ES2134749T3 - Diagnostico de la encefalopatia espongiforme. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE TIPIFICACION DE UNA MUESTRA DE UN PRION O DE UNA ENFERMEDAD DE ENCEFALOPATIA ESPONGIFORME, UN EQUIPO QUE SE PUEDE UTILIZAR EN DICHO PROCEDIMIENTO DE TIPIFICACION, UN PROCEDIMIENTO PARA LA IDENTIFICACION DE UNA INFECCION EN UN ANIMAL Y/O UN TEJIDO AFECTADO POR UN ENCEFALOPATIA ESPONGIFORME BOBINA (BSE), UN EQUIPO DESTINADO A SER UTILIZADO DURANTE UN PROCEDIMIENTO DE VALORACION Y/O DE PREVISION, UN PROCEDIMIENTO PARA TRATAR UNA ENFERMEDAD CON PRIONES, COMPUESTOS QUE CONVIENEN A DICHO PROCEDIMIENTO, Y EL USO DE ESTOS COMPUESTOS Y AGENTES FARMACEUTICOS QUE CONTIENEN ESTOS MISMOS COMPUESTOS.

Description

Diagnóstico de encefalopatía espongiforme.

La presente invención se refiere a un método para tipificar una muestra de una enfermedad producida por priones o de encefalopatía espongiforme, a un kit adecuado para uso en dicho método de tipificación, a un método para identificar la infección en un animal y/o tejido de encefalopatía espongiforme bovina (BSE), a un método para evaluar y/o predecir la susceptibilidad de un animal a la BSE, a un kit para uso en dicho método de evaluación y/o predicción, a un método para el tratamiento de una enfermedad producida por priones, a compuestos adecuados para dicho método, al uso de dichos compuestos y a agentes farmacéuticos que comprenden dichos compuestos. En particular, la presente invención se refiere al análisis molecular de una variación de una cepa de priones y a la etiología de una "nueva variante" de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

Las enfermedades producidas por priones o encefalopatías espongiformes transmisibles son un grupo de enfermedades neurodegenerativas que afectan tanto a los seres humanos como a los animales y que pueden transmitirse entre mamíferos por inoculación con, o en algunos casos por exposición alimentaria a, tejidos infectados. Están relacionadas con la acumulación en los cerebros afectados de una isoforma anormal de una glicoproteína codificada por el hospedador, la proteína prión (PrP), que parece ser el componente principal y posiblemente el único componente del agente transmisible o prión^{1}. Esta isoforma relacionada con la enfermedad, PrP^{Sc}, puede distinguirse de la isoforma celular normal, PrP^{C}, por su insolubilidad y resistencia parcial a las proteasas. PrP^{Sc} deriva de PrP^{C} por un mecanismo post-traduccional^{2} que parece implicar una modificación conformacional en lugar de covalente^{3}. Ciertos estudios transgénicos, de genética molecular humana y de conversión in vitro respaldan un modelo de propagación por priones que implica una interacción directa proteína-proteína entre la PrP^{C} del hospedador y la PrP^{Sc} inoculada, actuando la PrP^{Sc} para promover la conversión de PrP^{C} en PrP^{Sc} adicional en un proceso autocatalítico que transcurre más eficazmente cuando las proteínas que interaccionan tienen una estructura primaria idéntica^{4-7}. Además de la especial biología de estas enfermedades, el interés en las mismas se ha intensificado debido a la epidemia de una nueva enfermedad producida por priones, la encefalopatía espongiforme bovina (BSE)^{8}, en el Reino Unido y ahora en otros países, y a la posibilidad de que pueda representar una amenaza significativa para la salud pública mediante la ingestión de tejidos infectados con BSE. Se sabe que la BSE ha causado enfermedad por priones en otras diversas especies, incluyendo gatos domésticos (encefalopatía espongiforme felina) y ungulados exóticos cautivos (niala y kudu), presumiblemente como resultado de la ingestión de alimentos contaminados con BSE^{9}. La patogenicidad de los priones bovinos para los seres humanos es desconocida, aunque los resultados de la exposición de ratones transgénicos que expresan proteína prión humana, que carecen de una barrera de especie para los priones humanos, sugiere que la inducción de la producción de priones humanos por priones bovinos no es eficaz^{10}.

Aunque muchas líneas de evidencia convergentes respaldan la hipótesis de "solo proteína" para la propagación de priones^{1}, aún tiene que explicarse satisfactoriamente la existencia de múltiples aislados diferentes o "cepas" de agente que pueden pasarse de manera estable en ratones endogámicos del mismo genotipo de proteína prión dentro de este modelo. Las cepas pueden distinguirse por sus diferentes periodos de incubación y por los patrones de neuropatología cuando se someten a pases en ratones^{11}. Por ejemplo se reconocen varias cepas diferentes de scrapie natural de oveja, mientras que la BSE parece estar causada por una sola cepa de agente^{9}. El apoyo de la opinión de que la especificidad de la cepa está codificada por PrP solo se proporciona mediante el estudio de dos cepas diferentes de priones de encefalopatía de visón transmisibles que pueden propagarse en serie en hámsteres, denominados hiper (HY) y somnoliento (DY)^{12}. Estas cepas pueden distinguirse por las diferentes propiedades fisioquímicas de la PrP^{Sc} acumulada en los cerebros de hámsteres afectados^{13}. Después de una proteolisis limitada, pueden observarse patrones de migración de PrP^{Sc} específicos de cepa en geles de poliacrilamida. La proteína PrP^{Sc} de DY parece ser más sensible a proteasas que la proteína PrP^{Sc} de HY, produciendo un patrón de bandas diferente del de PrP^{Sc} en transferencias de Western después del tratamiento con proteinasa K. Esto está relacionado con los diferentes extremos N-terminales de PrP^{Sc} HY y DY después del tratamiento con proteasas e implica diferentes conformaciones de PrP^{Sc14} HY y DY. Además, la demostración de que estas propiedades fisioquímicas específicas de cepa pueden mantenerse durante la producción in vitro de PrP resistente a proteasas, cuando PrP^{C} se mezcla con PrP^{Sc} de hámster HY o DY, también respalda el concepto que las cepas de priones implican diferentes confórmeros de PrP^{15}.

Las enfermedades producidas por priones humanas ocurren de forma heredada, adquirida y esporádica. Aproximadamente el 15% son heredadas, relacionadas con mutaciones en la codificación del gel de la proteína prión (PRNP)^{16}. Las enfermedades producidas por priones adquiridas incluyen kuru y CJD iatrogénica. Las vías iatrogénicas reconocidas de transmisión son tratamiento con hormona de crecimiento o gonadotropina obtenidas de pituitaria de cadáveres humanos, injerto de duramadre o de córnea y el uso de instrumentos neuroquirúrgicos esterilizados de manera inadecuada^{17}. Sin embargo, la inmensa mayoría de enfermedades producidas por priones humanas ocurren como CJD esporádica, cuando no están presentes ni mutaciones de PRNP patógenas ni una historia de exposición iatrogénica. La inmensa mayoría de casos de CJD esporádica son homocigotos en el resto polimórfico 129, un polimorfismo de proteínas común en PrP humana que se sabe que juega un papel clave en la susceptibilidad genética a enfermedades producidas por priones humanas^{6,16,18-20}. Recientemente, Will et al informaron sobre la existencia de una nueva forma de enfermedad producida por priones humana en el Reino Unido, que afectaba a personas inusualmente jóvenes y que tenía un patrón clinicopatológico muy consistente y especial^{21}. Hasta la fecha, todos los pacientes estudiados son homocigotos (para metionina) en el resto polimórfico 129 de PrP y no están presentes mutaciones codificantes^{22}. Ninguno tiene una historia de exposición iatrogénica a priones humanos. Esto puede indicar la llegada de un nuevo factor de riesgo para CJD en el Reino Unido y el candidato más probable parece ser la exposición alimentaria a asaduras bovinas especificadas, antes de su exclusión legal de la dieta humana en el Reino Unido en 1989. Actualmente se cree que el riesgo de susceptibilidad a la BSE o a una variación o enfermedad relacionada es mayor para individuos que son homocigotos en el resto polimórfico 129 de PrP (y los homocigotos para metionina tienen un mayor riesgo que los homocigotos para valina). Se desconoce cuantas cepas de priones humanos causan la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD); hasta la fecha sólo se ha informado de dos patrones diferentes de PrP resistente a proteasa, relacionados con diferentes tipos clinicopatológicos de CJD esporádica^{23}.

La Patente de Estados Unidos Nº 4892814 describe un método para diagnosticar la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y distinguirla de otras causas de demencia en pacientes. El diagnóstico se consigue analizando el líquido cefalorraquídeo de un sujeto y determinando la presencia de proteínas p130 o p131.

El documento WO96/17249 describe la identificación de encefalopatía espongiforme en animales, identificando un agente que reacciona de manera cruzada con anticuerpos anti-apoliproteína.

Race et al (AM J VET RES 53 883-889 (1992)) describe una comparación del diagnóstico del scrapie basado en la detección de PrP-res con un diagnóstico basado en el examen histológico de cerebros de oveja. El método implica comparar las transferencias de Western de muestras de proteína prión procedentes de fuentes que incluyen oveja, hámster y ratón.

Priola et al (Molecular Neuro Biology 8 113-120 (1994)) analizan la transformación entre la forma sensible de proteasa normal de PrP y la forma resistente de proteasa anormal de PrP, que es característica del scrapie y de encefalopatías espongiformes. Los autores proponen que hay una interacción entre PrP-res y glicosaminoglicanos sulfatados endógenos en la acumulación de PrP res.

Por consiguiente, un primer aspecto de la invención proporciona un método para tipificar una muestra de una enfermedad producida por priones o encefalopatía espongiforme, comprendiendo el método comparar y/o identificar propiedades fisioquímicas similares de la muestra con una muestra patrón de tipo conocido. La muestra patrón de tipo conocido puede ser cualquiera de las conocidas en la técnica, o muestras futuras de un tipo conocido. Esta muestra patrón de un tipo conocido puede ser encefalopatía espongiforme bovina o enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

La comparación y/o identificación de propiedades similares (a menos que se incluyan propiedades fisioquímicas no similares) son procedimientos bien conocidos en la técnica. Puede usarse la comparación de cualquier propiedad fisioquímica, por ejemplo, una comparación de resistencia a proteasa y/o relaciones de glicoformas. Una comparación de resistencia a proteasa adecuada en la resistencia a la proteinasa K.

La muestra patrón de tipo conocido puede ser una muestra de encefalopatía espongiforme bovina de origen bovino o no bovino. En particular, la encefalopatía espongiforme bovina puede derivar de un mamífero o de un pollo, o puede ser de origen felino, ovino, cervino, ser humano o de otro primate (convenientemente macaco) o murino.

El método para tipificar una muestra de una enfermedad producida por priones o encefalopatía espongiforme puede comprender las etapas de someter la muestra a digestión por proteasas, someter a electroforesis los resultados de la etapa de digestión y comparar el patrón resultante de la electroforesis con una electroforesis convencional de una muestra conocida. Otros métodos similares y/o ligeramente variados son técnicas habituales bien conocidas usadas constantemente en la técnica.

Un método para tipificar una muestra de una enfermedad producida por priones o una encefalopatía espongiforme, de acuerdo con la invención, puede comprender un método para diagnosticar una enfermedad. El método, sea para el diagnóstico de una enfermedad o no, puede implicar una muestra que procede de un mamífero o de pollo, en particular procedente de un ser humano, u otro primate (adecuadamente macaco), animal bovino, ovino, cervino o murino.

La muestra a tipificar preferiblemente procede de tejido cerebral, otro tejido del sistema nervioso central, un tejido del sistema linforreticular (incluyendo el bazo, amígdalas o ganglios linfáticos), líquido cefalorraquídeo y/o sangre. De acuerdo con la presente invención, puede usarse una muestra de uno o más tejidos individuales.

De acuerdo con el primer aspecto de la invención, el patrón de electroforesis de la muestra conocida puede tener un patrón substancialmente similar al del tipo 4 mostrado en la figura 4 o un modelo equivalente cuando se somete a electroforesis en diversas condiciones.

Un segundo aspecto de la invención proporciona un kit para tipificar una enfermedad producida por priones o encefalopatía esponjiforme o para diagnosticar una enfermedad producida por priones o encefalopatía espongiforme, comprendiendo el kit un patrón de gel de electroforesis para priones o encefalopatía. Opcionalmente, el kit puede incluir medios para proporcionar la comparación de propiedades fisioquímicas de las muestras a tipificar y el patrón de gel. Dichos medios incluyen una enzima proteasa, tal como proteinasa K. El kit puede comprender el patrón de gel y otros ingredientes opcionales en combinación con instrucciones para usar el kit y/o medios de envasado, tal como un recipiente.

Un tercer aspecto de la invención proporciona un método para identificar una infección en un animal y/o tejido de encefalopatía espongiforme bovina, comprendiendo el método aislar una proteína prión del animal y/o tejido e identificar que dicha proteína prión puede caracterizarse por tener tres bandas distintas en un gel de electroforesis después de digestión con proteinasa K, comprendiendo las bandas i) una banda con el mayor peso molecular en la mayor proporción, ii) una banda con el menor peso molecular en la menor proporción, e iii) una banda con un peso molecular entre i e ii y de una proporción entre i e ii, o caracterizarse por tener proporciones de glicoformas substancialmente similares a las observadas en la encefalopatía espongiforme bovina. En el método de acuerdo con el tercer aspecto, el animal y/o tejido del que se muestrea el prión puede ser de mamífero o de pollo, y en particular de ser humano (u otro primate, adecuadamente macaco), o puede ser de origen ovino o murino. La muestra de priones puede proceder de uno o más de los siguientes: tejido cerebral, otros tejidos del sistema nervioso central, un tejido del sistema linforreticular (incluyendo el bazo, amígdalas o ganglios linfáticos), líquido cefalorraquídeo y/o la sangre.

Un cuarto aspecto de la invención proporciona un método para evaluar y/o predecir la susceptibilidad de un animal, en particular un individuo humano, a la encefalopatía espongiforme bovina o a un derivado de la misma, comprendiendo el método la etapa de determinar el genotipo del individuo en el resto polimórfico 129 de PrP. La determinación puede ser cuando el individuo sea homocigoto o heterocigoto en el resto polimórfico 129 de PrP, en particular cuando el animal es homocigoto para metionina o valina en el resto polimórfico 129 de PrP. El genotipo más susceptible a la encefalopatía espongiforme bovina, hasta la fecha, es el homocigoto para metionina (MM). Este genotipo aparece en aproximadamente el 38% de la población del Reino Unido. Otros genotipos susceptibles, en orden de susceptibilidad decreciente son homocigotos valina/valina y heterocigotos metionina/valina. El método del cuarto aspecto de la invención puede realizarse usando ADN obtenido de una muestra biológica del animal, en particular cuando la muestra biológica sea sangre.

Un quinto aspecto de la invención se refiere a un kit para uso en la evaluación y/o predicción de la susceptibilidad de un animal, en particular de un individuo humano, a la encefalopatía espongiforme bovina o a un derivado de la misma, que comprende al menos un par de cebadores adecuados para la amplificación por PCR de al menos una parte del gen que codifica para PrP. Los cebadores adecuados incluyen

5'-GTTTTCCAGTGCCCATCAGTG-3' y

5'-CTATGCACTCATTCATTATGC-3'

Hemos investigado una amplia serie de casos de enfermedades producidas por priones humanas para identificar los patrones de PrP resistentes a proteasa que podrían indicar diferentes tipos de cepas de priones de origen natural. Después estudiamos "nuevas variantes" de CJD para determinar si representa un tipo de cepa diferente que puede diferenciarse por criterios moleculares de otras formas de CJD. Aquí demostramos que la CJD esporádica e iatrogénica está relacionada con tres patrones distintos de PrP resistente a proteasa en transferencias de Western. Los tipos 1 y 2, como se ha descrito anteriormente, se ven en la CJD esporádica, y también en algunos casos de CJD iatrogénica. Un tercer tipo se observa en enfermedades producidas por priones adquiridas que se producen por una vía periférica de exposición a priones. La "nueva variante" de CJD está relacionada con la aparición única y muy consistente de PrP resistente a proteasa en transferencias de Western que implica un patrón característico de glicosilación. Mientras que la transmisión de CJD a ratones endogámicos produce un patrón característico de la CJD inoculada, la transmisión de BSE produce un patrón de proporción de glicoformas muy similar a la "nueva variante" de CJD. De manera similar, la BSE experimental en macaco y la BSE adquirida de manera natural en gatos domésticos muestran un patrón de glicoformas indistinguible del de la BSE murina experimental y la "nueva variante" de CJD. La transmisión del tipo 1, 2 y 3 de CJD a ratones transgénicos que expresan PrP humana revela persistencia o conversión del tipo de cepa dependiente del genotipo del codón 129 de PRNP, proporcionando pruebas que confirman la hipótesis de "sólo proteína" en relación con la infectividad y sugiriendo que la variación de cepa puede codificarse por una combinación de conformación de PrP y glicosilación.

Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para tipificar, diagnosticar e identificar la infección y kits como se indica en las reivindicaciones y en la descripción.

CJD esporádica y adquirida

Típicamente se observan tres bandas en transferencias de Western de PrP resistente a proteasa procedente de casos de CJD. Las dos bandas de mayor peso molecular representan las formas glicosiladas principales de PrP, mientras que la banda menor representa PrP no glicosilada^{23} (figura 1). Parchi et al, describieron dos patrones diferentes de CJD esporádica: se observó un patrón de tipo 1 en la mayoría de casos de CJD con homocigosis para metionina (MM) en el resto polimórfico 129 de PrP; se observó un patrón de tipo 2 en una minoría de casos MM y en todos los heterocigotos metionina/valina (MV) y homocigotos de valina (VV)^{23}. Realizamos análisis por transferencia de Western de proteínas prión resistente a proteasas en un total de 26 casos de CJD esporádica confirmados neuropatológicamente que representaban los tres codones genotipos del codón 129 de PRNP; se incluyeron los casos de fecha anterior y contemporáneos con la epidemia de encefalopatía espongiforme bovina (tabla 1). Confirmamos el hallazgo de Parchi et al^{23} de que en la CJD esporádica, los casos de MM tenían dos patrones de bandas diferentes (denominados tipos 1 y 2) (figuras 1a y b y tabla 1), mientras que los casos VV y MV mostraron todos el patrón de bandas de tipo 2^{23} (figura 1c y tabla 1). En nuestra muestra de CJD esporádica, descubrimos que MM de tipo 2 era más frecuente que MM de tipo 1 (tabla 1). Además, Parchi et al detectaron diferencias en la proporción de PrP resistente a proteasa en cada una de las tres bandas entre los pacientes de CJD esporádica de tipo 1 y los de tipo 2^{23}. En nuestra serie mayor, se observó una diferencia estadísticamente significativa entre los casos de tipo 1 y de tipo 2 con respecto a la proporción de la glicoforma de bajo peso molecular, pero no con respecto a las otras dos bandas (leyenda de la figura 4).

Después estudiamos una serie de CJD iatrogénicas, incluyendo pacientes tratados con hormona de crecimiento obtenida a partir de pituitaria humana con los tres genotipos del codón 129 de PRNP, un paciente tratado con gonadotropina procedente de pituitaria humana y un paciente que desarrolló CJD después de un injerto de duramadre.

Se detectó un tercer patrón de bandas diferente de PrP resistente a proteasa en todos los casos relacionados con hormona procedente de pituitaria que eran de genotipo de codón 129 de PRNP MV o VV (figura 2). En este patrón de "tipo 3", las tres bandas están desplazadas, lo cual es coherente con una disminución de aproximadamente 2-3 kDa del tamaño de la PrP resistente a proteasas detectado en comparación con la CJD esporádica de tipo 2. No hubo diferencias significativas en las proporciones de glicoformas entre el tipo 1 y el tipo 3 o entre el tipo 2 y el tipo 3 de CJD en esta muestra (leyenda de la figura 4). Sólo el caso de hormona de crecimiento MM tuvo un patrón de bandas indistinguible en el análisis por transferencia de Western de los casos de CJD esporádica de tipo 1 (figura 2). El caso relacionado con la duramadre tuvo un patrón de bandas indistinguible de la CJD esporádica de tipo 2 (figura 2). La posibilidad de que haya mayor heterogeneidad en tipos de PrP^{Sc} individuales está bajo investigación.

Estudios de transmisión a ratones

Estamos estudiando las características de transmisión de la CJD en ratones transgénicos que expresan PrP humana pero no PrP murina (denominados HuPrP^{+/+} Prn-p^{0/0} ya que son homocigotos para la serie transgénica humana)^{10}. Estos ratones carecen de una barrera de especie para priones humanos y la mayoría o todos los ratones inoculados sucumben a la enfermedad producida por priones en periodos de incubación consistentemente cortos^{10, 24} normalmente en la región de 180-220 días (datos no mostrados). Esto es una gran distinción con respecto a estudios con ratones no transgénicos que usan el mismo inóculo donde las transmisiones no son frecuentes y cuando ocurren están relacionadas con periodos de incubación prolongados y variables. La transmisión de la CJD de tipo 2 (los tres genotipos del codón 129) o de la CJD de tipo 3 (que fueron todos de genotipo MV o VV) dio como resultado la producción de PrP humana resistente a proteasas en los ratones con un patrón de bandas idéntico al del inóculo primario (es decir, el tipo 2 ó 3 respectivamente) (figura 3). Los ratones HuPrP^{+/+} Prn-p^{0/0} usados codifican valina en el resto 129^{25}. Sin embargo, la transmisión de CJD de tipo 1 (que son todos de genotipo MM) dio como resultado consistentemente un patrón de bandas de tipo 2 de PrP resistente a proteasas humana producida en el ratón (figura 3).

La proporción de glicoformas diferentes en transferencias de Western de homogeneizados de cerebro de estos ratones fue indistinguible de la de los propios casos humanos (datos no mostrados).

Nueva variante de CJD

El tratamiento con proteinasa K de PrP^{Sc} de la "nueva variante" de CJD puso de manifiesto el desplazamiento de bandas característico observado después de la digestión del fragmento resistente a proteasas, confirmando la digestión completa de la región N-terminal sensible a proteasas de PrP^{Sc} en las condiciones usadas (figura 1d). Todos los pacientes con la "nueva variante" de CJD estudiados fueron homocigotos para la metionina en el resto polimórfico 129^{22}. No se observaron mutaciones codificantes conocidas o nuevas de PRNP en los casos de la "nueva variante" de CJD o en los casos de CJD esporádica secuenciados. El análisis por transferencia de Western de estos diez casos de "nueva variante" de CJD pusieron de manifiesto un patrón consistente y diferente de formas de PrP resistentes a proteasas, que podrían diferenciarse claramente por los tamaños de las bandas de los casos de CJD esporádica de tipo 1 y de tipo 2 (figura 1, a-c), y de la CJD de tipo 3 por un patrón destacado y diferente de la intensidad de las bandas que difería de los tres tipos de CJD (figura 4). La desglicosilación con PNGasaF dio como resultado una sola banda, lo que sugirió un sitio de escisión proteolítica consistente y con independencia del estado de glicosilación (figura 1e) y que difiere de lo observado en la CJD esporádica. La glicoforma de alto peso molecular fue la más abundante con relativamente poca PrP no glicosilada en comparación con la CJD de tipo 1, tipo 2 y tipo 3. Todas estas diferencias en la intensidad de las bandas con respecto a las CJD de los tipos 1-3 fueron muy significativas estadísticamente (leyenda de la figura 4). Un diagrama de dispersión de las proporciones relativas de la glicoforma de alto peso molecular y de la glicoforma de bajo peso molecular revela dos poblaciones de casos no solapantes: la "nueva variante" CJD tiene un patrón diferenciado que difiere en gran medida de todos los tipos reconocidos anteriormente de CJD esporádica e iatrogénica (figura 5a).

Comparación con BSE

Como las intensidades de las bandas de PrP resistente a proteasa en la "nueva variante" de CJD diferían de manera notable de la CJD esporádica e iatrogénica, investigamos si este patrón de glicoformas distintivo se observaba también en la BSE natural o transmitida de manera experimental. En primer lugar, comparamos transmisiones de BSE y CJD al mismo ratón endogámico. No se disponía de datos de transmisión comparativos en ratones transgénicos, ya que BSE no se ha transmitido, hasta la fecha, a ratones HuPrP^{+/+} Prn-p^{0/0} (>500 días después de la inoculación). Las proporciones de glicoformas observadas en las transmisiones de CJD a ratones FVB de tipo silvestre fueron indistinguibles de las de los tres tipos de CJD (figura 5b). Sin embargo, la transmisión de BSE tanto a ratones FVB de tipo silvestre como a ratones C57BL/6 dio como resultado proporciones que fueron muy similares a las de la "nueva variante" de CJD (figura 5b y figura 6). De manera similar, los tamaños de las bandas de PrP resistente a proteasas observados tras la transmisión de BSE a ratones de tipo silvestre se desplazaron a una menor masa molecular en comparación con las transmisiones de CJD de tipo 2 (datos no mostrados). Después, estudiamos la BSE transmitida de manera natural en gatos domésticos (encefalopatía espongiforme felina^{26}) y la BSE experimental en un macaco^{27}. Estos casos también se parecen mucho a la "nueva variante" de CJD y BSE murina experimental (figura 7a y figura 5b). La propia BSE no fue detectable en transferencias de Western que usaban el anticuerpo monoclonal 3F4 (disponible en Senetek Plc, Senescence Technology, Maryland Heights, Missouri, Estados Unidos) o el anticuerpo policlonal R073. Sin embargo, se detectó una señal de PrP^{Sc} en homogeneizados de tallo cerebral de ratones con BSE infectados de manera natural usando un anticuerpo de conejo contra un péptido PrP humano sintético (95-108) y el patrón de las glicoformas (% de peso molecular alto 51,2, % de peso molecular bajo 33,9, % de no glicosilado 14,9) fue bastante similar al de la BSE transmitida y al de la "nueva variante" de CJD. Este anticuerpo también detectó PrP^{Sc} de gato doméstico, macaco y seres humanos, produciendo resultados similares a R073 y antisuero 3F4 (datos no mostrados).

Discusión

La CJD esporádica e iatrogénica parece estar relacionada con la producción de tres tipos distintos de PrP^{Sc} humana que pueden diferenciarse en transferencias de Western después de la escisión proteolítica por los diferentes tamaños de bandas. Los tipos 1 y 2 están relacionados con diferentes fenotipos clinicopatológicos de CJD esporádica^{23} y el tipo 3 se observa en casos de CJD iatrogénica en la que la exposición a priones se ha realizado mediante una vía periférica (inyección intramuscular de hormonas derivadas de pituitaria de cadáver humano) en lugar de por vía SNC directa (injerto de duramadre). Está bien reconocido que dichos casos adquiridos periféricamente tienen un fenotipo diferente, que presenta ataxia cerebelar y alteración psiquiátrica en lugar de enfermedades de demencia^{28}. La CJD iatrogénica resultante de la exposición del SNC típicamente se parece a la CJD esporádica clásica^{28}. La nueva variante de CJD, aunque tiene tamaños de bandas de PrP^{Sc} similares a los de la CJD de tipo 3, puede distinguirse de los tres tipos de CJD mediante un patrón característico de intensidades de bandas. Este marcador molecular característico, que diferencia claramente "la nueva variante" de CJD de la CJD esporádica, sirve para respaldar la propuesta, basada en estudios clinicopatológicos comparativos y vigilancia epidemiológica^{21}, de que la "nueva variante" de CJD es un subtipo nuevo y diferente de enfermedad producida por priones, relacionado con una cepa de priones anteriormente no reconocida. El número limitado de tipos de PrP^{Sc} humanos diferentes hace que la aparición espontánea de un nuevo tipo que es igual en doce individuos en el Reino Unido en los últimos dos años sea extraordinariamente improbable como explicación de una "nueva variante" de CJD. La conclusión alternativa es que estos casos han surgido de una fuente común de exposición a una nueva cepa de priones, y la ausencia de cualquier historia de exposición iatrogénica común sugiere que ésta es una nueva cepa animal. El hecho de que la "firma" de glicoforma de la "nueva variante" de CJD se observe en la propia BSE, en la BSE murina experimental (aunque la transmisión de CJD a estos tipos de ratones produce la "firma" de CJD) y en una BSE transmitida de manera natural en gatos domésticos y BSE experimental en macaco, es coherente con la hipótesis de que la "nueva variante" de CJD resulta de la transmisión de BSE a seres humanos. Se están realizando estudios de transmisión de la "nueva variante" de CJD en ratones HuPrP^{+/+} Prn-P^{0/0}; será interesante comparar los periodos de incubación y los patrones de neuropatología con otras transmisiones de CJD (que también están actualmente en estudio). La tipificación de PrP^{Sc} tendrá una aplicación inmediata en estudios epidemiológicos más amplios de CJD: es posible que la BSE pueda producir otros fenotipos clinicopatológicos en seres humanos, particularmente en diferentes grupos de edad y diferentes poblaciones étnicas, que no están reconocidos como "nueva variante" de CJD. Además, este método también puede permitir tipificar diversos animales para observar si la BSE también se ha transmitido de manera natural a estas especies. Hay una preocupación particular de que la BSE se haya transmitido y se mantenga en poblaciones de ovejas^{29}. La tipificación de cepas de scrapie conocidas que son anteriores a la fecha de la epidemia de BSE, y de aislados recientes, serán importantes a este respecto.

Este marcador molecular ya puede usarse en el diagnóstico diferencial de la "nueva variante" de CJD. La "nueva variante" de CJD es atípica tanto en sus características clínicas como en el electroencefalograma, de tal forma que el diagnóstico es dependiente de la neuropatología, en la autopsia o en algunos casos de biopsia cerebral. Sin embargo, aunque la biopsia cerebral puede demostrar encefalopatía espongiforme e inmunorreactividad de PrP adecuada para un diagnóstico de CJD, los rasgos neuropatológicos característicos necesarios para un diagnóstico de una "nueva variante" de CJD pueden no estar presentes en la muestra de biopsia^{21}. Como PrP se expresa en el sistema linforreticular y la replicación de los priones tiene lugar en el bazo y en otros tejidos linforreticulares^{30}, es posible detectar este marcador molecular de la "nueva variante" de CJD en biopsias de amígdalas ^{31} o de ganglio linfático y evitar de esta manera la biopsia cerebral.

La etiología de la CJD esporádica sigue sin estar clara, pero puede implicar mutación somática de PRNP o conversión espontánea de PrP^{C} en PrP^{Sc} como un suceso estocástico poco frecuente. La CJD esporádica está relacionada con PrP^{Sc} de tipo 1 o de tipo 2. El tipo 1 siempre está relacionado con el genotipo MM, y el tipo 2 con todos los genotipos (MM, MV o VV). El tipo 3 se observa en CJD iatrogénica de genotipo MV o VV. Sólo la proteína PrP M129 humana parece formar PrP^{Sc} de tipo 1, mientras que la proteína PrP M129 humana o PrP V129 humana puede producir PrP^{Sc} de tipo 2. Como la PrP^{Sc} de tipo 3 sólo se observa en individuos MV o VV, es posible que sólo la PrP V129 humana pueda formar este tipo. Como la PrP^{Sc} de tipo 3 se observa en casos de CJD iatrogénica adquirida periféricamente, es posible que esta cepa se seleccione o se produzca preferentemente por el sistema linforreticular, donde la replicación del prión se produce en primer lugar en la enfermedad transmitida experimentalmente en ratones^{32}. Si dicho tipo de PrP^{Sc} se formó preferentemente a partir de PrP V129 humana, esto podría explicar el exceso de genotipo VV de codón 129 de PRNP entre los casos de CJD relacionados con hormona procedente de pituitaria^{19,20,33}. Se necesitarán estudios adicionales para determinar si el patrón de tipo 3 es un marcador consistente de exposición periférica, en oposición a la exposición central a priones o CJD esporádica. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que se observan tamaños similares de bandas en el patrón de tipo 4 ("nueva variante" de CJD) (que son de genotipo MM de PRNP), que parece ser que se han producido por exposición periférica (presumiblemente en la dieta) a priones bovinos. La formación de tipos de PrP^{Sc} particulares parece estar limitada por el genotipo del codón 129 de PRNP del hospedador. Este hallazgo está respaldado por la observación de que PrP^{Sc} de tipo 1 se transforma en el tipo 2 tras el pase en ratones transgénicos que expresan PrP humana que codifica valina en el resto 129, mientras que los tipos 2 y 3 permanecen sin cambios en dicho pase.

Estos diferentes tipos de PrP^{Sc} humanas se observan en asociación con distintos fenotipos clinicopatológicos de CJD, y pueden mantenerse durante el pase en ratones, lo que argumenta que representan distintas cepas de priones humanos. El hallazgo de que las cepas parecen implicar diferentes modificaciones post-traduccionales de PrP que persisten o (cuando los genotipos de PrP no encajan) pueden convertirse de manera predecible entre cepas discretas durante el pase en ratones es consistente con un modelo de "sólo proteína" de propagación de priones en el que las cepas están codificadas por una modificación post-traduccional del propio PrP sin necesidad de un ácido nucleico u otro co-factor. Las bandas observadas en el análisis de Western de PrP después de la escisión proteolítica representan PrP diglicosilada, monoglicosilada (en cualquiera de los dos sitios de glicosilación unidos a N^{34}) y no glicosilada, y dos características diferentes de estas bandas, cambios de movilidad y diferencias en intensidades relativas, parecen estar relacionadas con el tipo de cepa. Los cambios de movilidad después de la escisión, observados en las tres bandas, implican diferentes conformaciones de PrP (que pueden incluir diferentes estados de ensamblaje). Las diferencias en las proporciones de glicoformas pueden indicar conversión preferencial de glicoformas particulares en estados conformacionales particulares. Se ha argumentado que la glicosilación de PrP diferente en diferentes regiones cerebrales podría proporcionar un mecanismo para la dirección de la neuropatología observada con diferentes tipos de cepas, ya que los priones pueden replicarse más eficazmente en poblaciones celulares que expresan una PrP glicosilada de manera similar sobre la superficie celular. Tanto la conformación de PrP como la glicosilación pueden contribuir al tipo de cepa, pero se necesitarán estudios adicionales para investigar si estas dos modificaciones post-traduccionales de PrP pueden contribuir al tipo de cepa independientemente, o son fenómenos muy relacionados.

La presente invención describe que patrones alterados de glicosilación están implicados en enfermedades producidas por priones y, en particular, distinguen la encefalopatía espongiforme bovina y la nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob de otras formas de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Es posible que una forma glicosilada particular de PrP esté implicada en la producción de, o en la estabilidad de isoformas de PrP relacionadas con la enfermedad. De esta manera, los inhibidores de la ruta de procesamiento biosintético para azúcares unidos a glicoproteínas inhibirán la replicación de los priones y, por lo tanto, podrán usarse para constituir la base de agentes terapéuticos para enfermedades producidas por priones en animales y en seres humanos.

Por consiguiente, un sexto aspecto de la presente invención proporciona un método para la prevención o tratamiento de una enfermedad producida por priones por medio de la administración de un compuesto que inhibe la unión de azúcares a proteínas y glicoproteínas.

La presente invención también proporciona, de acuerdo con un séptimo aspecto, un agente farmacéutico que comprende un compuesto que inhibe la unión de azúcares a una proteína o una glicoproteína en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona, de acuerdo con un octavo aspecto, un compuesto que inhibe la unión de azúcares a proteínas o glicoproteínas para uso como una substancia farmacéutica activa.

El compuesto es particularmente útil en la prevención y/o tratamiento de una enfermedad producida por priones. Las enfermedades producidas por priones a tratar incluyen cualquier enfermedad conocida en la técnica e incluyen encefalopatía espongiforme bovina y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (incluyendo la "nueva variante" de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob descrita en esta solicitud) en bovinos, seres humanos y otros animales.

El compuesto puede administrarse para dicho uso en un excipiente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente junto con uno o más agentes farmacéuticamente activos.

Muchos de dichos inhibidores de unión de azúcar a proteínas y glicoproteínas son conocidos en la técnica. Un ejemplo es desoxinojirimicina y cualquiera de sus derivados.

La presente invención también proporciona, de acuerdo con un noveno aspecto, el uso de un compuesto que inhibe la unión de azúcares a proteínas o glicoproteínas en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad producida por priones. La enfermedad producida por priones a tratar es como se ha descrito anteriormente.

La administración de dicho compuesto en la prevención o tratamiento de una enfermedad producida por priones debe ser una administración directa al tejido infectado, o preferiblemente es un compuesto que puede atravesar la barrera hematoencefálica. Ventajosamente, el agente terapéutico puede administrarse por vía oral, rectal o tópica y puede administrarse durante el resto de la vida del paciente.

Todas las características, incluyendo las características preferidas de los aspectos individuales de la invención como se han descrito anteriormente, se aplican a otros aspectos de la invención.

La invención se describirá a continuación mediante los siguientes ejemplos no limitantes que se proporcionan con fines ilustrativos, y con referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La Tabla 1 muestra la distribución de genotipos de PRNP y de tipos de bandas de PrP resistente a proteasas en casos de CJD esporádica, iatrogénica y de "nueva variante" confirmados neuropatológicamente. MM = genotipo homocigoto de metionina en el codón 129 de PRNP; MV y VV se refieren a heterocigotos de metionina/valina y homocigotos de valina respectivamente.

La Tabla 2 muestra los periodos de incubación para la transmisión de enfermedades producidas por priones a ratones transgénicos y de tipo silvestre.

La Figura 1 muestra transferencias de Western de homogeneizados de cerebro tratados con proteinasa K procedentes de pacientes con CJD esporádica y de "nueva variante" usando el anticuerpo monoclonal anti-PrP 3F4. Los números adyacentes a las barras horizontales indican las posiciones de los marcadores de peso molecular (kilodaltons). (a) Calle 1, tipo CJD esporádica de tipo 1, genotipo de PRNP MM; calle 2, CJD esporádica de tipo 2, genotipo de PRNP MM; calle 3, CJD iatrogénica de tipo 3, genotipo de PRNP VV; calle 4, "nueva variante" de CJD, genotipo de PRNP MM, patrón de bandas de "tipo 4". (b) Calles 1 y 2, CJD esporádica de tipo 1 y tipo 2 respectivamente (ambos con genotipo de PRNP MM; calles 3-7, casos de "nueva variante" de CJD (todos de genotipos de PRNP MM). (c) Calle 1, CJD esporádica de tipo 2, genotipo de PRNP MV; calle 2, CJD esporádica de tipo 2, genotipo de PRNP VV; calles 3-7, "nueva variante" de CJD (todos genotipo de PRNP MM). (d) "nueva variante" de CJD antes (1) y después de (2) tratamiento con proteinasa K. (e) Transferencia de Western de PrP desglicosilada. Calle 1, CJD esporádica de tipo 2, genotipo de PRNP MM; calle 2, "nueva variante" de CJD, genotipo de PRNP MM. El número adyacente a las barras horizontales indica la posición del marcador de peso molecular (kilodaltons).

La Figura 2 muestra transferencias de Western de homogeneizados de cerebro tratados con proteinasa K procedentes de pacientes con CJD iatrogénica usando el anticuerpo monoclonal anti-PrP 3F4. Los números adyacentes a las barras horizontales indican las posiciones de los marcadores de peso molecular (kilodaltons). Calles: 1, CJD esporádica (genotipo de PRNP MM) de tipo 1; 2, CJD iatrogénica (relacionada con hormona del crecimiento) (genotipo de PRNP MM) de tipo 1; 3 y 4, CJD esporádica (genotipo de PRNP MM) de tipo 2; 5, CJD iatrogénica (relacionada con duramadre) (genotipo de PRNP MM) de tipo 2; 6 y 7, CJD iatrogénica (relacionada con hormona del crecimiento) (genotipo de PRNP VV) de tipo 3; 8, CJD iatrogénica (relacionada con hormona del crecimiento) (genotipo de PRNP MV) de tipo 3; 9, CJD esporádica (genotipo de PRNP MV) de tipo 2; 10, "nueva variante" de CJD (genotipo de PRNP MM) de tipo 4.

La Figura 3 muestra la transmisión de CJD a ratones transgénicos que expresan sólo PrP humana. Se realizaron transferencias de Western de inóculos humanos primarios y homogeneizados de cerebro de ratón después del tratamiento con proteinasa K usando el anticuerpo monoclonal anti-PrP 3F4. Los números adyacentes a las barras horizontales indican las posiciones de los marcadores de peso molecular (kilodaltons). "Hu" indica inóculos humanos, "Mo" indica ratones transgénicos que desarrollan la enfermedad después de la inoculación con este caso humano. Los números adyacentes a las barras horizontales indican las posiciones de los marcadores de peso molecular (kilodaltons). Calles 1 y 2, CJD esporádica (MV) de tipo 2 \rightarrow ratón de tipo 2; calles 3 y 4, CJD esporádica (MV) de tipo 2 \rightarrow ratón de tipo 2; calles 5 y 6, CJD iatrogénica (relacionada con hormona del crecimiento) (MM) de tipo 1 \rightarrow ratón de tipo 2; calles 7 y 8, CJD esporádica (MM) de tipo 1 \rightarrow ratón de tipo 2; calles 9 y 10, CJD esporádica (MM) de tipo 1 \rightarrow ratón de tipo 2; calles 11 y 12, CJD esporádica (VV) de tipo 2 \rightarrow ratón de tipo 2; calles 13 y 14, CJD iatrogénica (relacionada con gonadotropina) (VV) de tipo 3 \rightarrow ratón de tipo 3; calles 15 y 16, CJD iatrogénica (relacionada con duramadre) de tipo 2 \rightarrow ratón de tipo 2.

La Figura 4 muestra las proporciones de diferentes glicoformas de PrP en CJD de tipo 1, tipo 2, tipo 3 y tipo 4 ("nueva variante"). El % de cada forma se proporciona como media \pm s.e.m. de los tres tipos de bandas. H = glicoforma de alto peso molecular, L = glicoforma de menor peso molecular, U = no glicosilado. Los resultados (%) fueron los siguientes: PM alto: tipo 1, 25,7 \pm 2,6 (n = 6), tipo 2, 25,2 \pm 0,7 (n = 18); tipo 3, 28,4 \pm 1,2 (n = 4); "nueva variante" de CJD ("tipo 4"), 47,8 \pm 1,1 (n = 9). PM bajo: tipo 1, 41,9 \pm 2,2; tipo 2, 45,7 \pm 0,7; tipo 3, 44,2 \pm 1,3; tipo 4, 37,8 \pm 0,7. No glicosilado: tipo 1, 32,5 \pm 1,3; tipo 2, 29,1 \pm 0,9; tipo 3, 27,4 \pm 2,3; tipo 4, 14,3 \pm 1,3. Las diferencias entre el tipo 1 y el tipo 2 fueron significativas con respecto a la glicoforma de bajo PM (P<0,05) pero no con la glicoforma de alto PM o con la forma no glicosilada. No hubo diferencias significativas entre los tipos 1 y 3 y entre los tipos 2 y 3. Las tres bandas fueron muy diferentes significativamente entre el tipo 4 y el tipo 1, el tipo 2 y el tipo 3 (glicoforma de alto PM en cada caso P<0,0001). En todos los casos se realizaron ensayos t con 2 colas de datos no emparejados.

La Figura 5 muestra un gráfico de dispersión de las proporciones de PrP resistente a proteasa en la glicoforma de alto peso molecular y de bajo peso molecular en casos humanos individuales y de animales con CJD transmitida o con BSE transmitida de manera natural o experimental. (a) Comparación de CJD esporádica, iatrogénica y "nueva variante". La CJD de tipo 1 está representada por cuadrados negros, la de tipo 2 con cuadrados blancos, la de tipo 3 con cruces y la de tipo 4 ("nueva variante" de CJD) con rombos blancos. (b) Comparación de tipos de CJD con BSE transmitida de manera natural y experimental. Todas las CJD esporádicas e iatrogénicas (tipos 1-3) están representadas por cuadrados negros, y los casos de "nuevas variantes" están representados por círculos blancos. Las transmisiones de CJD a ratones FVB se denotan por cuadrados blancos, las transmisiones de BSE a ratones FVB y C57BL/6 por cruces y círculos negros, respectivamente. La BSE transmitida de manera natural en un gato doméstico se denota mediante un triángulo negro y la BSE experimental en macaco mediante una forma de rombo negro.

La Figura 6 muestra la transmisión de BSE a ratones FVB y C57BL/6 de tipo silvestre. La transferencia de Western de homogeneizados de cerebro después del pre-tratamiento con proteinasa K usando anticuerpo anti-PrP R073. Los números adyacentes a las barras horizontales indican las posiciones de los marcadores de peso molecular (kilodaltons). Calles 1-3, ratones C57BL/6; calles 4-8, ratones FVB.

La Figura 7 muestra una transferencia de Western de homogeneizados de cerebro de macaco al que se le ha inoculado BSE (calle 1) usando anticuerpo R073 después del pre-tratamiento con proteinasa K de un gato doméstico con encefalopatía espongiforme felina (calles 2 y 3, antes y después del tratamiento con proteinasa K respectivamente). Los números adyacentes a las barras horizontales indican las posiciones de los marcadores de peso molecular (kilodaltons).

La Figura 8 muestra la transmisión de enfermedades producidas por priones a ratones. a, Gráfico de dispersión de las proporciones de PrP resiste a proteasas en las glicoformas de alta masa molecular (di-glicosiladas) y de baja masa molecular (mono-glicosiladas) en casos humanos individuales y ratones FVB con CJD, vCJD o BSE transmitidas experimentalmente. PrP^{Sc} de tipos 1-3 de casos de CJD esporádica e iatrogénica, cuadrados negros; vCJD, círculos blancos; transmisiones de CJD típica a ratones FVB, cuadrados blancos; BSE a ratones FVB, cruces. Transmisiones de vCJD a ratones FVB, triángulos blancos. b,c, transferencias de Western de homogeneizados de cerebro después del pre-tratamiento con proteinasa K usando anticuerpo policlonal anti-PrP 95-108 (ref. 44) (b) o anticuerpo monoclonal anti-PrP 3F4 (c). Los métodos fueron como en la referencia 43, con la excepción de que para el análisis de la glicoforma de PrP se usó un substrato quimiofluorescente (ECF, Amersham) y las proporciones se analizaron en un Storm 840 Phosphoimager (Molecular Dynamics). b, Transmisión de vCJD y BSE a ratones FVB no transgénicos. Calle 1, vCJD humana; 2, ratón FVB al que se le ha inoculado vCJD (mismo caso que en la calle 1); 3, BSE; 4, ratón FVB al que se le ha inoculado BSE (mismo caso que en la calle 3). c, Transmisión de vCJD a ratones HuPrP^{+/+} Prn-p^{0/0} transgénicos. Calle 1, CJD humana, PrP^{Sc} de tipo 2, 2, ratón transgénico al que se le ha inoculado CJD de la calle 1 que muestra un patrón de tipo 2; 3, caso de vCJD humana, ratón transgénico con PrP^{Sc} de tipo 4 en el que se ha inoculado vCJD de la calle 3 que muestra un patrón de tipo 5; caso de CJD humana, PrP^{Sc} de tipo 2, 6 y 7, patrón de PrP^{Sc} de tipo 5 en ratones transgénicos en los que se ha inoculado vCJD.

La Figura 9 muestra transferencias de Western de muestras tratadas con proteinasa K de pacientes con CJD, usando el anticuerpo monoclonal anti-PrP 3F4. Los números adyacentes a las barras horizontales indican las posiciones de los marcadores de peso molecular (kilodaltons). Calles: 1, cepa de CJD de tipo 2; 2, cepa de CJD de tipo 6; 3, cepa de CJD de tipo 7, calles 4, 5 y 6, capa de CJD de tipos 1, 2 y 4, respectivamente.

Ejemplos Ejemplo 1 Métodos Selección y análisis de genética molecular de pacientes

Se estudiaron veintiséis casos de CJD esporádica confirmados neuropatológicamente, incluyendo los tres genotipos del codón 129, seis casos de CJD iatrogénica confirmada neuropatológicamente y diez casos de la "nueva variante" de CJD confirmados neuropatológicamente de acuerdo con la Unidad Nacional de Vigilancia de CJD o el Grupo de Enfermedades Producidas por Priones, de los que se disponía de tejido cerebral congelado. Las muestras cerebrales usadas fueron corteza cerebral, normalmente corteza frontal. Se extrajo ADN de sangre o de tejido cerebral y se analizó la presencia de mutaciones de codificación conocidas o nuevas en el gen de la proteína prión (PRNP) y para determinar el genotipo del codón 129. En 8/10 casos de "nueva variante" de CJD y en la mayoría de pacientes con CJD esporádica e iatrogénica, la fase de lectura abierta de PRNP completa se amplificó por PCR usando cebadores oligonucleotídicos elegidos de manera que no se solapara un polimorfismo de intrón 5' con respecto a la fase de lectura abierta, lo cual puede conducir a la no amplificación de ciertos alelos, como se ha descrito anteriormente^{35}. El producto de PCR se fraccionó por tamaños en geles de agarosa para excluir mutaciones de inserción o deleción, y después los productos de PCR se secuenciaron en las dos cadenas de ADN usando un secuenciador automático de ADN ABI 373 o 377.

Análisis por transferencia de Western

Se homogeneizaron entre 10 y 20 mg de tejido cerebral en tampón de lisis (NP-40 al 0,5%, desoxicolato sódico al 0,5% en solución salina tamponada con fosfato) mediante pases en serie a través de agujas de diámetro decreciente. El homogeneizado se aclaró por centrifugación a 2.000 rpm durante 5 minutos. Se añadió proteinasa K (BDH) a una concentración final de 50 \mug/ml y las muestras se incubaron a 37ºC durante 1 hora. La reacción se terminó añadiendo Pefabloc (Boehringer) a 1 mM. Las muestras se mezclaron con 2 x tampón de carga SDS (tris-HCl 125 mM, SDS al 4%, glicerol al 20%, azul de bromofenol al 0,02%, pH 6,8) y se hirvieron durante 10 minutos. Después se centrifugaron a 14.000 rpm en una microcentrífuga durante 5 minutos antes de la electroforesis. Se sometieron a electroforesis entre 1 y 20 \mul de muestra en geles de tris-glicina al 16% (Novex)^{36}. Después, los geles se electrotransfirieron sobre una membrana de PVDF (Millipore) usando un depósito o un sistema de transferencia semi-seco^{37}. Las membranas se bloquearon en BLOTTO al 5% (leche desnatada en polvo al 5% en PBS con Tween 20 al 0,05%) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar en PBST (PBS con 0,05% de Tween 20), las membranas se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-PrP 3F4^{38} (diluido 1:5.000 en PBST) o anticuerpo policlonal de conejo R073^{39} (diluido 1:10.000 en PBST) durante un periodo comprendido entre 1 hora y una noche. Después del lavado, la membrana se incubó con anticuerpo de conejo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma) o anticuerpo de cabra anti-conejo (Sigma) a una dilución de 1:10.000 en PBST durante 1 hora. Las membranas se lavaron de nuevo en PBST y se revelaron usando un substrato quimioluminiscente (ECL; Amersham) usando una película Biomax MR (Kodak).

Desglicosilación de proteínas prión

Se desnaturalizaron 25 \mul de homogeneizado cerebral al 10% pre-tratado con proteinasa K, en SDS al 0,5% y \beta-mercaptoetanol al 1% durante 10 minutos a 100ºC. Se añadió NP-40 al 1% y las proteínas se incubaron en 500 unidades de PNGasaF (New England Biolabs), usando el tampón patentado, a 37ºC durante 2 horas. Después de la digestión, las proteínas se precipitaron con 4 volúmenes de metanol, se resuspendieron en tampón principal SDS y se sometieron a transferencia de Western como se ha indicado anteriormente.

Cuantificación de las proporciones de glicoformas de PrP

Las transferencias se exploraron en un densitómetro de exploración Hoefer (modelo GS300) y se obtuvieron las cantidades relativas de las diferentes glicoformas mediante integración computerizada de los picos representando cada una de las tres bandas distintas. La exploración se realizó tras exposiciones en el intervalo lineal de la película fotográfica.

Estudios de transmisión en ratones transgénicos y no transgénicos

Se siguieron protocolos estrictos de bioseguridad. Se criaron ratones transgénicos que expresaban PrP humana y se mantuvieron en una instalación de contención microbiológica animal de nivel I y se trasladaron a una instalación con contención de nivel II donde se realizó la inoculación intracerebral en una vitrina de seguridad microbiológica de Clase I. La preparación de los inóculos y la retirada de los tejidos se realizaron en una instalación con contención microbiológica de nivel III. Todos los ratones se examinaron dos veces por semana para comprobar el desarrollo de signos clínicos de scrapie. Al inicio de los signos, los ratones se examinaron diariamente. Los ratones se sacrificaban si mostraban cualquier signo de malestar. Los criterios para el diagnóstico clínico de scrapie en ratones fueron como se han descrito anteriormente^{40}. Se establecieron líneas transgénicas que expresaban PrP humana pero no PrP murina cruzando ratones transgénicos para PrP humana (denominados Tg152, producidos como se ha descrito anteriormente^{25}) con ratones homocigotos para alelos PrP nulos^{41}. Se determinó el genotipo de todos los ratones para confirmar la presencia del transgen HuPrP o alelos PrP nulos mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) con ADN genómico obtenido mediante biopsia de la cola como se ha descrito^{42}. Los ratones Tg152 tienen niveles de expresión de PrP humana de un 200% de los observados en cerebro humano normal^{42}. Los ratones se anestesiaron con halotano/O_{2} y se inocularon intracerebralmente en el lóbulo parietal derecho con 30 \mul de un homogeneizado cerebral al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Ejemplo 2

Las diferentes cepas de priones se distinguen por sus propiedades biológicas en la transmisión a animales de laboratorio y por diferencias físicas y químicas en las cepas de PrP^{Sc}. Ahora hemos descubierto que las características biológicas y de transmisión molecular de vCJD son coherentes con que sea el homólogo humano de la BSE.

Estudiamos ratones transgénicos que expresaban sólo PrP humana (HuPrP^{+/+} Prn-p^{0/0}), que, como se ha demostrado, carecen de una barrera de especies para los priones humanos de un caso de CJD iatrogénica, comparándolos con ratones no transgénicos (FVB). Los 16 casos de CJD, que englobaban un amplio intervalo de fenotipos clinicopatológicos, los tres tipos de PrP^{Sc} presentados en enfermedades producidas por priones esporádicas y adquiridas y todos los genotipos de PRNP en el codón polimórfico 129, una clave determinante de susceptibilidad genética a enfermedades producidas por priones humanas se transmitieron a estos ratones transgénicos.

Casi todos los ratones transgénicos inoculados contrajeron la enfermedad con periodos cortos de incubación similares, lo cual es coherente con la falta de barrera de especie para estos aislados (tabla 2). Estos ratones transgénicos expresan PrP humana homocigota para valina en el codón 129. Sin embargo, no hubo ninguna diferencia significativa en los periodos medios de incubación entre inóculos de los diferentes genotipos del codón 129. La tipificación de PrP^{Sc} de estas transmisiones demostró que se producen los mismos tipos de priones observados en CJD esporádica e iatrogénica (tipos 1-3), distintos de los observados en vCJD (tipo 4). En ratones FVB sólo se observaron transmisiones ocasionales, a periodos de incubación más largos y variables.

Por el contrario, se observó una transmisión eficaz de vCJD a ratones FVB (tabla 2), aunque los periodos de incubación fueran prolongados. A la inversa, la proporción de ataque de vCJD en los ratones transgénicos se redujo en comparación con la CJD típica, y los periodos de incubación fueron generalmente más viables y prolongados. Los periodos medios de incubación para estos seis casos de vCJD fueron similares en los dos tipos de ratones. El transcurso clínico en ratones transgénicos inoculados con vCJD fue mucho mayor que en las transmisiones de CJD típica. La vCJD en seres humanos también está relacionada con una larga duración clínica. Algunos ratones, además de mostrar características neurológicas típicas, caminaban hacia atrás persistentemente. Este signo clínico inusual no se observó en las transmisiones de CJD típica, insomnio familiar fatal u otras enfermedades producidas por priones heredadas.

La BSE se transmite eficazmente a ratones FVB, aunque con periodos de incubación prolongados y variables (tabla 2) que se reducen a un periodo de incubación corto consistente de aproximadamente 140 días tras el segundo pase (datos no mostrados). Las transmisiones de BSE a los ratones transgénicos no se produjeron en periodos de incubación más allá de los de la CJD clásica, aunque ahora hemos observado transmisión con periodos de incubación mucho mayores (tabla 2). Estas transmisiones se parecían a las de vCJD con una larga duración clínica y con pasos hacia atrás de algunos animales, así como las características clínicas típicas del scrapie en ratones.

Hubo similitudes sorprendentes en los patrones de deposición de PrP entre los animales inoculados con BSE y con vCJD (se publicarán estudios neuropatológicos detallados en otra parte). Dichos patrones se determinan por el genotipo del hospedador así como por la cepa del agente. Vimos distintos patrones en los dos tipos de ratones, aunque en cada caso, vCJD y BSE produjeron patrones muy similares. En ratones no transgénicos inoculados con vCJD y BSE, hubo placas de PrP y deposición difusa de PrP. En ratones HuPrP^{+/+} Prn-p^{0/0} transgénicos inoculados con vCJD y BSE vimos un patrón predominantemente pericelular de inmunotinción de PrP (datos no mostrados). Las placas de PrP son una característica rara de la enfermedad producida por priones en ratones. Los ratones transgénicos inoculados de manera simulada ocasionales mostraron una inmunotinción de PrP pericelular más débil y menos extensiva, reflejando probablemente el alto nivel de sobreexpresión de PrP^{C} en estos ratones. La transferencia de Western para PrP^{Sc} fue negativa en todos estos controles.

Se realizó un análisis por transferencia de Western para determinar los tipos de PrP^{Sc} producidos en estas transmisiones. Previamente hemos demostrado que el tipo de PrP^{Sc} observado en vCJD (tipo 4) tiene una proporción de glicoformas muy similar a la de la BSE sometida a pases en otras diversas especies^{2}. Los ratones FVC inoculados con vCJD produjeron PrP^{Sc} de ratón con proporciones de glicoforma parecida al tipo 4 y los tamaños de los fragmentos fueron indistinguibles de los observados en ratones FVB inoculados con BSE (Fig. 1a,b).

En la transmisión de vCJD a ratones HuPrP^{+/+} Prn-p^{0/0} transgénicos en los que se genera PrP^{Sc} humano, los tamaños de los fragmentos en el inóculo y el hospedador pueden compararse directamente. De nuevo, la PrP^{Sc} producida tenía proporciones de glicoformas similares al tipo 4. Sin embargo, los tamaños de los fragmentos fueron diferentes de los del inóculo y fueron indistinguibles de los del patrón PrP^{Sc} de tipo 2 (Fig. 1c). Hemos denominado tipo 5 a este nuevo patrón.

Anteriormente se ha presentado un cambio en el tamaño del fragmento en el pase en ratones de un genotipo del codón 129 de PrP diferente que el del inóculo. La PrP^{Sc} de tipo 1, observada en casos de CJD de genotipo de PRNP 129MM, se convierte consistentemente en PrP^{Sc} de tipo 2 en el pase en estos ratones transgénicos que expresan PrP humana 129VV. También se mantienen las proporciones de glicoformas del inóculo original^{2}. Se reconocen claramente cambios abruptos en las propiedades biológicas ("mutación") de cepas de scrapie murino en el pase en ratones de diferentes genotipos. Sin embargo, no hemos podido demostrar PrP^{Sc} mediante transferencia de Western en ratones HuPrP^{+/+} Prn-p^{0/0} transgénicos inoculados con BSE. Esto puede reflejar el sacrificio de muchos de estos ratones poco después del diagnóstico clínico en lugar de en un estado clínico más avanzado. Aunque se ha informado sobre la transmisión de enfermedades producidas por priones sin PrP^{Sc} detectable en el pase primario, será importante confirmar la transmisión mediante estudios de pase secundario.

Las valoraciones de priones en estos inóculos primarios son desconocidas, pero pueden ser mayores en los casos humanos, porque el ganado vacuno con BSE se habrá sacrificado antes de las etapas terminales de la enfermedad. Sin embargo, según el criterio clínico, patológico y molecular, vCJD muestra una similitud notable en sus características de transmisión a la BSE, y es bastante diferente de todas las demás formas de CJD esporádica y adquirida. Estos datos proporcionan una evidencia convincente de que BSE y vCJD están causadas por la misma cepa de priones. Tomados conjuntamente con la asociación temporal y espacial de vCJD con BSE pero no con scrapie u otras enfermedades producidas por priones en animales, y estudios de transmisión de BSE en macacos, esto sugiere fuertemente que la vCJD está causada por exposición a BSE. La posibilidad teórica de que tanto BSE como vCJD surjan de la exposición a una fuente común no identificada parece remota.

La producción de un tipo de cepa molecular diferente en la transmisión de vCJD a ratones que expresan PrP humana con valina 129 sugiere que la BSE transmitida a seres humanos de este genotipo podría producir una cepa similar. Estos casos pueden diferenciarse en su fenotipo clínico y patológico para vCJD, pero podrían identificarse tipificando PrP^{Sc}.

Aunque se ha argumentado que la barrera de especie reside en las diferencias de la estructura primaria de PrP entre el donante y el hospedador, nuestros datos enfatizan que el tipo de cepa puede ser igual de importante. Como la propagación de priones implica interacciones entre PrP^{Sc} y PrP^{C} de hospedador, y las cepas están relacionadas con diferencias en la conformación de PrP y glicosilación, estas interacciones de PrP pueden ser más eficaces si las proteínas que interaccionan no son sólo de la misma secuencia sino que tienen preferencias conformacionales y glicosilación similares. El emparejamiento inadecuado del codón 129 entre el inóculo y ratones HuPrP^{+/+} Prn-p^{0/0} no afecta significativamente a la transmisión de CJD, pero esto podría ser diferente para BSE. Todos los casos de vCJD han sido de genotipo 129 MM. Aunque nuestros ratones 129VV son mucho menos susceptibles a BSE que a la CJD típica, lo que sugiere una barrera entre especies substancial, los ratones con PrP humana 129MM podrían ser más susceptibles.

Ejemplo 3

Se tipificó la PrP^{Sc} de muestras de 100 pacientes con CJD de acuerdo con los métodos ya descritos anteriormente. Por consiguiente, pueden identificarse dos nuevos patrones diferentes de PrP resistente a proteasa en transferencias de Western. Se denominan tipos 6 y 7 (figura 9) y se cree que son sub-tipos adicionales de la CJD clásica.

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Claims (15)

1. Un método para tipificar una muestra de una enfermedad producida por priones o encefalopatía espongiforme que comprende comparar e identificar propiedades fisioquímicas similares de la muestra con una muestra patrón de un tipo de PrP^{Sc} conocido, donde las propiedades fisioquímicas son los tamaños y las proporciones de las distintas glicoformas de PrP^{Sc}.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo el método adicionalmente comparar la resistencia a proteasa de la muestra con una muestra patrón de tipo de PrP^{Sc} conocido.

3. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la muestra patrón de tipo de PrP^{Sc} conocido es encefalopatía espongiforme bovina o enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la encefalopatía espongiforme procede de un mamífero o de pollo, en particular es de origen bovino, felino, cervino, ovino, de ser humano u otro primate (adecuadamente macaco) o murino.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, comprendiendo el método las etapas de someter la muestra a digestión con una proteasa, someter a electroforesis el resultado de la etapa de digestión y comparar el patrón resultante de la electroforesis con una patrón de electroforesis convencional de una muestra con PrP^{Sc} conocido.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la tipificación de la muestra comprende un método de diagnóstico de una enfermedad.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra a tipificar procede de un mamífero o de pollo, en particular procede de un ser humano u otro primate (adecuadamente macaco), o es de origen bovino, felino, ovino, cervino o murino.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra a tipificar procede de tejido cerebral, otro tejido del sistema nervioso central, un tejido del sistema linforreticular incluyendo el bazo, las amígdalas o los ganglios linfáticos, líquido cefalorraquídeo y/o la sangre.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el patrón de electroforesis de la muestra de PrP^{Sc} conocida tiene un patrón substancialmente similar al del tipo 4 como se describe en la figura 4.

10. Un método para identificar una infección en un animal y/o tejido de encefalopatía espongiforme bovina, comprendiendo el método proporcionar una proteína prión de un animal y/o muestra de tejido e identificar que dicha proteína prión puede caracterizarse por tener tres bandas diferentes en un gel de electroforesis después de digestión con proteinasa K, comprendiendo las bandas: i) una banda con el mayor peso molecular en la mayor proporción, ii) una banda con el menor peso molecular en la menor proporción y iii) una banda con un peso molecular entre i e ii y con una proporción entre i e ii, y que se caracteriza por tener proporciones de glicoformas substancialmente similares a la encefalopatía espongiforme bovina.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el animal o el tejido no es bovino.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que el animal y/o tejido del que se toma la muestra de priones procede de un mamífero o de pollo, en particular procede de un ser humano u otro primate (adecuadamente macaco), o es de origen bovino, felino, cervino, ovino o murino.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el prión procede de tejido cerebral, otro tejido del sistema nervioso central, un tejido del sistema linforreticular incluyendo el bazo, las amígdalas o los ganglios linfáticos, el líquido cefalorraquídeo y/o la sangre.

14. Uso de un compuesto que inhibe la unión covalente de azúcares a proteínas o glicoproteínas en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de encefalopatía espongiforme bovina o variante de la enfermedad de Creutzfeldt Jakob.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el compuesto es desoxinojirimicina o un derivado de la misma.