ES2709395T3 - Métodos de estimación de números de cúmulos - Google Patents

Abstract

Un método de predicción de números de cúmulos o densidades de cúmulos que se producirán a partir de la amplificación en fase sólida de ácidos nucleicos que comprende: proporcionar un soporte sólido que tiene varios cebadores de captura inmovilizados sobre sí mismo; proporcionar cadenas de plantilla capaces de hibridarse con al menos algunos de dichos cebadores de captura; marcar las cadenas de plantilla o las extensiones de las mismas, si dichas cadenas no están ya marcadas; detectar la señal de las cadenas marcadas o extensiones de las mismas para determinar el número de cadenas individuales de plantilla presente en el soporte sólido; y analizar dicha señal detectada para estimar el número de cúmulos o las densidades de cúmulos que se obtendrán después de la amplificación de cúmulos de dichas cadenas de plantilla correlacionando el número de cadenas individuales de plantilla presentes con el número o las densidades previstos de cúmulos.

Description

DESCRIPCION

Metodos de estimacion de numeros de cumulos

La presente invencion versa sobre metodos para estimar o predecir numeros de cumulos despues de una amplificacion en fase solida mediante una obtencion de imagenes de la hibridacion de plantilla antes de la amplificacion en fase solida y la secuenciacion. Mas en particular, se lleva a cabo una ronda inicial de obtencion de imagenes de moleculas individuales en la etapa de hibridacion de la plantilla que permite predecir una estimacion general de los numeros de cumulos antes de que se formen los cumulos. La amplificacion de la senal permite que se lleve a cabo la obtencion de imagenes de moleculas individuales usando un aparato estandar de obtencion de imagenes de secuenciacion.

La tecnologfa de vanguardia basada en soportes solidos, tales como los chips de ADN de fase solida - por ejemplo, la tecnologfa de secuenciacion por smtesis (SBS) de Illumina- , es util para permitir la secuenciacion masivamente paralela, permitiendo opciones de secuenciacion mucho mas rapidas y rentables para mirar secuencias variables. La tecnologfa tiene una amplia gama de aplicaciones, incluyendo en la genomica, la transcriptomica y la epigenomica.

La tecnologfa de secuenciacion por smtesis (SBS) de Illumina usa cuatro nucleotidos marcadas fluorescentemente para secuenciar en paralelo las decenas de millones de cumulos en la superficie de la celda de flujo. Durante cada ciclo de secuenciacion, se anade a la cadena de acido nucleico un desoxinucleosido trifosfato marcado (dNTP) individual. Los dNTP tienen un bloque azida 3', asf como la marca fluorescente unida a la base. La azida 3' actua como terminador, por lo que, tras cada incorporacion de dNTP, se toma una imagen de la tincion fluorescente para identificar la base y, a continuacion, tanto el bloque azida como la marca fluorescente son escindidos qmmicamente para permitir la incorporacion del siguiente nucleotido (la propia marca fluorescente no actua como terminador). Dado que los cuatro dNTP (A, C, T, G) unidos a terminadores reversibles estan presentes como moleculas individuales separadas, la competencia natural minimiza el sesgo de incorporacion. Las identificaciones de nucleotidos se efectuan directamente a partir de mediciones de intensidad de la senal durante cada ciclo, lo que reduce muchusimo las tasas de errores no tratados con respecto a otras tecnologfas. El resultado final es una secuenciacion base a base sumamente precisa que elimina errores espedficos del contexto de la secuencia, permitiendo una robusta identificacion de nucleotidos en todo el genoma, incluyendo las regiones de secuencia repetitiva y dentro de los homopolfmeros.

En particular, hay disponibles varias tecnologfas SBS diferentes. La tecnologfa de secuenciacion SBS de Illumina anteriormente descrita usa cuatro nucleotidos marcados fluorescentemente, mientras que otras tecnologfas de secuenciacion pueden usar menos marcas (por ejemplo, qrnmica de 2 tinciones) o dNTP no marcados (por ejemplo, 454, torrente de iones). Aunque aqrn se ejemplifica la tecnologfa de Illumina, una persona experta entendera que la tecnologfa podna ser adaptada para ser usada con otras tecnologfas de secuenciacion.

Las bibliotecas presentadas para SBS consistiran generalmente en una secuencia de interes flanqueada a ambos lados por constructos adaptadores. En cada extremo, estos constructos adaptadores tienen sitios de enlace que permiten que el fragmento de biblioteca se una a un soporte solido, tal como una superficie de la celda de flujo. Los constructos tambien contienen varios sitios adicionales de enlace de cebadores. A menudo, antes de la secuenciacion, el ADN diana es etiquetado y fragmentado. Esto puede hacerse usando la tecnologfa Nextera de Illumina, en la que el etiquetado y la fragmentacion se llevan a cabo en una sola etapa, a menudo denominada eticmentacion. Simultaneamente, los transposomas fragmentan el ADN y anaden secuencias de adaptador a los extremos. A continuacion, el ADN eticmentado (etiquetado y fragmentado) es amplificado mediante PCR de ciclo limitado que tambien anade indices y secuencias de cebadores de secuenciacion requeridas para la formacion de cumulos.

Antes de su union a una celda de flujo, los fragmentos de la biblioteca son desnaturalizados. Las regiones P5' y P7' de fragmentos monocatenarios de biblioteca se hibridan con los oligonucleotidos (oligos) complementarios, que estan inmovilizados en la superficie de la celda de flujo. Los oligonucleotidos de la celda de flujo actuan como cebadores, y se sintetiza una cadena complementaria al fragmento de la biblioteca.

La cadena original se elimina por lavado, dejando copias de fragmentos que se enlazan covalentemente con la superficie de la celda de flujo.

La amplificacion de puentes genera multiples copias de cada fragmento, creando cumulos. Durante la generacion de cumulos, se inmovilizan plantillas de secuenciacion en una superficie de la celda de flujo patentada. La amplificacion en fase solida, denominada amplificacion de puentes crea aproximadamente 1.000 copias identicas de cada molecula individual de la plantilla en estrecha proximidad (diametro de un micrometro o menos). Dado que este proceso no implica fotolitograffa, manchado mecanico o colocacion de perlas en pocillos, se logran densidades del orden de 100 millones de cumulos unimoleculares por centimetro cuadrado.

A continuacion, la region P5 es escindida, dando lugar a cumulos que contienen fragmentos que estan unidos por la region P7. El cebador de secuenciacion se hibrida con el extremo del fragmento, e inicia la secuenciacion por un proceso de smtesis. El terminador reversible marcado fluorescentemente es visualizado (mediante excitacion por laser) cuando se anade cada dNTP, y luego escindido para permitir la incorporacion de la base siguiente. Las identificaciones de nucleotidos se realizan directamente a partir de mediciones de la intensidad de la senal durante cada ciclo.

Acto seguido, se quita todo de la plantilla y se reforman los cumulos de ADNbc mediante resmtesis (ciclos de amplificacion de puentes). A continuacion, se corta P7 en lugar de P5, dando lugar a fragmentos que estan unidos por la region P5. El cebador de secuenciacion hibrida y secuencia el otro extremo de la plantilla.

Dado que los cuatro dNTP enlazados con un terminador reversible estan presentes durante cada ciclo de secuenciacion, la competencia natural minimiza la incorporacion de sesgos en los casos estandar.

Los sistemas SBS permiten una cantidad masiva de lecturas de secuencias en paralelo. Se usan un muestreo profundo y una cobertura uniforme para generar un consenso y garantizar una alta confianza en la determinacion de diferencias geneticas. El muestreo profundo permite el uso de una votacion de mayona ponderada y un analisis estadfstico, de forma similar a metodos convencionales, para identificar homocigotos y heterocigotos y distinguir errores de secuenciacion. Se asigna a cada base lefda no tratada una puntuacion de calidad para que el soporte logico pueda aplicar un factor de ponderacion en diferencias de identificacion y en la generacion de puntuaciones de confianza.

Aunque tales tecnologfas han revolucionado la secuenciacion en comparacion con los metodos tradicionales de Sanger y de Maxam y Gilbert, una de las dificultades actuales mas significativas de la tecnologfa esta relacionada con la cuantificacion precisa de bibliotecas para permitir la prediccion de numeros de cumulos. La cuantificacion imprecisa lleva a varios problemas. La subcarga, que da lugar a demasiados pocos cumulos, no afecta a los datos de secuenciacion, pero si da lugar a que la produccion de datos sea menor de la deseada, dando como resultado aumentos de coste e ineficiencias en el sistema. Sin embargo, la sobrecarga, que da lugar a demasiados cumulos, puede poner en peligro la calidad de las secuencias.

Por ejemplo, Iraad et al., Current Protocols in Human Genetics (2014) y el documento WO 2012/134602 dan a conocer que la cuantificacion precisa es importante para lograr buenas densidades de cumulos.

La presente invencion proporciona un metodo de obtencion de imagenes de cadenas en la etapa de hibridacion de la plantilla que permite la prediccion de numeros de cumulos y posibles correcciones en los casos de subcarga y de sobrecarga de una celda de flujo o un soporte solido.

Segun la presente invencion, se proporciona un metodo de prediccion de numeros de cumulos a partir de la amplificacion en fase solida de acidos nucleicos que comprende:

proporcionar un soporte solido que tiene varios cebadores de captura inmovilizados sobre sf mismo;

proporcionar cadenas de plantilla capaces de hibridarse con al menos algunos de dichos cebadores de captura;

marcar las cadenas de plantilla o las extensiones de las mismas, si dichas cadenas no estan ya marcadas;

detectar la senal de las cadenas marcadas o extensiones de las mismas; y

analizar dicha senal detectada para determinar el numero de cadenas individuales de plantilla presentes en el soporte solido;

estimar el numero de cumulos o la densidad de cumulos que se obtendran despues de la amplificacion cumulos de dichas cadenas de plantilla.

El termino cumulo esta relacionado con “colonias” de moleculas inmovilizadas de acidos nucleicos, estando formado cada cumulo o colonia de varias cadenas identicas inmovilizadas de polinucleotidos y de varias cadenas identicas inmovilizadas de polinucleotidos complementarios que son creadas mediante amplificacion de cumulos.

A diferencia de la fluorescencia en masa medida en un analisis de tipo micromatriz, el presente metodo no detecta simplemente un “nivel” de senal en el ensayo. En realidad, la presente invencion cuenta o calcula los eventos basados en la molecula diferenciada unica (pero a menudo amplificados) vistos en el ensayo, y correlaciona esto para predecir el numero de cumulos que se obtendran despues de la amplificacion de los cumulos.

Preferentemente, el metodo incluye la amplificacion de la senal de las marcas tras marcar la cadena de plantilla o las extensiones de la misma. Aunque la amplificacion de la senal sena usada en muchos instrumentos actuales de secuenciacion debido a sus prestaciones para la obtencion de imagenes, puede que la amplificacion de la senal no se requiera siempre. El uso de un instrumento o detector de secuenciacion que sea capaz de detectar moleculas individuales no requerina la etapa de amplificacion de la senal.

Preferentemente, la etapa de marcado de las cadenas de plantilla o de las extensiones de las mismas comprende la hibridacion de un oligonucleotido marcado con la cadena de plantilla. Alternativamente, las cadenas de plantilla pueden estar ya marcadas, por ejemplo, si se usa una biblioteca que ya este marcada. Esta puede ser, por ejemplo, una biblioteca con una biotina o una tincion en el extremo 5'. Tambien se contempla que, cuando se forme una biblioteca, pueda haber una mezcla de oligonucleotidos marcados y no marcados que sena util cuando se trabaja con densidades elevadas, dado que no todas las moleculas senan detectables por imagenes (por ejemplo, solo podna detectarse un 10% o un 1% de las moleculas, y podna aplicarse un factor de correccion - por ejemplo, 10* o 100*- para calcular la densidad real).

Preferentemente, dichas cadenas de plantilla comprenden cada una al menos un sitio de enlace de marca.

Opcionalmente el sitio de enlace de marca es un sitio de cebador de secuenciacion.

Preferentemente, la etapa de marcado de las cadenas de plantilla o de las extensiones de las mismas comprende la hibridacion de dichas cadenas de plantilla con dichas sondas de captura en presencia de oligonucleotidos marcados capaces de hibridarse con los sitios de enlace de marca.

Opcionalmente, el metodo incluye la etapa de extension de cebadores de plantilla.

Opcionalmente, la etapa de marcado de las cadenas de plantilla o de las extensiones de las mismas comprende el uso de dNTP marcado durante la etapa de extension.

Opcionalmente, la etapa de marcado de las cadenas de plantilla o de las extensiones de las mismas comprende la hibridacion de un oligonucleotido marcado con la cadena de plantilla extendida.

Preferentemente, el soporte solido es una celda de flujo.

Preferentemente, los cebadores de captura comprenden los oligonucleotidos P5 y P7.

Preferentemente las cadenas de plantilla contienen secuencias de adaptador. Dichas secuencias de adaptador son complementarias de al menos uno de los cebadores de captura y se hibridaran con los mismos en condiciones apropiadas.

Opcionalmente, el sitio de cebador de secuenciacion comprende una secuencia SBS3 o SBS12.

Preferentemente, los oligonucleotidos marcados son secuencias marcadas SBS3' o SBS12'.

Preferentemente, los oligonucleotidos marcados o dNTP estan marcados con biotina.

Preferentemente, la amplificacion de la senal se produce exponiendo el soporte solido a estreptavidina marcada con tincion.

Se produce una amplificacion adicional proporcionando exposiciones posteriores a antiavidina y estreptavidina marcada con tincion.

Preferentemente, las exposiciones posteriores a antiavidina y estreptavidina marcada con tincion dan lugar a entre 10 y 100 moleculas de tincion por cadena de plantilla hibridada.

La estreptavidina marcada con tincion comprende una tincion fluorescente. Tinciones ejemplares incluyen tinciones disponibles comercialmente tales como Cy3 o Cy5.

Preferentemente, la etapa de deteccion de la senal de las cadenas marcadas o de las extensiones de las mismas comprende la obtencion de una imagen.

Opcionalmente, la obtencion de imagenes se lleva a cabo con un microscopio de fluorescencia.

El generador de imagenes debena poder generar una imagen en la que se puedan distinguir objetos que esten separados entre 1 y algunos micrometres. No tiene que tener una resolucion tan alta como nuestros sistemas de secuenciacion (que pueden resolver objetos separados por solo ~700nm), sino muy cercana a lo indicado.

Preferentemente, el metodo comprende la etapa de analizar la imagen y de proporcionar una estimacion o prediccion de numeros de cumulos.

Opcionalmente, para minimizar la densidad de los objetos que han de ser analizados, puede usarse una mezcla de oligonucleotidos marcados y no marcados. Por ejemplo, podna usarse un 10% de oligonucleotidos marcados cuando un usuario esperase, en consecuencia, recoger el 10% de las cadenas del ensayo. Entonces, 1000 manchas en el ensayo senan equivalentes a 10.000 cumulos. Esto se determina por la mezcla usada de oligonucleotidos marcados con respecto a los no marcados. En realidad, pequenas variaciones en la etapa de mezclado de oligonucleotidos daran lugar a cierta variabilidad en los numeros obtenidos, por lo que la puede ser preciso calibrar la relacion verdadera exacta para cada lote de oligonucleotidos si se requiere mayor precision.

Si el analisis sugiere que la densidad predicha de cumulos o el numero de cumulos es buena -es decir, estando dentro de un intervalo predeterminado deseado- , se lleva a cabo entonces una primera extension para copiar las moleculas en la superficie de la celda de flujo, antes de la amplificacion y el procedimiento estandares de los cumulos. Si el analisis sugiere que la densidad predicha de cumulos o el numero de cumulos son demasiado altos -es decir, estando por encima de un intervalo predeterminado deseado- , las moleculas originales son eliminadas (por ejemplo, lavando con hidroxido sodico). Preferentemente, la hibridacion de las cadenas de plantilla se lleva a cabo a continuacion a una concentracion de plantilla mas baja y se lleva a cabo una etapa de extension para copiar las moleculas a la superficie de la celda de flujo, procediendo asf a una amplificacion y un procesamiento estandares de los cumulos. No se requiere una segunda obtencion de imagenes a escala unimolecular.

Alternativamente, tambien se contempla que, si el analisis sugiere que la densidad predicha de cumulos o el numero de cumulos son demasiado altos -es decir, estando por encima de un intervalo predeterminado deseado-, solo se pueda eliminar del soporte solido una porcion o fraccion de las moleculas originales. Varios oligonucleotidos de eliminacion diferentes, preferentemente dos oligonucleotidos de eliminacion diferentes, pueden ser hibridados en diferentes proporciones con las moleculas de la plantilla. Una proporcion de los oligonucleotidos de eliminacion crea un sitio de restriccion, llevandose luego a cabo una etapa de digestion de restriccion para eliminar selectivamente las moleculas con el sitio de restriccion. En una realizacion, se elimina cierta fraccion de las moleculas hibridando dos conjuntos diferentes de oligonucleotidos de eliminacion - uno que crea un sitio de restriccion, otro que no crea dicho sitio de restriccion- en proporciones diferentes. Por ejemplo, la secuencia P5-SBS3 ya incluye un sitio BglII para la digestion de restriccion y este podna ser usado como uno de los oligonucleotidos de eliminacion, no teniendo el segundo grupo de oligonucleotidos de eliminacion el sitio de restriccion BglII. Entonces puede llevarse a cabo la digestion de restriccion usando la endonucleasa de restriccion BglII, digiriendose y eliminandose unicamente las cadenas con el oligonucleotido con el sitio de restriccion Bglll.

Una opcion adicional si el analisis sugiere que la densidad predicha de cumulos o el numero de cumulos son demasiado altos -es decir, estando por encima de un intervalo predeterminado deseado- es que pudiera usarse exonucleasa; por ejemplo, exonucleasa I. Entonces, seleccionando oligonucleotidos protectores que se enlacen unicamente con una porcion del extremo “libre” (normalmente, el extremo 3') de las moleculas de la biblioteca unidas a la superficie, una porcion de las moleculas de la biblioteca es protegida y las moleculas restantes son digeridas o eliminadas. La cantidad de oligonucleotidos protectores puede determinarse por titulacion, si hace falta. Tambien pueden usarse oligonucleotidos protectores adicionales para proteger a cualquier cebador P5 o P7 que no deseemos que sea eliminado de la superficie, ya que pueden hacer falta para etapas de amplificacion clonal adicionales.

Si el analisis sugiere que la densidad predicha de cumulos es demasiado baja, las moleculas que ya estan en la celda de flujo son extendidas, y luego se lleva a cabo una etapa adicional de hibridacion para hibridar cadenas de plantilla adicionales con dichas sondas de captura, que son entonces extendidas tambien antes de proceder a una amplificacion y un procesamiento estandares de los cumulos. No se requiere una segunda obtencion de imagenes a escala unimolecular despues de la etapa de hibridacion adicional.

Opcionalmente, el metodo incluye la etapa de llevar a cabo una primera extension de las cadenas de plantilla. La etapa de extension puede usar una ADN-polimerasa de alta fidelidad para ensamblar nucleotidos proporcionados en solucion.

La etapa de extension da como resultado que se eliminen el oligonucleotido marcado y las moleculas asociadas con la amplificacion de la senal. Se cree que esto es por el desplazamiento de los oligonucleotidos marcados y de las moleculas de amplificacion asociadas.

Opcionalmente, el metodo incluye la etapa adicional de llevar a cabo la amplificacion en fase solida seguida por la secuenciacion. La amplificacion en fase solida es, preferentemente, una amplificacion de puentes. Preferentemente, la secuenciacion es una secuenciacion por smtesis.

Para proporcionar una mejor comprension de la presente invencion, se describen metodos ejemplares de recuento de cumulos en la etapa de hibridacion de plantilla y una posible regulacion. Esto puede ser seguido por secuenciacion, preferentemente secuenciacion por smtesis, usando, por ejemplo, las plataformas MiSeq™, HiSeq™ 2000 o HiSeq™ 2500 de Illumina, y tambien se proporcionan ejemplos de la metodologfa en uso en una plataforma automatizada o semiautomatizada. Se hace referencia a las siguientes figuras, en las que:

la Figura 1 es un esquema basico que muestra las etapas del metodo;

la Figura 2 son varias imagenes que muestran los resultados de la obtencion de imagenes de cadenas simples usando un microscopio de fluorescencia (parte superior) o el generador de imagenes MiSeq™ (parte inferior);

la Figura 3 muestra una comparacion de totales de hibridacion de plantilla con una densidad de cumulos para 14 bibliotecas TruSeq™ estandar;

la Figura 4 muestra una comparacion de totales de hibridacion de plantilla con una densidad de cumulos para 14 bibliotecas TruSeq™ estandar e incorpora, ademas, 10 bibliotecas adicionales de doble mdice;

la Figura 5 muestra los resultados de la correccion de la subcarga y la sobrecarga;

la Figura 6 muestra los resultados de la correccion de la subcarga y la sobrecarga para dar una densidad de cumulos preferida; y

la Figura 7 es un flujo ejemplar de trabajo para un sistema automatizado tal como MiSeq™.

Amplificacion de cumulos

En la tecnica se conocen metodolog^as de amplificacion de cumulos y estan ejemplificadas por las divulgaciones de las patentes estadounidenses nos 7.985.565 y 7.115.400.

Las patentes estadounidenses nos 7.985.565 y 7.115.400 describen metodos de amplificacion de acidos nucleicos en fase solida que permiten inmovilizar productos de amplificacion en un soporte solido para formar matrices que comprenden cumulos o “colonias” de moleculas inmovilizadas de acidos nucleicos. Cada cumulo o colonia en tal matriz esta formado de varias cadenas identicas inmovilizadas de polinucleotidos y varias cadenas identicas inmovilizadas de polinucleotidos complementarios. Generalmente, en la presente memoria las matrices asf formadas son denominadas “matrices de cumulos”. Reacciones de productos de amplificacion en fase solida como las descritas en las patentes estadounidenses nos 7.985.565 y 7.115.400 son las denominadas estructuras “puenteadas”, formadas hibridando pares de cadenas inmovilizadas de polinucleotidos y de cadenas inmovilizadas de polinucleotidos complementarios, estando inmovilizadas ambas cadenas en el soporte solido en el extremo 5', preferentemente mediante una union covalente. Las metodologfas de amplificacion de cumulos son ejemplos de metodos en los que se usa una plantilla inmovilizada de acidos nucleicos para producir amplicones inmovilizados.

Se apreciara que cualquiera de las metodologfas de amplificacion anteriormente descritas o generalmente conocida en la tecnica puede ser utilizada con cebadores universales o espedficos a una diana para amplificar fragmentos inmovilizados de ADN. Metodos adecuados para la amplificacion incluyen, sin limitacion, la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificacion por desplazamiento de cadena (s Da ), la amplificacion arbitrada por transcripcion (TMA) y la amplificacion a base de secuencias de acidos nucleicos (NASBA), segun se describe en la patente estadounidense n° 8.003.354 Los anteriores metodos de amplificacion pueden ser empleados para amplificar uno o mas acidos nucleicos de interes. Por ejemplo, pueden utilizarse PCR - incluyendo la PCR multiple- , SDA, TMA, NASBA y similares para amplificar fragmentos inmovilizados de ADN. En algunas realizaciones, en la reaccion de amplificacion se incluyen cebadores dirigidos espedficamente al acido nucleico de interes.

Otros metodos adecuados para la amplificacion de acidos nucleicos pueden incluir la extension y la ligacion de oligonucleotidos, la amplificacion en drculo rodante (RCA) (Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)) y el ensayo de ligacion de oligonucleotidos (OLA) (veanse, en general, las tecnologfas de las patentes estadounidenses nos 7.582.420, 5.185.243, 5.679.524 y 5.573.907 y de los documentos EP 0320308 B1, EP 0336731 B1, EP 0439 182 B1, WO 90/01069, WO 89/12696 y WO 89/09835. Se apreciara que estas metodologfas de amplificacion pueden estar disenadas para amplificar fragmentos de ADN. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el metodo de amplificacion puede incluir la amplificacion de la sonda de ligacion o reacciones del ensayo de ligacion de oligonucleotidos (OLA) que contienen cebadores dirigidos espedficamente al acido nucleico de interes. En algunas realizaciones, el metodo de amplificacion puede incluir una reaccion de extension-ligacion de cebadores que contiene cebadores dirigidos espedficamente al acido nucleico de interes. Como ejemplo no limitante de extension de cebadores y de cebadores de ligacion que pueden estar espedficamente disenados para amplificar un acido nucleico de interes, la amplificacion puede incluir cebadores usados para el ensayo GoldenGate (Illumina, Inc., San Diego, California), ejemplificado por las patentes estadounidenses nos 7.582.420 y 7.611.869.

Metodos ejemplares de amplificacion isotermica que pueden ser usados en un metodo de la presente divulgacion incluyen, sin limitacion, la amplificacion por desplazamiento multiple (MDA), ejemplificada, por ejemplo, por Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002), o la amplificacion isotermica de acidos nucleicos por desplazamiento de cadena, ejemplificada, por ejemplo, por la patente estadounidense n° 6.214.587.

Otros metodos no basados en PCR que pueden usarse en la presente divulgacion incluyen, por ejemplo, la amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), que se describe, por ejemplo, en Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc, 1995, en las patentes estadounidenses nos 5.455.166 y 5.130.238, y en Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992), o la amplificacion por desplazamiento de cadena hiperramificada, que es descrita, por ejemplo, en Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003).

Los metodos de amplificacion isotermica pueden ser usados con la polimerasa fi 29 de desplazamiento de cadena o el gran fragmento de Bst ADN-polimerasa, 5'->3' exo-, para la amplificacion aleatoria de cebadores de ADN genomico. El uso de estas polimerasas aprovecha su elevada procesabilidad y su actividad de desplazamiento de la cadena. La elevada procesabilidad permite que las polimerasas produzcan fragmentos que tienen una longitud de 10-20 kb. Segun se ha definido anteriormente, pueden producirse fragmentos mas pequenos en condiciones isotermicas usando polimerasas que tienen baja procesabilidad y actividad de desplazamiento de cadena, tales como la polimerasa de Klenow. En la divulgacion de la patente estadounidense n° 7.670.810 se presenta con detalle una descripcion adicional de reacciones, condiciones y componentes de amplificacion.

Otro metodo de amplificacion de acidos nucleicos que es util en la presente divulgacion es la PCR etiquetada, que usa una poblacion de cebadores de dos dominios que tienen una region 5' constante seguida por una region 3' aleatoria, segun se describe, por ejemplo, en Grothues et al. Nucleic Acids Res. 21(5):1321-2 (1993).

Las primeras rondas de amplificacion se llevan a cabo para permitir una multitud de iniciaciones en el ADN desnaturalizado por calor basadas en la hibridacion individual de la region 3' sintetizada aleatoriamente. Debido a la naturaleza de la region 3', se preve que los sitios de iniciacion sean aleatorios en todo el genoma. Posteriormente, los cebadores no unidos pueden ser eliminados y puede tener lugar una duplicacion adicional usando cebadores complementarios de la region 5' constante.

La metodologfa de recuento de cumulos de la presente invencion permite a un usuario obtener imagenes de moleculas de plantilla hibridadas con un soporte solido, tal como la superficie de una celda de flujo antes de que se produzca realmente la amplificacion de cumulos. Despues del analisis de las imagenes, debena ser posible estimar cuantos cumulos se creanan si esas moleculas fueran llevadas a la secuenciacion. A continuacion, puede tomarse la decision de como procesar la celda de flujo. Si la densidad estimada esta dentro de un intervalo deseado, entonces es preciso, simplemente, en primer lugar, extender y amplificar las moleculas, usando, por ejemplo, amplificacion de puentes. Si se desea una densidad menor, entonces las moleculas originales pueden ser quitadas (deshibridadas), y usarse una menor concentracion de plantilla para sembrar los cumulos. Si se desea una densidad mayor, entonces es preciso, simplemente, en primer lugar, extender las moleculas originales, y usar una segunda mezcla de plantilla para aumentar el numero de cumulos creados. En casos en los que la concentracion de la biblioteca es muy baja, es posible llevar a cabo rondas adicionales de hibridacion y de extension, segun se requiera. Esto permitira a los usuarios obtener de manera mas fiable las densidades requeridas de cumulos diana, optimizando asf el rendimiento en las plataformas de secuenciacion y minimizando el desperdicio y mejorando adicionalmente la experiencia del usuario.

A menudo, antes de la secuenciacion, el ADN diana es etiquetado y fragmentado. Esto puede realizarse usando la tecnologfa Nextera de Illumina, en la que el etiquetado y la fragmentacion se llevan a cabo en una sola etapa, a menudo denominada eticmentacion. Simultaneamente, los transposomas fragmentan el ADN y anaden secuencias de adaptador a los extremos. A continuacion, el ADN eticmentado (etiquetado y fragmentado) es amplificado mediante PCR de ciclo limitado que tambien anade indices y secuencias de cebadores de secuenciacion requeridas para la formacion de cumulos.

En los metodos de secuenciacion por smtesis (SBS), se construyen bibliotecas y, con independencia del metodo de construccion de la biblioteca, las bibliotecas presentadas para la SBS generalmente consisten en una secuencia de interes flanqueada a ambos lados por constructos adaptadores. En cada extremo, estos constructos adaptadores tienen sitios de enlace a la celda de flujo que permiten que el fragmento de biblioteca se una a una superficie de la celda de flujo. Los constructos tambien contienen varios sitios adicionales de enlace de cebadores que incluyen sitios de enlace de secuenciacion; por ejemplo, SBS3/SBS12.

Antes de su union a la celda de flujo, los fragmentos de biblioteca son desnaturalizados y, asf, se copia por extension una copia monocatenaria del fragmento de biblioteca. Las regiones P5' (SEC ID NO 1) y P7' (SEC ID NO 2) de fragmentos monocatenarios de biblioteca se hibridan con sus oligonucleotidos complementarios, que estan inmovilizados en la superficie de la celda de flujo. Habitualmente, en esta etapa, los oligonucleotidos de la celda de flujo actuan como cebadores, y se sintetiza una cadena complementaria al fragmento de la biblioteca. La cadena original se elimina por lavado, dejando copias de fragmentos que se enlazan covalentemente con la superficie de la celda de flujo y se convierten en una poblacion clonal; por ejemplo, la amplificacion de puentes genera multiples copias de cada fragmento. Sin embargo, el presente metodo permite obtener imagenes o contar las cadenas hibridadas a escala unimolecular antes de la formacion de los cumulos. Se ha descubierto con sorpresa que esta determinacion del numero de cadenas unimoleculares hibridadas permite que se logre la prediccion general de que numeros de cumulos se obtendra despues de la amplificacion de puentes, permitiendo asf que se realicen posibles correcciones para garantizar el maximo uso de la celda de flujo.

En la Figura 1 se muestra una vision general basica de la metodologfa. La etapa 1 muestra una celda de flujo estandar a la que esta unido covalentemente un cesped de cebadores. Se obtienen cadenas de plantilla segun se ha descrito anteriormente, y la etapa 2 muestra cadenas de plantilla siendo hibridadas en un extremo del cesped de cebadores en la celda de flujo bajo las condiciones apropiadas. La hibridacion se lleva a cabo en presencia de oligonucleotidos biotinilados que se hibridan con sitios de cebador de secuenciacion en el otro extremo de la plantilla, como puede verse en la etapa 3. Para obtener imagenes de los resultados, puede ser necesario amplificar la senal de cada molecula individual unida, a no ser que se use una plataforma de secuenciacion que sea capaz de obtener imagenes de manera efectiva de moleculas individuales. La etapa 4 muestra la amplificacion de la senal usando capas de reactivos de deteccion en ensayo con Infinium que se vierten para proporcionar la amplificacion de la senal requerida para la obtencion de imagenes con sensibilidad unimolecular en plataformas estandar de obtencion de imagenes (por ejemplo, microscopio Manteia™, MiSeq™). La metodologfa actual preferida es usar 4 capas de tincion-estreptavidina (STM) y 3 capas de antiestreptavidina (ATM). Esto da como resultado que de 10 a 100 moleculas de tincion esten asociadas con cada molecula individual de plantilla unida, haciendo asf posible obtener imagenes de ellas usando un equipo estandar de obtencion de imagenes ya usado en la tecnologfa de secuenciacion. Una vez que la obtencion de imagenes se ha completado, pueden eliminarse los oligonucleotidos biotinilados y las moleculas de amplificacion de la senal. El enjuague con enzimas normales de extension puede eliminar las moleculas marcadas.

STM = estreptavidina marcada con tincion a 10ug/ml en tampon 1*B/W [enlace/lavado] (por ejemplo, la receta de tampon B/W del protocolo de perlas MyOne, Thermo Fisher Scientific)

ATM = anticuerpo de antiestreptavidina biotinilado a una disolucion 1/100 en tampon XC3 (Illumina Inc.)

Los lavados entre capas de STM o ATM son con HT2 o PR2 (Illumina Inc). Todas las etapas de STM/ATM y de lavado se realizan a temperature ambiente, con incubaciones de 5 minutos cada una.

La Figura 2 muestra los resultados de la obtencion de imagenes de cadenas individuales usando el microscopio de fluorescencia (parte superior) o el generador de imagenes MiSeq™ (parte inferior) despues de realizar la metodologfa de la presente invencion. Se titulo PhiX™ y se obtuvieron imagenes, y puede verse que en las imagenes pueden identificarse cadenas individuales.

A continuacion, se llevo a cabo un trabajo adicional en el que tambien se obtuvieron imagenes de los cumulos finales. La imagen de los cumulos fue superpuesta sobre las imagenes de las cadenas individuales y se descubrio que habfa una correlacion. Se noto que el numero de cadenas individuales objeto de formacion de imagenes se correlacionaba en hasta un 10% con el numero de cumulos finalmente formados.

La Figura 3 muestra una comparacion de recuentos de hibridacion de plantilla con la densidad de cumulos para 14 bibliotecas estandar TruSeq™, incluyendo B. cereus, E. coli y Rhodobacter humanos, de tres usuarios diferentes. Esto mostro una correlacion general que permite una prediccion general de numeros de cumulos y, asf, una oportunidad de correccion de la subcarga o la sobrecarga antes de avanzar mas. La Figura 4 muestra una imagen similar que, ademas, incorpora 10 bibliotecas adicionales de doble mdice. De nuevo, puede verse la correlacion general. El ensayo de las 14 bibliotecas TruSeq™ y de las 10 de doble mdice (todas en formato SBS3/SBS12) muestra una buena correlacion general entre el ensayo de hibridacion de plantilla y el recuento de cumulos determinado a partir del experimento de secuenciacion. Esto permite la deteccion de eventos de subcarga o sobrecarga y la correccion con una precision de aproximadamente /-10%.

Una vez que se ha obtenido una estimacion de los numeros de cumulos, puede tomarse una decision en cuanto a si se requiere correccion de la subcarga o la sobrecarga. Por ejemplo, un usuario de la celda de flujo buscana una densidad optima de cumulos de 1 a 1,3 millones de cumulos por mm2. Si la densidad estimada de cumulos se encuentra dentro del intervalo deseado, entonces se lleva a cabo una primera extension para copiar las moleculas a la superficie de la celda de flujo, antes de la amplificacion y el procesamiento estandares de cumulos. Si la densidad estimada de cumulos es demasiado alta, puede hacerse un ajuste quitando las moleculas originales (por ejemplo, lavando con hidroxido sodico y volviendo a hibridar a una menor concentracion de plantilla). El sistema procede entonces a una primera extension para copiar las moleculas a la superficie de la celda de flujo, antes de la amplificacion y el procesamiento estandares de cumulos.

La Figura 5 muestra los resultados para la correccion de la subcarga y la sobrecarga, y puede verse que, despues de la obtencion de imagenes de la hibridacion de la plantilla, los numeros de cumulos pueden ser potenciados extendiendo las primeras moleculas hibridadas, luego hibridando una segunda porcion de plantilla (por ejemplo, IR3 8pM+8pM tiene el doble de cumulos que IR38pM) o reducidos al no extender las moleculas objeto de formacion de imagenes, y usar luego una menor concentracion de la biblioteca para la 2a hibridacion (por ejemplo, IR8 usado a 10pM para una 1a hibridacion, pero luego hibridado de nuevo a 7,5pM -las primeras moleculas hibridadas son eliminadas por completo durante el 2° evento de hibridacion- ). La Figura 6 tambien muestra los resultados de la correccion de la subcarga y la sobrecarga para dar una densidad preferida de cumulos.

Ejemplos de metodologia en plataformas automatizadas

Los metodos son compatibles con plataformas que lleven a cabo una generacion de cumulos integrada. Esto puede requerir cierta modificacion del flujo de trabajo de dichas plataformas para permitir un movimiento adicional entre las estaciones de obtencion de imagenes y las estaciones de formacion de cumulos, ya que el metodo incluye una etapa adicional de obtencion de imagenes anterior a la formacion de cumulos cuando se compara con los flujos de trabajo actuales.

Cuando se usan MiSeq™, HiSeq™ u otros sistemas automatizados, se entendena que se requerinan soporte logico/secuencias de ejecucion de control apropiados para automatizar el proceso; por ejemplo, ejecutar el ensayo de obtencion de imagenes de hibridacion de la plantilla en el cBot™ para permitir un escaneo monodclico del ensayo en el HiSeq™, y permitir el ajuste del numero de cumulos en el cBot™, etc. Tambien puede usarse un soporte logico que permita el recuento de las moleculas en la etapa de hibridacion de plantilla. Debido a la naturaleza del ensayo, estas moleculas solo aparecen en una sola imagen, que es diferente de las varias imagenes a lo largo de varios ciclos que normalmente se usan para identificar cumulos.

Se usan reactivos de amplificacion de la senal para amplificar la senal procedente de las plantillas de oligonucleotidos y de cebadores marcados hibridados. Los reactivos de amplificacion de la senal incluyen una mezcla de estreptavidina marcada con tincion, una mezcla de antiestreptavidina y anticuerpo, y un tampon modificado de hibridacion y pueden ser usados para el ensayo de obtencion de imagenes de hibridacion de la plantilla (vease supra para detalles sobre STM y ATM. El tampon modificado de hibridacion es un tampon de hibridacion con los oligonucleotidos marcados/no marcados presentes cada uno a una concentracion de 0,25uM. Oligonucleotidos ejemplares son SBS3', SBS8', SBS12', NxtRV y NxtR2').

Se lleva a cabo una hibridacion estandar de plantilla en presencia de cebadores marcados, en este caso oligonucleotidos biotinilados. A continuacion, se lleva a cabo la amplificacion de la senal y se vierten capas de reactivos de deteccion por ensayo con Infinium en la celda de flujo para proporcionar la amplificacion de la senal requerida para obtener una imagen con sensibilidad unimolecular.

La mezcla de escaneo puede ser vertida en la celda de flujo antes de la obtencion de imagenes. La primera lectura del generador de imagenes en un sistema de secuenciacion como MiSeq™ o HiSeq™ escaneara la celda de flujo para obtener imagenes de las moleculas hibridadas como una lectura de un solo ciclo.

Un protocolo ejemplar usando MiSeq™ sena:

1. Descongelar el cartucho de reactivo MiSeq™ segun las instrucciones del fabricante, y descongelar tambien 1 tubo de cada de STM (~5ml), ATM (~5ml) y tampon modificado de hibridacion (~5ml).

2. Pipetear 750ul de STM (reactivo del ensayo de obtencion de imagenes de hibridacion de plantilla: estreptavidina marcada con tincion) en la posicion 18 del cartucho MiSeq™.

3. Pipetear 750ul de ATM (reactivo del ensayo de obtencion de imagenes de hibridacion de plantilla:

antiestreptavidina) en la posicion 20 del cartucho MiSeq™.

4. Desnaturalizar la plantilla segun el protocolo estandar de Illumina Inc. para la desnaturalizacion de la plantilla, salvo el uso del tampon modificado de hibridacion (tampon de hibridacion+complementos marcados de cebadores de secuenciacion) en lugar del tampon de hibridacion HTl para la disolucion de la plantilla desnaturalizada.

5. Pipetear 600ul de plantilla desnaturalizada en tampon modificado de hibridacion (TMP) en la posicion 17 del cartucho MiSeq™.

6. Ejecutar el proceso Templatelmage en un unico ciclo, siguiendo las indicaciones en pantalla en el MiSeq™.

7. Al final de la ejecucion, el soporte logico contara o determinara el numero de los objetos vistos en las imagenes.

Los resultados de este analisis determinan as etapas restantes.

Si se determina que la densidad estimada de cumulos se encuentra en el intervalo deseado, se lleva a cabo entonces una primera extension para copiar las moleculas en la superficie de la celda de flujo, antes de la amplificacion y procesamiento estandares de los cumulos. En esta etapa puede realizarse cualquier combinacion estandar de lecturas y lecturas de indices.

Si se determina que la densidad estimada de cumulos es mayor que el intervalo deseado, puede realizarse un ajuste quitando las moleculas originales y volviendo a hibridar a una concentracion menor de la plantilla. El sistema procede entonces a una primera extension para copiar las moleculas en la superficie de la celda de flujo, antes de la amplificacion y el procesamiento estandares de los cumulos. Nuevamente, en esta etapa puede realizarse cualquier combinacion estandar de lecturas y lecturas de indices. Un protocolo ejemplar usando MiSeq™ sena:

8. Diluir la biblioteca desnaturalizada a una concentracion menor, o desnaturalizar la biblioteca y diluir a una concentracion menor en tampon modificado de hibridacion.

9. Retirar del MiSeq™ el cartucho de reactivo.

10. Pipetear 600ul de plantilla desnaturalizada en tampon modificado de hibridacion (TMP2) en la posicion 19 del cartucho MiSeq™.

11. Iniciar otra ejecucion de MiSeq™.

Si se determina que la densidad estimada de cumulos es menor que el intervalo deseado, puede realizarse un ajuste extendiendo las moleculas que ya estan en la celda de flujo, e hibridando algunas mas de esa plantilla. Se lleva a cabo una primera extension para copiar las moleculas a la superficie de la celda de flujo, seguida por una hibridacion de la plantilla. A continuacion, se lleva a cabo una segunda extension para copiar el 2° conjunto de moleculas a la superficie de la celda de flujo, antes de la amplificacion y el procesamiento estandares de los cumulos. Nuevamente, en esta etapa puede realizarse cualquier combinacion estandar de lecturas y lecturas de indices. Un protocolo ejemplar usando MiSeq™ sena:

8. Volver a diluir la biblioteca desnaturalizada a una concentracion mayor, o volver a desnaturalizar la biblioteca y diluir a una concentracion mayor en tampon modificado de hibridacion. Alternativamente, puede ser posible usar otra parte alfcuota de la biblioteca diluida a la misma concentracion usada para la ejecucion de TemplateImage: sera preciso que esto sea determinado por el usuario.

9. Retirar del MiSeq™ el cartucho de reactivo.

10. Pipetear 600ul de plantilla desnaturalizada en tampon modificado de hibridacion (TMP2) en la posicion 19 del cartucho MiSeq™.

11. Iniciar otra ejecucion de MiSeq™ usando la SampleSheet creada en la etapa 17, siguiendo las indicaciones en pantalla.

La Figura 7 muestra un posible flujo de trabajo, siendo la etapa 1, la etapa 3a y la etapa 3d etapas de acciones de usuario y siendo las restantes etapas automatizadas.

La metodologfa tambien se puede llevar a cabo en otros sistemas de secuenciacion; por ejemplo, en el sistema HiSeq™ 2000. El flujo de trabajo del HiSeq™ 2000 consiste en 4 etapas principales:

1. Ensayo de hibridacion de la plantilla en el cBot™

2. Obtener imagenes del ensayo de hibridacion de la plantilla en el HiSeq™

3. Ajuste del numero de cumulos (unicamente se realiza si la primera densidad determinada de cumulos esta fuera del intervalo deseado), amplificacion y lectura de 1 preparacion en el cBot™

4. Secuenciacion estandar en el HiSeq™

la. Copiar al HiSeq™ secuencias de ejecucion relevantes de soporte logico.

lb . Descongelar 1 tubo de cada de STM (~5ml), ATM (~5ml) y tampon modificado de hibridacion (~5ml).

lc . Pipetear 600ul de STM (reactivo del ensayo de obtencion de imagenes de hibridacion de plantilla: estreptavidina marcada con tincion) en cada tubo de una tira de tubos de una placa de reactivos de un cBot. Poner este tubo de la tira en la posicion 2 de la placa.

ld . Pipetear 600ul de STM (reactivo del ensayo de obtencion de imagenes de hibridacion de plantilla:

antiestreptavidina) en cada tubo de una tira de tubos de una placa de reactivos de un cBot™. Poner este tubo de la tira en la posicion 4 de la placa.

le. Pipetear 1000ul de PR2 en cada tubo de una tira de tubos de una placa de reactivos de 2 cBot™. Poner estos en las posiciones 1 y 3 de la placa.

El diseno de la placa cBot™ es segun se describe a continuacion:

lf. Desnaturalizar la plantilla segun las instrucciones del fabricante - por ejemplo, segun el manual de Illumina Inc. - usando el tampon modificado de hibridacion en lugar del tampon de hibridacion HTl para la disolucion de la plantilla desnaturalizada.

lg . Pipetear 120ul de plantilla desnaturalizada en tubos de 0,2ml en tiras (tubos de plantilla) de tampon modificado de hibridacion.

lh . Iniciar una ejecucion de cBot™ usando una celda de flujo HiSeq™ v3, la placa de reactivos configurada en las etapas 1b-1e, y el tubo de tira de la mezcla de la plantilla configurado en las etapas 1f-g.

1i. Al final de la ejecucion, la celda de flujo esta lista para ser escaneada en el HiSeq™.

2a-d.Configurar el soporte logico de obtencion de imagenes.

2e. Descongelar reactivos de HiSeq™.

2f. Iniciar ejecucion de HiSeq™.

2g. Seleccionar la receta de secuenciacion requerida.

2h. Seleccionar “Guardar todas las imagenes” en el menu desplegable.

2i. Cebar los reactivos mediante una celda de flujo de prueba.

2j. Montar la celda de flujo de la etapa 1 en el HiSeq™ y realizar una prueba de bombeo.

2k. Iniciar la ejecucion.

2l. Al final de la ejecucion, contar los objetos vistos en las imagenes (usando las etapas 3a-3e).

3a. Descongelar una placa estandar de reactivos cBot™, y un tubo de AMX (mezcla de amplificacion).

3b. Pipetear 1ml de PR2 en cada tubo de una tira vada de tubos de placa de reactivos cBot™.

3c. Retirar el tubo de tira HTI (fila 1) de la placa de reactivos cBot™ y sustituirlo con el tubo de tira PR2 de la etapa 3b.

3d. Pipetear 1,3ml de AMX (mezcla de amplificacion) en cada tubo de una tira vada de tubos de placa de reactivos cBot™.

3e. Retirar el tubo de tira HFE (fila 2) de la placa de reactivos cBot y sustituirlo con el tubo de tira AMX de la etapa 3d.

3f. Para carriles que requieren la extension de las moleculas en la celda de flujo, pipetear 250ul de AMX en un tubo de tira de reactivos cBot™, que ha de ser puesto en la posicion 12 de la placa de reactivos.

3g. Para carriles que requieren la deshibridacion de las moleculas en la celda de flujo, pipetear 250ul de PR2 en un tubo de tira de reactivos cBot™, que ha de ser puesto en la posicion 12 de la placa de reactivos.

3h. Para carriles que requieren una segunda hibridacion de la plantilla, pipetear 120ul de mezcla de plantilla a la concentracion deseada en un tubo de tira de 0,2ml, que ha de ser puesto en la posicion 13.

3i. Para carriles que no requieren una segunda hibridacion de la plantilla, pipetear 120ul de HTl en un tubo de tira de 0,2ml, que ha de ser puesto en la posicion 13.

El diseno de la placa cBot es segun se describe a continuacion:

Fila Reactivo Etiqueta en el equipo de reactivos de Volumen cumulos (ul/pocillo) 1 Lavado PR2 PR2 1000 2 Mezcla de amplificacion AMX 1300 3 Premezcla LPM1 1150 4 Mezcla de amplificacion LAM1 1150 5 Formamida LDR1 1150 6 Mezcla de amplificacion LAM1 1150 7 Tampon de lavado HT2 1000 8 Mezcla de linealizacion LMX1 300 9 Mezcla de bloqueo BMX 350 10 0,1N NaOH HP5 500 Fila Reactivo Etiqueta en el equipo de reactivos de Volumen cumulos (ul/pocillo)

11 Mezcla de cebadores HP1 300

12 Mezcla de extension/Tampon de lavado AMX/PR2 250

3j. Volver a transferir la celda de flujo del HiSeq™ al cBot™ y ejecutar usando la placa de reactivos configurada en las etapas 3a-3g, y el tubo de tira de mezcla de la plantilla configurado en las etapas 3h-i.

3k. Al final de la ejecucion, la celda de flujo esta lista para ser secuenciada en el HiSeq™ 2000.

4a. La cuarta etapa del flujo de trabajo del HiSeq™ 2000 es la misma que configurar una ejecucion estandar del HiSeq™ 2000, ya que los numeros de cumulos han sido ajustados, amplificados y procesados en el cBot™ en la etapa 3.

4b. Reiniciar el HCS para que se restauren las configuraciones de escaneo.

4c. Configurar de forma normal la ejecucion del HiSeq™ 2000.

Se entiende que el termino “amplificacion” usado en la presente memoria significa el procedimiento de aumentar los numeros de una secuencia de polinucleotidos de la plantilla produciendo una o mas copias. En consecuencia, estara claro que el procedimiento de amplificacion puede ser exponencial o lineal. En la amplificacion exponencial, el numero de copias creadas de la secuencia de polinucleotidos de la plantilla aumenta a una tasa exponencial. Por ejemplo, en una reaccion ideal de PCR con 30 ciclos, 2 copias de ADN de plantilla produciran 230 o 1.073.741.824 copias. En la amplificacion lineal, el numero de copias creadas de las secuencias de polinucleotidos de la plantilla aumentan a una tasa lineal. Por ejemplo, en una reaccion ideal de amplificacion de 4 horas cuya velocidad de copia sea de 2000 copias por minuto, una molecula de ADN de plantilla producira 480.000 copias.

Se entiende que el termino “inmovilizado” o “enlazado” usado en la presente memoria abarca la union directa o indirecta, covalente o no covalente, a no ser que se indique algo distinto, ya sea explfcitamente o por el contexto. En ciertas realizaciones de la invencion puede preferirse la union covalente, pero generalmente todo lo que se requiere es que las moleculas (por ejemplo, acidos nucleicos) permanecen inmovilizados o unidos a un soporte en condiciones en las que sea prevea usar el soporte; por ejemplo, en aplicaciones que requieran la amplificacion y/o la secuenciacion de acidos nucleicos.

En muchas realizaciones de la invencion, los cebadores de amplificacion para una amplificacion en fase solida son inmovilizados mediante union covalente a un soporte solido en el extremo 5' del cebador o cerca del mismo, dejando libre la porcion del cebador espedfica a la plantilla para hibridarse con su plantilla afm y al grupo hidroxilo 3' libre para funcionar en la extension del cebador. La qrnmica de union elegida dependera de la naturaleza del soporte solido, y de cualquier funcionalizacion o derivatizacion aplicada al mismo. El propio cebador puede incluir un resto, que puede ser una modificacion qrnmica no nucleotfdica, para facilitar la union. En realizaciones particulares, el cebador puede incluir un nucleofilo que contenga azufre, tal como fosfotioato o tiofosfato en el extremo 5'. En el caso de hidrogeles de poliacrilamida en soporte solido, este nucleofilo puede enlazarse a un grupo bromoacetamida presente en el hidrogel. En una realizacion preferente, el medio de union de los cebadores al soporte solido es a traves de una union del fosfotioato 5' a un hidrogel que comprende acrilamida polimerizada y N-(5-bromoacetamidilpentil) acrilamida (BRAPA). Tal disposicion es descrita mas completamente en la solicitud WO 05/065814, en tramitacion como la presente.

Las moleculas de polinucleotidos monocatenarios de plantilla pueden estar unidas a un soporte solido mediante hibridacion con cebadores inmovilizados o, alternativamente, las moleculas de polinucleotidos monocatenarios tambien pueden estar unidas directamente al soporte solido en el extremo 5' o cerca del mismo. La qrnmica de union elegida dependera de la naturaleza del soporte solido, y de cualquier funcionalizacion o derivatizacion aplicada al mismo. La propia molecula de polinucleotido monocatenario puede incluir un resto, que puede ser una modificacion qrnmica no nucleotfdica, para facilitar la union. En realizaciones particulares, una molecula de polinucleotido monocatenario puede incluir un nucleofilo que contenga azufre, tal como fosforotioato o tiofosfato en el extremo 5'. En el caso de hidrogeles de poliacrilamida en soporte solido, este nucleofilo puede enlazarse a los grupos bromoacetamida presentes en el hidrogel. En una realizacion, el medio de union de la molecula de polinucleotido monocatenario al soporte solido es a traves de una union del fosforotioato 5' a un hidrogel que comprende acrilamida polimerizada y N-(5-bromoacetamidilpentil) acrilamida (BRAPA). Tal disposicion es descrita mas completamente en la solicitud WO 05/065814, en tramitacion como la presente.

El termino “soporte solido” usado en la presente memoria se refiere a cualquier superficie, sustrato o matriz inerte a la que puedan unirse los acidos nucleicos, tal como, por ejemplo, perlas -incluyendo perlas de latex o dextrano-, una superficie, tal como una superficie de poliestireno o polipropileno, gel de poliacrilamida, superficies de oro, superficies de vidrio y obleas de silicio. El soporte solido puede ser una superficie de vidrio. El soporte solido puede ser una superficie planaria, aunque la invencion tambien funciona en perlas que sean movidas entre recipientes de tampones diferentes, o perlas dispuestas en una superficie planaria. El soporte solido puede ser una celda de flujo, resina, gel, una perla, un pocillo, una columna, un chip, una membrana, una matriz, una placa o un filtro.

En ciertas realizaciones, el soporte solido puede comprender un sustrato o matriz inerte que haya sido “funcionalizado”; por ejemplo, mediante la aplicacion de una capa o revestimiento de un material intermedio que comprende grupos reactivos que permiten una union covalente a moleculas tales como polinucleotidos. A tftulo de ejemplo no limitante, tales soportes pueden incluir hidrogeles de poliacrilamida sobre un sustrato inerte, tal como vidrio. En tales realizaciones, las moleculas (por ejemplo, polinucleotidos) pueden unirse de forma covalente directamente al material intermedio (por ejemplo, el hidrogel), pero el propio material intermedio puede estar unida de forma no covalente al sustrato o matriz (por ejemplo, el sustrato de vidrio). Tal disposicion es descrita mas completamente en la solicitud WO 05/065814, en tramitacion como la presente, cuyo contenido esta incluido en la presente memoria por referencia.

Los cebadores o los oligonucleotidos de los cebadores son secuencias de polinucleotidos que son capaces de hibridarse espedficamente a una o mas plantillas de polinucleotidos monocatenarios que han de ser amplificadas en condiciones encontradas en la etapa de hibridacion de cebadores de cada ciclo de la reaccion de amplificacion. Generalmente, las reacciones de amplificacion pueden usar al menos dos cebadores de amplificacion, a menudo denotados cebadores “directo” e “inverso”. En ciertas realizaciones, los cebadores directo e inverso pueden ser identicos. Los oligonucleotidos del cebador directo incluyen una “porcion espedfica a la plantilla”, que es una secuencia de nucleotidos capaz de hibridarse con una secuencia de enlace de cebador en al menos una cadena de la molecula que ha de ser amplificada. Los oligonucleotidos del cebador inverso pueden incluir una porcion espedfica a la plantilla capaz de hibridarse al complemento de la cadena con la que se hibrida el cebador directo durante la etapa de hibridacion. Generalmente, los oligonucleotidos de cebadores son estructuras de polinucleotidos monocatenarios. Tambien pueden contener una mezcla de bases naturales y no naturales y tambien ligamentos naturales y no naturales de esqueleto, siempre que ninguna modificacion no natural no excluya la funcion como cebador, que es definida como la capacidad de hibridarse con una cadena de polinucleotidos de plantilla durante las condiciones de la reaccion de amplificacion y de actuar como punto de iniciacion para la smtesis de una nueva cadena de polinucleotidos complementaria de la cadena de plantilla.

Los cebadores pueden comprender, ademas, modificaciones qmmicas no nucleotidicas, siempre que, de nuevo, tales modificaciones no impidan permanentemente la funcion del cebador. Las modificaciones qmmicas pueden, por ejemplo, facilitar la union covalente del cebador a un soporte solido. Ciertas modificaciones qmmicas pueden mejorar por sf solas la funcion de la molecula como cebador, o pueden proporcionar alguna otra funcionalidad util, tal como proporcionar un sitio para la escision para permitir que el cebador (o una cadena de polinucleotidos extendida del mismo) sea escindido de un soporte solido.

“Amplificacion en fase solida”, segun se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier reaccion de amplificacion de acidos nucleicos llevada a cabo sobre un soporte solido o en asociacion con el mismo de modo que la totalidad o una porcion de los productos amplificados quede inmovilizada sobre el soporte solido. En particular, la expresion abarca reacciones de amplificacion en fase solida analogas a la PCR estandar en fase de solucion, salvo que uno o ambos de los cebadores directo e inverso de amplificacion esta/estan inmovilizados sobre el soporte solido

En la amplificacion en fase solida, pueden aplicarse condiciones adecuadas a una molecula de polinucleotidos monocatenarios o a varios oligonucleotidos de cebador inmovilizado de modo que la secuencia Z en el extremo 3' de la molecula de polinucleotidos monocatenarios se hibride con una secuencia X de oligonucleotidos de cebador para formar un complejo en el que el oligonucleotido del cebador se hibride con la plantilla monocatenaria creando una estructura en “puente”. En la tecnica se conocen las condiciones adecuadas, tales como tampones de neutralizacion y/o hibridacion (veanse Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York; Current Protocols, ed. Ausubel et al.). A continuacion, puede eliminarse el tampon de neutralizacion y/o hibridacion. Un tampon adecuado de hibridacion es denominado “premezcla de amplificacion”, y contiene 2 M de betama, 20 mM de Tris, 10 mM de sulfato amonico, 2 mM de sulfato de magnesio, 0,1% de Triton™, 1,3% de DMSO, pH 8,8.

Aplicando condiciones adecuadas, puede efectuarse una reaccion de extension para un complejo formado entre el cebador inmovilizado y la plantilla de polinucleotidos monocatenarios. El oligonucleotido del complejo puede ser extendido mediante adicion secuencial de nucleotidos para generar un producto de extension complementario de la molecula de polinucleotidos monocatenarios.

Ejemplos de enzimas con actividad de polimerasa que pueden ser usadas en la presente invencion son la ADN-polimerasa (fragmento de Kienow, T4 ADN-polimerasa, Bst polimerasa), ADN-polimerasas termoestables procedentes de diversas bacterias termoestables (tales como Taq, VENT, Pfu, Tfl, Phusion ADN-polimerasas) asf como sus derivados modificados geneticamente (TaqGold, VENTexo, Pfu exo). Tambien puede usarse una combinacion de ARN polimerasa y transcriptasa inversa para generar productos de extension. Una enzima polimerasa util puede tener actividad de desplazamiento de cadena. La enzima polimerasa puede ser activa a un pH entre aproximadamente 7 y aproximadamente 9, en particular entre pH 7,9 y pH 8,8. Las moleculas de trifosfato de nucleosidos usadas pueden ser trifosfatos de desoxirribonucleotidos - por ejemplo, dATP, dTTP, dCTP, dGTP-, o pueden ser trifosfatos de ribonucleosidos; por ejemplo, ATP, UTP, c Tp , GTP. Las moleculas de trifosfato de nucleosidos pueden presentarse en forma natural o no natural. Una reaccion de amplificacion tambien puede contener aditivos tales como DMSO y/o betama, por ejemplo, para normalizar las temperaturas de fusion de las diferentes secuencias de las cadenas de plantilla. Una solucion adecuada para los ciclos iniciales de extension es denominada “mezcla de amplificacion” y contiene 2 M de betama, 20 mM de Tris, 10 mM de sulfato amonico, 2 mM de sulfato de magnesio, 0,1% de Triton™, 1,3% de DMSO, pH 8,8, mas 200 mM de dNTP y 80 unidades/mL de Bst polimerasa (por ejemplo, el producto NEB de referencia M0275L).

La desnaturalizacion se puede llevar a cabo usando calor o usando un tampon de desnaturalizacion. Los tampones de desnaturalizacion adecuados son muy conocidos en la tecnica (veanse Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York; Current Protocols, ed. Ausubel et al.). A tftulo de ejemplo, se sabe que las alteraciones en pH y las soluciones de baja fuerza ionica pueden desnaturalizar acidos nucleicos a temperaturas sustancialmente isotermicas. Para la desnaturalizacion pueden usarse formamida y urea. En una realizacion particular, la concentracion de formamida es del 50% o mas, y puede ser usada pura. Tales condiciones dan lugar a la desnaturalizacion de moleculas de acidos nucleicos bicatenarios, produciendo moleculas de acidos nucleicos monocatenarios. Alternativamente, o ademas, las cadenas pueden ser separadas mediante tratamiento con una solucion muy baja en sal (por ejemplo, menos de 0,1 mM en condiciones cationicas) y pH elevado (>12) o usando una caotropica (por ejemplo, clorhidrato de guanidinio). En una realizacion particular, puede usarse una base fuerte. Una base fuerte es un compuesto qmmico basico que es capaz de desprotonar acidos muy debiles en una reaccion acido-base. La fuerza de una base esta indicada por su valor pKb. Los compuestos con un valor pKb inferior a aproximadamente 1 son denominados bases fuertes y son muy conocidos para un experto en la tecnica. En una realizacion particular, la base fuerte es una solucion de hidroxido sodico (NaOH) usada a una concentracion entre 0,05 M y 0,25 M. Mas en particular, se usa NaOH a una concentracion de 0,1 M.

Puede ser ventajoso llevar a cabo etapas opcionales de lavado entre las etapas de un metodo de amplificacion. Por ejemplo, podna aplicarse un tampon de extension sin enzima polimerasa con o sin dNTP a un soporte solido sobre el que se este llevando a cabo la amplificacion, y puede ser aplicado antes de ser eliminado y sustituido con tampon de extension completo (tampon de extension que incluye todos los componentes necesarios para que la extension prosiga).

Multiples ciclos de amplificacion sobre una superficie solida en las condiciones ejemplificadas anteriormente pueden dar lugar a una colonia o “cumulo” de acido nucleico que comprenda multiples copias inmovilizadas de una secuencia particular de polinuclettidos monocatenarios y de su secuencia complementaria. La inmovilizacion inicial de una molecula de polinucleotido monocatenario en las condiciones ejemplificadas en la presente memoria puede dar lugar a que la molecula de polinucleotido monocatenario se hibride unicamente con oligonucleotidos de cebador situados a una distancia dentro de la longitud total de la molecula de polinucleotido monocatenario. Asf, la demarcacion de la colonia o cumulo de acidos nucleicos formada puede estar limitada a un area relativamente local, concretamente el area en la que se inmovilizo la molecula inicial de polinucleotido monocatenario. Si se usan condiciones en las que las plantillas y las copias complementarias de las mismas siguen inmovilizadas en todo el proceso de amplificacion, entonces las plantillas no se entremezclan, salvo en la medida en que se vuelvan lo bastante grandes para solaparse en la superficie. En realizaciones particulares, no hay ningun acido nucleico no inmovilizado durante parte alguna del proceso de amplificacion y, asf, las plantillas no pueden difundir ni iniciar cumulos adicionales en otro lugar de la superficie.

Un procedimiento de amplificacion puede conllevar ciclos de exposicion a condiciones para la hibridacion, la extension y la desnaturalizacion de secuencias de acidos nucleicos. Los ciclos pueden repetirse para obtener un nivel suficiente de amplificacion. El procedimiento de amplificacion (por ejemplo, en una ronda) puede llevarse a cabo usando, por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45 o mas ciclos de amplificacion. Cada ciclo puede ser llevado a cabo usando los mismos reactivos y las mismas condiciones, o los reactivos y/o las condiciones pueden variar entre ciclos diferentes. Por ejemplo, los primeros 5, 10, 15, 20 o 25 ciclos, en una primera ronda, pueden llevarse a cabo usando condiciones de extension con concentraciones equimolares de cuatro tipos de nucleotidos diferentes, y los ciclos subsiguientes, en una segunda ronda, pueden llevarse a cabo usando condiciones que den lugar a que los nucleotidos se incorporen de manera menos eficiente. Pueden usarse condiciones de amplificacion normalizadas que usen nucleotidos incorporados de manera menos eficiente. Puede llevarse a cabo un numero mayor de ciclos de amplificacion, dado que la eficiencia global de la amplificacion se reduce, y las secuencias ricas en AT no llegan a ser amplificadas en demasfa. Por lo tanto, es posible llevar a cabo, por ejemplo, 25 ciclos of amplificacion en una primera ronda usando concentraciones equimolares de nucleotidos, y 15 o mas ciclos de amplificacion adicionales en una segunda ronda usando condiciones que usan nucleotidos incorporados con menor eficiencia (por ejemplo, concentraciones limitadas de nucleotidos A y/o T). Tales ciclos adicionales en la segunda ronda amplifican los cumulos ricos en GC con preferencia a los cumulos ricos en AT, normalizando, por ende, la intensidad de cumulos de diferentes composiciones de secuencia.

Las etapas de hibridacion, extension y desnaturalizacion de un metodo de amplificacion definido en la presente memoria pueden llevarse todas a cabo a la misma temperatura, sustancialmente isotermica. Preferentemente, la temperatura se entre 37°C y aproximadamente 75°C, dependiendo de la eleccion de enzima, mas preferentemente entre 50°C y 70°C, aun mas preferentemente entre 60°C y 65°C para la Bst polimerasa. En una realizacion particular, la temperatura sustancialmente isotermica puede estar en torno a la temperatura de fusion del cebador o de los cebadores de oligonucleotidos. En la tecnica se conocen metodos de calculo de las temperaturas apropiadas de fusion.

Por ejemplo, la temperature de hibridacion puede estar aproximadamente 5°C por debajo de la temperatura de fusion (Tm) de los cebadores de oligonucleotidos. En otra realizacion particular adicional, la temperatura sustancialmente isotermica puede ser determinada empmcamente. La temperatura puede ser aquella a la que el oligonucleotido presente la mayor especificidad hacia el sitio de enlace al cebador, a la vez que reduzca el enlace no espedfico. Aunque la informacion anterior es ejemplar de un metodo isotermico, un experto en la tecnica comprendera que las etapas de hibridacion, extension y desnaturalizacion de la amplificacion se llevan a cabo a diferentes temperaturas, dependiendo del instrumento de secuenciacion que se este usando.

Aunque las realizaciones anteriores describen la deteccion de senales fluorescentes procedentes de cadenas individuales, la deteccion no tiene que contar necesariamente las moleculas individuales; por ejemplo, podna usarse un escaner Typhoon para captar una senal de fluorescencia en masa; siempre que pueda hacerse una correlacion entre la senal y el numero final de cumulos, entonces el metodo seguina funcionando. Ademas, la deteccion no tiene por que estar basada en la fluorescencia, ni siquiera en la optica; por ejemplo, podnan usarse cascadas de amplificacion de senales de tipo HRP y detectar la senal por quimioluminiscencia, o usar algun tipo de cascada que genere iones de H+ y detectar cambios de pH.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos que se produciran a partir de la amplificacion en fase solida de acidos nucleicos que comprende: proporcionar un soporte solido que tiene varios cebadores de captura inmovilizados sobre sf mismo; proporcionar cadenas de plantilla capaces de hibridarse con al menos algunos de dichos cebadores de captura; marcar las cadenas de plantilla o las extensiones de las mismas, si dichas cadenas no estan ya marcadas; detectar la senal de las cadenas marcadas o extensiones de las mismas para determinar el numero de cadenas individuales de plantilla presente en el soporte solido; y analizar dicha senal detectada para estimar el numero de cumulos o las densidades de cumulos que se obtendran despues de la amplificacion de cumulos de dichas cadenas de plantilla correlacionando el numero de cadenas individuales de plantilla presentes con el numero o las densidades previstos de cumulos.

2. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en la reivindicacion 1 en el que la etapa de marcado de las cadenas de plantilla o de las extensiones de las mismas comprende la hibridacion de un oligonucleotido marcado con la cadena de plantilla.

3. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en cualquiera de las reivindicaciones previas en el que cada una de dichas cadenas de plantilla comprende al menos un sitio de enlace de marca; en el que, preferentemente, el sitio de enlace de marca es un sitio de cebador de secuenciacion.

4. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en cualquiera de las reivindicaciones previas en el que la etapa de marcado de las cadenas de plantilla o de las extensiones de las mismas comprende la hibridacion de dichas cadenas de plantilla con dichas sondas de captura en presencia de oligonucleotidos marcados capaces de hibridarse con los sitios de enlace de marca.

5. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en cualquiera de las reivindicaciones previas, incluyendo el metodo la etapa de extender los cebadores de plantilla; y, opcionalmente, en el que la etapa de marcado de las cadenas de plantilla o de las extensiones de las mismas comprende el uso de dNTP marcado durante la etapa de extension; o en el que la etapa de marcado de las cadenas de plantilla o de las extensiones de las mismas comprende la hibridacion de un oligonucleotido marcado con la cadena de plantilla extendida.

6. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en cualquiera de las reivindicaciones previas en el que el soporte solido es una celda de flujo; y/o los cebadores de captura comprenden los oligonucleotidos P5 y P7.

7. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en cualquiera de las reivindicaciones previas en el que las cadenas de plantilla comprenden secuencias de adaptador; y en el que, preferentemente, dichas secuencias de adaptador son complementarias de al menos uno de los cebadores de captura y se hibridaran con los mismos en condiciones apropiadas.

8. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en cualquiera de las reivindicaciones previas en el que el sitio de cebador de secuenciacion comprende una secuencia SBS3 o SBS12; y/o

en el que los oligonucleotidos marcados son secuencias marcadas SBS3' o S8S12'; y/o

en el que los oligonucleotidos marcados estan marcados con biotina.

9. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en cualquiera de las reivindicaciones previas, incluyendo el metodo la etapa de amplificar la senal de las cadenas marcadas o extensiones de las mismas;

en el que se produce, preferentemente, una amplificacion de senal exponiendo el soporte solido con oligonucleotidos marcados unido al mismo a estreptavidina marcada con tincion y, opcionalmente, proporcionando exposiciones subsiguientes a antiavidina y estreptavidina marcada con tincion; y/o

en el que la amplificacion de amplificacion de la senal da lugar a entre 2 y 1000, preferentemente entre 10 y 100 moleculas de tincion por cadena de plantilla hibridada; y preferentemente, ademas,

en el que la estreptavidina marcada con tincion comprende una tincion fluorescente.

10. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en cualquiera de las reivindicaciones previas en el que la obtencion de imagenes se lleva a cabo con un microscopio de fluorescencia.

11. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en cualquiera de las reivindicaciones previas en el que, si el analisis sugiere que la densidad predicha de cumulos esta dentro de un intervalo predeterminado deseado, entonces se efectua una primera extension para copiar las moleculas en la superficie de la celda de flujo, antes de la amplificacion y el procesamiento estandar de cumulos; o

si el analisis indica que la densidad predicha de cumulos es mayor que un intervalo predeterminado deseado, las moleculas originales de la plantilla son eliminadas del soporte solido; en el que, preferentemente,

las moleculas originales de la plantilla son eliminadas lavando con hidroxido sodico.

12. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el que, si el analisis indica que la densidad predicha de cumulos es mayor que un intervalo predeterminado deseado, una fraccion de las moleculas originales de la plantilla es eliminada del soporte solido; y, opcionalmente, (i) en el que varios oligonucleotidos de eliminacion diferentes, preferiblemente dos oligonucleotidos de eliminacion diferentes, son hibridados en diferentes proporciones con las moleculas de la plantilla, y en el que solo una proporcion de los oligonucleotidos de eliminacion crea un sitio de restriccion, llevandose luego a cabo una etapa de digestion de restriccion para eliminar selectivamente las moleculas con el sitio de restriccion o (ii) en el que los oligonucleotidos protectores son hibridados con una porcion de las moleculas de la biblioteca unidas a la superficie, usandose endonucleasa para eliminar, por digestion, las moleculas no protegidas de la biblioteca unidas a la superficie, y

en el que la cantidad de oligonucleotido protector puede ser determinada por titulacion o

en el quetambien pueden usarse oligonucleotidos protectores adicionales para proteger a cualquier cebador (por ejemplo, los cebadores P5 y P7) de su eliminacion por la exonucleasa.

13. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en la reivindicacion 9 en el que la hibridacion de las cadenas de plantilla se efectua entonces a una concentracion de plantilla mas baja y se lleva a cabo una etapa de extension para copiar las moleculas a la superficie de la celda de flujo.

14. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que, si el analisis indica que la densidad predicha de cumulos es menor que un intervalo predeterminado deseado, las moleculas que ya estan en la celda de flujo son extendidas y, a continuacion, se lleva a cabo una etapa adicional de hibridacion para hibridar cadenas de plantilla adicionales con dichas sondas de captura.

15. Un metodo de prediccion de numeros de cumulos o densidades de cumulos como en cualquiera de las reivindicaciones previas, incluyendo el metodo la etapa adicional de llevar a cabo una amplificacion en fase solida; en el que, opcionalmente,

la amplificacion en fase solida es amplificacion de puentes; y, ademas, opcionalmente,

incluyendo el metodo la etapa adicional de efectuar una secuenciacion por smtesis.