KR101276519B1

KR101276519B1 - Ｉｌ－１７에 대한 앱타머 및 그 사용

Info

Publication number: KR101276519B1
Application number: KR1020117003308A
Authority: KR
Inventors: 요시카즈 나카무라; 쇼지 오우치; 아키 이시구로
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠
Priority date: 2008-07-14
Filing date: 2009-07-14
Publication date: 2013-06-18
Also published as: US8440801B2; AU2009273052A1; KR20110028552A; EP2316935A4; EP2316935B1; ES2602119T3; CA2730796C; JPWO2010008001A1; EP2316935A1; CA2730796A1; CN102099471B; CN102099471A; US20110177578A1; AU2009273052B2; WO2010008001A1; JP5704638B2

Abstract

IL-17에 대한 양질인 앱타머를 제공하는 것. IL-17에 대한 저해활성을 갖는 엡타머; IL-17에 대한 결합활성 또는 저해활성을 갖는 앱타머 및 기능성 물질(예를 들면, 친화성 물질, 표식용 물질, 효소, 약물송달매체, 또는 약물 등)을 포함하는 복합체; IL-17에 대한 결합활성 또는 저해활성을 갖는 앱타머, 또는 해당 앱타머 및 기능성 물질을 포함하는 복합체를 포함하는 의약, 진단약 및 표식제 등.

Description

ＩＬ－１７에 대한 앱타머 및 그 사용{APTAMER AGAINST IL-17 AND USE THEREOF}

본 발명은 IL-17에 대한 앱타머 및 그 이용방법 등에 관한 것이다.

인터루킨17(IL-17 또는 CTLA-8)은 Th17세포에 의해서 분비되는 사이토카인으로, 염증성 질환이나 자기면역질환, 감염증과 깊게 관계하고 있다. 인간IL-17은 N말단에 시그널 펩티드를 포함하는 155아미노산으로 구성되는 20∼30kDa의 당단백질이다. 분자 내에 6개의 시스테인 잔기와 1군데의 N결합형 당쇄 결합부위를 갖는다. 성숙체는 136아미노산으로 이루어지고, 통상 이량체(dimer)로 존재한다.

IL-17패밀리 단백질로서는 IL-17A, B, C, D, E, F의 6종류의 단백질이 알려져 있다. 일반적으로 IL-17은 IL-17A의 것을 나타낸다. IL-17E는 IL-25로도 불리고 있다. 인간IL-17과 인간IL-17B, C, D, E, F의 아미노산 서열의 상동성은 각각 25, 28, 22, 27, 44％이고, IL-17F가 가장 상동성이 높다. 또한, 마우스IL-17 및 마모셋(marmoset)IL-17과는 63％ 및 90％의 상동성을 갖는다. 수용체로서 IL-17RA, IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD, IL-17RE가 알려져 있다. IL-17 및 IL-17F는 호모이량체 또는 헤테로이량체를 형성하고, IL-17RA 및 IL-17RC와 결합한다. IL-17과 IL-17RA의 결합은 Kd값이 약10^-7로 약하고, IL-17RC의 관여가 중요할 수 있음이 시사되고 있다.

Th17세포는 IL-17을 생산하는 CD4⁺T세포이다. in vitro에서 메모리 CD4⁺T세포를 IL-23으로 자극하면 IL-17생산이 유도된다. 한편, Th17세포의 분화유도에는 TGF-β와 IL-6이 중요한 역할을 하고 있다. TGF-β와 IL-6은 순수한T세포에 작용하여, RORgt(전사인자)의 발현을 유도한다. RORgt를 결손시키면 Th17세포가 분화될 수 없게 되는 것이나, 반대로 RORgt를 강제 발현함으로써 순수한T세포를 IL-17생산세포로 분화되는 것으로부터, 이 전사인자가 Th17세포분화에 중요하다고 생각되고 있다. RORgt의 발현유도에는 IL-6에 의한 STAT3의 활성화가 중요하지만, 반대로 IL-2에 의한 STAT5의 활성화는 발현을 억제한다. IL-2는 조절성 T세포의 분화에 필요하며, IL-2 결손 마우스는 심각한 자기면역을 발병하지만, 이것은 조절성 T세포가 감소하는 동시에 Th17 세포의 과잉분화가 일어나기 때문이라고 생각되고 있다. in vitro에서 순수한T세포를 TGF-β단독으로 자극하면, Th17은 아니고 조절성 T세포가 유도된다. Th1세포가 생산하는 IFN-γ나 Th2세포가 생산하는 IL-4 등은 Th17세포 분화에 억제적으로 작용한다.

IL-17수용체에 결합하면 Act-1, TRAF6을 통하여 NF-κB경로나 MAP키나제경로, C/EBP경로가 활성화되며, 염증성 사이토카인이나 케모카인이 유도된다. 예를 들어, IL-17은 대식세포에 작용하여 IL-1, TNF, MMP-9 등의 발현을 유도한다. 이 밖에 섬유아세포나 내피세포 등의 결합조직계 세포, 수지상세포 전구세포 등의 면역세포에 작용하여 IL-6 또는 IL-1, ICAM-1 등 각종 사이토카인이나 수용체의 발현을 유도하는 것이 알려져있다.

IL-17의 생산에는 TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ 등의 사이토카인이 관여된다. 한편, 이들의 사이토카인은 IL-17에 의해서 생산이 유도된다. IL-17은 다른 사이토카인과 상승적으로 작용하는 것이 알려져 있다.

IL-17은 염증성 질환이나 자기면역질환 등과 깊은 관계에 있다는 것을 알 수 있다. 만성관절 류머티즘, 전신성 홍반성루프스, 베체트병(Behcet's disease), 이식거절, 신장염 증후군, 염증성 장질환, 천식, 다발성 경화증, 치주병 등의 환자에서 IL-17의 발현이 상승하고 있다는 것이 알려져 있다. 또한, IL-17 결손 마우스에서는 만성관절류머티즘의 모델인 콜라겐 유도 관절염(CIA), 다발성 경화증의 모델인 실험적 자기면역성 뇌척수염(EAE), DNFB나 TNCB에 의한 접촉형 과민증 반응, 메틸화 BSA에 의한 지연형 과민증 반응, OVA유도에 의한 기도 과민증 반응 등이 현저하게 억제되는 것으로 보고되고 있다.

IL-17은 암과도 관계하고 있다. SCID 마우스의 피하에 비소세포 폐암 세포를 이식한 바, IL-17을 고발현시킨 마우스에서는 암세포의 증식이 촉진되는 것으로 보고되어 있다. 또한, 자궁경부암이나 난소암과도 관계하고 있는 것으로 보고되어 있다.

IL-17은 감염증과 관계하고 있다. IL-17R 녹아웃 마우스는 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae)감염, 칸디다 알비칸(Candida albicans)감염, 톡소포자충(Toxsoplasma gondii)감염 등에 고감수성이다. IL-17생산은 리포다당(LPS)이나 보렐리아속균(Borrelia burgdorferi)이나 폐렴막대균 등의 균체성분에 의해 유도된다. 이글의 성분은 항원 제시세포에 작용하여 IL-23을 유도함으로써, IL-17생산을 촉진한다고 생각되고 있다. IL-17R 녹아웃 마우스에서는 폐렴막대균 감염 후, 폐감염국소에 있어서 호중구의 유주(migration)와 기능에 중요한 역할을 하고 있는 CXCL1이나 CXCL2, G-CSF 등의 생산이 저하하고 있으며, 호중구의 유주에 장해가 인정된다.

그런데, 근래, RNA앱타머의 치료약, 진단약, 시약에의 응용이 주목받고 있으며, 몇 개의 RNA앱타머가 임상단계 혹은 실용화 단계에 들어가 있다. 2004년 12월에는 세계 최초의 RNA앱타머 의약인 마큐젠(Macugen)이 가령황반변성증의 치료약으로서 미국에서 승인되었다. RNA앱타머란 단백질 등의 표적물질에 특이적으로 결합하는 RNA의 것으로, SELEX법(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)을 이용해서 제작할 수 있다(특허문헌1∼3 참조). SELEX법이란, 10¹⁴개 정도의 다른 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA의 풀로부터, 표적물질에 특이적으로 결합하는 RNA를 선별해 오는 방법이다. 사용되는 RNA는 40잔기 정도의 랜덤서열을 프라이머서열로 끼워 넣은 구조를 하고 있다. 이 RNA풀을 표적물질과 회합시켜서, 필터 등을 이용하여 표적물질에 결합한 RNA만을 회수한다. 회수한 RNA는 RT-PCR로 증폭하고, 이것을 다음의 라운드의 주형으로서 사용한다. 이 작업을 10회 정도 반복함으로써 표적물질과 특이적으로 결합하는 RNA앱타머를 취득할 수 있는 경우가 있다.

특허문헌 1: 국제공개WO91/19813호 팜플렛 특허문헌 2: 국제공개W094/08050호 팜플렛 특허문헌 3: 국제공개W095/07364호 팜플렛

본 발명은 IL-17에 대한 앱타머 및 그의 이용방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해, 예의 검토한 결과, IL-17에 대한 양질인 앱타머를 제작하는 것에 성공하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 발명 등을 제공하는 것이다:

[1] IL-17에 결합하는 앱타머;

[2] IL-17과 IL-17수용체의 결합을 저해하는 앱타머;

[3] IL-17과 IL-17수용체의 결합은 저해하지만, IL-17F와 IL-17수용체의 결합은 저해하지 않는 앱타머;

[4] 서열번호 58의 서열을 포함하고 있는, IL-17과 IL-17수용체의 결합을 저해하는 앱타머;

[5] 서열번호 59 또는 60의 서열을 포함하고 있는, IL-17과 IL-17수용체의 결합을 저해하는 앱타머;

[6] 피리미딘 뉴클레오티드가 수식 뉴클레오티드인, [4] 또는 [5]에 기재한 앱타머;

[7] 이하 (a) 또는 (b)의 어느 하나인, [1]에 기재한 앱타머:

(a) 서열번호 1∼54의 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민일 수 있음)을 포함하는 앱타머로서, 해당 앱타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,

(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'위치가, 동일 또는 다르고, 불소원자이던가, 혹은 수소원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있으며,

(ii) 각 푸린 뉴클레오티드의 리보스의 2'위치가, 동일 또는 다르고, 히드록시기이거나, 혹은 수소원자, 메톡시기 및 불소원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는, 앱타머;

(b) 서열번호1∼54의 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민일 수 있음)에 있어서, 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머로서, 해당 앱타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,

(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'위치가, 동일 또는 다르고, 불소원자이거나, 혹은 수소원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있으며,

[8] 서열번호 58, 59 또는 60의 서열을 포함하고 있는, [7]에 기재한 앱타머;

[9] 서열번호 40 또는 44의 서열을 포함하고 있는, [7]에 기재한 앱타머;

[10] 앱타머에 포함되는 뉴클레오티드가 수식되어고 있는, [1]∼[9]의 어느 하나에 기재한 앱타머;

[11] [1]∼[10]의 어느 하나에 기재한 앱타머 및 기능성 물질을 포함하는 복합체;

[12] 기능성 물질이 친화성 물질, 표식용 물질, 효소, 약물송달매체 또는 약물인, [11]기재의 복합체;

[13] [1]∼[10]의 어느 하나에 기재한 앱타머 혹은 [11] 또는 [12]에 기재한 복합체를 포함하는 의약;

[14] [1]∼[10]의 어느 하나에 기재한 앱타머 혹은 [11] 또는 [12]에 기재한 복합체를 포함하는 자기면역질환, 암, 알레르기, 또는 그 밖의 염증과 관련하는 치료 또는 예방에 이용하는 의약;

[15] [1]∼[10]의 어느 하나에 기재한 앱타머 혹은 [11] 또는 [12]에 기재한 복합체를 포함하는 진단약;

[16] [1]∼[10]의 어느 하나에 기재한 앱타머 혹은 [11] 또는 [12]에 기재한 복합체를 포함하는 검출용 프로브;

[17] [1]∼[10]의 어느 하나에 기재한 앱타머 혹은 [11] 또는 [12]에 기재한 복합체를 포함하는 IL-17정제용 담체;

[18] [1]∼[10]의 어느 하나에 기재한 앱타머 혹은 [11] 또는 [12]에 기재한 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는, IL-17의 검출방법;

[19] [1]∼[10]의 어느 하나에 기재한 앱타머 혹은 [11] 또는 [12]에 기재한 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는, IL-17의 정제방법.

본 발명의 앱타머 또는 복합체는 염증성 질환이나 암, 알레르기, 감염증 등의 질환에 대한 의약, 혹은 진단약, 시약으로서 유용할 수 있다.

본 발명의 앱타머 또는 복합체는 또한, IL-17의 정제 및 농축, IL-17의 표식, 및 IL-17의 검출 및 정량에 유용할 수 있다.

도 1은 서열번호 1로 나타내는 앱타머의 MFOLD 프로그램에 의해 예상되는 2차 구조를 나타내는 도면이다. 공통서열을 검은 동그라미로 나타낸다.
도 2는 서열번호 2로 나타내는 앱타머의 MFOLD 프로그램에 의해 예상되는 2차 구조를 나타내는 도면이다. 공통서열을 검은 동그라미로 나타낸다.
도 3은 서열번호 29로 나타내는 앱타머의 MFOLD 프로그램에 의해 예상되는 2차 구조를 나타내는 도면이다. 공통 서열을 검은 동그라미로 나타낸다.
도 4는 서열번호 7로 나타내는 앱타머의 MFOLD 프로그램에 의해 예상되는 2차 구조를 나타내는 도면이다. 공통서열을 사각과 *(별표)로 나타낸다.
도 5는 서열번호 13으로 나타내는 앱타머의 MFOLD 프로그램에 의해 예상되는 2차 구조를 나타내는 도면이다. 공통서열을 사각과 *(별표)로 나타낸다.
도 6은 서열번호 30으로 나타내는 앱타머의 MFOLD 프로그램에 의해 예상되는 2차 구조를 나타내는 도면이다. 공통서열을 사각과 *(별표)로 나타낸다.
도 7은 서열번호 1로 나타내는 앱타머(Apt1)가 인간 IL-17에 결합하는 것을 나타내는 센서그램(sensorgram)이다.
도 8은 서열번호 1로 나타내는 앱타머가 인간 IL-17F에 결합하지 않는 것을 나타내는 센서그램이다.
도 9는 서열번호 40으로 나타내는 앱타머의 MFOLD 프로그램에 의해 예상되는 2차 구조를 나타내는 도면이다. 공통서열을 검은 동그라미로 나타낸다.
도 10은 서열번호 44로 나타내는 앱타머의 MFOLD 프로그램에 의해 예상되는 2차 구조를 나타내는 도면이다. 공통서열을 사각과 *(별표)로 나타낸다.
도 11은 서열번호 1로 나타내는 앱타머(Apt1)가 인간 IL-17과 인간 IL-17R의 결합을 저해하는 것을 나타내는 센서그램이다.
도 12는 서열번호 44로 나타내는 앱타머가 IL-17시그널링의 저해활성을 갖고 있는 것을 나타내는 도면이다. 검은 동그라미는 컨트롤DNA를, 검은 삼각은 항IL-17중화항체를, 검은 사각은 앱타머를 각각 나타낸다.
도 13은 앱타머에 의한 EAE 모델 마우스의 발증억제실험의 결과를 나타내는 도면이다. 검은 동그라미는 컨트롤군을, 검은 사각은 앱타머 1㎎/㎏투여군을, 검은 삼각은 앱타머 3㎎/㎏투여군을, X표는 앱타머 10㎎/㎏투여군을 각각 나타낸다. 또 *(별표)는 P＜O.05를 **은 P＜O.01을 나타낸다.

본 발명은 IL-17에 대해서 결합활성을 갖는 앱타머를 제공한다. 본 발명의 앱타머는 IL-17의 활성을 저해할 수 있다.

앱타머(aptamer)란, 소정의 표적분자에 대한 결합활성을 갖는 핵산분자를 말한다. 앱타머는 소정의 표적분자에 대해서 결합함으로써, 소정의 표적분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 수식핵산 또는 그들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 직쇄상(直鎖狀) 또는 환상(環狀)의 형태일 수 있다.

IL-17에 대한 저해활성이란, IL-17이 보유하는 임의의 활성에 대한 저해능을 의미한다. 예를 들면, IL-17은 면역계 세포나 결합조직계 세포 등에 작용하여 각종 사이토카인이나 케모카인의 생산을 유도한다. 따라서, IL-17에 대한 저해활성이란 이들의 사이토카인이나 케모카인 등의 생산을 저해하는 활성의 것이다. 이들 사이토카인이나 케모카인의 발현은 염증성 세포의 유주나 활성화를 유도하므로, IL-17의 저해활성이란 그들의 활성의 저해를 의미한다.

IL-17이란, CD4⁺T세포인 Th17세포가 생산하는 사이토카인으로, 예를 들면 Accession code AAH67505나 NP002181로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. IL-17은 IL-17A 또는 CTLA-8로 불려지는 것도 있다. 본 발명에서 나타내 는 IL-17은 동물체내에서 만들어지는 것 외에도, 마우스 등의 포유세포, 곤충세포, 대장균 등의 세포를 이용해서 제작할 수 있으며, 또한 화학합성에 의해서도 제작할 수 있다. 배양세포나 화학합성에 의해서 제작할 경우, 용이하게 변이체를 제작할 수 있다. 여기에서 변이체란, 아미노산이 수개 치환된 것이나 일부분의 아미노산 서열을 의미하며, 본래 IL-17이 가지고 있는 적어도 하나 이상의 활성을 가지고 있는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 아미노산이 치환될 경우, 치환 아미노산은 천연의 아미노산이어도 좋고, 비천연의 아미노산이어도 좋다. 본 발명에서 말하는 IL-17은 이들의 변이체를 포함한다.

IL-17수용체란, IL-17이 결합하는 세포 표면 단백질을 의미한다. IL-17수용체 패밀리로서 IL-17RA, IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD, IL-17RE가 알려져 있다. 본 발명에서 말하는 IL-17수용체란, 천연의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이어도 좋고, 그 변이체이어도 좋다. 여기에서 변이체란, 아미노산이 수개 치환된 것이나 일부분의 아미노산 서열을 의미하며, IL-17에 대해서 결합활성을 갖는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 본 발명은, IL-17과 IL-17수용체의 결합을 저해하는 앱타머를 제공한다.

본 발명의 앱타머는 임의의 포유동물에 유래하는 IL-17에 대한 저해활성을 가질 수 있다. 이와 같은 포유동물로서는, 예를 들면, 영장류(예, 인간, 원숭이), 설치류(예, 마우스, 래트(rat), 모르모트(guinea pig)) 및 애완동물, 가축 및 사역동물(예, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 돼지)을 들 수 있다.

본 발명의 앱타머는 IL-17의 임의의 부분에 결합하고, 그 활성을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않지만, ggauagcgaagucauugagcgcc(서열번호 40)의 서열을 포함하고 있는, IL-17과 IL-17수용체의 결합을 저해하는 앱타머인 것이 바람직하다. 이 서열은 후술하는 서열번호 1, 2 및 29로 나타내는 뉴클레오티드 서열의 공통서열(서열번호 58)로서, MFOLD 프로그램을 이용하여 예측되는 2차 구조가 같은 형상인 것을 포함한다(도 9 참조).

본 발명의 앱타머는 IL-17의 임의의 부분에 결합하고, 그 활성을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않지만, ggucuagccggaggagucaguaaucgguagacc(서열번호 44)의 서열을 포함하고 있는, IL-17과 IL-17수용체의 결합을 저해하는 앱타머인 것이 바람직하다. 이 서열은 후술하는 서열번호 6∼21, 30 및 31로 나타내는 뉴클레오티드 서열의 공통서열(서열번호 59) (혹은 후술하는 서열번호 7, 9, 13, 21 및 30으로 나타내는 뉴클레오티드 서열의 공통서열(서열번호 60))로서, MFOLD 프로그램을 이용하여 예측되는 2차 구조가 같은 형상인 것을 포함한다(도 10 참조).

본 발명의 앱타머는 IL-17의 임의의 부분에 결합하고, 그 활성을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않지만, gauagcgaagucauugagcgc(서열번호 58)의 서열을 포함하고 있는, IL-17과 IL-17수용체의 결합을 저해하는 앱타머인 것이 바람직하다. 이 서열은 후술하는 서열번호 1, 2 및 29로 나타내는 뉴클레오티드 서열의 공통서열로서, MFOLD 프로그램을 이용하여 예측되는 2차 구조가 같은 형상인 것이다(도 1∼3참조).

본 발명의 앱타머는 IL-17의 임의의 부분에 결합하고, 그 활성을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않지만, ggagucag(서열번호 59)의 서열을 포함하고 있는, IL-17과 IL-17수용체의 결합을 저해하는 앱타머인 것이 바람직하다. 이 서열은 후술하는 서열번호 6∼21, 30 및 31로 나타내는 뉴클레오티드 서열의 공통서열로서, MFOLD 프로그램을 이용하여 예측되는 2차 구조가 같은 형상인 것이다(도 4∼6참조).

또 본 발명의 앱타머는 ggaggagucaguaauc(서열번호 60)의 서열을 포함하고 있는, IL-17과 IL-17수용체의 결합을 저해하는 앱타머인 것이 바람직하다. 이 서열은 후술하는 서열번호 7, 9, 13, 21 및 30으로 나타내는 뉴클레오티드 서열의 공통서열로서, MFOLD 프로그램을 이용하여 예측되는 2차 구조가 같은 형상인 것이다(도 4∼6참조).

본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상, 약 10∼약 200 뉴클레오티드일 수 있지만, 예를 들면 약 100 뉴클레오티드 이하이며, 바람직하게는 약 50 뉴클레오티드 이하이고, 더욱 바람직하게는 약 40 뉴클레오티드 이하이며, 가장 바람직하게 약 35 뉴클레오티드 이하일 수 있다. 총 뉴클레오티드수가 적으면, 화학합성 및 대량생산이 더욱 용이하고, 또한 비용면에서의 장점도 크다. 또한, 화학수식도 용이하고, 생체내 안정성도 높으며, 독성도 낮다고 생각된다.

본 발명의 앱타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 다르고, 리보스(예, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스, 푸린 뉴클레오티드의 리보스)의 2'위치에 있어서 히드록시기를 포함하는 뉴클레오티드(즉, 비치환인 뉴클레오티드)이거나, 혹은 리보스의 2'위치에 있어서, 히드록시기가 임의의 원자 또는 기로 치환(수식)되어 있는 뉴클레오티드(본 발명에 있어서, 「치환 뉴클레오티드」또는 「수식 뉴클레오티드」로 기재하는 경우가 있다)일 수 있다.

이와 같은 임의의 원자 또는 기로서는, 예를 들면, 수소원자, 불소원자 또는-O-알킬기(예, -O-Me기), -O-아실기(예, -O-CHO기), 아미노기(예, -NH₂기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 적어도 1종(예, 1, 2, 3 또는 4종)의 뉴클레오티드가 리보스의 2'위치에 있어서, 히드록시기, 또는 상술한 임의의 원자 또는 기, 예를 들면, 수소원자, 불소원자, 히드록시기 및 -O-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종(예, 2, 3 또는 4종)의 기를 포함하는 수식 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 앱타머에 있어서는 또한, 모든 피리미딘 뉴클레오티드가 리보스의 2'위치에 있어서, 동일 또는 다르고, 불소원자로 치환되는 뉴클레오티드이거나, 또는 상술한 임의의 원자 또는 기, 바람직하게는, 수소원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 앱타머에 있어서는 또한, 모든 푸린 뉴클레오티드가 리보스의 2'위치에 있어서, 동일 또는 다르고, 히드록시기로 치환되는 뉴클레오티드이거나, 또는 상술한 임의의 원자 또는 기, 바람직하게는 수소원자, 메톡시기 및 불소원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되는 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 앱타머에 있어서는 또한, 모든 뉴클레오티드가 리보스의 2'위치에 있어서, 히드록시기, 또는 상술한 임의의 원자 또는 기, 예를 들면, 수소원자, 불소원자, 히드록시기 및 -O-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동일한 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 앱타머는 또한, IL-17의 활성을 저해할 수 있지만, IL-17F의 활성을 저해할 수 없다고 하는 특징을 가질 수 있다. 또한 본 발명의 앱타머는 IL-17과 IL-17수용체의 결합은 저해하지만, IL-17F와 IL-17수용체의 결합은 저해하지 않는다고 하는 특징을 가질 수 있다. IL-17F는 상동성 44％의 IL-17패밀리 단백질이며, 가장 IL-17에 유사하다.

본 발명의 앱타머는 또한,

(a) 서열번호 1∼54의 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민일 수 있음)을 포함하는 앱타머;

(b) 서열번호 1∼54의 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민일 수 있음)에 있어서 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머;

(c) 상기 (a)의 복수의 연결물, 상기 (b)의 복수의 연결물, 상기 (a) 및 (b)의 복수의 연결물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 연결물;

일 수 있다.

상기 (a)∼(c) 중, 바람직한 것은 서열번호 1∼54의 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열이, 서열번호 58, 59 또는 60의 서열인 (a)∼(c)이다.

상기 (a)∼(c) 중, 바람직한 것은 서열번호 1∼54의 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 40 또는 44의 서열인, (a)∼(c)이다.

상기 (b)에 있어서, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 뉴클레오티드수는 수개인 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 약 30개 이하, 바람직하게는 약 20개 이하, 더욱 바람직하게는 약 10개 이하, 더욱더 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 4개, 3개, 2개 또는 1개일 수 있다. 상기 (c)에 있어서 연결은 탠덤 (tandem)결합으로 실행할 수 있다. 또한, 연결할 때에 링커를 이용해도 좋다. 링커로서는, 뉴클레오티드사슬(예, 1∼약 20 뉴클레오티드), 비뉴클레오티드사슬(예, -(CH₂)_n-링커, -(CH₂CH₂0)_n-링커, 헥사에틸렌글리콜링커, TEG링커, 펩티드를 포함하는 링커, -S-S-결합을 포함하는 링커, -CONH-결합을 포함하는 링커, -OP0₃-결합을 포함하는 링커)을 들 수 있다. 상기 복수의 연결물에 있어서의 복수란, 2 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 2개, 3개 또는 4개일 수 있다.

상기 (a)∼(c)에 포함되는 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 다르고, 리보스(예, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스)의 2'위치에 있어서 히드록시기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2'위치에 있어서, 히드록시기가 임의의 기(예, 수소원자, 불소원자 또는 -0-Me기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다.

예를 들면, 상기 (a)∼(c)에 포함되는 각 뉴클레오티드에 있어서,

(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드가 리보스의 2'위치에 있어서, 동일 또는 다르고, 불소원자로 치환되는 뉴클레오티드이거나, 또는 상술한 임의의 원자 또는 기, 바람직하게는 수소원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있으며;

(ii) 각 푸린 뉴클레오티드가 리보스의 2'위치에 있어서, 동일 또는 다르고, 히드록시기로 치환되는 뉴클레오티드이거나, 또는 상술한 임의의 원자 또는 기, 바람직하게는, 수소원자, 메톡시기 및 불소원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는;

앱타머이어도 좋다. 본 발명은 상기 앱타머도 제공한다.

본 발명의 앱타머는 IL-17에 대한 결합성, 안정성, 약물송달성 등을 높이기 위해 각 뉴클레오티드의 당잔기(예, 리보스)가 수식된 것이어도 좋다. 당잔기에 있어서 수식되는 부위로서는, 예를 들면, 당잔기의 2'위치, 3'위치 및/또는 4'위치의 산소원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식(modification)의 종류로서는, 예를 들면, 불소화, O-알킬화(예, 0-메틸화, O-에틸화), O-아릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-아릴화, 아미노화(예, -NH₂)를 들 수 있다. 이와 같은 당잔기의 변경은, 자체 공지의 방법에 의해 수행할 수 있다(예를 들면, Sproat et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145 참조).

본 발명의 앱타머는 또한, IL-17에 대한 결합성 등을 높이기 위해 핵산염기(예, 푸린, 피리미딘)가 변경(예, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이와 같은 변경 (alteration)으로서는, 예를 들면, 5위 피리미딘 변경, 6 및/또는 8위 푸린 변경, 환외 아민에서의 변경, 4-티오우리딘에서의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드 우라실에서의 치환을 들 수 있다. 또한, 뉴클레아제 및 가수분해에 대해서 내성이 있도록 본 발명의 앱타머에 포함되는 인산기가 변경되어 있어도 좋다. 예를 들면, P (0)0기가 P(0)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(0)NR₂(아미데이트), P(0)R, R (0)OR', CO 또는 CH₂(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH₂-CH₂-)으로 치환되어 있어도 좋다〔여기에서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나, 혹은 치환, 또는 비치환된 알킬(예, 메틸, 에틸)이다〕.

연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고 이들의 연결기를 통해서 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.

변경은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 6'의 변경을 포함해도 좋다.

변경은 추가로 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(Myristoyl), 리토콜릭-오레일(Lithocolic-oleyl), 도코사닐(Docosanyl), 라우로일, 스테아로일, 팔미토일, 오레오일(Oleoyl), 리노레오일 (Linoleoyl), 그 밖의 지방질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 바이오틴 등을 말단에 부가함으로써 이루어질 수 있다. 이와 같은 변경에 대해서는, 예를 들면, 미국 특허 제5. 660.985호, 동 제5.756.703호를 참조할 것.

본 발명의 앱타머는 본 명세서 중의 개시 및 해당 기술분야에 있어서의 자체 공지의 방법에 의해 화학 합성할 수 있다. 앱타머는 인산기의 마이너스전하를 이용한 이온결합, 리보스를 이용한 소수(疏水)결합 및 수소결합, 핵산염기를 이용한 수소결합이나 스태킹결합 등 다양한 결합양식에 의해 표적물질과 결합한다. 특히, 구성 뉴클레오티드의 수만큼 존재하는 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온결합은 강하고, 단백질의 표면에 존재하는 라이신이나 아르기닌의 플러스 전하와 결합한다. 이로 인해, 표적물질과의 직접적인 결합에 관여하고 있지 않은 핵산염기는 치환할 수 있다. 특히, 줄기(stem)구조의 부분은 이미 염기쌍이 만들어져 있으며, 또한, 이중나선구조의 내측을 향하고 있으므로, 핵산염기는 표적물질과 직접 결합하기 어렵다. 따라서, 염기쌍을 다른 염기쌍에 치환해도 앱타머의 활성은 감소하지 않는 경우가 많다. 루프구조 등 염기쌍을 만들고 있지 않은 구조에 있어서도 핵산염기가 표적분자와의 직접적인 결합에 관여하고 있지 않은 경우에, 염기의 치환이 가능하다. 리보스의 2'위치의 수식에 관해서는, 보기 드물게 리보스의 2'위치의 작용기가 표적분자와 직접적으로 상호작용하고 있는 일이 있지만, 많은 경우 무관계이며, 다른 수식분자에 치환가능하다. 이와 같이 앱타머는 표적분자와의 직접적인 결합에 관여하고 있는 작용기를 치환 또는 삭제하지 않는 한, 그 활성을 보관 유지하고 있는 일이 많다. 또한, 전체의 입체구조가 크게 변하지 않는 것도 중요하다.

앱타머는 SELEX법 및 그의 개량법(예를 들면, Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510)을 이용하는 것으로 제작할 수 있다. SELEX법에서는 라운드수를 늘리거나 경합물질을 사용하는 것으로, 표적물질에 대해서 더욱 결합력이 강한 앱타머가 농축되고, 선별되어 온다. 따라서, SELEX의 라운드수를 조절하거나 및/또는 경합상태를 변화시키는 것으로, 결합력이 다른 앱타머, 결합형태가 다른 앱타머, 결합력이나 결합형태는 같지만 염기서열이 다른 앱타머를 얻을 수 있는 경우가 있다. 또한, SELEX법에는 PCR에 의한 증폭과정이 포함되지만, 그 과정에서 망간이온을 사용하는 등으로 하여 변이를 넣는 것으로 더욱 다양성이 풍부한 SELEX를 실시하는 것이 가능하게 된다.

SELEX로 얻어지는 앱타머는 표적물질에 대해서 친화성이 높은 핵산이며, 그것은 표적물질의 활성부위에 결합하는 것을 의미하지 않는다. 따라서, SELEX로 얻어지는 앱타머는 반드시 표적물질의 기능에 작용한다고는 한정되지 않는다. IL-17은 염기성 단백질이며, 핵산이 비특이적으로 결합하기 쉽다고 생각된다. 활성부위에 결합하지 않는 앱타머는 그 표적물질의 활성에 영향을 미치지 않는다. 실제, 컨트롤(control)로 이용한 RNA는 IL-17과 IL-17수용체의 결합을 저해하지 않았다.

이와 같이 해서 선택된 활성이 있는 앱타머는, 최적화 SELEX를 실시하는 것으로 더욱 고성능화하는 것이 가능하다. 최적화 SELEX란, 어느 서열이 정해져 있는 앱타머의 일부를 랜덤서열로 한 템플릿이나 10∼30％ 정도의 랜덤서열을 도프 한 템플릿을 제작하고, 재차 SELEX를 실시하는 것이다.

SELEX로 얻어지는 앱타머는 70 뉴클레오티드 정도의 길이가 있으며, 이것을 그대로 의약으로 하는 것은 어렵다. 그래서, 시행착오를 반복하고, 용이하게 화학합성을 할 수 있는 50 뉴클레오티드 정도 이하의 길이까지 짧게 할 필요가 있다.

SELEX로 얻어지는 앱타머는 그 프라이머 설계에 의존하고, 그 후의 최소화 작업의 용이성이 바뀐다. 잘 프라이머를 설계하지 않으면 SELEX에 의해서 활성이 있는 앱타머를 선별할 수 있었다고 해도, 그 후의 개발이 불가능하게 된다. 본 발명에서는 23 뉴클레오티드(서열번호 40)나 33 뉴클레오티드(서열번호 44)라도 활성을 보관 유지하고 있는 앱타머를 얻을 수 있고, 이들의 서열이 IL-17과 결합하기 위해 특히 중요하다는 것을 알았다.

앱타머는 화학합성이 가능하므로, 변경이 용이하다. 앱타머는 MFOLD 프로그램을 이용하여 2차 구조를 예측하거나 X선 해석이나 NMR 해석에 의해서 입체구조를 예측하는 것으로, 어느 뉴클레오티드를 치환 또는 결손하는 것이 가능한가, 또한, 어디에 새로운 뉴클레오티드를 삽입 가능한가를 어느 정도 예측할 수 있다. 예측된 새로운 서열의 앱타머는 용이하게 화학합성 할 수 있으며, 그 앱타머가 활성을 보관 유지하고 있을지 아닐지 기존의 어세이(assay)계에 의해 확인할 수 있다.

얻어진 앱타머의 표적물질과의 결합에 중요한 부분이, 상기와 같은 시행착오를 반복함으로써 특정할 수 있었던 경우, 그 서열의 양단에 새로운 서열을 부가해도 많은 경우 활성은 변화하지 않는다. 새로운 서열의 길이는 특별히 한정되는 것은 아니다.

수식에 관해서도 서열과 똑같이 고도로 설계 또는 변경이 가능하다.

이상과 같이, 앱타머는 고도로 설계 또는 변경이 가능하다. 본 발명은 또한 소정의 서열(예, 줄기 부분, 인터널 루프 부분, 헤어핀 루프 부분 및 한 가닥 사슬 부분으로부터 선택되는 부분에 대응하는 서열: 이하, 필요에 따라서 고정서열로 생략한다)을 포함하는 앱타머를 고도로 설계 또는 변경 가능한 앱타머의 제조방법을 제공한다.

예를 들면, 이와 같은 앱타머의 제조방법은, 하기:

[프라이머용 서열(i)]-(N)a-고정서열-(N)b-[프라이머용 서열(ii)]

[상기에 있어서, (N)a는 a개의 N으로 이루어지는 뉴클레오티드 사슬을 나타내고, (N)b는 b개의 N으로 이루어지는 뉴클레오티드 사슬을 나타내며, N은 각각, 동일 또는 다르고, A, G, C, U 및 T(바람직하게는, A, G, C 및 U)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드이다. a, b는 각각, 동일 또는 다르고, 임의의 수일 수 있지만, 예를 들면 1∼약 100, 바람직하게는 1∼약 50, 더욱 바람직하게는 1∼약 30, 더욱더 바람직하게는 1∼약 20 또는 1∼약 1O일 수 있다.〕로 나타내는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 단일종의 핵산분자 또는 복수종의 핵산분자(예, a, b의 수 등이 다른 핵산분자의 라이브러리), 및 프라이머용 서열(i), (ii)에 각각 대응하는 프라이머쌍을 이용하여 고정서열을 포함하는 앱타머를 제조하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 앱타머 및 그것에 결합한 기능성 물질을 포함하는 복합체를 제공한다. 본 발명의 복합체에 있어서의 앱타머와 기능성 물질간의 결합은 공유결합, 또는 비공유결합일 수 있다. 본 발명의 복합체는 본 발명의 앱타머와 1 이상(예, 2 또는 3개)의 동종 또는 이종의 기능성 물질이 결합한 것일 수 있다. 기능성 물질은 본 발명의 앱타머에 어떤 기능을 새롭게 부가하는 것, 혹은 본 발명의 앱타머가 보관 유지할 수 있는 어떤 특성을 변화(예, 향상)시킬 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 기능성 물질로서는, 예를 들면, 단백질, 펩티드, 아미노산, 지방질, 당질, 단당, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드를 들 수 있다. 기능성 물질로서는 또한, 예를 들면, 친화성 물질(예, 바이오틴, 스트렙타아비딘, 표적상보서열에 대해서 친화성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 항체, 글루타티온세파로오스, 히스티딘), 표식용 물질(예, 형광물질, 발광물질, 방사성 동위체), 효소(예, 겨자무과산화효소, 알칼리 포스파타아제), 약물송달매체(예, 리포솜, 마q이크로오스피어, 펩티드, 폴리에틸렌글리콜류), 약물(예, 컬리케어마이신 (calicheamycin)이나 듀오칼마이신 등 미사일요법에 사용되고 있는 것, 시클로포스파미드, 멜파란, 이포스파마이드 또는 트로포스파미드 등의 질소머스타드유사체, 티오테파 등의 에틸렌이민류, 카르무스틴 등의 니트로소요소, 테모졸로마이드 또는 다카르바진 등의 리스트제, 메토트렉세이트 또는 랄티트렉시드(raltitrexed) 등의 엽산유사대사길항제, 티오 구아닌, 클라드리빈 또는 플루다라빈 등의 푸린 유사체, 플루오로우라실, 테가푸르 또는 겜시타빈 등의 피리미딘 유사체, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈 등의 빈카 알카로이드(vinca alkaloid) 및 그 유사체, 에토포시드, 탁산, 도세탁셀 또는 파클리탁셀 등의 포도필로톡신 유도체, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신 및 미톡산트론 등의 안트라사이클린류 및 유사체, 블레오마이신 및 미토마이신 등의 다른 세포독성항생물질, 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴 등의 백금화합물, 펜토스타틴, 밀테포신, 에스트라무스틴, 토포테칸, 이리노테칸 및 비칼루타마이드), 독소(예, 리신독소, 리어독소 및 베로독소)를 들 수 있다. 이들의 기능성 분자는 최종적으로 제거되는 경우가 있다. 또한, 트론빈이나 메트릭스 메탈로프로테이네이즈(MMP), 팩터X 등의 효소가 인식해서 절단할 수 있는 펩티드, 뉴클레아제나 제한효소를 절단할 수 있는 폴리뉴클레오티드이어도 좋다.

본 발명의 앱타머 또는 복합체는, 예를 들면, 의약 또는 진단약, 검사약, 시약으로서 사용될 수 있다. 특히, 자기면역질환 및 염증을 동반하는 질환의 의약 또는 진단약, 검사약, 시약으로서 유용하다.

여기에서 자기면역질환 및 염증을 동반하는 질환으로서는, 다발성 경화증, 전신성 에리테마토데스(SLE), 강피증, 쇼그렌 증후군, 다발성 근육염(PM), 피부근육염(DM), 류머티즘성 관절염(만성관절류머티즘(RA), 변형성 관절증(0A)), 염증성 장염(크론병 등), 진행성 전신성 경화증(PSS), 결절성 동맥 주위염(PN), 갑상선 질환(바제도병 등), 귈랑바레 증후군(guillain-Barre syndrome), 원발성 담즙성 간경변(PBC), 특발성 혈소판 감소성 자반병, 자기면역 용혈성 빈혈, 중증근무력증(㎎), 근위축성 측색경화증(ALS), I형 당뇨병, 건선, 천식, 호중구 기능 이상, 호산구성 폐렴, 돌발성 폐선유증, 과민성 폐렴, 식도암, 갑상선암, 방광암, 대장암, 위암, 췌장암, 흉부암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 유방암, 신경아세포종, 뉴로글래스토마(neuroglastoma), 교모세포종, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 빌름스종양, 전립선암, 이식시의 거절반응, 이식편대숙주병, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식 과민증, 두드러기, 수술후 유착, 자궁내막증, 성인성 치주염, 기관지염, COPD, 감염증 등을 들 수 있다. 특히, 다발성 경화증, 류머티즘성 관절염, 염증성 장염, 강피증, 천식, 이식편대숙주병을 들 수 있다.

또한 본 발명의 앱타머 또는 복합체는 약물송달제, 인비보이메이징(in vivo imaging)용 프로브, IL-17의 혈중농도측정용 프로브, 조직염색용 프로브, ELISA용 프로브, IL-17의 분리정제용 리간드로서도 사용될 수 있다.

IL-17은 섬유아세포, 내피세포, 상피세포, 연골세포, 골아세포, 수상세포전구세포, 골수유래간질조포, T세포, 대식세포, 호중구 등의 각종 세포에 작용하는 것이 알려져 있다. IL-17은 이들의 세포에 작용하는 것으로 각종 사이트카인, 케모카인, 수용체의 생산 및 발현을 유도한다. 구체적으로는 CXCL1(KC 또는 Groα), CXCL2(MIP2 또는 Gr0β), CXCL5(LIX), CXCL6(GCP-2), CXCL8(IL-8), CXCL9(MIG), CXCL10(IP10), CXCL11(I-TAC), CCL2(MCP-1), CCL5(RANTES), CCL7(MCP-3), CCL11 (Eotaxin), CXCL12(SDF-1), CCL20(MIP3α, IL-1, IL-6, IL-8, IL-19, TNF, CSF2 (GM-CSF), CSF3(G-CSF), ICAM-1, VCAM-1, PTGS2(COX2), NOS2(iNOS), LCN2(24p3), DEFB4(BD2), S100A7(Psoriasin), S100A8(Calgranulin A), S100A9(Calgranulin B), MUC5AC, MUC5B, EREG, SOCS3, TNFSF11(RANKL), MMP1, MMP3, MMP9, MMP13, TIMP1, ADAMTS4, PGE2, SCF, CD80, CD86, MHC 등을 들 수 있다. 따라서 본 발명의 앱타머 또는 복합체는 이들의 세포 및 사이트카인, 케모카인 등에 관계한 질환의 의약 또는 진단약, 검사약, 시약으로서 사용될 수 있다.

IL-17은 그 수용체에 결합하는 것으로 Act1이나 TRAF6을 활성화하고, NF-κB경로나 MAP키나제경로, C/EBP경로 등을 활성화한다. 따라서, 본 발명의 앱타머 또는 복합체는 이들의 시그널전달경로의 활성화에 관계한 질환의 의약 또는 진단약, 검사약, 시약으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 앱타머 또는 복합체는 또한, 자기면역질환(예, 다발성 경화증, 전신성 에리테마토데스(SLE), 강피증, 쇼그렌 증후군, 다발성 근육염(PM), 피부근육염(DM), 류머티즘성 관절염(만성관절류머티즘(RA), 변형성 관절증(0A)), 염증성 장염(크론병 등), 진행성 전신성 경화증(PSS), 결절성 동맥 주위염(PN), 갑상선 질환 (바제도병 등), 귈랑바레 증후군, 원발성 담즙성 간경변(PBC), 특발성 혈소판 감소성 자반병, 자기면역 용혈성 빈혈, 중증근무력증(㎎), 근위축성 측색경화증(ALS), I형 당뇨병, 건선, 천식, 호중구 기능 이상, 호산구성 폐렴, 돌발성 폐선유증, 과민성 폐렴), 암(예, 식도암, 갑상선암, 방광암, 대장암, 위암, 췌장암, 흉부암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 유방암, 신경아세포종, 뉴로글래스토마(neuroglastoma), 교모세포종, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 빌름스종양, 전립선암), 이식질환(예, 거절반응, 이식편대숙주병), 알레르기(예, 천식, 알레르기성 비염, 아트피성 피부염, 음식 과민증, 두드러기), 그 밖에 염증과 관련하는 질환(예, 수술후 유착, 자궁내막증, 성인성 치주염, 기관지염, COPD), 감염증 등의 여러 가지 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 앱타머는 다발성 경화증, 류머티즘성 관절염, 염증성 장염, 강피증, 천식, 이식편대숙주병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 의약은 의약상 허용되는 담체가 배합된 것일 수 있다. 의약상 허용 되는 담체로서는, 예를 들면, 자당, 전분, 만니트(mannit), 솔비트, 유당, 글루코스, 셀룰로오스, 탈크, 인산칼슘, 탄산칼슘 등의 부형제, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 폴리프로필렌피롤리돈, 젤라틴, 아라비아고무, 폴리에틸렌글리콜, 자당, 전분 등의 결합제, 전분, 카르복시 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필전분, 나트륨-글리콜전분, 탄산수소나트륨, 인산칼슘, 구연산 칼슘 등의 붕괴제, 스테아린산마그네슘, 에어로실, 탈크, 라우릴황산나트륨 등의 윤활제, 구연산, 멘톨, 글리시르리진ㆍ암모늄염, 글리신, 오렌지가루 등의 방향제, 안식향산나트륨, 아황산수소나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등의 보존제, 구연산, 구연산 나트륨, 초산 등의 안정제, 메틸 셀룰로오스, 폴리비닐피로리돈, 스테아린산알루미늄 등의 현탁제, 계면활성제 등의 분산제, 물, 생리 식염수, 오렌지 쥬스 등의 희석제, 카카오지방, 폴리에틸렌글리콜, 백등유 등의 베이스 왁스 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.

경구투여에 매우 적합한 제재는, 물, 생리식염수, 오렌지 쥬스와 같은 희석액에 유효량의 리간드를 용해시킨 액제, 유효량의 리간드를 고체나 과립으로서 포함하고 있는 캡슐제, 사쉐(sachet)제 또는 정제, 적당한 분산매 중에 유효량의 유효성분을 현탁시킨 현탁액제, 유효량의 유효성분을 용해시킨 용액을 적당한 분산매 중에 분산시켜 유화시킨 유제 등이다.

또한, 본 발명의 의약은 필요에 의해, 맛의 마스킹, 장용성(腸溶性) 혹은 지속성 등의 목적을 위해, 자체 공지의 방법으로 코팅할 수 있다. 코팅에 이용되는 코팅제로서는, 예를 들면, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 트인 80, 풀로닉(Pluronic) F68, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트, 히드록시메틸셀룰로오스 아세테이트 석신산, 유드라짓 (Eudragit)(롬사제, 독일, 메타아크릴산ㆍ아크릴산 공중합체) 및 색소(예, 적산화철(Bengala), 이산화티탄 등)등이 이용된다. 해당 의약은 속방성 제제, 서방성 제제의 어느 것이라도 좋다. 서방의 기재로서는, 예를 들면, 리포솜, 아텔로콜라겐, 젤라틴, 히드록시 아파타이트, PLGA 등을 들 수 있다.

비경구적인 투여(예를 들면, 정맥 내 투여, 피하투여, 근육 내 투여, 국소투여, 복강 내 투여, 경비투여, 경폐투여 등)에 매우 적합한 제재로서는, 수성 및 비수성의 등장(等張)인 무균의 주사액제가 있으며, 이것에는 항산화제, 완충액, 제균제, 등장화제 등이 포함되어 있어도 좋다. 또한, 수성 및 비수성의 무균의 현탁액제를 들 수 있으며, 이것에는 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 방부제 등이 포함되어 있어도 좋다. 해당 제재는 앰플이나 바이알(vial)과 같이 단위투여량 혹은 복수회 투여량씩 용기에 봉입할 수 있다. 또한, 유효성분 및 의약상 허용되는 담체를 동결건조하고, 사용 직전에 적당한 무균의 용매에 용해 또는 현탁하면 좋은 상태로 보존할 수도 있다. 또한, 주사액제 이외에도 흡입제, 연고제도 가능하다. 흡입제의 경우, 동결건조상태의 유효성분을 미세화하고 적당한 흡입디바이스를 이용하여 흡입 투여한다. 흡입제로서는 추가로 필요에 따라서 종래부터 사용되고 있는 계면활성제, 기름, 조미료, 시클로덱스트린 또는 그 유도체 등을 적절히 배합할 수 있다.

여기에서 계면활성제로서는, 예를 들면 올레인산, 레시틴, 디에틸렌글리콜디올리에이트, 테트라히드로프루프릴올리에이트, 에틸렌올리에이트, 이소프로필 미리스테이트, 글리세릴트리올리에이트, 글리세릴모노라우레이트, 글리세릴모노올리에이트, 글리세릴모노스테아레이트, 글리세릴모노리시노에이트, 세틸알코올, 스테아릴알코올, 폴리에틸렌글리콜 400, 염화 세틸피리디늄, 소르비탄트리올리에이트(상품명 Span 85), 소르비탄모노올리에이트(상품명 Span 80) , 소르피탄모노라우레이트(상품명 Span 20) , 폴리옥시에틸렌 경화 피마자기름(상품명 HCO-60), 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄모노라우레이트(상품명 Tween 20) , 폴리옥시에틸렌(20) 소르피탄모노올리에이트(상품명 Tween 80), 천연자원 유래의 레시틴(상품명 EPICLON), 올레일폴리옥시에틸렌(2) 에테르(상품명 Brij 92), 스테아릴폴리옥시에틸렌(2) 에테르(상품명 Brij 72), 라우릴폴리옥시에틸렌(4) 에테르(상품명 Brij 30), 올레일폴리옥시에틸렌(2) 에테르(상품명 Genapol 0-020), 옥시에틸렌과 옥시프로필렌의 블록공중합체(상품명 Synperonic) 등을 들 수 있다. 기름으로서는, 예를 들면 옥수수유, 올리브유, 면실유, 해바라기유 등을 들 수 있다. 또한, 연고제의 경우, 적당한 의약상 허용되는 기제(황색 바셀린, 백색 바셀린, 파라핀, 플라스티베이스, 실리콘, 백색 연고, 밀랍, 돈유, 식물유, 친수 연고, 친수 바셀린, 정제라놀린, 가수라놀린, 흡수 연고, 친수플라스티베이스, 매크로골 연고 등)을 이용하고, 유효성분과 혼합하여 제재화해서 사용한다.

흡입제는 통상의 방법에 따라서 제조할 수 있다. 즉, 상기 본 발명의 앱타머 또는 복합체를 분말 또는 액상으로 하여, 흡입분사제 및/또는 담체 중에 배합하고, 적당한 흡입용기에 충전함으로써 제조할 수 있다. 또 상기 본 발명의 앱타머 또는 복합체가 분말의 경우는 통상의 기계적 분말흡입기를, 액상의 경우는 네뷸라이저(nebulizer) 등의 흡입기를 각각 사용할 수도 있다. 여기에서 분사제로서는 종래 공지의 것을 널리 사용할 수 있으며, 프레온-11, 프레온-12, 프레온-21, 프레온-22, 프레온-113, 프레온-114, 프레온-123, 프레온-142c, 프레온-134a, 프레온-227, 프레온-C318, 1, 1, 1, 2-테트라플루오로에탄 등의 프레온계 화합물, 프로판, ISO부탄, n-부탄 등의 탄화수소류, 디에틸에테르 등의 에테르류, 질소가스, 탄산가스 등의 압축가스 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 의약의 투여량은 유효성분의 종류ㆍ활성, 질병의 중독도(重篤度), 투여대상이 되는 동물종, 투여대상의 약물수용성, 체중, 연령 등에 따라서 다르지만, 통상, 성인 1일당 유효성분량으로서 약 0.0001∼약 100㎎/㎏ , 예를 들면 약 0.0001∼약 10㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.005∼약 1㎎/㎏일 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 앱타머 또는 복합체가 고정화된 고상 담체를 제공한다. 고상 담체로서는, 예를 들면 기판, 수지, 플레이트(예, 멀티 웰 플레이트), 필터, 카트리지, 칼럼, 다공질재를 들 수 있다. 기판은, DNA칩이나 프로테인 칩 등에 사용되고 있는 것 등 일 수 있으며, 예를 들면, 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌)기판이나 유리기판, 아파타이트기판, 실리콘기판, 알루미나기판 등이고, 이들 기판에 폴리머 등의 코팅을 행한 것을 들 수 있다. 수지로서는, 예를 들면 아가로오스입자, 실리카입자, 아크릴아미드와 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체, 폴리스티렌 가교 디비닐벤젠입자, 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교 한 입자, 셀룰로오스 파이버, 아릴덱스트란과 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교 폴리머, 단분산계 합성 폴리머, 단분산계 친수성 폴리머, 세파로오스 (Sepharose), 토요펄(Toyopearl) 등을 들 수 있으며, 또한, 이들 수지에 각종 작용기를 결합시킨 수지도 포함된다. 본 발명의 고상 담체는, 예를 들면 IL-17의 정제, 및 IL-17의 검출, 정량에 유용할 수 있다.

본 발명의 앱타머 또는 복합체는 자체 공지의 방법에 의해 고상 담체에 고정 할 수 있다. 예를 들면, 친화성 물질(예, 상술한 것)이나 소정의 작용기를 본 발명의 앱타머 또는 복합체에 도입하고, 이어서 해당 친화성 물질이나 소정의 작용기를 이용하여 고상 담체에 고정화하는 방법을 들 수 있다. 본 발명은 또한, 이와 같은 방법을 제공한다. 소정의 작용기는 커플링 반응에 제공하는 것이 가능한 작용기일 수 있으며, 예를 들면, 아미노기, 티올기, 히드록시기, 카르복실기를 들 수 있다. 본 발명은 또한, 이와 같은 작용기가 도입된 앱타머를 제공한다.

본 발명은 또한, IL-17의 정제 및 농축방법을 제공한다. 특히 본 발명은 IL-17을 다른 패밀리 단백질로부터 분리하는 것이 가능하다. 본 발명의 정제 및 농축방법은 본 발명의 고상 담체에 IL-17을 흡착시키고, 흡착한 IL-17을 용출액에 의해 용출시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 고상 담체로의 IL-17의 흡착은 자체 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들면, IL-17을 함유하는 시료(예, 세균 또는 세포의 배양물 또는 배양상청, 혈액)를 본 발명의 고상 담체 또는 그 함유물에 도입한다. IL-17의 용출은 중성용액 등의 용출액을 이용해서 실시할 수 있다. 중성용출액은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 pH 약 6∼약 9, 바람직하게는 약 6.5∼약 8.5, 더욱 바람직하게는 약 7∼약 8일 수 있다. 중성용액은 또한, 예를 들면, 나트륨염(예, NaCl), 칼륨염(예, KCl), 마그네슘염(예, MgCl₂), 계면활성제(예, Tween 20, Triton, NP 40), 글리세린을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 정제 및 농축방법은 또한 IL-17의 흡착 후, 세정액을 이용해서 고상 담체를 세정하는 것을 포함할 수 있다. 세정액으로서는, 예를 들면, 요소, 킬레이트제(예, EDTA), Tris, 산, 알칼리, Tranfer RNA, DNA, Tween 20 등의 표면활성제, NaCl 등의 염을 포함하는 것 등을 들 수 있다. 본 발명의 정제 및 농축방법은 또한 고상 담체를 가열 처리하는 것을 포함할 수 있다. 이와 같은 공정에 의해, 고상 담체의 재생, 멸균이 가능하다.

본 발명의 앱타머 또는 복합체는 검출용 프로브, 특히 IL-17의 검출용 프로브로서 이용할 수 있다. 앱타머의 표식방법으로서는 특별히 한정되지 않고, 자체 공지의 방법이 적용 가능하다. 이와 같은 방법으로서는, 예를 들면 방사성 동위원소에 의한 표식, 형광색소나 형광단백질에 의한 표식 등을 들 수 있다.

본 발명은 또한, IL-17의 검출 및 정량방법을 제공한다. 특히 본 발명은 IL-17을 다른 패밀리 단백질과 구별해서 검출 및 정량할 수 있다. 본 발명의 검출 및 정량방법은 본 발명의 앱타머를 이용해서(예, 본 발명의 복합체 및 고상 담체의 사용에 의해) IL-17을 측정하는 것을 포함할 수 있다. IL-17의 검출 및 정량방법은 항체 대신에 본 발명의 앱타머를 이용하는 것 이외는, 면역학적 방법과 똑같은 방법에 의해 실시될 수 있다. 따라서, 항체 대신에 본 발명의 앱타머를 이용함으로써, 효소면역측정법(EIA)(예, 직접경합 ELISA, 간접경합 ELISA, 샌드위치 ELISA), 방사면역측정법(RIA), 형광면역측정법(FIA), 웨스턴블롯법(예, 웨스턴블롯법에 있어서의 2차 항체의 대신으로서의 사용), 면역조직화학적 염색법, 셀 소팅법 등의 방법과 똑같은 방법에 의해 검출 및 정량을 실시할 수 있다. 이와 같은 방법은, 예를 들면 생체 또는 생물학적 샘플에 있어서의 IL-17량의 측정, IL-17이 관련되는 질환의 진단에 유용할 수 있다.

본 명세서 중에서 들어진 특허 및 특허 출원 명세서를 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 본 명세서에서의 인용에 의해 그 모두가 명시되었다고 같은 정도로 본 명세서에 편입되는 것이다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예 등에 하등 제약되는 것은 아니다.

실시예

실시예1 : IL -17에 특이적으로 결합하는 핵산의 제작

IL-17에 특이적으로 결합하는 핵산은 SELEX법을 이용해서 제작했다. SELEX는 Ellington들의 방법(Ellington and Szostak, Nature 346, 818-822, 1990) 및 Tuerk들의 방법(Tuerk and Gold. Science 249, 505-510, 1990)을 개량하여 실시했다. 표적물질로서 인간IL-17(Peprotech사제)를 이용했다. IL-17은 아미노 커플링에 의해서 아가로오스 수지(NHS-activated Sepharose, GE헬스케어사제)에 고정화했다. 아미노 커플링은 GE헬스케어사의 시방서에 따라 실시했다. 고정화량은 고정화전의 IL-17용액과 고정화 직후의 상청을 SDS-PAGE에 의해 조사하는 것으로 확인했다. SDS-PAGE의 결과, 상청으로부터는 IL-17의 밴드는 검출되지 않고, 사용한 IL-17의 거의 모두가 커플링된 것이 확인되었다. 약 400pmol의 IL-17이 약 10㎕의 수지에 고정화된 것이 된다.

최초의 라운드에서 이용한 RNA(30N-RNA)는 화학합성에 의해서 얻어진 DNA를 DuraScribe^TM T7 Transcription Kit(Epicentre사제)를 이용해서 전사하여 얻었다. 이 방법에 의해 얻어진 RNA는 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'위치가 플루오르화된 것이다. DNA주형으로서 이하에 나타내는 30뉴클레오티드의 랜덤서열의 양단에 프라이머서열을 가진 길이 89뉴클레오티드의 DNA를 이용했다. DNA주형과 프라이머는 화학합성에 의해서 제작했다. 이하에 이용한 DNA주형과 프라이머를 나타낸다.

DNA주형:

5'-tcacactagcacgcatagg-30N-catctgacctctctcctgctccc-3'(서열번호 55)

프라이머 Fwd:

5'-taatacgactcactatagggagcaggagagaggtcagatg-3'(서열번호 56)

프라이머 Rev:

5'-tcaeactagcacgcatagg-3'(서열번호 57)

N은 A, G, C 또는 T의 어느 하나를 나타낸다. 프라이머 Fwd는 T7RNA폴리메라제의 프로모터 서열을 포함하고 있다. 최초의 라운드에서 이용한 RNA풀의 변이는 이론상 10¹⁴이었다.

IL-17이 고정화된 수지에 RNA풀을 가하고, 30분 실온에서 보관 유지했다. 30분 후, IL-17에 결합하지 않은 RNA를 제거하기 위해, 용액 A로 수지를 세정했다. 여기에서 용액 A는 145mM 염화나트륨, 5.4mM 염화칼륨, 1.8mM 염화칼슘, O.8mM 염화마그네슘, 20mM 트리스(pH7.6), 0.05％ Tween 20의 혼합용액이다. IL-17에 결합한 RNA는 용출액을 가하여 실온에서 10분간 교반하는 것으로 회수했다. 용출액으로서 용액 A에 6M 구아니딘 염산염을 가해 pH7.6으로 조제한 것을 이용했다. 회수된 RNA는 RT-PCR로 증폭하고, DuraScribe^TM T7 Transcription Kit로 전사하여 다음 라운드의 풀로서 이용했다. 이상을 1라운드로 하고, 똑같은 작업을 8라운드 실시했다. SELEX종료 후, PCR산물을 pGEM-T Easy 벡터(Promega사제)에 클로닝하고, 대장균주 DH5α(Toyobo사제)에 형질전환했다. 싱글 콜로니로부터 플라스미드를 추출 후, DNA시퀸서(3130xl Genetic Analyzer, ABI사제)로 48클론의 염기서열을 조사했다.

SELEX를 6라운드 실시한 후에 서열을 조사한 바, 서열에 수속(收束)이 보였다. 서열번호 1로 나타내는 서열은 11서열 존재하고, 2염기 치환체가 1서열 존재했다. 서열번호 2로 나타내는 서열은 6서열 존재했다. 서열번호 3∼6으로 나타내는 서열은 2서열 존재했다. 서열번호 7∼28로 나타내는 서열은 1서열이었다. 서열번호 1과 2로 나타내는 서열에는 gauagcgaagucauugagcgc(서열번호 58; 21뉴클레오티드)의 공통서열이 포함되어 있었다. 또한, 서열번호 6∼21로 나타내는 서열에는 ggagucag(서열번호 59; 8뉴클레오티드)의 공통서열이 포함되어 있었다. 서열번호 1과 2로 나타내는 서열의 2차 구조를 MFOLD 프로그램(M. Zuker, Nucleic Acids Res. 31(13), 3406-3415, 2003)을 이용해서 예측한 바, 공통서열의 부분이 같은 형상이 되었다(도 1 및 2 참조).

다음으로 SELEX 8라운드의 서열을 조사했다. 6라운드보다도 수속하고 있으며, 서열번호 1과 2로 나타내는 서열이 각각 25서열과 7서열 존재했다. 서열번호 1로 나타내는 서열의 2염기 치환체가 1서열, 서열번호 2로 나타내는 서열의 1염기 치환체가 1서열 존재했다. 서열번호 29∼31로 나타내는 서열은 각각 4, 3, 2서열 존재했다. 서열번호 32∼36으로 나타내는 서열은 1서열 존재했다. 서열번호 29로 나타내는 서열에는 서열번호 58의 공통서열이 포함되어 있었다. 서열번호 29로 나타내는 서열의 2차 구조를 MFOLD 프로그램을 이용해서 예측한 바, 공통서열의 부분이 서열번호 1과 2로 나타내는 서열에 포함되어 있었던 공통서열과 같은 형상이 되었다(도 3 참조). 또한, 서열번호 30과 31로 나타내는 서열에는 서열번호 59의 공통서열이 포함되어 있었다. 또한, 서열번호 7, 9, 13, 21 및 30으로 나타내는 서열에는 ggaggagucaguaauc(서열번호 60; 16뉴클레오티드)의 공통서열이 포함되어 있었다. 서열번호 60으로 나타내는 공통서열은 서열번호 59를 함유한다. 이들 서열의 2차 구조를 MFOLD 프로그램을 이용해서 예측한 바, 공통서열의 부분이 같은 형상이 되었다(도 4∼6 참조). 서열번호 59로 나타내는 공통서열을 사각으로 둘러싸고, 서열번호 60으로 나타내는 공통서열의 나머지의 서열에 *(별표)를 붙였다.

이하에 각각의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 또한, 각 뉴클레오티드에 있어서의 괄호는 리보스의 2'위치의 수식을 나타낸다. 또 F는 불소원자를 나타내고, M은 OMe를 나타낸다. 구체적으로는 c(F)는 리보스의 2'위치가 불소원자로 치환된 시티딘을 나타내고, u(F)는 리보스의 2'위치가 불소원자로 치환된 우리딘을 나타낸다. 또 a(M)은 리보스의 2'위치가 OMe로 치환된 아데노신을 나타내고, g(M)은 리보스의 2'위치가 OMe로 치환된 구아노신을 나타내며, c(M)은 리보스의 2'위치가 OMe로 치환된 시티딘을 나타낸다(이하 동일).

또 각 서열의 선두는 5'말단이며, 종단이 3'말단이다.

서열번호 1:

gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gggc(F)agc(F)agaggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga

서열번호 2:

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서열번호 3:

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서열번호 4:

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서열번호 5:

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서열번호 6:

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서열번호 7:

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서열번호 8:

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서열번호 9:

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서열번호 10:

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서열번호 11:

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서열번호 12:

gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)gau(F)c(F)gu(F)u(F)gc(F)c(F)ggac(F)u(F)u(F)gc(F)c(F)c(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga

서열번호 13:

gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)gu(F)u(F)gaac(F)c(F)ggagc(F)au(F)c(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga

서열번호 14:

gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gau(F)gac(F)aggagu(F)c(F)agau(F)au(F)au(F)gc(F)ac(F)au(F)u(F)u(F)gac(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga

서열번호 15:

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서열번호 16:

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서열번호 17:

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서열번호 18:

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서열번호 19:

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서열번호 20:

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서열번호 21:

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서열번호 22:

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서열번호 23:

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서열번호 24:

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서열번호 25:

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서열번호 26:

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서열번호 27:

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서열번호 28:

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서열번호 29:

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서열번호 30:

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서열번호 31:

gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggaagu(F)ggagu(F)c(F)agau(F)au(F)agc(F)aau(F)au(F)u(F)au(F)gac(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga

서열번호 32:

gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gggc(F)agc(F)ggaggau(F)ggc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gggc(F)gc(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)ggu(F)ggag

서열번호 33:

gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggaggagc(F)c(F)agu(F)gau(F)c(F)gu(F)u(F)gac(F)c(F)u(F)c(F)aau(F)gc(F)ac(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga

서열번호 34:

gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)ggaggagac(F)agu(F)gau(F)c(F)gu(F)u(F)gac(F)c(F)c(F)ac(F)c(F)gggu(F)c(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga

서열번호 35:

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서열번호 36:

gggagc(F)aggagagaggu(F)c(F)agau(F)gu(F)au(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gac(F)aaagc(F)c(F)ggc(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)ga

서열번호 1∼6 및 29∼36으로 나타내는 핵산의 IL-17에 대한 결합활성을 표면 플라스몬 공명법에 의해 평가했다. 측정에는 BIAcore사제의 2000을 이용했다. 센서 칩에는 스트렙타아비딘이 고정화되어 있는 SA칩을 이용했다. 이것에, 5'말단에 바이오틴이 결합하고 있는 16뉴클레오티드의 Poly dT를 600RU 정도 결합시켰다. 리간드가 되는 핵산은 3'말단에 16뉴클레오티드의 Poly A를 부가하고, dT와 A의 결합에 의해 SA칩에 고정화했다. 고정화량은 약 800RU로 했다. 분석물(analyte)용의 인간 IL-17은 O. 5μM으로 조제하고, 비특이적 흡착을 경감하기 위해 0.1㎎/㎖의 tRNA를 가한 것을 20㎕ 주입했다. 런닝 버퍼에는 용액 A를 이용했다. 측정의 결과, 서열번호 1∼6 및 29∼36으로 나타내는 핵산의 모두가, 네가티브 컨트롤의 30N보다도 유의하게 IL-17에 결합하는 것을 알 수 있었다. 여기에서 30N과는 30뉴클레오티드의 랜덤서열을 포함하는 SELEX의 1라운드째에 사용한 핵산풀의 것이다. 일례로서 서열번호 1로 나타내는 앱타머(Apt1)와 인간 IL-17의 결합의 형태를 나타내는 센서 그램을 도 7에 나타낸다. 이상으로부터 서열번호 1∼6 및 29∼36으로 나타내는 핵산은 IL-17에 결합하는 앱타머인 것이 나타내어졌다.

서열번호 1∼6 및 29∼36으로 나타내는 IL-17앱타머가 같은 패밀리의 IL-17F에 결합하는지 아닌지 표면 플라스몬 공명법으로 조사했다. IL-17과 IL-17F의 아미노산 서열의 상동성은 50％이다. 실험에는 R&D사제의 IL-17F(1335-INS/CF)를 이용하고, 상술과 똑같이 tRNA를 가해서 비특이흡착을 경감시킨 상태에서 실시했다. 그 결과, 서열번호 1∼6 및 29∼36으로 나타내는 앱타머의 모두가 IL-17F에 결합하지 않는 것을 알 수 있었다. 일례로서 서열번호 1로 나타내는 앱타머가 인간 IL-17F에 결합하지 않는 것을 나타내는 센서 그램을 도 8에 나타낸다. 이상으로부터 서열번호 1∼6 및 29∼36으로 나타내는 앱타머는 IL-17에 특이적으로 결합하는 것을 알 수 있었다.

실시예 2: 서열번호 1, 2, 30으로 나타내는 앱타머의 단소화

서열번호 1, 2, 30으로 나타내는 앱타머의 단소화(shortening)를 실시하고, 서열번호 37∼44로 나타내는 핵산을 화학합성에 의해 제작했다. 이들의 핵산이 IL-17에 대해서 결합활성을 가지고 있는지 아닌지, 실시예 1과 똑같이 표면 플라스몬 공명법에 의해 조사했다. 그 결과, 이들 모든 핵산이 IL-17에 대해 결합활성을 가지고 있는 것을 알 수 있었다. 서열번호 40으로 나타내는 앱타머는 서열번호 1, 2, 29로 나타내는 앱타머에 포함되는 공통서열(서열번호 58)을 포함하는 것으로, 23뉴클레오티드의 길이이다. 서열번호 44로 나타내는 앱타머는 서열번호 30으로 나타내는 앱타머에 포함되는 공통서열을 포함하는 것으로, 33뉴클레오티드의 길이이다. 또한, 서열번호 44로 나타내는 앱타머는 서열번호 6∼21, 30, 31에 포함되는 8뉴클레오치드의 공통서열(서열번호 59) 및 서열번호 7, 9, 13, 21 및 30에 포함되는 16뉴클레오티드의 공통서열(서열번호 60)을 포함한다. 서열번호 40과 44로 나타내는 앱타머의 MFOLD 프로그램에 의한 2차 구조 예측을 도 9와 10에 각각 나타낸다. 도 9에 있어서, 공통서열은 검은 동그라미로 나타냈다. 도 10에 있어서, 서열번호 6∼21, 30, 31과의 공통서열에 사각, 서열번호 7, 9, 13, 21 및 30에만 공통의 서열에 *표(별표)를 기재했다.

이하에 각각의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열번호 37: 서열번호 1로 나타내는 앱타머의 변경체로 54뉴클레레오티드의 길이의 앱타머

c(F)agau(F)gggc(F)agc(F)agaggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)u(F)agu(F)gu(F)g

서열번호 38: 서열번호 37로 나타내는 앱타머의 변경체로 40뉴클레오티드의 길이의 앱타머

gc(F)agc(F)agaggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)

서열번호 39: 서열번호 38로 나타내는 앱타머의 변경체로 33뉴클레오티드의 길이의 앱타머

gc(F)agaggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)

서열번호 40: 서열번호 39로 나타내는 앱타머의 변경체로 23뉴클레오티드의 길이의 앱타머

ggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)

서열번호 41: 서열번호 39로 나타내는 앱타머의 변경체로 27뉴클레오티드의 길이의 앱타머

ggggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)c(F)c(F)

서열번호 42: 서열번호 2로 나타내는 앱타머의 변경체로 41뉴클레오티드의 길이의 앱타머

gu(F)gc(F)ac(F)au(F)gggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)gc(F)

서열번호 43: 서열번호 30으로 나타내는 앱타머의 변경체로 52뉴클레오티드의 길이의 앱타머

agaggu(F)c(F)agau(F)ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)u(F)au(F)gc(F)gu(F)g

서열번호 44: 서열번호 30으로 나타내는 앱타머의 변경체로 33뉴클레오티드의 길이의 앱타머

ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)

실시예 3: 서열번호 40으로 나타내는 앱타머의 변이체의 제작

서열번호 40으로 나타내는 앱타머에 1개소 변이를 가한 변이체를 제작하고, IL-17에 대한 결합활성을 표면 플라스몬 공명법에 의해 평가했다. 변이체의 서열과 수식을 이하에 나타낸다.

서열번호 45: 서열번호 40으로 나타내는 앱타머에 (u(F)16:c(F)16)의 변이를 가한 앱타머

ggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)c(F)gagc(F)gc(F)c(F)

서열번호 46:서열번호 40으로 나타내는 앱타머에 (g21:a21)의 변이를 가한 앱타머

ggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)ac(F)c(F)

서열번호 47: 서열번호 40으로 나타내는 앱타머에 (c(F)7:a(M)7)의 변이를 가한 앱타머

ggau(F)aga(M)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)

서열번호 48: 서열번호 40으로 나타내는 앱타머에 (u(F)12:a(M)12)의 변이를 가한 앱타머

ggau(F)agc(F)gaaga(M)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)

서열번호 40-2: 서열번호 40으로 나타내는 앱타머의 a3에 OMe의 수식을 가한 앱타머

gga(M)u(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)

서열번호 40-3: 서열번호 40으로 나타내는 앱타머의 c(F)7을 c(M)7로 한 앱타머

ggau(F)agc(M)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gagc(F)gc(F)c(F)

서열번호 40-4: 서열번호 40으로 나타내는 앱타머의 g19에 OMe의 수식을 가한 앱타머

ggau(F)agc(F)gaagu(F)c(F)au(F)u(F)gag(M)c(F)gc(F)c(F)

이들의 앱타머는 모두 IL-17과 결합했다. 이것은 서열번호 40으로 나타내는 앱타머는 수개의 변이를 넣어도, 수식방법을 바꾸어도, IL-17에 대해서 결합활성을 가지고 있는 것을 나타내고 있다.

실시예 4: IL -17과 IL - 17수용체의 결합을 저해하는 앱타머

서열번호 1∼6 및 29∼44로 나타내는 앱타머가 IL-17과 IL-17수용체(IL-17R)의 결합을 저해하는지 아닌지를 표면 플라스몬 공명법을 이용해서 조사했다.

BIAcore사의 프로토콜에 따라서 CM5 센서 칩에 Protein A(21181, PIERCE)를 고정화했다. 그곳에 IgG의 Fc부분이 융합한 인간 IL-17R-Fc(177-IR, R&D systems)를 약 900RU 고정화했다. 분석물로서 IL-17(0.11μM)과 앱타머(0.33μM)를 혼합해서 15분 보관 유지한 것을 흘렸다. 만약 앱타머가 IL-17과 IL-17R의 결합을 저해할 경우는 센서 그램의 시그널은 상승하지 않지만, 만약 저해하지 않는 경우는 3자 복합체를 형성하여 시그널이 상승하는 것이 예상된다. 저해실험을 개시하기 전에 IL-17R에 IL-17이 결합하는 것을 확인했다. 또 네가티브 콘트롤로서 IL-17과 30N을 혼합한 것을 이용했다. 30N은 30뉴클레오티드의 랜덤서열을 포함하는 SELEX의 1라운드째에 사용한 핵산 풀의 것이다. 실험의 결과, 서열번호 1∼6 및 29∼44로 나타내는 앱타머의 모두가 IL-17과 IL-17R의 결합을 저해하는 것을 알 수 있었다. 한편, 30N은 저해활성을 나타내지 않았다. 일례로서 서열번호 1로 나타내는 앱타머가 IL-17과 IL-17R의 결합을 저해하고 있는 것을 나타내는 센서 그램을 도 11에 나타낸다.

이상으로부터 서열번호 1∼6 및 29∼44로 나타내는 앱타머는 IL-17의 저해제로서 사용할 수 있는 것이 나타내어졌다.

실시예 5: 서열번호 44로 나타내는 앱타머의 변이체의 제작

서열번호 44로 나타내는 앱타머에 변이를 가한 변이체를 제작하고, IL-17과 IL-17R의 결합을 저해할지 아닌지를 실시예 6과 똑같이 표면 플라스몬 공명법을 이용해서 조사했다. 변이체의 서열과 수식을 이하에 나타낸다.

서열번호 49: 서열번호 44로 나타내는 앱타머에 (g7)결실의 변이를 가한 앱타머

ggu(F)c(F)u(F)ac(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)

서열번호 50: 서열번호 44로 나타내는 앱타머에 (g14:a14)의 변이를 가한 앱타머

ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggagaagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)

서열번호 51: 서열번호 44로 나타내는 앱타머에 (g20:a20)의 변이를 가한 앱타머

ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)aau(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)

서열번호 52: 서열번호 44로 나타내는 앱타머에 (g1g2u(F)3c(F)4:G1G2G3G4, g30a31c(F)32c(F)33:C30C31C32C33)의 변이를 가한 앱타머. 여기에서, 대문자는 디옥시뉴클레오티드를 나타낸다.

GGGGu(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)aCCCC

서열번호 44-1: 서열번호 44로 나타내는 앱타머에 (a19g20:a(M)19g(M)20)의 변이를 가한 앱타머

ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)a(M)g(M)u(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac (F)c(F)

서열번호 44-2: 서열번호 44로 나타내는 앱타머에 (a15g16:a(M)15g(M)16)의 변이를 가한 앱타머

ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggagga(M)g(M)u(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac (F)c(F)

서열번호 53: 서열번호 44로 나타내는 앱타머에 (g27) 이후를 결실시킨 앱타머

ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)gg

서열번호 54: 서열번호 44로 나타내는 앱타머의 (g1g2u(F)3)과 (a31c(F)32c(F)33)을 결실시킨 앱타머

c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)ag

서열번호 44-3: 서열번호 44로 나타내는 앱타머에 (a6g7:a(M)6g(M)7)의 변이를 가한 앱타머

ggu(F)c(F)u(F)a(M)g(M)c(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac (F)c(F)

서열번호 44-4: 서열번호 44로 나타내는 앱타머에 (g10g11:g(M)10g(M)11)의 변이를 가한 앱타머

ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)g(M)g(M)aggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac (F)c(F)

서열번호 44-5: 서열번호 44로 나타내는 앱타머에 (a12g13:a(M)12g(M)13)의 변이를 가한 앱타머

ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)gga(M)g(M)gagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac (F)c(F)

서열번호 44-6: 서열번호 44로 나타내는 앱타머에 (g14a15:g(M)14a(M)15)의 변이를 가한 앱타머

ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggagg(M)a(M)gu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac (F)c(F)

서열번호 44-7: 서열번호 44로 나타내는 앱타머에 (a22a23:a(M)22a(M)23)의 변이를 가한 앱타머

ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggagga(M)gu(F)c(F)agu(F)a(M)a(M)u(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)

서열번호 44-8: 서열번호 44로 나타내는 앱타머의 5'말단에 PEG40 (SUNBRIGHT GL2-400GS2, 일본유지사제)을 부가, 3'말단에 idT(inverted dT)를 부가한 앱타머.

PEG40-ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F)-idT

이들의 앱타머는 모두 IL-17과 IL-17수용체(IL-17R)의 결합을 저해했다. 이것은, 서열번호 44로 나타내는 앱타머는 수개의 변이를 넣거나 수식방법을 바꾸어도, IL-17과 IL-17수용체(IL-17R)의 결합에 대해서 저해활성을 가지고 있는 것을 나타내고 있다.

실시예 6: 앱타머는 배양세포의 IL -17 시그널링을 저해한다

서열번호 44로 나타내는 앱타머가 IL-17에 의한 세포자극을 저해할 수 있는지, 정상 인간 피부 섬유아세포(Normal human dermal fibroblast; NHDF; 산코 순약)를 이용해서 확인했다. NHDF세포는 IL-17에 의한 세포자극으로 세포 외에 인터루킨 6(IL-6)을 생산한다. NHDF세포를 인간 IL-17(Peprotech사제)(40ng/㎖)로 자극할 때, 배지 중에 앱타머(서열번호 44로 나타내는 앱타머)를 가하고, 24시간 후에 생산되는 IL-6을 효소면역정량(ELISA)법(Endogen Human IL-6 ELISA Kit: Thermo scientific)에 의해 측정했다. IL-6의 생산 저해 결과를 도 12에 나타낸다. 측정의 결과, 앱타머를 가하면 농도의존적으로 IL-6의 생산이 억제되고 있는 것이 확인할 수 있었다. 또한, 항IL-17중화 항체(MAB421, R&D Systems사제)보다도 높은 저해 효과를 얻을 수 있었다. 한편, 컨트롤RNA는 저해활성을 나타내지 않았다. 여기에서, 컨트롤RNA와는 30뉴클레오티드의 랜덤서열을 포함하는, SELEX의 1라운드째에 사용한 핵산 풀의 것이다. 이상의 것으로부터 본 발명의 앱타머는 생존하고 있는 세포에 대해서도 IL-17시그널링이 높은 저해활성을 가지고 있는 것이 나타났다.

실시예 7: 앱타머에 의한 EAE (실험적 자기면역성 뇌척수염) 모델 마우스의 발증억제실험

인간 다발성 경화증의 마우스 모델로서 알려지는 EAE 모델 마우스를 이용해서 앱타머에 의한 발증으로의 영향을 해석했다. 300㎍의 Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG₃₅ _-55)(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)를 500㎍의 결핵사균(Mycobacterium tuberculosis)을 포함하는 불완전 Freund's adjuvant와 함께 에멀젼화하고, 야생형 C57BL/6(암놈, 8주령)의 겨드랑이 하부 및 요부(腰部)에 피하 투여하여 감작했다. 또한, 감작 직후 및 48시간 후에 200ng의 백일해독소(pertussis toxin)를 200㎕의 PBS에 녹이고, 꼬리정맥 내 투여해서 EAE를 유도했다. 이후, 매일 이하의 기준에 의해 임상증상을 평가했다.

야생형 마우스군(n=10) 및 서열번호 44-8로 나타내는 앱타머투여군(1㎎/㎏, 3㎎/㎏, 10㎎/㎏ 각각 n=10)에 대해서 매일 임상 스코어를 붙이고, 임상증상의 평가를 실시했다. 임상 스코어 값은 0: 증상없음, O.5: 꼬리가 반 늘어짐, 1: 꼬리가 늘어짐, 2: 보행장해, 3: 한쪽 다리 마비, 4: 양 뒷다리 마비, 5: 앞 다리 한쪽 마비, 6:앞 다리 마비ㆍ사망을 나타내고, MOG₃₅ _-55 투여 후 25일까지의 모든 동물의 스코어를 기록했다.

서열번호 44-8로 나타내는 앱타머는 생리식염수에 용해하고, MOG₃₅ _-55투여일부터 2일에 1회의 간격으로 합계 13회 투여했다. 컨트롤군으로서 생리식염수를 동량 똑같이 투여했다.

임상증상평가의 경과를 도 13에 나타낸다. 컨트롤군과 비교하고, 서열번호 44-8로 나타내는 앱타머 1㎎/㎏투여군에 있어서 유의차는 볼 수 없었다. 한편, 서열번호 44-8로 나타내는 앱타머 3㎎/㎏ 및 10㎎/㎏투여군에서는 통계학적 유의차를 가지고 임상증상의 경감이 보였다. 통계학적 유의차는 Mann-Whitney의 U검정 및 Dunnett법을 이용해서 해석했다. 도면 중에 통계학적 유의차(*: p＜O.05, **: p＜O.01)를 나타낸다. 이상의 결과는 IL-17에 대한 앱타머가 다발성 경화증 등 자기면역질환의 치료약으로서 이용할 수 있는 가능성을 강하게 시사한다.

본 발명의 앱타머 또는 복합체는, 염증성 질환이나 암, 알레르기, 감염증 등의 질환에 대한 의약, 혹은 진단약, 시약으로서 유용할 수 있다. 본 발명의 앱타머 또는 복합체는 또한, IL-17의 정제 및 농축, IL-17의 표식, 및 IL-17의 검출 및 정량에 유용할 수 있다.

본 출원은 일본에서 출원된 특허출원2008-183233을 기초로 하고 있으며, 그들의 내용은 본 명세서에 모두 포함된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

IL-17에 결합하며 서열번호 1 내지 54로 이루어지는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 앱타머.
제1항에 있어서, IL-17과 IL-17 수용체의 결합을 저해하는 앱타머.
제1항에 있어서, IL-17과 IL-17 수용체의 결합을 저해하지만, IL-17F와 IL-17 수용체의 결합은 저해하지 않는 앱타머.
제1항에 있어서, IL-17과 IL-17 수용체의 결합을 저해하며, 서열번호 58의 서열을 포함하고 있는 앱타머.
제1항에 있어서, IL-17과 IL-17 수용체의 결합을 저해하며, 서열번호 59 또는 60의 서열을 포함하고 있는 앱타머.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 동일하거나 다르고, 불소 원자이거나 또는 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기에 의해 치환되는, 앱타머.
제 1 항에 있어서,
이하 (a) 또는 (b)의 어느 하나인, 앱타머:
(a) 서열번호 1 내지 54로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민일 수 있음)로 이루어지는 앱타머로서, 해당 앱타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'위치가 동일하거나 다르고, 불소원자이거나, 또는 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있으며,
(ii) 각 푸린 뉴클레오티드의 리보스의 2'위치가 동일하거나 다르고, 히드록시기이거나, 또는 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는, 앱타머;
(b) 서열번호 1 내지 54로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민일 수 있음)로 이루어지는 앱타머로서, 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가되며, 해당 앱타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'위치가 동일하거나 다르고, 불소 원자이거나, 또는 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있으며,
(ii) 각 푸린 뉴클레오티드의 리보스의 2'위치가 동일하거나 다르고, 히드록시기이거나, 또는 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는, 앱타머.
제 7 항에 있어서,
서열번호 58, 59 또는 60의 서열을 포함하는, 앱타머.
제 7 항에 있어서,
서열번호 40 또는 44의 서열을 포함하는, 앱타머.
IL-17에 결합하고, IL-17과 IL-17 수용체의 결합을 저해하지만 IL-17F가 IL-17 수용체에 결합하는 것을 저해하지 않으며, 서열 번호 58, 59 또는 60의 서열을 포함하며, 길이가 23 내지 72 뉴클레오티드이며, IL-17에 의해 자극된 NHDF(정상 인간 피부 섬유아세포) 세포로부터 IL-6의 생산을 저해하는 앱타머.
제10항에 있어서, 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 동일하거나 다르고, 불소 원자이거나 또는 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택된 원자 또는 기에 의해 치환되는 앱타머.
제 10 항에 있어서,
이하 (a) 또는 (b)의 어느 하나인, 앱타머:
(a) 해당 앱타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'위치가 동일하거나 다르고, 불소원자이거나, 또는 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있으며,
(ii) 각 푸린 뉴클레오티드의 리보스의 2'위치가 동일하거나 다르고, 히드록시기이거나, 또는 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는, 앱타머;
(b) 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가되며, 해당 앱타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'위치가 동일하거나 다르고, 불소 원자이거나, 또는 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있으며,
(ii) 각 푸린 뉴클레오티드의 리보스의 2'위치가 동일하거나 다르고, 히드록시기이거나, 또는 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는, 앱타머.
제 1 항에 기재한 앱타머, 및 친화성 물질, 표식용 물질, 효소, 약물송달매체 및 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기능성 물질을 포함하는 복합체.
제 10 항에 기재한 앱타머 및 친화성 물질, 표식용 물질, 효소, 약물송달매체 및 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기능성 물질을 포함하는 복합체.
다발성 경화증, 전신성 에리테마토데스(SLE), 강피증, 쇼그렌 증후군, 다발성 근육염(PM), 피부근육염(DM), 류머티즘성 관절염, 만성관절류머티즘(RA), 변형성 관절증(0A), 염증성 장염, 크론병, 진행성 전신성 경화증(PSS), 결절성 동맥 주위염(PN), 바제도병, 귈랑바레 증후군, 원발성 담즙성 간경변(PBC), 특발성 혈소판 감소성 자반병, 자기면역 용혈성 빈혈, 중증근무력증(MG), 근위축성 측색경화증(ALS), I형 당뇨병, 건선, 천식, 호중구 기능 이상, 호산구성 폐렴, 돌발성 폐선유증, 과민성 폐렴, 식도암, 갑상선암, 방광암, 대장암, 위암, 췌장암, 흉부암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 유방암, 신경아세포종, 교모세포종, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 빌름스종양, 전립선암, 이식 거부, 이식편대숙주병, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식 과민증, 두드러기, 수술후 유착, 자궁내막증, 성인성 치주염, 기관지염, 및 COPD로 이루어지는 군으로부터 선택된 질병을 치료하거나 예방하기 위한, 제 1 항 내지 제 5항, 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재한 앱타머 또는 청구항 제 13 항 또는 제 14 항에 기재한 복합체를 포함하는 의약.
다발성 경화증, 전신성 에리테마토데스(SLE), 강피증, 쇼그렌 증후군, 다발성 근육염(PM), 피부근육염(DM), 류머티즘성 관절염, 만성관절류머티즘(RA), 변형성 관절증(0A), 염증성 장염, 크론병, 진행성 전신성 경화증(PSS), 결절성 동맥 주위염(PN), 바제도병, 귈랑바레 증후군, 원발성 담즙성 간경변(PBC), 특발성 혈소판 감소성 자반병, 자기면역 용혈성 빈혈, 중증근무력증(MG), 근위축성 측색경화증(ALS), I형 당뇨병, 건선, 천식, 호중구 기능 이상, 호산구성 폐렴, 돌발성 폐선유증, 과민성 폐렴, 식도암, 갑상선암, 방광암, 대장암, 위암, 췌장암, 흉부암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 유방암, 신경아세포종, 교모세포종, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 빌름스종양, 전립선암, 이식 거부, 이식편대숙주병, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식 과민증, 두드러기, 수술후 유착, 자궁내막증, 성인성 치주염, 기관지염, 및 COPD로 이루어지는 군으로부터 선택된 질병을 진단하기 위한, 제 1 항 내지 제 5항, 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재한 앱타머 또는 청구항 제 13 항 또는 제 14 항에 기재한 복합체를 포함하는 진단 시약.
제 1 항 내지 제 5항, 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재한 앱타머 또는 제 13 항 또는 제 14 항에 기재한 복합체를 포함하는 IL-17 검출용 프로브.
제 1 항 내지 제 5항, 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재한 앱타머 또는 제 13 항 또는 제 14 항에 기재한 복합체를 포함하는 IL-17 정제용 고체상 담체.
제 1 항 내지 제 5항, 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재한 앱타머 또는 제 13 항 또는 제 14 항에 기재한 복합체를 이용하는 것을 포함하는 IL-17 검출 방법.
제 1 항 내지 제 5항, 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재한 앱타머 또는 제 13 항 또는 제 14 항에 기재한 복합체를 이용하는 것을 포함하는, IL-17의 정제방법.