JP2000230928A - 海綿状脳障害のための免疫学的アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 伝播性海綿状脳障害（ＴＳＥ）の原因の感染
性因子についての、動物（特に動物の死骸）を試験する
方法を提供すること。 【解決手段】 動物における伝播性海綿状脳障害（ＴＳ
Ｅ）についての推定因子を検出するための方法であっ
て、該方法は、動物から身体組織サンプルを採取する工
程、ＰｒＰ^SCと反応し得る標識した抗体と免疫学的アッ
セイにおける該サンプルを反応させる工程、および該サ
ンプルに結合された標識した抗体の量を決定する工程を
含む、方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、伝播性（Ｔｒａｎ
ｓｍｉｓｓａｂｌｅ）海綿状脳障害を検出する方法、お
よび伝播性海綿状脳障害（ＴＳＥ）についての免疫学的
アッセイまたは試験に関する。

【０００２】

【従来の技術】海綿状脳障害は、退行性（ｄｅｇｅｎｅ
ｒａｔｉｖｅ）神経疾患の群である。海綿状脳障害の多
くの例が存在し、ＢＳＥ（ウシ海綿状脳障害）、スクラ
ピー、クロイツフェルト−ヤーコプ病（ＣＪＤ）、ゲル
ストマン−シュトロイスラー−シャインカー（Ｓｃｈｅ
ｉｎｋｅｒ）症候群、クールー、伝播性ミンク（Ｍｉｎ
ｋ）脳障害、Ｍｕｌｅ Ｄｅｅｒの慢性るいそう疾患
（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｗａｓｔｉｎｇ Ｄｉｓｅａｓ
ｅ）、ネコ海綿状脳障害、ならびに動物（例えば、オオ
ジカ、ニアラ、クーズー、ゲムズボック、およびトラ）
において見出される他の海綿状脳障害を含む。ＢＳＥ
が、実験条件下でマウスおよびブタに伝播され得ること
もまた報告されている。感染性因子による種の障壁のこ
の交差は、ヒトに対する伝播が起こり得るという関心の
増加につながっている。

【０００３】ウシ海綿状脳障害（ＢＳＥ）は、「狂牛
病」として一般に知られるウシの退行性脳障害である。
それは、ゆっくりとした潜伏期を有し、４または５年ま
でに雌ウシにおける精神状態の進行性退行の症状があ
り、これは、協調の損失およびよたついた歩行、それら
の環境への興味の欠如、食物および水への無関心、また
は攻撃性を含む予測不可能な行動を含む。罹患したウシ
は、それらが３〜１０歳のとき、症状を示す。

【０００４】１９８６年１１月にイギリスにおいて最初
に確認され、それ以後そこでは、１００，０００を超え
る事例が報告されている。罹患したウシの死後は、神経
細胞の破壊および異常なタンパク質線維の沈着（これ
は、脳に海綿質（海綿状）組織を与える）に起因して、
脳組織において特徴的なパターンの空胞形成を示す。類
似の海綿状疾患は、ヒトにおいて一世紀にわたる間（例
えば、クロイツフェルト−ヤーコプ病またはＣＪＤ）、
ヒツジにおいて２００年にわたる間（スクラピー）認め
られている。ＢＳＥおよびその対応物の原因であると考
えられる因子は、プリオンとして公知の感染性タンパク
質である。プリオンは、タンパク質のみを含み、核酸を
含まない（核酸の存在は、通常のウイルスの場合におい
て必要とされる）感染性粒子である。特にスクラピーに
おいて、プリオンタンパク質またはＰｒＰ^SCとして公知
のあるタンパク質は、感染性に関して同時精製する（ｃ
ｏ−ｐｕｒｉｆｙ）ことが見出されており、そして他の
動物（例えば、実験条件下でのハムスター）由来の脳細
胞培養物におけるスクラピー様状態を生じ得る。ＰｒＰ
^SCは、スクラピー感染ヒツジの脳組織中に沈着する特徴
的なタンパク質線維の唯一公知の成分である。このタン
パク質ＰｒＰ^SCは、構造的改変を受けるようであるが、
用語ＰｒＰ^Cは、ＰｒＰ^SCの正常細胞対応物に関して使
用される。ＰｒＰ^Cの天然の機能は知られていないが、
それは生物における必須の構造または機能的な役割を有
するようである。

【０００５】タンパク質補充としてイギリスの乳牛に日
常的に給餌されていたリサイクル動物組織が、感染の元
として同定されている。ＢＳＥは、元来、スクラピーに
感染したヒツジの脳から蔓延し、そしてその蔓延は、Ｂ
ＳＥに感染したウシから採取された脳組織の摂取によっ
て偶発的に促進されたと考えられる。従って、イギリス
政府は、１９８８年７月に始まる、疑わしい動物および
それらの小屋の強制的な破壊を導入した。ウシへの動物
組織の給餌は、イギリスでは１９８８年７月に禁止され
た。

【０００６】疾患の最初の報告以来、特にクールー（関
連疾患）が、ニューギニア部族の間で儀式的な共食いに
よって蔓延すると知られて以来、消費者は、ＢＳＥが乳
製品または牛肉製品を介してヒトに伝播性であり得ると
恐れた。１９９０年後半には、消費者は、牛肉市場にお
ける崩壊を起こしたＢＳＥのヒトへの伝播に関心をもっ
ている。同様の恐怖が、１９９４年中期にドイツを襲っ
た。

【０００７】１９９６年において、新しく記載された型
の致死的なＣＪＤ（変異ＣＪＤ（Ｖａｒｉａｎｔ ＣＪ
Ｄ））の１０の症例が確認された。犠牲者は、異なった
脳組織症状を有し、すべて４２歳未満であり、そして疾
患の遺伝的な記録を有さなかった。犠牲者は、疑わしい
動物の根絶が効果を生じる前に、ＢＳＥ感染ウシとの接
触を介してその疾患を罹患し得ることが示唆されてい
る。変異ＣＪＤの同定により、イギリスにおける牛肉消
費の劇的な低下、ならびに世界中の種々の国々における
イギリスおよびいくつかの場合においてアイルランド牛
肉の輸入の禁止に至った。

【０００８】従って、獣医学的および経済的の両方の理
由のために、家畜、動物の死骸、および一般に肉中の、
ＢＳＥ、スクラピー、および他の関連する海綿状脳障害
への感染を検出するための診断の方法および診断キット
を提供する緊急の必要性が存在する。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ＢＳＥの原因の感染性因子についての、ウシ、特に
動物の死骸を試験する方法を提供することである。保護
方法が迅速であり、数時間足らずで結果が得られるこ
と、それが安価で、確実で、そして使いやすいものであ
ることもまた、目的である。

【００１０】そのような検出方法は、それが、ヒトの食
品販売店への感染肉の侵入を防ぎ、従ってヒトが、変異
ＣＪＤ、または感染肉を食べることによって伝播され得
る他の関連疾患を罹患する可能性を排除するという利点
を有する。そのような検出方法は、それが、肉および肉
製品における消費者の信頼を回復するというさらなる利
点を有し、それは、一般に農業団体および肉産業の両方
について有利である。

【００１１】現在、感染した肉の死骸または家畜の死骸
を同定し得る利用可能な試験は存在せず、そして肉消費
に関する公衆の恐れを鎮め得る利用可能な製品は存在し
ない。

【００１２】本発明は、海綿状脳障害の原因であると考
えられるｒｏｇｕｅプリオンタンパク質である推定因子
ＰｒＰ^SCについての免疫学的アッセイを提供する。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、免疫学的アッ
セイにおいて抗ＰｒＰ^SC抗体を用いて、動物における
（特に動物死骸における）伝播性海綿状脳障害（ＴＳ
Ｅ）を検出する方法に関する。同じ抗体を含むＴＳＥを
検出するための診断的キットもまた開示される。

【００１４】本発明に従って、動物におけるＴＳＥにつ
いての推定因子を検出するための方法であって、上記の
方法は、動物から身体組織サンプルを採取する工程、Ｐ
ｒＰ ^SCと反応し得る標識した抗体と免疫学的アッセイに
おける上記のサンプルを反応させる工程、および上記の
サンプルに結合された標識した抗体の量を決定する工程
を含む方法が提供される。

【００１５】適切には、上記アッセイにおいて使用され
る上記抗体が、以下の一般式：

【００１６】

【化４】

【００１７】を有する合成ペプチド配列に対して惹起さ
れ、ここで、Ｒ₁は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、およびＰｈｅか
ら選択されるアミノ酸残基であり；Ｒ₂は、Ｍｅｔまた
はＶａｌのいずれかであり；Ｒ₃は、Ａｌａであるか、
または存在せず；Ｒ₄およびＲ₅は、独立してＬｅｕ、Ｉ
ｌｅ、およびＭｅｔから選択されるアミノ酸残基であ
り；括弧内の１つ以上の残基は存在するか、または非存
在であり得、ただし、それらが存在する場合、それらは
配列内の残りのペプチドに付着され；そしてＸおよびＹ
は、各々独立して非存在であるか、または独立して１つ
以上のさらなるアミノ酸残基であり得る。

【００１８】以下の配列：

【００１９】

【化５】

【００２０】の１つ以上に対して惹起されるプリオン特
異的抗体は特に好ましい。

【００２１】上記の下線を付した配列に対して惹起され
る抗体は、さらに特に好ましい。

【００２２】アッセイにおいて使用される抗体は、好ま
しくはＰｒｏｔｅｕｓ，Ｅｎｇｌａｎｄから入手可能で
あるＰｒＰ^SCに対するＣ５抗体（本明細書中において分
化試薬と呼ばれる）である。他の抗ＰｒＰ^SC抗体もま
た、本発明における使用に適切である。適切な抗体は、
ＷＯ ９３／１１１５５に開示される合成ペプチドに対
して指向される抗体である。

【００２３】免疫学的アッセイは、競合的アッセイであ
り得、ここで固体支持体、適切にはマイクロタイタープ
レートが、キャリアータンパク質−ペプチド結合体で予
めコートされ、上記動物組織サンプルおよび抗ペプチド
抗体が、上記固体支持体に添加され、反応させられ、お
よび上記支持体が洗浄され、標識した抗（抗ペプチド抗
体）抗体が添加され、反応させられ、洗浄され、シグナ
ル試薬を添加され、そして上記シグナルが読みとられ
る。標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼであり得る。

【００２４】アッセイにおいて使用される一次抗体は、
好ましくはウサギ抗ＰｒＰ^SC抗体であり、そして二次抗
体は、好ましくは、ヤギ、ヒツジ、ロバ、または他の抗
ウサギ抗体から選択される。

【００２５】特定の実施態様において、ＥＬＩＳＡアッ
セイを使用して、ＰｒＰ^SCについてのペプチドフラグメ
ントを同定し得るが、他の適切な免疫学的アッセイは使
用され得る。

【００２６】好ましい実施態様において、増強化学発光
アッセイは、ＰｒＰ^SC因子の検出を補助するために使用
される。動物は、適切にはウシ、ヒツジ、およびブタで
あり得、そして組織サンプルは、適切にはそのような動
物の死骸から採取され得る。

【００２７】工程は以下である： １．ＰｒＰ^SC（海綿状脳障害の原因であると考えられる
ｒｏｇｕｅプリオンタンパク質）についての推定因子の
検出を可能にする神経組織の浄化（ｃｌｅａｎｕｐ）； ２．特定の因子（抗体）の添加を含むアッセイプライミ
ング工程； ３．ＰｒＰ^SCについてのペプチドフラグメントで予めコ
ートしたウェルを用いるＥＬＩＳＡ； ４．ＰｒＰ^SC因子の検出のための増強した化学発光アッ
セイ；および ５．結果の定量。

【００２８】特に、アッセイは、ＢＳＥにおいて見出さ
れる感染性プリオンタンパク質であるＰｒＰ^SCタンパク
質のためのアッセイを含む。アッセイは、ＰｒＰ^SCと、
正常なＢＳＥプリオンタンパク質であるＰｒＰ^SCとの間
を識別し得る。ＰｒＰ^SCタンパク質は、三重らせん中の
一連のペプチドであるが、ＰｒＰ^SCにおいて、３分の１
の分子は、平らなβ−シートの形態である。

【００２９】ＰｒＰ^CおよびＰｒＰ^SCの両方が罹患被験
体中で見出されるが、ＰｒＰ^Cは、正常な被験体中に見
出されるため、アッセイが正常なＰｒＰ^CとＰｒＰ^SCと
の間を識別し得ることは、特に重要である。

【００３０】特に好ましい実施態様において、ＣＮＳ組
織のサンプル、適切には脊髄の横断面が、動物の死骸か
ら取り出され、ホモジェナイズされ、濾過され、そして
マイクロタイタートレイ上に置かれる。次いで、サンプ
ルは、上記のような抗体と、免疫学的アッセイにおいて
反応させられる。

【００３１】本発明はまた、上記のような抗ペプチド抗
体を含む、動物中のＴＳＥの検出のための試験キットを
提供する。

【００３２】

【発明の実施の形態】本発明は、本明細書中において実
施例を参考としてより詳細に記載される。Ｅｎｆｅｒ
ＴＳＥイムノアッセイについて必要なものは、以下の通
りである： ａ）ＣＮＳ組織のサンプル ｂ）一連の調製用サンプル処理 ｃ）プリオン特異的抗体 ｄ）感度のよい検出方法。

【００３３】ａ）ＣＮＳ組織のサンプルを、特殊なサン
プリングｃｌａｖｉｃａｌ（Ｍｅｄｉｓｔｅｅｌ，Ｄｕ
ｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能）を用いて、屠
殺の時点にてウシの死骸から摘出する。この組織サンプ
ルは、脊髄の横断面が必要な場合確認分析のためにサン
プルから取り出され得るようなものでなければならな
い。サンプルを、一般的な容器中に入れ、そして追跡可
能な（ｔｒａｃｅａｂｌｅ）識別数（すなわち、ＥＵ
４桁（ｄｉｇｉｔ）死骸数、Ｉｒｉｓｈ Ｄｅｐａｒｔ
ｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ耳標（ｅａｒ
−ｔａｇ）数、または追跡可能な工場殺傷数）で識別す
る。サンプルを、試験のために実験室に輸送する。

【００３４】ｂ）実験室に到達する際に、サンプルを、
バーコードを用いて識別する。各サンプルに割り当てら
れたバーコードは、サンプルの起源の工場、動物を殺傷
した日付、および追跡可能な識別サンプル数に関する情
報を組み込む。重さが０．３ｇ〜１．１ｇにおよぶ各サ
ンプルの量を取り出し、そして均質化のためにストマッ
カーバッグ（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ ｂａｇ）に入れる。
元々のサンプルの切片を含むこのバッグを、元々のサン
プルに同一のバーコードに割り当てる。このことによ
り、システムを通して十分に追跡可能となる。固定容量
の均質化緩衝液を、ストマッカーバッグおよび均質化し
たサンプルに添加する。次いで、サンプルを、調製した
９６ウェルマイクロタイタープレート上に２連で分配す
る。固定容量の示差緩衝液（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
Ｂｕｆｆｅｒ）を、マイクロタイタープレートに適用
し、そしてインキュベートする。次いで、固定容量のプ
ライミング緩衝液を、プレート上のサンプルに添加し、
そしてインキュベートする。この工程は、サンプル調製
手順を完了する。

【００３５】ｃ）ここで、イムノアッセイのためのサン
プルの準備ができている。これは、プリオン特異的抗体
を必要とする。この抗体を、合成プリオンペプチドに対
してウサギにおいて惹起させる。固定した容量のこの特
異的抗体を、マイクロタイタープレートに添加し、イン
キュベートし、そして洗浄する。固定容量の二次抗体
を、プレートに添加し、インキュベートし、そして洗浄
する。ここで、結果の検出が可能である。

【００３６】ｄ）結果の検出は、増強化学発光による。
固定容量の化学発光試薬を、マイクロタイタープレート
に添加し、そしてインキュベートする。光シグナルを、
実験系化学発光計を用いて読みとり、結果を対応するバ
ーコードに割り当て、そして結果報告をプリントする。

【００３７】

【実施例】（実施例１） ＜試薬＞ （サンプルの均質化のための試薬） Ｅｎｆｅｒ均質化緩衝液（ＨＢ） 逆浸透水 示差試薬 ポジティブコントロール ネガティブコントロール Ｅｎｆｅｒイムノアッセイプライミング緩衝液（ＩＰ
Ｂ） （イムノアッセイ手順のための試薬） １．５Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ） １５０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅ
ｅｎ２０（０．０５％）塩化ナトリウム溶液（ＮａＣ
ｌ） 供給業者によって指示されるように希釈した１５０ｍＭ
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）中のウサギ抗
ＰｒＰペプチド 正常ヤギ血清 供給業者によって指示されるように希釈した１５０ｍＭ
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）中のロバ抗ウ
サギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体 Ａｍｅｒｌｉｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ^TMＪｏｈｎｓｏｎ
＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ。

【００３８】＜装置＞ バーコードリーダーおよびコンピュータデータベースイ
ンターフェイス バーコードラベルプリンター 回転（ボトル）ミキサー ９６ウェルマイクロタイトレーションプレート化学発光
リーダー ９６ウェルマイクロタイトレーションプレート振盪イン
キュベーター（２） ９６ウェルマイクロタイトレーションプレート洗浄機
（２） マイクロコンピュータ レーザープリンター マイクロコンピュータ「ｃｕｓｔｏｍ」ソフトウエア−
データ処理および報告 冷凍庫 −２０℃ 冷蔵庫 ４℃ 逆浸透水系 自動８チャンネルピペット 自動マイクロタイタープレートストリップディスペンサ
ー ボルテックスミキサー 使い捨てパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）ピペット ストマッカーホモジナイザーおよびバッグ（変量）） ブレード（Ｂｌａｄｅ） 安全サンプル箱および輸送トレイラー クラスＩＩ安全キャビネットシステム オートクレーブ。

【００３９】＜サンプルおよびサンプリング手順＞サン
プルを、脊髄中のＰｒＰ^SCタンパク質の検出を可能にす
るようにする。サンプルのサイズは、一次分析、および
必要な場合反復または確認分析の実施を可能にするに十
分なサイズである。サンプルを、固定量の組織が各サン
プルについて採取されることを確実にする様式で採取す
る。サンプルを、実験室においてサンプルの識別を可能
にする様式で採取する。パッケージング、保存、および
実験室への輸送の方法は、分析の結果が偏らないように
サンプルの完全性を維持する。分析のためのサンプル
を、絶縁および封をしたコンテナ中で実験室に輸送す
る。

【００４０】＜手順＞ （組織の均質化および調製）７．５ｍｌの均質化緩衝液
（ＨＢ）を、各サンプルに添加する。サンプルに封を
し、そしてホモジナイザーに入れ、３分間ホモジェナイ
ズする。サンプルをホモジナイザーから取り出し、そし
て４０個のサンプルの集積後、サンプルを指定した棚上
に置く。０．０２ｍｌの示差試薬を、ウェルＡ１、Ａ２
を除く予めコートしたマイクロタイタープレートの各ウ
ェルに適用する。各サンプルの識別バーコードを、バー
コードスキャナーを用いてマイクロコンピュータに順に
転送する。０．１８ｍｌのサンプルを、Ａ１、Ａ２、Ａ
３、Ａ４（コントロール）を除く各ウェルに適用する。
プレートを、マイクロタイタープレートシーラーで覆
う。マイクロタイタープレートを、振盪しながら３７℃
にて１時間インキュベートする。マイクロタイタープレ
ートウェルを、０．４ｍｌのＮａＣｌ溶液で８×洗浄す
る。０．２５ｍｌのイムノアッセイプライミング緩衝液
を、各ウェルに分配する。マイクロタイタープレート
を、振盪しながら３７℃にて１５分間インキュベートす
る。マイクロタイタープレートウェルを、０．４ｍｌの
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）溶液で４×洗浄
する。

【００４１】（化学発光イムノアッセイ）０．２ｍｌの
一次抗体を、マイクロタイトレーションプレートの各ウ
ェル中に分配する。マイクロタイトレーションプレート
を、浸透しながら３７℃にて４０分間インキュベートす
る。マイクロタイトレーションプレートウェルを、０．
４ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）溶液で
４×洗浄する。０．２ｍｌの二次抗体を、マイクロタイ
トレーションプレートの各ウェル中に分配する。マイク
ロタイトレーションプレートを、振盪しながら３７℃に
て３０分間インキュベートする。マイクロタイトレーシ
ョンプレートウェルを、０．４ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅ
ｎ（０．０５％）溶液で４×洗浄する。０．１５ｍｌの
Ａｍｅｒｌｉｔｅ^Tm試薬を、マイクロタイトレーション
プレートの各ウェル中に分配する。マイクロタイトレー
ションプレートを、振盪しながら３７℃にて３分間イン
キュベートする。発光を、リーダーで読みとる。データ
整理および解釈。

【００４２】（結果の計算） Ｎ／Ａ。

【００４３】＜抗体、均質化緩衝液、イムノアッセイプ
ライミング緩衝液、品質管理＞ （抗体）ウサギ抗−ＰｒＰペプチドを、凍結保存し、そ
して供給業者によって指示されるように使用強度（ｗｏ
ｒｋｉｎｇ ｓｔｒｅｎｇｈｔｈ）に希釈する。ロバ抗
ウサギＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
結合体を、４℃にて貯蔵し、供給業者によって指示され
るように希釈する。正常ヤギ血清を、４℃にて貯蔵し、
適切に希釈する。

【００４４】（品質管理） Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ．Ａｂｂｏｔｓｔｏｗｎ．Ｄｕｂｌｉ
ｎ．により供給される。

【００４５】（すべての試薬の供給源） Ｅｎｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．， Ｃｏ．Ｔｉｐｐｅｒａｒｙ， Ｉｒｅｌａｎｄ。

【００４６】＜流れ図＞ ＣＮＳ組織サンプル ↓ 均質化および調製 ↓ イムノアッセイ ↓ 結果報告。

【００４７】（実施例２） １．均質化： １．１ １ｇのＣＮＳ組織を、サンプルから取り出し、
そしてストマッカーバッグに入れる。 １．２ １５ｍｌの均質化緩衝液を、切片に添加する。 １．３ この混合物を、ストマッカーホモジナイザーを
用いて３分間ホモジェナイズする。 １．４ 生じたホモジネートを、１ミクロンのフィルタ
ーを通して濾過する。

【００４８】２．プレーティング： ２．１ ９６ウェルマイクロタイタープレートを、２０
０μｌの付着剤（Ａｄｈｅｒｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）を各
ウェルに分配し、そして３７℃にて一晩インキュベート
することによって調製する。 ２．２ 使用前に、プレートを４×ＰＢＳＴ（５×リン
酸緩衝化生理食塩水錠（Ｓｉｇｍａ，Ｕ．Ｋ．によって
供給される）、１リットル逆浸透Ｈ₂Ｏ／１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０に対して）（１５０ｍＭ）で洗浄する。 ２．３ ２００μｌのブランクコントロール（例えば、
水、生理食塩水、または緩衝液）を、２連でプレートの
Ａ１、２位置上に分配する。 ２．４ ２００μｌのネガティブコントロール（既知の
ネガティブＢＳＥホモジネート）を、４連でプレートの
Ｂ１、２、Ｃ１、２位置上に分配する。既知のネガティ
ブＢＳＥホモジネートは、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｂｂｏｔｓｔ
ｏｗｎ，Ｃａｓｔｌｅｋｎｏｃｋ，Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒ
ｅｌａｎｄによって供給される。 ２．５ ２００μｌのポジティブコントロール（既知の
ポジティブＢＳＥホモジネート（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｂｂｏ
ｔｓｔｏｗｎ，Ｃａｓｔｌｅｋｎｏｃｋ，Ｄｕｂｌｉ
ｎ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能））を、４連でプレー
トのＤ１、２、Ｅ１、２位置上に分配する。 ２．６ ２００μｌの各濾過したホモジネートを、２連
でプレートの残りの位置上に分配する。 ２．７ ５０μｌの示差緩衝液を、２５０μｌのウェル
容量を有するプレート上に分配する。 ２．８ プレートを、マイクロタイタープレートシーラ
ーで覆い、そして２０℃にて３０分間インキュベートす
る。 ２．９ プレートを、２０００ｒｐｍにて３０分間遠心
分離する。 ２．１０ 次いで、プレートを、１５０ｍＭのＰＢＳＴ
で４回洗浄する。 ２．１１ ５０μｌのプライミング緩衝液を、マイクロ
タイタープレートの各ウェルに添加し、そしてプレート
を３７℃にて１時間インキュベートする。 ２．１２ プレートを、１５０ｍＭのＰＢＳＴで４回洗
浄する。

【００４９】３．イムノアッセイ： ３．１ ２５０μｌの一次プリオン特異的抗体、ウサギ
抗プリオンペプチド抗体を１：２０００の希釈にて、プ
レート上に分配する。 ３．２ プレートを、室温にて４０分間インキュベート
する。 ３．３ プレートを、１５０ｍＭのＰＢＳＴで４回洗浄
する。 ３．４ ２５０μｌの二次抗体、ロバ抗ウサギＨＲＰを
１：２０００の希釈にてプレート上に分配し、そしてプ
レートを３７℃にて３０分間インキュベートする。 ３．５ プレートを、１５０ｍＭのＰＢＳＴで４回洗浄
する。

【００５０】４．検出 ４．１ ２５０μｌの増強化学発光試薬（Ａｍｅｒｌｉ
ｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，
Ｕ．Ｋ．によって供給される）を、プレートに添加す
る。 ４．２ プレートを、室温にて１０分間インキュベート
する。 ４．３ 光シグナルを、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｈｅ
ｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｕｐ
ｐｌｙ Ｃｏ．，Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄによっ
て供給される）（これは、走査波長リーダーである）を
用いて読みとる。デバイスは、全ＩＲ可視ＵＶスペクト
ルを走査し、そして結果を外挿することによって、プレ
ートの各ウェルからの発光を読みとる。 ４．４ プレートからの光シグナルを、特製ソフトウエ
アパッケージ（Ｇ．Ｋ．Ｓ．Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｄｕｂ
ｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能）に転送する。 ４．５ 各光シグナルを、対応するバーコードに割り当
て、そして報告をプリントする。 ４．６ 結果を、化学発光光単位Ｌ．Ｕ．で見積もる。

【００５１】＜試薬の供給源＞ １．プレート付着剤、均質化緩衝液、プライミング緩衝
液、および示差緩衝液は、Ｅｎｆｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ Ｌｔｄ．によって供給される。 ２．プリオン特異的抗体（抗ＰｒＰ）は、Ｅｎｆｅｒ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓによって供給され、そして以下の合成
プリオンペプチドに対して惹起されたウサギ抗体であ
る。 プリオン配列 Ｎ末端

【００５２】

【化６】

【００５３】本明細書中で使用されるすべての配列は、
以下のように見られるアミノ酸残基に対する標準的な
Ｉ．Ｕ．Ｐ．Ａ．Ｃ．三文字コード略語を用いて与えら
れる：Ａ−アラニン、Ｃ−システイン、Ｄ−アスパラギ
ン酸、Ｅ−グルタミン酸、Ｆ−フェニルアラニン、Ｇ−
グリシン、Ｈ−ヒスチジン、Ｉ−イソロイシン、Ｋ−リ
ジン、Ｌ−ロイシン、Ｍ−メチオニン、Ｎーアスパラギ
ン、Ｐ−プロリン、Ｑ−グルタミン、Ｒ−アルギニン、
Ｓーセリン、Ｔ−スレオニン、Ｖ−バリン、Ｗ−トリプ
トファン、およびＹ−チロシン。両方の下線を付した配
列（３４アミノ酸のペプチドおよび４０アミノ酸のペプ
チド）を用いて、ウサギ抗ＰｒＰ抗体を惹起させる。ペ
プチドを、活性化オボアルブミンに結合し、そしてフロ
イント完全アジュバント中で筋肉内注射する。追加免疫
注射は、皮下であり、そしてフロイント不完全アジュバ
ントを使用する。ウサギを、３０日目に採血する。 ３．化学発光試薬は、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈ
ｎｓｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓ，Ｕ．Ｋ．により供給され、そして結果をＬａｂｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用い
て読みとる。

【００５４】（実施例３） ＜確証データ＞ １．アッセイ間変動 １０のアッセイの全体において、ポジティブコントロー
ルおよびネガティブコントロールに対して生じたデータ
を、表１に提供する。これらのコントロールは、２つの
無関係の方法−組織学（ＨＩＳ）および免疫組織化学
（ＩＣＣ）によってポジティブおよびネガティブと判断
されている（これらの方法は、Ｅｎｆｅｒ試験を用いて
報告された結果を確認するために最終的に使用され
る）。これらの２つのサンプルに基づくアッセイ間変動
は、ポジティブコントロールについて１９％、そしてネ
ガティブコントロールについて９３％である。これらの
データは、アッセイが許容可能な再現性を有することを
示す。別のコントロールもまた、本研究に含んだ。これ
は、日ごとの抗体差異に起因するアッセイ間の変動の研
究を可能にするペプチドコントロールであった。これら
のデータは、表１に含まれる。再度、１４％にてのアッ
セイ間変動は、満足できるものである。

【００５５】２．アッセイ内変動 アッセイ内変動を、アッセイ間研究について使用される
ものと同じ型のコントロール（ポジティブ、ネガティ
ブ、およびペプチド）を用いて、そして各コントロール
について２３の反復を単一のプレート上に置いて決定し
た。これらのコントロールに対して生じたデータを、表
２に提供する。これは、ポジティブコントロールについ
て９％、ペプチドコントロールについて１１％、そして
ネガティブコントロールについて５７％の変動を示す。

【００５６】３．安定性研究 多くの安定性研究を、この確証の目的のために実施し
た。

【００５７】（ａ）ホモジネート安定性 この場合において、サンプルをホモジェナイズし、そし
てアリコートに分けた。７日の期間にわたって、同じホ
モジネートを、−２０℃、２〜８℃にて貯蔵したアリコ
ートを用いた４つの場合に関して、そして室温および３
７℃にて貯蔵したアリコートを用いた２つの場合に関し
て試験した。表３において要約した結果は、アッセイ間
変動を考慮すると、−２０℃の貯蔵条件でのこの期間に
わたって、光シグナルが安定であり、２〜８℃、室温、
および３７℃ではいくぶん劣化を有していることを示
す。

【００５８】（ｂ）均質化緩衝液（ＨＢ）の安定性 本研究は、生成目的のための均質化緩衝液の有効期限を
決定するように設定した。上記の（ａ）において要約し
たものと同様のプロトコルに従い、結果を表４において
提供した。再度、結果は、ＨＢが使用のために安定であ
ることを示す。

【００５９】（ｃ）一次抗体の安定性−使用強度 未希釈の抗体は、不定期間にわたって凍結保存され得
る。しかし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）を
用いて使用強度に希釈した抗体は、濃縮抗体ほど安定で
はなく、従って安定性研究を実施した。１：１Ｋの抗体
希釈を、７２日期間にわたって９つの場合に関して作製
した。研究の最終日に、９つの調製物の各々を、抗原で
コートしたプレートに適用し、そしてＥＬＩＳＡを実施
した。結果を表５に示す。これらのデータから、使用強
度抗体は少なくとも７０日の期間は安定であることが理
解され得る。

【００６０】（ｄ）均質化前の均質化緩衝液中のサンプ
ルの安定性 何らかの要因がＨＢを添加した後サンプルをホモジェナ
イズすることにおいて遅れを生じる場合、アッセイが影
響を受けないことを保証するために、この安定性試験を
実施した。均質化緩衝液を、１ｇの脳対１５ｍｌの緩衝
液の比でサンプルに添加し、そして混合物を室温で一晩
（１５時間）放置した。この時間の後、サンプルをホモ
ジェナイズし、そしてイムノアッセイを実施した。結果
を表６に示す（− ２つの試験されたサンプルの１つは
遅れなし、そして１つは遅れありであった）。処理は、
最終的な結果に差異を生じなかった。

【００６１】

【表１】

【００６２】

【表２】

【００６３】

【表３】

【００６４】

【表４】

【００６５】

【表５】

【００６６】

【表６】

【００６７】

【発明の効果】本方法は、死骸中のＴＳＥ因子の迅速な
検出を可能にし、結果は数時間足らずで得られ、通常約
１．５〜２時間である。したがって、その死骸は、ヒト
の食品販売店に入る前に食肉処理場から除去され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 599019694 Ｂｌｏｃｋ Ａ， Ｅａｒｌｓｆｏｒｔ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｅａｒｌｓｆｏｒｔ Ｔ ｅｒｒａｃｅ， Ｄｕｂｌｉｎ ２， Ｉ ｒｅｌａｎｄ (72)発明者 マイケル オコナー アイルランド国 カウンティー ダブリ ン， マウント メリオン， チェストナ ット グローブ 13 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA29 CB01 CB17 CB26 DA36 FB03 FB07 4H045 AA30 BA18 BA19 BA40 CA40 DA75 DA86 EA53

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動物における伝播性海綿状脳障害（ＴＳ
   Ｅ）についての推定因子を検出するための方法であっ
   て、該方法は、動物から身体組織サンプルを採取する工
   程、ＰｒＰ^SCと反応し得る標識した抗体と免疫学的アッ
   セイにおける該サンプルを反応させる工程、および該サ
   ンプルに結合された標識した抗体の量を決定する工程を
   含む、方法。
2. 【請求項２】 前記アッセイにおいて使用される前記抗
   体が、以下の一般式： 【化１】 を有する合成ペプチド配列に対して惹起され、ここで、
   Ｒ₁は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、およびＰｈｅから選択される
   アミノ酸残基であり；Ｒ₂は、ＭｅｔまたはＶａｌのい
   ずれかであり；Ｒ₃は、Ａｌａであるか、または存在せ
   ず；Ｒ₄およびＲ₅は、独立してＬｅｕ、Ｉｌｅ、および
   Ｍｅｔから選択されるアミノ酸残基であり；括弧内の１
   つ以上の残基は存在するか、または非存在であり得、た
   だし、それらが存在する場合、それらは配列内の残りの
   ペプチドに付着され；そしてＸおよびＹは、各々独立し
   て非存在であるか、または独立して１つ以上のさらなる
   アミノ酸残基であり得る、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記抗体が、以下の配列： 【化２】 の１つ以上に対して惹起されるプリオン特異的抗体であ
   る、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
4. 【請求項４】 前記抗体が、請求項３に示される下線を
   付した配列に対して惹起される抗体である、請求項３に
   記載の方法。
5. 【請求項５】 前記免疫学的アッセイが、競合的アッセ
   イであり得、ここで固体支持体、適切にはマイクロタイ
   タープレートが、キャリアータンパク質−ペプチド結合
   体で予めコートされ、前記動物組織サンプルおよび抗ペ
   プチド抗体が、該固体支持体に添加され、反応させら
   れ、および該支持体を洗浄され、標識した抗（抗ペプチ
   ド抗体）抗体が添加され、反応させられ、洗浄され、シ
   グナル試薬が添加され、そして該シグナルが読みとられ
   る、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】 前記動物が、ウシ、ヒツジ、およびブタ
   から選択され、そして前記組織サンプルが、そのような
   動物の死骸から採取される、請求項１〜５のいずれかに
   記載の方法。
7. 【請求項７】 ＣＮＳ組織のサンプル、適切には脊髄の
   横断面が試験のために使用される、請求項１〜６のいず
   れかに記載の方法。
8. 【請求項８】 動物におけるＴＳＥの検出のための試験
   キットであって、以下の一般式： 【化３】 を有する合成ペプチド配列に対して惹起される抗ペプチ
   ド抗体を含み、ここで、Ｒ₁は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、およ
   びＰｈｅから選択されるアミノ酸残基であり；Ｒ₂は、
   ＭｅｔまたはＶａｌのいずれかであり；Ｒ₃は、Ａｌａ
   であるか、または存在せず；Ｒ₄およびＲ₅は、独立して
   Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびＭｅｔから選択されるアミノ酸
   残基であり；括弧内の１つ以上の残基は存在するか、ま
   たは非存在であり得、ただし、それらが存在する場合、
   それらは配列内の残りのペプチドに付着され；そしてＸ
   およびＹは、各々独立して非存在であるか、または独立
   して１つ以上のさらなるアミノ酸残基であり得る、試験
   キット。