JP5749156B2 - 生理活性物質の生産のための単一細胞を選抜する方法 - Google Patents
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Description
1つ以上の生理活性物質を生産するための単一細胞又は細胞小集団を選抜することは、多くの場合において望ましい。例えば、細胞に対する生理活性物質の効果を決定するための小分子、タンパク又はsiRNAなどの薬剤候補のように、そのような情報を用いて生理活性物質への暴露後の細胞の状態又は動作を決定してもよい。そのような情報は、例えばSNP又は抗体といった生理活性物質の特定の変異体を発現する細胞を識別するのにも有用であり得る。例えば、多くの細胞におけるヌクレオチド配列の頻度を利用して、それらが作るタンパクの動作又は結果的に生じる表現型を予測するか又はモデル化するための抗体のように、そのような情報は、対象としている生理活性物質をコードする核酸配列を識別するのにも有用であり得る。本明細書の方法、装置及びキットは、これらの用途及び同様の用途に向けられている。
ここで用いられているように、生理活性物質は、生物系において活性を有するあらゆる物質である。生理活性物質の例には、小分子化合物;例えばタンパクといったポリペプチド;siRNA;及び、オリゴヌクレオチドが含まれる。複数のそのような生理活性物質は、例えば、そのような薬剤の2個以上;いくつかの場合においては、3個以上の物質;5個以上の物質;10個以上の物質;20個以上の物質;50個以上の物質;100個以上の物質;500個以上の物質;1000個以上の物質;5000個以上の物質;10,000個以上の物質;30,000個以上の物質;100,000個以上の物質;又は、1,000,000個以上のそのような物質を含む。
ここで、角括弧は、1リットル当たりのモル濃度又は1モル当たりのリットル濃度を意味する。
式IIIにおいて、Kの単位は、1モル当たりのリットルである。1モル当たりのリットルの典型的な値は、1モル当たり約105〜約1011リットルの範囲内である。
タンパク、核酸などの対象としている1つ以上の生理活性物質の生産のための単一細胞を選抜するための方法、装置及びキット、又は、タンパク及びそれをコードする核酸を提供する。
本発明の方法の一実施形態は、複数の分離細胞から情報を得る方法を含む。個別ウェルに多数の細胞を配置することによって、多数の細胞から同時にその情報を得てもよい。1つのウェル内に単一細胞を含むように試みがなされている。しかしながら、数百、数千又は数万もの細胞及びウェルを含む方法を実行する場合は、いくつかのウェルが細胞を含んでおらず、その他のウェルが1個を超える細胞を含んでいてもよい。
主題の方法の実施においては、対象としている1つ以上の生理活性物質を作る細胞を個別のウェルに分離する。いくつかの実施形態においては、細胞は、すべてのウェルにおいて、例えば、培養細胞株に由来する細胞、初代細胞試料に由来する細胞、又は、遺伝子操作された細胞などのように実質的に同一である。その他の実施形態においては、例えば、形質細胞又は同じヒト対象者に由来する異なる種類の細胞若しくは異なるヒト対象者に由来する同じ種類の細胞といった細胞は、各ウェルにおいて異なっていてもよい、すなわち、出所が異なるか、又は、それらをユニークにする遺伝子的相違を有していてもよい。いくつかの実施形態においては、1ウェル当たりに1個の細胞のみが配置される。その他の実施形態においては、1ウェル当たりに複数の細胞が配置される。一般的に、1個の細胞を含むマイクロウェルの数によって2個以上の細胞を含むマイクロウェルの数を除した比は、20%未満である。
マイクロウェルは、高さ50ミクロン(±25%)の壁を平面支持体に接合し、ウェル内部にオリゴヌクレオチドパッドを接合させることによって作成してもよい。単一細胞がマイクロウェル内に定着するように、これらのマイクロウェルに細胞を散布する。対象としているタンパクに付着するのに適した材料で覆われたカバーを、前記マイクロウェル上に配置する。例えば、トップカバーに抗体を固定化するために、タンパクA又はタンパクL(Sigma−Aldrich社、セントルイス、ミズーリ)などの抗体特異的捕捉剤によってそのカバーをコーティングする。
実施形態2においては、対象としているタンパクを付着するのに適した材料を、例えば、50ミクロンの六角形のウェルを含むブランクのPicoTiterPlate装置(454 Life Sciences社、ブランフォード、コネチカット)などの商用マイクロウェルアレイ上にコーティングする。単一細胞がウェル中に定着するような方法で、細胞を前記六角形のウェルに散布する。例えば、ウェルの表面の抗体を固定化するために、タンパクAなどの抗体特異的化合物によって表面をコーティングする。カスタムオリゴヌクレオチドアレイ(NimbleGenシステムズ社、マディソン、ウィスコンシン)を前記PicoTiterPlateの上に置いてmRNAを捕捉及び標識する。
実施形態3においては、平面支持体上に約50ミクロンの壁を付着させることによってマイクロウェルを作成する。単一細胞がマイクロウェル内に定着するような方法で、前記マイクロウェルに細胞を散布する。カスタムオリゴヌクレオチドアレイ(NimbleGenシステムズ社、マディソン、ウィスコンシン)を、前記作成されたマイクロウェルの上に置いてmRNAを捕捉及び標識する。タンパクを捕捉しない。
実施形態4においては、例えば、50ミクロンの六角形のウェルを含むブランクのPicoTiterPlate装置(454 Life Sciences社、ブランフォード、コネチカット)などの商用マイクロウェルアレイ用いて、散布した細胞を収容する。カスタムオリゴヌクレオチドアレイ(NimbleGenシステムズ社、マディソン、ウィスコンシン)を前記商用マイクロウェルアレイの上に配置して、mRNAを捕捉及び標識する。タンパクを捕捉しない。
実施形態5においては、2つの平面が多孔構造によって短い距離(例えば:50ミクロン)で分離されている。1つ又は両方の平面がマイクロアレイである。その多孔構造は、生体細胞(例えば:50ミクロン)を含むのに充分に大きい孔を含む。一時的に多孔構造を1つの平面に貼ることによって、開いたマイクロウェルのアレイを作成する。2つの方法:a)細胞を前記マイクロウェル上にランダムに散布するときに、通常、1つのみの細胞が1つのマイクロウェルを占めるように、前記細胞の濃度を選択する確率的分離;及び、b)予め決めたマイクロウェルに個別の細胞を移す決定論的分離、のうちの1つによって生体細胞を前記マイクロウェルの頂部に散布する。一定時間(例えば:3分)後に、密度増加によってマイクロウェル上の細胞が前記マイクロウェルに入るようにする。すべてのマイクロウェルに共通する薬剤を前記マイクロウェル上の領域に導入すると、各マイクロウェル内で反応が生じる。小分子を短い時間(例えば:10秒)で前記マイクロウェルから拡散させる。次いで、第2の平面を前記マイクロウェル上に置いて密閉し、より長い時間にわたってマイクロウェル内の反応を生じさせる。前記反応によって、前記マイクロウェルに閉じ込められた化学物質によるマイクロアレイの変性が生じた。前記マイクロアレイが変性されたと考えられた後に、平面アレイを分離し、多孔構造を除去した。前記変性されたマイクロアレイ内に作られたコードを分析中に用いて、マイクロウェルを測定結果に関連付ける。前記コードはマイクロアレイ上の物理位置であってもよいし、又は、分析するデータにタグが埋め込まれるようにしてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドアレイの場合には、前記埋め込まれたタグがユニークなDNA塩基配列であってもよい。
本発明の主題の方法の要となるのは、個別のマイクロウェル中に単一細胞を閉じ込めることである。従って、本発明の一態様は、マイクロウェルで構成されたマルチウェル装置である。マイクロウェルは、2つの目的:第1に個別の細胞間で反応物及び生成物の拡散を抑制すること;第2に核酸ハイブリダイゼーション又はタンパクの相互作用などの処理速度を加速させること、を果たす。従って、本発明のマルチウェル装置のマイクロウェルは、1cm2当たり100個よりも多いマイクロウェル密度で相互に連結されており、各マイクロウェルは、1ピコリットルから500ナノリットルの間の容積を有している。そのトレイは、任意の数のウェルを含んでいてもよく、好ましくは96個以上、100個以上、1,000個以上、10,000個以上、100,000個以上、1,000,000個以上のウェルを含む。通常、マイクロウェルは、1cm2当たり100個を超えるウェル密度を有する。このウェルは、単一細胞を保持することができるように設計されており、また、そのトレイ面は、トレイの表面周辺に細胞を置いて移動させるときに、単一細胞が各ウェル内に移動するように設計されている。さらに、このトレイは、マイクロウェルが外部の薬剤を断続的に利用できるように設計されていてもよい。
ポリヌクレオチドは、細胞が例えばシークエンシング反応において溶解された後に、プライマーとしてウェル中のヌクレオチドを複製するように機能してもよい。
以下の実施例は、当業者に、どのようにして本発明を作成及び使用するかについての完全な開示及び説明を提供するように出されており、また、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の試験がすべて又は唯一の行われた試験であることを表すように意図されている。使用した数(例えば量、温度など)に関する正確性を保証するように努めたものの、ある程度の実験誤差及びずれが含まれると考えられる。別段の定めがない限り、部は重量による部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、また、圧力は気圧又は気圧付近である。
マウスの免疫化
図2を参照して、BALB/cマウス201のグループを、50μgのニワトリ卵白リゾチーム(HEL、Sigma、セントルイス、ミズーリ)が含まれる完全フロインドアジュバント(Sigma)で腹膜内において免疫化させる。第1の免疫化の6週間後に、マウスを、同量のHELで静脈内において免疫化させる。第2の接種の2日後に、マウスの尾静脈から血液を得て、血清中のHELに対するポリクローナル抗体の存在をELISA試験によって測定する。前記ELISA試験によって測定された滴定濃度が充分なものであれば、その翌日にマウスを屠殺してひ臓を採取する。
脾細胞の細胞懸濁液は、ひ臓を機械的に破砕することによって得られる。また、赤血球をpH7.4の0.16M塩化アンモニウム溶液中で溶解させる。得られる一細胞懸濁液を、最適な希釈で、FITC(Pierce Biotechnology社、ロックフォード、イリノイ)によってラベルされたHELと、PE−Cy5(Prozyme社、サンリアンドロ、カリフォルニア)によってラベルされたHELとの組合せを用いて染色する。染色を4℃において2ステップで行った。まず、細胞を、経験的に決定される飽和濃度よりも低い最適濃度を用いて、FITCラベルされたHELによって1時間染色する。次いで、細胞を、FACSバッファーで3回洗浄する。次いで、細胞を、PE−Cy5ラベルされたHELで染色する。染色下後に、細胞を、5%FCSを含むPBS中で2回洗浄する。
PicoTiterPlate(PTP)装置(454 Life Sciences社、ブランフォード、コネチカット)を準備し、その表面を、タンパクL(ピアスバイオテクノロジー社、ロックフォード、イリノイ)を含む0.1M酢酸ナトリウムで一晩コーティングする。その表面を3%BSAを含むPBSで1時間ブロックする。3%BSAを含むPBSを除去した後に、その表面を、0.1%Tween−20を含むPBSで4回洗浄する。次いで、PTP装置をSUPERase−Inを加えたPBSで満たす。PTP装置がビーズ蒸着装置(454 Life Sciences社、ブランフォード、コネチカット)中に存在するときは、ウェルに残る気泡を遠心分離によって取り除く。2mLのピペットを用いて、細胞を、PTP装置上に穏やかに置き、10分間放置して個別の細胞がウェルに入るようにする。ウェルに入らない細胞をカバーガラスによってPTP装置から出す。細胞を、グアニジンチオシアナートなどのカオトロピック剤又はNP−40などの洗剤を含む従来の溶解溶液で溶解させる(ステップ204)。対象としているタンパクを捕捉したいのであれば、洗剤NP−40を用いることができる。タンパクA又はタンパクLなどの捕捉剤でコーティングされた固体表面を用いてマイクロウェルを覆い、溶解させた細胞から放出される高分子の拡散を制限し、また、タンパクアレイを形成する固体表面上の抗体などの前記対象としているタンパクを同時に捕捉する(ステップ211)。
フォトレジストの円筒形柱のアレイを、標準的なフォトリソグラフィー技術及び剛体クロムマスクを用いて、シリコンウェーハス上に作る。フォトマスクと同じ透明度を用いて、50μmの空間を作る間隔機構を有する、50μm×50μm×50μmの大きさの正方形機構のアレイを作る。
PDMSプレポリマー(架橋触媒と10:1比率で混合)を上述のパターン化フォトレジスト特性の薄浮き彫りの上に3,000rpmで60秒間スピンコーティングして、厚さ約45μmのフィルムを作成する。そのため、得られるPDMS膜は、上記フォトレジスト特性のサイズによって定まる角孔を有する。このPDMS膜を60℃で2時間硬化させる。PDMSプレポリマーのより厚い層を、液滴法によって膜のふちに加える。この膜を60℃で一晩保持する。この膜をピンセットを用いて支持体から取り除き、支持体のふちに沿って所望のサイズに切断する。
PDMS膜を、数滴のエタノールを有するスライドガラスの表面に置く。数滴のBSA(PBS中に1%w/vで含まれる)の緩衝液を、膜に滴下して孔を覆う。液体は疎水性の孔を容易には満たさないので、真空(約500ミリトル)を30秒間適用して2回解放して孔に溜まった空気を抜き取り、BSAを表面に15分間吸着させる。次いで、スライドガラス上のPDMS膜を、PBSで3回洗浄する。膜をPBSの存在下でスライドガラスから剥がし、スライド上にその膜を密着させるのを補助するためのPBSで覆われたタンパクアレイスライド(Full Moon BioSystems社、サニーベール、カリフォルニア)の上に移す。
スーパーエポキシ2スライドガラス(TeleChemインターナショナル社、サニーベール、カリフォルニア)を、タンパクL(ピアスバイオテクノロジー社、ロックフォード、イリノイ)でコーティングする。調製した孔を有するPDMS膜をスライドガラスの上に置いて、圧迫してその表面と均一に接触させる。全機構をBSAの緩衝液中で再度ブロックする。再び、短い時間で真空を適用して孔中に閉じ込められた空気を除去する。ブロッキングを1時間行った後に、PBSで3回洗浄する。孔を有するPDMS細胞膜を支持するタンパクLで覆われたスライドガラスは、直ちにB細胞から抗体を捕捉することができ、PDMS細胞膜上の孔は、代表的なマイクロウェルである。タンパクLに加えて、タンパクG、タンパクA/G、ヤギ抗マウスIgG抗体などを用いてもよい。
NimbleGen社のHD−2マイクロアレーチップは、62mm×14mmのアレイサイズを有する1つのスライド上に210万個のプローブを有している。従って、210万個のユニークなタグを有する能力がある。捕捉、タグ付け及びその後のDNA操作を容易にするために、重鎖及び軽鎖の両方に対するプローブの一般的特徴を利用する。ここで、重鎖捕捉プローブについての前記一般的特徴の一例は:XhoI切断、454 Life SciencesによるプライマーB、ウェル同定タグの始まりを識別するための2塩基スペーサー(常に不変)、14量体ウェル識別子、マウスγ重鎖CH1 IgG1、IgG2a、及びIgG2bアイソタイプ重鎖保存配列捕捉プローブである。更に、軽鎖捕捉プローブについての前記一般的特徴の一例は、XhoI切断部位、454 Life Sciences407によるプライマーA、ウェル同定タグの始まりを識別するための2塩基スペーサー(常に不変)、14量体ウェル識別子、及び、マウスκ軽鎖定常領域捕捉プローブである。マイクロウェル同定タグの長さは14量体であり、2億6800万以上の可能な配列の組合せがあり、210万個のプローブに対して必要とされるものをはるかに超えることに留意されたい。このクッションは、同じ塩基の三連続、及び、完全自己相補性、又は、マイクロウェル識別タグと、重鎖プローブ配列、軽鎖プローブ配列、454プライマーA又は454プライマーとの間の相補性などの望ましくない配列を除去することができる。さらに、40%〜60%の間のG+C含有率を維持することが望ましい。必要であれば、エラー訂正の目的で、ハミングコードにおいて用いられるようなパリティコードをウェル識別タグに埋め込むことができる。免疫グロブリン重鎖(配列番号:1)及び軽鎖(配列番号:2)ポリペプチドに対するプローブの例を、図4に示す。
PTP装置の一側面からピペットで移された同じ容積の1%NP−40は、最終NP−40濃度を0.5%にする。PTP装置を10秒間定温放置する。次いで、PTP装置の頂部をNimbleGen社のHD−2マイクロアレイチップで覆い、そのチップを適切な器具で安全に締め付ける。37℃において30分間定温放置する。次いで、全機構を、トレイ内に保持されたRNアーゼを含まないPBSに浸して、PTP装置からマイクロアレイを分離する。PTP装置をPBSで強く3回洗浄する。1個のB細胞から捕捉された抗体を現に有するPTP装置は、4℃において保存可能である。マイクロアレイを、トレイ内に保持されたPBS中に60℃において10分間浸して非特異的にハイブリダイズしたRNA種を除去し、次いで、PBSによって強く3回洗浄する。マイクロアレイは、下流操作を直ちに実行できる。
マイクロアレイを1枚のキムワイプで簡単に拭いて乾燥させ、スーパースクリプトIII RTase(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア)と、適切なバッファー成分と、5’−メチルdCTP以外のdNTPとを含む30μLの逆転写酵素(RTase)反応溶液を直ちに加える。カバーガラスを追加し、マイクロアレイを50℃の湿潤環境下に1時間置く。カバーガラスをDNAポリメラーゼバッファ中に浸して3回洗浄することによって除去する。再びチップをキムワイプ上で拭いて乾燥させる。大腸菌DNAポリメラーゼ及びRNaseHを含む適切な30μLのバッファを加え、サンプルを16℃で2時間定温放置した。チップを洗浄し、合成された二本鎖(ds)cDNAをT4 DNAポリメラーゼによって37℃で30分間平滑化する。ビオチン化された末端を有する予めアニールしたアダプターを加え、T4DNAリガーゼによって適切なバッファ中において室温で1時間にわたってチップ上の平滑末端cDNAに結合させる。次いで、10mM トリスHCl(pH7.5)、0.1mM EDTA中で強く洗浄することによって過剰なアダプターを除去する。スライド及び付着したcDNAを4℃で保存することができる。
ハイブリドーマ株TIB−228(American Type Culture Collection、マナッサス、ヴァージニア)は、アイソタイプIgG2bと共にヒトCD14に対する抗体を生産する。そのDNA塩基配列は、重鎖及び軽鎖について決定されている。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域についてのGenBank登録番号は、それぞれAY669065及びAY669066である。組み換えヒトCD14は、商業的に入手可能である(Abnova社、台北、台湾)。本発明を実施するときに、マイクロウェル内に分離する前に、10個〜50個の範囲内の適切な数の細胞を、濃縮された抗原特異的Bと混合してもよい。CD14は、PE−Cy5でラベルされることによって、FITCラベルされたHELで染色される抗HEL抗体と区別され得る。
NimbleGenチップに付着した二本鎖(ds)cDNAを、XhoIエンドヌクレアーゼ(New England Biolabs社、イプスウィッチ、マサチューセッツ)を用いて37℃で15分間定温放置することによって切断した(ステップ207)。選択的にストレプトアビジンビーズ(MyOne bead、Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア)によってその放出された二本鎖cDNAを捕捉して保存することができる。そのような戦略によって貯蔵中のDNA損失が最小化される。その後、相補鎖をビーズから融解分離し、454プライマーAによるリアルタイムPCRによって定量し、リアルタイムPCRのための軽鎖領域類似試薬内に位置する適切なプローブと共に軽鎖プライマーを、重鎖二本鎖cDNA用に設計することができる。
a)454の実行から配列リストを得る;
b)配列をコンピュータによって評価し、各配列の標識、スペーサー及び定常領域を識別することによって、各配列が重鎖(H)又は軽鎖(L)の配列であるかを判断し、さらに、重鎖定常領域の5’末端方向の塩基を配列決定して、その微細な変化から捕捉された抗体のアイソタイプを決定するステップ;
c)定常領域配列及びスペーサーを隠すステップ;
d)標識細胞の重鎖及び軽鎖の配列を識別するステップ;
e)標識細胞の重鎖及び軽鎖の配列に対応するタグを識別して調べて、マイクロアレイ上で隣接している(すなわち、マイクロウェル幅よりも小さい)かどうかを判断するし、肯定的であれば、これらのタグがマイクロウェルを識別する。標識細胞を含む複数のマイクロウェルの位置は、それぞれがB細胞を含み得るその他のマイクロウェルの物理的レイアウトを確立するステップ;
f)そのレイアウトに基づいて、予測される各マイクロウェルのタググループを作成するステップ;
g)同一の重鎖又は軽鎖を有する配列を識別するステップ;
h)同一の重鎖又は軽鎖の配列に対応するタグをコンピュータで評価し、タグが同一であれば、その重鎖又は軽鎖の由来が識別されるステップ;
i)識別された重鎖及び識別された軽鎖に由来するタグを用いて、Hタグと及びLタグのペアを調査して、予期したタググループに適合するかどうかをみて、肯定的であれば、組合せが識別されるステップ;
j)複数の重鎖配列又は軽鎖配列を確認された組合せに整列して共通配列を得て、その一致を、適切な免疫グロブリンv遺伝子の原型ゲノム配列と照合するステップ;
k)ペアになった重鎖及び軽鎖配列のCDR及びFRのすべてが識別をして、さらに、原型と比較して変異した残基を識別するステップ;
l)確認された組合せをクラスター化し、一致した同一の組合せの頻度は、クローン選択現象の結果を表すかどうかを決定するステップ;及び
m)DNA塩基配列をアミノ酸配列に翻訳するステップ。
約50ミクロンの化学的不活性構造の構築は当業者に周知である。これらは、上述した本発明の実施形態1及び実施形態3の両方で用いられている。簡潔に、34mmのカバーガラス(Fisher Scientific社、ピッツバーグ、ペンシルベニア)をアセトン、イソプロパノール、メタノール、脱イオン水(18Mohm)で洗浄し、窒素気流下で乾燥させた。それを、80mTorrのベース圧力及び120mTorrの酸素圧力とした120ワットの酸素プラズマに10分間暴露させてさらに洗浄する(Technics 500II Asher)。
この実施例は、実施形態3及び実施形態4当てはまる。グアニジンチオシアナート(GT)のマイクロウェル内への拡散及び元への後退を計算する分子シミュレーションから結果を算出した。シミュレートしたGT分子は、B細胞の細胞膜の方に拡散して、究極的にはそのB細胞の細胞膜を溶解させた。それぞれ異なる時点で典型的なマイクロウェルの20枚の画像を算出した。最初の10枚の画像間の差は0.1秒であり;最後の11枚の画像間の差は1.0秒であった。
のベクターを加えて、各Δt=3ミリ秒ごとに経路を再計算した。
シスタンパク複合体及び/又はトランスタンパク複合体が抗体であれば、本発明によって、以前に入手可能であったよりも非常に多くの情報が提供される。配列決定したタグを元のマイクロウェルに関連付けることによって、B細胞によって生産されたmRNAの集団及びそれぞれの重差配列及び軽鎖配列を識別する。前記配列は、各B細胞内の体細胞突然変異を暗示し得る。
最も変異しやすい軽鎖及び重鎖アミノ酸は、パラトープの最も可能性が高い位置である。配列の集団を整列させることができるので、パラトープを推測できる。
計算化学は大いに進歩してきたが、アミノ酸配列及び溶媒に関する情報のみを用いてタンパク三次構造をコンピュータで推測する現在の方法は、なお困難であり、時間がかかり、誤りが生じやすい。しかしながら、先の情報又は制約を推定上の折りたたみに組み込めば、計算時間及び精度を著しく改善できる。Web抗体モデリング(http://antibody.bath.ac.uk/)は、高度に成功した抗体モデルを実証している。本発明は、我々が発見する抗体の計算された構造、及び、上記実施例4で識別されるパラトープを用いて、推定上のタンパク折りたたみに対して現実的な確率を与える。
この実施例は、実施形態3及び実施形態4に当てはまる。各B細胞の表面は、形質細胞有するよりも少ない程度で、何千もの同じ膜結合B細胞レセプタ(BCR)を含んでいる。細胞を、小さい割合のBCRに結合する蛍光ラベルされた抗原の既知濃度に供することによって特異的にラベルすることができる。前記割合fは以下の式によって近似的に表される。
ここで、KDは解離定数であり、[a]は抗原の濃度である。
ここで、cは任意定数である。
a)各配列をサンプリングした回数を決定するステップ;
b)任意値のcを用いて各配列に関連付けられたコピー数を算出するステップ;
c)前記コピー数の順で配列を分類するステップ;
d)前方散乱FACS F1シグナルによって側方散乱FACSシグナルF2を標準化して、結合BCR表面密度を算出及び推測するステップ;
e)前記結合BCR密度推定によってFACSシグナルを分類するステップ;
f)パラメータcを調整して配列の総数が確実にFACSシグナルの総数と等しくなるようにするステップ;
g)前記配列を前記結合BCR密度推測値と共に整列させるステップ;
h)前記各結合BCR密度推測値に対するKDを算出するステップ;及び
i)各配列に、前記配列と共に整列された前記結合BCR密度推定値の平均KDを関連付けるステップによって決定される。
本発明は、マイクロウェルが密集する表面に特定数の細胞を散布する。例えば3分といった短時間後に、前記細胞がマイクロウェル内に定着する。できるだけ多くのマイクロウェルを有するようにすること、従って、できるだけ多くの細胞を有するようにすることと、マイクロウェルがa)タグされたオリゴヌクレオチドによって充分なmRNAを捕捉し、かつ、b)細胞の内部に由来する材料が実質的にmRNADNAハイブリダイゼーションを妨げないために充分な大きさを有していることに競合が存在する。B細胞などの10ミクロン〜15ミクロンの直径を有する細胞については、50ミクロンのウェルサイズが合理的な妥協点であると予想される。その他の細胞又は異なる化学的性質について、ウェルサイズが変わってもよいことは明らかである。
各マイクロウェルは、抗体mRNAを捕捉するための2つのタグされたオリゴヌクレオチドを含む。1つは重鎖に対してのものであり、もう1つは軽鎖のためのものである。これらの2つの配列デジタル的に関連付けるために、1個の細胞を含む各ウェルから少なくとも1つの分子を配列決定しなければならない。cDNA配列が放出されて貯蔵されるので、各細胞の重鎖及び軽鎖に由来する少なくとも1つの配列が配列決定されることを確かにするために、配列をオーバーサンプリングしなければならない。
ハイブリドーマ株(NQ2−12.4)は、2.8×10−7のKDモル−1測定値を有する。抗体kon測定値は、約105秒1−モル−1周辺に固まる傾向があり、2.8×10−2秒−1のkoffを与える。10−7モル−1よりも大きいKDは、各抗原に非常に弱く結合し、抗原から実質的に速く分離し、従って望ましい結果を得る可能性が低いので、研究、診断又は治療に関してほとんど関心の対象ではない。通常は10−8未満のKDといった堅く結合する抗体は、はるかに有用である。本発明は、堅い結合のKDが通常2.8×10−2秒−1未満のkoff値を有し、従って、蛍光の使用を容易にして、24×24mmの抗体アレイにおいてKD及びkoffを測定することができるという事実を活用する。konは、kon=koff/KDから算出計算される。この実施例において、本発明は、2.8×10−2秒−1の非常に弱い場合にも機能し、従って、その他の商業的に関心の対象としている抗体についても機能することを示す。
を用いてαを求める。測定したシグナルを占有率に変換することができるので、αを知ることは本発明において非常に有用である。蛍光リーダーのキャリブレーションから測定された蛍光色素分子の数がわかるので、この占有率が結合している抗体及び遊離している抗体の両方である抗体の総数を与える。この数は、細胞の独自性、すなわち、その細胞が形質細胞であるか又はB細胞であるかということに非常に関連している。形質細胞は、多くの場合、それらのB細胞前駆体に由来するさらなる体細胞突然変異を含んでいる。形質細胞の表面のB細胞レセプタが体細胞突然変異の前に作成されるので、その抗体が異なっていてもよい。B細胞を識別すること及び高頻度のB細胞を識別することによって、堅く結合する抗体をより良く推測することができる。
この実施例は実施形態2及び実施形態4に当てはまる。NimbleGen社のオリゴヌクレオチドアレイは、ジグザグに配列された13ミクロン×13ミクロンのサイズのオリゴヌクレオチドパッドを含む。ジグザグに配列されているとは、交互になっていること、例えば、前記黒い四角がジグザグに配置されたチェス盤を意味する。PicoTiterPlate(PTP)六角形ウェルとNimbleGen社アレイとを対にするとき、マイクロウェルに対して完全に暴露されるいくつかのオリゴヌクレオチドパッドが存在し、マイクロウェル壁の下に埋められるか又は複数のマイクロウェルに暴露されるその他のものが存在するであろう。NimbleGen社のオリゴヌクレオチドアレイ及びPTP六角形ウェルを用いて本発明を機能させるためには、ほとんどのウェルが少なくとも2個のパッドを含んでほとんどの領域が暴露されることを保証しなければならない。
ロボットマイクロアレイスポッタ(例えば:SpotBot2、TeleChem、International、サニーベール、カリフォルニア)を用いる場合、この方法が有用である。1%低融点アガロース溶液(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア)を精製水中に溶解させ、70℃でスライドガラスの表面に(1スライド当たり2.0ml)注いだ。アガロースをゲル化させた後に、スライドを大気中で乾燥させる。乾燥したスライドをマイクロアレイスポット装置内に入れて、温水(例えば:70°C)をアガロース上に注ぐ。このアガロースは融解し、さらなる温水によって洗い流される。マイクロアレイスポッターの許容範囲(SpotBot2については約10%)と同程度に複製可能な孔となるように孔パターンを作成する。前記孔を作成して洗浄すると、同じマイクロアレイスポッタを用いて、その他の分子をその孔にスポットすることができる。配列エラーがあれば、アガロースは、マイクロアレイ針に対して低い抵抗性を与える。最終結果は、温水注入処理によってウェルサイズが制御された孔、及び、ガラスに付着した検出分子の均一なコーティングである。ガラス上にコーティングする分子は、例えばオリゴヌクレオチド、タンパク、抗体、若しくは、捕捉分子、又は、2個以上のオリゴヌクレオチド、タンパク、抗体若しくは捕捉分子の混合物であってもよい。
SU−8フォトレジスト(MicroChem株式会社、ニュートン、マサチューセッツ)を、メーカーの推奨に従って、10cmのシリコンウェーハ上にスピンコートした。50ミクロン立方体マイクロウェルのパターンを、メーカーの推奨に従って、マスクアライナー(SUSS MicroTec AG社、Schleiβheimer Str.90、D 85748 Garching b、ミュンヘン)からの紫外線光に暴露させて、SU−8現像液(MicroChem社)を用いて現像した。製造社の推奨に従って、ポリジメチルシロキサン(PDMS)(SylGard エラストマー、Ellsworth Adhesives社、ジャーマンタウン、ウィスコンシン)を混合、硬化、及び、除去した。カミソリ刀を用いて205×154のマイクロウェル(31,570個のマイクロウェル)のアレイを切り取り、それを乾燥した清潔なスライドガラス上に慎重に置いてスライドガラスとの疎水結合を形成させることによって、底部トレイ(図5)を形成した。マイクロウェルのサイズ及び位置は、DNAチップ(385K CGHアレイ、Roche/Nimblegen社、マディソン、ウィスコンシン)上のオリゴヌクレオチドのパッドの位置及びサイズと正確に一致した。DNAチップは、マイクロウェルの頂部を形成し(図6)、大部分のウェルがDNAの直下に存在し、かつ、大部分のウェル壁が無処理ガラスに接するように、マイクロウェル上に配置された。この小さいマイクロウェルを用いる場合、PDMSウェル上のDNAスライドの位置決定、配列、及び、その後の密封は、通常はマスクアライナー又は特注装置などの機械的補助を必要とするほど繊細である。
配列及び処理中に、中程度の倍率の顕微鏡(例えば:100倍)で、マイクロウェル又はマイクロウェル中の細胞を調べることは多くの場合において有用である。顕微鏡の視野がすべてのマイクロウェルを含むことはほとんどない。従って、リアルタイムで1枚の顕微鏡画像を検討しても、又は、撮影した画像を後で検討しても、どのウェルを見ているかを正確に知ることは困難である。どのウェルを見ているかを正確に知るために、端又は角からのウェルを数えなくてもよいことが望ましい。
Claims (14)
- 対象としている分離細胞から産生したタンパク質に関するタンパク質及び核酸の配列情報を得る方法において:
複数の個別ウェルに複数の個別細胞を配置するステップであって、細胞のそれぞれが少なくとも1つの対象としているタンパク質を産生するステップと;
ウェル中の前記少なくとも1つの対象としているタンパク質を、少なくとも1つのタンパク質結合剤を含む第1の表面に接触させるステップであって、前記対象としているタンパク質のうちの少なくとも1つを選択的に結合し、かつ、前記第1の表面が、前記個別ウェルに関連づけられ得る位置特定可能な領域を含むステップと;
前記対象としている少なくとも1つのタンパク質の1以上の特性を決定するステップと;
前記1以上の特性を前記第1の表面の位置特定された特定領域に関連付けることによって、特定の対象とするウェルを識別するステップと;
前記ウェルにおける該細胞を溶解するステップと;
該溶解した細胞を第2の表面に接触させるステップと;
該溶解した細胞由来の核酸を、前記第2の表面に結合したオリゴヌクレオチドタグを含むオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするステップであって、前記第2の表面が前記個別ウェルに関連づけられ得る領域を含み、各々の領域における前記オリゴヌクレオチドタグが異なるステップと;
該ハイブリダイズした核酸を前記第2の表面上の前記領域に特異的な前記タグを含む核酸のコピーに変換するステップと;
該タグを付した核酸のコピーを貯留するステップと;
超高処理型DNA塩基配列決定技術を用いて、前記タグを付した核酸のコピーを配列決定するステップと;
特定のウェルに核酸配列の前記コピーを関連づけるために前記オリゴヌクレオチドタグの配列を用いるステップと;
を具え、前記対象としているタンパク質の特性と前記核酸配列のコピーを関連づけることを特徴とする方法。 - 複数の個別ウェル中に細胞集団に由来する複数の個別細胞を配置し、前記細胞が少なくとも1つの対象としているタンパク質を産生するステップと;
第1の面に結合した少なくとも1つのタンパク質結合剤を用いて、前記対象としているタンパク質を接触させ、分離するステップと;
前記ウェルにおける該細胞を溶解するステップと;
該溶解した細胞を第2の表面に接触させるステップと;
該溶解した細胞由来の核酸を、前記第2の表面に結合したオリゴヌクレオチドタグを含むオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするステップであって、前記第2の表面が前記個別ウェルに関連づけられ得る領域を含み、各々の領域における前記オリゴヌクレオチドタグが異なるステップと;
該ハイブリダイズした核酸を前記第2の表面上の前記領域に特異的な前記オリゴヌクレオチドタグを含む核酸のコピーに変換するステップと;
該タグを付した核酸のコピーを貯留するステップと;
超高処理型DNA塩基配列決定技術を用いて、前記タグを付した核酸のコピーを配列決定するステップと;
特定のウェルに核酸配列の前記コピーを関連づけるために前記オリゴヌクレオチドタグの配列を用いるステップと;
を具え、前記対象としているタンパク質とヌクレオチド配列を関連づけることを特徴とする方法。 - 請求項1又は2に記載の方法において、前記溶解した細胞由来の核酸がmRNAであり、前記核酸のコピーがcDNAであることを特徴とする方法。
- 請求項3に記載の方法が、対象としているタンパク質に対応する1以上のcDNA配列を同定するステップと、前記対象としているタンパク質を産生すべく前記cDNA配列を好適な発現系に移入するステップとを更に具えることを特徴とする方法。
- 請求項1又は2に記載の方法において、前記細胞が抗体産生細胞であり、前記対象としているタンパク質が抗体であることを特徴とする方法。
- 請求項5に記載の方法において、前記抗体産生細胞がB細胞、形質細胞、又はBリンパ球系の細胞から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項1又は2に記載の方法において、前記第1の面に結合した前記少なくとも1つのタンパク質結合剤が、タンパクA、タンパクG、タンパクL、タンパクA/G、又は抗IgG Fcγサブクラス特異的抗体からなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項1又は2に記載の方法において、1,000個以上の個別細胞は、ウェル密度が1cm2当たり100以上となるウェルトレイの、対応する数の個別ウェル内に配置されることを特徴とする方法。
- 請求項1又は2に記載の方法において、10,000個以上の個別細胞が対応する数の個別ウェル内に配置され、前記第1の面及び前記第2の面上には対応する数の位置特定された領域があり、前記ウェルが、1cm2当たり100を超えるマイクロウェルの密度で生成されたマイクロウェルであり、それぞれのマイクロウェルの容積が1ピコリットルないし500ナノリットルであることを特徴とする方法。
- 請求項1又は2に記載の方法において、前記対象としているタンパク質が抗体であり、前記タグを付した核酸のコピーを配列するステップが、前記抗体の重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列を得るステップを具えることを特徴とする方法。
- 請求項10に記載の方法が、前記ヌクレオチド配列を用いて前記対象としている抗体に関するメタデータを生成するステップを更に具えることを特徴とする方法。
- 請求項11に記載の方法において、前記メタデータが、前記ヌクレオチド配列に基づいた前記対象としている抗体の結合特性を含むことを特徴とする方法。
- 請求項12に記載の方法において、前記メタデータが、前記細胞集団における前記ヌクレオチド配列の出現頻度に基づいた前記細胞集団における対象としている前記抗体の出現頻度を含むことを特徴とする方法。
- 複数の個別ウェルに複数の個別細胞を配置するステップと;
前記細胞が抗体を産生するような条件下で、前記ウェルにおける前記細胞を存在可能にするステップと;
前記ウェルにおける前記抗体を前記ウェルと関連づけられ得る領域を含む第1の面と接触させるステップであって、前記第1の表面が抗体結合剤を含むステップと;
前記第1の面にある前記領域に結合した前記抗体を1以上の抗体結合剤と接触させるステップと;
前記1以上の抗体結合剤の前記第1の面の前記領域にある前記抗体との結合に関連づけられる結合情報を決定するステップと;
前記ウェルにおける前記細胞を溶解するステップと;
該溶解した細胞を第2の表面に接触させるステップと;
前記溶解した細胞由来の核酸を、前記第2の表面上の特有のタグを含むオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするステップと;
該ハイブリダイズした核酸を核酸のコピーに変換するステップと;
前記溶解した細胞由来の核酸の前記核酸のコピーにオリゴヌクレオチドタグを組み込むステップであって、それぞれのオリゴヌクレオチドタグが独自に単一のウェルに関連づけられるステップと;
前記複数のウェル由来の核酸のコピーを貯留するステップと;
該貯留した核酸を超高処理型DNA塩基配列決定技術を用いて配列決定するステップと;
ヌクレオチド配列をウェルに関連づけるために前記オリゴヌクレオチドタグの配列を用いるステップと;
を具え、前記抗体由来の結合情報とヌクレオチド配列を関連づけることを特徴とする方法。
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