fragmente ab und vervollständigen die Regenerierung des Sensors.

Abb. 9 zeigt das Ergebnis der enzymatischen Spaltung des Tracers: Bei Konzentrationen der Deoxyribonuclease von 10, 100 und 1000 Units/mL ist keinerlei Restsignal des Tracers beobachtbar. Bei einer Konzentration von 1 Unit/ml ist noch ein Tracersignal von etwa 10%, bei 0,1 Units/mL noch etwa 70% des Referenzsignals zu detektieren. Dieser Versuch zeigt eindeutig, daß es möglich ist, den Spacer des Tracers vor der Regenerierung enzymatisch zu spalten und den Marker vollständig zu entfernen. Der Erfolg der Spaltung hängt in erster Linie von der Konzentration der verwendeten Desoxyribonuclease ab.

Analog zu Anwendungsbeispiel 2 wurde auch hier in einen zweiten Experiment untersucht, ob nach der Regenerierung der Antikörper Antikörperbindungsstellen wieder frei zugänglich sind und noch genügend Antikörperaktivität vorhanden ist. Auch hier wurde der nicht regenerierte Teil der Kavitäten als Referenz benutzt und das Signal der regenerierten Kavitäten darauf normiert.

Abb. 9 zeigt das Ergebnis: Man sieht, daß nach der Neuinkubation mit Tracer etwa die Intensität des Kontrollsignals erreicht wird. Daraus kann geschlossen werden, daß die Regenerierung tatsächlich zu aktiven, frei zugänglichen Antikörperbindungsstellen führt. Das Konzept der Regenerierung der Sensors durch enzymatische Spaltung des Spacers des verwendeten Tracers wurde damit demonstriert.

Claims

1. Verfahren zur Beschleunigung der Dissoziation von Komplexen, dadurch gekennzeichnet, daß

- mindestens ein Bindungspartner dieser Komplexe permanent auf einer festen Phase immobilisiert ist und daß es sich bei diesem Bindungspartner um ein natürliches oder synthetisches Rezeptormolekül wie einen Antikörper, ein Enzym, einen biologischen Rezeptor oder eine Nucleinsäure handelt,
- mindestens ein weiterer, nicht permanent gebundener Bindungspartner dieses Komplexes eine oder mehrere kovalente oder nicht-kovalente Spaltungsstelle(n) aufweist,
- zur Beschleunigung oder Erleichterung der Dissoziation dieser Komplexe der oder die nicht permanent gebundenen Bindungspartner an ihrer Spaltungsstelle bzw. an ihren Spaltungsstellen mit Hilfe spezifischer Reagenzien oder spezifischer Bedingungen gespalten werden,
- die zu dieser Spaltung benutzten spezifischen Reagenzien oder spezifischen Bedingungen so gewählt werden, daß die Bindungsaktivität des permanent auf der festen Phase immobilisierten Bindungspartners weitgehend erhalten bleibt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach der einfachen oder mehrfachen Spaltung desjenigen Bindungspartners, der die Spaltungsstelle(n) aufweist, ein separater Dissoziationsschritt der nach der Spaltung noch von den immobilisierten Rezeptormolekülen komplexierten Fragmente dieses Bindungspartners folgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei demjenigen Bindungspartner der Komplexe, der permanent auf der festen Phase immobilisiert ist, um

a) einen Bestandteil eines Materials zur Separation, Reinigung, Entfernung oder Analyse von Stoffen oder Stoffgemischen handelt, wie Säulenmaterial zur analytischen oder präparativen chromatographischen Verwendung, bevorzugt Säulenmaterial zur Verwendung in der analytischen oder präparativen Affinitätschromatographie,
b) einen Bestandteil eines Sensors, bevorzugt eines Biosensors, zur Bestimmung der Konzentration oder zur Identifizierung eines Analyten oder eines Gemisches verschiedener Analyten,
c) einen Bestandteil eines Immunoassays zur Bestimmung der Konzentration oder zur Identifizierung eines Analyten oder eines Gemisches verschiedener Analyten handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der permanent auf der festen Phase immobilisierte Bindungspartner der Komplexe analytspezifische Bindungsreagenzien wie Antikörper (polyklonale, durch Affinitätsreinigung fraktionierte polyklonale (pseudo-monoklonale), monoklonale, rekombinante) oder deren Derivate, Nucleinsäuren oder deren auch synthetische Derivate (z. B. PNA), Lectine, Protein A, Protein G, Cyclodextrine, Enzyme, Apoenzyme, Rezeptoren, "Molecular Imprints", synthetische Antikörper, synthetische Kavitanden, Komplexbildner, natürliche, synthetische oder semisynthetische Polymere, andere, auch selbst-indizierende, Wirt-Gast-Systeme oder andere funktionelle Einheiten wie Biotin, Avidin, Streptavidin oder Marker enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der nicht permanent auf der festen Phase immobilisierte Bindungspartner der Komplexe analytspezifische Bindungsreagenzien wie Antikörper (polyklonale, durch Affinitätsreinigung fraktionierte polyklonale (pseudo-monoklonale), monoklonale, rekombinante) oder deren Derivate, Nucleinsäuren oder deren auch synthetische Derivate (z. B. PNA), Lectine, Protein A, Protein G, Cyclodextrine, Enzyme, Apoenzyme, Rezeptoren, "Molecular Imprints", synthetische Antikörper, synthetische Kavitanden, Komplexbildner, natürliche, synthetische oder semisynthetische Polymere, andere, auch selbst-indizierende, Wirt-Gast-Systeme oder andere funktionelle Einheiten wie Biotin, Avidin, Streptavidin, Antigene, Haptene oder Marker enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Dissoziation der Komplexe der Regenerierung eines Immunoassays oder eines Sensors, bevorzugt eines Biosensors, dient, wobei

- die Regenerierung dieses Sensors die Dissoziation von Komplexen zwischen permanent auf der festen Phase immobilisierten Rezeptormolekülen des Sensors und den zu bestimmenden Analyten sowie Tracern (analytähnlichen Substanzen, die direkt oder über einen Spacer an einen Marker gebunden sind) erfordert,
- die Dissoziation des Tracers erleichtert und/oder beschleunigt wird durch Spaltung der Bindung zwischen der analytähnlichen Substanz und dem Marker oder Spaltung oder Zerstörung des Markers selbst mit Hilfe spezifischer Reagenzien oder spezifischer Bedingungen,
- oder die Dissoziation der Analyten erleichtert und/oder beschleunigt werden kann durch eine vorausgehende oder begleitende enzymatische oder chemische Reaktion oder durch andere Bedingungen, wie Temperatur- oder pH-Änderungen, die eine Verkleinerung, Veränderung, Spaltung oder Derivatisierung der von den permanent auf der festen Phase immobilisierten Rezeptormolekülen des Sensors gebundenen Analyten bewirken,
- oder die Dissoziation des Tracers und der Analyten erleichtert und/oder beschleunigt wird durch Spaltung der Bindung zwischen der analytähnlichen Substanz und dem Marker oder Spaltung oder Zerstörung des Markers selbst mit Hilfe spezifischer Reagenzien oder spezifischer Bedingungen sowie durch eine vorausgehende oder begleitende enzymatische oder chemische Reaktion oder durch andere Bedingungen, wie Temperatur- oder pH-Änderungen, die eine Verkleinerung, Veränderung, Spaltung oder Derivatisierung der von den permanent auf der festen Phase immobilisierten Rezeptormolekülen des Sensors gebundenen Analyten bewirken.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Meßprinzip des zu regenerierenden Sensors auf der Kompetition der in der Probe vorhandenen Analytmoleküle mit den Tracermolekülen um die freien Bindungsstellen der analytspezifischen Bindungsreagenzien beruht.

8. Verfahren nach Anspruch 4, 5, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Marker verwendet werden können:

a) Enzyme wie Peroxidase [E.C. 1.11.1.7], Alkalische Phosphatase [E.C. 3.1.3.1], beta-Galactosidase [E.C. 3.2.1.23]; Biolumineszenz-Marker, bevorzugt Leuchtkäfer-Luciferase [E.C. 1.13.12.7], bakterielle Luciferase [E.C. 1.14.14.3], in Kombination mit chromogener, fluorogener, elektrochemischer oder Lumineszenz-Detektion,
b) größere Fluoreszenz-Marker wie Phycoerythrine, Phycocyanine oder fluoreszierende Latexpartikel, Green Fluorescent Protein (GFP) und dessen rekombinante Varianten oder Fluoreszenzfarbstoffe in Liposomen,
c) größere optische Marker wie gefärbte Latexpartikel, mit Farbstoff gefüllte Liposomen, farbgekoppelte Polymere oder Proteine, Aequorin sowie dessen rekombinante Varianten oder Metallpartikel (z. B. Gold),
d) Marker für piezoelektrische Sensoren wie Latexpartikel, Metallpartikel, Proteine oder andere Makromoleküle,
e) den Brechungsindex verändernde Marker für interferometrische, auf reflektometrischer Interferenz-Spektroskopie, Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (SPR) beruhende Sensoren oder Resonant-Mirror-Sensoren wie Proteine, Polymere oder Mikrokristalle.

9. Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Abspaltung des Markers die Bindung zwischen der analytähnlichen Substanz und dem Marker und/oder der Spacer, der diese Substanz mit dem Marker verbindet, gespalten wird, wobei diese Bindung oder der Spacer eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthält:

- chemisch spaltbare funktionelle Gruppen wie Thioether, Disulfide, Ester, Thioester, Diole oder Dicarbonyle; die Spaltung erfolgt durch ein Spaltungsreagens oder ein Gemisch von Spaltungsreagenzien, durch das die funktionellen Gruppen gespalten werden können,
- enzymatisch spaltbare funktionelle Einheiten, wie etwa Oligo- oder Polypeptide, Oligo- oder Polysaccharide, Nucleinsäuren, Nucleinsäurederivate, Glycoproteine, Lipide, Glyceride, Amide oder Ester; die Spaltung erfolgt durch ein geeignetes Enzym oder Enzymgemisch, durch das die funktionelle Einheit gespalten werden kann,
- pH-labile Gruppen, deren Spaltung durch geeignete Änderungen des pH-Wertes erfolgen kann.

10. Verfahren nach Anspruch 6, 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Tracer verwendet wird, der als Spacer zwei ganz oder teilweise komplementäre Oligonucleotide oder auch deren Derivate enthält, wobei bevorzugt eines der beiden komplementären Oligonucleotide an eine analytähnliche Substanz, das andere der beiden komplementären Oligonucleotide an den Marker gebunden ist, in der Weise, daß diese komplementären Oligonucleotide z. B. beide am 5'-Ende oder beide am 3'-Ende mit dieser analytähnlichen Substanz bzw. dem Marker verbunden werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Durchführung einer Bestimmung mit einem Sensor zunächst das Oligonucleotid-Konjugat der analytähnlichen Substanz zugegeben und selektiv von den permanent auf der festen Phase immobilisierten Rezeptormolekülen gebunden wird, in einem weiteren Schritt das Marker-Oligonucleo tid-Konjugat zugegeben wird, worauf die beiden ganz oder teilweise komplementären Oligonucleotide zum selektiv gebundenen Tracer hybridisieren.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Dissoziation der Komplexe zwischen den permanent auf der festen Phase immobilisierten Rezeptormolekülen und den Tracermolekülen zunächst die Abspaltung des Markers durch Bedingungen erfolgt, unter denen die beiden hybridisierten Oligonucleotidstränge des Spacers voneinander dissoziiert werden, beispielsweise:

- Temperaturerhöhung
- Änderungen des pH-Wertes
- Änderung der Konzentration an Salzen
- Zusatz von speziellen chaotropen Reagenzien, wie Harnstoff, Guanidiniumhydrochlorid oder Formamid
- Zusatz organischer Lösungsmittel.

13. Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Dissoziation der Komplexe zwischen den permanent auf der festen Phase immobilisierten Rezeptormolekülen und den Tracermolekülen zunächst die Abspaltung des Markers dadurch erfolgt, daß die beiden hybridisierten Oligonucleotide des Tracers enzymatisch gespalten werden, beispielsweise durch:

- Endonucleasen wie Desoxyribonuclease I (DNase I; E.C. 3.1.21.1), Micrococcal Nuclease [E.C. 3.1.31.1], S1 Nuclease [E.C. 3.1.30.1], und Restriktionsenzyme wie BamH I oder EcoR I [E.C. 3.1.21.4]
- Exonucleasen wie Exonuclease III [E.C. 3.1.11.2], Phosophodiesterase I [E.C. 3.1.4.1].

14. Verfahren nach Anspruch 10, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß zur parallelen Bestimmung unterschiedlicher Analyten in einem multianalytfähigen Sensor unterschiedliche Tracer verwendet werden, die aus Oligonucleotid-Konjugaten der den einzelnen zu bestimmenden Analyten ähnlichen Substanzen bestehen, wobei deren Nucleinsäuresequenzen so beschaffen sind, daß sie zur Herstellung eines Tracers alle mit dem gleichen Marker-Oli gonuleotid-Konjugat hybridisiert werden können.

15. Verfahren nach Anspruch 10, 12, 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Regenerierung eines multianalytfähigen Sensors zur parallelen Bestimmung verschiedener Analyten dadurch erleichtert wird, daß in analoger Durchführung zu Anspruch 11 zunächst die in Anspruch 14 beschriebenen verschiedenen Oligonucleotid-Konjugate der den einzelnen zu bestimmenden Analyten ähnlichen Substanzen zugegeben und von den permanent auf der festen Phase immobilisierten Rezeptormolekülen selektiv gebunden werden, in einem weiteren Schritt die Zugabe des in Anspruch 14 beschriebenen Marker-Oligonuleotid-Konjugates erfolgt, mit dem alle verschiedenen Oligonucleotid-Konjugate der den einzelnen zu bestimmenden Analyten ähnlichen Substanzen zu selektiv gebundenen Tracern hybridisieren.