KR101402554B1 - β-글루코세레브로시다제의 활성 증진에 의한 신경계 장애 치료 방법 - Google Patents

Abstract

야생형 β-글루코세레브로시다제의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 중추 신경계에서 β-글루코세레브로시다제의 발현 또는 활성 증가가 유익한 신경계 질환을 앓는 개체를 치료하고/거나 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 β-글루코세레브로시다제에 대한 약리학적 샤페론을 유효량 투여하는 것을 포함하되, 단, 개체는 β-글루코세레브로시다제를 코딩하는 유전자에 돌연변이를 갖지 않는 개체이다. 추가로, 특이적인 약리학적 샤페론으로서 동정되고, 중충 신경계에서 생체내 β-글루코세레브로시다제의 활성을 증가시키는 것으로 나타난 β-글루코세레브로시다제 저해제도 제공한다.

β-글루코세레브로시다제, 약리학적 샤페론, 신경퇴행성 장애

Description

β-글루코세레브로시다제의 활성 증진에 의한 신경계 장애 치료 방법{METHOD FOR THE TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISORDERS BY ENHANCING THE ACTIVITY OF β-GLUCOCEREBROSIDASE}

본 출원은 2006년 6월 23일 출원된 미국 가특허 출원 시리얼 번호 제60/815,952호 (그의 개시 내용 전문이 본원에서 참고로 인용된다)로부터 우선권을 주장한다.

본 발명의 기술분야

본 발명은 예를 들면, 파킨슨병과 같은 α-시누클레인 병증 치료, 및 니이만-픽 c형 질환 치료를 위해 리소좀성 효소인 β-글루코세레브로시다제의 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 가정컨대 β-글루코세레브로시다제를 안정시킴으로써 세포질 수송, 및 β-글루코세레브로시다제의 효소 활성을 증가시키는, β-글루코세레브로시다제에 대하여 특이적인 약리학적 샤페론을 제공한다.

신경퇴행성 질환에서의 단백질 응집

뉴런에서 프로테아좀성 시스템 및 리소좀성 시스템은 손상된 단백질, 미스폴딩된 단백질 또는 과량의 단백질을 분해시킴으로써 단백질 항상성을 유지시키기 위해 함께 작용한다. 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 고셰병, 타이 삭스, 파아버, 니이만-픽 A형, B형 & C형, G_M1 강글리오시드증, G_M2 강글리오시드증, 및 MPS-I를 비롯한, 단백질 또는 지질의 병적 응집과 관련된 다수의 신경퇴행성 질환은 프로테아좀성 기능 및 리소좀성 기능이 손상된 것으로 나타난다. 뉴런 스트레스 또는 단백질 응집과 관련된 기타 원인으로부터 유발된 신경퇴행이나 아포프토시스 이후에는 뉴런이 재생될 수 없기 때문에 뉴런에서의 단백질 응집은 특히 무서운 것이다.

단백질 응집 및 리소좀 . 리소좀성 시스템은 프로테아좀이 분해하기 어려운 단백질 응집체의 축적을 막는데 중요하다. 단백질 응집체 분해에 있어서 리소좀의 중요성은 인간 뇌에서 발견된 단백질 응집체와 함께 동일한 구조체에 공동으로 위치하는 리소좀성 단백질 및 자가포식 마커에 관한 많은 보도에 의해 입증되었다 ([Bjorkoy et al, J Cell Biol. 2005;171(4):603-14]; [Tribl et al., Mol Cell Proteomics, 2005; 4(7): 945-57]; [Wong et al., Mol genet Metab, 2004. 82(3): 192-207]; [Zhou, J Biol Chem. 2004. 279(37): 39155-64]). 특히, 산성인 구획 (리소좀)의 중화는 유사분열 이후의 뉴런 세포에서 α-시누클레인 (α-syn) 응집체의 축적을 유도하고, α-syn 독성을 악화시킨다 [Lee, J Neurosci, 2004; 24(8): 1888-96]. 병적 α-syn 응집은 파킨슨병 및 기타 α-시누클레인 병증과 관련이 있다. 최근, α-syn이 축적된 트랜스제닉 마우스 모델에 대한 리소좀 기능장애가 보고된 바 있다 ([Meredith et al., Brain Res, 2002; 956(1):156-65]; [Rockenstein et at, J Neurosci Res, 2005; 80(2): 247-59]).

단백질 응집 및 프로테아좀 . 프로테아좀은 세포질 단백질 분해에 있어서 없어서는 안될 중요한 요소이다. 프로테아좀-매개 분해는 폴리유비퀴틴 쇄에 의한 기질의 변형으로 시작되는데, 이는 다촉매 프로테아제 복합체인 26S 프로테아좀에 의한 단백질 가수 분해를 표적으로 한다. 유비퀴틴이 신경퇴행성 질환의 특징을 나타내는 다수의 선상 봉입체의 구성 요소라는 것이 연구를 통해 밝혀졌으며, 이는 상기와 같은 유형의 질환 진행 과정에서 공통된 뉴런 반응의 활성화를 제안한다 [Lowe et al., Neuropathol Appl Neurobiol. 1990; 16: 281-91]. 가족성 파킨슨병 과 관련된 유전자 (SNCA)에서의 돌연변이 동정, 및 산발성 파킨슨병 사례에서 여분의 도파민 흑질 뉴런내 단백질성 세포질 봉입체의 존재 확인을 비롯한 유전적 연구는 이러한 질환에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 대한 중요한 역할과 비정상적인 단백질 분해에 대해 제안하였다 [Betarbet et al., Exp Neurol. 2005;191 Suppl 1:S17-27].

뉴런을 비롯한 세포내 다수의 미스폴딩된 단백질 및 지질의 축적 또는 응집이 소포체 및 세포 스트레스를 일으킨다는 것이 잘 확립되어 있기 때문에 세포 "스트레스" 단백질인 폴리유비퀴틴 양의 증가는 프로테아좀 시스템이 과활성화된다는 것을 제안한다. 그러나, CNS 응집 질환의 경우 뉴런 항상성에 있어서 파괴에 대한 대안적 이론은 유비퀴틴/프로테아좀 경로의 억제에 기인한다 [Rocca et al., Molecular Biology of the Cell. 2001; 12: 1293-1301]. 생체내 및 시험관내 연구 둘 모두는 둘다가 파킨슨병의 특성인 α-syn 응집과 산화적 스트레스를 손상된 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 및 파킨슨병 발병기전과 연관시켰다 [Lev et al., Neurosci Lett. 2006; 399(1-2):27-32]. 특히, 프로테아좀 저해와 조합된 활성 산소종 (ROS)에 대한 노출은 프로테아좀 저해만을 단독으로 한 것보다도 더 α-syn 응집체 형성을 증가시켰다. 게다가, 잠재적으로 세포독성인 비정상 단백질의 축적 및 응집과 함께 26/20S 프로테아좀의 구조적 및 기능적 결함이 산발성 파킨슨병을 앓는 환자의 흑색질 치밀부에서 동정되었다 [McKnaught et al, Ann Neurol. 2003; 53 Suppl 3:S73-84]. 추가로, 단백질의 미스폴딩을 유발하고, 프로테아좀 분해를 방해하는 SNCA에서의 돌연변이가 가족성 파킨슨병과 관련이 매우 높다. 또한, 응집된 α-syn는 프로테아좀의 하위유니트인 S6'과의 상호작용에 의해 프로테아좀 기능을 저해하는 것으로 나타났다 [Snyder et al., J Mol Neurosci. 2004; 24(3):425-42]. 마지막으로, 프로테아좀 기능은 파킨슨병을 앓는 대상자의 뇌 뿐만 아니라, E3 유비퀴틴 리가제이자 유비퀴틴프로테아좀 시스템의 중요한 부분인 파킨이 결여되어 있는 개체 및 동물로부터 유래된 뇌에서 감소되어 있다.

따라서, 프로테아좀에 의한 단백질 처리에 있어서 나타내는 결함이 산발성 및 각종 가족성 형태의 파킨슨병에서의 공통 요인인 것으로 보인다. 단백질 미스폴딩을 유도하는 제제와 프로테아좀 저해제와의 조합물을 도파민 뉴런 배양물에 첨가한 실험으로부터 상기와 동일한 결론을 도출해 내었다 [Mytilineou et al., J Neural Transm. 2004; 111(10-11):1237-51]. 도파민 뉴런의 우선적 손실과 세포 사멸은 두가지가 조합되었을 때에 현저히 증가하였다.

극도로 낮은 수준의 프로테아좀 저해도 유비퀴틴 프로테아좀성 시스템을 하향 조절시킬 수 있고, 리소좀성 시스템 또는 자가포식 반응을 활성화시킬 수 있다 ([Ding et al., J Neurochem, 2003; 86(2):489-97]; [Iwata et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2005; 102(37):13135-40]; [Butler et al., Rejuvenation Res. 2005; 8(4):227-37]). 내인성 ER 샤페론과 손상된/변성된/미스폴딩된 단백질 사이의 불균형으로 인하여 불균형의 경중도에 따라 손상된/변성된/미스폴딩된 단백질은 축적되고, 노화, 프로테아좀 저해 (이는 아포프토시스를 일으킨다), 또는 괴사가 일어난다고 제안되었다 [Soti et al., Aging Cell. 2003; 2; 39-45]. 이러한 가설을 "독성 단백질 축적 가설"로 언급된다.

지질 결함 및 신경퇴행성 질환

리소좀성 축적병, 예를 들면, 고셰병, 타이 삭스, 파아버, 니이만-픽 A형, B형 및 C형, G_M1 강글리오시드증, 및 MPS-I 질환으로부터 입증된 바와 같이, 지질 축적은 신경퇴행과 관련이 있다고 잘 알려져 있다. 그러나, 리소좀성 하이드롤라제가 결핍되어 있는 것이 아닌 신경계 질환에서도 기타의 지질 축적이 관찰되었다. 일례로서 락토실세라마이드, GlcCer, G_M2-강글리오시드, 및 아시알로-G_M2의 병적 축적이 니이만-픽 C형 질환에서 관찰되는데, 상기 질환은 산성 스핑고마이엘리나제를 코딩하는 유전자에서의 미스센스 돌연변이에 기인한 산성 스핑고마이엘리나제 결핍과는 관련이 없는 리소좀성 콜레스테롤 축적병이다 [Vanier et al., Brain Pathology. 1998; 8: 163-74]. 이러한 축적은 예를 들면, 결함성 지질 수송과 같은 다른 기전에 의해 유발될 수 있다. 건강한 엔도좀 수송 시스템은 뉴런 기능에 중요하다 [Buckley et al., J Physiol, 2000; 525(Pt 1):11-9]. GlcCer를 비롯한 당스핑고지질 기전 파괴는 세포 수송을 손상시키고, 콜레스테롤 격리 및 축적을 유발한다 ([Pagano et al., Traffic, 2000; 1(11): 807-15]; [Sillence et al., J Lipid Res, 2002; 43(11):1837-1845]; [Helms et al., Traffic, 2004; 5(4):247-54]). 축적된 당지질은 엔도좀 시스템에서 정상적인 수송을 유지시키는데 중요한 단백질을 격리시킬 수 있는 "지질 뗏목(raft)"을 형성한다 [Pagano, 상기 문헌]. 게다가, 니이만-픽 C형 질환 세포로부터 유래된 섬유모세포에서 관찰되는 지질 수송의 결함은 당스핑고지질 생합성의 강력한 저해제를 사용하는 치료를 통해 가역화될 수 있으며 [Lachmann et al., Neurobiol Dis, 2004; 16(3):654-8], 추가로 상기 질환의 병상에 GlcCer 및 기타 지질이 관여하고 있음을 분명히 나타내고 있다.

추가로, 지질 뗏목과의 결합은 α-syn을 그의 본래의 세포 위치인 시냅스로 정상적으로 위치시키는데 필요하다 [Fortin et al., J Neurosci, 2004; 24(30):6715-23]. 파킨슨병 병상과 관련된 돌연변이는 이러한 결합을 파괴시킨다. 따라서, 이러한 결합 또한 파괴시키는 지질 뗏목 조성에서의 변화는 α-syn의 정상적인 위치화와 분포도 손상시킴으로써 파킨슨병의 원인이 될 수 있다.

당스핑고지질은 단백질 응집의 시딩을 돕는다.

알파-시누클레인은 강글리오시드에 대하여 고도의 친화성을 갖고, 야생형 α-syn은 그의 핵심에 GlcCer를 갖는 강글리오시드와 SDS 안정적 복합체를 형성한다 [Zimran et al., N Engl J Med, 2005; 352(7):728-31]. α-syn 및 β-아밀로이드 단백질 둘 모두의 가용성 형태는 G_M1에 강하게 결합하여 잠정적으로는 응집을 시딩 한다. ([Yanagisawa et al., Neurobiol Aging, 1998; 19(1 Suppl):S65-7]; [Yanagisawa et al., Nat Med, 1995; 1(10):1062-6]; [Lee et al., J Biol Chem, 2002; 277(1): 671-8]; [Hayashi et al., J Neurosci. 2004; May 19;24(20):4894-902]). 최근, 세포에 기초한 실험을 통해서 리소좀성 효소인 β-글루코세레브로시다제 (GCase)의 돌연변이가 파킨슨병의 발병 위험을 증가시킬 수 있다는 것이 입증되었다 ([Aharon-Peretz, et al., N Engl J Med, 2004; 351(19): 1972-7]; [Goker-Alpan et al., J Med genet, 2004; 41(12):937-40]; [Clark et al., Mov Disord, 2005; 20(1):100-3]; [Eblan et al., Mov Disord, 2005; 31 :31]). 돌연변이체 대립유전자의 보인자에서는 (조직학적으로) 상당 수준의 글루코실세라마이드가 축적되지 않는 것으로 나타나지만, 당스핑고지질 기전에서의 미세한 변화는 예를 들면, 정상적인 응집체에 대한 자가포식 반응을 파괴시키거나, 프로테아좀을 저해시킴으로써 이들 개체에서 파킨슨병이 발병될 위험을 증가시킬 수 있다. 추가로, (GCase 결핍에 기인한) 1형 고셰병 및 파킨슨증/치매을 앓는 환자는 해마 CA2-4 뉴런내 α-syn 양성 봉입체를 나타내었는데; 어느 환자는 뇌간형 및 피질형 루이 소체를 가졌고, 어느 환자는 흑색질 뉴런의 뚜렷한 뉴런 손실을 가졌다 [Wong et al., Mol. genet. Metabol. 2004; 38: 192-207].

유사하게, 시험관내에서 뇌 지질의 큰 단일 소포는 헌팅톤병에서 축적되는 병적 단백질인 가용성 N-말단 헌팅틴 엑손 1 단편과 용이하게 결합하였고, 돌연변이체 헌팅틴 응집체의 원섬유발생을 자극하였다 [Suopanki et al., J Neurochem. 2006; 96(3):870-84]. 최근, 샌드호프병 (G_M2 강글리오시드증)에 대한 마우스 모델에서는 G_M2 강글리오시드 외에도 α-syn 및 β-시누클레인이 뉴런에 축적되었다 [Suzuki et al., Neuroreport., 2003; 14(4):551-4]. 따라서, 강글리오시드 기전을 조작하는 것은 단백질이 응집체를 형성하는 성향에 영향을 줄 수 있다.

상기 내용은 생체내 지질 상호작용이 단백질의 미스폴딩에 영향을 줄 수 있으며, 신경퇴행성 질환 발병기전에서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 제안한다.

지질 및/또는 단백질 축적 및 염증

파킨슨병의 발병기전에 있어서 염증이 중요한 역할을 한다는 것이 점차로 인지되고 있다. 염증 및 면역, 또는 심지어 자가면역, 징후도 죽은 파킨슨병 환자 뇌에서 설명되었다. 알파-syn 응집체는 미세아교세포를 활성화시켜, 결과적으로는 만성 염증을 일으킴으로써 신경퇴행을 유발시킬 수 있다 [Wersinger et al., Curr Med Chem. 2006;13(5):591-602].

특이적인 효소 저해제로부터 유도된 약리학적 샤페론은

돌연변이체 효소를 구제하고, 야생형 효소를 증진시킨다.

LSD와 관련된 효소의 소분자 저해제와의 결합이 돌연변이체 효소 및 상응하는 야생형 효소, 둘 모두의 안정성을 증가시킬 수 있다는 것이 앞서 제시된 바 있다 (미국 특허 번호 제6,274,597호; 제6,583,158호; 제6,589,964호; 제6,599,919호; 제6,916,829호, 및 제7,141,582호 (상기 모두는 본원에서 참고로 인용된다)). 특히, 수개의 표적 리소좀성 효소에 대하여 특이적이고 선택적인 경쟁적 저해제인, 글루코스 및 갈락토스의 소분자 유도체를 투여하는 것이 시험관내에서 세포내 효소의 안정성을 효과적으로 증가시킬 수 있고, 이로써는 효소 활성을 측정함으로써 측정된 바 리소좀내 효소의 양을 증가시킬 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 리소좀내 효소의 양을 증가시킴으로써 효소 기질의 가수분해가 증가될 것으로 예측된다. 이러한 전략법을 지지하는 원래의 이론은 하기와 같았다: 돌연변이체 효소 단백질은 ER에서 불안정하기 때문에 [Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815], 효소 단백질은 정상적인 수송 경로에서 지체되고 (ER → 골지체 → 엔도좀 → 리소좀), 조기에 분해된다. 그러므로, 돌연변이체 효소에 결합하여 돌연변이체 효소의 안정성을 증가시키는 화합물은, 상기 효소에 대한 "샤페론"으로서 작용할 수 있으며, ER에서 나와, 리소좀으로 이동할 수 있는 양을 증가시킬 수 있다. 추가로, 몇몇 야생형 단백질의 폴딩과 수송이 불완전하고, 동시에 몇몇 야생형 단백질 중 70% 이하는 몇몇의 경우에 그의 최종 세포 위치에 도달하기 이전에 분해될 수 있기 때문에, 야생형 효소를 안정화시키기 위해서, 그리고 ER에서 나와 본래의 세포 위치로 수송될 수 있는 효소의 양을 증가시키기 위해 샤페론이 사용될 수 있다.

몇몇 효소 저해제는 효소의 촉매 중심 ("활성 부위")에 특이적으로 결합함으로써 시험관내에서 효소 구조를 안정화시키는 것으로 알려져 있기 때문에 다소 역설적으로 말하자면 이들 저해제가 ER로부터 나오기, 리소좀으로의 수송, 및 가수분해 활성을 회복시키는데 도움을 줄 수 있는 효과적인 샤페론인 것으로 제안되었다. 이와 같이 특이적인 약리학적 샤페론은 특이적인 양식으로 효소의 활성 부위에 결 합하고, 모든 단백질에 대해 일반적인 효과를 발하지는 않기 때문에 "활성 부위-특이 샤페론 (ASSCs)" 또는 "특이적인 약리학적 샤페론"으로 명명되었다.

리소좀성 GCase에 돌연변이를 갖고, 이로써, GCase 활성이 감소되어 있는 개체의 파킨슨병을 치료하는 방법은 2006년 6월 8일 출원된 미국 동시 계류 출원 시리얼 번호 제11/449,528호에 기술되어 있다. 돌연변이체 리소좀성 효소의 구제가 특정 질환의 병상을 가역화시킬 수 있지만, 특정 리소좀성 효소의 돌연변이를 포함하는 것이 아니지만 그에 대해 리소좀성 효소를 증가시키는 것이 유익할 수 있는 질환의 병상을 완화시킬 필요성은 여전히 남아있다.

본 발명의 요약

본 발명은 유효량의, GCase에 대하여 특이적인 약리학적 샤페론을 투여함으로써 개체에서 신경계 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 여기서, 신경계 장애는 중추 신경계 세포내의 단백질 및 지질 응집과 관련이 있되, 여기서, 신경계 장애는 돌연변이체 GCase와는 관련이 없는 것이다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은 뉴런을 유효량의, GCase에 대하여 특이적인 약리학적 샤페론에 노출시킴으로써 세포내 폴딩 및 프로세싱, 및 이로써 야생형 GCase의 활성을 증진시키는 방법을 제공한다.

이러한 실시태양의 하나의 측면에서, 치료하고자 하는 신경계 장애는 α-시누클레인 병증이다.

특정 실시태양에서, a-시누클레인 병증은 파킨슨병, 루이 소체병, 다계통 위축증, 할러포르텐-스파츠 병, 또는 전측두엽 치매이다.

이러한 실시태양의 또다른 측면에서, 치료하고자 하는 신경계 장애는 파킨슨병이다.

이러한 실시태양의 또다른 측면에서, 치료하고자 하는 신경계 장애는 니이만-픽 C형 질환 (NPCD)이다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 약리학적 샤페론은 GCase의 가역적 저해제이다.

본 발명의 이러한 측면의 특정 실시태양에서, 약리학적 샤페론은 이소파고민 화합물, 예를 들면, 이소파고민 또는 C-노닐-이소파고민, C-벤질 이소파고민, 또는 본원에서 제공되는 바와 같은 이소파고민의 N-알킬 유도체이다. 또다른 특정 실시태양에서, 약리학적 샤페론은 글루코이미다졸 화합물, 예를 들면, 글루코이미다졸, (5R, 6R, 7S, 8S)-5-하이드록시메틸-2-옥틸-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[1,2-a]피리딘-6,7,8-트리올 또는 (5R, 6R, 7S, 8S)-5-하이드록시메틸-2-(3,3-디메틸부틸)-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[1,2-a]피리딘-6,7,8-트리올이다.

추가의 실시태양에서, GCase 효소 활성의 증가는 기저 수준에 비하여 적어도 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 또는 5배이나, 이에 한정되지 않는다.

신경퇴행성 장애가 니이만-픽 C형 질환인 대체 실시태양에서, 제2 치료제가 알로프레가놀론, 스타틴, 페노피브레이트, 니아신; 에제티미브, 결합 수지, β-헥소사미니다제 A 또는 산성 β-갈락토시다제에 대해 특이적인 약리학적 샤페론, 2-N-아세틸아미노-이소파고민, 1,2-디데옥시-2-아세트아미도-노지리마이신, 나그스타틴, 4-에피-이소파고민, 및 1-데옥시갈락토노지리마이신으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 GCase에 결합하는 약리학적 샤페론을 개체에게 투여함으로써 신경퇴행성 장애를 앓고 있거나, 신경퇴행성 장애가 발병될 위험에 있는 개체에서 신경퇴행성 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 여기서, 상기 개체는 GCase를 코딩하는 유전자에 돌연변이를 갖고 있지 않는 개체이다.

본 발명은 또한 GCase 샤페론과, 신경계 장애 치료용의 기타 치료제를 사용하는 병용 요법 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 GCase 약리학적 샤페론과 또다른 치료제의 혼합물을 포함하는 물질 조성물을 제공한다. 신경계 장애가 파킨슨병, 파킨슨증, 또는 루이 소체 치매인 실시태양에서, 제2 치료제는 레보도파, 항콜린제, 카테콜-O-메틸 트랜스퍼라제 (COMT) 저해제, 도파민 수용체 효현제, 모노아민 옥시다제 저해제 (MAOI), 말초 데카르복실라제 저해제, 및 소염제로 구성된 군으로부터 선택된다.

특허 또는 출원 파일은 적어도 하나의 컬러 도면을 포함하고 있다. 컬러 도면(들)이 있는 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 필수 비용의 요청과 지불에 의해 관청이 제공할 것이다.

도 1. 도 1은 4주 동안 200 mg/kg/일의 이소파고민 타르트레이트 (IFG; AT2101)로 처리된 정상적인 C57BL6 마우스의 비장, 폐, 뇌 및 간에서의 GCase 증진을 나타낸다.

도 2. 도 2는 건강한 지원자에게 이소파고민 타르트레이트를 투여한 이후의 GCase 활성 변화를 나타낸다.

도 3A-C. 도 3은 IFG 타르트레이트로 처리하거나 처리하지 않은, α-시누클레인을 과발현하는 트랜스제닉 마우스의 피질 중 α-시누클레인을 면역조직화학적 염색법으로 염색하였을 때의 결과를 나타낸다. 도 3A는 비히클 처리군으로부터 얻은 결과를 나타내고; 도 3B 및 3C는 3개월 동안 매일 2 mg/kg으로 처리한 마우스로부터 얻은 결과를 나타낸다.

도 4A-C. 도 4는 IFG 타르트레이트로 처리하거나 처리하지 않은, α-시누클레인을 과발현하는 트랜스제닉 마우스의 해마 중 α-시누클레인을 면역조직화학적 염색법으로 염색하였을 때의 정성적 결과를 나타낸다. 도 4A는 비히클 처리군으로부터 얻은 결과를 나타내고; 도 4B 및 4C는 3개월 동안 매일 2 mg/kg으로 처리한 마우스로부터 얻은 결과를 나타낸다.

도 5A-D. 도 5는 1마리의 트랜스제닉 마우스의 뇌로부터 유래된 샘플로, 프로테이나제 K로 전처리한 샘플 중 α-시누클레인을 면역조직화학적 염색법으로 염색하였을 때의 정성적 결과를 나타낸다.

도 6A-B. 도 6은 3개월 동안 처리하지 않았거나, 지시된 농도의 IFG로 처리된, α-시누클레인을 과발현하는 트랜스제닉 마우스의 피질 (A) 및 해마 (B) 중 α-시누클레인을 면역조직화학적 염색법으로 염색하였을 때의 정량적 결과를 보여준다. 1 ㎟당 α-시누클레인 양성 세포의 갯수를 평가하였다.

상세한 설명

본 발명은 특이적인 약리학적 샤페론이 응집된 단백질 및 기질 지질 축적과 관련된 병상을 저해시키는데 있어서 충분한 수준으로까지, 심지어는 예방할 수 있는 정도로까지 야생형 GCase의 활성을 증가시킬 수 있다는 발견에 관한 것이다. 이는 결과적으로는 중추 신경계의 세포내 상기 기질 단백질 및 지질의 응집과 관련된 신경계 위험 요소, 병태, 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.

특히, 본 발명은 GCase 활성 증가가 유익할 수 있는 신경계 장애를 앓는 것으로 진단받았거나, 그에 걸릴 위험에 있거나, 그러한 것으로 의심되는 개체에게 GCase에 대하여 특이적인 하나 이상의 약리학적 샤페론을 투여하는 방법을 제공한다. 적합한 약리학적 샤페론은 개체에게 투여된 후에 GCase에 특이적으로 결합하고, GCase의 안정성 및 수송을 증가시킴으로써 리소좀에서 GCase의 활성을 증가시키는 임의의 화합물(들)을 포함하되, 단, 상기 신경계 질환 또는 장애는 GCase를 코딩하는 유전자내 돌연변이와는 관련이 없는 것이다. 가정컨대, 더 안정적인 세포내 형태의 GCase의 결과로서 중추 신경계의 세포에서 효소 기능의 증진은 세포내에서 GCase-결합 펩티드 및 GCase 지질 기질의 기전을 증가시키고, 이는 신경계 장애, 예를 들면, 파킨슨병 및 니이만-픽 C형 질환의 치료에 유용하되, 상기 질환 중 어느 것도 GCase 활성 결핍과는 관련이 없다.

본 발명은 부분적으로는 약리학적 샤페론이 인간에서 유의적으로 증가된 야생형 단백질의 활성을 촉진시킬 수 있는 능력이 있다는 발견에 기초한다. 이러한 현상은 모든 단백질의 발현에 대하여 일반적으로 작동하는 방법과는 대조적으로, 특정 약리학적 샤페론에 특이적으로 결합하는 단백질에 대하여 고도로 특이적인 것 이다. 본 발명의 기초가 되는 실험 결과는 약리학적 샤페론이 내인성 야생형 단백질 활성을 적어도 약 20-25%만큼, 몇몇 경우에는 적어도 약 50%만큼, 및 특정 실시태양에서는 적어도 약 90%만큼, 및 심지어 100%만큼 증가시킬 수 있다는 관찰 결과를 포함한다. 이러한 생체내 증가 수준은 조직 배양물 중의 세포에서는 관찰되지 않았고, 보통의 생리학적 과정이 생체내 약리학적 샤페론 효과를 완화시킬 것이라는 예측을 가정하면 이는 놀라운 것이다. 약리학적 샤페론이 인간에서 생체내 야생형 단백질의 활성 수준을 적어도 20-25%만큼, 및 특히 적어도 약 50%만큼 증가시킬 수 있을 것이라고 예측하는 것에 관한 근거는 없었다. 하기 예시하는 바와 같이, 건강한 대상자에게 이소파고민을 투여할 경우 GCase 활성은 용량에 의존하여 증가하게 된다 (도 2). 통상의 용량-반응 시험을 사용하여 용이하게 시험된 몇몇 농도에서는 효소 활성의 증가 수준이 적어도 50%부터 100% 이하만큼 증가하였다.

본 발명은 공지되어 있는, 리소좀성 효소 부족과 신경계 질환 상태 (예로서, 2형 및 3형 고셰병) 사이의 연관성, 및 예를 들면, 앞서 배경기술 섹션에 기술되어 있는 바와 같이 단백질 및/또는 지질 응집, 및 뉴런 사멸/퇴행이 다수의 비-LSD 신경퇴행성 장애에서 관찰된다는 사실로부터 도출되었다. 즉, 본 발명은 예상밖으로 비-결핍성 리소좀성 효소의 활성을 증가시킴으로써, 단백질 응집체, 특히, 단백질 (또는 단량체를 비롯한 그의 단편)이 리소좀성 효소의 지질 기질과 관련있는 응집체, 예를 들면, GlcCer과 SCNA의 제거를 증가시킬 수 있는 능력을 이용한다. 병적 단백질이 관련되는 지질 기질을 감소시키면 아마도 병적 단백질의 응집이 감소될 것이고, 이로써 신경계 증상이 호전되고/거나 뉴런 사멸 또는 신경퇴행은 예방될 수 있을 것이다. 별법으로, GCase 활성의 증진은 지질의 농도를 감소시킴으로써, 결과적으로는 응집되기 쉬운 단백질의 분해를 조정할 수 있는 보다 우수한 세포 환경을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 예상밖으로 비-결핍성 리소좀성 효소의 활성을 증가시킴으로써, GCase 활성 감소 이외의 다른 기전에 의해, 또는 세포내 지질 수송의 이상에 기인하여 GlcCer, 글루코실스핑고신 (GlcSph; 또는 비정상적인 지질 기전에 기인한 GCase 활성에 대한 반응으로 그의 수준이 변화한 기타의 기질)이 축적되어 있는 뉴런내 지질 프로파일을 변경시킬 수 있는 능력을 이용한다.

본 발명의 특이적인 약리학적 샤페론을 사용하는 것은 예를 들면, 재조합 효소 (ERT)의 투여에 의해, 또는 예로서, 자베스카(Zavesca)®를 사용한 기질 감소 요법 (SRT)를 사용함으로써 GCase를 보충하는 기타의 방법보다도 잠재적인 잇점을 갖는데, 이는 전자의 경우는 카테터를 통해 뇌로 직접적으로 투여되어야 하고, 후자의 경우는 다수의 당지질, 단, 하나의 특정 신경계 장애에 대해 감소시키는 것이 유익할 수 있는 것은 제외한 다수의 당지질 합성을 저해하기 때문이다. 자베스카®는 심각한 부작용을 갖고, 그의 사용은 ERT를 견딜 수 없는 환자에게는 제한된다. 그러므로, 이러한 치료법은 편재하는 선택된 효소의 하이드롤라제 활성을 증진시킬 수 있는 치료법보다 덜 효과적이다.

정의

생물학적 및 임상적 정의

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명의 문맥 내에서, 그리고 각 용어가 사용된 특정 문맥에서, 본 분야에서 통용되는 통상의 의미를 가진다. 본 발명의 조성물 및 방법과 그의 제조 및 사용 방법을 설명할 때 실무자에게 추가적인 지침을 제공하기 위하여, 특정 용어는 하기 또는 본 명세서의 도처에서 논의된다.

"신경계 장애," 또는 "신경퇴행성 장애"라는 용어는 뉴런 손실, 뉴런 퇴행, 뉴런 탈수초, 신경아교증 (거대아교세포증 및 미세아교세포증 포함) 또는 비정상적인 단백질 또는 독소 (예로서, β-아밀로이드 또는 α-시누클레인)의 뉴런 또는 뉴런외 축적을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 뉴런 또는 신경아교 세포의 결함과 관련있는 임의의 중추 신경계 (CNS) 또는 말초 신경계 (PNS) 질환을 지칭한다. 신경계 장애는 만성 또는 급성일 수 있다. 신경계 장애의 예로는 고셰병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 다발성 경화증 (MS), 헌팅톤병, 프리드리히 보행실조, 경증 인지 장애, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 파킨슨증 질환, 루이 소체병, 전측두엽 치매 (FTD) 다계통 위축증 (MSA), 진행성 핵상마비, 및 운동 장애 (운동 실조, 뇌성 마비, 무도성무정위운동, 근긴장이상, 뚜렛 증후군, 핵황달 포함) 및 진전 장애, 및 백색질 장애 (부신 백색질 장애, 이염색 백색질 장애, 카나반병, 알렉산더병, 펠리제우스-메르츠바허 질환 포함), 뉴런 세로이드 리포푸스신증; 모세혈관 확장성 운동실조증 및 레트 증후군으로 한정되지 않는다.

특히, "α-시누클레인 병증"이라는 용어는 α-syn의 비정상적인 축적과 관련이 있는 질환을 지칭하며, 파킨슨증, 파킨슨병, 루이 소체병, 다계통 위축증, 할러포르텐-스파츠 병, 및 전측두엽 치매를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"리소좀성 효소의 돌연변이와 관련있는 신경계 장애"는 조사하였을 때에 신 경계 장애를 앓지 않는 개체와 비교하여 신경계 장애를 앓는 개체에서 하나 이상의 리소좀성 유전자 또는 유전자들에서의 돌연변이가 또한 나타나는 임의의 신경계 장애를 지칭한다. 하나의 비제한적인 예로는 Gba 돌연변이와 관련있는 신경계 장애는 리소좀성 축적병, 예를 들면, 고셰병, 또는 이형접합 Gba 돌연변이와 관련있는 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 파킨슨병을 앓는 환자의 하위세트이다. 본 발명의 하나의 측면은 Gba 돌연변이를 포함하지 않는 신경계 장애를 치료하는 것에 관한 것이다.

"리소좀성 활성 증가"라는 용어는 리소좀성 효소에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉한 세포내 ER에서 기능성 구조를 취하는 리소좀성 효소 폴리펩티드의 양을, 리소좀성 효소에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉하지 않은 세포 (바람직하게는 동일한 세포 유형) 중의 리소좀성 효소 발현에 비해 증가시켜 약리학적 샤페론(들)을 투여하기 이전의 속도와 비교하여 세포내 리소좀에 의해 매개되는 지질 및/또는 단백질 대사의 속도를 증가시키는 것을 지칭한다. 리소좀내 단일 리소좀성 효소의 활성 증가는 리소좀성 활성을 증가시키는 반면, 본 발명은 유리하게 다수의 리소좀성 효소 활성을 증가시킴으로써 광범위한 지질 및/또는 단백질 대사를 일으킨다.

상기 언급한 용어는 또한 리소좀성 효소에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉하지 못한 세포 (바람직하게는 동일한 세포 유형)에서의 내인성 야생형 리소좀성 효소 폴리펩티드의 수송율과 비교하여 리소좀성 효소에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉한 세포에서 ER에서부터 리소좀으로의 야생형 리소좀성 효소 폴리펩티드의 수송율 증가를 의미한다.

"리소좀성 효소" 또는 "리소좀 효소"라는 용어는 리소좀에서 기능을 발휘하는 임의의 효소를 지칭한다. 리소좀성 효소로는 α-갈락토시다제 A; β-글루코시다제; α-글루코시다제; β-헥소사미니다제 A; β-헥소사미니다제 B; α-L-이두로니다제; β-갈락토시다제; β-글루쿠로니다제; α-글루쿠로니다제; α-푸코시다제; 설파타제; 산성 세라미다제; NPC1; 산성 스핑고마이엘리나제; 프로사포신 (사포신 A, B, C, D); 카텝신 (A, D, H, S, Z); H(+)-ATPase; 시알리다제; β-갈락토세레브로시다제; 아릴설파타제; 이두로네이트-2-설파타제; 헤파란 N-설파타제; α-N-아세틸글루코사미니다제; α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제; N-아세틸글루코사민-6-설페이트 설파타제; N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제; 아릴설파타제 B; 산성 α-만노시다제; 산성 β-만노시다제; 산성 α-L-푸코시다제; α-N-아세틸-뉴라미니다제; β-N-아세틸글루코사미니다제; 및 α-N-아세틸갈락토사미니다제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"야생형 리소좀성 효소"라는 용어는 보통의 내인성 리소좀성 폴리펩티드, 및 상기 리소좀성 효소 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 ER에서 기능적 구조를 이룰 수 있고, 리소좀성 위치화를 이룰 수 있으며, 야생형 활성을 보이는 (즉, 리소좀성 효소 기질 농도를 감소시키는) 능력을 갖는, 예를 들면, 정상인 개체에서의 대립유전자 변이체와 같이, (상기 언급한 폴리펩티드와 동일한 기능성 성질 및 결합 친화성을 갖는) 리소좀성 효소 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 기타 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 야생형 리소좀성 효소는 돌연변이체 또는 돌연변이 화된 단백질 또는 효소가 아니다. 그러나, 본 발명은 리소좀성 효소에 대하여 1 초과의 야생형 대립유전자가 존재할 수 있는 가능성을 배제시키지 않는다. 따라서, 이러한 용어는 리소좀성 효소의 기능 또는 활성에 유해한 영향을 주지 않는 다형태를 포함한다.

특정 시험으로 생체내 실질적인 기능에 상응하거나 상응하지 않는 단백질의 속성을 평가할 수 있지만, 이는 단백질 기능성을 대신할 뿐이고, 이러한 시험에서의 야생형 동태는 본 발명의 단백질 구제 또는 증강 기법에 대하여 허용되는 결과를 보여준다. 본 발명에 따른 상기 활성 중 하나는 야생형 리소좀성 효소의 소포체로부터 그의 본래의 위치인 리소좀으로의 적절한 수송이다.

본원에서 사용되는 바, "돌연변이화된 단백질" 또는 "돌연변이화된 효소"라는 용어는 단백질 기능 또는 활성에 영향을 주는 야생형 서열로부터 단백질 서열이 변경되도록 하는 유전자 돌연변이를 함유하는 유전자로부터 번역된 단백질 또는 효소를 지칭한다. 특이적인 실시태양에서, 상기 돌연변이는 ER에 정상적으로 존재하는 조건하에서 단백질이 안정적인 구조를 취하지 못하도록 한다. 이러한 구조를 취하지 못함으로써 이들 단백질은 단백질 수송 시스템에서 그의 정상적인 경로를 통해 세포내의 그의 적절한 위치로 수송되기 보다는 분해되거나, 응집된다. 구조 돌연변이 이외의 돌연변이 또한 효소 활성을 감소시킬 수 있거나, 전환을 더욱 가속화시킬 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "약리학적 샤페론" 또는 때때로 "특이적인 약리학적 샤페론" ("SPC")은 단백질에 특이적으로 결합하며, 한가지 이상의 다음의 효 과를 갖는 분자, 예를 들면, 소분자, 단백질, 펩티드, 핵산, 또는 당질을 지칭한다: (i) 단백질의 안정적인 분자 구조 형성을 향상시키고; (ii) ER로부터 또다른 세포 위치, 바람직하게는 본래의 세포 위치로의 단백질의 적절한 수송을 유도하고, 즉, 단백질의 ER-관련 분해를 방지하고; (iii) 미스폴딩된 단백질의 응집을 방지하고/거나; (iv) 단백질의 야생형 기능 및/또는 활성을 적어도 부분적으로 복원시키거나 증강시킨다. 예로서, 리소좀성 효소에 특이적으로 결합하는 화합물은 관련된 또는 무관한 일반 단백질 군이 아닌, 리소좀성 효소에 결합하여, 리소좀성 효소에 대해 샤페론 효과를 발휘하는 것을 의미한다. 따라서, 리소좀성 효소에 대한 약리학적 샤페론은 상기 리소좀성 효소에 우선적으로 결합하여 리소좀성 효소의 적절한 폴딩, 수송, 무응집 및 활성을 야기하는 분자이다. 본원에서 사용되는 바, 이러한 용어는 예를 들면, BiP와 같은 내인성 샤페론 또는 예를 들면, DMSO 또는 중수소수와 같은 다양한 단백질에 대하여 샤페론 활성이 입증된 비특이적인 제제를 지칭하는 것이 아니다.

하나의 비제한적인 실시태양에서, 약리학적 샤페론은 GCase의 저해제, 또는 구조적으로 유사한 그의 유사체일 수 있다. 약리학적 샤페론은 이소파고민; C-노닐-이소파고민; C-벤질-이소파고민; N-부틸-이소파고민; N-(3-사이클로헥실프로필)-이소파고민; N-(3-페닐프로필)-이소파고민; N-((2Z,6Z)-3,7,11-트리메틸도데카-2,6,10-트리에닐)-이소파고민; N-도데실-이소파고민 (N-도데실-IFG); 2-N-아세트아미도-이소파고민; 2-하이드록시-이소파고민; 2-N-아세틸아미노-이소파고민; 및 그의 유사체 및 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 목록으로부터 선택될 수 있다.

효소의 "경쟁적 저해제"는 기질과 거의 동일한 위치에서 효소에 결합하는, 효소 기질의 화학 구조 및 분자 형상과 구조적으로 유사한 화합물을 지칭할 수 있다. 따라서, 저해제는 기질 분자와 동일한 활성 부위에 대해 경쟁하여, Km을 증가시킨다. 충분한 기질 분자가 저해제를 대체하는데 이용가능하다면, 즉, 경쟁적 저해제가 가역적으로 결합할 수 있다면, 경쟁적 저해는 통상 가역적이다. 따라서, 효소 저해량은 저해제 농도, 기질 농도 및 활성 부위에 대한 저해제와 기질의 상대적인 친화성에 따라 달라진다.

저해제가 활성 부위에서 떨어진 위치에 결합하여 효소의 구조를 변화시킴으로써, 기질이 더 이상 활성 부위에 결합할 수 없는 경우에는, 비-고전적인 경쟁적 저해가 일어난다. 비-고전적인 경쟁적 저해의 경우, 활성 부위에 기질이 결합하여 다른 위치에서의 저해제 결합을 방지하며 그 반대로도 작용한다. 이는 알로스테리 저해를 포함한다.

"비경쟁적 저해제"는 효소와 강한 결합을 형성하는 화합물을 의미하는데, 비경쟁적 저해제는 과량의 기질 첨가에 의해 대체되지 않을 수 있으며, 다시 말해서, 비경쟁적 저해제는 비가역적일 수 있다. 비경쟁적 저해제는 효소 또는 단백질의 활성 부위에, 또는 그와 인접하거나 떨어진 위치에서 결합할 수 있으며, 효소와 관련하여 Km에는 영향을 미치지 않으나, Vmax를 감소시킨다.

비경쟁적 저해란 저해제가 ES 복합체에만 결합하는 상태를 의미한다. 저해제가 결합하면, 효소는 불활성화된다. 이런 점이 기질 부재하에서 효소에 결합할 수 있는 비-고전적인 경쟁적 저해제와 다르다.

용어 "Vmax"는 효소 촉매 반응의 초기 최대 속도, 즉, 포화 기질 농도를 지칭한다.

용어 "Km"은 ½ Vmax를 달성하는데 필요한 기질 농도이다.

효소 "증강제"는 리소좀성 효소에 결합하고, 효소 반응 속도를 증가시키는 화합물이다.

"리소좀성 효소를 안정화시킨다"라는 용어는 야생형 또는 기능적으로 동일한 리소좀성 효소 단백질의 구조를 유도 또는 안정화시키는 약리학적 샤페론의 능력을 지칭한다. "기능적으로 동일한"이라는 용어는 구조에 작은 변형이 있을 수 있지만 (거의 모든 단백질은 생리학적 상태에서 약간의 구조적인 유연성을 보임), 구조 유연성은 (1) 단백질 응집, (2) 소포체-관련 분해 경로를 통한 제거, (3) 단백질 기능, 예컨대, 손상된, 미스폴딩된, 또는 과량의 단백질 분해, 및/또는 (4) 야생형 단백질보다 더 높거나 더 낮은 수준으로 부적절한 세포내 수송, 예컨대 세포질내 리소좀으로의 위치화를 일으키지 않는다. 안정화는 (i) 세포내 효소 반감기의 증가; (ii) 리소좀내 효소 수준 증가; 또는 (iii) 인공 기질을 사용하여 세포 용해물에서 측정된 바 가수분해 활성의 증가 중 어느 하나에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "수송율"은 돌연변이체 단백질이 소포체로부터 세포내 그의 본래 위치, 세포막, 또는 세포외 환경으로 수송되는 능력을 지칭한다. 리소좀성 효소에 대한 본래의 위치는 리소좀이다.

본원에서 사용되는 바, "환자" 또는 "환자 군집"이라는 용어는 신경계 장애 를 앓는 것으로 진단받았거나, 신경계 장애가 발병될 위험에 있는 개체(들)를 지칭한다. 신경계 장애로 진단한다는 것은 신경계 기능이 감소되어 나타나는 증상을 확인하는 것을 포함한다. 증상은 진전, 손, 팔, 다리, 턱, 얼굴 떨림; 사지 및 몸통 경직, 또는 강직; 운동완만증, 또는 운동느림증; 자세불안정, 또는 균형 및 협응 장애; 기억상실증; 언어상실증; 실행증; 인식불능증; 성격 변화; 우울증; 환각; 및 망상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 신경계 장애를 진단하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 하나의 실시태양에서, 신경계 장애는 산발성인 것일 수 있고, 돌연변이체 유전자형과는 관련이 없다. 또다른 실시태양에서, 신경계 장애는 리소좀성 하이드롤라제가 결핍되어 있지 않은, 즉, 효소 활성을 감소시키는, 리소좀성 하이드롤라제 코딩 유전자내 돌연변이를 갖지 않는 환자의 CNS 또는 PNS 세포내 리소좀 효소 기질, 또는 기타 단백질 또는 그의 단편의 응집 증가에 기인할 수 있다. 이들 환자가 비-리소좀성 효소에 돌연변이를 가질 수 있는 있지만, 예를 들어 α-syn의 응집은 촉진된다. 또다른 비제한적인 실시태양에서, 신경계 장애는 사용되는 샤페론 중 어느 하나, 또는 그의 조합에 의해 치료될 수 없는 유전적 소지를 가질 수 있다. 예를 들어, 환자는 기능성 단백질이 생산되지 않는, 리소좀성 효소에 대한 동형접합성 무효화 돌연변이로 구성된 유전자형을 가질 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 방법에 따라 기타의 비-돌연변이화된 리소좀성 효소의 활성을 증가시키는 것이 리소좀성 효소 결핍을 보상시킬 수 있다.

"반응자"는 한가지 이상의 임상 증상의 개선, 호전 또는 예방, 또는 하나 이상의 대용 임상 마커의 개선 또는 반전을 보여주는, 중추 신경계 세포내 단백질 및 지질 응집체와 관련된 신경계 장애로 진단되어 본원 발명의 방법에 따라 치료되는 개체이다. 특정 실시태양에서, 정상인 대조군과 비교하여 증가 및 감소된 것을 포함한, 혈장내 α-시누클레인 수준의 변화가 GCase에 대한 약리학적 샤페론 요법에 관한 양성 반응을 나타내는 대용 마커이다.

용어 "치료학적 유효량" 및 "유효량"은 치료 반응을 야기하는데 충분한 특이적인 약리학적 샤페론의 양이다. 치료 반응이란 사용자 (예컨대, 임상의)가 상기의 증상 및 대용 임상 마커를 비롯한 요법에 대한 효과적인 반응으로서 인식하는, 모든 반응일 수 있다. 따라서, 치료 반응은 일반적으로 예컨대, 상기 기술된 것과 같은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 호전일 수 있다.

"약제학적으로 허용가능한"이라는 어구는 인간에게 투여되었을때 전형적으로는 부적절한 반응을 일으키지 않고 생리학적으로 허용가능한 분자 단위 및 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에서 사용되는 바, "약제학적으로 허용가능한"이라는 용어는 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 공인된 약전에서 동물, 보다 특히 인간에서 사용되는 것으로 기재된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 화합물이 투여될 때 사용되는 희석제, 애주번트, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 그러한 약제학적 담체는 예를 들면, 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물 또는 수성 식염수와 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 바람직하게는 담체로서, 특히 주사제 용액으로 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin, 18th Edition]에 기재되어 있다.

용어 "약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 성질 또는 정확성의 측면에서 측정값에 대해 허용가능한 정도의 오차를 의미한다. 통상 예시적인 오차 범위는 주어진 값 또는 범위의 20 퍼센트 (%), 바람직하게는 10%, 더욱 바람직하게는 5% 이내이다. 별법으로, 그리고 특히 생물계에서, 용어 "약" 및 "대략"은 크기 순서에 따라, 바람직하게는 주어진 값의 5-배, 및 더욱 바람직하게는 2-배 이내의 값을 의미한다. 본 명세서에서 주어진 수치는 달리 언급하지 않는 한 대략적인 값이며, 이는 명백히 기재되지 않은 경우라도 용어 "약" 또는 "대략"이 추론될 수 있는 것을 의미한다.

화합물 정의

용어 "알킬"은 단일 결합에 의해 분자의 잔여부에 결합되고, 불포화기를 포함하지 않고, 탄소 원자 및 수소 원자만으로 이루어진 선형 또는 분지형의 C₁-C₂₀ 탄화수소기를 의미하며, 예로서는 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸(이소프로필), n-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸에틸(t-부틸)을 들 수 있다. 본원에서 사용되는 알킬로서는 C₁-C₈ 알킬이 바람직하다.

용어 "알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하며, 선형 또는 분지형 쇄일 수 있는 C₂-C₂₀ 지방족 탄화수소기를 지칭하며, 예로서는 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐(알릴), 이소-프로페닐, 2-메틸-1-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐을 들 수 있다.

용어 "알키닐"은 그에 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 1가, 비분지형 또는 분 지형 탄화수소 쇄를 지칭한다. 알키닐기의 삼중 결합은 또다른 불포화기에 대해 공액 또는 비공액될 수 있다. 적합한 알키닐기로는 (C₂-C₈)알키닐기, 예를 들면, 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 메틸프로피닐, 4-메틸-1-부티닐,4-프로필-2-펜티닐-, 및 4-부틸-2-헥시닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 알키닐기는 치환되지 않거나, 1개 또는 2개의 적합한 치환기로 치환될 수 있다.

용어 "사이클로알킬"은 불포화된 비방향족 모노- 또는 멀티사이클릭 탄화수소환 시스템을 의미하며, 예를 들면, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실을 들 수 있다. 멀티사이클릭 사이클로알킬기의 예로는 퍼하이드로나프틸, 아다만틸 및 노르보르닐기가 브릿지된 사이클릭기 또는 스피로바이사이클릭기, 예컨대, 예로서, 스피로(4,4)논-2-일을 들 수 있다.

"사이클로알킬알킬"은, 상기 정의된 바와 같은 알킬기에 직접 결합된 상기 정의된 바와 같은 사이클로알킬기로서, 예를 들면, 사이클로프로필메틸, 사이클로부틸에틸, 사이클로펜틸에틸과 같은 안정한 구조체를 형성하는 것을 지칭한다.

용어 "알킬 에테르"는 적어도 하나의 산소가 알킬 쇄에 통합되어 있는 상기 정의된 바와 같은 알킬기 또는 사이클로알킬기를 지칭하며, 예로서, 메틸 에틸 에테르, 디에틸 에테르, 테트라하이드로푸란을 들 수 있다.

용어 "알킬 아민"은 적어도 하나의 질소 원자를 갖는 상기 정의된 바와 같은 알킬기 또는 사이클로알킬기를 지칭하며, 예로서, n-부틸 아민 및 테트라하이드로옥사진을 들 수 있다.

용어 "아릴"은 약 6개 내지 약 14개의 탄소 원자를 가지는 방향족 라디칼을 지칭하며, 예를 들면, 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인다닐, 바이페닐을 들 수 있다.

용어 "아릴알킬"은 상기 정의된 바와 같은 알킬기에 직접 결합된 상기 정의된 바와 같은 아릴기를 지칭하며, 예로서, -CH₂C₆H₅, 및 -C₂H₄C₆H₅를 들 수 있다.

용어 "헤테로사이클릭"은 탄소 원자들과, 질소, 인, 산소 및 황으로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 내지 5개의 헤테로원자로 구성된 안정적인 3- 내지 15-원 환 라디칼을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해 헤테로사이클릭 환 라디칼은 모노사이클릭 환, 바이사이클릭 환 또는 트리사이클릭 환 시스템일 수 있고, 이들 환은 융합 환, 브릿지된 환, 또는 스피로 환 시스템을 포함할 수 있으며, 상기 헤테로사이클릭 환 라디칼의 질소, 인, 탄소, 산소 또는 황 원자는 다양한 산화 상태로 임의로 산화될 수 있다. 추가로, 질소 원자는 임의로 4급화될 수 있고; 상기 환 라디칼은 부분적으로 또는 완전히 포화될 수 있다 (즉, 헤테로방향족 또는 헤테로아릴 방향족). 이러한 헤테로사이클릭 환 라디칼의 예로는 아제티디닐, 아크리디닐, 벤조디옥솔릴, 벤조디옥사닐, 벤조퓨라닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 디옥솔라닐, 인돌리지닐, 나프티리디닐, 퍼하이드로아제피닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 피리딜, 프테리디닐, 퓨리닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 테트라졸릴, 이미다졸릴, 테트라하이드로이소퀴놀릴, 피페리디닐, 피페라지닐, 2-옥소피페라지닐, 2-옥소피페리디닐, 2-옥소피롤리디닐, 2-옥소아제 피닐, 아제피닐, 피롤릴, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 옥사졸릴, 옥사졸리닐, 옥사솔리디닐, 트리아졸릴, 인다닐, 이속사졸릴, 이속사솔리디닐, 모르폴리닐, 티아졸릴, 티아졸리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸릴, 퀴누클리디닐, 이소티아졸리디닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 옥타하이드로인돌릴, 옥타하이드로이소인돌릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 데카하이드로이소퀴놀릴, 벤즈이미다졸릴, 티아디아졸릴, 벤조피라닐, 벤조티아졸릴, 벤조옥사졸릴, 푸릴, 테트라하이드로퍼틸, 테트라하이드로피라닐, 티에닐, 벤조티에닐, 티아모르폴리닐, 티아모르폴리닐 설폭사이드, 티아모르폴리닐 설폰, 디옥사포스폴라닐, 옥사디아졸릴, 크로마닐, 이소크로마닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

헤테로사이클릭 환 라디칼은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 주 구조체에 결합하여, 안정한 구조를 형성할 수 있다.

용어 "헤테로아릴"은, 상기 환이 방향족인 헤테로사이클릭 환을 지칭한다.

용어 "헤테로아릴알킬"은 알킬기에 직접 결합된 상기 정의된 바와 같은 헤테로아릴 환 라디칼을 지칭한다. 상기 헤테로아릴알킬 라디칼은 알킬기로부터 유래한 임의의 탄소 원자에서 주 구조체에 결합되어, 안정한 구조를 형성할 수 있다.

용어 "헤테로사이클릴"은 상기 정의된 바와 같은 헤테로사이클릭 환 라디칼을 지칭한다. 상기 헤테로사이클릴 환 라디칼은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 주 구조체에 결합되어, 안정한 구조를 형성할 수 있다.

용어 "헤테로사이클릴알킬"은 알킬기에 직접 결합된 상기 정의된 바와 같은 헤테로사이클릭 환 라디칼을 지칭한다. 상기 헤테로사이클릴알킬 라디칼은 상기 알킬기의 탄소 원자에서 주 구조체에 결합되어, 안정한 구조를 형성할 수 있다.

"치환된 알킬," "치환된 알케닐," "치환된 알키닐," "치환된 사이클로알킬," "치환된 사이클로알크알킬," "치환된 사이클로알케닐," "치환된 아릴알킬," "치환된 아릴," "치환된 헤테로사이클릭 환," "치환된 헤테로아릴 환," "치환된 헤테로아릴알킬," 또는 "치환된 헤테로사이클릴알킬 환"에서 치환기는 서로 동일하거나 상이할 수 있으며, 수소기, 하이드록시기, 할로겐기, 카르복실기, 시아노기, 아미노기, 니트로기, 옥소기 (=0), 티오기 (=S), 또는 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 헤테로사이클릭 환, -COOR^x, -C(O)R^x, -C(S)R^x, -C(O)NR^xR^y, -C(O)ONR^xR^y, -NR^xC0NR^yR^z, -N(R^x)SOR^y, -N(R^x)SO₂R^y, -(=N-N(R^x)R^y), -NR^xC(O)OR^y, -NR^xR^y, -NR^xC(0)R^y-, -NR^xC(S)R^y -NR^xC(S)NR^yR^z, -SONR^xR^y-, -SO₂NR^xR^y-, -OR^x, -OR^xC(O)NR^yR^z, -OR^xC(O)OR^y-, -OC(O)R^x, -OC(O)NR^xR^y, -R^xNR^yR^z, -R^xR^yR^z, -R^xCF₃, -R^xNR^yC(O)R^z, -R^xOR^y, -R^xC(O)OR^y, -R^xC(0)NR^yR^z, -R^xC(O)R^x, -R^xOC(O)R^y, -SR^x, -SOR^x, -SO₂R^x, -ONO₂ (여기서, 상기 기들 각각에 있어서 R^x, R^y 및 R^z는 수소 원자, 치환된 또는 비치환된 알킬, 할로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알크알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭 환, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴알킬일 수 있다)로부터 선택되는 임의로 치환된 기로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다.

용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 및 요오드 라디칼을 지칭한다.

용어 "짧은 유연성 링커"는 선형 길이가 약 6 Å 내지 약 12 Å, 바람직하게, 약 9 Å인 링커를 지칭한다. 짧은 유연성 링커는 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 탄소에 결합한 탄소, 및 예를 들면, 질소, 산소, 황과 같은 헤테로원자에 결합한 탄소와 같이 서로에 결합되어 있는 분자들을 포함하며, 여기서, 함께 결합되어 있는 분자들은 결합 축 주위로 회전할 수 있다. 특정 실시태양에서, 유연성 링커는 짧은 유연성 링커에 의해 연결된 분자 도메인간의 거리를 변경시킬 수 있는 상이한 구조와 배향을 채용할 수 있다.

신경퇴행성 장애에 대한 샤페론 요법

하나의 일련의 실시태양에서, 소분자 약리학적 샤페론은 ER에서 비-돌연변이체 GCase의 안정성을 증가시키고, 리소좀으로의 수송을 증가시키고, 리소좀에서 단백질을 안정화시킴으로써 효소 반감기를 증가시킨다. 이러한 전략법을 통해 리소좀내에서의 효소 활성 또는 효소 기능은 증가될 수 있고, 이로써 리소좀성 활성도 증가하게 된다. 따라서, 지질 기전, 예를 들면, GlcCer 기전은 GCase 활성을 증가시킴으로써 조정될 수 있고, 이를 통해서는 샤페론과 접촉하지 않은 세포와 비교할 때 세포내 GlcCer의 수준은 감소하게 된다. 상기 논의된 바와 같이, 이러한 전략법이 α-syn의 양을 감소시킬 것으로 예측되고/거나, 세포, 특히 뉴런에서 GlcCer 의 병적 축적 또는 GlcCer을 포함하는 임의의 파괴적 지질 불균형을 호전시킬 것으로 예측된다.

GCase에 대한 샤페론 . 단독으로 또는 조합물로 GCase의 활성을 증가시켜 리소좀 활성을 증가시키는 약리학적 샤페론으로서 사용될 수 있는 화합물은 다수 존재한다. 상기 논의된 바와 같이, GCase에 대한 경쟁적 저해제가 GCase 활성을 증가시키는 것으로 앞서 제시된 바 있다. 따라서, 다른 기전 역시 가능하지만, 상기의 GCase 저해제 및 기타 저해제가 가능하게는 리소좀내 GCase 활성을 증가시킴으로써 α-syn의 양을 감소시키는데 유용할 수 있을 것으로 기대된다.

이소파고민 (IFG; (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-3,4-피페리딘디올)은 하기 구조식을 갖는 화합물을 지칭한다:

이소파고민 타르트레이트는 최근 2007년 5월 23월 출원된 공유의 미국 특허 출원 시리얼 번호 제11/752,658호에 기술되어 있고, 이는 CAS 번호 919364-56-0을 지정받았다. 이소파고민은 또한 다양한 유기산 및 무기산으로 제조된, 다른 산성 부가염의 형태로 제조될 수 있다. 그러한 염으로는 염화수소, 브롬화수소, 메탄설폰산, 황산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 옥살산, 말레산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산으로 형성된 것 및 각종의 기타의 것 (예로서, 니트레이트, 포스페이트, 보레이트, 시트레이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, 살리실레이트 등)을 포함한 다. 그러한 염은 당업자에게 알려져 있는 바와 같이 형성될 수 있다.

이소파고민의 N-알킬 유도체 또한 본 발명에서의 사용을 위해 주시된다. 그러한 화합물은 미국 특허 제6,046,214호 (크리스티안센(Kristiansen) 등), 및 제5,844,102호 (시에르크스(Sierks) 등)에 기술되어 있다. 추가의 실시태양에서, 이소파고민 유도체는 하기 화학식(I), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 갖는다:

상기 식에서,

R은 C_1-7할로알킬, C_1-10알킬, C_3-7알케닐알킬, C_2-7알콕시알킬, C_1-7카바모일알킬 또는 X-Ar¹이고;

X는 -(CH)_n- 또는 C₂-C₃ 알케닐렌이며;

n은 정수 0-3이고;

Ar¹은

이며;

여기서, R₁ 및 R₂는 수소, 할로, C_1-3알킬, C_1-3알콕시, 아미노, 니트로, 헤테로아릴, 아릴, 또는 시아노로부터 독립적으로 선택되고; Y가 C, N, O, 또는 S일 때, X 및 Z는 독립적으로 C, N, O, 또는 S이거나; Y가 X 및 Z를 연결하는 단일 결합일 때, X 및 Z는 독립적으로 C, N-R³, O 또는 S이고; 여기서, R³은 C_1-3알킬 또는 수소이다.

추가의 또다른 실시태양에서, 이소파고민 유도체는 하기 화학식(Ia), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 갖는다:

상기 식에서,

R은 C_1-10알킬, C_3-7알케닐알킬, C_2-7알콕시알킬, 또는 X-Ar이고;

X는 -(CH)_n- 또는 C₂-C₃ 알케닐렌이며;

n은 정수 0-3이고;

Ar은

이며;

여기서, Y가 C, N, O, S 또는 X 및 Z를 연결하는 단일 결합일 때, X 및 Z는 C, N, O, 또는 S이고; R₁은 수소, 할로, C_1-3알킬, C_1-3알콕시, 아미노, 니트로, 아릴, 또는 시아노이다.

구체적인 N-알킬 유도체로는 N-도데실 이소파고민 및 하기 표 1에서 제공되는 것을 포함한다:

화합물은 하기와 같이 명명된다: (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-프로필피페리딘-3,4-디올 (1); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-펜틸피페리딘-3,4-디올 (2); (3R,4R,5R)-1-헵틸-5-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4-디올 (3); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-(3-메틸부트-2-에닐)피페리딘-3,4-디올 (4); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-(2-메톡시에틸)피페리딘-3,4-디올 (5); (3R,4R,5R)-1-벤질-5-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4-디올 (6); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-(2-메틸벤질)피페리딘-3,4-디올 (7); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-(3-메틸벤질)피페리딘-3,4-디올 (8); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-(4-메틸벤질)피페리딘-3,4-디올 (9); (3R,4R,5R)-1-(4-플루오로벤질)-5-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4-디올 (10); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-3,4-디올 (11); (3R,4R,5R)-1-(4-아미노벤질)-5-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4-디올 (12); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-(2-페닐에틸)피페리딘-3,4-디올 (13); (3R,4R,5R)-1-(바이페닐-4-일메틸)-5-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4-디올 (14); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-((테트라하이드로-2H-하이드로란-4-일)메틸)피페리딘-3,4-디올 (15); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-(피페리딘-4-일메틸)피페리딘-3,4-디올 (16); (3R,4R,5R)-1-(푸란-2-일메틸)-5-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4-디올 (17); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-(티오펜-2-일메틸)피페리딘-3,4-디올 (18); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-(피리딘-4-일메틸)피페리딘-3,4-디올 (19); (3R,4R,5R)-1-사이클로헥실-5-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4-디올 (20); (3R,4R,5R)-1-(사이클로헥실메틸)-5-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4-디올 (21); (3R,4R,5R)-1-(2-사이클로헥실에틸)-5-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4-디올 (22); (3R,4R,5R)-1-(사이클로펜틸메틸)-5-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4-디올 (23); (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-(4-메틸펜틸)피페리딘-3,4-디올 (24); 및 (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-1-(4-니트로벤질)피페리딘-3,4-디올 (25).

GCase에 대한 이들 화합물의 추가적인 저해 데이타, 및/또는 GCase에 대한 몇몇 세포 증강 데이타는 하기 표 2에서 제공한다:

이소파고민 및 몇몇 유도체를 합성하는 방법은 잘 알려져 있으며, 하기에 기재되어 있다: ([Jespersen et al., Angew. Chem., Int. ed. Engl. 1994; 33: 1778-9]; [Dong et al., Biochem. 1996; 35:2788]; [Lundgren et al., Diabetes. 1996; 45:S2 521]; [Schuster et al., Bioorg Med Chem Lett. 1999;9(4):615-8]; [Andersch et al., Chem. Eur. J. 2001; 7: 3744-3747]; [Jakobsen et al., Bioorg Med Chem. 2001; 9: 733-44; 36:435]; [Pandy et al., Synthesis. 2001 : 1263-1267]; [Zhou et al., Org Lett. 2001;3(2):201-3]; [Best et al., Can. J. Chem./Rev. Can. Chin. 2002; 80(8): 857-865]; [Huizhen et al., J. Carbohydr Chem. 2004;23: 223-238]; [Mehta et al., Tetrahedron Letters 2005; 41(30):5747-5751]; [Ouchi et al., J Org Chem. 2005;70(13):5207-14]; 및 가장 최근에는 [Meloncelli et al., Australian Journal of Chemistry. 2006; 59(11) 827-833]). L 입체이성체 합성은 [Panfil et al., J. Carbohydr Chem. 2006; 25: 673-84]에 기재되어 있다.

특히, 상기 기술된 N-알킬 이소파고민 유도체는 2차 아민을 알킬화시키는 당업계에 공지되어 있는 경로에 의해, 예를 들면, (상응하는 상업적으로 이용가능한 알코올로부터의) 메실레이트의 대체에 의해, 또는 환원적 아미노화에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법에 관한 간단한 설명을 하기에서 제공한다.

일반적인 알킬화 방법

1 당량의 알코올 및 1.5 당량의 트리에틸아민을 CH2Cl2에 용해시킨 후, 염화메탄설포닐 (1.2 당량)을 0℃에서 반응 혼합물에 적가한다. 반응 혼합물을 2시간 동안 RT에서 교반한 후, 물에 붓고, CH2Cl2로 추출한다. 용매를 제거하여 조 생성물을 수득하고, 이는 다음 단계에 직접 사용하였다.

이전 단계에서 얻은, 3 당량의 조 생성물 및 1 당량의 5-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4-디올 및 K2CO3 (5 당량)을 DMF에 현탁시키고, 혼합물을 교반시키고, 3일 동안 70℃에서 가열한다. 반응 혼합물을 여과하고, 용매를 제거하여 조 생성물을 수득한다. 조 생성물 및 실리카겔을 MeOH.HCl 용액에 현탁시키고, 30분 동안 RT에서 교반한다. 용매를 제거하여 고체를 수득하고, 상기 고체를 실리카겔 칼럼 상단에 가득 채운다. 최종 화합물을 에틸 아세테이트/MeOH/수성 암모니아 (9/1/0.2)에 의해 용리시킨다.

일반적인 환원적 아미노화 방법

3 당량의 알데히드 또는 케톤 및 1 당량의 5-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4-디올을 메탄올에 현탁시킨 후, Na(CN)BH3 (6 당량)을 가한다. 반응 혼합물을 3일 동안 RT에 교반한다. 반응 혼합물을 여과하고, 용매를 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물 및 실리카겔을 MeOH.HCl 용액에 현탁시키고, 30분 동안 RT에서 교반한다. 용매를 제거하여 고체를 수득하고, 상기 고체를 실리카겔 칼럼 상단에 가득 채운다. 최종 화합물을 에틸 아세테이트/MeOH/수성 암모니아 (9/1/0.2)에 의해 용리시켰다.

일반적인 니트로 환원 방법

5-(하이드록시메틸)-1-(4-니트로벤질)피페리딘-3,4-디올 및 아연 (10 당량)을 1시간 동안 RT하에 MeOH.HCl 용액에서 교반한다. 용매를 제거하여 조 생성물을 수득하고, 이는 실리카겔 칼럼에 의해 정제한다.

이들 화합물이 특이적으로 GCase에 결합하고, GCase를 증진시키기 때문에, 상기 화합물은 또한 고셰병과 GCase에서의 돌연변이와 관련된 기타 신경계 장애를 치료하는데에도 사용될 수 있다.

GCase에 대한 기타 샤페론으로는 글루코이미다졸, 폴리하이드록실사이클로알킬아민 및 유도체, 및 하이드록실 피페리딘 유도체를 포함하며, 이는 계류중인 미국 공개 출원 2005/0130972 및 2005/0137223, 및 상응하는 PCT 공개번호 WO 2005/046611 및 WO2005/046612 (이들 모두는 2004년 11월 12일에 출원되었으며, 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 글루코이미다졸 및 유도체는 하기 화학식(II)로 나타낸다:

상기 식에서, B는 수소, 하이드록시, 아세트아미노, 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택되고;

임의로 존재하는 R¹ 및 R²는 선형 길이가 약 6 Å 내지 약 12 Å, 바람직하게 약 9 Å인 짧은 유연성 링커이다. R¹ 및 R²는 또한 NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR³, O, S, S(O)_m, 및 -S(O)_m NR³으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부분이 임의로 개재된 C₂-C₆ 치환된 또는 비치환된 알킬; NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR³, O, S, S(O)_m, 및 -S(O)_m NR³으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부분이 임의로 개재된 C₂-C₆ 치환된 또는 비치환된 알케닐; NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR³, O, S, S(O)_m, 및 -S(O)_m NR³으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부분이 임의로 개재된 C₂-C₆ 치환된 또는 비치환된 알키닐 (여기서, m은 1 또는 2이고, R³은 각각 의 출현시 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 알케닐; 치환된 또는 비치환된 알케닐; 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알케닐; 치환된 또는 비치환된 아릴; 치환된 또는 비치환된 아릴알킬; 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴; 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭; 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴알킬; 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.

추가로, R¹-L¹ 및/또는 R²-L²는 수소일 수 있다.

R⁵는 수소, 하이드록시, 또는 하이드록실메틸을 나타내고;

L¹ 및 L²는 C₃-C₁₂ 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 알케닐; 치환된 또는 비치환된 알키닐; 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알케닐; 치환된 또는 비치환된 아릴; 치환된 또는 비치환된 아릴알킬; 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴; 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭; 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬; 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 친유성 기이다.

특정 실시태양에서, GIZ 화합물은 GIZ, (5R, 6R, 7S, 8S)-5-하이드록시메틸-2-옥틸-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[1,2-a]피리딘-6,7,8-트리올 및 (5R, 6R, 7S, 8S)-5-하이드록시메틸-2-(3,3-디메틸부틸)-5,6,7,8-테트라하이드로이미다 조[1,2-a]피리딘-6,7,8-트리올을 포함한다.

상기의 합성은 하기와 같이 달성될 수 있다:

a. (5R, 6R, 7S, 8S)-5-하이드록시메틸-2-n-옥틸-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[1,2-a]피리딘-6,7,8-트리올 (GCase에 대한 IC₅₀ = ~0.07 nM)

THF/EtOH (2:1) (3 ml)중 (5R, 6R, 7S, 8S)-6,7,8-트리스(벤질옥시)-5-[(벤질옥시)메틸]-2-(1-옥티닐)-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[1,2-a]피리딘 (120 mg, 0.179 mmol) 용액을 14h 동안 수소 대기하에서 Pd(OH)2/C (0.1 g)와 함께 신속하게 교반한다. 촉매를 여과한 후, 유기 용매를 회전 증발기 상에서 농축시키고, 잔류물을 CH2Cl2 (10 ml)에 용해시킨다. 용액을 무수 아세톤 얼음 배쓰에서 냉각시키고, CH2Cl2 중 BCl3 (1.0 M) 용액을 서서히 가한다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 3시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 빙수 배쓰에서 냉각시키고, 물을 5시간 동안 가한다. 회전 증발기를 사용하여 대부분의 용매를 제거하고, 조 생성물을 크로마토그래피 (CHCl₃/MeOH/H₂O 64:25:4)에 의해 정제한다. 물로부터 동결건조시켜 백색 기포로서 표제 화합물을 수득한다.

b. (5R, 6R, 7S, 8S)-6,7,8-트리스(벤질옥시)-5-[(벤질옥시)메틸]-2-(3,3-디메틸부트-1-이닐)-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[1,2-a]피리딘 (GCase에 대한 IC₅₀ = ~1.1 nM)

a에 기재된 것과 유사한 방식으로 (5R, 6R, 7S, 8S)-6,7,8-트리스(벤질옥시)-5-[(벤질옥시)메틸]-2-요오도-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[1,2-a]피리딘을 표제 화합물로 전환시킨다.

c. (5R, 6R, 7S, 8S)-5-하이드록시메틸-2-(3,3-디메틸부틸)-5,6,7,8-테트라하이드로-이미다조[1,2-a]피리딘-6,7,8-트리올 (GCase에 대한 IC₅₀ = ~0.03 nM)

(b)에 기재된 것과 유사한 방식으로 (5R, 6R, 7S, 8S)-6,7,8-트리스(벤질옥시)-5-[(벤질옥시)메틸]-2-(3,3-디메틸부트-1-이닐)-5,6,7,8-테트라하이드로-이미다조[1,2-a]피리딘을 표제 화합물로 전환시켰다.

본 발명에서의 사용을 위해 주시되는 폴리하이드록실사이클로알킬아민 (PHCA) 유도체는 하기 화학식(III)으로 나타낸 화합물, 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염 및 프로드럭을 포함한다:

상기 식에서, B는 수소, 하이드록시, N-아세트아미노, 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된다.

R¹은 독립적으로 각각의 출현시 수소; 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 알케닐, 치환된 또는 비치환된 알키닐, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알케닐, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 아릴알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, -C(O)R³ 및 -S(O)_mR³ (여기서, m은 1 또는 2이고, R³은 독립적으로 각각의 출현시 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 알케닐; 치환된 또는 비치환된 알키닐; 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알케닐; 치환된 또는 비치환된 아릴; 치환된 또는 비치환된 아릴알킬; 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴; 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭; 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴알킬; 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 및 C₁-C₆ 치환된 또는 비치환된 알킬에 결합된 -C(O)로 구성된 군으로부터 선택된다)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

임의로 존재하는 R²는 선형 길이가 약 6 Å 내지 약 12 Å, 바람직하게 약 9 Å인 짧은 유연성 링커이다. R²는 또한 NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR³, O, S, S(O)_m, 및 -S(O)_m NR³으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부분이 임의로 개재된 C₂-C₆ 치환된 또는 비치환된 알킬; NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR³, O, S, S(O)_m, 및 -S(O)_m NR³으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부분이 임의로 개재된 C₂-C₆ 치환된 또는 비치환된 알케닐; NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR³, O, S, S(O)_m, 및 -S(O)_m NR³으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부분이 임의로 개재된 C₂-C₆ 치환된 또는 비치환된 알키닐 (여기서, m은 1 또는 2이고, R³은 독립적으로 각각의 출현시 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 알케닐; 치환된 또는 비치환된 알키닐; 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알케닐; 치환된 또는 비치환된 아릴; 치환된 또는 비치환된 아릴알킬; 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴; 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭; 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴알킬; 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 및 C₁-C₆ 치환된 또는 비치환된 알킬에 결합된 -C(O)로 구성된 군으로부터 선택된다)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

L은 C₃-C₁₂ 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 알케닐, 치환된 또는 비치환된 알키닐; 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬; 치환된 또는 비치환된 사이클로알케닐; 치환된 또는 비치환된 아릴; 치환된 또는 비치환된 아릴알킬; 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴; 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭; 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬; 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 친유성 기이다.

이들 화합물은 공개된 미국 특허 출원 제2005/130972호에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.

Gba가 돌연변이화된, 본 발명에서의 사용을 위해 주시되는 하이드록실피페리딘 유도체는 하기 화학식(IV)로 나타낸다:

상기 식에서, A는 탄소 또는 질소를 나타내고;

B는 수소, 하이드록실, N-아세트아미드 또는 할로겐이며;

R¹은 수소, 치환된 또는 비치환된: 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 사이클로알케닐, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 헤테로사이클릴알킬, 또는 헤테로아릴알킬; -C(O)R³ or -S(O)_mR³이다. 바람직하게, R¹은 H 또는 1-12개의 탄소 원자를 갖는 유기 부분을 포함한다.

R²는 선형 길이가 약 6 Å 내지 약 12 Å인 임의의 짧은 유연성 링커이다. 별법으로, R²는 NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR³, O, S, S(O)_m, 및 -S(O)_m NR³으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부분이 임의로 개재된 C₁-C₆ 치환된 또는 비치환된: 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이다.

R³은 수소, 또는 치환된 또는 비치환된: 알킬, 알케닐; 알키닐; 사이클로알킬, 사이클로알케닐; 아릴; 아릴알킬; 헤테로아릴; 헤테로사이클릭; 헤테로사이클릴알킬; 또는 헤테로아릴알킬이다. 바람직하게, R³은 H 또는 1-12개의 탄소 원자, 또는 더욱 바람직하게 1-6개의 탄소 원자를 갖는 유기 부분을 포함한다.

m은 1 또는 2이고,

R⁵는 수소, 하이드록실, 또는 하이드록시메틸이다.

L은 수소, 치환된 또는 비치환된: 알킬, 알케닐, 알키닐; 사이클로알킬, 사이클로알케닐; 아릴; 아릴알킬; 헤테로아릴; 헤테로사이클릭; 헤테로사이클로알킬; 또는 헤테로아릴알킬을 포함하는, 1-12개의 탄소 원자를 갖는 친유성 기이다.

몇몇 실시태양에서, R²는 NH, NR³, 및 O로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부분이 임의로 개재된 C₂-C₆ 치환된 또는 비치환된 알킬; NH, NR³, 및 O로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부분이 임의로 개재된 C₂-C₆ 치환된 또는 비치환된 알케닐; NH, NR³, 및 O로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자가 임의로 개재된 C₂-C₆ 치환된 또는 비치환된 알케닐; NH, NR³, 및 O로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자가 임의로 개재된 C₂-C₆ 치환된 또는 비치환된 알케닐로 구성된 군으로부터 선택된다

다른 실시태양에서, R²는

으로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 실시태양에서, R²는 존재하지 않고, L은 수소, 비치환된 C₁-C₁₂ 알킬, 또는

비치환된 C₆-C₁₂ 알킬, 예를 들면, 비치환된 C₆ 알킬, 비치환된 C₇ 알킬, 비치환된 C₈ 알킬, C₉ 알킬 또는 벤질이다.

특정 실시태양에서, 본 발명에서의 사용을 위해 주시되는 하이드록실 피페리딘 화합물은 (3R,4R,5R,6S/6R)-5-(하이드록시 메틸)-6-n-헥실-3,4-디하이드록시피페리딘; (3R,4R,5R,6S/6R)-5-(하이드록시 메틸)-6-n-헵틸-3,4-디하이드록시피페리딘; (3R,4R,5R,6S/6R)-5-(하이드록시 메틸)-6-n-옥틸-3,4-디하이드록시피페리딘; 및 (3R,4R,5R,6S/6R)-5-(하이드록시 메틸)-6-n-노닐-3,4-디하이드록시피페리딘이다.

다른 특정 실시태양에서, 본 발명에서의 사용을 위해 주시되는 하이드록실 피페리딘 화합물은 하기: (3R,4R,5R,6S/6R)-5-(하이드록시 메틸)-6-n-부틸-3,4-디하이드록시피페리딘; (3R,4R,5R,6S/6R)-5-(하이드록시 메틸)-6-n-헥실-3,4-디하이드록시피페리딘; (3R,4R,5R,6S/6R)-5-(하이드록시 메틸)-6-n-헵틸-3,4-디하이드록시피페리딘; (3R,4R,5R,6S/6R)-5-(하이드록시 메틸)-6-n-옥틸-3,4-디하이드록시피페리딘; (3R,4R,5R,6S/6R)-5-(하이드록시 메틸)-6-n-노닐-3,4-디하이드록시피페리딘; (3R,4R,5R,6S/6R)-5-(하이드록시 메틸)-6-벤질-3,4-디하이드록시피페리딘을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

GCase에 대한 추가의 다른 샤페론은 미국 특허 제6,599,919호 (팬(Fan) 등) 에 기술되어 있고, 이는 칼리스테진 A₃, 칼리스테진 A₅, 칼리스테진 B₁, 칼리스테진 B₂, 칼리스테진 B₃, 칼리스테진 B₄, 칼리스테진 C₁, N-메틸-칼리스테진 B₂, DMDP, DAB, 카스타노스퍼민, 1-데옥시노지리마이신, N-부틸-데옥시노지리마이신, 1-데옥시노지리마이신 바이설파이트, N-부틸-이소파고민, N-(3-사이클로헥실프로필)-이소파고민, N-(3-페닐프로필)-이소파고민, 및 N-((2Z,6Z)-3,7,11-트리메틸도데카-2,6,10-트리에닐)-이소파고민을 포함한다.

본 발명의 화합물은 상기 구조체의 약제학적으로 허용가능한 염 및 프로드럭을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 무기 염기, 예를 들면, Li, Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Mn로부터 유도된 염; 및 유기 염기, 예를 들면, N,N'-디아세틸에틸렌디아민, 글루카민, 트릴에틸아민, 콜린, 하이드록시드, 디사이클로헥실아민, 메트포르민, 벤질아민, 트리알킬아민, 티아민; 알킬페닐아민, 글리시놀, 페닐 글리시놀과 같은 키랄 염기로부터 유도된 염, 천연 아미노산, 예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 노르류신, 티로신, 시스틴, 시스테인, 메티오닌, 프롤린, 하이드록시 프롤린, 히스티딘, 오르니틴, 리신, 아르기닌, 세린의 염; 비천연 아미노산, 예를 들면, D-이성체 또는 치환된 아미노산; 구아니딘, 치환된 구아니딘 (여기서, 치환기는 니트로, 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 암모늄 또는 치환된 암모늄 염 및 알루미늄 염으로부터 선택된다)의 염을 포함한다. 염은 적절하게는 설페이트, 니트레이트, 포스페이트, 퍼클로레이트, 보레이트, 아세테이트, 타르트레이트, 말레이드, 시트레이트, 숙시네이트, 팔모에이트, 메탄설포네이트, 벤 조에이트, 살리실레이트, 벤조설포네이트, 아스코르베이트,글리세로포스페이트, 케토글루타레이트인 산성 부가염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 용매화물은 수화물일 수 있거나, 예를 들면, 알코올과 같은 결정화의 다른 용매를 포함할 수 있다.

프로드럭은 생체내에서 활성 형태로 전환되는 화합물이다 (예로서, [R. B. Silverman, 1992, "The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action", Academic Press, Chp. 8]을 참조한다). 프로드럭은 특정 화합물의 생체분포 (예로서, 전형적으로는 프로테아제의 반응 부위로 진입하지 못하는 화합물을 허용하도록 생체분포를 변경시킬 수 있다) 또는 약물 통태학을 변경시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 카르복실산기는 예로서, 메틸기 또는 에틸기로 에스테르화됨으로써 에스테르를 산출할 수 있다. 에스테르가 대상자에게 투여될 때, 에스테르는 효소적으로, 또는 비-효소적으로, 환원적으로, 산화적으로, 또는 가수분해적으로 절단되어 음이온기를 나타낸다. 음이온기는 부분으로 에스테르화될 수 있고 (예로서, 아실옥시에틸 에스테르), 이는 절단되어 중간체 화합물을 나타내며, 이후 분해되어 활성 화합물을 산출한다.

프로드럭의 예 및 그의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다 (예로서, [Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J Pharm. Sci. 66:1-19]를 참조한다). 프로드럭은 계내에서 화합물의 최종 분리 및 정제시에 제조될 수 있거나, 별도로 정제된 화합물을 적합한 유도화제와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 하이드록시기는 촉매의 존재하에서 카르복실산 처리를 통해 에스테르로 전환될 수 있 다. 절단가능한 알코올 프로드럭 부분의 예로는 치환된 및 비치환된, 분지형 또는 비분지형 저금 알킬 에스테르 부분 (예로서, 에틸 에스테르), 저급 알케닐 에스테르, 디-저급 알킬-아미노 저급-알킬 에스테르 (예로서, 디메틸아미노에틸 에스테르), 아실아미노 저급 알킬 에스테르, 아실옥시 저급 알킬 에스테르 (예로서, 피발로일옥시메틸 에스테르), 아릴 에스테르 (페닐 에스테르), 아릴-저급 알킬 에스테르 (예로서, 벤질 에스테르), 치환된 (예로서, 메틸, 할로, 또는 메톡시 치환기로 치환) 아릴 및 아릴-저급 알킬 에스테르, 아미드, 저급-알킬 아미드, 디-저급 알킬 아미드, 및 하이드록시 아미드를 포함한다.

특이적인 약리학적 샤페론의 제형, 투여량 및 투여

본 발명은 화합물이 뉴런 세포에 대한 효과를 발휘하기 위해서는 혈액뇌장벽을 통과하여야 하기 때문에 전신 투여가능한 투여 형태로 투여되는 특이적인 약리학적 샤페론을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 특이적인 약리학적 샤페론은 다른 투여 형태를 고려할 수도 있지만 단일요법으로서 바람직하기로는 경구 투여 형태(하기 참조)로 투여된다. 경구 투여는 분할된 투약으로 또는 방출 조절형 제형으로 매일 투여하거나, 또는 즉시형- 또는 지효성-방출 투여 형태를 더 낮은 빈도로 투여하는 것을 포함한다. 특이적인 약리학적 샤페론의 제형, 투여량 및 투여 경로는 하기에 상세히 설명된다.

제형

특이적인 약리학적 샤페론은 예컨대, 정제 또는 캡슐제 또는 액제의 형태로 경구로, 또는 주사용 멸균 수용액으로서, 모든 투여 경로에 적합한 형태로 투여할 수 있다. 특이적인 약리학적 샤페론이 경구 투여용으로 제형화되는 경우, 정제 또는 캡슐제를 예를 들면, 결합제 (예로서, 미리 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스), 충진제 (예로서, 락토스, 미세결정 셀룰로스 또는 제이인산칼슘); 윤활제 (예로서, 스테아린산마그네슘, 활석 또는 실리카), 붕해제 (예로서, 감자 전분 또는 니트륨 전분 글리콜레이트), 또는 습윤제 (예로서, 라우릴 황산 나트륨)와 같이 약제학적으로 허용가능한 부형제를 이용하여 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 정제는 당업계에 잘 알려져 있는 방법으로 코팅할 수 있다. 경구 투여용 액상 제제는 예컨대, 액제, 시럽제 또는 현탁제 형태를 취할 수 있거나, 이는 사용하기 전에 물 또는 또다른 적합한 비히클로 구성하기 위한 건식 생성물로서 존재할 수 있다. 이러한 액상 제제는 예를 들면, 현탁화제 (예로서, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소첨가된 식용 지방), 유화제 (예로서, 렉시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클 (예로서, 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분별화된 식물성 오일), 및 보존제 (예로서, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 같은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 이용하여 통상적인 방법에 의해 제조할 수도 있다. 또한, 제제는 완충제 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 적절히 포함할 수 있다. 경구 투여용 제제는 특이적인 약리학적 샤페론을 방출 조절형 제공하거나, 지효성 방출로 제공하도록 적절히 제형화될 수도 있다.

비경구/주사용으로 적합한 특이적인 약리학적 샤페론의 약제학적 제형은 일반적으로 멸균 수용액 (수용성), 또는 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조용 분산제 및 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에서, 제형은 멸균형이어야 하며, 주사가 용이한 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 방제되어야 한다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올 폴리올 (예로서, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 등)을 포함하는 용매 또는 분산 매질, 그의 적정 혼합물 및 식물성 오일일 수 있다. 예를 들면, 렉시틴과 같은 코팅제를 사용함으로써, 분산제의 경우에는 입자의 필요한 크기를 유지시킴으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다. 미생물의 작용 방제는 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 벤질 알코올, 소르브산 등으로 이루어 질 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 합리적일 것이다. 주사용 조성물의 장기 흡수는 흡수 지연제 조성물, 예컨대,알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 이루어 질 수 있다.

멸균 주사액은 특이적인 약리학적 샤페론을 상기 나열된 각종의 다른 성분들과 함께 적절한 용매중에 필요량으로 혼입하고, 이후 필터 또는 종결 멸균화에 의해 제조한다. 일반적으로, 분산제는 각종 멸균 활성 성분을 염기성 분산 매질과 그외 상기 나열된 필수 성분을 포함하는 멸균 비히클에 혼입하여 제조한다. 멸균 주사액의 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 그의 미리 멸균 여과한 용액으로부터 활성 성분 분말과 임의의 부가적인 원하는 성분을 산출하는, 진공 건조 및 냉동 건조 기법이다.

제형은 부형제를 포함할 수 있다. 제형에 포함될 수 있는 약제학적으로 허 용가능한 부형제로는 시트레이트 완충액, 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액, 바이카보네이트 완충액과 같은 완충액, 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질; 혈청 알부민, 콜라겐 및 젤라틴과 같은 단백질; EDTA 또는 EGTA와 같은 염 및 염화나트륨; 리포좀; 폴리비닐피롤리돈; 덱스트란, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤과 같은 당; 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 (예로서, PEG-4000, PEG-6000); 글리세롤; 글리신 또는 다른 아미노산; 및 지질을 포함한다. 제형에 사용하기 위한 완충 시스템으로는 시트레이트; 아세테이트, 바이카보네이트 및 포스페이트 완충액을 포함한다. 포스페이트 완충액이 바람직한 실시태양이다.

또한, 제형은 비이온성 세정제를 포함할 수 있다. 바람직한 비이온성 세정제로는, 폴리소르베이트 20, 폴리 소르베이트 80, 트리톤 X-1OO, 트리톤 X-114, Nonidet P-40, 옥틸 α-글루코시드, 옥틸 β-글루코시드, Brij 35, 플루로닉(Pluronic) 및 트윈 20이 있다.

투여

특이적인 약리학적 샤페론의 투여 경로는 (바람직하게는) 경구, 또는 정맥내, 피하, 동맥내, 복막내, 눈, 근육내, 볼, 직장, 질, 안와내, 뇌내, 진피내, 두개내, 척수내, 실내, 경막내, 강내, 관절낭내, 폐내, 비강내, 경점막, 경피 또는 흡입을 포함한 비경구일 수 있다.

특이적인 약리학적 샤페론의 상기 기술된 비경구 제형의 투여는 주기적인 제제의 볼루스 주사일 수 있으며, 또는 외부 (예로서, 정맥내 백) 또는 내부 (예로서, 생분해성 임플란트) 저장체로부터 정맥내 또는 복막내 투여에 의해 투여할 수 있다. 예로서, 미국 특허 번호 제4,407,957호 및 제5,798,113호 (각각 본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다. 폐내 전달 방법 및 장치는 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,654,007호, 제5,780,014호 및 제5,814,607호 (각각 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 기타 유용한 비경구 전달 시스템은, 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투성 펌프, 이식용 주입 시스템, 펌프 전달, 캡슐화된 세포 전달, 림포좀 전달, 바늘을 이용한 주사, 바늘을 이용하지 않는 주사, 분무기, 연무기, 전기천공 및 경피 패치를 포함한다. 바늘을 이용하지 않는 주사 장치는 미국 특허 번호 제5,879,327호; 제제5,520,639호; 제5,846,233호; 및 제5,704,911호 (상기의 명세서는 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 상기 기술한 제형 모두 이러한 방법으로 투여될 수 있다.

경피 주사는 자가 투여가능한 장점이 있지만, 정맥내 투여에 비해 혈장 반감기가 길어진다. 추가로, 재충진가능한 주사 펜 및 바늘이 없는 주사 장치와 같이, 환자 용이성을 위해 제작된 다양한 기구를 본원에서 논의된 발명의 제형과 함께 사용할 수 있다.

투여량

내인성 돌연변이체 리소좀 효소를 구제하는데 유효한 특이적인 약리학적 샤페론의 유효량은 당업자가 경우에 따라 결정할 수 있다. 반감기 (t_½), 혈장 최대 농도 (C_max), 혈장 최대 농도 시간 (t_max), 곡선하 면적으로 측정한 노출 (AUC), 및 대체 단백질과 특이적인 약리학적 샤페론 둘 모두에 대한 조직 분포와 같은 약물 동태학 및 약동학 뿐만 아니라, 특이적인 약리학적 샤페론/리소좀 효소 (친화성 상수, 결합 및 해리 상수 및 결합가) 데이타를, 당업계에 공지된 통상의 방법으로 수득하여, 그의 활성을 저해하지 않으면서 대체 단백질을 안정화시키는데, 즉 치료학적 효과를 부여하는데 필요한 상용가능한 양을 결정할 수 있다.

세포 배양 분석법 또는 동물 연구를 통해 얻은 데이타를 이용하여 인간 및 인간을 제외한 동물에서의 치료학적 투약 범위를 설정할 수 있다. 본 발명의 치료 방법에 사용되는 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED₅₀ 농도 (시험군 군집의 50%에 대해 유효한 농도)를 포함한, 순환 농도 범위이다. 임의의 치료법에 사용되는 특정 투여량은 사용되는 특정 투약 형태, 이용되는 투여 경로 및 개체 (예로서, 환자)의 증상 등과 같은 인자에 따라 상기 범위내에서 변경될 수 있다.

치료학적 유효량은 먼저 세포 배양 분석법으로 추정하고 동물 모델에서 일반화하여 일정 기간 동안 세포에서 관찰되는 EC₅₀ 보다 높으면서 동시에 일정 기간 동안 관찰되는 IC₅₀ 보다 아래에 있는 순환 농도 범위에 도달할 수 있다. 화합물의 EC₅₀ 농도는 효소 활성의 최대 증가의 50%를 이루는 농도이며 (예로서, 세포 배양 분석법으로 측정), IC_5O은 효소 활성의 최대 저해의 50%를 이루는 농도이다. 특정 개체, 예를 들면, 인간 환자에게 사용하기 위한 적절한 투여량은 하기에 추가로 기술되는 바와 같은 정보를 이용하여 보다 정확하게 결정될 수 있다.

혈장내 화합물의 측정은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 기체 크로마토그래피와 같은 기법에 의해 환자와 같은 개체에서 통상적으로 측정할 수 있다.

조성물의 독성 및 치료 효능은 예컨대 세포 배양 분석법에서 표준적인 약제학적 방법에 의해, 또는 LD₅₀ 및 ED₅₀을 측정하기 위한 실험 동물을 이용하여 측정할 수 있다. 매개변수 LD₅₀ 및 ED₅₀은 당업계에 잘 알려져 있으며, 그 각각은 군집의 50%를 치사시키는 화합물의 용량 및 군집의 50%에 치료학적으로 유효한 용량을 지칭한다. 독성과 치료 효과 사이의 용량비를 치료 지수라고 지칭하며, 이는 LD₅₀/ED₅₀으로 표시할 수 있다. 치료 지수가 높은 특이적인 약리학적 샤페론이 바람직하다.

샤페론이 저해제일 경우, 특이적인 약리학적 샤페론의 최적 용량은 GCase, 예로서, 리소좀성 효소에 저해를 받지 않으면서 생체내 조직 또는 순환에서 GCase, 예로서, 리소좀성 효소를 안정화시키는데 필요한 양에 따라 결정된다. 이는 장기간 동안의 조직 또는 순환계에서의 특이적인 약리학적 샤페론의 생체이용성과, 조직 또는 순환계에서 특이적인 약리학적 샤페론의 약물 동태학 및 약동학에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 저해제의 농도는 투여량이 (i) 리소좀으로 최대로 수송될 수 있도록 얼마 동안 EC₅₀ 보다 높은 혈장 농도에 도달함과 동시에, (ii) 일단 효소가 리소좀에 존재하게 되면 기질이 가수분해될 수 있도록 얼마 동안 혈장 농도가 IC₅₀ 이하가 되도록 하는 효소에 대한 특이적인 샤페론의 EC₅₀ 및 IC_5O 값을 계산 해냄으로써 결정될 수 있다.

이러한 결정은 또한 혈액 및 조직내 샤페론의 반감기, Tmax, 및 Cmax, 및 리소좀성 효소의 반감기를 비롯한 약물 동태학적 인자에 따라 달라질 것이다. 하나의 실시태양에서, 약리학적 샤페론에 대한 투약 요법을 예측하는 근본 원리는 2007년 4월 27일 출원된 미국 가특허 출원 제60/914,288호 (그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 추가로 기재되어 있다. 상기 출원은 먼저 효소의 안정화 및 리소좀으로의 수송을 최대화시키기 위해 매일 "부하 용량"을 제공한 후, 이어서, 저해제의 해리와 기질의 가수분해를 허용하는 일정 기간의 비-1일 간격 투약법이 이루어지는 GCase 저해제에 대한 "정점 및 저점" 투약법을 기술한다. 그러나, 기타 투약 요법 또한 고려된다.

병용 약물 요법

약리학적 샤페론을 신경계 질환과 같은 장애 치료에 사용되는 다른 약물과 함께 이용하여 신경계 질환을 앓는 환자를 치료할 수 있다. 파킨슨병에 대한 종래의 약물 치료법으로는 RNAi, 약리학적 제제, 예를 들면, 레보도파, 항콜린제, COMT (카테콜-O-메틸 트랜스퍼라제) 저해제, 도파민 수용체 효현제, MAOI (모노아민 옥시다제 저해제), 말초 데카르복실라제 저해제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또한 GCase에 대한 약리학적 샤페론 또는 샤페론들을 알로프레그나놀론, 저콜레스테롤식, 또는 콜레스테롤-강하제, 예를 들면, 스타틴 (예로서, 리피토(Lipitor)®); 피브레이트, 예를 들면, 페노피브레이트 (리피딜(Lipidil)®); 니아신; 에제티미브 (제티아(Zetia)®) 및/또는 결합 수지, 예를 들면, 콜레스티르아 민 (퀘스트란(Questran)®)과 함께 이용하여 니이만-픽 C형 질환을 앓는 환자를 치료할 수 있다.

추가로, 약리학적 샤페론은 유전자 요법과 함께 사용될 수 있다. 유전자 요법은 SNCA 유전자에 대한 대체 유전자, 예를 들면, Gba 또는 저해성 RNA (siRNA), 둘 모두와 함께 고려된다. 유전자 요법은 2004년 2월 17일 출원된 공유의 미국 특허 출원 시리얼 번호 제10/781,356호에 더욱 상세히 기술되어 있다.

그외 주시되는 병용 요법으로는 α-syn 및 애주번트를 포함하는 백신과 같은 백신 요법과 특이적인 약리학적 샤페론의 병용 [Pilcher et al., Lancet Neurol. 2005; 4(8):458-9], α-syn에 대한 샤페론, 예를 들면, Hsp70 또는 특이적인 약리학적 샤페론과 GCase 샤페론의 병용, 소염제, 예를 들면, 이부프로펜 또는 기타 NSAIDS과의, 또는 신경퇴행성 질환을 보호할 수 있는 기타 제제, 예를 들면, 덱스트로메토르판 [Li et al., FASEB J. 2005; Apr;19(6):489-96], 제니스테인 [Wang et al., Neuroreport. 2005; Feb 28;16(3):267-70], 또는 미노클리클린 [Blum et al., Neurobiol Dis. 2004; Dec;17(3):359-66]과의 병용을 포함한다.

GCase에 대한 기질 저해제, 예를 들면, N-부틸-데옥시노지리마이신 (자베스카(Zavesca)®)과의 병용 요법 또한 주시된다.

최근, GCase 샤페론과 기타 리소좀성 효소에 대한 하나 이상의 샤페론과의 병용 또한 주시된다. 하나의 실시태양에서, 샤페론은 그에 대한 샤페론이 투여되어지는 리소좀성 효소 어느 것에도 어떤 돌연변이도 갖지 않는 개체에게 투여된다. 또다른 실시태양에서, 개체는 GCase 이외의 리소좀성 효소에 돌연변이를 가지며, GCase 샤페론과 함께 상기 효소에 대해 특이적인 샤페론을 투여받는다. 하기는 리소좀 효소에 대하여 효능이 있는 샤페론을 열거한 표이다.

표 1

리소좀성 효소	특이적인 약리학적 샤페론
α-글루코시다제 진뱅크 수탁 번호 Y00839	1-데옥시노지리마이신 (DNJ) α-호모노지리마이신 카스타노스퍼민
산성 β-글루코시다제 (β-글루코세레브로시다제) 진뱅크 수탁 번호 J03059	이소파고민 C-벤질-이소파고민 및 유도체 N-알킬 (C9-C12)-DNJ 글루코이미다졸 (및 유도체) C-알킬-IFG (및 유도체) N-알킬-β-발레인아민 플루페노진 칼리스테진 A3, B1, B2, 및 C1
α-갈락토시다제 A 진뱅크 수탁 번호 NM000169	1-데옥시갈락토노지리마이신 (DGJ) α-알로-호모노지리마이신 α-갈락토-호모노지리마이신 β-1-C-부틸-데옥시노지리마이신 칼리스테진 A2 및 B2 N-메틸-칼리스테진 A2 및 B2
산성 β-갈락토시다제 진뱅크 수탁 번호 M34423	4-에피-이소파고민 1-데옥시갈락토노지리마이신
갈락토세레브로시다제 (산성 β-갈락토시다제) 진뱅크 수탁 번호 D25283	4-에피-이소파고민 1-데옥시갈락토노지리마이신
산성 α-만노시다제 진뱅크 수탁 번호 U68567	1-데옥시만노지리마이신 스와인소닌 만노스타틴 A
산성 β-만노시다제 진뱅크 수탁 번호 U60337	2-하이드록시-이소파고민
산성 α-L-푸코시다제 진뱅크 수탁 번호 NM_000147	1-데옥시푸코노지리마이신 β-호모푸코노지리마이신 2,5-이미노-1,2,5-트리데옥시-L-글루시톨 2,5-데옥시-2,5-이미노-D-푸시톨 2,5-이미노-1,2,5-트리데옥시-D-알트리톨
α-N-아세틸글루코사미니다제 진뱅크 수탁 번호 U40846	1,2-디데옥시-2-아세트아미도-노지리마이신

α-N-아세틸갈락토사미니다제 진뱅크 수탁 번호 M62783	1,2-디데옥시-2-아세트아미도-갈락토노지리마이신
β-헥소사미니다제 A 진뱅크 수탁 번호 NM_000520	2-N-아세틸아미노-이소파고민 1,2-디데옥시-2-아세트아미도-노지리마이신 나그스타틴
β-헥소사미니다제 B 진뱅크 수탁 번호 NM_000521	2-N-아세트아미도-이소파고민 1,2-디데옥시-2-아세트아미도-노지리마이신 나그스타틴
α-L-이두로니다제 진뱅크 수탁 번호 NM_000203	1-데옥시이두로노지리마이신 2-카복시-3,4,5-트리데옥시피페리딘
β-글루쿠로니다제 진뱅크 수탁 번호 NM_000181	6-카복시-이소파고민 2-카복시-3,4,5-트리데옥시피페리딘
시알리다제 진뱅크 수탁 번호 U84246	2,6-디데옥시-2,6, 이미노-시알산 시아스타틴 B
이두로네이트 설파타제 진뱅크 수탁 번호 AF_011889	2,5-안하이드로만닛톨-6-설페이트
산성 스핑고마이엘리나제 진뱅크 수탁 번호 M59916	데시프라민, 포스파티딜이노시톨-4,5-디포스페이트

하나의 특정 실시태양에서, 니이만-픽 C형 질환은 GlcCer 이외에 G_M2-강글리오시드 및 G_M1-강글리오시드 축적을 특징으로 하기 때문에 β-헥소사미니다제 A에 대하여 특이적인 약리학적 샤페론 및/또는 산성 β-갈락토시다제에 대하여 특이적인 약리학적 샤페론과 함께 GCase에 대하여 특이적인 약리학적 샤페론을 사용함으로써 치료한다 [Vanier et al., Brain Pathology. 1998; 8: 163-74].

샤페론 요법에 대한 반응 측정

상기 명시한 바와 같이, 신경퇴행성 질환을 앓는 환자는 신경계 증상을 특징으로 한다. 예를 들면, 파킨슨병을 앓는 환자는 진전, 경직, 운동완만증, 및 자세 불균형을 경험한다. 루이 소체 치매를 앓는 환자는 정신 감퇴 이외에 강한 정신병증상 (환시), 예를 들면, 기억력 감퇴 및 단순 작업 수행 불능을 경험하게 된다. 약리학적 샤페론 요법 사용시 관찰가능한 증상의 개선, 또는 장애가 발병될 위험에 있는 환자에서 특정 증상의 발병 개시 지연, 또는 상기 장애의 진행 지연이 샤페론 요법에 대해 바람직한 반응의 증거가 될 것이다.

추가로, 측정가능한 대용 마커는 또한 샤페론 요법에 대한 반응을 평가하는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 몇몇 연구원들은 파킨슨병을 앓는 환자의 혈장에서 보다 높은 수준의 α-syn을 검출하였거나, 올리고머 형태의 α-syn이 파킨슨병을 앓는 환자의 혈장에서 검출되었다는 것을 보고한 반면 ([Lee et al., J Neural Transm. 2006;113(10):1435-9]; [El-Agnaf et al., FASEB J. 2006;20(3):419-25]), 몇몇 연구원들은 정상적인 대조군과의 비교에서 파킨슨병 환자의 혈장 α-syn이 감소되었다는 것을 보고하였다 [Li et al., Exp Neurol. 2007;204(2):583-8].

본 발명은 하기 실시예로 추가적으로 설명한다. 이러한 실시예의 사용은 단지 예시에 불과하며 어떠한 방식으로든 본 발명 또는 예시된 것의 범주 및 의미를 한정하는 것은 아니다. 이와같이, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 바람직한 특정 실시태양으로 한정되지 않는다. 실제, 본 명세서 판독시 본 발명에 대한 수많은 수정 및 변형이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 따라서 청구항에 부여된 등가의 전체 범주로 첨부된 청구항 측면으로만 한정된다.

실시예 1: IFG로 처리하였을 때 마우스 생체내에서의 GCase 활성

하나의 GCase 샤페론인 IFG를 야생형 GCase를 발현하는 정상적인 마우스에 투여하고, GCase 활성을 평가하였다.

방법

약물 투여. 본 실시예는 GCase-특이 샤페론인 이소파고민이 마우스에 미치 는 효과에 관한 정보를 제공한다. IFG를 200 mg/kg/일로 마우스에 투여하고; 연구 개시후 4주째에 기관 및 혈장을 수집하였다. 1군당 수컷 C57BL6 (25 g) 마우스 10마리를 사용하였다. 약물을 식수 중에 제공하며, 물 소비량을 매일 모니터하였다.

대조군 (0 mg/kg/일)의 경우, 마우스는 매일 식수 (약물 불포함)를 투여받았고, 이를 2개의 군으로 분할하였다. 처리 4주후에 10마리의 동물을 안락사시키고, 하행대동맥 또는 대정맥으로부터 혈액을 수집하고, 조직을 수거한 후, 부검하였다.

시험군의 경우, 10마리의 마우스는 200 mg/kg/일로 투여하기 위해 매일 식수를 투여받았다.

혈액 샘플을 리튬 헤파린으로 뽑아내고, 혈장을 위해 회전시켰다. 출혈시킨 후, 비장, 폐, 뇌 및 간을 떼어내고, 바이알에 놓았다. 급속 냉동시키기 위해서 상기 바이알을 건식 얼음상에 놓았다. 이어서, 조직 및 혈장은 조직의 GCase 수준에 대하여 분석하였다.

조직 시료. 소량의 조직을 떼어내어, 500 ㎕ 용해 완충액 (20 mM 시트르산나트륨 및 40 mM 제이인산나트륨, pH 4.0, 0.1% 트리톤 X-100 포함)에 가하였다. 이어서, 단시간 동안 미세균질기를 사용하여 조직을 균질화시킨 후, 4℃에서 10분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 새 튜브로 옮기고, 효소 분석법을 위해 사용하였다.

조직 효소 분석법. 2.5 ㎕의 상등액 (96-웰 플레이트)에 17.5 ㎕ 반응 완충액 (시트레이트 포스페이트 완충액, pH 4.5, 트리톤 X-100 불포함), 및 50 ㎕의 4-메틸 움벨리페론 (4-MU)-표지된 기질, β-글루코피라노시드, 또는 표지된 음성 대 조군 (α-글루코피라노시드 또는 α-갈락토피라노시드)을 가하였다. 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 70 ㎕의 종결 완충액 (0.4 M 글리신-NaOH, pH 10.6)을 가하였다. GCase의 활성은 웰당 1초간의 판독 시간을 사용하여 355 nm에서 여기시켜 460 nm에서의 방출을 측정함으로써 측정하였다 (빅터(Victor)2 다중표지 계수기-왈락(Wallac)). 효소 활성은 첨가된 용해물의 양 (㎕)으로 표준화하고, 1 ㎕의 용해물당 효소 활성을 예측하였다. 증가비는 화합물을 사용하지 않은 경우의 활성분의 화합물을 사용한 경우의 활성(사용한 경우의 활성/화합물을 사용하지 않은 경우의 활성)과 동일하다.

결과

도 1에서 입증된 바와 같이 GCase 수준은 간 (1), 비장 (2), 뇌 (3) 및 폐 (4)에서 IFG 처리 후 2주째 증가하였다. 10마리의 마우스 각각을 0, 1, 10, 또는 100 mg/kg/일 IFG 유리 염기로 처리한 별도의 실험에서도 유사한 결과가 관찰되었고; 야생형 GCase 활성은 IFG 유리 염기에 따라 선형의 용량-반응 증가를 보였다.

이러한 결과는 특이적인 약리학적 샤페론이 생체내, 및 특히 뇌에서 비-돌연변이체 GCase의 활성을 증가시킬 수 있다는 증거를 지지한다.

이러한 결과는 특이적인 약리학적 샤페론이 생체내, 및 특히 뇌에서 비-돌연변이체 GCase의 활성을 증가시킬 수 있다는 증거를 지지한다.

실시예 2: 안전성, 내약성, 약물 동태학 및 β-글루코세레브로시다제 효소 활성에 미치는 효과를 평가하기 위한 다중-용량의 IFG 투여

또다른 리소좀성 효소인 α-갈락토시다제 A에 대한 약리학적 샤페론인 DGJ는 50 mg b.i.d. 및 150 mg b.i.d으로 건강한 지원자의 백혈구에서 α-갈락토시다제 A 활성을 용량에 의존하는 방식으로 증가시킨다는 것이 앞서 제시된 바 있다.

본 실시예에서는 건강한 지원자에서 IFG의 안전성, 내약성, 약물 동태학 및 약동학을 평가하기 위해 IFG를 경구 투여하는 2개의 이중-맹검, 위약-통제된 1단계 연구를 기술한다.

연구 디자인 및 기간 . 인간에서의 제1 단일 상승 용량 연구 (1a)에서, 8, 25, 75, 150 (2개의 코호트), 및 300 mg의 용량을 투여하였다 (각각 코호트에서 6개 활성, 2개는 위약). 복합 상승 용량 연구 (1b)에서, 25, 75, 및 225 mg의 용량을 7일간 매일 투여하였다 (각각 코호트에서 6개 활성, 2개는 위약). 두가지 연구 모두에서 각 군의 8명의 대상자 중 6명은 무작위로 IFG 타르트레이트를 받도록 하고, 2명의 대상자는 위약을 받았다. 대상자들은 하루 전날 저녁부터 투약이 완전히 끝난 후 24시간째까지 갇혀 있게 하였다. 1a 연구 단계에서 대상자는 투약 후 48시간째 (PK 샘플링) 및 7일째 (안전성 계속 관리) 회복되었다. 1b 연구 단계에서 대상자는 최종 투약 후 48시간째 (PD 샘플링), 7일째 (PD 샘플링 및 안전성 계속 관리), 및 14일째 (PD 샘플링) 회복되었다.

연구 집단 . 대상자는 일반 지역 사회의 일원으로 구성된 19세 내지 55세 사이 (19세 및 55세 포함)의 건강한 남성 및 여성 지원자였다.

안전성 및 내약성 평가 . 안전성은 생명 징후, 실험상의 매개변수 (혈청 화학검사, 혈액학적 검사, 및 소변 검사), 신체 검사를 평가하고, 치료 기간 동안의 유해 사례를 기록함으로써 측정하였다.

약물 동태학 샘플링 . 투약 전 EDTA를 함유하는 혈액 수집 튜브에 혈액 샘플 (각각 10 mL)을 수집하고, 투약 후 48시간 동안 1a 단계시 일정한 간격으로 측정하였다. 1b 연구 단계에서는 최소 투약 후 24시간 동안 전체 IFG 타르트레이트 약물 동태학적 프로파일을 측정하고, Cmin 값은 투약전 6일 및 7일째 수득하고, 또다른 전체 프로파일은 최종의 7일째 투약 후 24시간 동안 측정하였다.

GCase 효소 활성 샘플링 . GCase 활성을 투약전 1일, 3일, 5일, 7일, 9일, 14일, 및 21일째 측정하였다. 혈액 샘플을 얼음 배쓰에서 냉각시키고, 가능한 빨리 냉동 상태에서 원심분리시켰다. 혈장 샘플을 2개의 분취량을 나누고, 분석시까지 20±10℃에서 저장하였다. 연구 종결시, 모든 샘플은 분석을 위해 MDS 파마 서비스 애널리티컬 래버러토리즈(MDS Pharma Services Analytical Laboratories) (링컨(Lincoln))로 옮겼다. 1일째 및 7일째 IFG 타르트레이트 투여 후 처음 12시간 동안의 신 제거율을 측정하기 위해서 IFG의 분석을 위해 각 대상자로부터 완전한 소변 배출량을 수집하였다.

통계학적 분석 . 실험실 평가, 신체 검사, 유해 사례, ECG 모니터링 및 생명 징후 평가를 비롯한 안정성 데이타는 처리군과 수집 시점에 따라 요약하였다. 기술 통계량 (산술 평균, 표준 편차, 중앙값, 최소 및 최대)은 정량적 안정성 데이타에 대해서 뿐만 아니라, 기준과의 차이에 대해서 계산하였다. 정성적 안전성 데이타 분류를 위해 빈도 계수를 수집하였다.

결과

약물 동태학. 상기 두가지 연구 모두에서, 이소파고민 타르트레이트는 일반 적으로 모든 투여량에서 내약성이 뛰어났고, 두가지 연구 모두에서 처리시 출현된 유해 사례는 대개 경미하였다. 중증의 유해 사례는 발생하지 않았다.

이소파고민 타르트레이트는 경구 경로를 통해 우수한 전신 노출을 나타내었다. 단일-용량 연구에서, 혈장 AUC 및 Cmax 값을 투여량에 대하여 선형으로 보정하였다. 평균 혈장 수준은 3.4시간째에 최고였고 (SEM: 0.6시간), 혈장 제거 반감기는 14시간 (SEM: 2시간)이었다. 다중-용량 연구에서, 경구 투여한 후 7일째 약물 동태학 양상은 용량에 대하여 선형인 것으로 나타났으며, 이소파고민 타르트레이트의 축적은 예측되지 않았다. Tmax 및 반감기 값은 단일-투약 연구에서 관찰된 것과 유사하였다.

반복된 용량으로 25 내지 225 mg의 IFG를 건강한 남성 및 여성 대상자에게 투여한 후의 평균 반감기 범위는 5.14 내지 19.9시간이었다. 1일째 및 7일째 AUC 및 Cmax 비교에 준하여 반복 투약 후 최소의 IFG가 축적된 것이 관찰되었다. 평가한 어떤 약물 동태학 매개변수에서도 성별간의 차이는 관찰되지 않았다.

IFG를 받은 건강한 성인 대상자에 의해서 가장 빈번하게 보고된 유해 사례로는 접촉성 피부염, 두통, 구역, 혈청 빌리루빈 증가, 어지럼증, 가피 형성, 눈 충혈, 및 천자 부위 통증을 포함한다. 어떤 중증의 유해 사례도 발생하지 않았으며, 어떤 대상자도 유해 사례에 기인하여 치료를 중단하지는 않았다.

GCase 활성. IFG를 받은 모든 대상자에서 치료 기간 동안에는 GCase 수준이 현저히 증가하였고, 이후 약물 제거시에는 감소하였으며, IFG 최종 투약후 2주째인 21일째까지는 거의 기저 수준으로 돌아왔다. 효소 수준의 증가는 용량과 관련이 있으며, 기준보다 대략 3.5-배에 도달하였다 (도 2). 이러한 결과는 경구적으로 투여된 IFG가 인간 생체내에서 그가 의도하는 표적인 GCase의 수준을 증가시키는 효능을 갖고 있다는 것을 시사한다.

실시예 3: α-시누클레인을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서의 IFG의 평가

본 실시예는 α-시누클레인을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 IFG를 투여함으로써 얻은 결과를 기술한다. 뉴런에서의 야생형 인간 α-시누클레인 발현으로 마우스가 2개월이 될 때까지 신피질, CA3 해마, 및 흑색질의 뉴런에는 α-시누클레인, 및 핵 및 세포질을 포함한 유비퀴틴-결합된 (ubiquinated) 면역반응성 봉입체가 점점 축적되었다 [Masliah et al, Science. 2000; 287: 1269]. 마우스 및 인간에서 야생형 GCse의 활성을 증가시킬 수 있는 IFG의 능력에 기초하여, 이들 마우스에서 GCase를 증가시키는 것이 과발현된 α-시누클레인을 상쇄시킬 수 있고, 봉입체를 감소시키거나 제거할 수 있을 것으로 기대되었다.

방법

마우스 . 처리 개시시 다른 처리군 모두와 관련하여 각각 기준 및 3 내지 4주에 관해 5 내지 6주령째에 48마리의 트랜스제닉 동물 (수컷 및 암컷)을 6개의 군 (n=8)으로 배치하였다. 하나의 트랜스제닉 동물군은 기준군 (5주령)으로 하고, 이를 0일째 처리하지 않은 상태로 희생시켰다. 하나의 트랜스제닉 동물군은 비히클로 처리하였다.

처리 . 마우스 (3-4주령)를 3개월 동안 2 mg/kg; 20 mg/kg; 또는 200 mg/kg의 IFG 타르트레이트로 매일 한번씩 (경구로) 처리하였다. 1개의 군 또한 20 mg/kg로 이틀에 한번씩 처리하였다.

조직 시료 . 기준군의 동물을 5주령째에 희생시켰다. 다른 동물 모두는 3개월의 처리 기간 종결시 희생시키고, 혈청 및 포식세포 뿐만 아니라, 폐, 뇌 및 CSF의 시료를 위해 혈액을 추출하였다. 이로써, 모든 마우스는 표준 흡입 마취 (이소푸루란, 박스터(Baxter))에 의해 진정시켰다. 둔개 및 대후두공 노출에 뇌척수액을 수득하였다. 노출시, 파스튜르 피펫을 대후두공 안으로 대략 0.3-1 mm 깊이까지 삽입하였다. 전체적으로 흐름이 멈출 때까지 석션 및 모세관 작용에 의해 CSF를 수집하였다. CSF를 즉시 냉동시키고, -80℃에서 보관하였다.

CSF를 샘플링한 후, 각각의 마우스를 등쪽으로 드러눕히고, 가슴을 개복한 후, 1 cc 시린지에 부착된 26-게이지 바늘을 우측 심장 심실 챔버내로 삽입하였다. 광 석션을 니들에 가하였다. 혈액을 2부로 나누었다. 1부는 3.8% 시트르산나트륨에서 수집하여 혈장 및 포식세포를 수득하고, 1부에서는 혈청을 수득하였다. 마우스에 생리학적 (0.9%) 식염수를 경심장으로 주입하고, 폐 조직 뿐만 아니라 뇌를 신속하게 떼어내었다. 폐를 냉 PBS에서 세정하여 (오직 바깥쪽만) 혈액을 제거한 후, 급냉시켰다.

뇌를 떼어내어 반으로 절단하였다. 마우스 모두의 우측 반구를 실온에서 1시간 동안 새로 제조한 4% 파라포름알데히드/PBS (pH 7.4)에서 침지식으로 고정시켰다. 이후, 확실하게 냉동보관하기 위해 뇌를 24시간 동안 15% 수크로스 PBS 용액으로 옮겨 놓았다. 다음날 뇌를 액상 이소펜탄에서 냉동시키고, 조직 검사에 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 1군당 10마리의 동물로부터 IFG-타르트레이트 처리에 대한 효과를 측정하기 위해서 알파-시누클레인 병상의 결정을 위해 10 ㎛ 두께의 냉동절편을 절단하였다. 언근한 기관 및 조직 모두를 샘플링하고, 특정의 뇌 부위로부터 즉, 한쪽 반뇌의 해마, 중뇌, 전두엽 피질 및 선조체로부터 추출하고, 냉동시켰다. 나머지 한쪽 반뇌는 조직학적 평가를 위해 프로세싱하였다.

염색. α-시누클레인 양성 세포 및 루이 소체와 유사한 봉입체의 갯수를 평가하기 위해 희석율 1:5로 모노클로날 인간 알파-시누클레인 특이 항체 (알렉시스(Alexis)®; 카탈로그 번호 804-258-L001)를 사용하여 면역조직화학적 염색을 수행하고, 2차 Cy2 항체 (잭슨 이뮤노리서치((Jackson Immunoresearch)®)로 검출하였다. 각각 따로따로 전체 해마 및 피질에서 평가하기 위해 1층당 하나의 슬라이스로 이루어진 5개의 상이한 층에서 알파-시누클레인 양성 세포의 갯수를 계수하였다.

간략하면, 샘플을 실온에서 PBS로 10분 동안 세척한 후, 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드로 처리하여 고정시킨 후, 실온에서 각각 5분씩 2회에 걸쳐 PBS로 세척하였다. 프로테이나제 K-처리 절편의 경우, 실온에서 10분 동안 10 ㎍/ml 프로테이나제 K를 함유하는 PBS에서 절편을 인큐베이션시켰다. 이어서, 샘플을 실온에서 15분 동안 차단 용액과 함께 인큐베이션시켜 내인성 퍼옥시다제를 차단한 후, 추가로 두번 더 5분간 PBS로 세척하였다. 이어서, 샘플을 실온에서 60분 동안 차단 시약과 함께 인큐베이션시켜 비특이 결합을 차단한 후, 추가로 두번 더 5분간 PBS로 세척하였다. 이어서, 샘플을 실온에서 5분 동안 M.O.M 희석제와 인큐베이션시킨 후, 실온에서 60분 동안 1차 항체 (M.O.M 희석제 중 희석율 1:5)와 함 께 인큐베이션시켰다.

1시간후, 샘플을 실온에서 5분 동안 2회에 걸쳐 PBS로 세척하고, 실온에서 추가의 60분 동안 차단 시약과 함께 인큐베이션시켰다. 2회에 걸쳐 세척한 후, 샘플을 빛이 없는 상태하에 실온에서 60분 동안 2차 Ab Cy 2-염소 항-래트 (M.O.M 희석제 중 희석율 1:200)와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 샘플을 5분 동안 PBS로 세척하고, 5분 동안 멸균의 분자-생물 등급수로 세척하고, 폴리비닐 알코올로 덮었다.

뇌 α-시누클레인 병상 측정 . α-시누클레인 면역반응성 평가를 위해 전문 영상 분석 소프트웨어 (이미지 프로 플러스(Image Pro Plus), 버전 4.5.1.29)를 사용하였다. 동일하게 노출 시간을 400 ms로 설정하여 각각의 형광 이미지를 기록하였다. IR 계수에 대하여 픽셀 고해상도를 확실하게 하면서 각각 100배 확대된 100개 이하의 단일 영상을 하나의 영상 (실제 크기 약 3 x 1 m)으로 조립하였다. 조립된 영상 모두를 수동으로 모든 측정에서의 검출을 위해 대비시키고, 동일한 강도에 기초한 임계값을 사용하였다. 매우 예민한 층중의 단일 세포와, 인접한 층 사이에서는 오직 하나만을 계수할 수 있도록 하기 위해서 최소 크기를 30 ㎛²로 크기 제한을 설정하였다. 거시적 근거에 기초하여 평가하는 동안, 물체 계수의 아우트라인을 저장하였다.

추가 단계에서는 측정된 모든 물체를 저장된 아우트라인을 사용하여 원래의 (비대조) 영상으로부터 끌어내고, 분류된 물체 영상에서 물체 크기에 따라 조립하 였다. 분류된 물체 영상을 진원도 한정 (하한: 1; 상한: 1.5)을 사용하여 재평가함으로써 α-시누클레인 양성 세포를 편향된 물체로부터 떼어놓았다. 이들 자동 물체 계수를 시각적으로 조정하고, 계수는 스프레드 시트에서 충분한 원형을 띠지 않거나, 배경으로부터 분리될 수 없는 명백한 세포들 모두를 가함으로써 수동으로 보정하여 최종의 세포 계수를 얻었다. 하기 매개변수를 평가하고, 계산하였다:

● 각 슬라이스에서 피질 및 해마의 측정 면적; 및

● 특이적인 뇌 부위 해마 및 지질의 측정 면적당 IR 양성 세포의 갯수.

결과

정성적 결과 . 처리된 마우스와 비처리된 마우스 사이의 차이는 정성적으로 대조군 동물의 병상과 비교하여 IFG-타르트레이트 (2 및 20 mg/kg b.w. 매일)로 처리된 동물 중 몇몇에서는 배경이 강하게 감소하고, α-시누클레인 양성 세포 갯수가 감소한 것에서부터 면역반응성 세포의 갯수는 감소하지 않고 배경이 감소된 것까지 상이한 정도로 육안으로 볼 수 있었다 (도 3A-C, 피질; 도 4A-C, 해마). 인간 α-시누클레인을 과발현하는 마우스에서 배경의 강도는 신경돌기 및 가지 돌기 뿐만 아니라, 시냅스 중의 세포내 α-시누클레인으로부터 비롯된 것이며, 따라서, 배경 감소는 이들 뉴런 구조체내 단백질의 발현이 감소되었다는 것과 동일화시킬 수 있다.

이는, 비히클 대조군으로 처리된 마우스로부터 유래된 절편을 염색함으로써 입증된 바와 같이 (도 5A), 이러한 마우스 모델이 응집된 α-시누클레인을 발생시킨다는 첫번째 증거가 된다. α-시누클레인을 염색하기 전에 프로테이나제 K로 절 편을 전처리하였을 때에도 또한 단량체 α-시누클레인의 분해에 의한 응집된 α-시누클레인이 존재하는 것으로 나타났다 (도 5C). 마우스를 IFG로 전처리하였을 때 α-시누클레인 응집이 감소하는 것으로 보였다. 영상은 프로테이나제 K로 전처리하지 않았거나, 전처리하였을 때 20mg/kg IFG-타르트레이트에 반응한 단 1마리의 동물에 관한 현재까지의 분석을 나타낸다 (각각 도 5B 및 D). α-시누클레인 응집체는 프로테이나제 K 분해에 대하여 내성을 띠기 때문에 정해진 연구 기간 동안에 상기 동물 모델에서는 α-시누클레인 응집체가 축적되었고, 희생 3개월전 IFG-타르트레이트로 처리하는 것이 이러한 α-시누클레인 응집체의 축적을 막았다는 것이 전처리를 통해서 밝혀졌다.

정량적 결과 . IFG-타르트레이트로 처리하였을 때 측정된 뇌 부위, 둘 모두에서 α-시누클레인 병상이 감소하였으나, 그 효과는 해마에서 보다 현저하였고 (도 5B), 피질에서는 유의적 수준에 도달하지 못했다 (도 6A). 용량 반응은 해마의 경우에서는 뚜렷하게 육안으로 볼 수 있었고, 피질에서는 잠재적으로 육안으로 볼 수 있었다. 최저 용량인 2 mg의 IFG-타르트레이트/kg가 가장 효과적이었으며, 해마에서 면역반응성 세포의 갯수는 비히클-처리 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하였다 (p < 0.05) (도 6B). 그보다 고용량은 α-시누클레인 병상을 통계학상 유의적으로 감소시키지 못했다. 20 mg IFG-타르트레이트로 매일 처리하는 것 또는 이틀에 한번씩 처리하는 것 사이에는 어떤 차이도 없었으며, 평균은 동일한 수준이었다. 그러나, 20 mg 용량이 대조군과 비교하여 효과가 없었으며, 따라서, 매일 또는 이틀에 한번씩 처리하는 것이 동일한 효능을 갖고 있다는 결과는 정확하지 않 을 수 있다는 것은 명시되어야 한다.

기준군에서의 평가를 통해 하기 결과를 얻었다: 첫번째로, 5주령째에 해마 중 α-시누클레인으로 충만된 세포의 출현과 관련하여 개개의 마우스에는 변화가 있었으며, 이를 통해 해마 병상의 변화와 높은 통계학적 표준 편차가 있었다. 추가로, 피질 중 면역반응성 세포의 갯수는 상기 연령에서는 일관되게 낮았다. 그러므로, 노화하는 동안 병상의 증가는 피질의 경우 모든 연구군과 비교하여 유의적이었지만, 해마의 경우에는 유의적인 수준에 도달하지 못하였는데, 이는 기준군에서 상기 부위에 있어서의 개인적인 차이에 기인하는 것이다.

동물 1마리당 전체 연구된 부피를 증가시키는 것과 동등한 것으로, 부위 둘 모두를 개개의 평균으로 평균화한 후, 가장 효과적인 유효량인 2 mg IFG-타르트레이트로 처리된 마우스 (p > 0.05)를 제외한 모든 군은 기준과 비교하여 유의적으로 더 높은 α-시누클레인 양성 세포 부하량을 가졌다 (p < 0.01). 이는 2 mg IFG-타르트레이트의 투여량이 연령에 수반한 병상 증가를 방지한다는 결론을 인정하는 것이다.

이러한 데이타는 GCase를 증가시키는 것이 α-시누클레인 수준을 감소시킬 수 있고, α-시누클레인 단량체가 올리고머 응집체로 응집되지 못하도록 한다는 것을 지지한다. 상기 정상적인 대조군 (p = 0.027)과 비교하여 고셰병을 앓는 (즉, GCase 활성이 감소된) 환자에서 혈장 α-syn 수준 (ELISA에 의해 검출)이 상승한 것으로 관찰되었다는 최근의 결과로부터 추가로 지지된다. 고셰병을 앓는 53명의 남성과 여성 (3형을 갖는 남성 1명 포함)으로부터 유래된 혈장을 평가하였다.

실시예 4: GCase 활성이 감소된 마우스의 뇌에서 α-시누클레인의 축적 및 파킨슨증 동태 표현형의 발생

본 실시예는 GCase 활성이 감소되어 있는 트랜스제닉 돌연변이체 넉-인 마우스와, GCase의 비가역적 저해제인 콘두리톨-β-에폭시드 (CBE)로 처리된 V394L 동형접합성 넉-인 마우스의 뇌에서 알파-시누클레인을 면역조직화학적 분석법으로 분석한 결과를 기술한다. GCase 활성이 감소되어 있고, 뇌에 글루코실세라마이드가 축적되어 있는 [Sun et al 2005, Journal of Lipid research] 트랜스제닉 마우스 모델에는 또한 유비퀴틴-결합된 및 응집된 α-시누클레인이 축적되었다. 뇌에는 글루코실세라마이드 또는 α-시누클레인이 축적되지 않지만, GCase의 비가역적 저해제인 콘두리톨-β-에폭시드 (CBE) 처리에 의해 글루코실세라마이드 및 α-시누클레인의 축적이 유도될 수 있는 고셰병에 대한 트랜스제닉 마우스 모델을 발생시켰다.

방법

마우스 . 점 돌연변이 D409H 또는 V394L에 대하여 동형접합성이고, 프로사포신 넉-아웃 배경에서 낮은 수준으로 사포신 C를 발현하는 마우스를 뇌에서의 α-시누클레인 축적에 관해 분석하였다. 이들 마우스는 뇌에서는 글루코실세라마이드를 축적하는 것으로 보고되었다. 오직 점 돌연변이 V394L에 대해서만 동형접합성인 마우스를 CBE 처리하고, 그리고 CBE 처리하지 않고 α-시누클레인 축적에 관해 분석하였다. CBE로 처리하지 않은 경우에는 이들 마우스의 뇌에 글루코실세라마이드가 축적되지 않았다. 연속 30일 동안 매일 마우스에 CBE를 복강 주사하고 (마우스 총 중량으로부터 계산하여 500 μM), α-시누클레인 축적에 관해 면역조직화학법에 의해 뇌를 분석하였다.

조직 시료 및 염색 . 뇌 조직을 냉동시키고, 면역조직화학법을 위해 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정시키고, 항-인간 α-시누클레인 (ab1903; 압캠(Abcam), 매사추세츠주 케임브리지 소재) 및 토끼 항-유비퀴틴(ab7780; 압캠, 매사추세츠주 케임브리지 소재)으로 일련의 절편을 공-표지하였다.

결과

GCase-활성화 단백질 프로사포신 C 발현이 감소되어 있고, 조합된 Gba 돌연변이 (D409H 또는 V394L)를 갖는 마우스의 뇌로부터 유래된 일련의 절편을 α-시누클레인 및 유비퀴틴에 대해 염색하였다. 10주령된 마우스의 경우, 해마, 기저핵 (꼬리핵, 피각, 흑색질, 시상하핵), 뇌간, 및 몇몇 피질 및 소뇌 부위에서 유의적인 갯수의 α-시누클레인 응집체가 관찰되었다. 유비퀴틴-결합된 응집체 또한 이들 부위에서 발견되었고, 몇몇은 α-시누클레인과 함께 위치하였다. 그러나, α-시누클레인 응집체는 V394L 마우스에서 관찰되지 않았다 (일반 프로사포신 사용). 그러나, 30일 동안 V394L 마우스를 CBE로 처리하였을 때에는 뇌에 α-시누클레인이 축적되었다. 이러한 결과를 조합해 보면 GCase 활성을 감소시키고, 뇌에서의 글루코실세라마이드 수준을 증가시키는 것이 α-시누클레인 축적을 증가시킬 수 있다는 것을 제안할 수 있다.

본 발명은 본원에 개시된 구체적인 실시태양으로 그 범주가 한정되는 것은 아니다. 실제, 당업자라면 본원에 개시된 것 이외에도 전술한 상세한 설명 및 첨 부 도면으로부터 본 발명에 대한 여러가지 변형이 자명할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범주내에 포함된다.

특허, 특허 출원, 공개공보, 제품 설명서 및 프로토콜이 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되어 있으며, 이들의 개시 내용 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다.

Claims (34)

1. α-시누클레인 병증을 앓거나 α-시누클레인 병증이 발병할 위험에 처해 있는 개체의 치료에 사용되기 위한 약제학적 조성물로서, 개체는 β-글루코세레브로시다제를 코딩하는 유전자에 돌연변이를 갖지 않고, 활성 성분으로서 이소파고민 또는 그의 염을 포함하는, 약제학적 조성물.
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3. 제1항에 있어서, α-시누클레인 병증이 파킨슨병, 루이 소체병, 다계통 위축증, 할러포르텐-스파츠 병, 및 전측두엽 치매인 약제학적 조성물.
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6. 제1항에 있어서, 염이 이소파고민 타르트레이트인 약제학적 조성물.
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11. 제1항에 있어서, β-글루코세레브로시다제의 활성을 기저 수준에 비하여 적어도 1.2배만큼 증가시키는데 유효한 양으로 이소파고민 또는 그의 염을 포함하는 약제학적 조성물.
12. 제11항에 있어서, β-글루코세레브로시다제의 활성을 기저 수준에 비하여 적어도 1.5배만큼 증가시키는데 유효한 양으로 이소파고민 또는 그의 염을 포함하는 약제학적 조성물.
13. 제12항에 있어서, β-글루코세레브로시다제의 활성을 기저 수준에 비하여 적어도 2배만큼 증가시키는데 유효한 양으로 이소파고민 또는 그의 염을 포함하는 약제학적 조성물.
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28. 제1항에 있어서, 개체의 혈장 중의 α-시누클레인 수준을 조정하는데 유효한 양의 이소파고민 또는 그의 염을 포함하는 약제학적 조성물.
29. 제1항에 있어서, 제2 치료제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
30. 제29항에 있어서, α-시누클레인 병증이 파킨슨병, 파킨슨증 또는 루이 소체 치매이고, 제2 치료제가 레보도파, 항콜린제, 카테콜-O-메틸 트랜스퍼라제 (COMT) 저해제, 도파민 수용체 효현제, 모노아민 옥시다제 저해제 (MAOI), 말초 데카르복실라제 저해제, 및 소염제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
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