CN102099471A - 针对il-17的适配体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了针对IL-17的高质量适配体。具有针对IL-17的抑制活性的适配体；包含具有针对IL-17的结合活性或抑制活性的适配体和功能性物质(例如亲和性物质、标记用物质、酶、药物递送介质、药物等)的复合物；药物、诊断试剂或标记试剂，其中包含：具有针对IL-17的结合活性或抑制活性的适配体、或者含该适配体和功能性物质的复合物。

Description

针对IL-17的适配体及其用途
技术领域
本发明涉及针对IL-17的适配体以及利用该适配体的方法等。
背景技术
白细胞介素17(IL-17或CTLA-8)是由Th17细胞分泌的细胞因子，与炎性疾病、自身免疫疾病和感染性疾病密切相关。人IL-17是由在N末端包含信号肽的155个氨基酸构成的20-30kDa的糖蛋白。在其分子结构中，存在6个半胱氨酸残基和1处结合N的糖链结合位点。成熟形式由136个氨基酸组成，通常以二聚体存在。
作为IL-17家族的蛋白，已知有6种蛋白：IL-17A、B、C、D、E和F。一般而言，IL-17是指IL-17A。IL-17E也称作IL-25。人IL-17与人IL-17B、C、D、E和F的氨基酸序列的同源性分别是25％、28％、22％、27％和44％，IL-17F的同源性最高。人IL-17与小鼠IL-17和狨猴IL-17的同源性分别是63％和90％。作为其受体，IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE是已知的。IL-17和IL-17F形成同源双体或异源双体，并且与IL-17RA和IL-17RC结合。IL-17与IL-17RA的结合较弱，其Kd值为大约10-7，这说明IL-17RC的参与可能具有重要意义。
Th17细胞是产生IL-17的CD4+T细胞。当在体外用IL-23刺激记忆CD4+T细胞时，会诱导IL-17的产生。另一方面，TGF-β和IL-6在Th17细胞的分化诱导中具有重要作用。TGF-β和IL-6作用于幼稚T细胞(naive Tcell)以诱导RORgt(转录因子)的表达。由于RORgt的缺乏导致Th17细胞不能分化，另外通过强制表达的RORgt使幼稚T细胞能够被相反地分化为产生IL-17的细胞，所以该转录因子被认为对于Th17细胞分化具有重要意义。虽然通过IL-6激活STAT3对于诱导RORgt的表达具有重要意义，但是通过IL-2激活STAT5相反地抑制表达。IL-2对于调节性T细胞的分化是必需的；IL-2缺失型小鼠会遭受严重的自身免疫；这被认为是由于调节性T细胞的减少和同时发生的Th17细胞的过度分化。当在体外用单独的TGF-β刺激幼稚T细胞时，会诱导调剂性T细胞而非Th17。Th1细胞产生的IFN-γ、Th2细胞产生的IL-4等对于Th17细胞的分化具有抑制作用。
当IL-17结合至受体时，NF-κB途径、MAP激酶途径和C/EBP途径经由Act-1和TRAF6被激活，这导致炎性细胞因子和趋化因子的诱导。例如，IL-17作用于巨噬细胞以诱导IL-1、TNF、MMP-9等的表达。此外，已知IL-17还作用于结缔组织系统细胞，例如成纤维细胞和内皮细胞，并且作用于免疫系统细胞，例如树突细胞祖细胞，以诱导各种细胞因子和受体例如IL-6、IL-1和ICAM-1的表达。
诸如TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的细胞因子参与IL-17的产生。另一方面，IL-17诱导这些细胞因子的产生。已知IL-17与其它细胞因子协同作用。
已经发现IL-17与炎性疾病、自身免疫疾病等密切相关。已知在具有慢性风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、贝赫切特病、移植排斥、肾炎综合征、炎性肠病、哮喘、多发性硬化、牙周病等的患者中，IL-17的表达升高。已经报道在IL-17缺失型小鼠中，胶原诱导的关节炎(CIA)(其为慢性风湿性关节炎的模型)、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(其为多发性硬化的模型)、DNFB或TNCB引起的接触型超敏反应、甲基化的BSA引起的延迟型超敏反应、OVA诱导的呼吸道超敏反应等被显著抑制。
IL-17还与癌症相关。已经报道：向SCID小鼠皮下移植非小细胞肺癌细胞会促进高度表达IL-17的小鼠中癌细胞的增殖。还已经报道：IL-17也与宫颈癌和卵巢癌相关。
IL-17与感染性疾病相关。IL-17R敲除小鼠对于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)感染、白色念珠菌(Candida albicans)感染、刚地弓形虫(Toxsoplasma gondii)感染等具有高度易感性。脂多糖(LPS)和细菌细胞体成分、例如伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)和肺炎克雷伯氏菌的细胞体成分诱导IL-17的产生。认为这些成分通过作用于抗原呈递细胞以诱导IL-23，从而促进IL-17的产生。在IL-17R敲除小鼠中，在感染肺炎克雷伯氏菌之后，在肺部的感染位点上，CXCL1、CXCL2、G-CSF等(它们在嗜中性粒细胞的迁移和功能中具有重要作用)的产生会下降，发现嗜中性粒细胞的迁移被破坏。
近年来，RNA适配体(aptamer)应用于治疗药物、诊断试剂和测试试剂已经引起了人们的注意；一些RNA适配体已经处于临床研究阶段或处于实际应用中。在2004年12月，世界上首例RNA适配体药物即Macugen在美国被批准作为用于年龄相关的黄斑变性的治疗药物。RNA适配体是指特异性结合靶分子例如蛋白质的RNA，并且其可以使用SELEX法(指数富集配体系统进化法)来制备(国际专利公布WO91/19813、WO94/08050、WO95/07364)。在SELEX法中，从具有大约1014个不同的核苷酸序列的RNA库中选择特异性结合靶分子的RNA。使用的RNA具有大约40个残基的随机序列，其两翼为引物序列。使该RNA库与靶分子混合，只有那些与靶分子结合的RNA被回收(使用过滤器等)。通过RT-PCR扩增所回收的RNA，将其用作下一轮的模板。通过重复该操作大约10次，可以获得特异性结合靶分子的RNA适配体。
[现有技术文献]
[专利文献]
专利文献1：WO91/19813
专利文献2：WO94/08050
专利文献3：WO95/07364
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明旨在提供针对IL-17的适配体，和利用该适配体的方法等。
解决技术问题的方法
本发明人长期不懈地研究以解决以上描述的问题，并且成功地制备了针对IL-17的高质量适配体，这使本发明得以完成。
因此，本发明提供了以下内容：
[1]与IL-17结合的适配体；
[2]抑制IL-17与IL-17受体结合的适配体；
[3]抑制IL-17与IL-17受体结合但不抑制IL-17F与IL-17受体结合的适配体；
[4]抑制IL-17与IL-17受体结合并包含SEQ ID NO：58的序列的适配体；
[5]抑制IL-17与IL-17受体结合并包含SEQ ID NO：59或60的序列的适配体；
[6][4]或[5]中描述的适配体，其中嘧啶核苷酸是修饰的核苷酸；
[7][1]的适配体，其是以下的(a)或(b)的任一种：
(a)包含选自SEQ ID NO：1-54中的核苷酸序列(条件是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的适配体，其中所述适配体中包含的核苷酸是这样的：
(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2’位是相同的或不同的，并且是氟原子或被选自氢原子、羟基和甲氧基的原子或基团取代，和
(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2’位是相同的或不同的，并且是羟基或被选自氢原子、甲氧基和氟原子的原子或基团取代；
(b)包含选自SEQ ID NO：1-54中的核苷酸序列(条件是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的适配体，其中一个或数个核苷酸被替换、缺失、插入或添加，其中所述适配体中包含的核苷酸是这样的：
(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2’位是相同的或不同的，并且是氟原子或被选自氢原子、羟基和甲氧基的原子或基团取代，和
(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2’位是相同的或不同的，并且是羟基或被选自氢原子、甲氧基和氟原子的原子或基团取代；
[8][7]中描述的适配体，其包含SEQ ID NO：58、59或60的序列；
[9][7]中描述的适配体，其包含SEQ ID NO：40或44的序列；
[10][1]至[9]中任一项描述的适配体，其中所述适配体中包含的核苷酸是被修饰的；
[11]包含[1]至[10]中任一项描述的适配体和功能性物质的复合物；
[12]根据[11]的复合物，其中所述功能性物质是亲和性物质、标记用物质、酶、药物递送介质或药物；
[13]包含[1]至[10]中任一项描述的适配体或者[11]或[12]中描述的复合物的药物；
[14]用于治疗或预防自身免疫疾病、癌症、过敏症或其它与炎症相关的疾病的药物，其包含[1]至[10]中任一项描述的适配体或者[11]或[12]中描述的复合物；
[15]包含[1]至[10]中任一项描述的适配体或者[11]或[12]中描述的复合物的诊断试剂；
[16]包含[1]至[10]中任一项描述的适配体或者[11]或[12]中描述的复合物的IL-17检测探针；
[17]包含[1]至[10]中任一项描述的适配体或者[11]或[12]中描述的复合物的用于纯化IL-17的固相载体；
[18]检测IL-17的方法，该方法包括使用[1]至[10]中任一项描述的适配体或者[11]或[12]中描述的复合物；和
[19]纯化IL-17的方法，该方法包括使用[1]至[10]中任一项描述的适配体或者[11]或[12]中描述的复合物。
发明效果
本发明的适配体或复合物可用作药物或诸如诊断试剂的试剂，该药物或试剂用于炎性疾病和诸如癌症、过敏症、感染性疾病等疾病。本发明的适配体或复合物还可用于纯化和浓缩IL-17、标记IL-17，以及检测和定量IL-17。
附图说明
图1显示了由MFOLD程序预测的SEQ ID NO：1所示的适配体的二级结构，其中黑色圆圈中包括的部分表示共同序列。
图2显示了由MFOLD程序预测的SEQ ID NO：2所示的适配体的二级结构，其中黑色圆圈中包括的部分表示共同序列。
图3显示了由MFOLD程序预测的SEQ ID NO：29所示的适配体的二级结构，其中黑色圆圈中包括的部分表示共同序列。
图4显示了由MFOLD程序预测的SEQ ID NO：7所示的适配体的二级结构，其中方框中包括的部分和*(星号)表示共同序列。
图5显示了由MFOLD程序预测的SEQ ID NO：13所示的适配体的二级结构，其中方框中包括的部分和*(星号)表示共同序列。
图6显示了由MFOLD程序预测的SEQ ID NO：30所示的适配体的二级结构，其中方框中包括的部分和*(星号)表示共同序列。
图7是传感图，其显示了SEQ ID NO：1所示的适配体(Apt1)与人IL-17结合。
图8是传感图，其显示了SEQ ID NO：1所示的适配体(Apt1)不与人IL-17F结合。
图9显示了由MFOLD程序预测的SEQ ID NO：40所示的适配体的二级结构，其中黑色圆圈中包括的部分表示共同序列。
图10显示了由MFOLD程序预测的SEQ ID NO：44所示的适配体的二级结构，其中方框中包括的部分和*(星号)表示共同序列。
图11是传感图，其显示了SEQ ID NO：1所示的适配体(Apt1)抑制人IL-17与人IL-17R的结合。
图12显示：SEQ ID NO：44所示的适配体具有对IL-17信号传导的抑制活性。黑色圆圈表示对照DNA的结果，黑色三角形表示抗IL-17中和抗体的结果，黑色方框表示适配体的结果。
图13显示了适配体在小鼠EAE模型中的发病抑制实验的结果。黑色圆圈表示对照组的结果，黑色方框表示1mg/kg适配体给药组的结果，黑色三角形表示3mg/kg适配体给药组的结果，×表示10mg/kg适配体给药组的结果。各个*(星号)代表P＜0.05，各个**代表P＜0.01。
具体实施方式
本发明提供了对IL-17具有结合活性的适配体。本发明的适配体能够抑制IL-17的活性。
适配体是指具有对于特定靶分子的结合亲和性的核酸分子。适配体还可以通过与特定靶分子结合而抑制特定靶分子的活性。本发明的适配体可以是RNA、DNA、修饰的核酸或它们的混合物。本发明的适配体还可以是直链状或环状的形态。
针对IL-17的抑制活性是指，抑制IL-17所具有的任意选择的活性的能力。例如，IL-17作用于免疫系统细胞、结缔组织系统细胞等以诱导产生各种细胞因子和趋化因子。因此，针对IL-17的抑制活性是指抑制产生这些细胞因子、趋化因子等的活性。由于这些细胞因子和趋化因子的表达诱导炎性细胞的迁移和激活，所以针对IL-17的抑制活性意味着抑制其活性。
IL-17是指Th17细胞产生的细胞因子，Th17细胞是CD4+T细胞，IL-17是例如具有登记号AAH67505或NP002181所示的氨基酸序列的蛋白质。IL-17有时被称作IL-17A或CTLA-8。本发明所示的IL-17除了在动物体内产生之外，还可以使用小鼠和其它哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌等的细胞来制备，还可以通过化学合成来制备。当通过细胞培养或化学合成来制备IL-17时，可以容易地制备突变体。在本文中，突变体是指其中数个氨基酸被替换的序列，或者部分氨基酸序列，并且意指具有本来IL-17所具有的至少一种活性的蛋白或肽。当氨基酸被替换时，替换氨基酸可以是天然存在的氨基酸，或者可以是非天然存在的氨基酸。在本发明中提及的IL-17包括这些突变体。
IL-17受体意思是IL-17所结合的细胞表面蛋白。作为IL-17受体家族的成员，IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE是已知的。在本发明中提及的IL-17受体可以是包含天然存在的氨基酸序列的蛋白，或者是其突变体。在本文中，突变体是指其中数个氨基酸被替换的序列，或者部分氨基酸序列，并且意指具有对于IL-17的结合活性的蛋白或肽。本发明提供了抑制IL-17与IL-17受体结合的适配体。
本发明的适配体可以显示出针对源自任何哺乳动物的IL-17的抑制活性。此类哺乳动物包括灵长类(例如，人、猴)、啮齿类(例如，小鼠、大鼠和豚鼠)、宠物、家畜和役畜(例如，狗、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪)。
本发明的适配体没有特别限制，只要其能够结合IL-17的任意选择的部分以抑制其活性。适配体优选为抑制IL-17与IL-17受体结合的适配体，其包含序列ggauagcgaagucauugagcgcc(SEQ ID NO：40)。该序列包括后述的SEQ ID NO：1、2和29所示的核苷酸序列的共同序列(SEQ ID NO：58)，并且具有使用MFOLD程序所预测的相同的二级结构(见图9)。
虽然本发明的适配体没有特别限制，只要其能够结合IL-17的任意选择的部分以抑制其活性，但所述适配体优选为抑制IL-17与IL-17受体结合、并且包含序列ggucuagccggaggagucaguaaucgguagacc(SEQ ID NO：44)的适配体。该序列包括后述的SEQ ID NO：6-21、30和31所示的核苷酸序列的共同序列(SEQ ID NO：59)(或者后述的SEQ ID NO：7、9、13、21和30所示的核苷酸序列的共同序列(SEQ ID NO：60)，并且具有使用MFOLD程序所预测的相同的二级结构(见图10)。
虽然本发明的适配体没有特别限制，只要其能够结合IL-17的任意选择的部分以抑制其活性，但所述适配体优选为抑制IL-17与IL-17受体结合的适配体，其包含序列gauagcgaagucauugagcgc(SEQ ID NO：58)。该序列是后述的SEQ ID NO：1、2和29所示的核苷酸序列的共同序列，并且具有使用MFOLD程序所预测的相同的二级结构(见图1-3)。
虽然本发明的适配体没有特别限制，只要其能够结合IL-17的任意选择的部分以抑制其活性，但所述适配体优选为抑制IL-17与IL-17受体结合的适配体，其包含序列ggagucag(SEQ ID NO：59)。该序列是后述的SEQID NO：6-21、30和31所示的核苷酸序列的共同序列，并且具有使用MFOLD程序所预测的相同的二级结构(见图4-6)。
本发明的适配体优选为抑制IL-17与IL-17受体结合的适配体，其包含序列ggaggagucaguaauc(SEQ ID NO：60)。该序列是后述的SEQ ID NO：7、9、13、21和30所示的核苷酸序列的共同序列，并且具有使用MFOLD程序所预测的相同的二级结构(见图4-6)。
本发明的适配体的长度没有特别限制，通常可以是大约10至大约200个核苷酸，可以是例如，不超过大约100个核苷酸，优选不超过大约50个核苷酸，更优选不超过大约40个核苷酸，最优选不超过大约35个核苷酸。当核苷酸的总数目较小时，化学合成和大量生产将较容易，就成本而言具有较大的优势。还考虑到化学修饰容易，体内稳定性高，毒性低。
本发明的适配体中包含的各核苷酸是相同的或不同的，并且可以是在核糖(例如嘧啶核苷酸的核糖，嘌呤核苷酸的核糖)的2’位包含羟基的核苷酸(即，非取代的核苷酸)，或者，通过任意原子或基团在核糖的2’位进行取代(修饰)的核苷酸(在本发明中有时称作“取代的核苷酸”或“修饰的核苷酸”)。
任意此类原子或基团的实例，可以提及被氢原子、氟原子或者-O-烷基(例如-O-甲基)、-O-酰基(例如-O-CHO基团)、氨基(例如-NH2基团)取代的核苷酸。本发明的适配体还可以是修饰的核苷酸，其中至少一种(例如1、2、3或4种)核苷酸包括在核糖的2’位的羟基，或上述的任意原子或基团，例如，选自氢原子、氟原子、羟基和-O-甲基的至少两种(例如，2、3或4种)基团。
在本发明的适配体中，所有的嘧啶核苷酸是相同的或不同的，每个可以是在核糖的2’位被氟原子取代的核苷酸，或在核糖的2’位被上述任意原子或基团(优选选自氢原子、羟基和甲氧基的原子或基团)取代的核苷酸。
在本发明的适配体中，所有的嘌呤核苷酸是相同的或不同的，每个可以是在核糖的2’位被羟基取代的核苷酸，或者在核糖的2’位被上述任意原子或基团(优选选自氢原子、甲氧基和氟原子的原子或基团)取代的核苷酸。
本发明的适配体还可以是这样的适配体，其中所有的核苷酸在核糖的2’位都包含羟基，或上述任意原子或基团，例如，选自氢原子、氟原子、羟基和-O-甲基的相同基团。
本发明的适配体还可以具有“能够抑制IL-17的活性，但不能抑制IL-17F的活性”的特征。本发明的适配体还可以具有“能够抑制IL-17与IL-17受体结合，但不能抑制IL-17F与IL-17受体结合”的特征。IL-17F是具有44％的同源性的IL-17家族的蛋白，与IL-17最为相似。
本发明的适配体还可以是：
(a)包含选自SEQ ID NO：1-54的核苷酸序列(条件是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的适配体；
(b)包含选自SEQ ID NO：1-54的核苷酸序列(条件是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的适配体，其中一个或数个核苷酸被替换、缺失、插入或添加；或
(c)选自下列的缀合物：上述适配体(a)的多缀合物、上述适配体(b)的多缀合物、以及上述适配体(a)和(b)的多缀合物。
上述(a)至(c)中优选的是这样的(a)至(c)，其中选自SEQ ID NO：1-54的核苷酸序列是SEQ ID NO：58、59或60的序列。
上述(a)至(c)中优选的是这样的(a)至(c)，其中选自SEQ ID NO：1-54的核苷酸序列是SEQ ID NO：40或44的序列。
在上述(b)中，对于替换、缺失、插入或添加的核苷酸的数目没有限制。核苷酸的数目可以是例如，不超过大约30个，优选不超过大约20个，更优选不超过大约10个，更优选不超过大约5个，最优选为4、3、2或1个。在上述(c)中，可以通过串联结合达到缀合。在缀合时可以使用连接体。作为连接体，有核苷酸链(例如1至大约20个核苷酸)和非核苷酸链(例如-(CH2)n-连接体、-(CH2CH2O)n-连接体、六甘醇连接体、TEG连接体、含肽的连接体、含-S-S-键的连接体、含-CONH-键的连接体、含-OPO3-键的连接体)。上述多缀合物中提及的多个没有特别限制，只要其是2个以上，例如可以是2、3或4个。
上述(a)至(c)的各核苷酸，不论是相同还是不同，可以是在核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖)的2’位包含羟基的核苷酸，或者在核糖的2’位被任意基团(例如氢原子、氟原子或-O-甲基)取代的核苷酸。
例如，本发明的适配体可以是这样的适配体，其中上述(a)至(c)中包含的核苷酸是这样的：
(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2’位是相同的或不同的，并且被氟原子取代，或被任意上述原子或基团、优选选自氢原子、羟基和甲氧基的原子或基团取代；和
(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2’位是相同的或不同的，并且被羟基取代，或被任意上述原子或基团、优选选自氢原子、甲氧基和氟原子的原子或基团取代。本发明还提供了上述适配体。
本发明的适配体可以是这样的适配体，其中每个核苷酸的糖残基(例如核糖)被修饰以增加对IL-17的结合活性、稳定性、药物递送性等。糖残基中被修饰的实例有：糖残基的2’位、3’位和/或4’位的氧原子替换为另一种原子等等。作为修饰的种类有：氟化、O-烷基化(例如O-甲基化、O-乙基化)、O-芳基化、S-烷基化(例如S-甲基化、S-乙基化)、S-芳基化、胺化(例如-NH2)。可以通过本身已知的方法进行糖残基中的此类改变(参见，例如Sproat等人，(1991)Nucl.Acid.Res.19，733-738；Cotton等人，(1991)Nucl.Acid.Res.19，2629-2635；Hobbs等人，(1973)Biochemistry 12，5138-5145)。
本发明的适配体还可以具有改变的(例如化学替换)核酸碱基(例如嘌呤或嘧啶)以增加对IL-17的结合活性等。此类改变的实例有：5-位的嘧啶改变、6-和/或8-位的嘌呤改变、用环外胺(extracyclic amine)的改变、用4-硫尿苷的替换、用5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶的替换。本发明的适配体中包含的磷酸基团(phosphate group)可以改变以赋予对核酸酶和水解的抗性。例如P(O)O基团可以用P(O)S(硫代酯(thioate))、P(S)S(二硫代酯)、P(O)NR2(酰胺化物)、P(O)R、R(O)OR’、CO或CH2(甲缩醛(formacetal))或3’-胺(-NH-CH2-CH2-)替换[其中每个R或R’单元独立地是H或者是取代或非取代的烷基(例如甲基、乙基)]。
连接基团是例如-O-、-N-或-S-，并且核苷酸可以通过这些连接基团结合至相邻的核苷酸。
改变还可以包括这样的改变：例如在3’和5’加帽。
改变还可以通过进一步向末端添加聚乙二醇、氨基酸、肽、反向dT、核酸、核苷、十四酰、石胆酸-油烯基(Lithocolic-oleyl)、二十二酰(docosanyl)、月桂酰、硬脂酰、棕榈酰、油酰、亚油酰(linoleoyl)、其它脂质、甾族化合物、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光物质、抗癌剂、毒素、酶、放射活性物质、生物素等来进行。对于此类改变，参见例如美国专利5,660,985和5,756,703。
本发明的适配体可以按照本说明书中的公开和本领域中本身已知的方法化学合成。适配体与靶分子结合的方式是多种多样的，例如基于磷酸基团的负电荷的离子键、基于核糖的疏水键和氢键、基于核酸碱基的氢键和堆积相互作用(stacking interaction)。特别地，基于磷酸基团的负电荷的离子键(其以与构成核苷酸的数目相同的数目存在)是较强的，并且与存在于蛋白质表面的赖氨酸和精氨酸的正电荷结合。因此，不参与直接与靶分子结合的核酸碱基可以被替换。特别地，由于主干(stem)结构的部分已经形成碱基对并且朝向双螺旋结构的内侧，所以核酸碱基不可能直接与靶分子结合。因此，即使碱基对被替换为另一碱基对，适配体的活性通常也不会降低。在其中不形成碱基对的结构中(例如环结构)，只要核酸碱基不参与直接与靶分子的结合，就可能进行碱基替换。关于核糖的2’位的修饰，核糖的2’位的官能团甚少直接与靶分子相互作用，但是在很多情况下，其没有相关性，可以被另一种修饰的分子替换。因此，除非参与直接与靶分子结合的官能团被替换或删除，否则适配体通常会保持其活性。另外，重要的是，整体的立体结构不会发生巨大改变。
可以使用SELEX方法或其改进形式(例如，Ellington等人，(1990)Nature，346，818-822；Tuerk等人，(1990)Science，249，505-510)来制备适配体。在SELEX方法中，通过增加轮次(round)的数目或使用竞争性物质，对于靶分子显示出更强结合力的适配体被浓缩并被选择。因此，通过调节SELEX的轮次的数目和/或改变竞争状态，可以在一些情况下获得具有不同结合力的适配体、具有不同结合形态的适配体、具有相同结合力或结合形态但是具有不同碱基序列的适配体。SELEX方法包括通过PCR进行扩增的过程；在该过程中通过使用锰离子等引起突变，从而可以进行具有丰富的多样性的SELEX。
通过SELEX获得的适配体是对于靶分子显示出高亲和性的核酸，但是这并不意味着与靶分子的生物活性位点结合。因此，通过SELEX获得的适配体并不一定对于靶物质的功能起作用。IL-17是碱性蛋白，其被认为容易与核酸非特异性地结合。不结合至活性位点的适配体不会影响靶物质的活性。事实上，用于对照的RNA不抑制IL-17与IL-17受体的结合。
由此选择的活性适配体可以通过进行SELEX优化以达到高功能。对于SELEX优化，制备其中具有确定序列的适配体被部分地随机排列的模板、或者掺杂了大约10％至30％的随机序列的模板；然后再次进行SELEX。
通过SELEX获得的适配体的长度是大约70个核苷酸，这难以直接制成药物。因此，需要重复尝试误差法以将适配体缩短至大约50个核苷酸的长度或更短，以能够容易地化学合成。
通过SELEX获得的适配体取决于其引物设计，随后的最小化操作的容易性会变化。除非成功地设计了引物，否则随后的开发是不可能的，即使通过SELEX选出了具有活性的适配体。在本发明中发现：可以获得甚至具有23个核苷酸(SEQ ID NO：40)或33个核苷酸(SEQ ID NO：44)的保持活性的适配体，这些序列对于与IL-17的结合是特别重要的。
适配体由于可化学合成因而容易改变。对于适配体而言，通过使用MFOLD程序来预测二级结构，或者通过使用X射线分析或NMR分析来预测立体结构，从而可以在一定程度上预测哪些核苷酸可以被替换或缺失，以及在哪里可以插入新的核苷酸。可以容易地化学合成具有新序列的预测的适配体，并且可以使用现有的测定系统来确认该适配体是否保持活性。
如果通过重复如上所述的尝试误差法鉴定出对于获得的适配体与靶分子结合具有重要意义的区域，则活性在很多情况下保持不变，即使向其序列两端添加新的序列。新序列的长度没有特别限制。
关于修饰，与序列同样可以进行众多设计或改变。
如上所述，适配体可以进行众多设计或改变。本发明还提供了制备适配体的方法，其能够对包含特定序列(例如，与选自主干区域、内环区、发夹环区和单链区的部分对应的序列：如有需要，以下简称为固定序列)的适配体进行众多的设计或改变。
例如，此类适配体的制备方法包括制备包含固定序列的适配体：通过使用如下所示的核苷酸序列组成的单一种类的核酸分子：
Figure BPA00001301168400131
-(N)a-固定序列-(N)b-[其中(N)a代表由“a”个N的单元组成的核苷酸链；(N)b代表由“b”个N的单元组成的核苷酸链；N的单元中的每一个，无论相同或不同，是选自A、G、C、U和T(优选A、G、C和U)的核苷酸。每个“a”和“b”，无论相同或不同，可以是任何数字，并且可以是例如1至大约100，优选1至大约50，更优选1至大约30，进一步优选1至大约20或1至大约10]，或多个种类的核酸分子(例如，a、b数目不同的核酸分子库等)，以及分别对应于引物序列(i)和(ii)的引物对。
本发明还提供了包含本发明的适配体和与其结合的功能性物质的复合物。在本发明的复合物中，适配体与功能性物质之间的结合可以是共价键或非共价键。本发明的复合物可以是这样的复合物，其中本发明的适配体与一个或多个(例如2或3个)相同种类或不同种类的功能性物质结合在一起。所述功能性物质没有特别限制，只要其另外赋予本发明的适配体一定的功能，或者能够改变(例如改善)本发明的适配体可以具有的某些特性。所述功能性物质的实例有：蛋白、肽、氨基酸、脂质、糖、单糖、多核苷酸和核苷酸。所述功能性物质的实例有：亲和性物质(例如生物素、链霉亲和素、对于靶互补序列具有亲和性的多核苷酸、抗体、谷胱甘肽琼脂糖、组氨酸)、标记用物质(例如，荧光物质、发光物质、放射性同位素)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、药物递送介质(例如，脂质体、微球体、肽、聚乙二醇类)、药物(例如，用于导弹疗法(missile therapy)的那些药物，例如刺孢霉素和倍癌霉素；氮芥类似物，例如环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺或曲磷胺；氮丙啶，例如噻替派；亚硝基尿，例如卡莫司汀；烷基化试剂，例如替莫唑胺或达卡巴嗪；叶酸样代谢拮抗剂，例如甲氨蝶呤或雷替曲塞；嘌呤类似物，例如硫代鸟嘌呤、克拉屈滨或氟达拉滨；嘧啶类似物，例如氟尿嘧啶、替加氟或吉西他滨；长春花生物碱，例如长春碱、长春新碱或长春瑞滨，及其类似物；鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷、紫杉烷、多西紫杉醇或紫杉醇；蒽环类，例如多柔比星、表柔比星、伊达比星和米托蒽醌，及其类似物；其它细胞毒性抗生素，例如博莱霉素、丝裂霉素；铂化合物，例如顺铂、卡铂和奥沙利铂；喷司他丁、米替福新、雌莫司汀、拓扑替康、伊立替康和比卡鲁胺)，和毒素(例如篦麻蛋白毒素、liatoxin和Vero毒素)。在一些情况下，这些功能性分子最后被除掉。此外，分子可以是可被酶识别并切割的肽，所述酶例如凝血酶、基质金属蛋白酶(MMP)和因子X，并且可以是可被核酸酶或限制酶切割的多核苷酸。
本发明的适配体或复合物可以用作例如药物、诊断性药物、检测性药物、或试剂。其特别可用作用于自身免疫疾病和伴有炎症的疾病的药物、诊断性药物、检测性药物、或试剂。
在本文中，自身免疫疾病和伴有炎症的疾病包括多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、舍格伦综合征、多肌炎(PM)、皮肌炎(DM)、风湿性关节炎(慢性风湿性关节炎(RA)、骨关节炎(OA))、炎性小肠结肠炎(克罗恩病等)、进行性系统性硬化症(PSS)、结节性动脉外膜炎(PN)、甲状腺疾病(巴泽多病等)、吉-巴综合征、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力(MG)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、I型糖尿病、牛皮癣、哮喘、嗜中性粒细胞功能异常、嗜酸性肺炎、突发性肺纤维化、超敏性肺炎、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、胸癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、neuroglastoma、胶质母细胞瘤、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、肾母细胞瘤、前列腺癌、移植中的移植物排斥反应、移植物抗宿主病、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏、荨麻疹、术后粘连、子宫内膜异位症、成人牙周炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病、传染病等等。特别是，多发性硬化症、风湿性关节炎、炎性小肠结肠炎、硬皮病、哮喘、和移植物抗宿主病。
本发明的适配体或复合物还可用作药物递送介质、用于体内成像的探针、用于测定血液中IL-17浓度的探针、用于组织学染色的探针、用于ELISA的探针，以及用于分离和纯化IL-17的配体。
已知IL-17作用于各种细胞，例如成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、软骨细胞、成骨细胞、树突细胞祖细胞、骨髓衍生的间质细胞、T细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。IL-17通过作用于这些细胞而诱导多种细胞因子、趋化因子、受体的产生及表达。特别地，其中有CXCL1(KC或Groα)、CXCL2(MIP2或Groβ)、CXCL5(LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL8(IL-8)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL11(I-TAC)、CCL2(MCP-1)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL11(Eotaxin)、CXCL12(SDF-1)、CCL20(MIP3α)、IL-1、IL-6、IL-8、IL-19、TNF、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、ICAM-1、VCAM-1、PTGS2(COX2)、NOS2(iNOS)、LCN2(24p3)、DEFB4(BD2)、S100A7(Psoriasin)、S100A8(钙粒蛋白A)、S100A9(钙粒蛋白B)、MUC5AC、MUC5B、EREG、SOCS3、TNFSF11(RANKL)、MMP1、MMP3、MMP9、MMP13、TIMP1、ADAMTS4、PGE2、SCF、CD80、CD86、MHC等等。因此，本发明的适配体或复合物可以用作与这些细胞和细胞因子、趋化因子等相关的疾病的药物、诊断性药物、检测性药物、或试剂。
IL-17通过与其受体结合而激活Act1和TRAF6，并且激活NF-κB途径、MAP激酶途径、C/EBP途径等。因此，本发明的适配体或复合物可以用作与这些信号传导途径的激活相关的疾病的药物、诊断性药物、检测性药物、或试剂。
本发明的适配体或复合物还可用于预防或治疗多种疾病，包括自身免疫疾病(例如，多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、舍格伦综合征、多肌炎(PM)、皮肌炎(DM)、风湿性关节炎(慢性风湿性关节炎(RA)、骨关节炎(OA))、炎性小肠结肠炎(克罗恩病等)、进行性系统性硬化症(PSS)、结节性动脉外膜炎(PN)、甲状腺疾病(巴泽多病等)、吉-巴综合征、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力(MG)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、I型糖尿病、牛皮癣、哮喘、嗜中性粒细胞功能异常、嗜酸性肺炎、突发性肺纤维化、超敏性肺炎)，癌症(例如食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、胸癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、neuroglastoma、胶质母细胞瘤、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、肾母细胞瘤、前列腺癌)，移植疾病(例如移植物排斥反应、移植物抗宿主病)，过敏症(例如，哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏、荨麻疹)，其它炎症相关疾病(例如，术后粘连、子宫内膜异位症、成人牙周炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病)，传染病等等。特别是，本发明的适配体可用于预防或治疗多发性硬化症、风湿性关节炎、炎性小肠结肠炎、硬皮病、哮喘、和移植物抗宿主病。
本发明的药物可以是配合了药学上可接受的载体的药物。药学上可接受的载体的实例有：赋形剂，如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙和碳酸钙；粘合剂，如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖和淀粉；崩解剂，如淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、钠-甘醇-淀粉、碳酸氢钠、磷酸钙和柠檬酸钙；润滑剂，如硬脂酸镁、二氧化硅气凝胶、滑石、十二烷基硫酸钠；矫味剂，如柠檬酸、薄荷醇、甘草甜素-铵盐、甘氨酸和橙粉；防腐剂，如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、羟苯甲酯和羟苯丙酯；稳定剂，如柠檬酸、柠檬酸钠和醋酸；悬浮剂，如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和硬脂酸铝；分散剂，如表面活性剂；稀释剂，如水、生理盐水和橙汁；基质蜡(base wax)，例如可可脂、聚乙二醇和煤油；等等，但这些不是限制性的。
适合于口服给药的制剂是：将有效量的配体溶解于例如水、生理盐水或橙汁之类的稀释液中而制备的溶液；包含有效量的固体或粒状的配体的胶囊、小药囊或片剂；将有效量的有效成分混悬于合适的分散剂中而制备的混悬剂；将有效量的有效成分的溶液在合适的分散剂中分散并乳化而制备的乳液；等等。
可以通过本身已知的方法对本发明的药物进行包衣，目的是为了掩盖味道、肠溶、缓释等等。作为用于包衣的包衣剂的实例，可以使用羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚氧化亚乙基二醇、吐温80、普流罗尼克F68、醋酞纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟甲基纤维素醋酸琥珀酸酯、尤特奇(由Rohm，Germany生产的甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物)、色素(例如，红色氧化铁、二氧化钛等等)等等。药物可以是速释制剂或缓释制剂。缓释的基材的实例包括脂质体、去端肽胶原(atelocollagen)、明胶、羟磷灰石、PLGA等。
作为适合于胃肠外给药(例如，静脉内给药、皮下给药、肌肉内给药、局部给药、腹腔内给药、鼻内给药、肺部给药等)的制剂，有水性和非水性的等渗的无菌注射液体制剂，其可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、等渗剂等。还可以列举水性和非水性的无菌混悬剂，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、杀菌剂等。该制剂可以以单元剂量体积或以数个分割的剂量包括在容器中，例如安瓿或小瓶。还可以将有效成分与药学上可接受的载体冷冻干燥并储存于“可以在临使用前溶解于或悬浮于合适的无菌介质”的状态。除了注射液体制剂之外，吸入剂和软膏剂也是可以接受的。在吸入剂的情况下，处于冷冻干燥状态的有效成分被微粒化并且通过使用合适的吸入设备通过吸入来给药。吸入剂中可以根据需要而适当配合常规使用的表面活性剂、油、调味品、环糊精或其衍生物等。
在本文中，表面活性剂的实例有：油酸、卵磷脂、二甘醇二油酸酯、油酸四氢呋喃甲酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、三油酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、glyceryl monolysinoate、十六烷醇、硬脂醇、聚乙二醇400、西吡氯铵、三油酸山梨坦(商品名司盘85)、单油酸山梨坦(商品名司盘80)、单月桂酸山梨坦(商品名司盘20)、聚氧乙烯硬化蓖麻油(商品名HCO-60)、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯(商品名吐温20)、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯(商品名吐温80)、天然来源的卵磷脂(商品名EPICLON)，油烯基聚氧乙烯(2)醚(商品名Brij 92)、硬脂基聚氧乙烯(2)醚(商品名Brij 72)、月桂基聚氧乙烯(4)醚(商品名Brij30)、油烯基聚氧乙烯(2)醚(商品名Genapol 0-020)、氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物(商品名Synperonic)等等。油的实例有：玉米油、橄榄油、棉籽油、葵花子油等。在软膏剂的情形中，将适当的药学上可接受的基质(黄凡士林、白凡士林、石蜡、塑性基质(plastibase)、硅氧烷、白软膏、蜂蜡、猪油、植物油、亲水软膏、亲水凡士林、纯化的羊毛脂、水解的羊毛脂、吸水软膏、亲水塑性基质、聚乙二醇软膏等)与活性成分混合，并用作制剂。
可以根据常规方法制备吸入剂。具体而言，吸入剂可以这样制备：将上述的本发明的适配体或复合物粉末化或液体化，将其配合至吸入推进剂和/或载体中，将它们填充在合适的吸入容器中。在上述的本发明的适配体或复合物是粉末的情形中，可以使用普通的机械粉末吸入器；在是液体的情形中，可以使用诸如喷雾器的吸入器。在本文中，可以广泛使用通常已知的推进剂：氯氟烃系列化合物，例如氯氟烃-11、氯氟烃-12、氯氟烃-21、氯氟烃-22、氯氟烃-113、氯氟烃-114、氯氟烃-123、氯氟烃-142c、氯氟烃-134a、氯氟烃-227、氯氟烃-C318、和1，1，1，2-四氟乙烷；烃类，例如丙烷、异丁烷和正丁烷；醚，例如二乙醚；压缩气体，例如氮气和二氧化碳气体；等等。
本发明的药物的给药量根据有效成分的种类和活性、疾病的严重程度、给药对象的动物物种、给药对象的药物耐受性、体重、年龄等而变化，基于成人的每日的有效成分量的通常给药量可以是大约0.0001至大约100mg/kg，例如大约0.0001至大约10mg/kg，优选大约0.005至大约1mg/kg。
本发明还提供了其中固定了本发明的适配体或复合物的固相载体。固相载体的实例有：基板、树脂、平板(例如多孔平板)、滤器、药筒、柱、多孔材料。基板可以是用于DNA芯片、蛋白质芯片等中的那些；例如，镍-PTFE(聚四氟乙烯)基板、玻璃基板、磷灰石基板、硅基板、氧化铝基板等，以及通过使用聚合物等包覆这些基板而制备的基板。树脂的实例有：琼脂糖颗粒、二氧化硅颗粒、丙烯酰胺与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物、聚苯乙烯交联的二乙烯基苯颗粒、使用表氯醇交联的葡聚糖颗粒、纤维素纤维、芳基葡聚糖与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联聚合物、单分散系的合成聚合物、单分散系的亲水性聚合物、琼脂糖(Sepharose)、Toyopearl等，还包括通过将各种官能团结合至这些树脂而制备的树脂。本发明的固相载体可用于例如IL-17的纯化、检测和定量。
可以通过本身已知的方法将本发明的适配体或复合物固定到固相载体上。例如，有一种方法是，将亲和性物质(例如上述的那些)或预先确定的官能团导入本发明的适配体或复合物，然后利用所述亲和性物质或预先确定的官能团将所述适配体或复合物固定在固相载体上。本发明也提供了这样的方法。预先确定的官能团可以是能够进行偶联反应的官能团；例如，氨基、巯基、羟基和羧基。本发明还提供了其中导入了此类官能团的适配体。
本发明还提供了纯化和浓缩IL-17的方法。特别地，本发明可以将IL-17从其它家族蛋白的蛋白中分离出来。本发明的纯化和浓缩方法可以包括：将IL-17吸附至本发明的固相载体，使用洗脱剂洗脱吸附的IL-17。可以通过本身已知的方法实现IL-17向本发明的固相载体的吸附。例如，将含有IL-17的样品(例如细菌或细胞培养物或培养物上清液，血液)导入本发明的固相载体、或包含本发明的固相载体的组合物。可以使用诸如中性溶液的洗脱剂来洗脱IL-17。对于中性洗脱液没有限制，其pH可以是例如大约6至大约9，优选大约6.5至大约8.5，更优选大约7至大约8。所述中性溶液还可以包含例如钾盐(例如NaCl、KCl)、镁盐(例如MgCl2)、表面活性剂(例如吐温20、Triton、NP40)和甘油。本发明的纯化和浓缩方法还可以包括，在IL-17吸附之后使用洗涤液洗涤固相载体。洗涤液的实例包括那些含有脲、螯合剂(例如EDTA)、Tris、酸、碱、转运RNA、DNA、表面活性剂例如吐温20、盐例如NaCl等的洗涤液。本发明的纯化和浓缩方法还可以包括，对固相载体进行加热处理。该步骤能够使固相载体再生和灭菌。
本发明的适配体或复合物还可以用作检测探针，特别是用于检测IL-17的探针。标记适配体的方法没有特别限制，可以应用本身已知的方法。此类方法包括例如，使用放射性同位素进行标记、使用荧光色素或荧光蛋白进行标记，等等。
本发明还提供了检测和定量IL-17的方法。特别地，本发明可以将IL-17与其它家族蛋白区别开并检测及定量。本发明的检测和定量方法可以包括，使用本发明的适配体(例如，通过使用本发明的复合物和固相载体)来测定IL-17。可以通过与免疫学方法相同的方式进行检测和定量IL-17的方法，不同之处在于，使用本发明的适配体，而非使用抗体。因此，通过使用本发明的适配体(代替抗体)作为探针，通过与酶免疫测定(EIA)(例如，直接竞争性ELISA、间接竞争性ELISA、夹心式ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)，Western印迹法(例如在Western印迹法中用以代替二抗)、免疫组织化学染色法、细胞分选法等方法相同的方式可以进行检测和定量。这些方法可用于例如，测定生物体或生物样品中的IL-17的量，以及用于诊断与IL-17相关的疾病。
本文提及的所有公开物中的公开内容，包括专利和专利申请说明书，通过引用并入本发明，达到明文记载所有这些公开物的程度。
以下通过下面的实施例更详细地描述本发明，但是，这些实施例并不限制本发明的范围。
实施例
实施例1：特异性结合IL-17的核酸的制备
使用SELEX方法制备特异性结合IL-17的核酸。对Ellington等人的方法(Ellington and Szostak，Nature 346，818-822，1990)和Tuerk等人的方法(Tuerk and Gold，Science 249，505-510，1990)加以改进，进行SELEX。人IL-17(由Peprotech Company生产)用作靶物质。通过氨基偶联将IL-17固定于琼脂糖树脂(NHS-激活的琼脂糖，由GE Healthcare生产)。根据GEHealthcare Company的说明书的指导进行氨基偶联。通过使用SDS-PAGE检测固定前的IL-17溶液以及固定之后即刻的上清液来确认固定的量。SDS-PAGE的结果表明，在上清液中检测不到IL-17的条带；可以确认：几乎所有的所用的IL-17都被偶联。这意味着大约400pmol的IL-17被固定于大约10μL的树脂上。
使用DuraScribeTM T7转录试剂盒(由Epicentre生产)通过转录由化学合成得到的DNA来获得用于第一轮的RNA(30N-RNA)。通过该方法获得的RNA的嘧啶核苷酸的核糖的2’位被氟原子取代。将长度为89个核苷酸的下列DNA(其在30个核苷酸的随机序列的两端具有引物序列)用作DNA模板。通过化学合成来制备所用的DNA模板和引物。以下显示了所用的DNA模板和引物。
DNA模板：
5’-tcacactagcacgcatagg-30N-catctgacctctctcctgctccc-3’(SEQ ID NO：55)
正向引物：
5’-taatacgactcactatagggagcaggagagaggtcagatg-3’(SEQ ID NO：56)
反向引物：
5’-tcacactagcacgcatagg-3’(SEQ ID NO：57)
N代表A、G、C和T中的任一种。正向引物包含T7RNA聚合酶的启动子序列。理论上，用于第一轮的RNA库的差异是1014。
将RNA库加入到固定有IL-17的树脂中，并将其在室温静置30分钟。30分钟之后，使用溶液A洗涤树脂以除去未与IL-17结合的RNA。在本文中，溶液A是145mM氯化钠、5.4mM氯化钾、1.8mM氯化钙、0.8mM氯化镁、20mM Tris(pH 7.6)和0.05％吐温20的混合溶液。在室温加入洗脱液并搅拌10分钟，由此回收与IL-17结合的RNA。通过加入6M的盐酸胍将溶液A调为pH 7.6之后，将其用作洗脱液。通过RT-PCR扩增回收的RNA并使用DuraScribeTM T7转录试剂盒进行转录，将其用作下一轮的库。将这些步骤的每一轮重复8轮。结束SELEX之后，将PCR产物克隆进入pGEM-T Easy载体(由Promega生产)，并使用该载体转化大肠杆菌菌株DH5α(由Toyobo生产)。从单菌落提取质粒之后，使用DNA测序仪(3130xl Genetic Analyzer，由ABI生产)检查48个克隆的碱基序列。
在进行6轮SELEX后，检测序列；发现了序列的集中。存在11个如SEQ ID NO：1所示的序列，其中一个具有2-碱基取代。存在6个如SEQ IDNO：2所示的序列。存在2个如SEQ ID NO：3-6所示的序列。存在1个如SEQ ID NO：7-28所示的序列。在SEQ ID NO：1和2所示的序列中，包含共同序列gauagcgaagucauugagcgc(SEQ ID NO：58；21个核苷酸)。在SEQ IDNO：6-21所示的序列中，包含共同序列ggagucag(SEQ ID NO：59；8个核苷酸)。当使用MFOLD程序(M.Zuker，Nucleic Acids Res.31(13)，3406-3415，2003)预测SEQ ID NO：1和2所示的序列的二级结构时，发现共同序列部分在形态上是相同的(见图1和2)。
接下来，检查8轮SELEX之后获得的序列。比6轮过后观察到更多的集中性；分别存在25个和7个SEQ ID NO：1和2所示的序列。存在1个由SEQ ID NO：1所示的序列的2-碱基取代产生的序列，存在1个由SEQID NO：2所示的序列的1-碱基取代产生的序列。分别存在4个、3个和2个SEQ ID NO：29-31所示的序列。存在1个SEQ ID NO：32-36所示的序列。SEQ ID NO：29所示的序列包含共同序列SEQ ID NO：58。当使用MFOLD程序预测SEQ ID NO：29所示序列的二级结构时，发现共同序列部分在形态上与SEQ ID NO：1和2所示序列中包含的共同序列是相同的(见图3)。SEQ ID NO：30和31所示的序列包含SEQ ID NO：59的共同序列。此外，SEQ ID NO：7、9、13、21和30所示的序列包含共同序列ggaggagucaguaauc(SEQ ID NO：60；16个核苷酸)。SEQ ID NO：60所示的共同序列包含SEQ ID NO：59。当使用MFOLD程序预测这些序列的二级结构时，发现共同序列部分在形态上是相同的(见图4-6)。SEQ ID NO：59所示的共同序列的碱基显示于方框中，SEQ ID NO：60所示的共同序列的其余序列的碱基标记为*(星号)。
以下显示了各个核苷酸序列。每个核苷酸的括号表示在核糖的2’位的修饰。F代表氟原子，M代表OMe。具体而言，c(F)代表胞苷，其中核糖的2’位被氟原子取代，u(F)代表尿苷，其中核糖的2’位被氟原子取代。a(M)代表腺苷，其中核糖的2’位被OMe取代；g(M)代表鸟苷，其中核糖的2’位被OMe取代；c(M)代表胞苷，其中核糖的2’位被OMe取代(同样的表示适用于下文)。
每个序列的起始端是5’末端，终止端是3’末端。
SEQ ID NO：1：
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SEQ ID NO：2：
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SEQ ID NO：3：
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SEQ ID NO：4：
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SEQ ID NO：5：
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SEQ ID NO：6：
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SEQ ID NO：7
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SEQ ID NO：8
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SEQ ID NO：9
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SEQ ID NO：10
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SEQ ID NO：11
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SEQ ID NO：12
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SEQ ID NO：13
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SEQ ID NO：14
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SEQ ID NO：15
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SEQ ID NO：16
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SEQ ID NO：17
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SEQ ID NO：18
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SEQ ID NO：19
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SEQ ID NO：20
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SEQ ID NO：21
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SEQ ID NO：22
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SEQ ID NO：23
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SEQ ID NO：24
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SEQ ID NO：25
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SEQ ID NO：26
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SEQ ID NO：27
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SEQ ID NO：28
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SEQ ID NO：29：
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SEQ ID NO：30：
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SEQ ID NO：31：
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SEQ ID NO：32：
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SEQ ID NO：33：
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SEQ ID NO：34：
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SEQ ID NO：35：
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SEQ ID NO：36：
gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gu(F)au(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gac(F)aaagc(F)c(F)ggc(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga
通过表面等离振子共振法来评价SEQ ID NO：1-6和29-36所示的核酸对于IL-17的结合活性。使用BIAcore 2000进行测定。使用SA芯片作为传感器芯片，其中固定了链霉亲和素。其中结合的是大约600RU的在5’末端结合了生物素的16个核苷酸的多聚dT。配体核酸的3’末端添加16个核苷酸的多聚A，并且通过dT和A的结合而固定于SA芯片。固定的量是大约800RU。注射以0.5μM制备的用于分析的20μL人IL-17，并加入0.1mg/mL tRNA以减少非特异性吸附。溶液A用作运行缓冲液。测定结果发现，SEQ ID NO：1-6和29-36所示的所有核酸都结合至IL-17，其结合显著高于阴性对照30N。在本文中，30N是指用于第一轮SELEX的核酸库，其包含30个核苷酸的随机序列。作为实例，图7中显示了传感图，其显示了SEQ ID NO：1所示的适配体(Apt1)与人IL-17的结合状态。从以上可以显示出，SEQ ID NO：1-6和29-36所示的核酸是与IL-17结合的适配体。
通过表面等离振子共振法测定了SEQ ID NO：1-6和29-36所示的IL-17适配体是否与同一家族的IL-17F结合。IL-17与IL-17F之间的氨基酸序列同源性是50％。使用R&D公司生产的IL-17F(1335-INS/CF)进行实验，如上所述，加入tRNA以减少非特异性吸附。结果发现，SEQ ID NO：1-6和29-36所示的适配体没有一个与IL-17F结合。作为实例，图8中显示了传感图，其显示了SEQ ID NO：1所示的适配体不与人IL-17F结合。从以上发现，SEQ ID NO：1-6和29-36所示的适配体特异性地结合IL-17。
实施例2：SEQ ID NO：1、2和30所示适配体的缩短
进行SEQ ID NO：1、2和30所示的适配体的缩短，以通过化学合成来制备SEQ ID NO：37-44所示的核酸。按照与实施例1相同的方式通过表面等离振子共振法测定这些核酸是否具有对IL-17的结合活性。结果发现：所有这些核酸都具有对IL-17的结合活性。SEQ ID NO：40所示的适配体包含SEQ ID NO：1、2和29所示适配体中所含的共同序列(SEQ ID NO：58)，其长度是23个核苷酸。SEQ ID NO：44所示的适配体包含SEQ ID NO：30所示适配体中所含的共同序列，其长度是33个核苷酸。SEQ ID NO：44所示的适配体包含SEQ ID NO：6-21、30和31中所含的8个核苷酸的共同序列(SEQ ID NO：59)，以及SEQ ID NO：7、9、13、21和30中所含的16个核苷酸的共同序列(SEQ ID NO：60)。使用MFOLD程序预测的SEQ IDNO：40和44所示适配体的二级结构分别显示于图9和10。在图9中，通过黑色圆圈标示出了每个共同序列。在图10中，在SEQ ID NO：6-21、30和31中共有的序列的碱基以方框标出，仅仅在SEQ ID NO：7、9、13、21和30中共有的序列的碱基以*号(星号)标出。
以下显示了各个核苷酸序列。
SEQ ID NO：37：长度为54个核苷酸的适配体，其为SEQ ID NO：1所示适配体的变体
c(F)agau(F)gggc(F)agc(F)agaggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)g
SEQ ID NO：38：长度为40个核苷酸的适配体，其为SEQ ID NO：37所示适配体的变体
gc(F)agc(F)agaggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)
SEQ ID NO：39：长度为33个核苷酸的适配体，其为SEQ ID NO：38所示适配体的变体
gc(F)agaggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)
SEQ ID NO：40：长度为23个核苷酸的适配体，其为SEQ ID NO：39所示适配体的变体
ggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)
SEQ ID NO：41：长度为27个核苷酸的适配体，其为SEQ ID NO：39所示适配体的变体
ggggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)c(F)c(F)
SEQ ID NO：42：长度为41个核苷酸的适配体，其为SEQ ID NO：2所示适配体的变体
gu(F)gc(F)ac(F)au(F)gggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)
SEQ ID NO：43：长度为52个核苷酸的适配体，其为SEQ ID NO：30所示适配体的变体
agaggu(F)c(F)agau(F)ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)g
SEQ ID NO：44：长度为33个核苷酸的适配体，其为SEQ ID NO：30所示适配体的变体
ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)
实施例3：SEQ ID NO：40所示适配体的突变体的制备
通过向SEQ ID NO：40所示适配体中引入1处突变来制备突变体，通过表面等离振子共振法评估其对IL-17的结合活性。以下显示了突变体的序列和修饰。
SEQ ID NO：45：通过向SEQ ID NO：40所示适配体中引入突变(u(F)16∶c(F)16)而制备的适配体
ggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)c(F)gagc(F)gc(F)c(F)
SEQ ID NO：46：通过向SEQ ID NO：40所示适配体中引入突变(g21∶a21)而制备的适配体
ggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)ac(F)c(F)
SEQ ID NO：47：通过向SEQ ID NO：40所示适配体中引入突变(c(F)7∶a(M)7)而制备的适配体
ggau(F)aga(M)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)
SEQ ID NO：48：通过向SEQ ID NO：40所示适配体中引入突变(u(F)12∶a(M)12)而制备的适配体
ggau(F)agc(F)gaaga(M)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)
SEQ ID NO：40-2：通过向SEQ ID NO：40所示适配体的a3添加OMe修饰而制备的适配体
gga(M)u(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)
SEQ ID NO：40-3：通过以c(M)7替换SEQ ID NO：40所示适配体的c(F)7而制备的适配体
ggau(F)agc(M)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)
SEQ ID NO：40-4：通过向SEQ ID NO：40所示适配体的g19添加OMe修饰而制备的适配体
ggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gag(M)c(F)gc(F)c(F)
所有这些适配体都与IL-17结合。这表明，即使引入数个突变或者改变修饰方法，SEQ ID NO：40所示的适配体仍然保持对于IL-17的结合活性。
实施例4：抑制IL-17与IL-17受体结合的适配体
通过表面等离振子共振法测定SEQ ID NO：1-6和29-44所示的适配体是否抑制IL-17与IL-17受体(IL-17R)的结合。
按照BIAcore公司的操作说明，将蛋白A(21181，PIERCE)固定于CM5传感器芯片上。在其上固定大约900RU的融合了IgG的Fc部分的人IL-17R-Fc(177-IR，R&D systems)。作为分析物，将IL-17(0.11μM)与每种适配体(0.33μM)的混合物静置15分钟，然后流入该混合物。如果适配体抑制IL-17与IL-17R的结合，则预期传感图上的信号不会上升；如果适配体不抑制其结合，则会形成三体复合物，预期信号会上升。在开始抑制实验之前，确认IL-17确实与IL-17R结合。对于阴性对照，使用IL-17与30N的混合物。30N是指用于第一轮SELEX的核酸库，其包含30个核苷酸的随机序列。实验结果发现，SEQ ID NO：1-6和29-44所示的所有适配体都抑制IL-17与IL-17R的结合。同时，30N未显示出抑制活性。作为一个实例，图11显示了传感图，其显示了SEQ ID NO：1所示的适配体抑制IL-17与IL-17R的结合。
从上文可以看出，SEQ ID NO：1-6和29-44所示的适配体可以用作IL-17的抑制剂。
实施例5：SEQ ID NO：44所示适配体的突变体的制备
通过向SEQ ID NO：44所示适配体中引入突变来制备突变体，按照与实施例6相同的方式，使用表面等离振子共振法检测其是否抑制IL-17与IL-17R的结合。以下显示了突变体的序列和修饰。
SEQ ID NO：49：通过向SEQ ID NO：44所示适配体中引入(g7)缺失突变而制备的适配体
ggu(F)c(F)u(F)ac(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)
SEQ ID NO：50：通过向SEQ ID NO：44所示适配体中引入突变(g14∶a14)而制备的适配体
ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggagaagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)
SEQ ID NO：51：通过向SEQ ID NO：44所示适配体中引入突变(g20∶a20)而制备的适配体
ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)aau(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)
SEQ ID NO：52：通过向SEQ ID NO：44所示适配体中引入突变(g1g2u(F)3c(F)4：G1G2G3G4，g30a31c(F)32c(F)33：C30C31C32C33)而制备的适配体。在此，每个大写字母表示脱氧核苷酸。
GGGGu(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)aCCCC
SEQ ID NO：44-1：通过向SEQ ID NO：44所示适配体中引入(a19g20∶a(M)19g(M)20)突变而制备的适配体
ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)a(M)g(M)u(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)
SEQ ID NO：44-2：通过向SEQ ID NO：44所示适配体中引入(a15g16∶a(M)15g(M)16)突变而制备的适配体
ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggagga(M)g(M)u(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)
SEQ ID NO：53：通过缺失SEQ ID NO：44所示适配体的(g27)及其后的序列而制备的适配体
ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)gg
SEQ ID NO：54：通过从SEQ ID NO：44所示适配体中缺失(g1g2u(F)3)和(a31c(F)32c(F)33)而制备的适配体
c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)ag
SEQ ID NO：44-3：通过向SEQ ID NO：44所示适配体中引入(a6g7∶a(M)6g(M)7)突变而制备的适配体
ggu(F)c(F)u(F)a(M)g(M)c(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)
SEQ ID NO：44-4：通过向SEQ ID NO：44所示适配体中引入(g10g11∶g(M)10g(M)11)突变而制备的适配体
ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)g(M)g(M)aggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)
SEQ ID NO：44-5：通过向SEQ ID NO：44所示适配体中引入(a12g13∶a(M)12g(M)13)突变而制备的适配体
ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)gga(M)g(M)gagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)
SEQ ID NO：44-6：通过向SEQ ID NO：44所示适配体中引入(g14a15∶g(M)14a(M)15)突变而制备的适配体
ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggagg(M)a(M)gu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)
SEQ ID NO：44-7：通过向SEQ ID NO：44所示适配体中引入(a22a23∶a(M)22a(M)23)突变而制备的适配体
ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggagga(M)gu(F)c(F)agu(F)a(M)a(M)u(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)
SEQ ID NO：44-8：通过向SEQ ID NO：44所示适配体的5’末端添加PEG40(SUNBRIGHT GL2-400GS2，由NOF Corporation Company生产)，并向其3’末端添加idT(反向dT)而制备的适配体
PEG40-ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)-idT
所有这些适配体都抑制IL-17与IL-17受体(IL-17R)的结合。这表明，即使引入数个突变或者改变修饰方法，SEQ ID NO：44所示的适配体仍然保持对于IL-17与IL-17受体(IL-17R)结合的抑制活性。
实施例6：适配体抑制培养细胞中的IL-17信号传导
使用正常人皮肤成纤维细胞(NHDF，Sanko Junyaku)测定SEQ ID NO：44所示适配体是否能够抑制由IL-17引起的细胞刺激。当使用IL-17刺激时，NHDF细胞在细胞外产生白细胞介素6(IL-6)。当使用人IL-17(由Peprotech Company生产)(40ng/ml)刺激NHDF细胞时，向培养基中加入适配体(SEQ ID NO：44所示的适配体)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法(Endogen Human IL-6ELISA Kit：Thermo scientific)测定24小时之后产生的IL-6。图12显示了对IL-6的产生的抑制结果。测量结果确认：当加入适配体时，以浓度依赖性方式抑制了IL-6的产生。获得了比抗-IL-17中和抗体(MAB421，由R&D Systems生产)更高的抑制效果。另一方面，对照RNA未显示出抑制活性。在此，对照RNA是指用于第一轮SELEX的核酸库，其包含30个核苷酸的随机序列。这些发现显示：本发明的适配体在活细胞中同样具有针对IL-17信号传导的高抑制活性。
实施例7：适配体诱导的EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎)的小鼠模 型中的发病抑制实验
使用小鼠EAE模型(已知其为人类多发性硬化的小鼠模型)分析适配体对于发病的影响。使用含有500μg结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的氟氏不完全佐剂将300μg的髓鞘少突胶质糖蛋白肽35-55(MOG35-55)(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)乳化，将此乳液皮下给予野生型C57BL/6小鼠(雌性，8周龄)的腋窝和腰部，以将动物致敏。另外，在致敏后的即刻和48小时之后，将200ng百日咳毒素(pertussis toxin)溶解于200μL PBS并尾静脉给予以诱导EAE。然后，使用以下所示的标准每日评估临床症状。
对于野生型小鼠组(n＝10)和接受SEQ ID NO：44-8所示适配体的小鼠组(对于1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg，各n＝10)，每日记录临床评分，并且评估临床症状。临床分值按照如下评定：0：无症状；0.5：尾巴半低垂；1：尾巴完全低垂；2：步态紊乱；3：单肢瘫痪；4：双后肢瘫痪；5：前肢偏瘫；6：前肢瘫痪/死亡；记录所有动物的评分，直至给予MOG35-55后第25天的时候停止。
将SEQ ID NO：44-8所示的适配体溶解于生理盐水，从给予MOG35-55之日起，以2天的间隔总共给予该适配体13次。对于对照组，按照相同的方式给予同量的生理盐水。
图13显示了随时间进程对临床症状的评估情况。与对照组相比，在接受1mg/kg的SEQ ID NO：44-8所示适配体的小组中没有观察到显著差异。另一方面，在接受3mg/kg和10mg/kg的SEQ ID NO：44-7所示适配体的小组中，见到了临床症状的减轻，具有统计学上显著的差异。使用Mann-Whitney U-检验和Dunnett的方法分析统计学上显著的差异。在图中显示了统计学上显著的差异(*：P＜0.05，**：P＜0.01)。以上结果强烈说明，针对IL-17的适配体可用作自身免疫疾病例如多发性硬化的治疗性药物。
工业适用性
本发明的适配体或复合物可用作炎性疾病和诸如癌症、过敏症、感染性疾病等疾病的药物或试剂，例如诊断试剂。本发明的适配体或复合物还可用于纯化和浓缩IL-17、标记IL-17，以及检测和定量IL-17。
本申请基于在日本提交的专利申请号2008-183233，其内容通过引用全文并入本文。
Figure IPA00001301167900011
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Figure IPA00001301167900171
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Claims (19)

1.与IL-17结合的适配体。
2.抑制IL-17与IL-17受体结合的适配体。
3.抑制IL-17与IL-17受体结合但不抑制IL-17F与IL-17受体结合的适配体。
4.抑制IL-17与IL-17受体结合并且包含SEQ ID NO：58的序列的适配体。
5.抑制IL-17与IL-17受体结合并包含SEQ ID NO：59或60的序列的适配体。
6.权利要求4或5所述的适配体，其中嘧啶核苷酸是修饰的核苷酸。
7.权利要求1所述的适配体，其是以下的(a)或(b)的任一种：
(a)包含选自SEQ ID NO：1-54中的核苷酸序列(条件是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的适配体，其中所述适配体中包含的核苷酸是这样的：
(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2’位是相同的或不同的，并且是氟原子或被选自氢原子、羟基和甲氧基的原子或基团取代，和
(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2’位是相同的或不同的，并且是羟基或被选自氢原子、甲氧基和氟原子的原子或基团取代；
(b)包含选自SEQ ID NO：1-54中的核苷酸序列(条件是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的适配体，其中一个或数个核苷酸被替换、缺失、插入或添加，其中所述适配体中包含的核苷酸是这样的：
(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2’位是相同的或不同的，并且是氟原子或被选自氢原子、羟基和甲氧基的原子或基团取代，和
(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2’位是相同的或不同的，并且是羟基或被选自氢原子、甲氧基和氟原子的原子或基团取代。
8.权利要求7所述的适配体，其包含SEQ ID NO：58、59或60的序列。
9.权利要求7所述的适配体，其包含SEQ ID NO：40或44的序列。
10.权利要求1至9中任一项所述的适配体，其中所述适配体中包含的核苷酸是修饰的。
11.包含权利要求1至10中任一项所述的适配体和功能性物质的复合物。
12.权利要求11所述的复合物，其中所述功能性物质是亲和性物质、标记用物质、酶、药物递送介质或药物。
13.包含权利要求1至10中任一项所述的适配体或权利要求11或12所述的复合物的药物。
14.用于治疗或预防自身免疫疾病、癌症、过敏症或其它与炎症相关的疾病的药物，其包含权利要求1至10中任一项所述的适配体或权利要求11或12所述的复合物。
15.包含权利要求1至10中任一项所述的适配体或权利要求11或12所述的复合物的诊断试剂。
16.包含权利要求1至10中任一项所述的适配体或权利要求11或12所述的复合物的IL-17检测探针。
17.包含权利要求1至10中任一项所述的适配体或权利要求11或12所述的复合物的用于纯化IL-17的固相载体。
18.检测IL-17的方法，包括使用权利要求1至10中任一项所述的适配体或权利要求11或12所述的复合物。
19.纯化IL-17的方法，包括使用权利要求1至10中任一项所述的适配体或权利要求11或12所述的复合物。
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