ES2334071T3 - Ensayo de infectividad. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para infectar una línea celular diana con un agente EET, que comprende: i) formar una preparación de membrana que contiene un agente EET de un primer tipo de célula animal en una primera membrana; y mezclar dicha preparación de membrana con una segunda membrana de un segundo tipo de célula animal; en el que el primer y segundo tipos de células animales son diferentes; ii) formar una membrana contigua que comprende dicho agente EET y dicha segunda membrana; iii) poner en contacto dicha línea celular diana con dicha membrana contigua; y así infectar dicha línea celular diana con dicho agente EET; en el que la segunda membrana es del mismo tipo de células animal que la de la línea celular diana.

Description

Ensayo de infectividad.

La presente invención se refiere a procedimientos para la promoción de la infección de una línea de cultivo celular con un agente EET para generar una línea celular infectadas, preferentemente una línea celular transfectadas de manera estable. La presente invención también se refiere a las utilizaciones de la línea celular infectada para la detección de un agente EET y para el diagnóstico de enfermedades EET, y para la identificación de agentes terapéuticos adecuados para tratar enfermedades EET.

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son una familia de trastornos neurodegenerativos que incluye la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (ECJ) y Kuru en humanos, la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en bovinos y tembladera en ovejas. Las EET presentan, como una enfermedad familiar, esporádica o iatrogénica, una frecuencia de aproximadamente 1 caso por millón de población (Will, 1993). Sin embargo, la aparición de una variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (vECJ) en el Reino Unido en la década de 1990 - posiblemente debido al consumo de productos cárnicos infectados con EEB (Bruce, et al, 1997; Hill et al, 1997) - ha planteado la posibilidad de niveles mucho más altos de incidencia de la ECJ.

La naturaleza de las enfermedades transmisibles EET se debe a una única entidad infecciosa, llamada prión, que se propone que no tiene componentes de ácidos nucleicos (Prusiner 1982). Las enfermedades EET se caracterizan por la formación de formas mutantes (PrP^{Sc}) de la proteína priónica celular normal (PrP^{c}). El prión mutante, PrP^{Sc}, es muy resistente a la degradación física y química. En particular, el PrP^{Sc} es muy resistente a la proteasa, en comparación con el prión normal, el PrP^{c}.

Los priones resistentes a la proteasa pueden producirse de manera hereditaria como resultado de mutaciones (es decir, enfermedad EET familiar), o de forma esporádica mediante un mecanismo aún no definido (es decir, enfermedad EET esporádica). Además, los priones resistentes a la proteasa pueden producirse por "infección" después de la exposición del prión normal del al prión exógenos resistente - por ejemplo, mediante transfusión de sangre infectada, mediante la implantación de tejido o trasplante, o mediante la exposición a la contaminación de productos médicos e instrumentos quirúrgicos (es decir, enfermedad EET iatrogénica).

Se han adoptado prácticas rigurosas en las industrias agrícolas y las que transforman carne para reducir el riesgo de contaminación cruzada entre animales infectados con EEB y de la carne que se destina al consumo humano. Sin embargo, los animales infectados con EEB todavía pueden ser procesados de manera no intencionada en mataderos, sobre todo si el animal está en las etapas tempranas de la enfermedad y, por lo tanto, sin ser detectado como un huésped infectados con EET. También hay un riesgo considerable en la eliminación de material infectado con EEB conocido, especialmente si el equipo utilizado en la operación de eliminación se vuelve a utilizar posteriormente en las prácticas de la manipulación normal sin una esterilización adecuada.

La naturaleza resistente proteolítica del prión PrP^{SC} significa que no se ve afectada gran parte por los procedimientos estándar de esterilización. Así, la combinación de estabilidad excepcional, diversas vías de transmisión y problemas con el diagnóstico y la detección tiene importantes consecuencias para la salud pública.

En particular, ha resultado difícil definir el nivel de riesgo de transmisión de enfermedades priónicas humanas a través de la cirugía, trasplante o transfusión. Hay casos bien documentados de transmisión a través de neurocirugía (Bernoulli et al 1977; Brown et al, 2000), trasplante de duramadre (Anon, 1987; Brooke et al, 2004), y utilización de hormona de crecimiento humano (Brown, et al, 2000; Swerdlow et al, 2003), todos relativos a formas esporádicas de la enfermedad. La posibilidad de transmisión a través de cirugía de rutina también existe, y algunos estudios han sugerido que una mayor tasa de ECJ esporádica se incrementa con el número de actos quirúrgicos que una persona pueda haber sufrido (Collins et al, 1999, Ward et al, 2002).

El largo período de incubación de la enfermedad, ya sea a nivel pre-clínico o sub-clínico (revisado por Hill y Collinge, 2003) significa que actualmente no es posible estimar el número de personas portadoras de la enfermedad. Todos estos portadores, independientemente de si se van a desarrollar los síntomas, puede ser capaces de transmitir la enfermedad a otras personas, especialmente las personas de un determinado genotipo más susceptibles, a través de cualquiera de las rutas descritas anteriormente.

La aparición de la vECJ ha hecho la estimación de los niveles de riesgo mucho más difícil, ya que determinados aspectos de su presentación difieren sensiblemente del de las formas más tradicionales. A modo de ejemplo, el agente de la vCJD se encuentra en niveles mucho más altos en tejido linfoide como las amígdalas y el apéndice (Hilton et al, 2002; Joiner et al, 2002) y el sistema nervioso periférico (Herzog et al). Ambas características sugieren que la transmisión iatrogénica de la vECJ es más probable que en las formas tradicionales de ECJ, debido al número mucho mayor de prácticas quirúrgicas relacionadas con estos tejidos, en comparación con la cirugía del sistema nervioso central (aunque el material de prión se ha encontrado en el músculo esquelético de pacientes con ECJ esporádica - Glatzel et al, 2003). En la actualidad existen buenas evidencias de que la vECJ, al menos, puede transmitirse mediante transfusión sanguínea (Llewelyn et al, 2004; Peden et al, 2004), lo que aumenta aún más el riesgo asociado con la cirugía de rutina y el manejo de instrumentos quirúrgicos contaminados.

Las áreas clave de incertidumbre, en parte, resultan de la falta de una detección adecuada y/o herramientas de diagnóstico para la investigación de las EET, dando lugar a problemas importantes para la gestión, tanto de las EET humanas como las animales.

Se han desarrollado varios procedimientos para el análisis post-mortem de material cerebral de bovinos sospechosos de estar infectados con la EEB, y éstas han sido adaptadas para el diagnóstico de la caquexia crónica en los ciervos. Sin embargo, actualmente no hay procedimientos para pruebas ante-mortem en animales.

La detección y el diagnóstico de todas las formas de la enfermedad EET humana son muy difíciles, porque no hay ningún procedimiento de detección validado actualmente disponible. El diagnóstico de personas sospechosas de estar infectadas con una enfermedad EET, por lo tanto, es muy difícil, con las mediciones neurofisiológicas y los resultados de comportamiento como principal criterio de diagnóstico, con el apoyo de biopsia de las amígdalas, y confirmación solamente post mortem. En este sentido, la biopsia de las amígdalas - aunque proporciona datos útiles de soporte para el diagnóstico - actualmente no es definitiva y no es propicia para su uso diagnóstico con fines de detección. En particular, la utilidad de la biopsia de la amígdala se limita a la detección de la vECJ (ya que el agente de priones vCJD no se encuentra en niveles significativos en el tejido de las amígdalas en la forma familiar, esporádica o iatrogénica de la ECJ).

La identificación del tipo de cepas EET sigue siendo un área importante de investigación, ya que la identificación de los orígenes de una de cepas EET puede ayudar a identificar el origen del agente, y puede aportar pruebas valiosas respecto a la ruta de la infección. Los procedimientos conocidos para identificar los orígenes de las cepas de EET incluyen diferentes procedimientos bioquímicos (que todavía no están totalmente demostrados) y bioensayos con cepas de origen animal múltiples para definir la relación de infectividad de la cepa aislada. Estos estudios consumen mucho tiempo, son costosos, y el trabajo con números de animales potencialmente grandes tiene implicaciones éticas.

Así, la disponibilidad de un procedimiento adecuado para la detección y el cultivo de las cepas de EET sería sumamente valioso, tanto en términos de ser capaz de reducir la dependencia de los ensayos con animales, sino también en términos de reducir el coste y el tiempo necesarios para el diagnóstico.

Aparte de su potencial de diagnóstico, las líneas celulares infectadas de forma transitoria o estable con el agente de EET, serían muy útiles para la detección de fármacos que sean capaces de interferir en la patogenia de la infección y para investigar los procesos que subyacen a la invasión celular y la muerte.

Así, el desarrollo de una línea celular EET infectable sería particularmente útil para desarrollar terapias para las enfermedades EET. Aunque se han sugerido una serie de modelos celulares, sólo un número muy limitado de estos modelos han demostrado que son capaces de propagar de manera estable las cepas de EET. Las líneas celulares descritas en la literatura se ven muy limitadas por la gama de agentes infecciosos que pueden ser utilizados. En más detalle, sólo un número limitado de líneas celulares pueden ser infectadas por una gama muy limitada de agentes EET.

Las únicas combinaciones publicadas son las líneas celulares N2a, SMB o GT7 infectadas con tembladera RML (véase, por ejemplo, WO 02/059615 y WO 03/081249, que describen N2a/RML sistemas infecciosos).

Una única publicación (Arjona et al, 2004) cita la infección de líneas celulares GT1 y N2a con los agentes de priones en humanos (ECJ esporádica). Aunque estos resultados aún no se han justificado, este documento describe la infección con cepas ECJ muy definidas y no aborda la cuestión más amplia de por qué ciertos tipos de células sólo pueden ser infectados por ciertos agentes.

Una serie de otros grupos han tratado de infectar líneas celulares con EEB, ECJ, otras cepas de tembladera y otros agentes EET, pero han sido infructuosos. Las razones para no ser capaz de generar modelos de infección celular para otras cepas EET (tales como EEB y vECJ) no están claras, pero pueden referirse a la necesidad de mantener un delicado equilibrio entre la propagación estable del agente infeccioso y la muerte celular, tal como se observa durante la infección por EET.

El documento WO 02/24871 describe un procedimiento para propagación in vitro del agente responsable de EET.

Fevrier B. et al., PNAS vol. 101 (26), 29 de junio de 2004, páginas 9683-9688 indica que las células liberan priones en asociación con exosomas.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de un modelo de infección de la célula que sea capaz de soportar la infección y/o la propagación de una serie de agentes/cepas EET, y por lo tanto ser útil para el diagnóstico de las EET y/o para la detección de la terapia potencial.

La presente invención responde a esta necesidad en la técnica, proporcionando un procedimiento para infectar una célula diana con un agente EET, tal como se define en las reivindicaciones.

El agente EET es preferentemente uno seleccionado entre el grupo que consiste en ECJ, vECJ, ECJ esporádica, ECJ familiar, ECJ iatrogénica, EEB, EEB ovina, y CWD. En otra realización, el agente EET puede ser tembladera.

En una realización preferida, la fuente del agente EET se selecciona entre el grupo que consiste en tejidos linfáticos (por ejemplo, amígdalas, apéndice, amígdalas rectales), tejidos neuronales (por ejemplo, cerebro, sistema nervioso central), y sangre (por ejemplo, linfocitos). En una realización, dichos tejidos o dicha sangre pueden ser de origen humano. En otra realización, dichos tejidos o dicha sangre pueden ser de origen bovino. En otras realizaciones, dichos tejidos o dicha sangre pueden ser de origen ovino/ciervos.

El procedimiento de la presente invención permite que las células resistan la muerte celular durante las primeras etapas de la exposición al agente infeccioso EET, lo que permite que las células propaguen el agente de forma estable durante el posterior crecimiento y división celular. En una realización, las líneas celulares infectadas de la presente invención demuestran estabilidad durante al menos 2 semanas, típicamente por lo menos 4 semanas. En una realización preferida, las líneas celulares infectadas demuestran estabilidad durante al menos 2 meses, preferentemente durante al menos 3 meses, y más preferentemente durante al menos 4 meses.

El procedimiento de la presente invención proporciona medios para permitir la infección de nuevas combinaciones de líneas celulares y agentes EET, superando así la "barrera de especies". En particular, el procedimiento es adecuado para el establecimiento de modelos para el diagnóstico de ECJ.

El procedimiento de la presente invención tiene una serie de aplicaciones útiles para el diagnóstico de las enfermedades EET y para el cribado de candidatos potenciales del fármaco, tal como se describe en detalle más adelante.

En una realización de la presente invención, la fuente de material infeccioso - por ejemplo, el cerebro los tejidos o la sangre de animales infectados (por ejemplo, cerebro de ratón VM infeccioso EEB-301V) - se mezcla con un intermediario (es decir, donantes) antes de la preparación de la membrana para la infección final de una célula diana. Esta mezcla se realiza en una etapa de mezcla específica, y preferentemente en ausencia sustancial de células enteras, antes de la posterior infección de la célula diana. Esta etapa de mezcla ayuda a mejorar la compatibilidad entre el tipo de EET y la célula objetivo final.

En una realización, el agente infeccioso no se purifica antes de mezclarse con la preparación de membrana del donante. En este sentido, es preferible que el agente infeccioso esté presente como parte de una preparación de la membrana (es decir, el agente infeccioso preferentemente se purifica para eliminar las células en conjunto, pero los componentes de la membrana se retienen).

Con la introducción del agente infeccioso en un intermediario (es decir, la membrana de un donante), el agente se integra en una membrana contigua en la que se presenta favorable para que se produzca la infección de células posteriormente. En este sentido, se ha postulado que un mecanismo para la conversión de células mediadas de PrP^{c} mediante PrP^{sc} implica el salto de PrP^{sc} intacta a la célula objetivo, incluyendo su anclaje GPI, y luego actuar en cis sobre otras moléculas PrP^{c} (Hooper, 2002). Mediante la inserción previa de la PrP^{sc} en una membrana intermediaria (es decir, donante), el procedimiento de la presente invención niega el requisito aparente de contacto celular directo entre el agente infeccioso y la célula diana, y aumenta la eficiencia global del proceso.

En una realización, los cofactores de células específicas, tales como dominios similares a cavéolas, están presentes en las preparaciones de membrana intermedias (es decir, donantes). Cuando están presentes, estos cofactores pueden ayudar a las etapas iniciales de la infección, y por separado, pueden actuar como acompañantes para facilitar la endocitosis y el tráfico en varios compartimentos intracelulares, y afectan a los diferentes procesos celulares. Por ejemplo, el transporte de agentes infecciosos en los lisosomas podría dar lugar a la inhibición o la sobrecarga de los organelos, que a su vez evita la capacidad de la célula de, a continuación, quitar/degradar las moléculas más infecciosas. El transporte de los agentes infecciosos en estos compartimentos, por lo tanto, puede ayudar a garantizar que la célula infectada sea estable y que las generaciones posteriores también permanezcan infectadas.

En una realización, las membranas intermedias (es decir, los donantes) de la presente invención (incluyendo el agente infeccioso integrado) ejercen un efecto directo en la célula diana. En este sentido, en el uso de la presente invención, dichas membranas (por ejemplo, en forma de microsomas o exosomas) son transportadas hacia las células objetivo utilizando las vías de endocitosis. Estas vías pueden conducir a rutas de degradación de la célula diana (por ejemplo, lisosomas), que se sobrecarga, lo que permite que el agente infeccioso se establezca en la célula diana.

Las células están normalmente expuestas al agente infeccioso durante 24-96 horas. El tiempo exacto depende de la concentración de inóculo, que puede requerir incubaciones más largas para preparaciones "más débiles", o por el contrario un periodo de tiempo donde haya una considerable muerte celular bajo exposición. El inóculo se elimina mediante cambios del medio y la extensión de la infección se monitoriza mediante procedimientos inmunológicos para la detección de PrP^{sc}, tal como se describe en los siguientes ejemplos. Después de aproximadamente 1-2 semanas posteriores a la exposición, las poblaciones de células infectadas de forma transitoria mueren o se infectan de manera estable. Estas líneas celulares tienen una vida útil de entre 3 a 4 meses y son capaces de dividirse cuando sea necesario, sin pérdida de PrP^{sc} o su morfología distintiva.

Una amplia gama de diferentes tipos de preparaciones de membrana puede ser utilizadas como el "donante" en la presente invención. Preferiblemente, la membrana donante está presente en forma de una preparación sustancialmente libre de células (es decir, que no incluye las células enteras que contienen los núcleos intactos). Preferiblemente, la membrana de los donantes está sustancialmente libre de priones (especialmente libre de PrP^{sc}). Preferiblemente, la membrana donante es un tipo que es diferente del material de la fuente de tipo celular del agente infeccioso (es decir, TSE).

La centrifugación forma la base de la mayoría de los procedimientos para el enriquecimiento de las fracciones de membrana - por ejemplo, membranas microsomales o exosomales. A modo de ejemplo, una fracción microsomal total de crudo se puede preparar usando la aproximación basada diferencial relativamente simple, que permite el aislamiento de las membranas que comprenden vesículas derivadas de todos los tipos de membranas celulares - incluyendo la membrana plasmática, la retícula endoplasmática y Golgi, por ejemplo. Muchos de los cuerpos intracelulares a partir de los cuales se derivan las membranas han sido asociados con PrP^{sc}, el agente infeccioso putativo. Este tipo de preparación, por lo tanto, constituye una fuente de membranas que se asocian con las formas extracelulares e intracelulares del agente del prión en varias etapas de procesamiento, junto con cualquier cofactor requerido para la infectividad.

Alternativamente, se pueden utilizar fracciones de enriquecimiento, tales como preparaciones de membrana de plasma enriquecido o de membrana endosómica. En este sentido, la membrana plasmática y las membranas endosómica se cree que son uno de los sitios principales para la propagación del prión.

Una gama de técnicas de enriquecimiento convencionales se pueden utilizar para el refinamiento de la fracción microsomal - por ejemplo, centrifugación de gradiente de densidad y/o separación de fase dependiente de la temperatura, utilizando Triton X-114 (C Bordier, 1981).

Por ejemplo, la separación de fase dependiente de la temperatura utilizando Triton X-114 facilita el aislamiento de "dominios de balsa" de lípidos resistentes al detergente, o dominios similares a cavéolas, que se ha demostrado que contienen un alto nivel de infecciosidad (Safar et al. 1990). Estos dominios también han demostrado ser importantes en la conversión de PrP^{c} a PrP^{sc} (Taraboulos, 1995).

La mezcla de material infeccioso y las preparaciones de membrana celular intermedias (es decir, donantes) se puede realizar mediante cualquier procedimiento convencional - por ejemplo, procedimientos que implican la simple mezcla, corte del material infeccioso en la preparación de la membrana, y la generación de preparaciones de membrana fundida después de la interrupción de la célula limitada y la fusión posterior.

Diferentes metodologías pueden utilizarse para promover la interacción entre el agente infeccioso y las preparaciones de membrana donantes, y/o entre la preparación de la membrana fundida resultante y las células diana. Por ejemplo, es conocido el uso de polietileno glicol (PEG) para crear una línea celular productora de anticuerpo inmortal mediante la fusión de células B que producen anticuerpos intactos con un tipo de células del melanoma. El PEG también puede ser utilizado para fusionar preparaciones de lisatos celulares/de membrana enriquecidas con materiales similares desde la fuente de infección. Lo mismo se aplica a la fusión final de la preparación de las preparaciones de membrana fundida resultantes y las células diana. Otros polímeros que compiten por el agua, tales como dextranos y poli(vinilpirrolidona) (PVP), también aumentan las interacciones intermoleculares entre las especies diferentes de la membrana. Otros lípidos, tales como agentes de transfección de ADN, O-alquilfosfatidilcolinas, también pueden utilizarse para promover la fusión de las membranas.

Otros medios para promover la interacción entre el agente infeccioso y de las membranas donantes (también entre las membranas fusionadas resultantes y las células diana) es alterando el contenido de lípidos presentes en la bicapa lipídica por sí mismas antes de la lisis celular y la purificación mediante la adición de productos químicos al medio celular. Así, en una realización, un agente infeccioso, las membranas donantes y/o las células diana son tratadas para eliminar los componentes de la superficie celular que podrían interferir con el proceso de infección, o en el caso de los agentes infecciosos y las membranas donantes, para enriquecer las fracciones como las subfracciones de la membrana celular, las balsas de lípidos o las membranas endosómicas que potencialmente mejoran el proceso de infección. A modo de ejemplo, se sabe que el monooleato de glicerol, el ácido oleico y el ácido araquidónico, son todos capaces de desestabilizar la bicapa y promover así la fusión de la membrana (McIntosh, 1999). Además, la adición de un inhibidor de la sintetasa de ceramida, tal como fumonisina B1, reduce la cantidad de esfingolípidos presentes en las balsas de lípidos. Esto se ha demostrado que conduce a mayores niveles de PrP^{sc} en una célula infectada (Naslavsky, 1999).

En una realización, se pueden utilizar la sonicación para desestabilizar las membranas, contribuyendo así a la interacción entre los agentes infecciosos y las membranas donantes, y/o la fusión entre las membranas (es decir, las membranas donantes con el agente infeccioso integrado) y las células diana.

Así, la extensión de la fusión de la membrana puede controlarse mediante una combinación de medios físicos y químicos.

En una realización, la línea celular objetivo utilizada para las infecciones puede coincidir con las especies animales y/o el tipo de célula en el que el agente infeccioso (es decir, el agente EET) ha sido detectado. A modo de ejemplo, la línea celular de neuroblastoma N2a de ratón puede estar infectada con EEB-301V o vECJ pasada de ratón. También a modo de ejemplo, las líneas celulares de neuroblastoma humano tal como Kelly, NB69 y SK-N-SH pueden estar infectadas con material humano vCJD de células neuronales primarias o inmortalizadas, de origen bovino o de ratón, derivadas de los ganglios de la raíz dorsal puede ser utilizadas como destino de la infección con EEB o el material EEB de ratón pasado, respectivamente. Además, las células no neuronales humanas, tal como la línea celular Caco-2 derivada del intestino, pueden utilizarse como destino de la infección con material de vECJ.

En una realización preferida, la línea celular objetivo y la línea celular en la que el agente infeccioso se ha detectado son ambas bovinas. En una realización más preferida, la línea celular objetivo y la línea celular en el que el agente infeccioso se ha detectado son ambas humanas.

En una realización alternativa, la línea celular objetivo utilizada para las infecciones no es necesario que coincida con la especie animal/tipo de células en las que el agente EET se ha detectado, dando lugar a una infección de especies mixtas. A modo de ejemplo, las líneas celulares objetivo N2a de ratón se pueden infectar con el material vCJD o ECJ no variante humano, tal como las formas familiar o esporádica de la enfermedad. La línea celular PC12 de rata de fenotipo neuronal se puede infectar con vCJD o ECJ no variante humano, o material EEB. La línea celular de no neuroblastoma humano, Caco-2, pueden infectarse con el material no humano, tal como EEB o tembladera pasada en ratón.

Así, en una realización, una línea celular de ratón puede infectarse con agente infeccioso de cobaya, tal como tembladera de cobaya.

Podrán aplicarse criterios de selección correspondientes en la elección de la membrana intermedia (es decir, donante) empleada. Esta selección se puede basar en una coincidencia con la membrana donante y/o con las especies animales/tipo celular en el que el agente infeccioso se ha detectado, por ejemplo, tal como se describió anteriormente. En una realización preferida, la selección se basa en una coincidencia entre la membrana donante y la célula diana. A modo de ejemplo, las membranas N2a donantes de ratón pueden combinarse con EEB pasado de ratón para infectar una línea celular murina, tal como N2a. Las membranas donantes humanas derivadas de células Kelly pueden combinarse con material vCJD o ECJ no variante para infectar una línea celular humana. La coincidencia se realiza preferiblemente a nivel de especies, aunque también puede (o por separado) realizarse en el nivel de tipo de células.

En una realización alternativa, sin embargo, no será necesario aplicar los criterios de coincidencia entre la membrana donante y/o las especies animales/tipo celular en el que el agente infeccioso se ha detectado. A modo de ejemplo, las membranas donantes murinas de células N2a pueden combinarse con material humano, tal como material vECJ o no vECJ para infectar las líneas celulares derivadas. Por el contrario, las membranas de células NB69 humanas pueden mezclarse con material EEB pasado de ratón para infectar las células derivadas murinas.

En una realización preferida, se emplea una especie animal coincidente y una combinación de tipo de células. Por ejemplo, material infeccioso de caquexia crónica (CWD) se combina con membranas donantes derivadas de una línea celular de neuroblastoma humano o de ratón. Esta fusión se utiliza para inocular el mismo tipo de célula que proporcionan las membranas donantes, creando así un ratón infectado con CWD crónica o una línea celular humana.

Para aumentar la variedad de especies/material mixto que puede generarse, el tipo de célula diana a infectar puede modificarse para coincidir más con las especies y/o el tipo de células a partir de las que el material infeccioso se ha derivado. Por ejemplo, usando un tipo de célula objetivo N2a (es decir, ratón) a infectarse con material infeccioso vCJD como ejemplo, la línea celular objetivo se puede modificar primero utilizando la interferencia de ARN (RNAi) para "knock-out" la expresión del PrP^{c} murino endógeno. Usando la tecnología convencional de expresión recombinante, esta línea celular "knock-out" se modifica para expresar el gen PrP^{c} humano (es decir, una célula N2a^{hPrPc}). Las membranas intermedias (es decir, donantes) se purifican a partir de este nuevo tipo de células, se mezclan con un agente infeccioso vECJ, y a continuación se utilizan para infectar la línea celular objetivo el N2a^{hPrPc} original. Un enfoque similar puede utilizarse con las formas familiares o esporádicas de la enfermedad.

Las membranas donantes "transgénicas" descritas anteriormente también pueden utilizarse para facilitar la infección de las líneas celulares objetivo de tipo salvaje. Utilizando el ejemplo N2a, las membranas se purifican a partir de tipo de células N2a^{hPrPc}, mezcladas con vCJD y a continuación se utilizan para infectar un tipo de células de neuroblastoma murino sin modificar, tal como la cepa GT1.

Otras combinaciones incluyen la modificación de líneas celulares de neuroblastoma murino o humano para expresar un PrP^{c} cérvido para crear un ensayo in vitro de CWD.

Se pueden utilizar membranas donantes "transgénicas" más complejas mediante fusión de las membranas de la célula diana con membranas derivadas de una línea celular no infectada de la misma especie que el agente infeccioso. Una vez más, usando el ejemplo N2a, las membranas N2a purificadas se fusionan con las membranas purificadas derivadas de una línea celular de neuroblastoma humano, tal como las de Kelly, para crear una preparación de membrana "transgénica" compleja. Esta se funde en una segunda etapa con agente vECJ y se utiliza para infectar la línea celular N2a. Del mismo modo, un proceso similar puede usarse para infectar una línea celular de neuroblastoma humano, tal como NB69, con EEB o CWD pasado de ratón.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de un agente EET en una muestra de células, que comprende:

iii)

poner en contacto dicha célula diana con una preparación de membrana, en el que la preparación de la membrana comprende el agente EET y una membrana donante;

iv)

infectar la célula diana con el agente EET, y

v)

detectar de la presencia del agente EET en la célula diana.

Todas las realizaciones descritas anteriormente para el primer aspecto de la presente invención se aplican igualmente al segundo aspecto de la presente invención.

Mediante el uso de este aspecto de la invención, un agente EET (presente en una muestra infectada) puede pasarse fácilmente, proporcionando así un medio sencillo y rápido para la propagación, proporcionando dicho agente EET una cantidad adecuada para su detección y, opcionalmente, el tipo de cepa (por ejemplo, mediante detección de anticuerpos o secuenciación del ADN).

Un área de aplicación de las líneas celulares producidas mediante el procedimiento de la presente invención reside en la capacidad para comprobar las muestras potencialmente infectadas, tal como sangre de donantes (por ejemplo, leucocitos), para la presencia de agentes de prión infeccioso. En este sentido, los agentes del prión infeccioso identificados en la sangre están asociados con distintas fracciones, siendo alrededor del 50% de la infección extracelular y estando el 50% asociado con los leucocitos. Los leucocitos son rutinariamente eliminados de la sangre donada en muchos países, incluido el Reino Unido, para reducir la posibilidad de transmisión de enfermedades, y este material es ideal para probarse a través de un modelo de infección celular de la presente invención.

Sin embargo, mientras que en la vCJD y la tembladera parece que hay una cantidad relativamente grande de infecciosidad en sangre, este no es el caso de las formas más esporádicas y familiares de ECJ. La detección de estos agentes infecciosos depende de la identificación de las muestras y/o el tejido que muestra la infectividad y que son razonablemente accesibles para el muestreo (por ejemplo, una serie de tejidos periféricos o líquido cefalorraquídeo). La razón para la detección de agentes de priones en muestras de tejido es similar a la descrita en la sangre (Head, 2004).

Otro riesgo potencial de infección cruzada viene de la utilización de productos de origen animal para la producción de fármacos biológicos derivados de cultivo celular. En este sentido, una línea celular podría estar contaminada con agente de EET endógena, y/o la infección puede ser introducida desde materiales de origen animal (por ejemplo, suero bovino fetal) utilizados en el crecimiento o el cultivo de la línea celular. El procedimiento de la presente invención es particularmente útil para la detección de agentes EET en estas situaciones, donde la cantidad de material infeccioso está probablemente muy por debajo del nivel de sensibilidad que ofrecen las pruebas in vitro, tales como Western blot.

Según un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de un tipo de cepa de agente EET en una muestra de células, que comprende:

i)

poner en contacto el agente EET de prueba, en los ensayos por separado, con una pluralidad de preparaciones de membrana donantes, en el que cada preparación de membrana donante comprende una membrana de una especie animal diferente;

ii)

en cada ensayo, mezclar el agente EET y la membrana donante respectiva para proporcionar una pluralidad de mezclas de membrana donante EET;

iii)

poner en contacto una pluralidad de dichas mezclas de membranas EET donantes, en ensayos por separado, con una célula diana; y

iv)

detectar de la presencia del agente EET en las células diana;

donde las especies animales de los componentes de la membrana donante de la célula diana(s) en la(s) que se detecta el agente EET es indicativa del tipo de cepa del agente EET en la muestra.

Una variación de la misma realización, que comprende:

i)

poner en contacto el agente EET de prueba, en ensayos por separado, con una pluralidad de preparados de membrana donante;

ii)

en cada ensayo, mezclar el agente EET y la membrana donante respectiva para proporcionar una pluralidad de mezclas de membrana donante EET;

iii)

poner en contacto una pluralidad de dichas mezclas de membrana donante EET, en ensayos por separado, con una pluralidad de células diana, en donde cada célula diana es de una especie animal diferente;

iv)

detectar de la presencia del agente EET en las células diana;

en donde la especie animal de la célula(s) diana en las que se detecta el agente EET es indicativa del tipo de cepa del agente EET en la muestra.

Todas las formas de realización descritas en relación con el primer aspecto de la presente invención se aplican igualmente al tercer aspecto de la presente invención.

Teniendo en cuenta su velocidad y sensibilidad, en una realización, el procedimiento de la presente invención también es útil para la caracterización de cepas. La diferenciación entre las cepas EET se logra mediante el uso de células diana (o membranas de múltiples donantes) que difieren en su susceptibilidad al agente EET en cuestión. A modo de ejemplo, el diagnóstico de una infección EEB en los ovinos se puede lograr mediante la incubación de muestras de cerebro de oveja con una serie de líneas celulares diana, según la presente invención. En consecuencia, el agente infeccioso sólo infecta las líneas celulares que son sensibles al agente. Alternativamente, las líneas celulares pueden mostrar una amplia gama de susceptibilidad a la infección. Refiriéndose al ejemplo anterior de EEB, el patrón de la infección será diferente del de, por ejemplo, la tembladera o ECJ, que demostrará una selectividad diferente para diferentes líneas celulares.

Para lograr esta selectividad, las líneas celulares diana pueden derivarse de una serie de diferentes especies animales. Alternativamente, para lograr la selectividad, las líneas celulares diana pueden diferenciarse mediante una serie de agentes no convencionales para modificar la respuesta celular. Como una alternativa más, las líneas celulares diana pueden tratarse con agentes modificadores glicoproteína/glucolípido convencionales diferentes para alterar la química de la superficie de las líneas celulares. Las técnicas y los reactivos adecuados son convencionales (Naslavsky, 1999).

Al igual que con el segundo aspecto de la presente invención, la infección se detecta preferentemente mediante la unión de anticuerpos a PrP^{sc}, y mediante la visualización posterior a través de, por ejemplo, ELISA o Western blot.

Según un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para evaluar la eficacia de una tecnología de descontaminación contra un agente EET, comprendiendo dicho procedimiento:

i)

exponer el agente EET a tecnología de descontaminación;

ii)

poner en contacto una primera célula diana con una preparación de membrana de prueba, en donde la preparación de membrana de prueba comprende el agente EET expuestos y una membrana donantes, e infectar la célula diana con el agente EET expuesto;

iii)

contactar una segunda célula diana con una preparación de membrana de control, donde la preparación de la membrana de control comprende agente EET expuesto y una membrana donante, e infectar la célula diana con el agente EET no expuesto; y

iv)

detectar la presencia del agente EET en la primera y segunda célula diana;

en donde una reducción del agente EET en la primera célula comparada con la segunda célula indica que la tecnología de descontaminación es efectiva.

Todas las formas de realización descritas en relación con el primer aspecto de la presente invención se aplican igualmente al cuarto aspecto de la presente invención.

En un aspecto, la primera y segunda células objetivo son de la misma especie animal, preferentemente, tanto del grupo que consiste en humanos, ovejas, vaca, ratón y ciervos.

En un aspecto, las células diana son del mismo tipo de célula (por ejemplo, células neuronales, tales como células de neuroblastoma, o células de fibroblastos).

En un aspecto, el componente de la membrana donante de la preparación de membrana de prueba y la preparación de la membrana de control son de la misma especie animal (preferiblemente ambos del grupo que consiste en humanos, ovejas, vacas, ratones y ciervos).

Cualquier tecnología de descontaminación se puede determinar utilizando este procedimiento, incluyendo procesos de descontaminación y/o productos químicos de descontaminación.

La referencia a un "agente EET expuesto" significa un agente EET que se ha expuesto a tecnología de descontaminación. Así, un "agente EET no expuesto" es un agente EET que no ha sido expuesto a tecnología de descontaminación.

En un aspecto, el agente EET puede estar expuesto a tecnología de descontaminación en la solución. Tras la exposición a la tecnología de descontaminación, la muestra puede requerir un tratamiento posterior - por ejemplo, centrifugación y/o lavado - para separar el agente de tratamiento de la tecnología de descontaminación, evitando así una muerte celular excesiva tras la incubación con la célula diana.

Alternativamente, el agente EET puede estar expuesto a tecnología de descontaminación en una fase sólida, por ejemplo un disco de metal - permitiendo así una determinación que se hará de las tecnologías de descontaminación para su uso en instrumentos quirúrgicos. Así, en un aspecto, el cuarto aspecto de la invención comprende además la etapa inicial de secado del agente EET en fase sólida, antes exponerse a la tecnología de descontaminación (por ejemplo, una tecnología de limpieza o desinfección). Las membranas donantes pueden incubarse con fases sólidas tratadas, lo que permite que se produzca la fusión y la conversión.

Al igual que con los aspectos segundo y tercero de la presente invención, la infección se detecta preferentemente mediante la unión de anticuerpos a PrP^{sc}, y la visualización posterior a través de, por ejemplo, ELISA o Western blot.

La eficacia de la tecnología de descontaminación puede examinarse como una reducción de registro de la infecciosidad, comparando el número de células infectadas para las fusiones de prueba con el número de células infectadas de las fusiones de control. Así, el cuarto aspecto de la invención permite hacer comparaciones directas de la eficacia de las diferentes tecnologías de descontaminación.

La presente invención se describe ahora con referencia a las figuras, en las que:

La figura 1A muestra morfologías celulares de células N2a siguiendo con EEB-301V;

La figura 1B muestra la inmunodetección de PrP^{C/Sc} en poblaciones celulares;

La figura 2 muestra la inmunodetección de PrP resistente a proteinasa K para células con EEB- 301V.

En mayor detalle, la figura 1A muestra la morfología celular distintiva de las células N2a con EEB-301V. En los paneles 1 y 2, puede apreciarse el desarrollo de neuritas extendidas. Grandes células granuladas con vacuolización clara se muestran en los paneles 3-6. Estas células granuladas también mostraron la agrupación de las células normales N2a en su superficie celular (grupos 3 y 5). No se observan morfologías equivalentes en las células N2a en el cultivo en una etapa comparativa. Aumento x20 (paneles 1 y 2), x80 (grupos 3-6).

La figura 1B muestra ELISPOT mostrando inmunodetección de PrP^{C/Sc} en poblaciones celulares. El panel A muestra la inmunotinción de PrP^{c} para las células N2a en medio solo (panel A1), tras la adición de homogenado cerebral normal (2), o la preparación de membrana microsomal (3). La señal PRP^{C} se retira después de la digestión de la proteinasa K (véase el panel 4). Como control positivo; se filtró homogenado de cerebro infeccioso EEB 301V y se digiere con proteinasa-K demostrando la detección de PrP^{Sc} (panel 5). El panel B muestra la inmunotinción de los distintos clones de células N2a después del juntarse con homogenado de cerebro infeccioso EEB-301V y el cultivo posterior. Los clones de células muestran distintos patrones de inmunotinción, que permanecen después de la digestión con proteinasa K (paneles B1-6), confirmando así la infectividad de la célula.

La figura 2 ilustra ELISPOT mostrando inmunodetección de PrP resistente a proteinasa K para las células juntadas con EEB-301V. Las células juntadas con preparación de células de membranas microsomales en solitario (control MMP) o en combinación con homogenado infeccioso de cerebro de ratón EEB-301V (de los pozos iniciales C10, C7, C2, F4, E5) se filtra a través de una placa ELISPOT. Todas las muestras, excepto para el control MMP, fueron tratadas con proteinasa K (PK, 5 \mug/ml, 37ºC, 90 min) de acuerdo con el protocolo descrito en los ejemplos a continuación. La membrana se bloqueó y sondó con 6H4 (Prionics), seguida de fosfatasa alcalina anti-ratón y color desarrollado con TMB. El tratamiento con proteinasa K eliminó la señal en el grupo de control MMP, pero la señal se mantuvo en varios clones procedentes de los pozos con la preparación MMP-iMBH (en particular, C7 clon 3, 7 y 8, C2 clon 3, clon F4 1 y el clon E5 2, 4, y 5).

Ejemplos

Ejemplo 1

Infección de una línea celular de neuroblastoma mediante agentes de prión Generación de preparaciones de membrana a partir de material de cerebro infeccioso

Las fracciones de membrana infecciosa se aislaron mediante una separación inicial del orgánulo intacto seguido de centrifugación diferencial para purificar las membranas. Se generó primero un homogenado crudo al 20% (w/v) mediante homogeneización de los cerebros en tampón de fosfato salino (PBS) usando un Stomacher. El homogenado crudo resultante también se cortó usando un mortero manual de seguridad que comprende un émbolo de PTFE y un recipiente de vidrio. La suspensión fina resultante fue sometida a 3 etapas de centrifugación: Etapa 1, 1000 g, 5 min, para eliminar las partículas grandes de material, etapa 2, 10000 g, 7 min, para eliminar orgánulos intactos tales como núcleos y mitocondrias; etapa 3, 100000 g, 60 min, para formar cuentas de membranas microsomales. Las membranas microsomales fueron resuspendidas en PBS al 20% (w/v) y almacenadas a -70ºC hasta su utilización. Alternativamente, si era necesaria una preparación más cruda de membrana microsomal, la etapa de centrifugación final consistió en 26000 g, 120 min.

Cultivo de líneas celulares de neuroblastoma, y preparación para la infección

Líneas celulares de neuroblastoma de ratón, tal como N2a o GT1, o líneas celulares de neuroblastoma humano, tal como Kelly, NB69 o SK-N-SH fueron cultivadas utilizando técnicas estándar de cultivo celular. El medio se basó en cualquiera de RPMI, MEM o DMEM: HAMS F12 con un 10-15% de suero bovino fetal (FCS) agregado en presencia o ausencia de 2 mm de glutamina y 1% de aminoácidos no esenciales. Además, se añadió entre un 1-5% de glucosa para aumentar el nivel de expresión de PrP^{c} y ayudar así el proceso de infección. En la preparación de las células para la infección, se dividieron utilizando una proporción adecuada para alcanzar una densidad celular de aproximadamente 1x104 células por pozo en una placa de 24 pozos. Dos días después de la división, las células estaban listas para ser infectadas.

Mezcla e incubación de preparados de la membrana celular

Este procedimiento da como resultado una nueva presentación del agente infeccioso asociado con cofactores asociados a la membrana de la célula diana para ayudar a la infección en el modelo celular.

La línea celular diana a infectar fue utilizada para preparar una fracción de membrana microsomal, tal como sigue. Las células diana fueron cultivadas bajo las mismas condiciones descritas anteriormente. Aproximadamente 1x10^{7} células fueron cosechadas, lavadas con PBS y lisadas. Las células fueron brevemente resuspendidas en tampón HEPES 10 mM, pH 7,5 + 1 mM EDTA, cóctel de inhibidores de proteasa (Complete, Roche Diagnostics GmbH) y se cortaron al pasar por una aguja 23G 5 veces. Un volumen igual de tampón de lisis que contenía sucrosa 500 mM fue añadido para mantener la integridad de los núcleos. La suspensión se inoculó de nuevo y se centrifugó a 6000 g durante 10 minutos para formar material en grandes partículas. El sobrenadante se centrifugó a 15500 g durante 4 horas a 4ºC. El sobrenadante resultante fue descartado y las cuentas, que contienen un una preparación de membrana microsomal en crudo, se resuspendió en PBS.

La fusión de los microsomas en crudo de la célula diana con material infeccioso en forma de homogeneizado crudo o una preparación de membrana enriquecida se logró mediante la combinación de los componentes en una proporción de 100 \mug de microsomas diana y 1500 \mug de material infeccioso (es decir, 1:15) y la inyección a través de una aguja de seguridad un total de 3 veces. La mitad del material fundido se aplicó entonces a las células diana por pozo en una placa de 24 pozos.

Cultivo y análisis de líneas celulares infectadas

Dos días después de la exposición al agente infeccioso, el medio fue sustituido y se monitorizó el índice de crecimiento de las células. El índice de crecimiento poco después de la infección tiende a reducirse y, por lo tanto, las células no requieren la división durante 7-10 días. En esta situación, se añadió medio nuevo en la parte superior de las células para mantener la viabilidad celular. Las células se dividieron en dos ocasiones cuando confluyen y se analizaron para determinar la infectividad (ver más abajo). Las células infectadas se mantuvieron en el medio estándar de cultivo de células tal como se describió previamente con la glucosa añadida y se dividen como se requiera.

La primera indicación de que las células han sido infectadas es que hay una considerable muerte celular, con las células restantes que tienen una morfología distinta (figura 1). Las células infectadas tienen un alto grado de vacuolización, que podría ser lisosomal en naturaleza, ya que las células pueden estar tratando de degradar el material infeccioso. Las células supervivientes produjeron neuritas que se extienden desde el cuerpo celular principal - indicando que tenía lugar la diferenciación de eventos.

La confirmación de la infecciosidad se realizó utilizando una técnica de transferencia de células basada en el procedimiento descrito por Klohn et al. (2003). Después de la división, alrededor de 5000 células fueron colocadas en un pozo de una placa de filtración de 96 pozos (Immobilon-P, Millipore) y se lava con PBS a través de succión y se deja secar durante 1 hora.

Para evaluar la presencia de PrP^{sc}, las células secas fueron tratadas con 5 \mug/ml de proteinasa K en tampón de lisis celular (10 mM Tris, 150 mM NaCl pH 7,2, 0,5% desoxicolato, 0,5% Tritón) durante 90 minutos a 37ºC. La membrana se lavó a continuación dos veces con PBS y se incubó durante 25 minutos a temperatura ambiente con inhibidor de proteasa APMSF (5 mM en PBS). La proteína en la membrana fue desnaturalizada en tampón de urea (6M urea en 10 mM Tris pH 8,0) durante 10 minutos a temperatura ambiente. La membrana se lavó 4 veces con PBS, se bloqueó durante 45 minutos a temperatura ambiente con leche desnatada 5% en PBS y se lavó una vez con PBS. El anticuerpo primario 6H4 fue añadido a la disolución 1:1000 en PBST que contenía leche desnatada 1% y la membrana se incubó durante 1 hora a 37ºC. La membrana se lavó 4 veces con PBST y se incubó con fosfatasa alcalina anti-ratón (1/1000 en PBST) durante 2 horas a 37ºC. Después del lavado de la membrana 4 veces con PBST, los anticuerpos unidos se detectaron mediante la adición de BCPT y reactivos NBT. Tras el desarrollo del color, la placa se lavó con agua y se filmó con una cámara digital.

La figura 2 muestra la identificación de las células infectadas con el procedimiento de transferencia de células. El patrón de manchas en la membrana se refiere a distintas colonias de células infectadas y se ofrece una estimación del nivel de infectividad presente en la muestra original.

La utilización de equipos de contaje ELISpot aumenta considerablemente el número de muestras que pueden ser controladas utilizando este procedimiento y tiene una sensibilidad próxima a la del bioensayo en ratones.

La confirmación de la infecciosidad puede lograrse mediante el uso de una variedad de distintos sistemas de detección basados en anticuerpos. El Western blot se realizó con ácido fosfotúngstico (PTA) para enriquecer la PrP^{sc} en lisados celulares (Safar et al, 1998). El PTA selectivamente precipita PrP^{sc}, dejando la forma no infecciosa, PrP^{c} en la solución. Entre 5.000-20.000 células se lisan en 300 ml de 10 mM Tris/HCl, pH 7,4 + 1 NP40%, 1% Triton X-100, 4% Sarcosil: se añadió PK a 25 mg/ml y se incubó durante 1 hora a 37ºC. La digestión se detuvo mediante la adición de Pefabloc (Roche Diagnostics GmbH) en 1 mM, y se añadió PTA al 0,3% en presencia de 170 mM MgCl_{2}, pH 7,4. Después de 16 h a 37ºC, el PrPsc precipitado se hizo en cuentas mediante centrifugación y se analizó mediante Western blot utilizando el anticuerpo específico del prión, 6H4, tal como se describe anteriormente. El patrón de bandas en la mancha también puede ayudar a la identificación del tipo de cepa (véase el ejemplo 8). Para detectar las isoformas PrP^{sc} sensibles a la proteinasa, se incorporó la metodología de PTA al inmunoanálisis dependiente de la conformación (CDI, Safar et al. 1998). Extractos de la célula fueron preparados por duplicado, tal como se describió anteriormente, con una alícuota desnaturalizada con GdnHCI. El anticuerpo anti-prión marcado con europio, 3F4, sólo es capaz de reconocer su epítope en PrP^{sc} después de la desnaturalización y, por lo tanto, la relación de la unión del anticuerpo entre las formas nativas y desnaturalizadas de la muestra permite determinar la cantidad de PrP^{sc} presente a través de medios fluorométricos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Procedimientos para promover la interacción y la fusión de las membranas modelo

Para promover la fusión de las membranas de diferentes tipos de células, los dos componentes fueron cortados a través de una aguja fina (véase el Ejemplo 1).

Para la caracterización de las vesículas, se utilizó microscopía electrónica (EM) para determinar el rango de tamaño de las partículas formadas. Las vesículas que son demasiado grandes (> 250 nm) puede que no se endocitosen de manera efectiva mediante la célula diana y, por lo tanto, afectan a la infectividad. Sin embargo, el rango de tamaño de las partículas producidas puede controlarse mediante la variación del consumo de energía en el sistema y el uso de diferentes concentraciones de productos químicos. Además, EM ventajosamente permite estimar el porcentaje de las membranas derivadas del retículo endoplasmático rugoso (rER) en la preparación de la membrana microsomal. Mediante el uso de una serie de marcadores específicos para las membranas de las enzimas derivadas de los organelos de la célula principal, puede también caracterizarse de manera precisa la composición de la preparación de la membrana. Por ejemplo, en la determinación de la 5'- nucleosidasa, la actividad indica la presencia de fragmentos de membrana plasmática, y la determinación de la actividad de bD-galactosidasa, indica la presencia de material derivado lisosomal.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Aislamiento de la membrana de plasma enriquecida y de las membranas endosómicas

Diferentes tipos de membrana donante y/o agente infeccioso pueden utilizarse para lograr la infección o para variar la selectividad de la prueba. Para preparar una preparación de plasma más enriquecido, los homogeneizados procedentes de tejidos o células se someten a una velocidad de rotación baja como para la preparación de una preparación en crudo de la membrana microsomal. Las cuentas de esta etapa se resuspenden en 71% de sacarosa, se transfieren a tubos de centrifugación y se recubren con un 53% y 42% de sacarosa y se centrifuga a 100000 g durante 1 h. Las membranas plasmáticas de alta pureza de banda y justo por encima del 42% - 53%. Usando diferentes concentraciones de sacarosa, también se puede lograr la purificación de las membranas asociadas con endocitosis, tales como los lisosomas o endosomas. La combinación de la sacarosa por encima de la técnica de centrifugación de gradiente con separación de fases Triton X-100 permite un mayor nivel de depuración para lograr como resultado el aislamiento de microdominios particulares, "balsas de lípidos", dentro de las membranas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Cribado de sangre donada para detectar la presencia de agentes infecciosos de priones

Los leucocitos son sistemáticamente eliminados de la sangre donada, y una variedad de dispositivos de filtración están disponibles comercialmente y serán conocidos por parte de los están familiarizados con la técnica. Después de la donación de sangre y de la leucorreducción, la unidad de filtro se desmonta y el filtro se lava para aislar la fracción de leucocitos.

Los leucocitos pueden ser tratados en este punto para facilitar el proceso de infección. A modo de ejemplo, los leucocitos se pueden tratar para aislar a las fracciones de membrana específicas, para eliminar el prión infeccioso anclado a GPI de la superficie de la célula, o para eliminar grupos glicosil de las glicoproteínas celulares a través de uno de los procedimientos descritos anteriormente.

La línea celular diana es preferiblemente una línea celular de neuroblastoma humano, tal como células Kelly o NB69 (Schwab, 1983), pero otras líneas celulares humanas también pueden ser adecuadas para soportar el proceso de infección.

Las fracciones de células infecciosas (preparadas tal como se describe anteriormente) son cortadas, junto con una preparación de membrana celular donante mediante el paso repetido a través de una aguja 23G: las células diana viables son expuestas a fusión, seguido de recubrimiento posterior en placas de cultivo de tejidos. Las células se cultivan durante un período de 7-14 días, o quizás durante más tiempo si es necesario para que se manifieste la infectividad, y los gránulos de células y/o el sobrenadante se recogen mediante ELISpot en una membrana de nitrocelulosa o
PVDF.

El ELISpot es sondeado con un anticuerpo anti-prión (por ejemplo, 6H4 Prionics), que tiene un epítope que es resistente a la digestión de proteinasa K de las preparaciones filtradas con membrana. Esto se realiza para identificar la presencia de PrP^{Sc} plegado resistente a la proteasa, que se cree que es indicativo de la enfermedad. Alternativamente, el filtro se sondea con un anticuerpo que es específico para la forma no plegada y no reconoce la forma celular normal, PrP^{c}. Preferiblemente, el anticuerpo es específico para la forma del prión infeccioso que está presente en la sangre, ofreciendo así la especificidad adicional para el procedimiento de detección. Las muestras positivas son las identificadas con material inmunorreactivo de priones en comparación con el control negativo de células no infectadas y leucocitos normales.

Las unidades de sangre se ponen en cuarentena hasta que se conocen los resultados de las pruebas y, si es negativo para infectividad de priones, las unidades se liberan posteriormente para su uso.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Detección de priones infecciosos en otras muestras ECJ esporádica

Muestras de LCR se toman de personas sospechosas de tener ECJ esporádica. La muestra se centrifuga para aislar las células intactas del LCR que es probable que incluyan astrocitos, gliales y posiblemente algunas células neuronales (aunque la presencia de células neuronales no es esencial para el éxito de la prueba). Las cuentas de células se mezclan con una preparación de membrana donante, por ejemplo, derivada de la línea celular diana, tal como células de neuroblastoma humano (tal como SK-N-SH células) y las membranas se funden mediante el uso de PEG o tratamientos similares. Las células diana viables se exponen a la preparación de membrana fundida y se colocan en placas de cultivo de tejidos y las muestras se incuban durante el período de tiempo requerido. La infección se detecta mediante ELISpot con la membrana sondeada con anticuerpos anti-prión adecuados, ya sea directamente o después de la digestión con Proteinasa K.

Opcionalmente, los modelos descritos en los ejemplos 1-3 pueden utilizarse para optimizar y/o mejorar la absorción de material infeccioso en la línea celular.

Tembladera

Un segundo ejemplo se refiere a la detección de tembladera en células aisladas de un hisopo bucal de una oveja sospechosa. Estas células se recogen mediante centrifugación como anteriormente y se mezclan con una preparación derivada de una membrana de la célula diana, tal como la línea celular de neuroblastoma de ratón N2a. Opcionalmente, una línea celular transgénica que expresa una PrP ovina en la línea celular N2a, en la que el gen PrP nativo de ratón se ha eliminado mediante técnicas convencionales, se puede utilizar como línea celular diana. Las células bucales se incuban con una preparación de membrana donante, por ejemplo, derivada de la célula diana, con las membranas unidas mediante cualquiera corte o fusión de la membrana (tal como se describió anteriormente). Las células diana viables se incuban con las membranas se fusionan y se colocan en placas y se analizan tal como se describió anteriormente.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Uso del modelo de la infección de células para probar las líneas de cultivo celular farmacéuticas para la infección de priones

La línea celular diana de interés se cultiva en condiciones estándar según sea necesario. Se toman células de los cultivos de crecimiento activo o de los cultivos que se han diferenciado para detener la progresión del ciclo celular. Las células se recogen, se forman en cuentas mediante centrifugación y las cuentas de células mezcladas con una preparación de membrana donante (por ejemplo, derivados de células diana preparados con uno de los procedimientos descritos anteriormente). Los procedimientos de fusión basados corte o sonicación ayudan a asegurar que las células en cuentas se lisan durante este proceso y ayuda a garantizar la integración eficiente del sistema de dos componentes. La fusión de la membrana resultante se utiliza para inocular las preparaciones de célula diana, que se colocan en placas y crecen el tiempo suficiente para permitir la infección de la célula diana, y a continuación se cultivan para proporcionar material suficiente para el análisis. A continuación las células pueden evaluarse para infección mediante ELISpot o Western blot, según proceda.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

Utilización de una línea celular infectada para la lucha contra los ensayos de fármacos candidatos anti-priones

Las líneas celulares diana infectadas son generadas mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente. Una vez establecidas, las líneas celulares pueden ser utilizadas para probar los agentes propuestos para tener algún tipo de actividad contra el prión. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que se une a PrP^{Sc} se incuba con la línea celular en una variedad de concentraciones y en diversos cursos de tiempo. La línea celular se evalúa para la producción continua de PrP^{Sc} tras el tratamiento de anticuerpos y esto se compara con los controles de células no tratadas y las células tratadas con un anticuerpo del mismo isotipo pero no dirigido a PrP. ELISpot o Western blot con anticuerpos adecuados se utilizan para evaluar los efectos de los anticuerpos en la propagación del prión. Los candidatos potencialmente interesantes son identificados como los que reducen los niveles de PrP^{Sc} producido por la célula y que lo hace en concentraciones que son compatibles con su uso terapéutico.

Procedimientos similares se aplican en el cribado de candidatos de fármaco, para el uso de estrategias "marcado génico" dirigidas a la prevención de acumulación de PrP^{Sc}, y para otros procedimientos terapéuticos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

Uso del modelo de la infección celular para la tipificación de cepas EET

Un panel de líneas celulares de diferentes destinatarios se crea utilizando una variedad de diferentes técnicas.

Inicialmente, se identifican modelos de células de neuroblastoma u otras dianas de una serie de diferentes especies y/o genotipos PrP. Esto podría, por ejemplo, incluir las líneas celulares de neuroblastoma humano (por ejemplo, Kelly, NB69, SK-N-SH); neuroblastomas de ratón/rata (N2a, PC12); líneas celulares transgénicas con genes de PrP alterado (por ejemplo, N2a con gen PrP ovino, bovino o humano), y líneas celulares inmortalizadas de diferentes regiones del cerebro (por ejemplo, hipocampo, sustancia negra, bulbo raquídeo, tálamo y otros).

Estas líneas celulares se pueden tratar, además, con reactivos químicos que alteran el patrón de glicosilación de ciertas proteínas y/o las propiedades superficiales de la línea celular (por ejemplo, reactivos para modificar la síntesis de colesterol, línea celular deficiente en gangliósido N2a, líneas celulares negativas en glicosiltransferasa (por ejemplo, líneas celulares alfa(1,2) fucosiltransferasa), negativas en glicohidrolasa o reactivos químicos que logran efectos similares), o que alteran el tráfico intracelular de vesículas unidas a la membrana (por ejemplo, neurotoxinas botulínicas, brefeldina A, bafilomicina). El panel preciso de líneas celulares que se utilizarán para el estudio puede depender del agente infeccioso y de sus orígenes.

Para evaluar el tipo de cepa, la muestra (por ejemplo, cerebro o las células blancas de la sangre) se mezcla primero con una preparación de membrana donante purificada a partir de una serie de células diana diferentes de acuerdo con los protocolos mencionados anteriormente. Las membranas celulares y el agente infeccioso que se probarán se mezclan con o sin corte, según corresponda, y se aplican a la correspondiente línea celular diana a infectar, y las células se colocan en placas de cultivo de tejidos. Las líneas celulares se cultivan durante un mínimo de 7 días y la infección de células se evalúa mediante ELISpot y/o Western blot. La definición del tipo de cepa depende de la gama de líneas celulares infectadas y la correlación de esta información con los estudios previos con cepas EET de origen definido (Bruce, 2002).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

Uso de líneas celulares infectadas para evaluar la eficacia de las tecnologías de descontaminación contra agentes EET en la solución

Un panel de líneas celulares se configura tal como se describió anteriormente (Ejemplo 8), junto con sus membranas donantes respectivas.

Para demostrar la eficacia de una tecnología de descontaminación contra un agente EET en la solución, el agente se expuso por primera vez al proceso de descontaminación química o para la duración de tiempo determinada. Después de la exposición, la muestra, opcionalmente, puede requerir una centrifugación y/o lavado para separar el agente de tratamiento en el proceso de descontaminación o químico, para prevenir una muerte celular excesiva.

Las membranas donantes de las líneas celulares respectivas se funden con el agente de tratamiento mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente, y las células se colocan en placas de cultivo de tejidos. De manera similar, se establece el control de fusiones, consistente en el agente EET no tratado con las membranas donantes. Después de un periodo adecuado de tiempo, la extensión de la infección se determina mediante el procedimiento
ELISPOT.

\newpage

La eficacia de la tecnología de descontaminación puede expresarse como una reducción de la infecciosidad de registro mediante la comparación del número de células infectadas con la forma de fusiones de ensayo con el del control de fusiones.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Utilización de líneas celulares infectadas para evaluar la eficacia de las tecnologías de descontaminación contra agentes EET en instrumentos quirúrgicos

El ensayo de infectividad también se puede utilizar para evaluar las tecnologías de descontaminación para su uso en instrumentos quirúrgicos.

El agente infeccioso se seca sobre una fase sólida señal adecuada (por ejemplo, un disco de metal) y se expone a tecnología de limpieza o desinfección. Las membranas donantes se incuban con las fichas tratadas, utilizando los procedimientos descritos anteriormente, para permitir que se produzcan eventos de fusión y de conversión, seguidos por incubación con las células diana. De manera similar, se establece el control de fusiones, consistente en el agente EET no tratado con las membranas donantes. Las células se retiran de las placas y se determina el número de infectados mediante ELISPOT.

Otra vez, una reducción de la infecciosidad de registro puede determinarse por comparación con el grupo de control infeccioso sin tratamiento, lo que permite realizar comparaciones directas sobre la eficacia de las diferentes tecnologías de descontaminación.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias

D. O. V. Alonso, S. J. DeArmond, F. E. Cohen and V. Daggett, Mapping the early steps in the pH-induced conformational conversion of the prion protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 2985-2989.

Anon. Update: Creutzfeldt-Jacob disease in a patient receiving a cadaveric dura mater graft. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 36 (1987) 324-325.

C. Bernoulli, J. Siegfried, G. Baumgartner, F. Regli, T. Rabinowicz, D. C, Gajdusek, and C. J. Jr. Gibbs. Danger of accidental person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jacob disease by surgery. Lancet. 1 (1977) 478-479.

C. Bordier. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-114 solution. J Biol Chem. (1981);256 (4) 1604-1607

D. C. Bolton, M. P. McKinley and S. B. Prusiner, Identification of a protein that purifies with the scrapie prion, Science 218 (1982) 1309-1311.

F. J. Brooke, A. Boyd, G. M. Klug, C. L. Masters and. S. J. Collins. Lyodura use and the risk of iatrogenic Creutzfeldt-Jacob disease in Australia Med J Aust. 180 (2004) 177- 181.

P. Brown, M. Preece, J. P. Brandel, T. Sato, L. McShane, I. Zerr, A. Fletcher, R.G. Will, M. Pocchiari, N. R. Cashman, J. H.. d'Aignaux, L. Cervenakova, J. Fradkin, L. B. Schonberger and S. J. Collins. Iatrogenic Creutzfeldt-Jacob disease at the millennium. Neurology. 55 (2000) 1075-1081.

M. Bruce, R. G. Will, J. W. Ironside, I. McConnell, D. Drummond, A. Suttie, L. McCardle, A. Chree, J. Hope, C. Birkett, S. Cousens, H. Fraser, and C. J. Bostock, Transmissions to mice indicate that "new variant" CJD is caused by the BSE agent, Nature 389 (1997) 498-501.

M. E. Bruce, A. Boyle, S. Cousens, I. McConnell, J. Foster, W. Goldmann and H. Fraser, J Gen Virol 83 (2002) 695-704.

B. Caughey, G. J. Raymond, D. A. Kocisko and P. T. Lansbury, Cell-free formation of protease-resistant prion protein, J. Virol. 71 (1997) 4107-4110.

H J. Cho, Inactivation of the scrapie agent by pronase, Can. J. Comp. Med. 47 (1983) 494-496.

S. Collins, M. G. Law, A. Fletcher, A. Boyd, J. Kaldor, and C. L. Masters. Surgical treatment and risk of sporadic Creutzfeldt-Jacob disease: a case-control study. Lancet. 353(1999) 693-697.

E. A. Croes, G. Roks, G. H. Jansen, P. C. Gnijssen, and C. M. van Duijn. Creutzfeldt-Jacob disease 38 years after diagnostic use of human growth hormone. Neurol Neurosurg Psychiatry; 72 (2002) 792-793.

B. S. De Silva, K. L. Egodage and G. S. Wilson. Purified protein derivative (PPD) as an immunogen carrier elicits high antigen specificity to happens. Bioconjug Chem. 10 (1999) 496-501.

H. Diringer, H. Gelderblom, H. Hilmert, M. Ozel, C. Edelbluth and R. H. Kimberlin, Scrapie infectivity, fibrils and low molecular weight protein, Nature 306 (1983) 476- 478.

G. Fichet, E. Comoy, C. Duval, K. Antloga, C. Dehen, A. Charbonnier, G. McDonnell, P. Brown, C. I. Lasmezas and J. P. Deslys. Novel methods

\hbox{for disinfection of prion-contaminated
medical devices.  Lancet . 364 ( 2004 ) 
521-6.}

M. Glatzel, E. Abela, M. Maissen, and A. Aguzzi. Extraneural pathologic prion protein in sporadic Creutzfeldt-Jacob disease. N Engl J Med. 349 (2003) 1812-1820.

A. H. Grobben, P. J. Steel, R. A. Somerville and D. M. Taylor, Inactivation of the bovine spongiform encephalopathy (BSE) agent by the acid and alkaline processes for manufacturing of bone gelatine, Biotechnol. Appl. Biochem. 39 (2004) 329-338.

D. L. Ritchie, M. W. Head, J. W. Ironside, Advances in the detection of prion protein in peripheral tissues of variant Creutzfeldt-Jacob disease patients using paraffin-embedded tissue blotting. Neuropathology & Applied Neurobiology 30 (2004), 360-368.

C. Herzog, N. Sales, N. Etchegaray, A. Charbonnier, S. Freire, D. Dormont, J. P. Deslys and C. I. Lasmezas. Tissue distribution of bovine spongiform encephalopathy agent in primates after intravenous or oral infection. Lancet. 363 (2004) 422-428.

A. F. Hill, M. Desbruslais, S. Joiner, K. C. Sidle, I. Gowland, J. Collinge, L. J. Doey, and P. Lantos. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389 (1997) 448-450.

A. F. Hill and J. Collinge. Subclinical prion infection. Trends Microbiol. 11 (2003) 578-584.

D. A. Hilton, A. C. Ghani, L. Conyers, P. Edwards, L. McCardle, M. Penney, D. Ritchie, and J. W. Ironside. Accumulation of prion protein in tonsil and appendix: review of tissue samples. BMJ. 325 (2002) 633-634.

S. Joiner, J. Linehan, S. Brandner, J. D. Wadsworth and J. Collinge. Irregular presence of abnormal prion protein in appendix in variant Creutzfeldt-Jacob disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 73 (2002) 597-598.

P. C. Klohn, and L. Stoltze, et al. (2003). "A quantitative, highly sensitive cell-based infectivity assay for mouse scrapie prions". Proc Natl Acad Sci U S A 100(20): 11666-71.

D. A. Kocisko, J. H. Come, S. A. Priola, B. Chesebro, P. T. Lansbury and B. Caughey, Scrapie infectivity correlates with converting activity, protease resistance, and aggregation of scrapie-associated prion protein in guanidine denaturation studies, Nature 370 (1994) 471-474.

J. P. Langeveld, J.-J. Wang, D. F. M. Van de Wiel, G. C. Shih, G. J. Garssen, A. Bossers and J. C. H. Shih, Enzymatic degradation of prion

\hbox{protein in brain stem from infected cattle and
sheep,  J. Inf. Dis . 188 ( 2003 )
1782-1789.}

C. A. Llewelyn, P. E. Hewitt, R. S. Knight, K. Amar, S. Cousens, J. Mackenzie, and R. G. Will. Possible transmission of variant Creutzfeldt-Jacob disease by blood transfusion. Lancet. 363 (2004) 417-221.

N. Naslavsky, H. Shmeeda, G. Friedlander, A. Yanai, A. H. Futerman, Y. Barenholz and A. Taraboulos, J. Biol. Chem. 274 (1999) 20763-20771.

A. H. Peden, M. W. Head, D. L. Ritchie, J E. Bell, and J. W. Ironside. Preclinical vCJD after blood transfusion in a PRNP codon 129 heterozygous patient. Lancet. 364 (2004) 527-529.

S B. Prusiner, Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie, Science 216 (1982) 136-144.

R. Rubenstein, R. I. Carp, W. Ju, C. Scalici, M. Papini, A. Rubenstein and R. Kascsak, Concentration and distribution of infectivity and PrPSc following partial denaturation of a mouse-adapted and a hamster-adapted scrapie strain, Arch. Virol. 139 (1994) 301-311.

Safar, J., H. Wille, et al. (1998). "Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations". Nat Med 4(10): 1157-65.

Safar, J., M. Ceroni, et al. (1990). "Subcellular distribution and physicochemical properties of scrapie-associated precursor protein and relationship with scrapie agent". Neurology 40(3 Pt 1): 503-8.

Schwab, M., et al. (1983). "Amplified DNA with limited homology to myc cellular oncogene is shared by human neuroblastoma cell lines and a neuroblastoma tumour". Nature 305 (5931): 245-248.

A. J. Swerdlow, C. D. Higgins, P. Adlard, M. E. Jones, and M. A. Preece. Creutzfeldt-Jacob disease in United Kingdom patients treated with human pituitary growth hormone. Neurology. 61(2003) 783-791.

D. M. Taylor, H. Fraser, I. McConnell, D. A. Brown, D. L. Brown, K. A. Lamza and G. R. Smith, Decontamination studies

\hbox{with the agents of bovine spongiform encephalopathy and
scrapie,  Arch.  Virol . 139 ( 1994 )
313-326.}

D. M. Taylor. Inactivation of transmissible degenerative encephalopathy agents: A review. Vet J. 159 (2000) 10-17.

D. M. Taylor, Transmissible degenerative encephalopathies. Inactivation of the causal agents, in: Principles and practice of disinfection, preservation and sterilisation. A. D. Russell, W. B. Hugo and G. A. J. Ayliffe (Eds.) Blackwell Scientific Publications, Oxford (1999) pp 222-236.

D. M. Taylor, Resistance of transmissible spongiform encephalopathy agents to decontamination, Contrib. Microbiol. 7 (2001) 58-67.

D. M. Taylor, K. Fernie, P. J. Steele, I. McConnell and R. A. Somerville, Thermostability of mouse-passaged BSE and scrapie is independent of host PrP genotype: implications for the nature of the causal agents, J. Gen. Virol. 83 (2002) 3199-3294.

D. M. Taylor. Resistance of transmissible Spongiform encephalopathy agents to decontamination. Contrib Microbiol. 11 (2004) 136-145.

H. J. Ward, D. Everington, E. A. Croes, A. Alperovitch, N. Delasnerie-Laupretre, I. Zerr, S. Poser, and C. M. van Duijn. Sporadic Creutzfeldt-Jacob disease and surgery: a case-control study using community controls. Neurology. 59 (2002) 543-548.

G. A. Wells, Pathology of nonhuman spongiform encephalopathies: variations and their implications for pathogenesis, Dev. Biol. Stand. 80 (1993) 61-69.

R. G. Will, Epidemiology of Creutzfeldt-Jacob disease, Br. Med. Bull. 49 (1993) 960-970.

J. H. Wille, G.-F. Zhang, M. A. Baldwin, F. E. Cohen and S. B. Prusiner, Separation of scrapie prion infectivity from PrP amyloid polymers, Mol. Biol. 259 (1996) 608-621.

D. J. Weber and W. A. Rutala. Creutzfeldt-Jacob disease: recommendations for disinfection and sterilization. Clin Infect Dis. 32 (2001) 1348-1356.

D. J. Weber and W. A. Rutala. Managing the risk of nosocomial transmission of prion diseases. Curr Opin Infect Dis. 15 (2002) 421-425.

S. van der Werf; J. P. Briand, S. Plaue, J. Burckard, M. Girard, and M. H. Van Regenmortel. Ability of linear and cyclic peptides of neutralization antigenic site 1 of poliovirus type 1 to induce virus cross-reactive and neutralizing antibodies. Res Virol. 145 (1994) 349-359.

Z. X. Yan, L. Stitz, P. Heeg, E. Pfaff, K. Roth. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25(2004) 280-283.

W. Q. Zou and N. R Cashman, Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form, J. Biol. Chem. 277 (2002) 43942-43947.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 02059615 A [0017]

\bullet WO 03081249 A [0017]

\bullet WO 0224871 A [0020]

Documentos citados en la descripción

\bulletFevrier B. et al. PNAS, 29 June 2004, vol. 101(26),9683- 9688 [0021]

\bullet D. O. V. Alonso; S. J. DeArmond; F. E. Cohen; V. Daggett. Mapping the early steps in the pH-inducedconformational conversion of the prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, vol. 98, 2985-2989[0122]

\bullet Anon. Update: Creutzfeldt-Jakob disease in a patient receiving a cadaveric dura mater graft. MMWR Morb Mortal Wkly Rep., 1987, vol. 36, 324-325 [0122]

\bullet C. Bernoulli; J. Siegfried; G. Baumgartner; F. Regli; T. Rabinowicz; D. C, Gajdusek; C. J. Jr. Gibbs. Danger of accidental person-to-persontransmission of Creutzfeldt-Jakob disease by surgery. Lancet, 1997, vol. 1, 478-479 [0122]

\bullet C. Bordier. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-114 solution. J Biol Chem., 1981, vol. 256 (4), 1604-1607 [0122]

\bullet D. C. Bolton; M. P. McKinley; S. B. Prusiner. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science, 1982, vol. 218, 1309-1311 [0122]

\bullet F. J. Brooke; A. Boyd; G. M. Klug; C. L. Masters; S. J. Collins. Lyodura use and the risk of iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease in Australia. Med J Aust., 2004, vol. 180, 177-181 [0122]

\bullet P. Brown; M. Preece; J. P. Brandel; T. Sato; L. McShane; I. Zerr; A. Fletcher; R. G. Will; M. Pocchiari; N. R. Cashman. Iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease at the millennium. Neurology, 2000, vol. 55, 1075-1081 [0122]

\bullet M. Bruce; R. G. Will; J. W. Ironside; I. McConnell; D. Drummond; A. Suttie; L. McCardle; A. Chree; J. Hope; C. Birkett. Transmissions o mice indicate that "new variant" CJD is caused by the BSE agent. Nature, 1997, vol. 389, 498-501 [0122]

\bullet M. E. Bruce; A. Boyle; S. Cousens; I. McConnell; J. Foster; W. Goldmann; H. Fraser. J Gen Virol, 2002, vol. 83, 695-704 [0122]

\bullet B. Caughey; G. J. Raymond; D. A. Kocisko; P. T. Lansbury. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. J. Virol., 1997, vol. 71, 4107-4110 [0122]

\bullet H. J. Cho. Inactivation of the scrapie agent by pronase. Can. J. Comp. Med., 1983, vol. 47, 494-496. [0122]

\bullet S. Collins; M. G. Law; A. Fletcher; A. Boyd; J. Kaldor; C. L. Masters. Surgical treatment and risk of sporadic Creutzfeldt-Jakob disease: a case-control study. Lancet, 1999, vol. 353, 693-697 [0122]

\bullet E. A. Croes; G. Roks; G. H. Jansen; P. C. Gnijssen; C. M. van Duijn. Creutzfeldt-Jakob disease 38 years after diagnostic use of human growth hormone. Neurol Neurosurg Psychiatry, 2002, vol. 72, 792-793 [0122]

\bullet B. S. De Silva; K. L. Egodage; G. S. Wilson. Purified protein derivative (PPD) as an immunogen carrier elicits high antigen specificity to happens. Bioconjug Chem., 1999, vol. 10, 496-501 [0122]

\bullet H. Diringer; H. Gelderblom; H. Hilmert; M. Ozel; C. Edelbluth; R. H. Kimberlin. Scrapie infectivity, fibrils and low molecular weight protein. Nature, 1983, vol. 306, 476-478 [0122]

\bullet G. Fichet; E. Comoy; C. Duval; K. Antloga; C. Dehen; A. Charbonnier; G. McDonnell; P. Brown; C. I. Lasmezas; J. P. Deslys. Novel methods for disinfection of prion- contaminated medical devices. Lancet, 2004, vol. 364, 521-6 [0122]

\bullet M. Glatzel; E. Abela; M. Maissen; A. Aguzzi. Extraneural pathologic prion protein in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. N Engl J Med., 2003, vol. 349, 1812-1820 [0122]

\bullet A. H. Grobben; P. J. Steel; R. A. Somerville; D. M. Taylor. Inactivation of the bovine spongiform encephalopathy (BSE) agent by the acid and alkaline processes for manufacturing of bone gelatine. Biotechnol. Appl. Biochem., 2004, vol. 39, 329-338 [0122]

\bullet D. L. Ritchie; M. W. Head; J. W. Ironside. Advances in the detection of prion protein in peripheral tissues of variant Creutzfeldt-Jakob disease patients using paraffin-embedded tissue blotting. Neuropathology & Applied Neurobiology, 2004, vol. 30, 360-368 [0122]

\bullet C. Herzog; N. Sales; N. Etchegaray; A. Charbonnier; S. Freire; D. Dormont; J. P. Deslys; C. I. Lasmezas. Tissue distribution of bovine spongiform encephalopathy agent in primates after intravenous or oral infection. Lancet, 2004, vol. 363, 422-428 [0122]

\bullet A. F. Hill; M. Desbruslais; S. Joiner; K. C. Sidle; I. Gowland; J. Collinge; L. J. Doey; P. Lantos. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature, 1997, vol. 389, 448-450 [0122]

\bullet A. F. Hill; J. Collinge. Subclinical prion infection. Trends Microbiol., 2003, vol. 11, 578-584 [0122]

\bullet D. A. Hilton; A. C. Ghani; L. Conyers; P. Edwards; L. McCardle; M. Penney; D. Ritchie; J. W. Ironside. Accumulation of prion protein in tonsil and appendix: review of tissue samples. BMJ, 2002, vol. 325, 633-634 [0122]

\bullet S. Joiner; J. Linehan; S. Brandner; J. D. Wadsworth; J. Collinge. Irregular presence of abnormal prion protein in appendix in variant Creutzfeldt-Jakob disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2002, vol. 73, 597-598 [0122]

\bullet P. C. Klohn; L. Stoltze et al. A quantitative, highly sensitive cell-based infectivity assay for mouse scrapie prions. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, vol. 100 (20), 11666-71 [0122]

\bullet D. A. Kocisko; J. H. Come; S. A. Priola; B. Chesebro; P. T. Lansbury; B. Caughey. Scrapie infectivity correlates with converting activity, protease resistance, and aggregation of scrapie-associated prion protein in guanidine denaturation studies. Nature, 1994, vol. 370, 471-474 [0122]

\bullet J. P. Langeveld; J.-J. Wang; D. F. M. Van de Wiel; G. C. Shih; G. J. Garssen; A. Bossers; J. C. H. Shih. Enzymatic degradation of prion protein in brain stem from infected cattle and sheep. J. Inf. Dis., 2003, vol. 188, 1782-1789 [0122]

\bullet C. A. Llewelyn; P. E. Hewitt; R. S. Knight; K. Amar; S. Cousens; J. Mackenzie; R. G. Will. Possible ransmission of variant Creutzfeldt-Jakob disease by blood transfusion. Lancet, 2004, vol. 363, 17-221 [0122]

\bullet N. Naslavsky; H. Shmeeda; G. Friedlander; A. Yanai; A. H. Futerman; Y. Barenholz; A. Araboulos. J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, 20763-20771 [0122]

\bullet A. H. Peden; M. W. Head; D. L. Ritchie; J. E. Bell; J. W. Ironside. Preclinical vCJD after blood transfusion n a PRNP codon 129 heterozygous patient. Lancet, 2004, vol. 364, 527-529 [0122]

\bullet S. B. Prusiner. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science, 1982, vol. 216, 136-144 [0122]

\bullet R. Rubenstein; R. I. Carp; W. Ju; C. Scalici; M. Papini; A. Rubenstein; R. Kascsak. Concentration and distribution of infectivity and PrPSc following partial denaturation of a mouse-adapted and a hamster-adapted scrapie strain. Arch. Virol., 1994, vol. 139, 301-311 [0122]

\bulletSafar, J.; H. Wille et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med, 1998, vol. 4 (10), 1157-65 [0122]

\bulletSafar, J.; M. Ceroni et al. Subcellular distribution and physicochemical properties of scrapie-associated precursor protein and relationship with scrapie agent. Neurology, 1990, vol. 40, 503-8 [0122]

\bulletSchwab, M. et al. Amplified DNA with limited homology to myc cellular oncogene is shared by human neuroblastoma cell lines and a neuroblastoma tumour. Nature, 1983, vol. 305 (5931), 245-248 [0122]

\bullet A. J. Swerdlow; C. D. Higgins; P. Adlard; M. E. Jones; M. A. Preece. Creutzfeldt-Jakob disease in United Kingdom patients treated with human pituitary growth hormone. Neurology, 2003, vol. 61, 783-791 [0122]

\bullet D. M. Taylor; H. Fraser; I. McConnell; D. A. Brown; D. L. Brown; K. A. Lamza; G. R. Smith. Decontamination studies with the agents of bovine spongiform encephalopathy and scrapie. Arch. Virol., 1994, vol. 139, 313-326 [0122]

\bullet D. M. Taylor. Inactivation of transmissible degenerative encephalopathy agents: A review. Vet J., 2000, vol. 159, 10-17 [0122]

\bullet Transmissible degenerative encephalopathies. D. M. Taylor. Inactivation of the causal agents, in: Principles and practice of disinfection, preservation and sterilisation. Blackwell Scientific Publications, 1999, 222-236 [0122]

\bullet D. M. Taylor. Resistance of transmissible spongiform encephalopathy agents to decontamination. Contrib. Microbiol., 2001, vol. 7, 58-67 [0122]

\bullet D. M. Taylor; K. Fernie; P. J. Steele; I. McConnell; R. A. Somerville. Thermostability of mouse-passaged BSE and scrapie is independent of host PrP genotype: implications for the nature of the causal agents. J. Gen. Virol., 2002, vol. 83, 3199-3294 [0122]

\bullet D. M. Taylor. Resistance of transmissible Spongiform encephalopathy agents to decontamination. Contrib Microbiol., 2004, vol. 11, 136-145 [0122]

\bullet H. J. Ward; D. Everington; E. A. Croes; A. Alperovitch; N. Delasnerie-Laupretre; I. Zerr; S. Poser; C. M. van Duijn. Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease and surgery: a case-control study using community controls. Neurology, 2002, vol. 59, 543-548 [0122]

\bullet G. A. Wells. Pathology of nonhuman spongiform encephalopathies: variations and their implications for pathogenesis. Dev. Biol. Stand., 1993, vol. 80, 61-69 [0122]

\bullet R. G. Will. Epidemiology of Creutzfeldt-Jacob disease. Br. Med. Bull., 1993, vol. 49, 960-970 [0122]

\bullet J. H. Wille; G.-F. Zhang; M. A. Baldwin; F. E. Cohen; S. B. Prusiner. Separation of scrapie prion infectivity from PrP amyloid polymers. Mol. Biol., 1996, vol. 259, 608-621 [0122]

\bullet D. J. Weber; W. A Rutala. Creutzfeldt-Jakob disease: recommendations for disinfection and sterilization. Clin Infect Dis., 2001, vol. 32, 1348-1356 [0122]

\bullet D. J. Weber; W. A. Rutala. Managing the risk of nosocomial transmission of prion diseases. Curr Opin Infect Dis., 2002, vol. 15, 421-425 [0122]

\bullet S. van der Werf; J. P. Briand; S. Plaue; J. Burckard; M. Girard; M. H. Van Regenmortel. Ability of linear and cyclic peptides of neutralization antigenic site 1 of poliovirus type 1 to induce virus cross-reactive and neutralizing antibodies. Res Virol., 1994, vol. 145, 349-359 [0122]

\bullet Z. X. Yan; L. Stitz; P. Heeg; E. Pfaff; K. Roth. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol., 2004, vol. 25, 280-283 [0122]

\bullet W. Q. Zou; N. R Cashman. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J. Biol. Chem., 2002, vol. 277, 43942-43947 [0122]

Claims (17)

1. Procedimiento para infectar una línea celular diana con un agente EET, que comprende:

i)

formar una preparación de membrana que contiene un agente EET de un primer tipo de célula animal en una primera membrana; y mezclar dicha preparación de membrana con una segunda membrana de un segundo tipo de célula animal; en el que el primer y segundo tipos de células animales son diferentes;

ii)

formar una membrana contigua que comprende dicho agente EET y dicha segunda membrana;

iii)

poner en contacto dicha línea celular diana con dicha membrana contigua;

y así infectar dicha línea celular diana con dicho agente EET;

en el que la segunda membrana es del mismo tipo de células animal que la de la línea celular diana.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Procedimiento para infectar una línea celular diana con un agente EET, que comprende:

i)

formar una preparación de membrana que contiene un agente EET de una primera especie animal, en una primera membrana, y mezclar dicha preparación de membrana con una segunda membrana de una segunda especie animal, en donde la primera y segunda especies animales son diferentes;

ii)

formar una membrana contigua que comprende dicho agente EET y dicha segunda membrana;

iii)

poner en contacto dicha línea celular diana con dicha membrana contigua;

y así infectar dicha línea celular diana con dicho agente EET;

en el que la segunda membrana es de la misma especie animal que la línea celular diana.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente EET de dicho primer tipo de célula animal y la segunda membrana son de diferentes especies animales.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el agente EET de la primera especie animal y la segunda membrana son de diferentes tipos de células animales.

5. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el TSE se selecciona entre el grupo formado por ECJ, vECJ, ECJ esporádica, ECJ familiar, ECJ yatrogénica, EEB, EEB ovina, y CWD.

6. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la fuente del agente EET se selecciona entre el grupo formado por tejidos linfáticos (por ejemplo, amígdalas, apéndice, amígdala rectal), tejidos neuronales (por ejemplo, cerebro, sistema nervioso central), y sangre (por ejemplo, linfocitos).

7. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la línea celular diana se selecciona entre el grupo formado por células neuronales (por ejemplo, células de neuroblastoma), y células de fibroblasto.

8. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la segunda membrana y la línea celular diana son de una especie animal seleccionado entre el grupo que consisten de humanos, ovejas, vacas, ratones y ciervos.

9. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la segunda membrana y la línea celular diana son de un tipo de célula seleccionado entre el grupo formado por células de neuroblastoma (por ejemplo, NB69, SK-N-SH, y Kelly).

10. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la línea celular diana y la célula de la cual se obtiene el agente EET son de la misma especie animal, preferentemente del grupo que consiste en humanos, ovejas, vaca, ratón, y ciervos.

11. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la línea celular diana y la célula de la que se obtiene el agente EET son del mismo tipo celular, preferiblemente del grupo que consiste en células de neuroblastoma (por ejemplo, NB69, SK-N-SH, y Kelly).

12. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la segunda membrana y la célula de la que se obtiene el agente EET son del mismo tipo celular, preferentemente del grupo que consiste en células de neuroblastoma (por ejemplo, NB69, SK-N-SH, y Kelly).

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente EET se selecciona entre el grupo que consiste en ECJ, vECJ, ECJ esporádica, ECJ familiar, ECJ yatrogénica, y en el que la línea celular diana y la segunda membrana son de una especie no humana (por ejemplo, de ratón, rata, vaca, oveja, ciervo).

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente EET es EEB, y en el que la línea celular diana y segunda membrana son de especies no bovinas (por ejemplo, de humano, ratón, rata, oveja o ciervo).

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente EET es CWD, y en el que la línea celular diana y la segunda membrana son de especies no de ciervo (por ejemplo, de humano, ratón, rata, vaca u oveja).

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente EET es EEB o la tembladera ovina, y en el que la línea celular diana y la segunda membrana son de una especie no ovina (por ejemplo, de humano, ratón, rata, vaca o ciervo).

17. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la primera o segunda membrana es una membrana microsomal.