CN103958683A - 与肾上腺皮质刺激激素结合的分子及其应用 - Google Patents

与肾上腺皮质刺激激素结合的分子及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103958683A
CN103958683A CN201280058613.XA CN201280058613A CN103958683A CN 103958683 A CN103958683 A CN 103958683A CN 201280058613 A CN201280058613 A CN 201280058613A CN 103958683 A CN103958683 A CN 103958683A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acth
binding molecule
peptide
mentioned
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280058613.XA
Other languages
English (en)
Inventor
伊藤克法
加畑博幸
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sysmex Corp
Original Assignee
Sysmex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sysmex Corp filed Critical Sysmex Corp
Publication of CN103958683A publication Critical patent/CN103958683A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/695—Corticotropin [ACTH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/117—Modifications characterised by incorporating modified base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/665—Assays involving proteins derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • G01N2333/695—Corticotropin [ACTH]

Abstract

本发明涉及与肾上腺皮质刺激激素(ACTH)以高的亲和性结合的分子。另外，本发明涉及用于检测及/或纯化ACTH的上述的分子的利用。

Description

与肾上腺皮质刺激激素结合的分子及其应用
技术领域
本发明涉及与肾上腺皮质刺激激素(ACTH)以高的亲和性结合的分子。另外，本发明涉及用于检测及/或纯化ACTH的上述的分子的应用。
背景技术
在血液中含有各种各样的肽，在其中也存在在特定的病态的活体中显示与健康时不同的血中浓度的肽。那样的肽在临床检查的领域作为疾病的标志物而被关注。例如，在由垂体激素的分泌降低发生的西蒙斯、席汉综合征等的临床检查中，使用利用抗原抗体反应的ACTH的检测用试剂盒。
但是，抗原抗体反应中利用的抗体的制作极其烦琐，再者有抗体的品质难管理的问题。
近年，作为利用抗原抗体反应的方法中涉及的新的肽检测法，有利用作为与目标肽特异性地结合的核酸分子的适体的检测法。例如，在专利文献1中记载了可与目标蛋白质以高的亲和性结合的，含修饰核苷酸的适体的制造方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2003/078623号
发明内容
发明要解决的技术课题
在现有技术中开发了特异性地识别各种蛋白质或多肽的适体，但尚未发现可与ACTH以高的亲和性结合的分子。
从而，本发明旨在提供，是与抗体不同的分子的、与ACTH以高的亲和性结合的分子。另外，本发明旨在提供用于使用那样的分子检测及/或纯化ACTH的试剂及方法。
解决课题的技术方案
从而，本发明提供下述的(a)、(b)及(c)中任一个所表示的、具有含修饰碱基的核酸序列的ACTH结合分子。
(a)X1TTX2X3TX3TX4GX4GAX5TX2X1TX6C
(b)AX5X7GTX2X6CX3TX4GTX2X3TX6CTX8
(c)X6CTX2AX5TX2X9AX1TX7GX6CAX5TX2
其中，X1～X9各自表示下式所表示的修饰碱基。式中，P表示磷酸基，
【化1】
另外，本发明提供使用上述的ACTH结合分子或连结其的载体检测ACTH的方法及纯化的方法。
发明效果
本发明可提供与ACTH以高的亲和性结合的分子。另外，本发明提供可使用这样的分子检测及/或纯化样品中的ACTH的试剂及方法。
附图说明
图1：1A、1B及1C是对含ACTH肽的样品溶液、和含ACTH肽及本发明的ACTH结合分子的样品溶液进行测定的荧光光谱。
图2：2A、2B及2C是在以ACTH结合分子的浓度作为X轴，以标准化的荧光强度作为Y轴的座标上标绘各样品的数据而得到的图。
图3：A、3B及3C是在以经过时间作为X轴，波长变动量作为Y轴的座标上标绘由反射干涉分光法(RIfS)测定ACTH肽和本发明的ACTH结合分子的相互作用而得到的波长变动量而得到的图。
图4：是显示分别添加4种肽溶液之后的波长变动量的变化的图。
图5：是在以ITIH4肽的浓度作为X轴，以荧光强度作为Y轴的座标上标绘对向含ACTH肽及本发明的ACTH结合分子的样品溶液添加ITIH4肽的溶液进行测定的荧光强度而得到的图。
图6：是将对向含ACTH肽及本发明的ACTH结合分子的样品溶液添加ITIH4肽的溶液进行测定的荧光强度标准化，将此数据在以ITIH4肽的浓度作为X轴，以标准化的荧光强度作为Y轴的座标上标绘而得到的图。
图7：是由RIfS测定血清样品中的ACTH肽和ACTH结合分子的相互作用，将得到的波长变动量在以经过时间作为X轴，以波长变动量作为Y轴的座标上标绘而得到的图。
实施方式
[1]ACTH结合分子
在本说明书中，ACTH结合分子是指对ACTH有亲和性，可与ACTH特异性地结合的功能性分子。
本发明的ACTH结合分子由上述的(a)、(b)及(c)中的任一个所表示，具有含有修饰碱基的核酸序列，并且对ACTH有亲和性。
ACTH是由39个氨基酸组成的激素，由脑的垂体分泌，作用于肾上腺皮质而促进肾上腺皮质激素的分泌。
在本发明的实施方式中，ACTH除了在活体内产生的天然的ACTH之外，可为由导入编码ACTH的基因的哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌等的细胞产生的肽，也可为由化学合成制造的肽。另外，ACTH由于在生物种之间氨基酸序列的相同性高，ACTH的来源只要是产生ACTH的生物种，就不特别限定，可举出哺乳类(例如，人、小鼠、大鼠、狗、兔)、鸟类(例如鸵鸟)、鱼类(例如白斑星鲨)等。
在本发明的实施方式中，成为ACTH结合分子的目标的ACTH可为全长的肽，也可为其片段。作为片段，由至少ACTH的1～24位的氨基酸序列构成的肽是优选的。
本发明的ACTH结合分子中含的修饰碱基是向构成核苷(或者核苷酸)的腺嘌呤、鸟嘌呤及胞嘧啶的氨基导入取代基的碱基。取代基的导入方法不特别限定，可由现有技术中公知的方法进行。例如，可举出下式所示的方法等。
【化2】
在上述的式中，R是-(CH2)3COOH、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2OH、-CHNH2CH2NH2或下述的式(1)～(4)中任一个所示的基团。
【化3】
在本发明的实施方式中，ACTH结合分子可通过合成含具有上述的修饰碱基及通常的碱基的核苷的多核苷酸来制造。那样的合成方法不特别限定，可由现有技术中公知的方法进行。作为那样的方法，可举出例如，氨基亚磷酸酯法、二酯法、三酯法、亚磷酸酯法、硫代亚磷酸酯法、H-膦酸酯法等。另外，也可使用市售的DNA自动合成装置。
在本发明的实施方式中，ACTH结合分子可为DNA，也可为RNA。从而，在本发明的ACTH结合分子的核酸序列中，将胸腺嘧啶(T)用尿嘧啶(U)取代的分子也包括在本发明的范围内。
在本发明的实施方式中，ACTH结合分子的结构只要是不妨碍与ACTH的结合的结构，就不特别限定，优选为链状结构。
在本发明的实施方式中，ACTH结合分子也可有附加序列。即，ACTH结合分子可在上述的(a)、(b)及(c)中的任一个所表示的核酸序列之一端或两端附加那样的序列。附加序列只要不妨碍ACTH结合分子和ACTH的结合，就不特别限定，例如可为用于将ACTH结合分子由PCR法等扩增的核酸序列，也可为用于稳定化ACTH结合分子的结构的核酸序列。用于扩增ACTH结合分子的核酸序列可根据使用的引物的序列适宜设定。另外，作为用于稳定化ACTH结合分子的结构的核酸序列，可举出例如，附加在上述的(a)、(b)及(c)中的任一个所表示的核酸序列的两端时，可在分子内形成15～35个碱基对的互补的碱基对的序列。
上述的附加序列的长度不特别限定，通常100聚体以下，优选为80聚体以下。再有，附加序列可在上述的(a)、(b)及(c)中的任一个所表示的核酸序列的多核苷酸的合成时附加。
在本发明的实施方式中，ACTH结合分子也可有接头。即，ACTH结合分子可在上述的(a)、(b)及(c)中的任一个所表示的核酸序列之一端或两端附加那样的接头。接头只要不妨碍ACTH结合分子和ACTH的结合，就不特别限定，用于使ACTH结合分子结合于载体的接头是优选的。作为那样的接头，直链状合成高分子及直链状天然高分子等的链状的分子是优选的。在ACTH结合物质和ACTH的结合中静电相互作用发挥作用，所以作为上述的高分子，使用不抑制ACTH结合物质和ACTH的结合的非离子性的高分子是优选的。
作为直链状合成高分子，可举出例如，碳原子数1～700的烷基、聚乙二醇、聚乙烯基醇(含部分皂化聚醋酸乙烯酯)、聚乙烯基甲基醚、聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺或丙烯酰胺衍生物的聚合物、聚乙烯基乙酰胺及聚乙烯基甲酰胺等。在这些之中，从亲水性高，容易得到及合成的观点来看，聚乙二醇是特别优选的。另外，从难抑制ACTH结合物质和ACTH的结合的观点来看，聚乙烯基吡咯烷酮及聚乙烯基乙酰胺是优选的。
作为直链状天然高分子，可举出例如，核酸、多糖、及亲水性多肽等的蛋白质等。再有，接头可由现有技术中公知的方法附加到ACTH结合分子上。
在本发明的实施方式中，ACTH结合分子可连结到现有技术中公知的载体而使用。从而，连结本发明的ACTH结合分子的载体也包括在本发明的范围内。
作为载体的材质，可举出例如，多糖类、塑料、玻璃等。作为载体的形状，可举出例如，珠、凝胶等。作为载体的具体例，可举出琼脂糖珠、琼脂糖珠、磁性珠、玻璃珠、硅酮凝胶等。这些的载体可填充到柱中使用。另外，也可将多孔板、微阵列用基板等作为载体使用。
ACTH结合分子和载体可直接连结，也可经上述的接头等的其他物质间接连结。另外，ACTH结合分子的向载体的连结可由现有技术中公知的方法进行。例如，通过向本发明的ACTH结合分子附加生物素，向载体附加亲和素或链霉亲和素，可解开生物素和亲和素或链霉亲和素的结合，连结ACTH结合分子和载体。
这样的连结本发明的ACTH结合分子的载体，例如，可作为用于检测及/或纯化样品中的ACTH的生物传感器使用。
本发明的ACTH结合分子可与ACTH以高的亲和性结合，所以在本发明的实施方式中，可将ACTH结合分子及连结其的载体作为ACTH检测用试剂利用。作为那样的检测用试剂使用本发明的ACTH结合分子时，也可将ACTH结合分子用酶、染料、荧光物质、放射性同位元素等的现有技术中公知的标记物质标记。将用这样的物质标记的ACTH结合分子与有含ACTH的可能性的样品混合之后，基于来源于标记的信号，可检测与ACTH结合分子结合的ACTH。
另外，在本发明的别的实施方式中，本发明的ACTH结合分子及连结其的载体可作为用于被认为与ACTH的分泌的亢进相关的疾病的预防或治疗的药剂、或者作为ACTH抑制剂利用。将ACTH结合分子作为那样的药剂或试剂使用时，例如将ACTH结合分子溶解于水、生理盐水或适宜的缓冲液而作成适宜的浓度的溶液，将其通过适宜的途径施用给对象，或添加到活细胞的培养基即可。
[2]ACTH的检测方法及纯化方法
本发明提供使用上述的ACTH结合分子检测样品中的ACTH的方法及纯化的方法。
本发明的ACTH的检测方法包括：将样品与本发明的ACTH结合分子或连结其的载体混合的步骤，以及在此步骤中得到的混合物中，通过解析ACTH结合分子和ACTH的结合来检测ACTH的步骤。
在本发明的实施方式中，样品只要是有含ACTH的可能性的样品，就不特别限定，优选为有含ACTH的可能性的液体样品。另外，样品也可为活体样品。作为那样的活体样品，可举出例如，血液、血浆、血清、体液等。将这样的样品与本发明的ACTH结合分子或连结其的载体混合的条件不特别限定，本领域技术人员可适宜设定。例如，样品是液体样品时，ACTH结合分子的添加量，以终浓度表示，1～500nM、优选为5～100nM即可。另外，混合时的温度及时间是于20～37℃经30秒钟～5分钟左右即可。
在本发明的优选的实施方式中，检测步骤中的ACTH结合分子和ACTH的结合的解析通过向上述的混合步骤中得到的混合物照射光而得到光学信息来进行。作为那样的光学信息，可举出例如，反射光的波长、荧光强度、吸光度等。
作为光学信息得到反射光的波长时，向上述的混合物照射白色光，由反射干涉分光法(Reflectometric Interference Spectroscopy：RIfS)经时测定反射光的波长变化是优选的。其中，RIfS是指，向基板上的流路注入样品，在该基板上使分子相互作用，通过向其中照射白色光而将自基板的反射光的干涉效果作为波长变化量进行测定来检测分子间相互作用的方法。
作为光学信息得到反射光的波长时，作为别的优选的方法，可举出利用表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance：SPR)的原理的方法。其中，利用SPR的原理的方法是指，通过对固定化分子等的基板，向无流路的面(即，未固定化分子等的面)以至全反射的方式照射特定的波长的光而检测得到的反射光，通过解析该反射光的反射角度的变化，测定固定化到基板上的物质的量的变化的方法。例如，向固定化ACTH结合分子的基板上的流路注入ACTH，通过向无流路的面以至全反射的方式照射特定的波长的光而检测得到的反射光，通过解析该反射光的反射角度的变化，可检测ACTH结合分子上结合ACTH而发生的质量变化。
作为光学信息得到荧光强度时，使用用现有技术中公知的荧光物质预先标记的本发明的ACTH结合分子。向标记的ACTH结合分子和样品的混合物照射激发标记的荧光物质的光，通过取得来源于标记的信号，可检测与ACTH结合分子结合的ACTH。
另外，作为光学信息得到吸光度时，利用由过氧化物酶等的化学发光酶的化学发光的方法是优选的。作为利用化学发光的方法，可使用与ELISA(酶联免疫吸附测定)法同样的方法。例如，向固定化ACTH结合分子的基板上结合ACTH之后，进行酶标记，再进行酶反应而将色原性底物变更为染料。然后，通过用比色计测定所述染料的呈色来解析得到的吸光度，可检测与ACTH结合分子结合的ACTH。
通过使用本发明的结合分子，与利用抗原抗体反应时相比，可容易、短时间、并且低成本检测ACTH。
本发明的ACTH的纯化方法包括：将样品与连结本发明的ACTH结合分子的载体混合的步骤，以及从此步骤得到的混合物，取得连结到载体的ACTH结合分子和ACTH的复合物的步骤。
在此纯化方法中，将样品和载体混合的步骤与上述的本发明的ACTH的检测方法中所述的同样。
从得到的混合物，取得连结到载体的ACTH结合分子和ACTH的复合物的手段不特别限定。例如，当样品是液体，载体是珠时，可由离心分离取得连结到载体的ACTH结合分子和ACTH的复合物。或者，通过向填充连结本发明的ACTH结合分子的载体的柱通入样品，可取得该样品中的ACTH和连结到载体的ACTH结合分子的复合物。
从上述的复合物游离ACTH的方法在现有技术中公知。例如，通过向得到的复合物添加高盐浓度的溶液而混合，可从该复合物游离ACTH。
通过使用本发明的结合分子，与利用抗原抗体反应时相比，可容易、短时间、并且低成本纯化ACTH。
接下来，由实施例详细地说明本发明，本发明不限于这些实施例。实施例
实施例1：ACTH结合分子的制作
(1-1)ACTH肽
作为成为ACTH结合分子的目标的ACTH肽，使用向含ACTH的1～24位的氨基酸序列的肽的N末端，作为接头附加“生物素-PEG4-DDDDK-”而合成的肽(株式会社BIOLOGICA制)。再有，在所述接头中，“DDDDK”是成为肠激酶的切断位点的氨基酸序列，“生物素-PEG4”是用于向后述的使用亲和性层析的树脂固定化上述的肽的标签。
(1-2)ACTH结合分子的筛选
ACTH结合分子的筛选由SELEX(指数富集法配体系统统进化)法进行。首先，将腺嘌呤、鸟嘌呤及胞嘧啶的氨基由接下来示的方法取代，合成含9种修饰碱基的核苷。
【化4】
在上述的式中，R是-(CH2)3COOH、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2OH、-CHNH2CH2NH2或下述的式(1)～(4)中任一个所示的基团。
【化5】
使用得到的含修饰核苷的核苷，由DNA自动合成装置，制作含由固定序列1(35聚体：SEQ ID NO:1)-随机寡核苷酸序列(20聚体)-固定序列2(33聚体：SEQ ID NO:2)组成的寡核苷酸的随机库。再有，固定序列1及2的序列如下。
固定序列1：GAAGGTGAAG GTCGGCTGAA GCATTAGACC TAAGC
固定序列2：GCTTAGGTCT AATGCACCAT CATCACCATC TTC
然后，使用固定化(1-1)中合成的ACTH肽的树脂，对于随机库进行亲和性层析。结果，得到75种ACTH结合分子的候选。对这些的候选实施由SPR法(表面等离子体共振)的第1次筛选，得到与ACTH肽的亲和性高的12种ACTH结合分子的候选。再者，对这12种实施由荧光滴定法的第2次筛选，得到与ACTH肽的亲和性高的3种ACTH结合分子。将得到的ACTH结合分子分别称为抗-SYS2-001、抗-SYS2-002及抗-SYS2-021。以下示各ACTH结合分子的序列。
抗-SYS2-001：X1TTX2X3TX3TX4GX4GAX5TX2X1TX6C
抗-SYS2-002：AX5X7GTX2X6CX3TX4GTX2X3TX6CTX8
抗-SYS2-021：X6CTX2AX5TX2X9AX1TX7GX6CAX5TX2
其中，X1～X9各自表示下式所表示的修饰碱基。式中，P表示磷酸基，
【化6】
实施例2：ACTH结合分子与ACTH肽的结合的检测和解离平衡常数(KD)的算出
(2-1)荧光标记ACTH肽
作为成为ACTH结合分子的目标的ACTH肽，使用将由ACTH的1～24位的氨基酸序列组成的肽用红色荧光染料的四甲基若丹明(TMR)标记的TMR-ACTH肽(株式会社BIOLOGICA制)。
(2-2)荧光光谱测定及由荧光滴定法的测定
将(2-1)中合成的TMR-ACTH肽溶解于0.5×Tris缓冲食盐水(TBS)(20mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl)至成终浓度800nM，得到样品溶液A。另外，实施例1中得到的抗-SYS2-001及TMR-ACTH肽溶解于0.5×TBS至终浓度分别成1600nM及800nM，得到样品溶液B。对于抗-SYS2-002及抗-SYS2-021，与样品溶液B同样，与TMR-ACTH肽一同溶解于0.5×TBS，得到样品溶液C及D。
对样品溶液A～D的每一个，由日立荧光光度计F-7000(FL)(日立HighTech)测定在激发波长540nm及荧光波长550～650nm的荧光光谱。得到的荧光光谱示于图1。
接下来，将样品溶液B、C及D分别与样品溶液A混合，将ACTH结合分子的浓度调节到0～800nM。对于得到的各溶液，测定在激发波长540nm及荧光波长580nm的荧光强度。将得到的荧光强度标准化之后，在以ACTH结合分子的浓度(nM)作为X轴，以标准化的荧光强度作为Y轴的座标上，标绘对各溶液的数据。对于得到的坐标图，使用KaleidaGraph(HULINKS公司)，进行对下式(I)的曲线拟合，算出ACTH结合分子和ACTH肽的结合的KD值。此解析结果示于图2。
【数1】
Y＝a×Xb/(Xb+KD b)  式(I)
(式(I)中，a表示常数，b表示希尔系数。)
由图1知，TMR-ACTH肽的荧光由ACTH结合分子的添加而衰减。从而认为，TMR-ACTH肽和本发明的ACTH结合分子结合。
另外，由图2知，对于表示ACTH结合分子和TMR-ACTH肽的结合的亲和性的KD值而言，抗-SYS2-001是1.1×10-9M、抗-SYS2-002是1.1×10-9M、抗-SYS2-021是6.1×10-10M。其中，由于专利文献1中所示的适体的KD值是1.0×10-7～1.0×10-9M，得知本发明的ACTH结合分子，对于ACTH肽，有与以往技术的适体相同程度或其以上的亲和性。
实施例3：由反射干涉分光法(RIfS)的ACTH结合分子和ACTH肽的结合及解离的检测
(3-1)肽
作为ACTH肽，使用含ACTH的1～24氨基酸序列的ACTH肽(株式会社BIOLOGICA制)。另外，从在Villanueva J等的报告(Jclin Invest116(1)，271-284,2006)中作为疾病标志物的肽之中，使用氨基酸残基数是25残基左右的肽，并且等电点是酸性(pI值不足5.5)、中性(pI值是5.5～8.5)或碱性(pI值大于8.5)的肽(株式会社BIOLOGICA制)。对这4种肽的信息示于以下的表1。
【表1】
(3-2)ACTH结合分子和ACTH肽的结合及解离的检测
将NeutrAvidin(SIGMA公司)溶解于0.5×TBS至终浓度成0.1μM，制备NeutrAvidin溶液(0.1μM)。实施例1中得到的3种ACTH结合分子分别溶解于纯水而作成50μM的溶液，将这些再用纯水稀释100倍而制备各ACTH结合分子的溶液(0.5μM)。将上述的4种肽的冷冻干燥粉末分别溶解于0.5×TBS至终浓度成17μM，制备各肽的溶液(17μM)。
预先将用生物素修饰的氮化硅芯片(Konica Minolta Opto株式会社制)设置于分子间相互作用测定装置Mi-亲合力(Konica MinoltaOpto株式会社制)，将该芯片上形成的流路用0.5×TBS取代。其后，将上述的NeutrAvidin溶液、ACTH结合分子的溶液及肽溶液以此顺序分别向流路注入100μL。再有，各溶液的注入在NeutrAvidin溶液是经过时间0sec之时，ACTH结合分子的溶液是1800sec之时，肽的溶液是3600sec之时进行。然后，由RIfS的测定观察得到的波长变动量(nm)的经时变化。在以经过时间(sec)作为X轴，以波长变动量(nm)作为Y轴的座标上，标绘由测定得到的波长变动量。
在得到的坐标图(以下，称为“传感图”)之中，将肽溶液作为ACTH肽溶液使用之时的传感图示于图3。另外，对于抗-SYS2-001，分别添加4种肽溶液之后(即，经过时间3600sec往后)的波长变动量的变化示于图4。再有，在图3及4中，▽是指表示ACTH肽和ACTH结合分子的结合的峰，▼是指表示两者的解离的峰。
由图3知，在全部的传感图中，在0sec～900sec观察到向生物素修饰SiN芯片的NeutrAvidin的结合，在1800sec～2700sec见到向NeutrAvidin的ACTH结合分子的结合。另外，在3600sec注入ACTH肽的溶液时，观察刻表示ACTH肽和ACTH结合分子的结合及解离的峰。从而知，由使用固定化这3种ACTH结合分子的芯片的RIfS测定可检测ACTH。再有，在抗-SYS2-021的传感图中，测定时发生噪声，但由于确认到与ACTH的结合及解离的峰，因此对可检测ACTH的结果无影响。
另外，由图4知，可观察到肽和ACTH结合分子的结合及解离的峰的仅为ACTH，在其他肽中观察不到那样的峰。因此知，本发明的ACTH结合分子与ACTH肽特异性地结合。
实施例4：利用竞争结合抑制的ACTH结合分子和目标肽的特异性的探讨
将作为分子量及等电点与ACTH肽接近的肽的ITIH4肽作为竞争结合抑制物质使用，探讨本发明的ACTH结合分子的向目标肽的特异性。
(4-1)样品的制备
作为测定用样品，如下制备样品溶液E、F及G。样品溶液E是将ACTH结合分子(抗-SYS2-002)及TMR-ACTH肽溶解于0.5×TBS至终浓度分别成800nM而得到。样品溶液F是将TMR-ACTH肽溶解于0.5×TBS至终浓度成800nM而得到。样品溶液G是将ITIH4肽溶解于0.5×TBS至终浓度成1,000μM而得到。
(4-2)样品的测定
对于样品溶液E，由日立荧光光度计F-7000(FL)(日立HighTech)测定在激发波长540nm及荧光波长580nm的荧光强度。测定后，向样品溶液E少量添加样品溶液G而均匀混和，对于得到的混合液测定荧光强度。然后，向此混合液再添加样品溶液G而混和，再测定荧光强度。重复进行此操作，将得到的荧光强度在以ITIH4肽的浓度作为X轴，以荧光强度作为Y轴的座标上标绘。另外，对于样品溶液F也进行同样的操作，将荧光强度标绘在座标上。得到的坐标图示于图5。
将由样品溶液E的测定得到的荧光强度标准化，将此数据在以ITIH4肽的浓度作为X轴，以标准化的荧光强度作为Y轴的座标上标绘。对于得到的坐标图，使用KaleidaGraph(HULINKS公司)，进行对下述的式(II)的曲线拟合而进行解析。此解析结果示于图6。
【数2】
Y＝(Ki×[TMR-ACTH]/Kd)/[X+{Ki×(Kd+[TMR-ACTH])/Kd}]  式(II)
(式(II)中，Ki表示ITIH4肽和ACTH结合分子的结合的KD值，Kd表示ACTH肽和ACTH结合分子的结合的KD值。)
由图5知，由实施例2(图1)中见到的TMR-ACTH和ACTH结合分子的结合的荧光的衰减由ITIH4肽的添加而解消。另外，在ACTH结合分子非存在下，荧光的衰减不解消。因此认为，由ITIH4肽的添加的荧光的变化(衰减的解消)通过ITIH4肽和ACTH结合分子相互作用而发生。即认为，通过ITIH4肽与ACTH结合分子结合，从而与ACTH结合分子结合的TMR-ACTH游离。
由图6知，Kd值被算出为1.3nM、Ki值被算出为850nM。使用此结果算出ACTH结合分子的对ACTH肽的目标特异性S值。其中，目标特异性S值是指由与目标及非目标的解离平衡常数的除法得到的值(S＝Ki/Kd)。即，此目标特异性S值越大，表示对目标肽的特异性越高。
本发明的ACTH结合分子(抗-SYS2-002)的目标特异性S值被算出为650。即知，本发明的ACTH结合分子可以S值650的特异性识别相对于ACTH肽长度(分子量)是72％、等电点是89％相同的ITIH4肽。其中，关于目标特异性，为了比较本发明的ACTH结合分子和以往的适体，参照SUSAN E.W.等的报告(RNA、14卷、1037-1047页、2008年)。SUSAN E.W.等的抗p65适体只能以S值99的特异性筛选相对于目标长度(分子量)是85％、等电点是91％相同的蛋白质(p50)。从而得知，本发明的ACTH结合分子相比以往的适体有更高的目标特异性。
实施例5：由RIfS测定的含血清的样品中的ACTH检测
(5-1)样品溶液的制备
预先将制备好的ACTH肽溶液(5μL、1.36mM(4mg/mL))、健康者血清(4μL)及ST缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.4)、100mMNaCl)(391μL)混合，制备含ACTH肽的血清样品。另外，代替ACTH肽溶液使用纯水(5μL)，制备不含ACTH肽的血清样品。
(5-2)由RIfS测定的血清样品中的ACTH肽的检测
与实施例3同样，预先将用生物素修饰的氮化硅芯片(KonicaMinolta Opto株式会社制)设置于分子间相互作用测定装置Mi-亲合力(Konica Minolta Opto株式会社制)，将该芯片上形成的流路用0.5×TBS取代。其后，将NeutrAvidin溶液(0.1μM)、ACTH结合分子的溶液(0.5μM)及上述的血清样品中的任一个以此顺序各自向流路注入100μL。再有，各溶液的注入在NeutrAvidin溶液是经过时间0sec之时，ACTH结合分子的溶液是1800sec之时，血清样品是3600sec之时进行。然后，由RIfS的测定观察得到的波长变动量(nm)的经时变化。将得到的波长变动量用在3600sec的波长变动量0修正的传感图示于图7。再有，在图7中，▽是指表示ACTH肽和ACTH结合分子的结合的峰，▼是指表示两者的解离的峰。
由图7知，与实施例3同样，见到ACTH结合分子的向芯片的结合，其后仅在使用含ACTH肽的血清样品时，ACTH肽和ACTH结合分子结合(图7的▽)、然后可观察到解离(图7的▼)的样式。因此知，本发明的ACTH结合分子在含如血清一样的杂质的样品中也可检测ACTH肽。
本申请与2011年12月28日申请的日本专利申请特愿2011-289028号相关，将此专利权利要求、说明书、附图及摘要的全部通过引用并入本说明书中。

Claims (14)

1.ACTH结合分子，其具有由下述(a)、(b)及(c)中的任一个所表示的、含修饰碱基的核酸序列：
(a)X1TTX2X3TX3TX4GX4GAX5TX2X1TX6C
(b)AX5X7GTX2X6CX3TX4GTX2X3TX6CTX8
(c)X6CTX2AX5TX2X9AX1TX7GX6CAX5TX2
其中，X1～X9各自表示下述式所表示的修饰碱基，式中，P表示磷酸基，
【化1】
2.权利要求1所述的ACTH结合分子，其还具有附加序列。
3.权利要求1所述的ACTH结合分子，其还具有接头。
4.权利要求3所述的ACTH结合分子，其中上述接头是选自直链状合成高分子及直链状天然高分子中的至少1种。
5.权利要求4所述的ACTH结合分子，其中上述直链状合成高分子是选自聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮及聚乙烯基乙酰胺中的至少1种。
6.权利要求4所述的ACTH结合分子，其中上述直链状天然高分子是选自核酸、多糖及蛋白质中的至少1种。
7.载体，其连结了权利要求1所述的ACTH结合分子。
8.ACTH检测用试剂，其含有权利要求1所述的ACTH结合分子。
9.ACTH的检测方法，其包括：
将样品与权利要求1～6中任一项所述的ACTH结合分子或权利要求7所述的载体混合的步骤，以及
在上述步骤得到的混合物中，通过解析ACTH结合分子和ACTH的结合来检测ACTH的步骤。
10.权利要求9所述的方法，其中通过向上述混合物照射光以得到光学信息来解析上述检测步骤中的ACTH结合分子和ACTH的结合。
11.权利要求10所述的方法，其中上述光学信息是反射光的波长、荧光强度或吸光度。
12.ACTH的纯化方法，其包括：
将样品与权利要求7所述的载体混合的步骤，以及
从上述步骤得到的混合物中得到连结到载体的ACTH结合分子和ACTH的复合物的步骤。
13.权利要求9或12所述的方法，其中上述样品是活体样品。
14.权利要求13所述的方法，其中上述活体样品是血液、血浆、血清或体液。
CN201280058613.XA 2011-12-28 2012-12-20 与肾上腺皮质刺激激素结合的分子及其应用 Pending CN103958683A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011289028 2011-12-28
JP2011-289028 2011-12-28
PCT/JP2012/083097 WO2013099762A1 (ja) 2011-12-28 2012-12-20 副腎皮質刺激ホルモンと結合する分子およびその利用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103958683A true CN103958683A (zh) 2014-07-30

Family

ID=48697251

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280058613.XA Pending CN103958683A (zh) 2011-12-28 2012-12-20 与肾上腺皮质刺激激素结合的分子及其应用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9090896B2 (zh)
EP (1) EP2799549B1 (zh)
JP (1) JP5805788B2 (zh)
CN (1) CN103958683A (zh)
WO (1) WO2013099762A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015064223A1 (ja) * 2013-10-31 2015-05-07 国立大学法人 群馬大学 ヌクレオシド誘導体又はその塩、ヌクレオシド誘導体の５'－リン酸エステル又はその塩、ヌクレオシド誘導体の３'－ホスホロアミダイト化物又はその塩、並びにポリヌクレオチド
JP6385185B2 (ja) * 2014-07-29 2018-09-05 シスメックス株式会社 標的ペプチドの種類の判定装置、判定プログラムおよび判定方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003078623A1 (fr) * 2002-03-19 2003-09-25 Fujitsu Limited Molecule fonctionnelle et son procede de production
WO2009028345A1 (ja) * 2007-08-31 2009-03-05 Fujitsu Limited 核酸合成用ダイマーアミダイド及び核酸合成方法
CN102099471A (zh) * 2008-07-14 2011-06-15 国立大学法人东京大学 针对il-17的适配体及其用途

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2104698A1 (en) * 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
ES2604764T3 (es) * 2007-07-17 2017-03-09 Somalogic, Inc. Análisis de muestras de ensayo
ATE505736T1 (de) 2007-09-28 2011-04-15 Max Planck Gesellschaft Streifenleiter-antenne und antennenanordnung für ein magnetresonanzgerät
EP2487180B1 (en) * 2009-10-06 2014-12-03 Riken Novel artificial fluorescent bases
US9540412B2 (en) * 2010-05-13 2017-01-10 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Methods of preparing targeted aptamer prodrugs

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003078623A1 (fr) * 2002-03-19 2003-09-25 Fujitsu Limited Molecule fonctionnelle et son procede de production
WO2009028345A1 (ja) * 2007-08-31 2009-03-05 Fujitsu Limited 核酸合成用ダイマーアミダイド及び核酸合成方法
CN102099471A (zh) * 2008-07-14 2011-06-15 国立大学法人东京大学 针对il-17的适配体及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEIHUA PAN ET AL.: "Minimal primer and primer-free SELEX protocols for selection of aptamers from random DNA libraries", 《BIOTECHNIQUES》 *
王巍 贾凌云: "适配体筛选方法研究进展", 《分析化学》 *
谢海燕 等: "核酸适配体及其在化学领域的相关应用", 《化学进展》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US9090896B2 (en) 2015-07-28
EP2799549A1 (en) 2014-11-05
JP5805788B2 (ja) 2015-11-10
EP2799549A4 (en) 2015-08-12
EP2799549B1 (en) 2016-07-27
US20140322821A1 (en) 2014-10-30
JPWO2013099762A1 (ja) 2015-05-07
WO2013099762A1 (ja) 2013-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8344121B2 (en) Nanoprobes for detection or modification of molecules
JP2022046677A (ja) 親和性試薬を使用する核酸シークエンシング
CN101189337A (zh) 生长素释放肽结合核酸
KR101535709B1 (ko) Pna 앱타머를 이용한 표적 분자의 검출방법
US8703734B2 (en) Nanoprobes for detection or modification of molecules
Li et al. High‐sensitive determination of human α‐thrombin by its 29‐mer aptamer in affinity probe capillary electrophoresis
CN111172166A (zh) 一种特异性识别β-乳球蛋白的核酸适配体及其应用
CN103958683A (zh) 与肾上腺皮质刺激激素结合的分子及其应用
WO2011105071A1 (en) Method for screening nucleic acid ligand
CN109715807A (zh) 分泌型免疫球蛋白A(sIgA)结合核酸分子、sIgA分析用传感器和sIgA分析方法
US10760084B2 (en) α-amylase-binding nucleic acid molecule and use thereof
Rose et al. Capillary electrophoretic development of aptamers for a glycosylated VEGF peptide fragment
JP6128621B2 (ja) マイクロベシクルに対する核酸アプタマー
KR100930974B1 (ko) 레티놀 결합 단백질(ｒｂｐ4)에 특이적으로 결합하는ｄｎａ 앱타머 및 그 제조방법
KR20190031705A (ko) 조류인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도
CN114457083A (zh) 一组特异识别孔雀石绿的单链dna核酸适配体及其应用
CN105821046A (zh) 一种特异性的l-丝氨酸适配体及其用途
KR101678946B1 (ko) 25-하이드록시 비타민 디3에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도
KR101912358B1 (ko) 펙테이트리에이즈 3(Pectate lyase 3)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도
CN109371031A (zh) 一种特异性结合牛血清白蛋白核酸适配体的筛选方法
CN114836426B (zh) 一种结合dkk1蛋白的核酸适配体及其应用
KR20190066811A (ko) 오담(ODAM, Odontogenic Ameloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 그의 용도
KR101616524B1 (ko) 베스핀에 특이적으로 결합가능한 앱타머 및 이를 이용한 바이오 센서
JP2010041951A (ja) 標的分子の検出方法
KR102029803B1 (ko) 부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20140730