CN104561231B - 一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法，首先准备由生物相容性较好、无色透明、经微尺度加工制作而成的浮游藻类细胞微孔阵列培养装置，待测样品经预处理后，满足浮游藻类细胞密度介于1×10⁵~5×10⁵ cells/mL，接种进入上述微孔阵列培养装置中，培养8h～24h；对初始状态下进入微孔阵列培养装置中每个具有浮游藻类细胞的微孔进行细胞数量计数，确认微孔编号；培养结束后分别按照细胞数量增加、减少、不变等三种情况对上述编号微孔内的细胞进行再次计数；对出现细胞数量增加的微孔，结合其初始状态，根据细胞分裂倍增的理论计算公式，计算浮游藻类细胞比增殖速率，并进一步可获得种群的生长速率。

Description

一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学、生态学、水环境科学等研究领域，尤其涉及对实验室与环境样品中浮游藻类监测分析、测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法。

背景技术

藻类是一类具有叶绿素，能进行放氧的光合作用；植物体没有真正根、茎、叶的分化，用单细胞的孢子或合子进行繁殖的低等植物。悬浮生长于水体中的浮游藻类(也称“浮游植物”)是水体重要的初级生产者。

为获得水体中浮游藻类的生长速率，通常情况下，采用细胞计数或其他浮游藻类生物量计量方法：如OD值、水体叶绿素a浓度等，获得水体中藻类生物量。在此基础上，计算特定时间段内藻类生物量的变化量，获得特定浮游藻类样本的生长速率。但是，由于天然水体或实验室培养样品中浮游藻类细胞样本往往呈现出多种生存状态(不同生长阶段、死亡残体、休眠等)混合存在的特点，故通过上述方法获得的浮游藻类样本生长速率，实际上仅为表观生长速率。以细胞分裂倍增为基础的的浮游藻类细胞比增殖速率，因存在技术上困难，难以区分不同生长状态，通常不易获得。这在一定程度上给深入解释藻类细胞生理生态特征、预判浮游藻类细胞的生长潜力与活性造成了障碍。

发明内容

鉴于目前天然水体或实验室样品中浮游藻类细胞增殖速率难以测定的问题，本发明的目的在于提供一种针对单细胞浮游藻种简易测定样品中浮游藻类细胞分裂速率的方法，通过特殊的细胞微孔平板培养阵列，对待测样品中的浮游藻类细胞取样与短期培养，基于细胞计数方法，测算出浮游藻类细胞增殖速率。

为达到上述目的，本发明提供一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法，包括以下步骤：

S1、获取待测样品并进行预处理，控制待测样品中浮游藻类细胞密度；

S2、接种，将S1中得到的待测样品接种入微孔阵列培养装置；

S3、培养前计数，确定进入微孔阵列培养装置的各个微孔中的浮游藻类细胞数量以及进入微孔阵列的浮游藻类细胞总数；

S4、培养后计数，将待测样品在微孔阵列培养装置中培养一个周期后，确定每个微孔中细胞数量以及整个微孔阵列的浮游藻类细胞总数；

S5、计算，根据S3和S4中的数值计算浮游藻类细胞比增殖速率和种群生长速率。

其中，所述待测样品，为天然水体藻类浮游样品或实验室内培养的浮游藻类样品。对于天然水体中藻类样品，因杂质较多，需将水样通过孔径≥30μm的浮游动物绢网以过滤水体中的其他大粒径杂质。对实验室培养的浮游藻类样品，因水样杂质较少，可不经预处理，直接接种进入微孔阵列培养装置。

所述待测样品，经预处理后，接种入经过灭菌消毒且烘干的微孔阵列培养装置。接种的浮游藻类细胞密度介于1×10⁵～5×10⁵cells/mL。若待测样品中藻类细胞密度低于1×10⁵cells/mL，则可能导致辨识度下降，存在较大的检测误差。若待测样品中藻类密度高于5×10⁵cells/mL，则需经过稀释，确保样品在上述适宜的细胞密度范围，以避免细胞密度过大对浮游藻类细胞微孔阵列培养产生干扰。

所述的微孔阵列培养装置，为一种基于微尺度加工的浮游藻类细胞培养装置。其主要特征是采用由生物相容性较好、无色透明、具有一定强度，且能够开展微尺度加工的材料做成底板，可以由硅、二氧化硅或聚二甲基硅氧烷制成，底板上通过微尺度加工工艺刻蚀形成大量微孔，微孔按照矩阵方式排列并组成了特定阵列。相邻微孔阵列之间的间距为3mm～10mm，所述微孔阵列的组数为9～16组。每个微孔均设置有编号，方便对特定微孔进行定位观测。使用前，需经过灭菌消毒和烘干处理。

进一步地，所述的微孔，尺寸应2～3倍于待测样品浮游藻类细胞的尺寸范围，以保证至少1个浮游藻类细胞、至多不超过5个浮游藻类细胞能够进入微孔中培养。微孔阵列中的微孔间距控制在2μm～3μm。

进一步地，采用玻璃毛细管或微量移液器，从预处理后的待测样品中移取出一定数量(100μL～500μL)的浮游藻类细胞样品，接种至微孔阵列中，在重力和毛细力的作用下，样品将分散随机进入微孔阵列的一定数量的微孔中。接种的样品数量控制应在适宜的范围，保证其完全被一个微孔阵列上的微孔全部吸收，不出现因取样量过大，漫出微孔阵列而出现误差。

进一步地，采用光学显微镜对浮游藻类细胞进行观察计数，确定进入微孔的浮游藻类细胞数量、具有浮游藻类细胞的微孔数量及微孔编号，并最终确定进入微孔阵列的浮游藻类细胞总数，记为N₀。

在样品所需的培养条件下如温度、光照等，最好是在样品前期所在的环境条件下培养，培养周期T为8h～24h，确定培养周期完成后每个具有浮游藻类细胞的微孔内的细胞增减数量，并分别按照细胞数量增加、减少、不变三种情况分别进行统计：

1)微孔阵列中，出现细胞增加的微孔数量及其编号，统计初始状态下该类微孔中细胞的总数量N₀₊，以及培养期结束后该类微孔中细胞数量N_I；

2)微孔阵列中，出现细胞减少或不变的微孔数量及其编号，统计初始状态下该类微孔中细胞的总数量N_0-，以及培养期结束后该类微孔中细胞数量N_D；

3)同N₀相对应的、培养结束后所有微孔中待测样品浮游藻类细胞数量N_T，其中增加为正值，减少为负值；故数量关系上N_T＝N_I+N_D。

在培养周期内，待测样品浮游藻类细胞的比增殖速率μ_n(单位为：d^-1)：

${\mathrm{\μ}}_n=\frac{{\log }_2(N_I/N_{0+})}{T}$

而表观上的种群生长速率μ_o(单位为：d^-1)则为：

${\mathrm{\μ}}_o=\frac{\mathrm{Ln}(N_T/N_0)}{T}$

进一步地，为确保水样中样本数足够，需至少同时满足以下3个方面的质量控制要求：1)对待测水样取样、接种培养至少3次，每次接种培养于不同的微孔阵列中；2)原则上，应对接种后微孔阵列中每个有浮游藻类细胞的微孔进行细胞观测和计数。考虑到接种后每个细胞阵列中的细胞数量可能过大而增加计数工作量，为保证测试精度，应保证初始状态下的细胞计数总量在1000个以上，即N₀≥1000。3)接种培养时间不宜过久，避免因生存环境发生变化而同待测样品实际情况产生偏差，故在微孔培养中培养时间不宜超过24h。

该方法仅适用于以单细胞形式生存的浮游藻类细胞，不适用于以群体形式生存的浮游藻类细胞。若通过超声波技术将浮游藻类群体分散为单细胞并进行微孔阵列培养，将显著改变原群体中单个细胞的生存环境，测试结果存在较大不确定性。此约束适用于本发明的全部内容，以下不再赘述。

综上所述，相比较于传统的培养方式，本发明具有以下有益的效果：

采用基于微尺度加工的微孔阵列，可以将原先处于不同生长状态混合生存的浮游藻类样品分散培养至微孔阵列中，实现了从宏观种群动态观测到微观细胞增殖分析的转变；可通过细胞增殖或死亡的直接观测，获得比增殖速率，并进而掌握种群中细胞生存状态、生长活性等特征，为开展藻类生理生态研究提供重要工具支持。

附图说明

图1为发明的流程图；

图2为本发明的实施例中微孔阵列培养装置的结构示意图；

图3是图2中部分微孔阵列放大图；

图4是图3的微孔阵列的剖视图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解发明的其他优点及功效。

如图1所示，本发明提供一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法，包括以下步骤：

S1、待测样品预处理

以实验室培养的小球藻样品作为待测水样。采用血球计数板对原水样中小球藻细胞进行计数，得到小球藻细胞浓度为4.6×10⁵cells/mL，介于1×10⁵cells/mL和5×10⁵cells/mL之间，因其为实验室水样，故可直接接种。

S2、待测样品接种

小球藻细胞在微孔培养板上的接种过程均需保证无菌操作，整个过程中所用到的溶液、器材均提前灭菌，整个接种过程在超净工作台上完成。接种过程为：

1)将细胞密度满足要求的待测水样用自行拉制的玻璃毛细管吸取一定体积滴在微孔培养板上；

2)静置5min，使藻细胞通过自身重力和与微孔材料间的毛细作用沉降到培养微孔中；

3)用毛细管轻轻吸走多余的培养液；

4)用灭菌的培养基洗掉未进入培养微孔的细胞。

S3、接种后计数

接种完成后用光学显微镜计数观察，确定具有小球藻细胞的微孔及其编号，以及微孔中的小球藻细胞个数，最后累计计算初始状态下进入微孔阵列中的总细胞数，记为N₀。本实施例以9个微孔为例，接种后N₀＝22cells。

S4、培养后计数

在前期试验样品存在的环境条件下培养8h，本实施例中温度为20℃、光照为3000lux。培养后观察每个微孔中细胞数量变化情况，见表1：

表1 培养前后微孔阵列中藻细胞变化情况统计表

S5、小球藻细胞比增殖速率、种群生长速率的计算

如表1所示，经过8h培养后，9个微孔中5号、7号、8号、9号出现了细胞分裂增殖的现象，故N_I＝14cells，N₀₊＝8cells；其余微孔则出现了细胞数量下降或不变的情况，则N_D＝10cells；N_0-＝14cells。故细胞的比增殖速率为：

${\mathrm{\μ}}_n=\frac{{\log }_2(N_I/N_{0+})}{T}=\frac{{\log }_2(14/8)}{8/24}=2.42d^{-1}$

该种群的表观生长速率为：

${\mathrm{\μ}}_o=\frac{\mathrm{Ln}(N_T/N_0)}{T}=\frac{\mathrm{Ln}(24/22)}{8/24}=0.26d^{-1}$

上述的实施例中例举了9个微孔培养前后的变化情况，其余实施例中可统计几十至几百个微孔培养前后的藻细胞数目变化情况，进而进行藻细胞比增殖速率、种群生长速率的计算；采用方法与上述方法一致，在此不再一一例举。

本发明的方法实现了从宏观种群动态观测到微观细胞增殖分析的转变；可通过细胞增殖或死亡的直接观测，获得比增殖速率，并进而掌握种群中细胞生存状态、生长活性等特征，为开展藻类生理生态研究提供重要工具支持。

进一步如图2至图4所示，本发明中用到的微孔阵列培养装置包括由聚二甲基硅氧烷制成的底板1，底板1上开设有9个微孔阵列2，微孔阵列2呈3×3的矩阵分布，相邻两组微孔阵列2的间距为3mm-10mm，本例中为4mm，每组微孔阵列2由10×10至100×100个大小相同的微孔3形成，并排列成矩形，微孔3为圆柱形微培养孔，每组微孔阵列中的微孔间距为2μm～3μm，微孔3的直径和孔深分别为20μm。

该微孔阵列培养装置，培养微孔间相互隔开，各微孔中的藻细胞间互不干扰，能够充分体现出藻细胞在单独存在条件下的生长状况；有效地确定了微孔阵列中不同微孔之间的间距，可促进浮游藻类细胞顺利接种入微孔，避免浮游藻类细胞在接种过程中停留在微孔与微孔之间的底板。由于培养微孔很小，微孔间呈阵列排布，因此可以节省实验空间，能够在很小的空间上做很多组平行实验；培养微孔呈阵列形式有序排列，可实现浮游藻类细胞的有序培养，实现均一化的浮游藻类细胞培养条件。孔本身体积小、面积少，培养过程中所需藻种少，从而可以大规模进行实验而不至于对室内藻种培养工作造成难度。

任何熟悉此技术的人士皆可在不违背发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、获取待测样品并进行预处理，控制待测样品中浮游藻类细胞密度，所述待测样品为天然水体藻类浮游样品或实验室内培养的浮游藻类样品，所述天然水体藻类浮游样品通过浮游动物绢网过滤水体中的大粒径杂质后进入步骤S2；所述浮游藻类细胞密度为1×10⁵～5×10⁵cells/mL；

S2、将步骤S1中得到的待测样品接种入微孔阵列培养装置；

S3、采用光学显微镜对浮游藻类细胞进行观察计数，确定进入微孔阵列培养装置的各个微孔中的浮游藻类细胞数量以及进入微孔阵列的浮游藻类细胞总数；

S4、将待测样品在微孔阵列培养装置中培养一个周期后，确定每个微孔中细胞数量以及整个微孔阵列的浮游藻类细胞总数；

S5、根据步骤S3和S4中的数值计算浮游藻类细胞比增殖速率和种群生长速率。

2.根据权利要求1所述的一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法，其特征在于：所述步骤S2中微孔阵列培养装置包括底板以及开设在底板上的多组微孔阵列，相邻微孔阵列之间的间距为3mm～10mm，所述微孔阵列由开设在底板上的多个微孔排列而成，每组微孔阵列中相邻微孔之间的间距为2μm～3μm。

3.根据权利要求2所述的一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法，其特征在于：所述底板由硅、二氧化硅或聚二甲基硅氧烷制成，所述微孔阵列的组数为9～16组，每个微孔均设置有编号。

4.根据权利要求3所述的一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法，其特征在于：所述微孔尺寸为待测样品浮游藻类细胞尺寸的2～3倍，进入单个微孔中的浮游藻类细胞为1～5个。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法，其特征在于：所述步骤S3中，用玻璃毛细管或微量移液器从预处理后的待测样品中移取出100μL～500μL的浮游藻类细胞样品接种至微孔阵列中，在重力和毛细力的作用下，使样品分散随机进入微孔阵列的一定数量的微孔中，保证样品完全被一个微孔阵列上的微孔吸收。

6.根据权利要求1至4任意一项所述的一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法，其特征在于：所述步骤S3中，确定进入微孔的浮游藻类细胞数量、具有浮游藻类细胞的微孔数量及微孔编号，并最终确定进入微孔阵列的浮游藻类细胞总数，记为N₀。

7.根据权利要求6所述的一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法，其特征在于：所述步骤S4中，在前期待测样品存在的环境条件下培养，培养周期为8h～24h，确定培养周期完成后每个具有浮游藻类细胞的微孔内的细胞增减数量，并分别按照细胞数量增加、减少、不变三种情况分别进行统计：

1)微孔阵列中，出现细胞增加的微孔数量及其编号，统计初始状态下该类微孔中细胞的总数量N₀₊，以及培养期结束后该类微孔中细胞数量N_I；

2)微孔阵列中，出现细胞减少或不变的微孔数量及其编号，统计初始状态下该类微孔中细胞的总数量N_0-，以及培养期结束后该类微孔中细胞数量N_D；

3)同N₀相对应的、培养结束后所有微孔中待测样品浮游藻类细胞数量N_T，故数量关系上N_T＝N_I+N_D。

8.根据权利要求7所述的一种测定浮游藻类细胞比增殖速率的方法，其特征在于：所述步骤S5中，采用如下方式计算，在培养周期内，

待测样品浮游藻类细胞的比增殖速率μ_n为：

${\mathrm{\μ}}_n=\frac{{\mathrm{Log}}_2(N_I/N_{0+})}{T}$

表观上的种群生长速率μ_o为：

${\mathrm{\μ}}_o=\frac{Ln(N_T/N_0)}{T}.$