JP2006506055A - 予防的および治療的ｈｉｖアプタマー - Google Patents

Abstract

ＨＩＶの予防治療のための材料および使用方法を示す。ＨＩＶ疾患の構成要素に特異的な調節されたアプタマー治療組成物を含む治療組成物を、ＨＩＶ感染症に対するワクチンとしてこれらの治療組成物を投与する方法と共に示す。本発明は、ｇｐ１２０およびｇｐ１２０と結合してｇｐ１２０の高次構造のシフトを誘導し、それにより体液性免疫応答を誘発することができる、膜結合受容体に対するエピトープが曝露される核酸アプタマーを含む組成物を提供する。

Description

（発明の分野）
本発明は、一般に、核酸分野に関し、より詳細には、ｇｐ１２０に特異的に結合するアプタマーまたはアプタマー組成物を使用したＨＩＶの治療または予防のための組成物および方法に関する。

（発明の背景）
アプタマーは、古典的ワトソン−クリック塩基対合以外の相互作用によって分子に対する特異的結合親和性を有する核酸分子である。

ファージディスプレイまたはモノクローナル抗体（ＭＡｂ）によって作製されたペプチドのようなアプタマーは、選択された標的と特異的に結合し、結合を介してその標的が機能する能力を遮断することができる。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからｉｎ ｖｉｔｒｏ選択プロセス（図１）によって作製されたアプタマーにより、１００種を超えるタンパク質（成長因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン、および受容体が含まれる）が作製されている。典型的なアプタマーは、サイズが１０〜１５ｋＤａ（３０〜４５ヌクレオチド）であり、その標的とサブナノモルの親和性で結合し、密接に関連した標的を区別する（例えば、典型的には、同一の遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質と結合しない）。一連の構造研究により、アプタマーが抗体−抗原複合体の親和性および特異性を駆動する同型の結合相互作用（水素結合、静電気的相補性（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）、疎水性接触、立体排除など）を使用することができることが示されている。

アプタマーは、治療薬としての使用のための多数の所望の特徴（高特異性および親和性、生物学的効率、および優れた薬物動態学的性質が含まれる）を有する。さらに、これらは、例えば以下の抗体および他のタンパク質生物学を超える特定の競争上の有意性を提供する。

１）スピードおよび調節。アプタマーは、完全にｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスで産生されるので、初期治療リード化合物を迅速に作製することが可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択により、アプタマーの特異性および親和性を厳しく調節し、有毒且つ非免疫原性の標的に対してリード化合物を作製することが可能である。

２）毒性および免疫原性。クラスとしてアプタマーは、毒性または免疫原性をほとんど示さないか全く示さない。ラットまたはウッドチャックへの高レベルのアプタマーの慢性投与（１０ｍｇ／ｋｇ／日を９０日間）では、いかなる臨床、細胞、または生化学的測定によっても毒性は認められない。多数のモノクローナル抗体の有効性が抗体自体の免疫応答性によって厳しく制限され得るのに対して、アプタマーに対して抗体を誘発することは非常に困難である（アプタマーをＭＨＣを介したＴ細胞によって提示できず、免疫応答は一般に核酸フラグメントを認識するように訓練されていない可能性が最も高いため）。

３）投与。全ての現在承認されている抗体治療薬が静脈内注入（典型的には、２〜４時間）によって投与されているのに対して、アプタマーは皮下注射によって投与することができる。この相違は、主に比較的低い溶解性に起因し、それによりほとんどの治療ＭＡｂは大量に必要である。良好な溶解性（１５０ｍｇ／ｍｌ超）および比較的低い分子量（アプタマー：１０〜５０ＫＤ；抗体１５０ＫＤ）により、０．５ｍｌ未満の注射によって毎週アプタマーを送達させることができる。皮下投与によるアプタマーの生物学的利用能は、サルの研究において８０％超である（Ｔｕｃｋｅｒ，１９９９）。さらに、小サイズのアプタマーは、抗体または抗体フラグメントが透過できない高次構造の狭窄領域を透過可能であり、アプタマーベースの治療薬または予防薬のさらに別の利点であえる。

４）拡張性および費用。治療アプタマーは化学合成されるので、製造の必要性を満たすために必要に応じて容易に拡大縮小する（ｓｃａｌｅ）ことができる。拡大縮小製造の困難さにより現在いくつかの生物製剤の利用可能性が制限されており、タンパク質の大量製造プラントの資本コストは多額であるが、１つの大量合成機で年間１００ｋｇを超えるオリゴヌクレオチドを製造することができ、初期投資額は比較的少額である。ｋｇスケールの現在のアプタマー商品の合成費用は５００ドル／ｇと見積もられており、これは高度に至適化した抗体のコストに匹敵する。プロセス開発の継続的な改良により、商品コストが５年間で１００ドル／ｇ未満に抑えられると予想される。

５）安定性。治療アプタマーは化学的に安定している。これらは、本質的に、熱、変性剤などへの曝露後に活性が回復するように順応し、凍結乾燥粉末として室温で長期間（１年超）保存することができる。対照的に、抗体は冷蔵で保存しなければならない。

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因）は、依然として世界中の公衆衛生における非常に深刻な脅威である。世界的に、４０００万人超がＨＩＶに感染し、毎日およそ１４，０００人が新たに感染している（ＵＮＡＩＤＳ Ｒｅｐｏｒｔ，２００２）。明らかに、ＡＩＤＳ蔓延の抑制のための最良の長期的解決法は、安全且つ有効なＨＩＶワクチンの開発である。ｇｐ１２０サブユニットは、体液性免疫応答が増大する一次ウイルス抗原である（Ｐｒｏｆｙ，１９９０；ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ｐｏｉｇｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００１）。成熟エンベロープ糖タンパク質は、ビリオン表面に非共有結合したｇｐ１２０およびｇｐ４１成分の巨大な前駆体（ｇｐ１６０）のプロセシングによって生じる三量体として存在する（Ｋｏｗａｌｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｂｕｒｔｏｎ，１９９７）。各ｇｐ１２０モノマーは、５つの可変領域（Ｖ１〜Ｖ５）が散在した５つの定常領域（Ｃ１〜Ｃ５）からなる（Ｓｔａｒｃｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。可変領域は、免疫学的監視からコア領域を保護する一助となるタンパク質の外面に配向する傾向がある。ｇｐ１２０はまた、非常にグリコシル化されている（Ｌｅｏｎａｒｄ，１９９０）。ｇｐ１２０の表面変動性およびグリコシル化によりその免疫原性が減少する。細胞性免疫応答を刺激するワクチン開発が進行しているが、臨床目的におけるＨＩＶワクチン候補による有効な中和抗体応答の誘導は、急務であるが医学的必要性は満たされていない。

最も有効なＨＩＶワクチン開発ルートに関する研究者の現在の意見は、中和抗体、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびＴヘルパー応答を広範に含む体液性および細胞性免疫応答の両方を誘導する必要性に集中している。ＣＴＬ細胞はＣＤ８＋であり、Ｔヘルパー細胞はＣＤ４＋である。しかし、臨床試験におけるワクチン誘導性中和抗体応答は今までのところ一次ウイルスに対して脆弱且つ無効であった。

さらに最近の努力は、ｇｐ１２０サブユニットワクチンの開発への投資である（Ｇｒａｈａｍ，２００２で概説）。しかし、単量体ｇｐ１２０に対して作製された抗体は、一般に、中和しないかせいぜい実験用ＨＩＶ株のみを中和することができ（Ｂｅｌｓｈｅ ｅｔａｌ．，１９９４；Ｋａｈｎ，ｅｔａｌ．，１９９４）、より医学的に関連した一次ＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）単離物は中和できない（Ｃｏｈｅｎ，１９９４）。しかし、非ヒト霊長類モデルにおける受動抗体研究では、中和抗体が実際に感染症を防御することが示された（Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｐｕｔｋｏｎｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｅｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。実際、細胞感染の確立後のみに有効なＣＴＬと異なり、抗体は、侵入前にウイルスを中和することができる唯一の免疫成分である。ｇｐ１２０誘導性免疫原による有効な中和抗体応答の誘導は未だ達成されない目的である。

エンベロープ糖タンパク質の変動性は、ＨＩＶの免疫攻撃を回避する例外的能力で重要な役割を果たす。感染が進行するにつれてウイルス変異が容易に蓄積され、単一の感染個体内でさえ種々の変異型集団が作製され、ＣＴＬ調節から回避する機会が得られる（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。この多様性は、ワクチンデザインを非常に困難にしている。同時に、表面の変動性および広範なグリコシル化が単量体ｇｐ１２０免疫原の比較的低い免疫原性に寄与している（Ｌｅｏｎａｒｄ，１９９０；Ｌａｎｇｌｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。興味深いことに、最近の結果は、感染個体が中和抗体応答を生じ得るかしばしば生じることを示している。不運なことに、これらの応答は、ｅｎｖ遺伝子の急速な進化に遅れをとるようであるので、増殖性感染に関連する高レベルのウイルス血症に抵抗して排除することができない（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００３ ａｎｄ Ｒｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。しかし、これらの結果により、適切な免疫原でワクチン接種した個体がＨＩＶへの初期曝露に関連する比較的低いウイルス負荷を防御することができる免疫応答を得ることができることが示唆される。

多数の臨床試験における免疫原試験を使用したＨＩＶに対する有効な免疫応答の研究において種々のストラテジーが開発されている（Ｅｍｉｎｉ，２００２；Ｇｒａｈａｍ，２００２に概説）。弱毒化生ＨＩＶワクチンは、非ヒト霊長類において防御を誘導する能力が示されている（Ｎｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。しかし、安全性を考慮して現行の試みが主に弱毒化生ウイルスワクチンおよび死滅全ウイルスワクチンの使用から離れる方向に進んでいる。最近のＶａｘｇｅｎ試験で使用されたワクチンのようなＨＩＶ表面タンパク質（主にｇｐ１２０またはｇｐ１６０）に基づいているが安全且つ一般的に耐性が十分なサブユニットワクチンでは集団中で中和抗体応答を誘発できなかった（Ｗａｎｔａｎａｂｅ，２００３）。ほとんどのサブユニットワクチンによって産生された実験用ＨＩＶ株に対する中和抗体応答は、ＨＩＶ−１感染時に認められる応答の数分の１である（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００２）。通常、ワクチン抗原起源に対応して、時折、型特異的中和を得ることができる。しかし、一次Ｒ５ ＨＩＶ単離物の中和は認められなかった（Ｍａｓｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。臨床試験で評価された別のワクチン概念には、細胞内および表面での抗原産生に依存し、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示されるベクター包含（ｖｅｃｔｏｒｅｄ）ワクチンおよびＤＮＡワクチンが含まれる。新たな証拠により、これらのアプローチを使用して耐久性のあるＣＤ８＋ＣＴＬ活性を誘導することができることが示唆される（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００２）。しかし、上記のように、ＣＴＬベースの機構は、既に感染した細胞の根絶のみで成功している。ウイルス負荷を調節して疾患を軽減することができる可能性があるにもかかわらず、細胞媒介機構のみではＨＩＶ感染を防止する可能性が低い。

強力且つ持続する中和抗体は、任意のワクチン誘導性免疫の重要な成分である。最近、通常感染時のみに一過性に曝露される中和エピトープに曝露されることが公知のｇｐ１２０の高次構造の安定化に基づいたより良好なｇｐ１２０ベースの免疫原のデザインが試みられた。ＨＩＶ侵入プロセスは複雑であり、ｇｐ１２０によって編成される一連のタンパク質−タンパク質接触が含まれる。ＣＤ４受容体およびＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４共同受容体（図２）とのＨＩＶ結合相互作用はそれぞれｇｐ１２０の有意な構造再整列に付随するようである（Ｄｏｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＣＤ４の初期結合によって可変性ループＶ１およびＶ２（図３）のシフトによりｇｐ１２０の高次構造変化が誘導され、それによりケモカイン共同受容体結合部位を含む保存ｇｐ１２０コア残基が曝露する（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｔｒｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。このマスクされていないコア領域（１７ｂ、４８ｄ）を認識するＣＤ４誘導性（ＣＤ４ｉ）抗体は、中和活性を有することが報告されている（Ｔｈａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。その後のＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４へのｇｐ１２０の結合により、ウイルスおよび細胞膜の融合を担うｇｐ４１の融合ドメインを曝露することができるｇｐ１２０の第２の高次構造シフトが刺激される。ＨＩＶ侵入プロセスに関連する高次構造の変化に依存する１つの研究では、アカゲザル・マカークにおいて免疫源として共有結合的で架橋したｇｐ１２０／ＣＤ４複合体を使用して強力な中和抗体応答が得られた（Ｆｏｕｔｓ ｅｔａｌ．，２００２）。不運なことに、この効果の有意な部分は、抗ＣＤ４抗体応答によって媒介される可能性が高い。別の最近の利点は、ＣＤ４模倣物分野においてである。シラトキシン足場を使用して、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．は、ｇｐ１２０に対するＣＤ４の作用を機能的に模倣することができる小ミニタンパク質を操作した（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。これらにより、ｇｐ１２０と共に通常ＣＤ４受容体の非存在下閉塞したで高保存ＣＤ４誘導性（ＣＤ４ｉ）エピトープに曝露される免疫原としてのこのミニタンパク質の１つの使用が提案される。

いくつかの生化学的および構造的証拠は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合誘導性構造変化（ｇｐ１２０可変領域ループのプロテアーゼ感受性の増加（Ｓａｔｔｅｎｔａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９１）ならびにケモカイン受容体結合部位（Ｓａｔｔｅｎｔａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９６）および共同受容体結合を競合する抗体のエピトープ（Ｔｈａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）のＣＤ４刺激接近可能性が含まれる）を支持する。最近のｇｐ１２０／ＣＤ４／ＭＡｂ相互作用についての熱力学的分析により、ＣＤ４結合時の異常に高い侵入の変化が明らかとなり、これはｇｐ１２０が受容体結合の際に高次構造の大きな変化を受けるとの推測をさらに支持する（Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＣＤ４ｉ中和抗体１７ｂとＣＤ４およびｇｐ１２０との三重複合体の構造分析により、ＣＤ４との相互作用の安定化はＣＣＲ５結合領域の曝露または形成で重要な役割を果たすことが確認された（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。

異なるＨＩＶサブタイプで保存性を示し、且つウイルスを細胞に侵入させるために少なくとも一過性にｇｐ１２０表面上に曝露されなければならないので、受容体および共同受容体結合部位は、ワクチンデザインまたは治療介入での使用のための魅力的な標的である。特に、ＣＣＲ５結合領域は、ｇｐ１２０コア上に最も高度に保存された表面の１つである（Ｒｉｚｚｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＨＩＶ侵入の基本的機能に不可欠な高度に保存されたエピトープに対する抗体応答は、種々のＨＩＶサブタイプに対してさえも中和活性を示すと予想される。したがって、ｇｐ１２０に特異的に結合して適切な免疫原性エピトープを示す高次構造変化を誘導し、それによりＨＩＶによる細胞感染を防止または治療するための体液性免疫応答を得ることができる防止薬（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）および予防薬が必要である。

（発明の要旨）
本発明の新規の態様は、目的の標的の特定の所望の高次構造への変化を促進する核酸を単離するためのＳＥＬＥＸ（「アゴニストＳＥＬＥＸ」）の使用である。好ましい実施形態では、目的の標的はｇｐ１２０であり、所望の高次構造の変化は、例えば、ｇｐ１２０を誘導することによって感染時に存在する中間構造を予想して「固定する」有効な中和抗体応答を誘発するものである。目的の標的は、細胞表面受容体であり、所望の高次構造の変化は、細胞内シグナル伝達経路またはウイルス表面分子のサブユニットを誘発するものであり、所望の高次構造の変化は、ウイルスの一部としてその天然の構造中にサブユニットが固定されたものであり得る。

１つの実施形態では、本発明は、ｇｐ１２０上の保存エピトープを細胞膜上の共同受容体に曝露する、ｇｐ１２０の高次構造をシフトさせるためのｇｐ１２０に結合するアプタマーを提供する。

１つの実施形態では、本発明は、ｇｐ１２０上のエピトープをＣＣＲ５受容体に曝露する、ｇｐ１２０の高次構造をシフトさせるためのｇｐ１２０に結合するアプタマーを提供する。

１つの実施形態では、本発明は、ｇｐ１２０上のエピトープをＣＸＣＲ４受容体に曝露する、ｇｐ１２０の高次構造をシフトさせるためのｇｐ１２０に結合するアプタマーを提供する。

１つの実施形態では、本発明は、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４結合エピトープが通常ＣＤ４による結合の非存在下で遮断される、ｇｐ１２０上のエピトープをＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４受容体に曝露する、ｇｐ１２０の高次構造をシフトさせるためのｇｐ１２０に結合するアプタマーを提供する。

１つの実施形態では、本発明は、ｇｐ１２０へのＣＤ４結合効果を刺激するアプタマーを提供する。

１つの実施形態では、本発明は、動物またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和体液性免疫応答を誘発することができるエピトープを提示する高次構造が「固定」されたｇｐ１２０アプタマー−ｇｐ１２０抱合体を提供する。

１つの実施形態では、本発明は、動物またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの体液性免疫応答を誘発することができるエピトープを提示する高次構造が「固定」されたｇｐ１２０アプタマー−ｇｐ１２０抱合体の被験体への投与による、ｇｐ１２０に対する体液性免疫応答を誘導する材料および方法を提供する。

１つの実施形態では、本発明は、ｇｐ１２０上のエピトープをＣＣＲ５受容体に曝露する、ｇｐ１２０の高次構造をシフトさせるためのｇｐ１２０に結合する有効量のアプタマーの投与による、被験体へのＨＩＶ感染症ワクチンを接種するための材料および方法を提供する。

１つの実施形態では、本発明は、動物またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの体液性免疫応答を誘発することができるエピトープを提示する高次構造が「固定」されたアプタマー−ｇｐ１２０抱合体の被験体への投与による、ｇｐ１２０に特異的な中和抗体の産生方法を提供する。

本発明はまた、例えば、別の調節分子の濃度変化に応答して治療標的の生物活性を変化させるために使用することができるアプタマーレギュレーターを提供する。より詳細には、本発明は、アプタマーのエフェクターリガンドへの結合により、例えば、アプタマー結合（エフェクター）リガンドの高次構造の変化によってエフェクターリガンドの第３の分子への結合が調節される（すなわち、活性化または抑制される）アプタマーを提供する。

１つの実施形態では、本発明は、結合活性が治療アプタマーの結合活性を抑制する第１のリガンドによって調節される、治療アプタマーを提供する。

１つの実施形態では、本発明は、結合活性が治療アプタマーの結合活性を増強する第１のリガンドによって調節される、治療アプタマーを提供する。

１つの実施形態では、本発明は、ＣＣＲ５受容体に結合する（それにより、ｇｐ１２０結合が変化する）治療アプタマーを提供する。

（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中で使用される、「アプタマー」は、古典的ワトソン−クリック塩基対合以外の相互作用によって分子に対する特異的結合親和性を有する核酸分子である。

（ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法）
ｇｐ１２０に対するアプタマーの適切な作製方法は、一般に、図１に示す「試験管内進化法」（「ＳＥＬＥＸ^ＴＭ」）と呼ばれるプロセスを使用する。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスは、標的分子に高特異性で結合する核酸分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ進化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）法であり、例えば、１９９０年６月１１日提出の米国特許出願番号０７／５３６，４２８号（現在は放棄）、「核酸リガンド」というタイトルの米国特許第５，４７５，０９６号、および「核酸リガンド」というタイトルの米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３号も参照のこと）に記載されている。各ＳＥＬＥＸによって同定された核酸リガンドは、所与の標的化合物または分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスは、核酸が種々の二次元および三次元構造の形成に十分な能力ならびに実質的に任意の化合物（単量体または重合体のいずれでも）とのリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）ためのその単量体内で利用可能な十分な化学的多用途性を有するという固有の洞察に基づく。任意のサイズまたは組成の分子を、標的として使用することができる。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、出発点として標準的なＤＮＡ合成機による化学合成に由来する無作為化配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドテンプレートの巨大ライブラリーに依存する。いくつかの例では、１００％ランダムオリゴヌクレオチド集団をスクリーニングする。他では、集団中の各オリゴヌクレオチドは、ランダム配列およびオリゴヌクレオチド集団の全分子に共通する配列を含む少なくとも１つの５’末端および／または３’末端が固定された配列を含む。固定化配列には、ＰＣＲプライマー用のハイブリッド形成部位などの配列、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７、およびＳＰ６など）、制限部位、またはホモポリマー配列（ポリＡまたはポリＴ配列など）、触媒コア（以下にさらに記載）、アフィニティカラムへの選択的結合のための部位、ならびに目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にする他の配列が含まれる。

オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、任意の長さであってよく、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含むことができ、修飾または非天然ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが含まれ得る。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号；同第５，６６０，９８５号；同第５，９５８，６９１号；同第５，６９８，６８７号；同第５，８１７，６３５号；および同第５，６７２，６９５号、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９２／０７０６５号を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドを、当該分野で周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を使用してホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成することができる（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６））。オリゴヌクレオチドを、トリエステル合成法などの液相法を使用して合成することもできる（Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）；Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８））。自動化ＤＮＡ合成装置にて実施した典型的な合成により、１０^１５〜１０^１７個の分子が得られる。配列デザインにおける十分に巨大なランダム配列領域により、各合成分子が固有の配列を示す可能性が増大する。

無作為化配列を合成するために、４つ全てのヌクレオチドの混合物を合成プロセスの間のヌクレオチドが無作為に組み込まれる各ヌクレオチド添加工程で添加した。１つの実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは完全にランダムな配列を含むが、他の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは非ランダムまたは部分的にランダムな配列ストレッチを含み得る。部分的にランダムな配列を、各添加工程で異なるモル比での４つのヌクレオチドの添加によって作製することができる。

テンプレート分子は、典型的には、３０〜５０個のランダムヌクレオチドの内部領域に隣接した固定化５’および３’末端配列を含む。標準量（１μモル）の合成により１０^１５〜１０^１６個の各テンプレート分子が得られ、これはほとんどのＳＥＬＥＸ実験に十分である。組換えＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって、この出発ライブラリーからＲＮＡライブラリーを作製する。次いで、このライブラリーを、同一の一般的選択スキームを使用して、実質的に任意の所望の結合親和性および選択性の基準を達成するために、結合に好ましい条件下で標的と混合し、結合、分離、および増幅の段階的反復に供した。好ましくは無作為化配列のセグメントを含む核酸混合物から開始し、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法は、結合に好ましい条件下で混合物を標的と接触させる工程と、標的分子に特異的に結合した核酸から結合していない核酸を分離する工程と、核酸−標的複合体を分離する工程と、核酸−標的複合体から分離した核酸を増幅してリガンドが豊富な核酸混合物を得る工程と、標的分子に対して特異性の高い高親和性核酸リガンドを得るために望ましいサイクル数で結合、分離、解離、および増幅工程を繰り返す工程を含む、。

多数の可能な配列および構造を含む核酸混合物内に、所与の標的に対して広範な結合親和性が存在する。例えば、２０ヌクレオチドの無作為化セグメントを含む核酸混合物は、４^２０個の可能な候補を有し得る。標的に対してより高い親和定数を有する候補は、標的に結合する可能性が最も高い。分離、解離、および増幅後、第２の核酸混合物を作製し、より高い結合親和性候補のために富化する。得られた核酸混合物が主に１種または数種のみの配列から構成されるまで、さらなる選択ラウンドにより最良のリガンドが段階的に優先される。次いで、これらをクローン化し、配列決定し、それぞれ純粋なリガンドとして結合親和性について試験することができる。

所望の目的が達成されるまで、選択および増幅サイクルを繰り返す。最も一般的な場合、サイクルの反復において結合強度に有意な改善が認められなくなるまで選択／増幅を継続する。この方法を使用して、約１０^１８もの異なる核酸種をサンプリングすることができる。試験混合物の核酸には、好ましくは、無作為化配列部分および十分な増幅に必要な保存配列が含まれる。多数の方法（無作為化核酸配列の合成および無作為に切断された細胞核酸からのサイズ選択が含まれる）において核酸配列変異型を産生することができる。可変配列部分は、全部または部分的にランダムな配列を含み得る：これはまた、無作為化配列と共に組み込まれた保存配列の一部を含み得る。試験核酸中の配列変動性を、選択／増幅反復前またはその間の変異誘発によって移入または増加させることができる。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭの１つの実施形態では、選択プロセスは、選択した標的に最も強固に結合する核酸リガンドの単離に非常に効率的であり、これにはたった１サイクルの選択および増幅しか必要でない。このような効率的な選択は、例えば、核酸がカラム上に結合した標的に結合する能力を、カラムが最も親和性の高い核酸リガンドを十分に分離および単離することができるような様式で操作するクロマトグラフィ型プロセスで得ることができる。

多くの場合、単一の核酸リガンドが同定されるまでＳＥＬＥＸ^ＴＭの反復工程を実施することは必ずしも望ましくない。標的特異的核酸リガンド溶液には、多数の保存配列および標的に対する核酸リガンドの親和性に有意に影響を与えることなく置換または添加することができる多数の配列を有する核酸構造またはモチーフのファミリーが含まれ得る。終了前のＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスの終結により、核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの配列を決定することが可能である。

種々の核酸の一次構造、二次構造、および三次構造が存在することが公知である。非ワトソン−クリック型相互作用に関与することが最も一般的に示されている構造またはモチーフを、ヘアピンループ、対称および非対称のバルジ、シュードノット、および無数のこれらの組み合わせという。ほとんどの公知の場合、このようなモチーフは、３０個のヌクレオチドを超える核酸配列で形成することができることを示唆する。この理由のために、連続的無作為化セグメントを使用したＳＥＬＥＸ手順を、約２０〜５０ヌクレオチドの無作為化セグメントを含む核酸配列から開始することができることがしばしば好ましい。

コアＳＥＬＥＸ^ＴＭ法を、多数の特定の目標を達成するために改変した。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号は、ベントＤＮＡなどの特定の構造特性を有する核酸分子を選択するためのゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸ^ＴＭの使用を記載する。米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子と結合および／または光架橋および／または光不活化することができる光反応基を含む核酸リガンドの選択のためのＳＥＬＥＸ^ＴＭベースの方法を記載する。「フローセルＳＥＬＥＸ」というタイトルの米国特許５，５６８，５８８号および１９９７年１月３１日提出の米国特許出願番号０８／７９２，０７５号は、標的分子に対する高親和性と低親和性でオリゴヌクレオチドを高効率で分離するＳＥＬＥＸ^ＴＭベースの方法を記載する。米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスの実施後に改良された核酸リガンドを得る方法を記載する。米国特許第５，７０５，３３７号は、リガンドのその標的への共有結合方法を記載する。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭを使用して、標的分子上の１つを超える部位に結合する核酸リガンドを得ることができ、且つ標的上の特定の部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得ることができる。ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、想定される任意の標的（タンパク質（核酸結合タンパク質およびその生体機能の一部として核酸に結合することが知られていないタンパク質が含まれる）を含む生体高分子および小分子、補因子、および他の小分子が含まれる）に結合する核酸リガンドを単離および同定する手段を提供する。例えば、カフェインおよび密接に関連するアナログ（テオフィリン）と高親和性で結合することができるＳＥＬＥＸ^ＴＭによって同定された核酸配列を開示した米国特許第５，５８０，７３７号を参照のこと。

カウンター−ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、１つまたは複数の非標的分子と交差反応性を有する核酸リガンド配列の排除による標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改良する方法である。カウンター−ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、ａ）核酸の候補混合物を調製する工程と、ｂ）候補混合物に標的を接触させる工程と、候補混合物と比較して標的に対する親和性が増大した核酸を残りの候補混合物から分離することと、ｃ）親和性の増大した核酸を残りの候補混合物から分離する工程と、ｄ）親和性の増大した核酸を１つまたは複数の非標的分子と接触させて、非標的分子に対して特異的親和性を有する核酸リガンドを除去する工程と、ｅ）標的分子に対して特異的親和性を有する核酸を増幅して標的分子に対して比較的高い結合親和性および特異性を有する核酸配列が富化された核酸混合物を得る工程から構成される。

治療薬およびワクチンとしての核酸の使用において遭遇する１つの潜在的問題は、ホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなどの細胞内および細胞外酵素によって所望の結果を得る前に体液中で急速に分解され得ることである。したがって、ＳＥＬＥＸ法は、リガンドに改良された特徴（改良されたｉｎ ｖｉｖｏ安定性または改良された送達特性など）を付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を含む。このような修飾の例には、リボースおよび／もしくはリン酸塩での置換ならびに／または塩基の位置が含まれる。修飾ヌクレオチドを含むＳＥＬＥＸ同定核酸リガンドは、ピリミジンの５’位および２’位を化学修飾したヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，６６０，９８５号に記載されている。米国特許第５，７５６，７０３号は、種々の２’修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する。米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ_２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基で修飾した１つまたは複数のヌクレオチドを含む特異性の高い核酸リガンドを記載する。

本発明で意図される核酸リガンドの修飾には、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体にさらなる電荷、極性、疎水性、水素結合、静電気的相互作用、および変動性を組み込む他の化学基を提供する修飾が含まれるが、これらに限定されない。このような修飾には、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミン修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換、骨格修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルホスフェート修飾、メチル化、および異常な塩基対合の組み合わせ（同塩基、イソシチジン、およびイソグアニジンなど）などが含まれるが、これらに限定されない。修飾には、キャッピングなどの３’および５’修飾も含まれ得る。本発明の好ましい実施形態では、核酸リガンドは、ピリミジン残基の糖部分が２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾されたＲＮＡ分子である。

修飾は、ＳＥＬＥＸプロセス前またはプロセス後修飾であり得る。ＳＥＬＥＸプロセス前修飾により、そのＳＥＬＥＸ標的に対する特異性およびｉｎ ｖｉｖｏでの改良された安定性の両方を有する核酸リガンドが得られる。２’−ＯＨ核酸リガンドでのＳＥＬＥＸプロセス後修飾により、核酸リガンドの結合能力に悪影響を与えずにｉｎ ｖｉｖｏ安定性を改良することができる。

他の修飾が当業者に公知である。ＳＥＬＥＸプロセス後（事前に同定した非修飾リガンドの修飾）またはＳＥＬＥＸプロセスへの組み込みによってこのような修飾を行うことができる。

ＳＥＬＥＸ法は、米国特許第５，６３７，４５９号および米国特許第５，６８３，８６７号に記載の選択されたオリゴヌクレオチドと他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位との組み合わせを含む。ＳＥＬＥＸ法は、さらに、米国特許第６，０１１，０２０号に記載の選択された核酸リガンドと診断複合体または治療複合体中の親油性または非免疫原性高分子量化合物との組み合わせを含む。ジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロールなど親油性化合物と会合したＶＥＧＦ核酸リガンドを含む診断複合体または治療複合体は、米国特許第５，８５９，２２８号に記載されている。

グリセロール脂質などの親油性化合物またはポリアルキレングリコールなどの非免疫原性高分子量化合物と会合したＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許第６，０５１，６９８号にさらに記載されている。非免疫原性の高分子量化合物または親油性化合物と会合したＶＥＦＧ核酸リガンドは、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／１８４８０号にさらに記載されている。これらの特許および特許出願により、オリゴヌクレオチドの広範な形状および他の特性、ならびに有効な増幅および複製特性と他の分子の所望の特性とを組み合わせることが可能である。

ＳＥＬＥＸ法による小さな可動性ペプチドに対する核酸リガンドの同定もまた探索した。小ペプチドは、可動性構造を有し、通常、溶液中で複数の配座異性体が平衡して存在しているので、最初、結合親和性は可動性ペプチドの結合の際に喪失した配座異性体エントロピーによって制限され得ると考えられていた。しかし、溶液中での小ペプチドに対する核酸リガンド同定の実行可能性が、米国特許第５，６４８，２１４号で証明された。本特許では、物質Ｐ（１１アミノ酸ペプチド）に対する高親和性ＲＮＡ核酸リガンドを同定した。

ヌクレアーゼおよび加水分解に耐性を示すオリゴヌクレオチド集団を作製するために、修飾オリゴヌクレオチドを使用することができ、１つまたは複数の置換ヌクレオチド間結合、変化した糖、変化した塩基、またはその組み合わせが含まれ得る。１つの実施形態では、Ｐ（Ｏ）Ｏ基を、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）（式中、ＲまたはＲ’は独立してＨまたは置換もしくは非置換アルキルである）に置換する。結合基を、−Ｏ−、−Ｎ−、または−Ｓ−結合を介して隣接ヌクレオチドに結合することができる。オリゴヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。

さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾糖基（１つまたは複数の水酸基をハロゲン、脂肪族基、またはエーテルもしくはアミンなどの官能基と置換する）を含む。１つの実施形態では、フラノース残基の２’位を、任意のＯ−メチル基、Ｏ−アルキル基、Ｏ−アリル基、Ｓ−アルキル基、Ｓ−アリル基、またはハロ基と置換する。２’修飾糖の合成方法は、Ｓｐｒｏａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載されている。２−フルオロ−リボヌクレオチドオリゴマー分子は、非置換リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを使用して作製した分子と比較して標的分子に対する核酸センサー分子の感度を１０倍〜１００倍に増加させることができ（Ｐａｇｒａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７３（１９９７））、標的分子とのさらなる結合相互作用が得られ、核酸センサー分子の二次構造の安定性が増大する（Ｋｒａｕｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：５２０９−５２１２（１９９８）；Ｐｉｅｋｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４−３１７（１９９１）；Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５５２９−５２３４（１９９４）；Ｊｅｌｌｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１３６３−１１３７２（１９９５）；Ｐａｇｒａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５：６８−７３（１９９７））。

核酸アダプター分子は、一般に、５〜２０サイクルの手順で選択される。１つの実施形態では、最初の選択段階のみで異成分を移入し、複製プロセスを通して移入しない。

（ｇｐ１２０アプタマーの作製方法）
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、以下の添付の説明に記載する。本明細書中に記載のものと類似または等価な任意の方法および材料を本発明の手順または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料を本明細書中に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明から明らかである。明細書では、他で明確に示さない限り、単数形には複数形も含まれる。他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書中に引用された全ての特許および刊行物は、本明細書中で参考として援用される。

理論に拘束されることを望まないが、本発明は、その標的（「アゴニストＳＥＬＥＸ」）の高次構造の変化を誘導する能力を有するアプタマーの新規の産生方法、好ましくはｇｐ１２０と組み合わせて使用されるアジュバントとして（予防ワクチンとして）のその適用を記載する。アゴニストＳＥＬＥＸ法の中心的な工程を、図８〜１０に例示する。ＨＩＶワクチンアジュバントの作製のため使用する特定の方法を、図１１に示す。

ＨＩＶワクチンアジュバントとしての潜在的有用性を有するアプタマーを、天然のｇｐ１２０受容体／共同受容体（すなわち、ＣＤ４およびＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４）によって産生されたものに類似するｇｐ１２０の高次構造変化を駆動する能力に基づいて単離することができる。以前に単離して特徴付けた中和抗体は、ＣＤ４およびケモカイン受容体結合部位をマッピングすることが公知である。これらの抗体を、アプタマー選択のために適切な高次構造変化を部分的に駆動するための代理受容体として（図９）およびアプタマーによって誘導された適切な高次構造の変化の検出のためのプローブとして使用することができる。図８に概略的に示すように、アゴニストの標的への結合により、標的の標的パートナーとの相互作用（例えば、結合）の性質が変化する標的の高次構造変化が促進される。典型的には、アゴニストによって促進された標的と標的パートナーとの間の相互作用により、細胞内のシグナル伝達経路が開始される。一般的な例では、標的は膜受容体であり、アゴニストはペプチドもしくはタンパク質リガンドまたは本明細書中に開示のアプタマーであり、標的パートナーは細胞内シグナル伝達分子である。ＨＩＶ感染の場合、ＣＤ４を、標的パートナーＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４との相互作用を促進するための標的ｇｐ１２０に対して作用するアゴニストと説明することができる。ＨＩＶワクチンとして使用するためのアプタマーアジュバントは、標的（ｇｐ１２０）の高次構造を変化させて保存エピトープを曝露させ、それにより標的（ｇｐ１２０）とＢ細胞受容体との間の会合を駆動するアゴニストとして機能する。

本明細書中で使用される、「アゴニスト」は、標的への結合の際に標的の最適な高次構造の変化を誘導する任意の分子（好ましくは、アプタマー）を意味する。本明細書中で使用される、「標的パートナー」（または「ＴＰ」）は、標的に特異的に相互作用する（例えば、結合する）分子を意味する。本明細書中で使用される、「標的パートナーアナログ」（または「ＴＰＡ」）は、標的パートナーに類似の様式で標的と相互作用する（例えば、標的上の同一または重複部位で結合する）分子（抗体など）を意味する。本明細書中で使用される、「標的パートナー／アナログ」（または「ＴＰ／Ａ」）は、標的パートナーまたは標的パートナーアナログのいずれかまたは両方を意味する。「アゴニストＳＥＬＥＸ」プロセスでは、（１）標的パートナーまたはそのアナログとの会合を介したアゴニスト結合高次構造に向かう標的と特異的に相互作用する能力、および／または（２）標的の標的パートナーまたはそのアナログとの会合を特異的に駆動する能力に基づいてアプタマーを単離する。ｇｐ１２０アゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択のために、標的パートナー受容体（Ｂ細胞表面に発現する中和抗体の膜会合形態に相当する）を、ＣＣＲ５、ＣＤ４、１７ｂ、またはｂ１２（またはそのフラグメント）などの標的パートナーアナログ（中和抗体の結合を駆動するエピトープに結合することが公知の種）と機能的に置換することができる。下記のように、いくつかのアゴニストＳＥＬＥＸストラテジーはアゴニスト競合物に依存する。アゴニスト競合物は、アゴニストと同一の部位で標的と相互作用し、標的結合アゴニストの溶離に競合的に使用することができる分子である。

所望のアゴニスト特性を有するアプタマーを、図９および図１０に概説の広範なストラテジーならびに図１１に例示の特異的経路によって作製することができる。最初に、全経路は、ランダム配列プールからのｇｐ１２０特異的アプタマーまたはリガンドの選択から出発する（工程１）。次いで、ｇｐ１２０特異的アプタマーを、ｇｐ１２０を結合する蛍光のある偏った分子プールの作製のための出発点として使用する（工程２）。種々の負および正の淘汰圧を使用して、受容体／共同受容体結合によるものに類似の高次構造変化を誘発するアプタマーを特異的に富化させることができる（工程３〜６）。工程３〜６は、アゴニスト特性を有する分子のために工程２で作製されたプール内でアプタマーを富化する。その後、富化プール内の各クローンの高処理スクリーニングを使用して、アジュバントとして使用するための最適なアプタマーを同定することができる（工程７）。あるいは、１つの工程で富化されたプールを、その後の別の工程を介した富化のための出発点として使用することができる（工程８）。さらに、ｇｐ１２０に結合する能力およびｇｐ１２０の適切な高次構造のシフトを起こさせる能力が同時に選択されるように、工程１および／または工程２を全て省略することができる。複数の選択ストラテジーの組み合わせにより、アゴニスト活性を有するアプタマーを最も効率的に富化し、最終的に単離することができる。図４の各工程を実施することができる詳細な方法を、以下の節に記載する。

工程１：ｇｐ１２０アプタマーの選択。最初の工程では、アプタマーを、標的（例えば、ｇｐ１２０）への特異的結合についてランダム配列プールから選択する。好ましい実施形態では、アプタマーは、前に記載したＳＥＬＥＸ法に由来する。例えば、ｇｐ１２０特異的アプタマーを下記のように誘導することができる。

（Ａ）異なる配列の候補核酸混合物を調製する。候補混合物は、一般に、固定化配列領域（すなわち、候補混合物の各メンバーは同一の位置に同一の配列を含む）および無作為化配列領域を含む。（ｉ）下記の増幅工程を補助するため、（ｉｉ）標的に結合することが公知の配列を最小にするため、または（ｉｉｉ）候補混合物中の核酸の所与の構造整列濃度を増大させるために固定化配列領域を選択する。無作為化配列を、全て無作為化するか（すなわち、任意の位置である塩基が見出される確立は１／４である）、部分的に無作為化することができる（例えば、任意の位置である塩基が見出される確立を０と１００％との間の任意のレベルで選択することができる）。

（Ｂ）標的と候補混合物のメンバーとの間の結合に好ましい条件下で、候補混合物を選択された標識と接触させる。これらの環境下で、標的と候補混合物の核酸との間の相互作用を、標的と標的に対して最も強い親和性を有する核酸との間の核酸−標的対の形成と見なすことができる。

（Ｃ）標的に対して最も高い親和性を有する核酸を、標的に対してより低い親和性を有する核酸と分離する。候補混合物中に最も高い親和性核酸に対応する非常に少数の配列（およびおそらくたった１つの核酸分子）が存在し、一般に、分離時に候補混合物中に有意な量（約５〜５０％）の核酸が保持されるように分離基準を設定することが望ましい。

（Ｄ）次いで、分離時に標的に対して比較的高い親和性を有するものとして選択される核酸を増幅して、標的に対して比較的高い親和性を有する核酸中で富化された新規の候補混合物を作製する。標的と新規の候補混合物のメンバーとの間の結合に好ましい条件下でこの新規の候補混合物を選択標的と接触させて、さらな核酸−標的対を形成する。

（Ｅ）所望の配列数および配列型が得られるまで工程（Ｃ）および（Ｄ）（それぞれ、分離および増幅）を繰り返す。

上記の分離工程および増幅工程の繰り返しにつれて、新規に形成された候補混合物が含む固有の配列が減少し、標的細胞に対する核酸の平均親和性は徐々に増加する。極端にすれば、ＳＥＬＥＸプロセスにより、標的分子に対して最も高い親和性を有する元の候補混合物由来の核酸を示す１つまたは少数の固有の核酸を含む候補混合物が得られる。

本明細書中に記載の任意の様式で改変した基本的ＳＥＬＥＸ法によって本発明のアプタマーを調製することもできる。精製ｇｐ１２０または個別のドメインもしくはフラグメント（集合的に「フラグメント」）を使用して、ＳＥＬＥＸプロセスを行うことができる。あるいは、全長ｇｐ１２０またはｇｐ１２０フラグメントを、適切な発現系で産生することができる。あるいは、ｇｐ１２０中に見出された配列を含む合成ペプチドを標的として使用して、ＳＥＬＥＸプロセスを行うことができる。至適な核酸リガンドのために必要な正確なアミノ酸数の決定は、当業者の日常的実験である。ｇｐ１２０フラグメントは負の選択および正の選択における全長ｇｐ１２０のの代わりの標的としてＳＥＬＥＸプロセスで使用することができる。負の選択で有用なフラグメントを以下に記載する。正の選択で有用である可能性が最も高いフラグメントは、Ｃ１および／またはＣ５領域を欠くＶ１およびＶ２領域を含むフラグメントである。正の選択で有用な他のフラグメントを、当業者の日常的実験によって同定することができる。簡単に述べれば、マウスまたはアカゲザルを種々のｇｐ１２０構築物で免疫化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＩＶ感染を中和する能力について血清をスクリーニングする。最も強い中和応答を生じた同定ｇｐ１２０構築物を選択する。あるいは、一旦ｇｐ１２０−アプタマー抱合体が有用なＨＩＶワクチンと同定されると、アプタマーまたはｇｐ１２０の両方またはいずれかを、一部（例えば、ｇｐ１２０のＣ１および／またはＣ５領域またはアプタマーの末端もしくは他の非必須領域）の欠失、抱合体を形成するため最小化ｇｐ１２０および／またはアプタマーの混合、活性についての新規抱合体の試験、および全長ｇｐ１２０−アプタマー構築物の活性との比較によって最小にすることができる。

好ましい実施形態では、疎水性相互作用によって磁性ビーズに結合したｇｐ１２０のフラグメントを使用してＳＥＬＥＸプロセスを実施する。次いで、一本鎖ＲＮＡ分子の候補混合物を、マイクロタイタープレートのウェル中の磁性ビーズと接触させる。選択された温度での所定の時間のインキュベーション後、ビーズを磁場によってプレートのウェルの側面に保持し、プレートのウェルを洗浄して結合していない候補核酸リガンドを除去する。ｇｐ１２０に結合する核酸リガンドを、ウェル中の溶液に放出し、逆転写酵素によって逆転写し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅させる。次いで、増幅した候補混合物を使用して、次のＳＥＬＥＸプロセスラウンドを開始する。

好ましい実施形態では、標的（ｇｐ１２０）に対して高い親和性および特異性を有する分子プールを単離するために５〜１０回のＳＥＬＥＸプロセスを行う。

工程２：種々のｇｐ１２０アプタマーベースのプールの作製。高親和性リガンドだけでなく標的の適切な高次構造の変化を誘導するリガンドを単離する可能性を増大させるために、工程１のｇｐ１２０アプタマーのプールを、「多様化する」（すなわち、機能的多様性を増大させるために、選択したクローンの配列を変化させる）。以下を含むいくつかのの方法の組み合わせによってこれを行うことができる。

（Ａ）元の選択で存在する各クローンを単離および特徴付ける。特徴づけには、結合親和性アッセイ、（ｉｉ）配列決定、（ｉｉｉ）結合を担う最初の連続ドメインを定義するための短縮、（ｉｖ）機能的分子の人工的系統発生の作製（例えば、アプタマークローンのランダム変異誘発、結合種についての変異誘発プールの再選択（元のランダムプールで使用したものと同一のＳＥＬＥＸプロセスを使用）、再選択クローンの配列決定、ならびに保存配列および結合に必要な構造の配列決定クローンの分析による）が含まれ得る。これらの実験によって得られた情報を使用して、元のアプタマークローンに関連する新規の配列プールの化学合成を指示することができる（いくつかの例を、図１２に示す）。

（Ｂ）元の選択（工程１）で単離した１つまたは複数のアプタマーを、変異誘発条件下でのＰＣＲ増幅用テンプレートとして使用することができる。ポリメラーゼ媒介複製ラウンドの繰り返しにより、アプタマー配列の至る所に変異が組み込まれる。

（Ｃ）ランダム配列プライマーを使用したＰＣＲまたはランダム配列タグのライゲーションによって、ランダム配列タグをアプタマーまたはアプタマープールの５’および／または３’末端に添加することができる（図１２）。

機能的種の多様性を増大させるために同一の選択プロトコールを並行して使用して多プールデザインを使用することができる。実際、同一の選択条件下では、伝統的な体系化されていないプールでアプタマーが得られない場合、構造リボゾームフレームワークに構築したランダムプールによりアプタマーが得られた。これらの結果により、プール中にいくつかの初期ステム構造を得ることにより、核酸熱力学／構造ランドスケープ中のプールを複合体または異なるエピトープに結合するためにより広範に接近可能な領域に変換することができることが示唆される。

工程３〜６：ｇｐ１２０アゴニストを単離するためのスキームの選択。図１１に図示するように、工程２で得たｇｐ１２０アプタマーベースの配列のプールをアゴニスト活性を有するか有する可能性が高い種を富化させるために工程３〜６のＳＥＬＥＸプロセスの変化に供する。各工程の産物（ｏｕｔｐｕｔ）を、アゴニスト活性についてアッセイするか、別の選択工程のための投入物（ｉｎｐｕｔ）として提供することができる。例えば、ＣＤ４様活性（すなわち、ＣＤ４結合によって誘導されるものに類似の高次構造変化を誘導する傾向があること）を有するｇｐ１２０アプタマーを単離するように工程３〜４をデザインする。同様に、ケモカイン受容体様活性（すなわち、ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４結合誘導されるものに類似の高次構造変化を誘導する傾向があること）を有するｇｐ１２０アプタマーアゴニストを単離するように工程５〜６をデザインする。したがって、工程３および４を首尾よく組み合わせてアゴニストの１つのクラスを得ることができ、工程５および６を首尾よく組み合わせて別のクラスを得ることができる。

工程３：ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を競合するアプタマーの選択。本方法によるＣＤ４様アゴニストの選択は、図９に概説の一般的ストラテジーに従う。工程２で作製した配列プールを、以下の反復選択ラウンドに供する。

（１）ｇｐ１２０アプタマーベースの配列プールを、固定化標的パートナー／アナログと接触させ、特異的結合が優先される条件下で結合させる。最も好ましい実施形態では、標的パートナー／アナログは、固定化タンパク質Ａに結合する中和抗体１７ｂである。非結合種を回収し、次の工程に進める。

（２）標的（ｇｐ１２０）またはそのフラグメントを、実験条件下で高親和性で標的を結合することができる固定化ＴＰ／Ａを使用した固体支持体への結合によって固定化する。最も好ましい実施形態では、標的は、組換え発現ｇｐ１２０／ΔＣ１ΔＣ５である。選択された配列プールを、固定化標的（ｇｐ１２０）と接触させ、特異的結合が優先される条件下で結合させ、標的に対する親和性が低い種をいストリンジェントな洗浄によって除去し、破棄する。

（３）過剰なアゴニスト競合物（例えば、ＣＤ４）を保持されたプール画分と組み合わせる。ＣＤ４はｇｐ１２０に対して高い親和性を有し、ＣＤ４結合部位と重複する部位を介してｇｐ１２０に結合するアプタマーに置き換わる。既知のアゴニストによって特異的に溶離された種を、前記のように酵素で増幅させる。

投入物プールの有意な画分が捕捉されて特異的に溶離されるまで上記プロセスを繰り返す。好ましい実施形態では、このプロセスを５〜１０回繰り返す。

上記プロセスの代替法として、標的（ｇｐ１２０）と、アゴニスト競合物（例えば、ＣＤ４）と、選択的に標的パートナー／アナログ（例えば、１７ｂ）との固定化複合体を、負の選択工程で最初に使用することができる（すなわち、ランダム配列プールを複合体に接触させて、非結合種のみを回収し、後の工程に移す）。負の選択を通過した分子を、次に、標的（ｇｐ１２０）および選択的に標的パートナー／アナログ（１７ｂ）を含むがアゴニスト競合物を欠く固定化複合体と接触させる。複合体に対する親和性を有する分子を、ストリンジェントな洗浄およびその後の変性によって単離する。

上記方法により、その結合部位がＣＤ４と重複する種が富化される。ＣＤ４様活性を有するアゴニストは重複部位に結合することが予想され、いくつかの寄生型では、非アゴニストアプタマー（例えば、ＣＤ結合部位を部分的にのみ重複し、適切な高次構造の変化を誘導しないアプタマーが含まれる）がさらに富化される。以前の変異誘発および結晶学研究により、ＣＤ４とｇｐ１２０との間に特異的結合を誘導する重要な決定基が定義されている（Ｋｗｏｎｇ，１９９８）。これらには、Ｖ１−Ｖ２伸長ループ（Ｔｈｒ１２３〜Ｔｈｒ１９８）、Ｇｌｙ３６６−Ａｓｐ３７０、およびＭｅｔ４２６−Ｖａｌ４３０が含まれる。これらの領域中の変異は結合を破壊することが公知であり、ＣＤ４結合の結果としてこれらの領域の高次構造が変化するという証拠が存在する。アプタマーアゴニストは、標的活性化を駆動するために類似の相互作用に依存することが予想され、これらの相互作用を使用できないアプタマーは、適切な高次構造の変化を駆動する可能性が低いと見なすことができる。したがって、これらの配列／領域（したがって、アゴニスト）を欠く修飾標的を、プールから修飾標的に結合するアプタマーを除去するための負の選択で使用することができる。

この負の選択ストラテジーの実施形態では、ｇｐ１２０ΔＣ１／ΔＣ５／ΔＶ１−Ｖ２（ΔＴｈｒ１２３−Ｔｈｒ１９８をトリペプチドＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙに置換したもの）を固定化し、特異的結合を優先する条件下でｇｐ１２０アプタマーベースの配列プールと接触させる。特異的アプタマー修飾標的複合体を形成することができる期間でのインキュベーション後、非結合種を回収し、結合した種を破棄する。次いで、回収した種を、野生型標的（ｇｐ１２０）結合についての正の選択工程に移し、その後アゴニスト競合溶離に供する。Ｖ１−Ｖ２ループにより、ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体中のｇｐ１２０由来の接触表面の約半分が得られ、これが１７ｂ中和抗体に直接接触する。Ｖ１−Ｖ２の非存在下で特異的にｇｐ１２０と結合することができるアプタマーは、Ｖ１−Ｖ２ループの高次構造を変化させる方法で相互作用する可能性が低いので、アゴニスト活性を示すことができない。

同一の様式で、ｇｐ１２０ΔＣ１／ΔＣ５／Ｇｌｙ３６６−Ａｓｐ３７０→Ａｌａ／ΔＭｅｔ４２６−Ｖａｌ４３０変異体を使用して負の選択を行った。これらの残基は、ｇｐ１２０−ＣＤ４相互作用の他方の半分が必要である。しかし、これらの残基は標的パートナーの結合部位を直接定義しないので、この工程で活性アゴニストを選択プールから除去することが可能である。

工程４：標的パートナー／アナログに結合する標的を促進するアプタマーの選択。本方法によって単離したアゴニストは、図１０に概説の一般的ストラテジーに従う。ＣＤ４の前結合により、抗体１７ｂに対するｇｐ１２０の親和性が約１０倍に増加し（Ｚｈａｎｇ，２００１）、ケモカイン受容体ＣＣＲ５では１００倍〜１０００倍に増加することが示されている。標的の調整により、アゴニストおよび標的パートナー／アナログ濃度ならびに他の実験条件により、この特性を使用して標的パートナー／アナログに対する標的の親和性を増大させる標的結合物を選択することができる。

標的パートナー／アナログ（ＴＰ／Ａ）を固体支持体に固定化する。好ましい実施形態では、ＴＰ／Ａ（ｇｐ１２０に特異的に結合することが以前に示されているＣＣＲ５由来のスルホチロシンが豊富なペプチド）を、ストレプトアビジンコーティングプレートへのビオチン化を介して固定した（Ｃｏｒｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）。標的（ｇｐ１２０）アプタマーベースの配列を選択的に固定化ＴＰ／Ａと接触させ、特異的複合体形成を優先する条件下で結合させる。非結合オリゴヌクレオチド（「種」ともいう）を回収し、結合した種を破棄する。

（１）由来の負に選択された配列を標的と組み合わせ、標的のみとＴＰ／Ａとの間での有効な結合を優先しない条件下でＴＰ／Ａに固定化する。ＴＰ／Ａに対する標的親和性を増加させる様式で標的と特異的に相互作用することができる種は固体支持体上に優先的に保持され、そうでない種は溶液中に残存する。好ましい実施形態では、標的およびＴＰ／Ａの濃度を、１％未満の両形態しかその結合傾向を増大させるアゴニスト種の非存在下で複合体を形成しないようにに十分に低く維持する。新規のアゴニスト種−標的−ＴＰ／Ａ複合体が形成される平衡期後、非結合種をストリンジェントな洗浄によって除去する。

選択的に、低親和性の三重複合体（アプタマー−標的−ＴＰ／Ａ）を形成する標的結合アプタマーの放出を促進するために、過剰な遊離標的を弱く結合した標的と競合的に置換することができる。

特異的に保持されたアプタマーを、変性（例えば、加熱）によって固定化ＴＰ／Ａから除去するか、例えば、可溶性ＣＤ４または１７ｂＦａｂ（タンパク質Ａに結合しない）の使用によって特異的に溶離することができる。

工程５：ｇｐ１２０ケモカイン受容体結合部位と競合するアプタマーの選択。ＣＤ４様アゴニストの作製に対して行われる取り組みと並行して、選択を使用してＣＤ４ＢＳエピトープの適切な提示を誘導するためにケモカイン受容体結合部位付近に結合するアプタマーを作製することができる。アゴニスト競合物ＣＤ４のＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４の可溶性形態への置換または標的パートナーアナログ１７ｂの可溶性ＣＤ４もしくは中和抗体ｂ１２への置換を使用した工程３に記載の方法を使用してこの特異性を有するアプタマーを作製することができる。例を以下に記載する。

（１）ｇｐ１２０アプタマーベースの配列のプールを、固定化標的パートナー／アナログと接触させて、特異的結合を優先する条件下で結合させる。非結合種を回収し、後の工程に移す。

（２）実験条件下で高親和性で標的を結合することができる固定化標的パートナー／アナログを使用して、標的（ｇｐ１２０）またはそのフラグメントを固体支持体への結合によって固定化する。最も好ましい実施形態では、標的は組換え発現したｇｐ１２０／ΔＣ１ΔＣ５であり、ＴＰ／Ａはモノクローナル抗体ｂ１２である。選択配列のプールを固定化標的（ｇｐ１２０）と接触させて、特異的結合を優先する条件下で結合させる。ストリンジェントな洗浄によって標的に対する親和性の低い種を除去し、破棄する。

（３）ケモカイン受容体結合部位競合物（例えば、１７ｂまたは界面活性剤可溶性ＣＣＲ５）を保持されたプール画分と組み合わせる。ＣＣＲ５および１７ｂはｇｐ１２０に対して高い親和性を有し、ケモカイン受容体結合部位と重複する部位を介してｇｐ１２０に結合するアプタマーに置き換わる。既知のアゴニストによって特異的に溶離された種を、前記のように酵素で増幅させる。

ＣＤ４結合部位を介して相互作用するアプタマーの選択と同様に、ケモカイン受容体結合部位の選択により、受容体結合部位の一部と相互作用するが標的の適切な高次構造の変化を駆動しない非アゴニストを作製する。結合部位の残基が欠失または置換される標的の修飾形態を含む適切な負の選択工程によって、これらのアプタマーを選択されたプールから優先的に除去することができる。好ましい実施形態では、ＣＤ４様アゴニスト選択にういて前に記載の負の選択工程によって、伸長Ｖ１−Ｖ２可変ループを欠くｇｐ１２０の修飾形態（Ｔｈｒ１２３−Ｔｈｒ１９８→Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）が得られる。

工程６：ＣＤ４またはその機能的アナログに結合するｇｐ１２０を促進するアプタマーの選択。ケモカイン受容体およびその機能的アナログに対するｇｐ１２０の結合親和性を増大させるアゴニストの作製に対して行われる取り組みと並行して、選択を使用してＣＤ４またはその機能的アナログに対する高親和性結合を促進する分子の単離よってケモカイン受容体様アゴニスト活性を有するアプタマーを作製することができる。アゴニストＣＤ４のＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４への置換または標的パートナーアナログ１７ｂの可溶性ＣＤ４もしくは中和抗体ｂ１２への置換を使用した工程４（図１０）に記載の方法を使用してこの特異性を有するアプタマーを作製することができる。例を以下に記載する。

（１）標的パートナー／アナログを、固体支持体上に固定する。好ましい実施形態では、ＴＰ／Ａはｂ１２であり、これを当該分野で周知のタンパク質Ａ固定化法を使用して予め固定化したタンパク質Ａへの非共有結合によって固定化する。標的（ｇｐ１２０）アプタマーベースの配列を、選択的に固定化ＴＰ／Ａに接触させて特異的複合体形成を優先する条件下で結合させる。非結合種を回収し、結合種を破棄する。

（２）（１）由来の負に選択された配列を標的と組み合わせ、標的のみとＴＰ／Ａとの間での有効な結合を優先しない条件下でＴＰ／Ａに固定化する。ＴＰ／Ａに対する標的親和性を増加させる様式で標的と特異的に相互作用することができる種は固体支持体上に優先的に保持され、そうでない種は溶液中に残存する。好ましい実施形態では、標的およびＴＰ／Ａの濃度を、１％未満の両形態しかその結合傾向を増大させるアゴニスト種の非存在下で複合体を形成しないように十分に低く維持する。新規のアゴニスト種−標的−ＴＰ／Ａ複合体が形成される平衡期後、非結合種をストリンジェントな洗浄によって除去する。

選択的に、低親和性の三重複合体（アプタマー−標的−ＴＰ／Ａ）を形成する標的結合アプタマーの放出を促進するために、過剰な遊離標的を弱く結合した標的と競合的に置換することができる。

特異的に保持されたアプタマーを、変性（例えば、加熱）によって固定化ＴＰ／Ａから除去するか、例えば、ｇｐ１２０結合特異性を有する非ビオチン化ＣＣＲ５由来のスルホペプチドの使用によって特異的に溶離することができる。

工程７：ワクチンアジュバントとして使用するためのｇｐ１２０アゴニストのＳＥＬＥＸ後操作／至適化。工程３〜６に記載の選択方法の反復適用により、抗原として有効な免疫応答を誘発する能力を増大させるｇｐ１２０の高次構造の変化を誘導する能力を有するアプタマーを富化したプールが得られる。有用なアプタマーベースのワクチンアジュバントを作製するために、アプタマープール内の最良の出発候補を同定してアジュバントとして使用するためのその産生特性を改良するための以下のさらなる工程を実施する。

（１）クローンのスクリーニング。一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択で単離された各アプタマーをいクローン化し、機能活性について特徴付ける。最初のスクリーニングでは、標的への標的パートナー／アナログの結合を促進する能力に基づいてアプタマーを評価することができる。例えば、固定化１７ｂを含むアッセイプレート中で、蛍光標識したｇｐ１２０を、所定量のＣＤ４様アゴニストアプタマークローンと組み合わせる。結合インキュベーションおよびストリンジェントな洗浄後、蛍光プレートリーダーを使用して保持されたｇｐ１２０を定量することができる。最も高いアゴニスト活性を有するアプタマーを、本アッセイにおいてｇｐ１２０保持を最も有効に促進すると予想する。一定範囲のアプタマー濃度の試験により、最も親和性の高いアプタマーアゴニストを同定することができる。この一次スクリーニングの利点は、非常に多数の候補を最小限の作業で迅速に評価する能力である。

二次スクリーニングでは、中程度の処理能力で中和抗体応答を誘導する能力についてアプタマーを試験することができる。下記の１つまたは複数の方法によって、アプタマーを組換え発現ｇｐ１２０に抱合し、当該分野で周知の方法を使用して、Ｒｉｂｉ（Ｒ−７００）または細胞壁材料（Ｒ−７３０）などの従来のアジュバントと共に処方することができる。次いで、免疫応答を誘発するためにアプタマー複合体をマウスに注射する。詳細には、マウスの４つの皮下部位に０．０５ｍｌのワクチンを注射する。３週間間隔で追加免疫化を行い、免疫化から１０〜２８日後に尾から採血する。最後に、放血によってより大量の血清を得て、ｇｐ１２０に対する血清抗体をｇｐ１２０酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって定量することができる（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。次いで、血清の中和活性を、ヒト末梢血単核（ＰＢＭＣ）標的細胞を使用した中和アッセイで試験する（Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２００１）。（２）クローンの特徴づけ。活性について少量のクローンが同定されたので、その産生特性を改良するためにこれらのクローンをさらに特徴付けることができる。特徴づけには、以下が含まれる：（ａ）配列決定。各クローン化アプタマーを保有するプラスミドを従来の十分に確立されているＤＮＡ配列決定法を使用して配列決定することができる。（ｂ）短縮。末端標識アプタマーを、部分的加水分解に供し、標的（ｇｐ１２０）結合に基づいて分離し、加水分解フラグメントが結合種または非結合種として区画されるかどうかを決定するために分析する。このプロセスを通して、結合を担う最小連続ドメインを定義する個別の５’および３’境界を同定することができる。（ｃ）系統発生分析。アプタマークローンを、変異誘発ＰＣＲまたは転写用オリゴヌクレオチドテンプレートのドーピング再合成（ｄｏｐｅｄ ｒｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）のいずれかによるランダム変異誘発に供する。変異誘発配列プールを、前述の１つまたは複数の工程（工程３〜６）を使用した再選択に供する。再選択プール内の機能的クローンは、結合種（元のランダムプール内で使用した同一のＳＥＬＥＸプロセスを使用する）、再選択クローンの配列決定、ならびに保存配列および結合に必要な構造についての配列決定クローンの分析のためである。（ｄ）合成。当該分野で公知の核酸合成技術を使用して、最小アプタマーを合成する。

（３）アプタマーの至適化。エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ消化への耐性を増加させながらｇｐ１２０結合の高親和性を保存するアプローチによって、アプタマーの薬物動態学的性質を至適化した。出発プールでの２’−フルオロ置換アプタマーの使用んにより高いヌクレアーゼ耐性が付与され、２’−Ｏ−メチルプリン残基の導入によってなおさらに増強することができる。ｇｐ１２０：アプタマー複合体が重要な２’−ＯＨ基とｇｐ１２０との間で接触し得るので、２’−Ｏ−メチル置換基は全てのプリン部位で寛容され得ない。したがって、抗ｇｐ１２０アプタマーのプリン残基での２’−Ｏ−メチル置換基を、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド妨害アッセイで試験する（Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。アプタマーの５’末端および３’末端でのキャップ構造は、エキソヌクレアーゼ活性を有効に遮断することも公知である（Ｆｌｏｅｇｅ，１９９９；Ｔｕｃｋｅｒ，１９９９；Ｒｕｃｋｍａｎ，１９９８；Ｄｏｕｇａｎ，２０００）。３’−３’チミジンおよび３’−ビオチンキャップ修飾を含む候補２’−フルオロピリミジンおよび２’−Ｏ−メチルプリン含有アプタマーを化学合成し、ｇｐ１２０結合および関連するｇｐ１２０の結合誘導性高次構造変化について試験することができる。

（４）ｇｐ１２０への結合。有効なワクチンアジュバントとしてのアプタマーの活性は、アプタマーがｇｐ１２０に共有結合することが必要であり得る。ｇｐ１２０の表面炭水化物部分を介したアプタマーの連結により、共有結合したアプタマー／ｇｐ１２０複合体の１つの操作手段が得られる。種々の長さのＰＥＧスペーサー領域を組み込んだ抗ｇｐ１２０アプタマーを、ヒドラジン処理によって修飾し、過ヨウ素酸塩酸化ｇｐ１２０と反応させる。次いで、得られた共有結合アプタマー／ｇｐ１２０複合体を、ＣＤ４、ＣＣＲ５、および抗体相互作用ならびに中和抗体の作製能力に関して特徴づける。あるいは、前述のようにアプタマーおよびｇｐ１２０を光架橋させることができる。

（投与、用量、および治療計画）ＨＩＶ感染の予防または感染個体のＨＩＶレベルの減少方法は、ヒトをアプタマー−ｇｐ１２０ワクチンに曝露する工程と、ｇｐ１２０と反応する抗体を能動的に誘導する工程と、ＨＩＶがｉｎ ｖｉｖｏで細胞に感染する能力を防止／軽減する工程を含む。この方法は、非感染被験体またはコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）免疫系を有するＨＩＶ感染被験体に適切である。本方法により、ＧＰ１２０と反応してウイルスの細胞感染能を中和する抗体が誘導される。大量に曝露した以前に感染していない個体では、本方法によりＨＩＶへの曝露の際のウイルス増殖が防止される。既に感染した個体については、本方法により、循環ウイルス（「ウイルス負荷」）レベルが減少し、疾患の影響が緩和される。本発明はまた、ｇｐ１２０と抱合していないｇｐ１２０アプタマーの投与によるＨＩＶ感染の治療を含む。

用語「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などは、本明細書中で、所望の薬理学的効果または生理学的効果の獲得を意味するために使用される。効果は、障害またはその症状の徴候を完全または部分的に防止するという点で予防的であり、障害および／または障害に寄与する副作用の部分的または完全な治癒という点で治療的であり得る。本明細書中で使用される、「治療」は、任意の治療を対象とし、（ａ）障害に罹患しやすい被験体の疾患の発症の予防、（ｂ）障害の阻害（すなわち、その進行の停止）、または（ｃ）障害の緩和または改善が含まれる。「有効量」または「治療有効量」は、所望の生理学的効果を得るのに十分な量である。ワクチンについての適切な投与計画を、一般に、患者集団に対する比較臨床試験に基づいて決定し、有効量のワクチンは、それぞれの場合において当業者にっよって通常考慮される要因（治療を受ける被験体の年齢、性別、および体重、治療条件、ならびに治療を受ける病状の重症度が含まれる）に基づいて意志によって選択される。

（アプタマー−ｇｐ１２０ワクチンの投与）
アプタマー−ｇｐ１２０ワクチンを処方し、種々の手段（全身、局所、または局部投与が含まれる）で投与することができる。好ましくは、アプタマー−ｇｐ１２０ワクチンを処方し、全身投与する。処方および投与技術を、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｔｗｅｎｔｉｅｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，”Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡで見出すことができる。適切な経路には、経口、直腸、経粘膜、または腸投与、非経口送達（筋肉内注射または皮下注射が含まれる）、または鼻腔内注射が含まれ得るが、これらに限定されない。

全身投与のために、注射（筋肉内（好ましい）および皮下が含まれる）が好ましい。注射のために、ワクチンを、水溶液中、好ましくは生理学的に適合する緩衝液（ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水など）中に処方し、アジュバント（例えば、ミョウバン、ポリマー、コポリマー）が含まれ得る。さらに、ワクチンを、固体または凍結乾燥形態で処方し、その後使用直前に再溶解または懸濁することができる。

生物学的半減期、免疫応答、投与間隔、および毒性などのパラメーターを扱う当業者に周知の手順によって有効なワクチンの濃度および投与頻度を決定することができる。好ましい投与濃度は、約０．１μｇ／ｋｇ体重〜約４μｇ／ｋｇ体重の範囲であり得るが、約０．５μｇ／ｋｇ体重が最も好ましい。免疫原性に依存して、１ヶ月間隔で２〜３回の投与、その後６ヶ月後、その後１年間隔の追加注射が、中和抗体の必要な循環濃度の維持に十分であり得る。用量、投与間隔、および投与数は、患者集団（年齢、体重、基礎疾患、免疫学的状態など）に依存する。

ワクチンを単独または他の治療と組み合わせて投与することができる。このような治療には、小分子である抗ＨＩＶインヒビターもしくはアンタゴニストおよび／または異なる機構（例えば、Ｔ細胞媒介免疫の作製による）によって作用する他の抗ＨＩＶワクチンの連続投与または同時投与が含まれる。

（薬学的組成物）
投与に適切な薬学的組成物は、典型的には、ワクチンおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される、「薬学的に許容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合する任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、ならびに等張剤および吸収遅延剤などが含まれることが意図される。適切なキャリアは、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｔｗｅｎｔｉｅｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，”Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡに記載されている。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例には、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびリン酸緩衝化生理食塩水が含まれる。リン酸アルミニウム、リポソーム、および不揮発性油などの非水性賦形剤などのアジュバントも使用することができる。薬学的に活性な物質のためのこのような溶媒および薬剤の使用は当該分野で周知である。任意の従来の溶媒または薬剤が活性化合物に適合しない範囲を除いて、組成物中でのその使用が意図される。補助的活性化合物を組成物に組み込むこともできる。

本発明の薬学的組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例には、非経口投与（例えば、筋肉内および皮下投与）が含まれる。非経口適用のために使用される溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれ得る：滅菌希釈剤（注射用の水、生理食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒など）；抗菌薬（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど）；キレート剤（エチレンジアミンテトラ四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；緩衝液（酢酸緩衝液またはリン酸緩衝液など）、および張度調整剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）。塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を使用してｐＨを調整することができる。ミョウバンまたは当該分野で一般に知られている他の薬剤などのアジュバントの封入によって免疫原性を増強することができる。非経口調製物を、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスまたはプラスチック製の多用量のバイアル中に封入することができる。全ての場合、組成物は無菌でなければならず、容易にシリンジで使用できる範囲の流動物であるべきである。組成物は、製造および保存条件下で安定でなければならず、多用量バイアルに処方した場合に細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。

上記成分の１つまたはその組み合わせと共に適切な溶媒中に所要量の活性化合物を組み込み、その後濾過滅菌することにより滅菌注射用溶液を調製することができる。一般に、基剤となる分散媒および上記の必要な他の成分を含む滅菌賦形剤への活性化合物の組み込みによって分散液を調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、事前に濾過滅菌した溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥、凍結乾燥、およびフリーズドライである。

投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、単位投与形態の非経口組成物を処方することが特に有利である。本明細書中で使用される、「単位投与形態」は、治療される被験体のための単一投与として適切な物理的に個別の単位をいい、各単位は、必要な薬学的キャリアと組み合わせて所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位投与形態の仕様は、活性化合物の固有の特徴、特に達成すべき治療効果、および個体治療のためのこのような活性化合物の配合分野における固有の制限によって決定され、これらに直接依存する。

（調節アプタマーの作製方法）
調節アプタマーは、第１のリガンドまたはエフェクター（例えば、ｇｐ１２０）へのアプタマーの結合によって第２のリガンド（例えば、ＣＣＲ５受容体）へのアプタマーの結合が調節された（すなわち、活性化または抑制された）アプタマーである。これらの性質を有するアプタマーを、以下の任意の選択ストラテジーを使用して作製することができる。

（方法１：ナイーブ配列プールからの選択）
さらなる血清安定性のために２’−フルオロピリミジンを含む核酸プールを使用してリガンド調節アプタマーを選択する。第１のプールについて、４０個の無作為化ヌクレオチド−（Ｎ_４０）−によって、

（配列番号２）に連結した配列：

（配列番号１）を有するＤＮＡテンプレートを、ＡＢＩ ＥＸＰＥＤＩＴＥ^ＴＭＤＮＡ合成機を使用して合成し、標準的な方法によって精製する（Ｎ_４０は各アプタマーに固有に構築した４０ヌクレオチドのランダム配列を示す）。テンプレートプール由来の固有の配列を有する約１０^５個のＤＮＡ分子を、プライマー

を使用してＰＣＲ増幅することができる。

第２のプール「半構造（ｓｅｍｉ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）」プールは、以下の配列

を有するＤＮＡテンプレートを同一の様式で合成する。テンプレートプール由来の固有の配列を有する約１０^１５個のＤＮＡ分子を、プライマー

を使用してＰＣＲ合成することができる。増幅プールＰＣＲ産物を、エタノールで沈殿させ、水に再懸濁し、Ｎａｐ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で脱塩する。各プールＰＣＲ増幅物由来の約４×１０^１５個のＤＮＡ分子を、２’−フルオロピリミジン（Ｓｏｕｓａ，１９９９）、２’−フルオロピリミジン、および２’−ＯＨプリンＮＴＰを受け入れる変異Ｙ６３９Ｆ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで転写して対応する配列を有する約３×１０^１６個のＲＮＡ分子を得た。１０^１４〜１０^１５個のランダム配列から作製した全体積が約１００μｌの安定化２’−フルオロピリミジンプールを、ニュートラビジンコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）中に固定したビオチン化標的またはプレート中に固定した接着標的発現細胞のいずれかと接触させる。正の選択工程および不の選択工程で使用される典型的な結合緩衝液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣ１_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、および０．１ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ（４ｍＭ）を含む。室温で１０分間の負のインキュベーション後、この負の選択工程で標的のみと結合するＲＮＡを除去する。次いで、非結合ＲＮＡを含む溶液を、固定化標的を含む別の同一のウェルに移し、エフェクターを溶液に添加する。エフェクターの添加濃度を、エフェクターと応答する分子を最適な濃度に最終的に富化するように調整することができる。最初に、任意のエフェクター依存量を有する分子が確実に単離されるように、飽和濃度のエフェクター得る（典型的には、グルコースなどの小分子エフェクターにはミリモルであり、タンパク質エフェクターには高μモル濃度である）。連続選択ラウンドでは、最もエフェクターに依存する分子を優先的に単離するためにエフェクター濃度を減少させることができる。１時間の平衡後、ウェルを過剰な結合緩衝液でリンスする（典型的には、プレート洗浄ロボットでの３０秒間の震盪にて１２０μｌの１×ＡＳＢで４回の洗浄）。５０μｌのＲＴ混合物（ＲＴプライマー（４μＭ）、５×「Ｔｈｅｒｍｏ緩衝液」（１×）、ＤＴＴ（１００ｍＭ）、混合ｄＮＴＰ（各０．２ｍＭ）、バナジウム酸ヌクレオチドインヒビター（２００μＭ）、ｔＲＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）、０．５μｌのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（水で５０μｌにする））を選択ウェルに添加し、蒸発を防ぐためにウェルの上にテープを貼って６５℃で３０分間インキュベートする。

ＲＴ反応物を、１００μｌのＰＣＲ反応物（５’プライマー（１μＭ）、３’プライマー（１μＭ）、１０×ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＣＲ緩衝液（Ｍｇなし）（１×）、ｄＮＴＰ（それぞれ０．２ｍＭ）、ＭｇＣｌ_２（３ｍＭ）、１μｌ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑ、１０μｌの隠喩ベーとしたＲＴ反応物（水で１００μｌにする）を含む）で１０倍希釈し、以下のスケジュールでサーマルサイクラーを運転する：９４℃で１分間、６２℃で１分間、７２℃で３分間。ＰＣＲ反応物を１０サイクルでアガロースゲルによってアッセイし、定義された増幅バンドが臭化エチジウム染色によって視覚化されるまで、それぞれ連続５サイクル運転した。完了したＰＣＲ反応物を、Ｃｅｎｔｉ−ｓｅｐカラムを使用して精製し、５０μｌの転写反応物（４×ＴＫ転写緩衝液（１×）、ＭｇＣｌ_２（２５ｍＭ）、ＮＴＰ（各５ｍＭ）、ＮＥＢ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（２μｌ）（水で５０μｌにする））で１０倍希釈する。転写反応物を３７℃で一晩インキュベートし、得られた転写産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％ゲル）によって精製する。

正の選択および負の選択の両方を通過した分子画分が元のナイーブプール画分をよりも有意に増加するまで（典型的には、投入物の１０％超）全選択プロセスを繰り返す。典型的には、富化には１０回を超える選択サイクルが必要である。富化プール内の各分子を単離し、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングシステム（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）を使用したプールしたテンプレートＤＮＡのサブクローニングによって特徴付ける。各クローンを配列決定し、固有のクローンをエフェクター依存結合についてスクリーニングする。

（方法（２）：標的結合の予備選択およびその後のエフェクター依存性選択）
標的およびエフェクターの結合特性の両方を有する分子が出発プールに存在する確率が低い場合、選択方法（１）を以下のように修正することができる。最初の標的結合およびエフェクター依存性の両方の選択の代わりに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択を使用して、標的に対して高親和性を有する分子を単離することができる。選択的多様化工程（選択された標的結合配列プールを部分的に無作為化する）後、エフェクター依存性選択を適用することができる。標的特異的アプタマーを単離するために、以下のように修正した前述の選択方法を適用した：（１）負の選択工程の標的を省略すること、および（２）正の選択工程のエフェクターを省略すること。５〜１５ラウンドの選択により、典型的には、１〜１０００個の固有の配列を含む標的結合種のプールが得られる。特異的に標的に結合する能力について各クローンをスクリーニングする。

エフェクター依存性標的結合活性の可能性が増加した多様化配列プールを、多数の以下の手段によって作製することができる。

１）配列の富化標的結合プールの変異誘発ＰＣＲ増幅。

２）高親和性および特異性結合を有するクローンを選択する標的結合プールから単離した各クローン配列のドーピング再合成。この場合、配列の各位置または特定の領域内に１０〜３０％の確率で配列に変異を無作為に導入する。

３）ランダム配列ドメインに隣接した標的結合プールから単離した各クローン配列の機能的に重要なサブドメインの再合成。一旦元のプールから各アプタマーが同定されると、生化学活性に必要な最小配列エレメントを以下の２つの並行アプローチによって同定することができる：（１）部分的アルカリ加水分解による短縮分析、および（２）ドーピング再選択（方法は、Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ ＆ Ｐｏｌｉｓｋｙ，１９９６で概説されている）。最小機能的アプタマーエレメントを決定するための補助に加えて、ドーピング再選択によって導入された配列変動により、親和性または生化学活性が改良された元のクローンの変異体を得ることができる。多様化プールを、前述のエフェクター依存性標的結合についての選択に供する。

（方法（３）：エフェクター結合の予備選択およびその後のエフェクター依存性選択）
標的およびエフェクターの結合特性の両方を有する分子が出発プールに存在する確率が低い場合、選択方法（１）を以下のように修正することができる。最初の標的結合およびエフェクター依存性の両方の選択の代わりに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択を使用して、エフェクターに対して高親和性を有する分子を単離することができる。前述のように、選択的多様化工程（選択されたエフェクター結合配列プールを部分的に無作為化する）後、エフェクター依存性標的結合選択を適用することができる。エフェクター特異的アプタマーを単離するために、以下のように修正した第１の選択方法を適用した：（１）負の選択工程の標的を省略すること、および（２）正の選択工程の標的を省略し、代わりのエフェクターを捕捉固体支持体に固定すること。グルコースなどの小分子エフェクターの場合、１〜５ｍＭの固定化エフェクターを使用した２００μｌアガロースビーズカラムを使用する従来のアフィニティクロマトグラフィが好ましい固定化形式である。５〜１５ラウンドの選択により、典型的には、１〜１０００個の固有の配列を含むエフェクター結合種のプールが得られる。特異的にエフェクターに結合する能力について各クローンをスクリーニングする。

エフェクター結合分子の配列多様化プールを、以下の手段の１つによって作製することができる。

１）配列の富化エフェクター結合プールの変異誘発ＰＣＲ増幅。

２）高親和性および特異性結合を有するクローンを選択する、エフェクター結合プールから単離した各クローン配列のドーピング再合成。この場合、配列の各位置または特定の領域内に１０〜３０％の確率で配列に変異を無作為に導入する。

３）ランダム配列ドメインに隣接したエフェクター結合プールから単離した各クローン配列の機能的に重要なサブドメインの再合成。機能的に重要なエフェクター結合配列のサブドメインを、元のクローンの短縮およびその後のエフェクター結合のアッセイによって定義することができる。

多様化プールを、選択方法（１）に記載のエフェクター依存性標的結合の選択に供する。

（方法（４）：エフェクター結合および標的結合モチーフの予備選択およびその後のエフェクター依存性標的結合選択）
標的およびエフェクターの結合特性の両方を有する分子が出発プールに存在する確率が低い場合、選択方法（１）を以下のように修正することができる。最初の標的結合およびエフェクター依存性の両方の選択の代わりに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択を使用して、２つの個別の分子プール（一方はエフェクターに高親和性を有し、他方は標的に高親和性を有する）を単離することができる。２つのプール内のサブドメインを、各分子がエフェクター結合モチーフの１つのコピーおよび標的結合モチーフの１つのコピーを含む分子のキメラプールを作製するように操作することができる。前述のように、このキメラプールを、エフェクター依存性の標的結合選択に供する。

標的特異的アプタマーを単離するために、以下のように修正した選択方法（１）を適用した：（１）負の選択工程の標的を省略すること、および（２）正の選択工程の標的を省略すること。エフェクター特異的アプタマーを単離するために、以下のように修正した選択方法（１）を適用した：（１）負の選択工程の標的を省略すること、および（２）正の選択工程の標的を省略し、代わりのエフェクターを捕捉固体支持体に固定すること。グルコースなどの小分子エフェクターの場合、１〜５ｍＭの固定化エフェクターを使用した２００μｌアガロースビーズカラムを使用する従来のアフィニティクロマトグラフィが好ましい固定化形式である。

好ましい実施形態では、各標的およびエフェクター特異的プール由来の高親和性クローンの機能的サブドメインを使用して、エフェクター依存性選択のためのキメラプールを作製することができる。機能的サブドメインを、前述のように同定することができる（選択方法（２））。介在ランダム配列ドメインと共に機能的モチーフを連結されることによってキメラプールを作製することができる。あるいは、前述のように、エフェクター依存性リボザイムのためのヘリックスの連結を介した結合によって二次構造レベルでモチーフを組み合わせることができる（Ｓｏｕｋｕｐ，Ｇ．，ａｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．（１９９９）“Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ ７（７）：７８３−９１）。

他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書中に記載のものと類似の方法およい材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および材料を上に記載する。矛盾する場合、定義を含む本明細書を調節する。さらに、材料、方法、および実施例は例示のみを意図し、本発明を制限することを意図しない。

本明細書中に引用した全ての刊行物および特許書類は、それぞれのこのような刊行物または書類が具体的且つ個別に本明細書中に参考として援用されるように示されるかのように本明細書中で参考として援用される。刊行物および特許書類の引用は、いずれも適切な先行技術と承認されていることを意図せず、これらの内容または日付に関していかなる承認も構成していない。本発明は明細書によって説明され、当業者は、本発明を種々の実施形態で実施することができ、上記説明および下記の実施例は例示を目的とし、以下の特許請求の範囲を制限しないと認識する。

（実施例１ ｇｐ１２０に対する結合親和性を有するアプタマーの同定）
図４は、治療目的のアプタマーの作製に典型的に必要な工程を示す。プロセスは、およそ以下の４つの段階と見なすことができる：（ｉ）および（ｉｉ）アプタマー同定、（ｉｉｉ）アプタマーの最小化、および（ｉｖ）安定性についてのアプタマーの至適化。

１０^１４〜１０^１５個のランダム配列から作製した安定化２’−フルオロ−ピリミジンプールを、ニュートラビジンコーティング９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）中に固定したビオチン化スルホチロシン−ＣＣＲ５ペプチド（Ｃｏｒｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）と接触させた。あるいは、９６ウェルプレートに固定した接着性ＣＣＲ５発現細胞を使用することができる。ペプチドまたは細胞のみに結合するＲＮＡを、この負の選択工程で除去した。次いで、ＲＮＡ溶液を別の同一のＣＣＲ５ペプチドに移した。あるいは、細胞を含むウェルを使用することができる。この点で、ｇｐ１２０を反応物に添加し、これらを平衡化した。次いで、ウェルを選択緩衝液でリンスし、固定化ＲＮＡを、逆転写、ＰＣＲ、および別の活性レベルの選択ラウンドのための転写によって増幅した。この様式で選択されたアプタマーは共にｇｐ１２０に結合し、ＣＣＲ５へのｇｐ１２０結合を誘導するので、ＣＣＲ５またはＣＤ４ｉエピトープが曝露される。活性ベースの選択によって作製されたアプタマーは、ＣＤ４結合部位に結合し得るが、アプタマーはＣＣＲ５結合高次構造中でｇｐ１２０を安定化するための別の機構を使用することができるので、これは絶対的に必要ではない。最初の負の選択工程を使用したので、非アロステリック様式で同時にＣＣＲ５およびｇｐ１２０に結合するアプタマーを選択すべきではなかった。選択後プロセス時に、確実にｇｐ１２０の非存在下でいかなるＣＣＲ５結合活性も含まないように適切にプールおよびクローンをスクリーニングした。選択プロセスのより詳細な説明を以下に示す。

プール調製。さらなる血清安定性のために２’−フルオロピリミジンを含む２つの異なる核酸プールを使用して、ｇｐ１２０アプタマーの選択を行った。第１のプールのために、第１のプールについて、４０個の無作為化ヌクレオチド−（Ｎ_４０）−によって、

（配列番号２）に連結した配列：

（配列番号１）を有するＤＮＡテンプレートを、ＡＢＩ ＥＸＰＥＤＩＴＥ^ＴＭＤＮＡ合成機を使用して合成し、標準的な方法によって精製する（Ｎ_４０は各アプタマーに固有に構築した４０ヌクレオチドのランダム配列を示す）。テンプレートプール由来の固有の配列を有する約１０^５個のＤＮＡ分子を、プライマー

を使用してＰＣＲ増幅した。第２のプール「半構造」プールについて、ＤＮＡテンプレート配列

を同一の様式で合成する。第２のテンプレートプール由来の固有の配列を有する約１０^１５個のＤＮＡ分子を、プライマー

を使用してＰＣＲ増幅した。増幅プールＰＣＲ産物を、エタノールで沈殿させ、水に再懸濁し、Ｎａｐ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で脱塩した。プールＰＣＲ増幅物由来の約４×１０^１５個のＤＮＡ分子を、２’−フルオロピリミジン、２’−フルオロピリミジン、および２’−ＯＨプリンＮＴＰを受け入れる変異Ｙ６３９Ｆ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで転写して対応する配列を有する約３×１０^１６個のＲＮＡ分子を得た。

初期選択実験。ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ ＢａＬは、選択用の標的であった。このｇｐ１２０株は、その共同受容体としてＣＣＲ５を使用するので、ＨＸＢ２などの株を使用する実験用ＣＸＣＲ４共同受容体よりも予防ワクチン開発のための臨床的に関連する株を示す可能性がより高い。ＣＨＯ細胞中で発現した精製組換えｇｐ１２０ ＢａＬを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から入手した。

ｇｐ１２０ ＢａＬに結合するアプタマーを富化するために、ニトロセルロース区画化法（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，１９９０；Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６）を使用して、初期実験を行った。最初に、２×１０^１４個の固有の配列を、５０〜１００ｎＭのｇｐ１２０ ＢａＬを含む選択緩衝液（２０ｍＭ Ｋ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣ１_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭ ＫＣｌ）にて室温で１時間平衡化した。複合体化ＲＮＡ分子および遊離ＲＮＡ分子を、０．２ミクロンニトロセルロースフィルターディスクを使用して分離した（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，１９９０；Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ＲＮＡ／ｇｐ１２０ ＢａＬ複合体は、ニトロセルロース膜上に保持される一方で、非結合ＲＮＡは通過すると予想された。７Ｍ尿素、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡへの膜の浸漬および９０℃で５分間の加熱によってＲＮＡをニトロセルロース膜から溶離した。溶離プロセスを２回繰り返し、その後溶離物ＲＮＡのフェノールおよびエタノール沈殿を使用して溶離物を抽出した。３’プライマーＹＷ．４２．３０Ｂへのアニーリング後、５０℃で３０分間の逆転写によってＲＮＡを増幅し（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ^ＴＭＲＴ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、プライマーＹＷ．４２．３０ＢおよびＹＷ．４２．３０Ａを使用した標準的条件下（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＰＣＲを行って、第２の選択ラウンド用の対応するＤＮＡテンプレートを得た。ニトロセルロースに結合した分子を除去するためにｇｐ１２０とのインキュベーション前にプールしたＲＮＡをニトロセルロースフィルターを通過させること以外は、類似の手順を使用してその後の選択ラウンドを行った。８選択ラウンド後５’−^３２Ｐ標識ＲＮＡプールを使用した標準的なニトロセルロースフィルター結合アッセイ（図５）におけるナイーブプールと比較した場合、ｇｐ１２０ ＢａＬ特異的結合を検出可能である。結合範囲は狭いが、この初期工程の目的は、最も高い親和性アプタマーを作製するために選択を駆動することではなく、ｇｐ１２０ ＢａＬ結合のためにナイーブプールを富化することができることを証明したにすぎない。

（ＣＣＲ５へのｇｐ１２０結合を促進する抗ｇｐ１２０アプタマーの活性ベースの選択）
一旦ｓｐ１２０ＢａＬ結合のナイーブプールが首尾よく富化されると、アゴニスト（または活性）ベースの選択ストラテジー（アゴニストＳＥＬＥＸ）を行った。ＣＣＲ５ペプチドのみに結合することができるＲＮＡ分子を除去するために、４×１０^１４〜４×１０^１５個のナイーブＲＮＡプール分子の、１００μｌ結合反応物を含む選択緩衝液を含むニュートラビジンコーティング９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に固定した配列：

（配列番号２２６）（Ｃｏｒｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）（ＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）によって合成および精製した）のビオチン化スルホチロシン−ＣＣＲ５ペプチドでの平衡化によって選択を開始した。ペプチドのみでの平衡化後、ＲＮＡ溶液を、固定化ＣＣＲ５ペプチドを含む新鮮なウェルに移した。この第２のウェルに、５０〜１００ｎＭの最終濃度のｇｐ１２０ ＢａＬを添加し、ＲＮＡ／ｇｐ１２０溶液を、固定化ペプチドにて室温で１時間平衡化した。次いで、溶液をウェルから除去し、破棄した。次いで、ウェルを、２００μｌの選択培地で４〜８回洗浄し、洗浄物も破棄した。ペプチド結合ｇｐ１２０／ＲＮＡ複合体を同時に溶離し、６５℃で３０分間ウェルから直接逆転写し（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、その後プライマーＹＷ．４２．３０ＢおよびＹＷ．４２．３０Ａ、ならびにその後の選択ラウンド用の増幅ＤＮＡを転写物を使用した標準的条件下（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＰＣＲを行った。

１３ラウンドの活性ベースの選択後、ｇｐ１２０ ＢａＬに結合する能力についてプールを試験した。首尾よく選択したＲＮＡ分子は、ｇｐ１２０に結合する能力を有するはずである。示されるように（図６）、活性ベースの選択を通過した５’−^３２Ｐ標識ＲＮＡプールのみが中程度の親和性（ニトロセルロースフィルター結合アッセイにおいてＫ_Ｄが約２００ｎＭ）でｇｐ１２０ ＢａＬに結合し、元の非選択ナイーブプールは全く結合しない。さらなるコントロールとして、ＥＬＩＳＡアッセイは、ｇｐ１２０ ＢａＬのみではＣＣＲ５−ペプチドの存在下または非存在下のいずれにおいてもニュートラビジンコーティングプレートに結合せず、フィルター結合アッセイにおいて活性選択プールはニュートラビジンまたはＣＣＲ５−ペプチド／ニュートラビジン複合体のいずれにも結合しないことを示した。これらの結果により、活性選択プールの成分は実際にｇｐ１２０に対するＣＤ４の作用を模倣する能力を有することが示唆される。

活性選択プールがｇｐ１２０に対するＣＤ４の作用を模倣する能力をさらに試験するために、標準的な選択条件下（上記）での５’−^３２Ｐ標識活性選択プール（または負のコントロールとしてのナイーブプール）を使用して、プレート結合試験を行った。この試験は、ＣＣＲ５ペプチド、ｇｐ１２０ ＢａＬもしくはこれらの成分の両方の存在または非存在の関数としてのニュートラビジンコーティングプレートの残存数を測定した。これらの結果（図７）により、標識ＲＮＡのウェル中で結合する能力が活性選択、ＣＣＲ５ペプチド、およびｇｐ１２０ ＢａＬに依存し、それによりｇｐ１２０ ＢａＬに対するＣＤ４の作用を模倣することができるアプタマーが分子プール中で富化されることがさらに示唆される。この同一のアッセイを使用した他の試験では、矛盾する結果が得られ、これはおそらくアッセイの感度の低さによる。結果を明確にするために、実施例４〜７に記載のアッセイなどのさらなるアッセイを実施する。

活性ベースの選択由来のクローンをスクリーニングした。Ｎ４０プール活性のみをベースにした選択由来の２つの優性クローンは、ｇｐ１２０ ＢａＬ特異的結合を有する。これらは、以下である。

配列番号１１〜配列番号２８の配列を、Ｎ４０プールを使用した抗ｇｐ１２０ ＢａＬフィルター結合選択（活性ベースの選択ではない）のＲ８から作製した。

配列番号２９〜配列番号３６の配列を、ＳＳプールを使用した抗ｇｐ１２０ ＢａＬフィルター結合選択（活性ベースの選択ではない）のＲ８から作製した。

配列番号３７〜配列番号６７の配列を、Ｎ４０プールを使用した抗ｇｐ１２０ ＢａＬフィルター結合選択のＲ８から作製し、その後ＣＣＲ５ペプチドを使用した１０ラウンドの活性ベースの選択を含む。

配列番号６８〜配列番号１１５の配列を、Ｎ４０プールのみを使用した活性選択（ＢａＬ結合剤の予備富化は使用しない）のＲ１０から作製した。

配列番号１１６〜配列番号１６１の配列を、Ｎ４０プールのみを使用した活性選択（ＢａＬ結合剤の予備富化は使用しない）のＲ１３から作製した。

配列番号１６２〜配列番号２２５の配列を、ＳＳプールのみを使用した活性選択（ＢａＬ結合剤の予備富化は使用しない）のＲ１０またはＲ１３のいずれかから作製した（プレート８１０配列は１０ラウンドを通過し、プレート８１３配列は１３ラウンドを通過）。

（実施例２：アプタマーの最小化）
ＳＥＬＥＸにより、典型的には、７０〜９０ヌクレオチド長のＲＮＡ分子が得られる。アプタマー長の最小化により、アプタマー候補の化学合成が容易になり、別の非結合構造の排除によってアプタマー−リガンド複合体の親和性を増大させることができる。一旦各アプタマーが元のプールから同定されると、高親和性結合に必要な最小配列エレメントを、以下の２つの並行アプローチによって同定することができる：（１）部分的アルカリ化水分かによる短縮分析、および（２）ドーピング再選択（方法は、Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ ＆ Ｐｏｌｉｓｋｙ，１９９６に概説されている）。

（実施例３：ヌクレアーゼ耐性のためのアプタマー至適化）
核酸は、血清中でエンドヌクレアーゼと５’→３’および３’→５’エキソヌクレアーゼとの組み合わせによって分解される。適切な化学修飾（または本明細書中に開示されているもの）は、各活性を遮断する（Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｃｕｍｍｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｊｅｌｌｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｄｏｕｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。簡単に述べれば、転写反応における選択時の２’−フルオロピリミジンの組み込みおよび２’−Ｏ−メチルプリンの選択後付加によってエンドヌクレアーゼ分解からアプタマーが保護され、３’−３’チミジンキャップでの末端修飾により、エキソヌクレアーゼに対する有意な耐性を得ることができる。

（実施例４：クローン分析およびアプタマー活性アッセイ）
さらなるラウンドによりｇｐ１２０に結合したプールＲＮＡ画分または上で詳述した他の複合体をさらに増加させない時点まで選択が到達した場合、プールしたテンプレートＤＮＡをＴＯＰＯ ＴＡクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してクローン化する。各クローンを配列決定する。以下に概説の技術を使用して、固有のクローンを所望の特性についてスクリーニングする。

選択したアプタマークローンを、ｇｐ１２０に結合する能力に基づいて評価する。単純な結合には、アプタマーがＣＤ４模倣物である必要があるので、これを使用して選択したアプタマークローンのライブラリーを迅速に選別することができる。ｇｐ１２０結合が証明された各クローンを、ｇｐ１２０に対するＣＤ４の生物作用を模倣する能力に基づいてさらなるスクリーニングを行う。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００表面プラズモン検出システムにおいて、ビオチン化ＣＣＲ５ペプチドに対するｇｐ１２０の結合親和性のＣＤ４またはアプタマー誘導性変化を検出するための好感度三成分（ｔｈｒｅｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｔ）光学バイオセンサー結合アッセイを設定する（Ｃｏｒｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）。さらに、ＣＣＲ５発現細胞における^３２Ｐ標識アプタマークローンのｇｐ１２０依存性結合を、共同受容体へのｇｐ１２０結合におけるｓＣＤ４の効果（Ｄｏｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９）ならびにＣＣＲ５特異的モノクローナル抗体３Ａ９（Ｗｕ ｅｔ ａｌ，１９９７）およびｇｐ１２０ ＣＤ４ｉエピトープ特異的抗体１７ｂ（Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）によって結合が特異的に遮断される能力を定量するために使用した実験に機能的に類似するフィルター結合実験でスクリーニングする。ＣＣＲ５発現細胞を、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ，ＰＡ）から入手することができ、可溶性ＣＤ４をＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）から購入し、抗体３Ａ９および１７ｂはＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから無料で利用可能である。

（実施例５：アプタマーのｇｐ１２０への共有結合）
アプタマーをｇｐ１２０に共有結合する場合、有効なワクチン中でのアプタマー活性が増強される。その５’末端にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを使用して抗ｇｐ１２０アプタマーを合成して、第一級アミン部分の末端に約２０〜２００Å（オングストローム）のスペーサーを有するアプタマーが得られる。スペーサーの長さおよび「水のような」性質により、非結合２片系（ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ ２−ｐｉｅｃｅ ｓｙｓｔｅｍ）で認められるものと同一の様式でアプタマーがｇｐ１２０に結合可能である。標準的な変異誘発技術によって、ｇｐ１２０のＮ末端ｎおよびＣ末端ならびに非中和表面中の一連の単一システイン変異を作製する。次いで、Ｐｉｅｒｃｅから利用可能なヘテロ二官能性架橋剤（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート））を使用して、アミン末端化アプタマーをｇｐ１２０上の遊離チオールに共有結合させる。次いで、アプタマー／ｇｐ１２０抱合体を、上記のＣＣＲ５ペプチドまたはＣＣＲ５発現細胞に結合する能力についてスクリーニングする。複数のｇｐ１２０ ＢａＬ変異体およびアプタマースペーサーの長さの試験により、生化学活性に至適な配置が同定される。

（実施例６：アプタマー／ｇｐ１２０免疫原に対する抗体の作製）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイで活性が証明されたアプタマーをｇｐ１２０に共有結合させ、複合体を中和抗体応答を誘導する能力についてアッセイした。免疫原を、最終濃度がそれぞれ５０〜１００μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌのサポニンベースのＱＳ２１アジュバントを使用して処方する（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１ およびＭｃＧａｕｇｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００３）。少なくとも６組の免疫化試験を並行して行うことができる。モルモットに、ｉ）至適化アプタマー／ｇｐ１２０抱合体、ｉｉ）混合配列（非機能的）アプタマー／ｇｐ１２０抱合体、ｉｉｉ）共有結合抱合を含まないアプタマー／ｇｐ１２０複合体、ｉｖ）共有結合抱合を含まない混合配列アプタマー／ｇｐ１２０複合体、ｖ）ｇｐ１２０のみ、またはｖｉ）アジュバントのみのいずれかで免疫化する。したがって、免疫源としてのｇｐ１２０のみと比較したアプタマー、抱合、および核酸の効果を評価する。免疫応答を誘発するために、種々のアプタマー複合体をモルモットに注射する。各試験のために、３匹の動物に０．０５ｍｌ（５０〜１００μｇ）のワクチンを皮下注射する。３週間間隔で２回の追加免疫化を行い、免疫化から１０〜２８日後に動物を交配する。ｇｐ１２０に対する血清抗体を、ｇｐ１２０ ＥＬＩＳＡによって最初に定量する（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。

（実施例７：細胞ベースのＨＩＶ中和アッセイ）
１サイクルＨＩＶ−１感染アッセイにおいて、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ駆動β−ガラクトシダーゼおよび非蛍光蛍光発生基質（５−クロロメチルフルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＭＦＤＧ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））で一過性にトランスフェクトしたＵ８７．ＣＤ４．ＣＣＲ５細胞（ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｄａｔａｂａｓｅから利用可能）（Ｂｊｏｒｎａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７およびＲｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）を使用して中和アッセイを行う。ＨＩＶ感染により、フロレセイン産生によって検出することができるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現をトランス活性化するＴａｔが発現される。各希釈物を三連で試験する。非特異的中和のコントロールとして前免疫血清も試験する。ＨＩＶ−１ ＢａＬ株は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の１サイクル感染性アッセイに利用可能である。２０Ｕのインターロイキン−２を含む５０μｌのＲＰＭＩ完全培地（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）中のウイルス（５０〜１００、５０％組織培養感染用量）を、同体積の連続希釈熱変性血清（５６℃で３５分間）と室温で１０分間予備インキュベートする。次いで、この混合物を、トランスフェクトしたＵ８７．ＣＤ４．ＣＣＲ５細胞と共に９６ウェルの平底プレートにて３７℃で４８時間インキュベートして感染およびβ−ガラクトシダーゼの産生サイクルを１回行う。次いで、蛍光発生基質ＣＭＦＤＧの添加およびＰａｃｋａｒｄ Ｆｕｓｉｏｎ蛍光プレートリーダーにおけるフルオレセイン蛍光の定量によって、β−ガラクトシダーゼ産生を測定することができる。各希釈物を、三連で試験する。非特異的中和のコントロールとして前免疫血清も使用する。

（実施例８：アプタマー安定性評価のためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ）
アプタマーの血清安定性を、記載のようにｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイする（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。簡単に述べれば、２ｎＭの５’−^３２Ｐ末端標識アプタマーをヒト血清中にて３７℃でインキュベートする。特定の時点で８７％ホルムアミドの添加によって反応を停止させ、変性ＰＡＧＥによって変性率を分析する。

（実施例９：結合選択）
１つの実施形態では、ｇｐ１２０特異的結合アプタマーの選択を、スペーサー（例えば、ＰＥＧスペーサー）の末端で結合する（オリゴヌクレオチド）プローブを捕捉するためのＲＮＡプールの連結によって容易にすることができる。プローブ−スペーサーを、ｇｐ１２０に対する公知の遺伝子座特異性を有するモノクローナル抗体に結合させるかまたはｇｐ１２０に直接結合させる。この様式では、ｇｐ１２０の高次構造シフトを誘導することができる低親和性アプタマーをより容易に同定することができる。１つの実施形態では、当該分野で公知のリンカーおよび連結方法による抗体もしくはフラグメント上のグリコシル残基への連結化学によって、プローブ−スペーサーを、ｇｐ１２０特異的結合モノクローナル抗体もしくはそのフラグメントに連結させる。１つの実施形態では、当該分野で公知の前記リンカーおよび連結化学を使用して、プローブ−スペーサーを、ｇｐ１２０上のグリコシル残基への連結によってｇｐ１２０と直接連結させる。

ｇｐ１２０へのプールの前結合により、高親和性結合剤を最初に除去する必要があり、ＣＤ４を模倣することができるが本質的にｇｐ１２０親和性が低いアプタマーを富化することができる。ｇｐ１２０にＲＮＡを結合させるための公知のエピトープのモノクローナル抗体の使用により、その後のワクチン試験におけるアプタマーおよびｇｐ１２０の最終共有結合のためのシステイン変異のどこで操作されるかが指示される。選択されたモノクローナル抗体またはそのＦａｂフラグメントは非中和であり、受容体や共同受容体のいずれの結合も妨害しない。この方法は、活性ベースの選択方法に適合する。

著者によって引用された上記参考文献および発行年を、以下の完全な引用によって示し、それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される。

（参考文献）

本発明を書面による説明および実施例によって説明しているが、当業者は、本発明を種々の実施形態で実施することができ、且つ上記説明および実施例は例示を目的とし、以下の特許請求の範囲を制限しないと認識する。

図１は、ランダム配列オリゴヌクレオチドプール由来のｉｎ ｖｉｔｒｏアダプター選択（ＳＥＬＥＸ^ＴＭ）プロセスを示す図である。 図２は、ＣＣＲ５膜タンパク質へのｇｐ１２０のＣＤ４誘導性結合の際のＨＩＶ細胞感染の略図を示す図である。 図３は、ＣＤ４受容体およびＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４共同受容体（それぞれｇｐ１２０の有意な構造の再整列を伴うようである）とのＨＩＶ結合相互作用の略図である。 図４は、典型的にアプタマーの作製に必要な工程の略図である。 図５は、ニトロセルロース結合アッセイにおけるコントロールと比較した場合にｇｐ１２０ ＢａＬ特異的結合が検出可能であることを示す図である。 図６は、ｇｐ１２０ ＢａＬに対するアプタマーの結合親和性を示すニトロセルロースフィルター結合アッセイ由来の結果を示す図である。 図７は、標準的な選択条件下での５’−^３２Ｐ標識活性選択プール（または負のコントロールとしてナイーブプール）を使用したプレート結合アッセイ実験の結果を示す図である。プロットは、ＣＣＲ５ペプチド、ｇｐ１２０ ＢａＬ、その両方の存在、または非存在の関数としてのニュートラアビジンコーティングプレートの残存数を示す。 図８は、標的パートナー（例えば、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４）または標的パートナーアナログ（例えば、ｇｐ１２０上のＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４結合部位を認識する抗体）との特異的相互作用（例えば、結合）を容易にするための標的（例えば、ｇｐ１２０）の高次構造変化を誘導するアゴニスト（例えば、ｇｐ１２０特異的アプタマー）の略図である。 図９は、アゴニストＳＥＬＥＸ^ＴＭストラテジーの略図である。このストラテジーでは、標的に対するアゴニスト非依存親和性を有する標的パートナー（または「ＴＰ」）または標的パートナーアナログ（または「ＴＰＡ」）を使用して、ＴＰ（またはＴＰＡ）−標的複合体と特異的に相互作用することができる種について種々の分子ライブラリーをスクリーニングする。アゴニスト種を、（１）ＴＰ／Ａへの結合に対する選択、（２）固定化ＴＰ／Ａ−標的複合体上で特異的に保持される分子の選択、および（３）公知の高親和性アゴニストによるＴＰ／Ａ−標的複合体から特異的に放出された分子の選択によって特異的に富化することができる。 図１０は、第２のアゴニストＳＥＬＥＸ^ＴＭストラテジーの略図である。このストラテジーでは、標的パートナーまたは標的パートナーアナログを使用して、アゴニスト結合が標的−ＴＰＡ／Ａ複合体形成に必要なような実験条件下で（例えば、温度、変性剤、塩濃度、標的濃度、またはＴＰ／Ａ濃度）ＴＰ（またはＴＰＡ）−標的複合体の形成を特異的に促進することができる種について種々の分子ライブラリーをスクリーニングする。アゴニスト種を、（１）ＴＰ／Ａへの結合に対する選択、（２）標的を固定化ＴＰ（またはＴＰＡ）に添加した場合のみに特異的に保持される分子の選択よって特異的に富化することができる。 図１１は、ｇｐ１２０アゴニスト、ｇｐｇｐ１２０１２０、または変異型（例えば、ΔＣ１ΔＣ５、ループ短縮など）；ＣＫＲＡ：ケモカイン受容体または機能的アナログ（例えば、中和抗体１７ｂ、界面活性剤溶解ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４またはその機能的アナログのＣＤ４溶解性フラグメント（例えば、中和抗体ｂ１２））；（−）負の選択工程；（＋）正の選択工程；（ ）：成分が任意に選択されることを示す略図である。 図１２は、選択プールの多様性を示す略図である。

Claims (41)

1. ｇｐ１２０およびｇｐ１２０と結合してｇｐ１２０の高次構造のシフトを誘導し、それにより体液性免疫応答を誘発することができる、膜結合受容体に対するエピトープが曝露される核酸アプタマーを含む組成物。
2. 前記膜結合受容体に対するエピトープがＣＣＲ５に対するエピトープである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記膜結合受容体に対するエピトープがＣＸＣＲ４に対するエピトープである、請求項１に記載の組成物。
4. 前記核酸アプタマーが、配列番号９〜配列番号２２５から選択される、請求項１、請求項２、または請求項３に記載の組成物。
5. ｇｐ１２０およびｇｐ１２０と結合してｇｐ１２０の高次構造のシフトを誘導し、それにより体液性免疫応答を誘発することができる、膜結合受容体に対するエピトープが曝露される核酸アプタマーを含む組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体へのＨＩＶ感染症ワクチンの接種方法。
6. 前記膜結合受容体に対するエピトープがＣＣＲ５に対するエピトープである、請求項５に記載の方法。
7. 前記膜結合受容体に対するエピトープがＣＸＣＲ４に対するエピトープである、請求項５に記載の方法。
8. 前記核酸アプタマーが、配列番号９〜配列番号２２５から選択される、請求項５、請求項６、または請求項７に記載の方法。
9. ｇｐ１２０およびｇｐ１２０と結合してｇｐ１２０の高次構造の変化を誘導し、それにより体液性免疫応答を誘発することができる、膜結合受容体に対するエピトープが曝露される核酸アプタマーを含む組成物を投与する工程を含む、ｇｐ１２０に特異的な中和抗体の産生方法。
10. 前記膜結合受容体に対するエピトープがＣＣＲ５に対するエピトープである、請求項９に記載の方法。
11. 前記膜結合受容体に対するエピトープがＣＸＣＲ４に対するエピトープである、請求項９に記載の方法。
12. 前記核酸アプタマーが、配列番号９〜配列番号２２５から選択される、請求項９、請求項１０、または請求項１１に記載の方法。
13. 前記中和抗体が産生される、請求項９に記載の方法。
14. ｇｐ１２０およびｇｐ１２０と結合してｇｐ１２０の高次構造の変化を誘導し、それにより体液性免疫応答を誘発することができる、膜結合受容体に対するエピトープが曝露される核酸アプタマーを含む組成物を投与する工程を含む、ＨＩＶ感染症の処置方法。
15. 前記膜結合受容体に対するエピトープがＣＣＲ５に対するエピトープである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記膜結合受容体に対するエピトープがＣＸＣＲ４に対するエピトープである、請求項１４に記載の方法。
17. 前記核酸アプタマーが、配列番号９〜配列番号２２５から選択される、請求項１４、請求項１５、または請求項１６に記載の方法。
18. 配列番号９〜配列番号２２５から選択されるｇｐ１２０に結合するアプタマー。
19. 配列番号９〜配列番号２２５から選択されるｇｐ１２０に結合するアプタマーを含む組成物。
20. 前記アプタマーが配列番号９〜配列番号２２５から選択される、ｇｐ１２０と複合体化したｇｐ１２０に結合するアプタマー。
21. 治療有効量の配列番号９〜配列番号２２５から選択されるｇｐ１２０に結合するアプタマーを投与する工程を含む、被験体におけるＨＩＶ感染症の処置方法。
22. ｇｐ１２０と複合体化したｇｐ１２０に結合する治療有効量のアプタマーを投与する工程であって、前記アプタマーが配列番号９〜配列番号２２５から選択される工程を含む、被験体におけるＨＩＶ感染症の処置方法。
23. ｇｐ１２０と複合体化したｇｐ１２０に結合する予防有効量のアプタマーを投与する工程であって、該アプタマーが配列番号９〜配列番号２２５から選択される工程を含む、被験体におけるＨＩＶ感染症の予防方法。
24. ｇｐ１２０と複合体化したｇｐ１２０に結合するアプタマーを投与する工程であって、該アプタマーが配列番号９〜配列番号２２５から選択される工程を含む、ＨＩＶ ｇｐ１２０に対する特異性を有する中和抗体の産生方法。
25. ｇｐ１２０と複合体化したｇｐ１２０に結合するアプタマーを投与する工程であって、該アプタマーが配列番号９〜配列番号２２５から選択される工程を含む、ｇｐ１２０に特異的な中和抗体が得られる、被験体の体液性免疫応答を誘発する方法。
26. 以下：
    （ａ）第１級アミン部分で終わる約２０Åから約２００Åまでのスペーサーを含むアプタマーを合成する工程；
    （ｂ）ｇｐ１２０のＮ末端、Ｃ末端、および／または非中和表面中のシステイン変異上に単一の遊離チオールを生成する工程；
    （ｃ）架橋剤を使用して該アプタマーをｇｐ１２０上の該遊離チオールと共有結合させる工程；ならびに
    （ｄ）ｇｐ１２０エピトープへの結合についてアプタマーをスクリーニングする工程
    を含む、ｇｐ１２０と結合してｇｐ１２０の高次構造の変化を誘導し、それにより体液性免疫応答を誘発することができるエピトープが膜結合受容体に曝露されるアプタマーの同定方法。
27. 以下：
    （ａ）第１級アミン部分で終わる約２０Åから約２００Åまでのスペーサーを含むアプタマーを合成する工程；
    （ｂ）ｇｐ１２０に結合する抗体または抗体フラグメント中のシステイン変異上に単一の遊離チオールを生成する工程；
    （ｃ）架橋剤を使用して該アプタマーを該抗体または抗体フラグメント上の該遊離チオールと共有結合させる工程；ならびに
    （ｄ）ｇｐ１２０エピトープへの結合についてアプタマーをスクリーニングする工程
    を含む、ｇｐ１２０と結合して前記ｇｐ１２０の高次構造の変化を誘導し、それにより体液性免疫応答を誘発することができるエピトープが膜結合受容体に曝露されるアプタマーの同定方法。
28. 前記スペーサーがポリエチレングリコールである、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
29. 前記架橋剤がヘテロ二官能性架橋剤である、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
30. 前記ヘテロ二官能性架橋剤が、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシニミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート）である、請求項２９に記載の方法。
31. 前記ｇｐ１２０エピトープが、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４から選択される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記スクリーニングをｇｐ１２０ ＢａＬ変異体を使用して行い、該スクリーニングをＣＣＲ５ペプチドまたは全長ＣＣＲ５受容体を使用して行う、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
33. 第２のリガンドを認識する第２の結合ドメインに結合した第１のリガンドを認識する第１の結合ドメインを含むアプタマーにおいて、該第２の結合ドメインによる第２のリガンドの結合が、該第１の結合ドメインによる該第１のリガンドの結合によって調節される、アプタマー。
34. 前記第１のリガンド結合ドメインがアロステリックエフェクター分子と特異的に相互作用し、前記第２のリガンド結合ドメインが該アロステリックエフェクター分子の標的と特異的に相互作用する、請求項３３に記載のアプタマー。
35. 前記アロステリックエフェクター分子が、ｇｐ１２０であり、前記標的がＣＣＲ５受容体である、請求項３４に記載のアプタマー。
36. 前記第２の結合ドメインによる前記第２のリガンドの結合が、前記第１の結合ドメインによる前記第１のリガンドの結合によって活性化される、請求項３３に記載のアプタマー。
37. 前記第２の結合ドメインによる前記第２のリガンドの結合が、前記第１の結合ドメインによる前記第１のリガンドの結合によって活性化される、請求項３４に記載のアプタマー。
38. 前記第２の結合ドメインによる前記第２のリガンドの結合が、前記第１の結合ドメインによる前記第１のリガンドの結合によって抑制される、請求項３３に記載のアプタマー。
39. 前記第２の結合ドメインによる前記第２のリガンドの結合が、前記第１の結合ドメインによる前記第１のリガンドの結合によって抑制される、請求項３４に記載のアプタマー。
40. ＳＥＬＥＸを使用して、それぞれ第１および第２のリガンドに結合する第１および第２のアプタマーを単離する工程、該第１および第２のアプタマーの結合ドメインを含む分子の種々の配列プールを操作する工程、ならびに該プールから調節されたアプタマーを選択する工程であって、該第２の結合ドメインによる第２のリガンドの結合が該第１の結合ドメインによる第１のリガンドの結合によって調節される工程を含む、調節されたアプタマーを選択する方法。
41. 治療有効量のＣＣＲ５受容体アプタマーを投与する工程であって、該ＣＣＲ５受容体アプタマーがｇｐ１２０エフェクターに結合し、該ｇｐ１２０エフェクターによって活性化されて該ＣＣＲ５受容体に結合する工程と、細胞へのｇｐ１２０の結合を防止する工程を含む、被験体におけるＨＩＶの処置方法。

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