KR101912358B1

KR101912358B1 - 펙테이트리에이즈 3(Pectate lyase 3)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101912358B1
Application number: KR1020170055561A
Authority: KR
Inventors: 구만복; 이방현; 정윤민
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2018-10-26

Abstract

본 발명은 펙테이트리에이즈 3(Pectate lyase 3)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 펙테이트리에이즈 검출용 핵산 앱타머, 이를 포함하는 펙테이트리에이즈 3의 검출방법, 검출용 조성물, 검출용 칩, 검출용 센서 및 검출용 키트는 펙테이트리에이즈 3 앱타머의 펙테이트리에이즈 3에 대한 높은 특이성과 결합력을 바탕으로 시료 내 존재하는 펙테이트리에이즈 3의 검출에 유용하다.

Description

펙테이트리에이즈 3(Pectate lyase 3)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도{Nucleic Acid aptamer binding to Pectate lyase 3 with specificity and Uses thereof}

본 발명은 펙테이트리에이즈 3(Pectate lyase 3)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 펙테이트리에이즈 3에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 서로 다른 7종의 핵산 앱타머와 이를 이용한 펙테이트리에이즈 3 검출방법 및 검출용 조성물, 칩, 센서 및 키트에 관한 것이다.

펙테이트리에이즈 3(Pectate lyase 3)는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)의 특이적인 단백질이다. 소나무재선충은 소나무, 곰솔(해송), 잣나무에 소나무재선충병(Pine wilt disease)을 일으키는 선충(Nematode)으로 매개충인 솔수염하늘소(Monochamus alternatus)와 북방수염하늘소(Monochamus saltuarius)에 의해 이동 전파된다. 매개충의 성충은 5월 중순에서 7월 하순 사이 목질부로부터 탈출하여 건전한 나무를 갉아먹는데 이 때 성충의 몸에 기생하던 소나무재선충이 건강한 나무로 이동하고, 이동한 소나무재선충은 나무의 줄기와 가지뿐 아니라 뿌리 속까지 자유롭게 이동하며 나무 속 곰팡이 등을 먹이로 이용한다. 감염된 나무는 수분 및 양분 이동에 이상이 생겨 잎이 처지고 시드는 증상이 나타나는데 병증이 나타나는 시기는 침입한 소나무재선충 양이나 온도에 따라 3주에서 이듬해까지 다양하다. 일본에서 시작된 소나무재선충병은 현재 한국뿐 아니라 미국, 중국, 캐나다, 포르투갈 등 전세계적으로 확산되어 심각한 문제를 일으키고 있다.

현재 소나무재선충병에 대한 방제는 훈증, 소각, 파쇄, 나무주사, 항공살포 등의 다양한 방법으로 이루어지고 있으며, 이러한 방제를 효과적으로 진행하여 소나무재선충병의 확산을 막기 위해서는 빠르고 정확한 예찰이 우선되어야 한다. 현재 소나무재선충을 분류 및 동정하는 방법은 크게 두 가지인데 한가지는 형태학적 차이를 이용하는 것이고 다른 한가지 방법은 분자생물학적 특징인 유전자의 차이를 이용해 분류하는 방법이다. 그러나, 두 가지 방법 모두 전문성을 필요로 하고 시간이 많이 소요되며 지역별 변이가 발생할 수 있다는 점에서 이러한 단점을 보완할 수 있는 새로운 예찰 방법이 필요한 실정이다.

앱타머(aptamer)는 10^12~14 정도의 다양성을 가지는 랜덤 핵산 라이브러리로부터 얻어지는 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA 분자 구조체를 말한다. 또한, 앱타머는 센서 분야에서 이용되는 기존의 감지물질인 항체와는 달리 핵산구조체이므로 열 안정성이 우수하며, 시험관내(in vitro)에서 합성되기 때문에, 동물이나 세포가 따로 필요하지 않아 생산 비용 면에서도 경제적이며, 타겟 물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자 물질부터 환경호르몬, 항생제, 잔류 의약품 등의 저분자 유기화학 물질, 박테리아, 바이러스 등의 다양한 타겟에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 따라서 다양한 타겟 물질에 대한 앱타머가 만들어지고 있으며, 표적 물질과 강한 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약 개발, 약물 전달 시스템 그리고 바이오센서 등에 응용하는 많은 연구가 이루어지고 있다.

따라서, 앱타머는 나무 내 극미량의 펙테이트리에이즈 3 농도 측정에 매우 적절한 물질이며, 이를 활용한 나노 바이오 기술을 통해 소나무재선충의 특정 단백질을 검출하는데도 응용할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 펙테이트리에이즈 3 농도 측정 방법의 개발을 위해 예의 연구 노력한 결과, 펙테이트리에이즈 3에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 DNA 앱타머를 SELEX를 통해 개발하였다. 또한, 상기 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 포함하여 펙테이트리에이즈 3를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 펙테이트리에이즈 3(Pectate lyase 3)를 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는, 펙테이트리에이즈 3(Pectate lyase 3)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머를 이용한 펙테이트리에이즈 3 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 펙테이트리에이즈 3 검출용 조성물, 칩, 센서 및 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 따르면 펙테이트리에이즈 3(Pectate lyase 3)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 이용하여 소나무재선충 감염목 내 펙테이트리에이즈 3를 보다 간편하게 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 펙테이트리에이즈 3 검출방법 및 장치를 이용하여 극소량의 펙테이트리에이즈 3가 포함되어 있는 시료에서 타겟을 선택적으로 측정함으로써 형태학적으로 유사한 타선충과 소나무재선충 간의 차이를 구분할 수 있다. 따라서, 소나무재선충 감염목 시료 내 펙테이트리에이즈 3를 쉽고 빠르게 감지함으로써 정확하고 신속한 소나무재선충병 예찰에 유용하다.

도 1은 앱타머를 이용한 FRET 분석법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 그래핀옥사이드를 이용하여 펙테이트리에이즈 3(Pectate lyase 3)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머 제조 과정의 모식도이다.
도 3은 selection round 에서부터 얻어진 펙테이트리에이즈 3에 결합하는 ssDNA 의 양이 증가함을 보여주는 그래프이다.
도 4 내지 도 10은 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 7의 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 11는 DNA 앱타머의 펙테이트리에이즈 3에 대한 친화도에 대한 FRET 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 DNA 앱타머 Pel3_4R_4-4를 이용하여 펙테이트리에이즈 3와 카운터 타겟인 유사 선충 분비단백질 및 나무 추출 단백질에 대한 SPR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 DNA 앱타머 Pel3_4R_4-4를 이용한 다양한 펙테이트리에이즈 3 농도의 SPR 분석 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 펙테이트리에이즈 3(Pectate lyase 3)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 GO-SELEX 프로세스를 이용하여 선별하였다. 그 결과, 서열번호 1 내지 7의 염기서열로 표시되는 핵산 앱타머가 상기 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

본 발명의 용어 "GO-SELEX 프로세스"란 임의적으로 합성된 DNA 또는 RNA의 집합에서 타겟 물질에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA 또는 RNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 타겟 물질의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법(J.-W. Park, R. Tatavarty, D.W. Kim, H.-T. Jung and M.B. Gu (2012), Immobilization-free screening of aptamers assisted by graphene oxidew, Chemical Communications, 48,15,2071-2073)을 의미한다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는, 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산 앱타머가 RNA인 경우에는 상기 핵산서열에서 T는 U이다.

본 발명의 핵산 앱타머는 GO-SELEX 프로세스에 의해 선택된, 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합하는 임의의 염기서열의 핵산 앱타머일 수 있다.

더욱 구체적으로, 본 발명의 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합할 수 있는 상기 핵산 앱타머는 하기의 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있다:

a) 양끝에 PCR용 프라이머 영역을 포함하고 중앙에 20 내지 50개의 임의의 염기를 가지는 단일가닥 핵산 풀(pool)과 그래핀옥사이드 용액을 혼합하여 그래핀옥사이드에 결합하지 않은 핵산을 제거하는 단계;

b) 상기 혼합액에 타겟물질 또는 카운터 타겟물질을 혼합하여 4 ℃에서 결합을 유도하는 단계;

c) 상기 카운터 타겟물질에 결합하는 타겟 비특이적인 단일가닥 핵산을 제거하고, 그래핀에 결합된 타겟 특이적인 단일가닥 핵산에 대해 타겟에 의한 배좌 변위(Conformational change)를 유발시켜 그래핀으로부터 타겟 특이적인 앱타머를 분리하는 단계;

d) 상기 단계에서 얻은 타겟물질에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산에 대해 상기 PCR용 프라이머 영역을 이용하여 PCR을 수행하여 증폭시키는 단계; 및

e) 상기 단계에서 얻은 PCR 생산물로부터 단일가닥 핵산을 분리하고 상기 단일가닥 핵산을 a) 단계의 혼합액에 첨가하여 그래핀 기반 선별과정을 반복 수행하는 단계.

상기 핵산 앱타머 제조방법의 d) 단계에서, 프라이머 쌍 중 하나에 플루오레세인(fluorescein)이 붙여진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 전기영동을 통해 기 변성된 단일가닥 DNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 다른 관점에서, 본 발명의 핵산 앱타머를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 펙테이트리에이즈 3의 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 검출은 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 또는 SPR(surface plasmon resonance) 분석법으로 검출하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 FRET 분석법은 그 준비의 편리성과 간단한 작동법으로 인해 앱타머의 작동여부를 빠르고 간단하게 확인하는데 적합하다. 소광물질(quencher)인 그래핀옥사이드는 FAM이라는 형광물질과 특정 거리 내에 존재할 때 520nm 근처에서 방출하는 FAM의 빛 에너지를 흡수하며, 이러한 현상을 FRET이라고 한다. 상기 FRET 분석법에 의한 펙테이트리에이즈 3의 검출은 다음과 같은 원리로 이루어진다. FAM으로 3'끝을 표지한 단일가닥 DNA 앱타머와 그래핀옥사이드를 반응시키면 그래핀옥사이드는 단일 가닥 DNA와 π-π결합을 통해 비특이적으로 결합하고, FAM의 형광은 그래핀옥사이드에 의해 소광된다. 이 후 타겟을 넣어주면 앱타머와 타겟 간의 친화도가 그래핀옥사이드와의 친화도보다 높은 경우에는 앱타머가 그래핀옥사이드로부터 떨어져 나와 다시 FAM의 형광이 나타나는 반면, 앱타머와 타겟 사이 친화도가 더 낮은 경우에는 타겟 단백질이 그래핀옥사이드에서 앱타머를 분리하지 못해 소광된 상태를 유지한다. 결합력의 차이가 형광의 방출량 차이로 나타나는 이러한 특성을 바탕으로 형광을 측정함으로써, 앱타머를 사용하여 펙테이트리에이즈 3 유무를 판단할 수 있다.

또한, 상기 SPR 분석법은 매우 민감한 진단법으로 타겟의 존재 양을 민감하게 확인하는데 유용하다. 상기 SPR 분석법을 통한 펙테이트리에이즈 3의 검출은 다음과 같은 원리로 이루어진다. SPR 칩의 금속 표면에 일정 질량 이상이 결합하게 되면 금속표면에 형성되는 플라스몬(plasmon)을 동요시켜 공명 파장 변화를 일으키는데 이는 결과적으로 표면 위 굴절률 변화로 나타난다. SPR 칩 위에 스트렙타아비딘(streptavidin)-비오틴(biotin) 결합을 이용해 앱타머를 고정시키고 그 위로 타겟을 흘려주면 앱타머와 결합한 타겟의 양에 비례하여 SPR 신호가 증가하는 이러한 특성을 바탕으로 SPR을 통해 펙테이트리에이즈 3를 정량적으로 검출할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 시료는 물, 토양, 식물, 선충류 및 곤충류로 구성된 군에서 채취된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 앱타머는 이 기술분야에서 이미 공지된 방법에 의해 화학 합성할 수도 있다.

본 발명의 핵산 앱타머는, 펙테이트리에이즈 3에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기(예를 들어, 리보오스나 디옥시리보오스)가 수식된 것이어도 좋다. 당잔기에서 수식되는 부위로서는, 예컨대 당잔기의 2'부위, 3'부위 및/또는 4'부위의 산소원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대 플루오로화, O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예, -NH)를 들 수 있다. 이러한 당잔기의 변형은, 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다(Sproat et al.,(1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145).

본 발명의 핵산 앱타머는 또한 펙테이트리에이즈 3에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산염기(예를 들면, 푸린, 피리미딘)가 변형(예를 들면, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 변형으로서는, 예컨대 5부위 피리미딘 변형, 6 및/또는 8부위 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환을 들 수 있다.

또한, 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성을 갖도록, 본 발명의 핵산 앱타머에 포함되는 인산기가 변형되어 있어도 좋다. 예컨대 P(0)0기가, P(0)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR₂(아미데이트), P(O)R, R(O)OR', CO 또는 CH₂(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH₂-CH₂-)으로 치환되어 있어도 좋다. 여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다. 연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고, 이들의 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.

본 발명에서의 변형은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 변형을 포함하여도 좋다.

변형은 또한, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(Myristoyl), 리쏘콜릭-올레일(Lithocolic-oleyl), 도코사닐(Docosanyl), 라우로일(Lauroyl), 스테아로일(Stearoyl), 팔미토일(Palmitoyl), 올레오일(Oleoyl), 리놀레오일(Linoleoyl), 그 외 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다. 이러한 변형에 대해서는, 예컨대 미국특허 제5,660,985호, 미국특허 제5,756,703호를 참조한다.

본 발명의 다른 실시 예에서는 상기 서열번호 1 내지 7로 표시되는 핵산 앱타머 중 가장 높은 친화도를 보인 서열번호 1로 표시되는 핵산 앱타머인 Pel3_4R_4-4 에 대하여 FRET 분석 및 SPR 분석을 수행한 결과, 펙테이트리에이즈 3에 해당 앱타머가 특이적으로 결합함을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 펙테이트리에이즈 3 검출용 조성물을 제공한다. 본 발명의 펙테이트리에이즈 3 검출용 조성물은 펙테이트리에이즈 3를 검출하기 위한 것으로, 시료로부터 펙테이트리에이즈 3의 검출을 위해 본 발명의 핵산 앱타머를 이용하여 어떠한 형태로도 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 펙테이트리에이즈 3 검출은 상기 앱타머와 시료를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 시료는 물, 토양, 식물, 선충류 및 곤충류로 구성된 군에서 채취된 것을 특징으로 할 수 있으나, 펙테이트리에이즈 3를 포함하는 시료이면, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합하는 앱타머는 또한, 펙테이트리에이즈 3만을 특이적으로 검출하는바, 이를 포함하여 펙테이트리에이즈 3의 제거용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물을 이용하는 펙테이트리에이즈 3 제거방법의 한 예를 들면, 상기 핵산 앱타머가 고정화된 자성비드를 컬럼(column)에 채운 후 펙테이트리에이즈 3를 포함하는 시료를 통과시켜 펙테이트리에이즈 3를 선택적으로 제거할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 핵산 앱타머를 포함하는 펙테이트리에이즈 3 검출용 칩에 관한 것이다. 상기 검출용 칩은 핵산 앱타머가 기판 상에 고정화된 칩 형태일 수 있으며, 또는 핵산 앱타머가 기판상에 고정화된 마이크로어레이 형태일 수 있다. 핵산 앱타머를 기판상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 상기 기판은 적합한 견고성 또는 반-견고성을 갖는 지지체를 의미하며, 예컨대, 유리, 막(membrane), 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 마이크로어레이는 기판의 특정의 영역에 핵산 물질이 고밀도로 부착된 어레이(배열)를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 칩은 SPR 칩인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 SPR 칩은 SPR 칩 위에 스트렙타아비딘(streptavidin)-비오틴(biotin) 결합을 이용해 앱타머를 고정시키고 그 위로 타겟을 흘려주면 앱타머와 결합한 타겟의 양에 비례하여 SPR 신호가 증가하는 특성을 바탕으로 타겟 단백질을 정량적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 실시 예에서는 상기 서열번호 1 내지 7로 표시되는 핵산 앱타머 중 가장 높은 친화도를 보인 서열번호 1로 표시되는 핵산 앱타머 Pel3_4R_4-4 에 대하여 FRET 분석 및 SPR 분석을 수행한 결과, 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합함을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 있어서 상기 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머는 기판에 고정되어 펙테이트리에이즈 3 검출용 센서의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 센서는 상기 핵산 앱타머를 이용하는 형태이면 모두 이용 가능하나, 바람직하게는 시료 투입부, 시료 이동부 및 검출부로 구성된 스트립 센서일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 펙테이트리에이즈 3 검출용 센서는 소나무재선충병을 구별할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합하는 앱타머를 함유하는 검출 센서 시스템은, 키트(kit)의 형태로 제공될 수 있다. 펙테이트리에이즈 3 검출용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 임의의 염기서열을 가지는 DNA pool 합성

56mer DNA pool로서 양 끝에 PCR을 위한 프라이머 영역(primer region)이 있고 중앙에 임의의 염기를 가진 DNA pool을 아래와 같은 방법으로 합성하였다. 본 발명에 사용된 DNA pool은 Genotech Inc. Korea에 화학적으로 합성을 의뢰하였다.

GTAAGCAGCCTGATGTCG -random region- GACACGGCTCAGTTCATC

서열번호 8: GTAAGCAGCCTGATGTCG

서열번호 9: GACACGGCTCAGTTCATC

실시예 2: GO-SELEX 프로세스를 이용한 펙테이트리에이즈 3에 특이 DNA 앱타머의 선별

실시예 1에서 합성된 랜덤 DNA pool을 버퍼용액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 1.8mM KH₂PO₄)에 넣고 그래핀옥사이드 용액과 혼합하여 30분간 상온에서 반응시킨 후, 그래핀옥사이드와 결합하지 않은 DNA를 제거하기 위해 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 본 혼합액에 타겟(펙테이트리에이즈 3 : 서열번호 10)을 혼합하여 2시간 4 ℃에서 반응시킴으로써 타겟 특이적 DNA의 배좌 변위(Conformational change)를 유발시켜 그래핀옥사이드로부터 분리한 다음, 원심분리를 통해 그래핀옥사이드를 제거한 후 에탄올 침전법으로 타겟에 의해 그래핀옥사이드에서 분리된 DNA를 확보하였다.

GO-Counter SELEX에서는 랜덤 DNA pool과 그래핀옥사이드 혼합액에 카운터 타겟(유사선충 분비 단백질 또는 나무 추출 단백질)을 혼합하여 2시간 4 ℃에서 반응시킨 후 원심분리하여 상층액을 제거함으로써 카운터 타겟에 의해 그래핀옥사이드로부터 분리된 DNA를 제거한 후 타겟을 넣고 2시간 4 ℃에서 반응시켰다. 원심분리를 통해 그래핀옥사이드를 제거한 후 에탄올 침전법으로 타겟에 의해 그래핀옥사이드에서 분리된 DNA를 확보하였다.

이렇게 얻어진 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합하는 DNA의 양을 측정한 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 각 선별단계(selection round)에서 얻어진 펙테이트리에이즈 3에 결합하는 DNA의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 펙테이트리에이즈 3에 결합 가능한 DNA 앱타머 pool의 제조

펙테이트리에이즈 3와 결합 특이적인 DNA의 양을 늘리기 위해 이미 알고 있는 프라이머 영역을 이용하여 PCR을 수행하였다.

PCR 생산물은 두 가닥의 DNA이므로 이를 단일가닥으로 분리하기 위한 과정을 위하여, 아래와 같이 하나의 프라이머에는 플루오레세인(fluorescein)을, 다른 하나의 프라이머에는 poly A를 고정하였다.

forward primer 5-fluorescein- GTAAGCAGCCTGATGTCG-3: 서열번호8

reverse primer 5-polyA(A20)-C18 spacer-GACACGGCTCAGTTCATC-3: 서열번호 9

PCR 반응물을 정제키트(purification kit)를 이용하여 정제한 후, 이중가닥의 DNA를 단일가닥으로 만들기 위해 폴리아크릴아마이드젤 전기영동을 실시하였다.

8%의 폴리아크릴아마이드 젤에는 6M의 요소(urea), 20%의 포름아마이드(formamaid)가 포함되어 있어 전기영동 후에는 두 개의 밴드가 생기는데, 이는 전기영동 과정에서 두 가닥의 DNA가 변성되어 플루오레세인이 붙어있는 DNA 가닥은 위에, 붙어있지 않은 DNA 가닥은 아래에 각각 위치하게 된다. 플루오레세인이 붙어 있는 DNA 밴드를 잘라내어 젤 추출(gel extraction)을 실시한 후 다시 에탄올 침전법으로 분리된 DNA를 확보하였다.

이 때 확보된 DNA pool은 다시 처음의 타겟이 들어 있는 버퍼용액과 혼합하여 새로운 선별과정을 시작한다. 이러한 과정의 모식도를 도 2 에 나타내었고, 일련의 과정(SELEX process)을 한 번의 선별 (selection)이라 하면 GO-SELEX 는 총 4번의 선별과정과 1번의 카운터 선별과정을 거쳐 펙테이트리에이즈 3에 결합하는 DNA pool을 얻었다.

최종적으로 얻어진 DNA pool을 Qiagen cloning kit를 이용하여 클로닝(cloning)하고 얻어진 콜로니에서부터 DNA를 추출하여 염기분석을 시행할 결과 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합하는 핵산 구조체를 확보하였다.

실시예 4: DNA 앱타머의 염기서열 분석 및 특이성 분석

펙테이트리에이즈 3 높은 친화도를 가지고 결합하는 DNA의 염기서열을 분석한 결과를 하기 표 1에 제시하였다. 또한, 이 펙테이트리에이즈 3 앱타머의 2차 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 예측한 결과를 도 4 내지 도 10에 나타내었다.

펙테이트리에이즈 3에 높은 친화도를 가지고 결합하는 DNA 앱타머의 염기서열

서열번호	앱타머	염기서열
1	Pel3_4R_4-4	GTAAGCAGCCTGATGTCGCCTTTCGATGCTTTATCTTCGACACGGCTCAGTTCATC
2	Pel3_5R_63	GTAAGCAGCCTGATGTCGGGTGTTTGTATTGGATTTGGGACACGGCTCAGTTCATC
3	Pel3_5R_115	GTAAGCAGCCTGATGTCGGTTGTGTGCCGTATACCATGGACACGGCTCAGTTCATC
4	Pel3_5R_117	GTAAGCAGCCTGATGTCGGTTGCAATTCTAAAAACTCGGACACGGCTCAGTTCATC
5	Pel3_5R_121	GTAAGCAGCCTGATGTCGCCTATCCATCTTTGTTCTCCGACACGGCTCAGTTCATC
6	Pel3_5R_174	GTAAGCAGCCTGATGTCGTGCGGGGTTTCCCAAACTCGGACACGGCTCAGTTCATC
7	Pel3_5R_191	GTAAGCAGCCTGATGTCGTATGTTATCTCTGTCTATTGGACACGGCTCAGTTCATC

상기의 DNA 앱타머의 펙테이트리에이즈 3에 대한 친화도는 다음과 같이 FRET 분석법을 통하여 확인하였다.

3'말단에 FAM을 연결한 DNA 16nM과 20분간 초음파처리한 그래핀옥사이드 6.4ug/ml를 각 125ul을 상온에서 30분간 로테이터 상에서 반응시킨 후 64nM의 펙테이트리에이즈 3를 250ul 첨가해 추가로 30분간 반응시켰다. 그 후 검은 96-well 플레이트 상에서 멀티플레이트리더기를 이용하여 형광 값을 측정하였으며, 이 때 여기파장(excitation wavelength)은 480nm를 사용하였다. DNA와 그래핀옥사이드 두 가지 만을 반응시켰을 때 나타나는 형광값을 F₀로 하고 펙테이트리에이즈 3와 반응했을 때 형광값을 F라고 하였을 때 (F-F₀)/F₀ 결과 값을 확인한 결과, 도 11에 개시된 바와 같이, 본 발명의 앱타머가 펙테이트리에이즈 3에 대해 높은 친화도를 가지고 결합하는 것을 확인할 수 있었다..

서로 다른 7종의 펙테이트리에이즈 3와 결합하는 앱타머 중에서 FRET 분석법 결과 가장 높은 친화도를 보인 앱타머인 Pel3_4R_4-4의 특이성을 다음과 같이 SPR 분석법을 통하여 확인하였다.

SPR 금칩(gold chip)을 DTPA(Dithiophosphoric acid)로 처리 후 칩의 금 표면을 200mM EDC/50mM NHS (Carbodiimide/ N-Hydroxysuccinimide)에서 1시간, 100ug/ml 스트렙타아비딘 1시간 30분, 50mM 에탄올아민 30분, 비오틴 표지한 앱타머 1uM 1시간, 50ug/ml BSA 1시간을 차례로 상온에서 반응시켰다. 매 단계 3차 증류수로 금 표면을 씻어내고 질소 건을 이용해 건조 시켜주는 과정을 반복하고, 상기 과정을 통해 앱타머를 고정시킨 SPR 칩을 SPR 기계에 삽입하고 칩 위로 버퍼 용액 (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 1.8mM KH₂PO₄) 10분, 타겟 단백질(펙테이트리에이즈 3), 혹은 카운터 타겟(유사선충 분비 단백질 또는 나무 추출 단백질) 10분, 버퍼용액 10분을 30ul/sec로 흘려주었다. SPR 기계로 mdegree값을 측정한 결과, 도 12에 개시된 바와 같이, 본 발명의 앱타머가 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: DNA 앱타머의 펙테이트리에이즈 3와의 결합력 분석

서로 다른 7종의 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합하는 앱타머 중에서 가장 특이도가 높은 앱타머인 Pel3_4R_4-4 앱타머와 다양한 농도의 펙테이트리에이즈 3와의 결합을 분석하였다.

위와 같은 방법으로 앱타머 Pel3_4R_4-4를 고정시킨 SPR 칩을 SPR 기계에 삽입 후 PBS 10분, 샘플 10분, PBS 10분을 차례로 흘려주었으며, 이 때 샘플은 0nM부터 200nM(5.1746ug/ml)까지 7가지 농도의 펙테이트리에이즈 3이다. SPR 기계로 mdegree값을 측정한 결과, 도 13에 개시된 바와 같이, 본 발명의 앱타머는 농도에 비례하여 펙테이트리에이즈 3에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea University Research & Business Foundation <120> Pectate lyase 3 <130> 073 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 1 gtaagcagcc tgatgtcgcc tttcgatgct ttatcttcga cacggctcag ttcatc 56 <210> 2 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 2 gtaagcagcc tgatgtcggg tgtttgtatt ggatttggga cacggctcag ttcatc 56 <210> 3 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 3 gtaagcagcc tgatgtcggt tgtgtgccgt ataccatgga cacggctcag ttcatc 56 <210> 4 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 4 gtaagcagcc tgatgtcggt tgcaattcta aaaactcgga cacggctcag ttcatc 56 <210> 5 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 5 gtaagcagcc tgatgtcgcc tatccatctt tgttctccga cacggctcag ttcatc 56 <210> 6 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 6 gtaagcagcc tgatgtcgtg cggggtttcc caaactcgga cacggctcag ttcatc 56 <210> 7 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 7 gtaagcagcc tgatgtcgta tgttatctct gtctattgga cacggctcag ttcatc 56 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 8 gtaagcagcc tgatgtcg 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 9 gacacggctc agttcatc 18 <210> 10 <211> 240 <212> PRT <213> Bursaphelenchus xylophilus <400> 10 Gln Phe Gly Thr Trp Pro Asn Pro Lys Ser Thr Gln Lys Val Pro Lys 1 5 10 15 Thr Ile Glu Val Lys Ala Gly Thr Val Phe Asp Gly Lys Met Glu Arg 20 25 30 Tyr Val Ser Gly Phe Ala Asp Gly Gly Ile Glu Glu Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Ile Phe Leu Leu Gly Asp Gly Ala Thr Ile Gln Asn Leu Val Ile Ser 50 55 60 Tyr Pro Ala Ala Asp Gly Ile His Cys Asn Gly Ser Cys Lys Ile Glu 65 70 75 80 Asn Val Trp Trp Glu Asp Val Gly Glu Asp Ala Ala Thr Phe Leu Gly 85 90 95 Glu Lys Asn Ala Val Tyr Ser Val Thr Gly Gly Gly Ala Lys Lys Gly 100 105 110 His Asp Lys Val Phe Gln His Asn Gly Gly Gly Thr Leu Thr Ile Lys 115 120 125 Asn Phe Gln Gly Glu Asp Ile Gly Arg Leu Tyr Arg Ser Cys Gly Asn 130 135 140 Cys Asn Ile Asn Gly Lys Phe Asp Arg His Val Ile Ile Asp Asn Val 145 150 155 160 Lys Val Ile Gly Pro Cys Leu Ser Leu Ala Cys Val Asn Gly Asn Tyr 165 170 175 Gly Asp Ser Ala Thr Leu Thr Asp Val Gln Ile Ser Gly Ala Val Thr 180 185 190 Ser Ile Cys Gln Asp Thr Gln Gly Asn Asn Val Glu Thr Leu Pro Pro 195 200 205 Val Asn Gln Leu Tyr Val Ala Asp Gln Asp Gly Asp Gly Lys Val Cys 210 215 220 Asn Tyr Lys Lys Thr Asp Val Lys Lys Phe His His His His His His 225 230 235 240

Claims

서열번호 1 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 표시되는, 펙테이트리에이즈 3(Pectate lyase 3)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머:
여기서, 상기 핵산 앱타머가 RNA인 경우에는 상기 핵산서열에서 T는 U임을 특징으로 함.
다음 단계를 포함하는 펙테이트리에이즈 3의 검출방법:
(a) 펙테이트리에이즈 3를 함유하는 시료와 제1항의 핵산 앱타머를 접촉시켜, 펙테이트리에이즈 3-앱타머 복합체를 수득하는 단계; 및
(b) (a) 단계에서 수득된 복합체를 검출하는 단계.
제2항에 있어서, 상기 (b) 단계는 복합체를 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 또는 SPR(surface plasmon resonance) 분석법으로 검출하는 것을 특징으로 하는 펙테이트리에이즈 3의 검출방법.
제2항에 있어서, 상기 시료는 물, 토양, 식물, 선충류 및 곤충류로 구성된 군에서 채취된 것을 특징으로 하는 펙테이트리에이즈 3의 검출방법.
제1항의 핵산 앱타머를 포함하는 펙테이트리에이즈 3 검출용 조성물.
제1항의 핵산 앱타머를 포함하는 펙테이트리에이즈 3 검출용 칩.
제1항의 핵산 앱타머를 포함하는 펙테이트리에이즈 3 검출용 센서.
제1항의 핵산 앱타머를 포함하는 펙테이트리에이즈 3 검출용 키트.