JP6385185B2 - 標的ペプチドの種類の判定装置、判定プログラムおよび判定方法 - Google Patents

標的ペプチドの種類の判定装置、判定プログラムおよび判定方法 Download PDF

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Description

本発明は、標的ペプチドの種類の判定装置、プログラムおよび標的ペプチドの種類の判定方法に関する。
ペプチドの同定方法としては、例えば、質量分析法を利用する方法などがある（特許文献１参照）。
特許文献１に記載の方法は、以下のように行なわれる。まず、標的ペプチドなどの測定対象物質および他の物質を含有する試料と、他の物質よりも測定対象物質をイオン化させやすいマトリックスとを混合する。つぎに、得られた混合物にレーザ光を照射して測定対象物質を特異的にイオン化させる。その後、イオン化された測定対象物質のマススペクトルを得る。
米国特許出願公開第２００６／０２４３８９９号明細書
しかし、より簡便にペプチドの種類を判定することが望まれている。
本発明は、前記従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、例えば、質量分析計のように操作が複雑な装置などを用いなくても、簡便にペプチドの種類を判定することができる装置、プログラムおよび方法を提供することにある。
すなわち、本発明は、被検試料に含まれる標的ペプチドの第１〜第３情報を取得する取得部と、既知のペプチドを含む標準試料を用いて取得された当該既知ペプチドの第１〜第３情報を予め記憶する記憶部と、取得部において取得された標的ペプチドの第１〜第３情報と、予め記憶部に記憶された既知ペプチドの第１〜第３情報とを比較し、標的ペプチドが既知ペプチドであるか否かを判定する制御部と、を備え、第１情報が、ペプチドと結合するタンパク質を介して標的ペプチドが支持体に固定化された固相担体において、タンパク質から標的ペプチドが解離する際の解離速度定数であり、第２情報が、支持体上の層厚の変化量の最大値であり、かつ、第３情報が、ペプチドとタンパク質との解離様式が、ペプチドとタンパク質との解離方法が実質的に１種類の態様である単調様式およびペプチドとタンパク質との解離方法が複数種類の態様である複相様式のいずれであるかについての情報である、標的ペプチドの種類の判定装置を提供する。
また、本発明は、標的ペプチドの種類を判定するためにコンピュータを、被検試料に含まれる標的ペプチドの第１〜第３情報を取得する取得手段、既知ペプチドを含む標準試料を用いて取得された当該既知ペプチドの第１〜第３情報を予め記憶する記憶手段、および取得部において取得された標的ペプチドの第１〜第３情報と、予め記憶部に記憶された既知ペプチドの第１〜第３情報とを比較し、標的ペプチドが既知ペプチドであるか否かを判定する制御手段として機能させ、第１情報が、ペプチドと結合するタンパク質を介して標的ペプチドが支持体に固定化された固相担体において、タンパク質から標的ペプチドが解離する際の解離速度定数であり、第２情報が、支持体上の層厚の変化量の最大値であり、かつ、第３情報が、ペプチドとタンパク質との解離様式が、ペプチドとタンパク質との解離方法が実質的に１種類の態様である単調様式およびペプチドとタンパク質との解離方法が複数種類の態様である複相様式のいずれであるかについての情報である、標的ペプチドの種類判定プログラムを提供する。
さらに、本発明は、（ａ）ペプチドと結合するタンパク質が支持体に固定化されたタンパク質固定化担体に、前記標的ペプチドを含む被検試料を接触させることにより、前記標的ペプチドと前記タンパク質との複合体を前記支持体上に形成させた固相担体を調製する工程、
（ｂ）前記タンパク質に標的ペプチドが結合する際の前記タンパク質固定化担体の支持体上の層厚の変化、前記タンパク質から標的ペプチドが解離する際の前記固相担体の支持体上の層厚の変化またはこれらの両方を測定することにより、支持体上の層厚の変化量の最大値を取得する工程、
（ｃ）前記固相担体の支持体上の層厚の変化を測定することにより、前記タンパク質から前記標的ペプチドが解離する際の標的ペプチドの解離速度定数を取得する工程、
（ｄ）前記標的ペプチドと前記タンパク質との解離様式が、ペプチドとタンパク質との解離方法が実質的に１種類の態様である単調様式およびペプチドとタンパク質との解離方法が複数種類の態様である複相様式のいずれであるかを判別する工程、
（ｅ）前記標的ペプチドの解離速度定数、前記層厚の変化量の最大値および前記解離様式と、既知ペプチドを用いて予め前記標的ペプチドと同様に測定して得られた解離速度定数、層厚変化量の最大値および解離様式とを比較する工程、および
（ｆ）前記工程（ｅ）で比較結果に基づいて前記標的ペプチドが前記既知ペプチドであるか否かを判定する工程
を含む、標的ペプチドの種類の判定方法を提供する。
本発明によれば、例えば、質量分析計のように操作が複雑な装置などを用いなくても、簡便にペプチドの種類を判定することができる装置、プログラムおよび方法を提供することができる。
標的ペプチドの種類の判定装置の機能ブロック図である。 図１に示される判定装置のハードウェア構成図である。 標的ペプチドの種類の判定の一例を示すフローチャートである。 実施例１で得られたセンサグラムである。 実施例１で得られたセンサグラムである。 実施例１で得られた１種類の既知ペプチドのペプチドマップである。 実施例１で得られた複数種類の既知ペプチドのペプチドマップである。 実施例１で得られた判定結果を示す説明図である。 比較例１で得られた判定結果を示す説明図である。 （Ａ）は基板上に全血を固定化した時点からの支持体上の層厚の変化を示すセンサグラム、（Ｂ）は実施例４で得られたペプチドマップである。 （Ａ）は基板上にヒトγグロブリンを固定化した時点からの支持体上の層厚の変化を示すセンサグラム、（Ｂ）は実施例５で得られたペプチドマップである。 （Ａ）は基板上にトランスサイレチンを固定化した時点からの支持体上の層厚の変化を示すセンサグラム、（Ｂ）は実施例６で得られたペプチドマップである。 （Ａ）は基板上にＢＳＡを固定化した時点からの支持体上の層厚の変化を示すセンサグラム、（Ｂ）は実施例７で得られたペプチドマップである。 （Ａ）は基板上に熱変性ＢＳＡを固定化した時点からの支持体上の層厚の変化を示すセンサグラム、（Ｂ）は実施例８で得られたペプチドマップである。
１．用語の定義
本明細書において、「Ｘ以上」は、Ｘの値と、Ｘよりも大きい値とを含むことを意味する。また、「Ｙ以下」は、Ｙの値と、Ｙよりも小さい値とを含むことを意味する。さらに、「Ｘ〜Ｙ」のように、端点による数値範囲の記載は、各範囲内に含まれるすべての数および有理数ならびに記載されている端点を含む。
本明細書において、「層」とは、支持体の表面上に形成されたタンパク質などの層をいう。支持体の表面上において、タンパク質などの層は、通常、膜状になっていると考えられる。当該技術分野では、この層の厚さを、「膜厚」または「層厚」という。この層の厚さは、後述の反射干渉分光法などの光学的方法で測定することができる。この場合、層の厚さは、「光学的厚さ」または「光学的深さ」とも呼ばれる。
本明細書において、「ペプチド」は、特に明記しない限り、標的ペプチドと、標的ペプチド以外のペプチドとを包含する。ここでは、「ペプチド」は、２〜１２９個のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物をいう。「タンパク質」は、１３０個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物をいう。本実施形態で用いられる「ペプチド」および「タンパク質」のいずれも、天然起源の物質であってもよいし、人工的に合成された物質であってもよい。
２．標的ペプチドの種類の判定方法
本実施形態に係る標的ペプチドの種類の判定方法は、
（ａ）ペプチドと結合するタンパク質が支持体に固定化されたタンパク質固定化担体に、標的ペプチドを含む被検試料を接触させることにより、標的ペプチドとタンパク質との複合体を支持体上に形成させた固相担体を調製する工程、
（ｂ）タンパク質に標的ペプチドが結合する際のタンパク質固定化担体の支持体上の層厚の変化、タンパク質から標的ペプチドが解離する際の固相担体の支持体上の層厚の変化またはこれらの両方を測定することにより、支持体上の層厚の変化量の最大値を取得する工程、
（ｃ）固相担体の支持体上の層厚の変化を測定することにより、タンパク質から標的ペプチドが解離する際の標的ペプチドの解離速度定数を取得する工程、
（ｄ）標的ペプチドとタンパク質との解離様式が単調様式および複相様式のいずれであるかを判別する工程、
（ｅ）標的ペプチドの解離速度定数、層厚の変化量の最大値および解離様式と、既知ペプチドを用いて予め標的ペプチドと同様に測定して得られた解離速度定数、層厚変化量の最大値および解離様式とを比較する工程、および
（ｆ）工程（ｅ）で比較結果に基づいて標的ペプチドが既知ペプチドであるか否かを判定する工程
を含むことを特徴としている（以下、「本実施形態に係る方法」という）。
本実施形態に係る方法では、ペプチドが、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）について、ペプチドの種類に応じた固有の特徴を有していることに基づき、標的ペプチドの種類を判定する。
（Ｉ）固相担体において、タンパク質からペプチドが解離する際の解離速度定数、
（ＩＩ）タンパク質とペプチドとの結合または解離の際の支持体上の層厚の変化量の最大値、および
（ＩＩＩ）ペプチドとタンパク質との解離様式が単調様式および複相様式のいずれであるか。
本実施形態に係る方法では、まず、工程（ａ）において、固相担体を調製する。工程（ａ）では、タンパク質固定化担体の支持体に固定化されたタンパク質に、標的ペプチドを含む被検試料を接触させることにより、標的ペプチドとタンパク質との複合体を形成させる。これにより、タンパク質固定化担体の支持体上に複合体層を形成させる。
固相担体は、ペプチドと結合するタンパク質と、支持体と、標的ペプチドとを備えている。固相担体においては、標的ペプチドは、タンパク質を介して支持体上に固定化されている。
タンパク質固定化担体は、ペプチドと結合するタンパク質と支持体とを備えている。タンパク質固定化担体においては、ペプチドと結合するタンパク質が、直接的にまたは接着剤を介して間接的に、支持体に固定化されている。タンパク質固定化担体においては、タンパク質は、支持体の表面の全面に固定化されていてもよく、後述の層厚の測定に必要な程度に支持体表面の一部分に固定化されていてもよい。支持体の表面上において、タンパク質は、層状になっている。
支持体は、ペプチドと結合するタンパク質を固定化し得る支持体であればよい。したがって、タンパク質を直接支持体に固定化する場合、支持体としては、例えば、当該タンパク質が吸着または結合する物質もしくは材料からなる支持体、当該タンパク質が吸着または結合する物質もしくは材料で基体の表面を修飾して得られた支持体などが挙げられるが、特に限定されない。タンパク質が吸着または結合する物質もしくは材料としては、例えば、窒化シリコン、氷、ニッケル、金、アミノ酸化合物、ポリエーテル系高分子化合物、カルボキシメチルセルロース、エチレングリコール化合物、ジゴキシゲニン、ビタミン誘導体、抗体、アビジンなどが挙げられるが、特に限定されない。支持体の材料としては、例えば、シリカ、シリコン、石英などのケイ素化合物；シリコーン樹脂、ポリスチレン、アクリル樹脂、石英、アルミニウム、金、カーボンなどが挙げられるが、特に限定されない。タンパク質が吸着または結合する材料による基体の表面の修飾は、例えば、化学気相蒸着法などによって行なうことができる。一方、接着剤を介してタンパク質を間接的に支持体に固定化する場合、支持体の材料としては、基体の材料と同様の材料が挙げられるが、特に限定されない。接着剤としては、例えば、分子接着剤（ＢＤバイオサイエンシーズ社製、商品名：セルタック）などが挙げられるが、特に限定されない。支持体の形状は、タンパク質を固定化できる表面を有していればよい。支持体の形状としては、例えば、板状、粒子状などが挙げられるが、特に限定されない。また、支持体の大きさは、第１情報、第２情報および第３情報の測定に適した大きさであればよい。
支持体の具体例としては、窒化シリコン基板、ニッケルビーズ、金粒子、コアセルベート、アミノ酸化合物修飾基板、ポリエーテル系高分子化合物膜、カルボキシメチルセルロース基板、エチレングリコール系自己組織化単分子膜、ジゴキシゲニン固定化基板、ビタミン誘導体固定化ビーズ、ラングミュア−ブロジェット（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）膜、抗体固定化基板、アビジン固定化ビーズなどが挙げられるが、特に限定されない。
ペプチドと結合するタンパク質としては、血液などの体液中に存在するタンパク質、酵素、レセプター、主要組織適合遺伝子複合体、生体膜輸送体、ペプチドと結合するタンパク質で構成されたアプタマーなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのなかでは、好ましくは血液などの体液中に存在するタンパク質、より好ましくは血液中に存在するタンパク質である。ペプチドと結合するタンパク質の具体例としては、アルブミン、トランスサイレチン、グロブリンなどが挙げられるが、特に限定されない。なお、ペプチドと、当該ペプチドと結合するタンパク質との結合様式としては、水素結合、ファンデルワールス力による結合、疎水結合、イオン結合、配位結合などが挙げられるが、特に限定されない。
支持体の表面面積１ｍｍ2あたりのペプチドと結合するタンパク質の固定量は、本実施形態に係る方法の用途、当該タンパク質の種類などに応じて適宜決定することができる。通常、支持体の表面面積１ｍｍ2あたりのペプチドと結合するタンパク質の固定量は、後述の工程（ｂ）において、支持体上の層厚の変化を良好に測定する観点から、好ましくは０．０２ｎｇ以上、２ｎｇ以下である。支持体の表面面積１ｍｍ2あたりのペプチドと結合するタンパク質の固定量は、測定の利便性を確保する観点から、より好ましくは０．０５ｎｇ以上、さらに好ましくは０．１ｎｇ以上であり、より好ましくは１ｎｇ以下、さらに好ましくは０．５ｎｇ以下である。
ペプチドと結合するタンパク質を直接支持体に固定化する場合、支持体へのタンパク質の固定は、タンパク質を含む溶液と支持体との接触、例えば、タンパク質を含む溶液を支持体の表面に塗布すること、タンパク質を含む溶液中に支持体を浸漬させること、支持体の表面上にタンパク質を含む溶液を流すことなどによって行なうことができる。また、ペプチドと結合するタンパク質を、接着剤を介して間接的に支持体に固定化する場合、支持体へのタンパク質の固定は、例えば、支持体の表面に接着剤を付着させた後、支持体上の接着剤にタンパク質を付着させること；タンパク質に接着剤を付着させた後、支持体の表面に接着剤を介してタンパク質を付着させることなどによって行なうことができる。
被検試料としては、例えば、標的ペプチドを含む可能性がある試料；血液、唾液などの体液；尿などの生体に由来する試料（生体試料）；ペプチド医薬品；ペプチドを含有する化粧料；ペプチドを含有する食品；ペプチドを含有する工業用接着剤；ペプチドを含有するカラムクロマトグラフィー用充填剤；ペプチドを含有するバイオマス燃料などが挙げられるが、特に限定されない。標的ペプチドは、天然に存在するペプチドであってもよく、合成されたペプチドであってもよい。標的ペプチドとしては、例えば、オリゴペプチド；ポリペプチド；環状ペプチド、ペプチドミミックなどのペプチド化合物などが挙げられるが、特に限定されない。標的ペプチドは、ペプチド医薬に用いられるペプチドまたはペプチド化合物であってもよい。被検試料は、標的ペプチドを溶解させるための溶媒を含んでいてもよい。溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液などの緩衝液、精製水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられるが、特に限定されるものではない。被検試料が水系溶媒（例えば、精製水、緩衝液など）を含む場合、被検試料のｐＨは、標的ペプチドの生理的機能を維持し得るｐＨであることが好ましい。被検試料には、必要に応じ、標的ペプチドの安定化剤などを含有していてもよい。
タンパク質固定化担体と被検試料との接触は、例えば、層厚の変化の測定に用いられる測定装置を用いて行なうことができる。タンパク質固定化担体と被検試料との接触は、例えば、タンパク質固定化担体におけるタンパク質が固定された表面に被検試料を含む液体を一定流速で供給すること、タンパク質固定化担体におけるタンパク質が固定された表面に被検試料を含む液体を滴下すること、被検試料を含む液体にタンパク質固定化担体を浸漬させること、タンパク質固定化担体におけるタンパク質が固定された表面に被検試料を含む液体をスピンコートすること、電解吸着、電気浸透、イオン化スプレー、打錠作業などによって行なうことができる。タンパク質固定化担体に接触させる被検試料の量は、被検試料の種類などに応じて適宜決定することができる。タンパク質固定化担体と被検試料とを接触させるときの温度は、ペプチドと結合するタンパク質と標的ペプチドとが結合する温度の範囲から、標的ペプチドの種類、ペプチドに結合するタンパク質の種類、本実施形態に係る方法の用途などに応じて適宜決定することができる。タンパク質固定化担体と被検試料との接触時間は、標的ペプチドの種類、ペプチドに結合するタンパク質の種類、本実施形態に係る方法の用途などに応じて適宜決定することができる。
本実施形態に係る方法では、工程（ｂ）において、タンパク質に標的ペプチドが結合する際のタンパク質固定化担体の支持体上の層厚の変化、タンパク質から標的ペプチドが解離する際の固相担体の支持体上の層厚の変化またはこれらの両方を測定することにより、支持体上の層厚の変化量の最大値を取得する。工程（ｂ）により、後述の第２情報である層厚の変化量の最大値を得ることができる。
層厚の変化量の最大値は、タンパク質固定化担体の支持体上の層厚（タンパク質にペプチドが結合する前の層厚）と固相担体の支持体上の層厚（タンパク質にペプチドが結合した後の層厚）との差が最大になるときの値である。すなわち、層厚の変化量の最大値とは、実質的にタンパク質のみが支持体に固定化されているときの支持体上のタンパク質層の光学的厚さと、ペプチドとタンパク質との複合体が支持体上に形成されているときの支持体上の複合体層の光学的厚さとの差である。タンパク質層の光学的厚さは、ペプチドとタンパク質との接触前の光学的厚さであってもよく、ペプチドとタンパク質との接触後にペプチドが実質的に全て解離した後の光学的厚さであってもよい。本明細書において、「層厚の変化量の最大値」の概念には、タンパク質固定化担体のタンパク質に標的ペプチドが結合する際の層厚の変化量の最大値および固相担体のタンパク質から標的ペプチドが解離する際の層厚の変化量の最大値の両方の概念が含まれる。
層厚の変化の測定は、例えば、反射干渉分光法などで行なうことができる。本実施形態に係る方法では、層厚の変化を簡便に測定することができる観点から、反射干渉分光法が好ましい。
反射干渉分光法は、層における白色光干渉に基づく分光法である。層の厚さに変化が生じた場合、層に照射された光の反射光に位相のズレに伴う白色光干渉が生じる。このとき、白色光干渉により、反射光の分光反射率曲線のボトム波長がシフトする。本実施形態の方法では、層厚の変化の指標として、反射光の分光反射率曲線のボトム波長の波長変化量Δλを継時的に測定することにより、支持体上の層厚の変化を測定することができる。波長変化量Δλの測定には、例えば、層厚変位・分子間相互作用測定装置〔コニカミノルタ（株）製、商品名：ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）〕などを用いることができる。本明細書において、波長変化量Δλには、タンパク質に標的ペプチドが結合する際の波長変化量、タンパク質から標的ペプチドが解離する際の波長変化量およびこれらの両方が包含される。波長変化量Δλの測定は、工程（ａ）における被検試料とタンパク質固定化担体との接触の際（例えば、接触開始時から接触終了時までの間など）、工程（ａ）における被検試料とタンパク質固定化担体との接触終了後、またはこれらの両方で行なわれる。工程（ａ）における被検試料とタンパク質固定化担体との接触の際に波長変化量Δλの測定を行なう場合、波長変化量Δλの測定温度および測定時間は、被検試料とタンパク質固定化担体との接触の際の温度および接触時間と同様である。工程（ａ）における被検試料とタンパク質固定化担体との接触終了後に波長変化量Δλの測定を行なう場合、波長変化量Δλの測定温度および測定時間は、標的ペプチドの種類、ペプチドに結合するタンパク質の種類、本実施形態に係る方法の用途などに応じて適宜決定することができる。
層厚の変化の測定を、層厚変位・分子間相互作用測定装置〔コニカミノルタ（株）製、商品名：ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）〕を用い、タンパク質に標的ペプチドが結合する際に行なう場合、例えば、以下の手順によって行なうことができる。まず、支持体と、フローセルとを、層厚変位・分子間相互作用測定装置にセットする。つぎに、支持体とフローセルとの間に形成された流路に、ランニングバッファを流して支持体の表面の平衡化を行なう。その後、流路に、ペプチドと結合するタンパク質を含む溶液を一定の流速で注入し、タンパク質を支持体の表面に吸着させる。これにより、タンパク質が支持体に固定化されたタンパク質固定化担体を得ることができる。つぎに、支持体の表面へのタンパク質の吸着後所定時間経過時に、被検試料を流路に一定の流速で注入する。流路へのタンパク質を含む溶液の注入および被検試料の注入を行なう際に、流路に白色光を照射したときの反射光の分光反射率曲線のボトム波長の波長変化量Δλを経時的に測定する。これにより、波長変化量Δλの経時的変化を示すセンサグラムを得ることができる。なお、層厚の変化の測定は、タンパク質固定化担体の作製時からはじめなくてもよく、例えば、予め作製されたタンパク質固定化担体に被検試料を接触させる時点からはじめてもよい。
一方、層厚の変化の測定を、層厚変位・分子間相互作用測定装置〔コニカミノルタ（株）製、商品名：ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）〕を用い、タンパク質に標的ペプチドが解離する際に行なう場合、例えば、以下の手順によって行なうことができる。まず、支持体と、フローセルとを、層厚変位・分子間相互作用測定装置にセットする。つぎに、支持体とフローセルとの間に形成された流路に、ランニングバッファを流して支持体の表面の平衡化を行なう。その後、流路に、ペプチドと結合するタンパク質を含む溶液を一定の流速で注入し、タンパク質を支持体の表面に吸着させる。これにより、タンパク質が支持体に固定化されたタンパク質固定化担体を得ることができる。つぎに、支持体の表面へのタンパク質の吸着後所定時間経過時に、被検試料を流路に一定の流速で注入する。被検試料の注入後で、かつタンパク質へのペプチドの結合後に、流路に白色光を照射したときの反射光の分光反射率曲線のボトム波長の波長変化量Δλを経時的に測定する。これにより、波長変化量Δλの経時的変化を示すセンサグラムを得ることができる。
本実施形態に係る方法では、工程（ｃ）において、固相担体の支持体上の層厚の変化を測定することにより、タンパク質から標的ペプチドが解離する際の標的ペプチドの解離速度定数を取得する。工程（ｃ）により、後述の第１情報である解離速度定数を得ることができる。
解離速度定数は、例えば、ペプチドとタンパク質固定化担体との接触により、波長変化量（すなわち、支持体上の層厚の変化量）が最大値になる時点から、最小値になる時点までの間の層厚の変化量の経時的変化などに基づいて算出することができるが、特に限定されない。解離速度定数は、例えば、以下の手順により算出することができる。まず、ペプチドの解離開始時点から解離終了時点までの間の層厚の変化量（波長変化量）Δλの経時的変化を示すセンサグラムを作成する。つぎに、得られたセンサグラムについて、統計解析／グラフ作成ソフトウェア〔（株）ヒューリンクス製、商品名：カレイダグラフ〕を用いて最小二乗法によりカーブフィッティングを行なうことにより、センサグラムの近似曲線を得る。得られた近似曲線を表わす式を、式（Ｉ）：
（式中、Δλは層厚の変化量、ａ、ｂ、ｋ1およびｋ2はカーブフィッティングで定まる任意の数、ｔは経過時間を示す）
で表わされる式と対比する。式（Ｉ）におけるａ値がｂ値よりも大きい場合（ａ＞ｂ）、ｋ1の値をペプチドの解離速度定数ｋoffの値として得ることができる。また、ａ値がｂ値よりも小さい場合（ａ＞ｂ）、ｋ2の値をペプチドの解離速度定数ｋoffの値として得ることができる。
本実施形態に係る方法では、つぎに、工程（ｄ）において、標的ペプチドとタンパク質との解離様式が単調様式および複相様式のいずれであるかを判別する。工程（ｄ）により、後述の第３情報を得ることができる。
本実施形態に係る方法では、ペプチドと当該ペプチドに結合するタンパク質との解離様式は、ペプチドの種類に応じ、単調様式および複相様式に分類する。本明細書において、「単調様式」とは、ほぼ１種類の態様のペプチドとタンパク質との解離方法が見られる様式をいう。本明細書において、「複相様式」とは、複数種類の態様のペプチドとタンパク質との解離方法が見られる様式をいう。解離様式の違いは、ペプチドおよびタンパク質それぞれの立体構造、タンパク質における結合部位の形状、結合部位の数、タンパク質に対するペプチドの親和性などに起因すると考えられる。
工程（ｄ）において、解離様式の判別は、層厚の変化量が最大値を示す時間以降のセンサグラムから最小二乗法によって求められた近似曲線を表わす式の係数に基づいて行なうことができる。近似曲線を表わす式としては、式（Ｉ）が挙げられる。
式（Ｉ）を用いて解離様式を判別する場合、解離様式の判別は、式（Ｉ）のｂ値を用い、以下の判断基準によって行なうことができる。
＜解離様式の判別の判断基準＞
・ 式（Ｉ）におけるｂ値が、解離様式を単調様式および複相様式に分けるための所定の閾値よりも小さい場合、タンパク質からのペプチドの解離様式が単調様式であると判別する。
・ 式（Ｉ）におけるｂ値が、閾値以上である場合には、タンパク質からのペプチドの解離様式が複相様式であると判別する。
閾値は、異なる被検試料を用いたときの判定結果のばらつきの影響を低減する観点から、０．１０９以上であり、０．５１９以下である。同一の被検試料を用いたときの測定の再現性を確保する観点から、より好ましくは０．１６３以上、０．３１９以下である。
本実施形態に係る方法では、つぎに、工程（ｅ）で、標的ペプチドの解離速度定数、層厚の変化量の最大値および解離様式と、既知ペプチドを用いて予め標的ペプチドと同様に測定して得られた解離速度定数、層厚の変化量の最大値および解離様式とを比較する。すなわち、工程（ｅ）では、標的ペプチドの第１〜第３情報と、既知ペプチドの第１〜第３情報とを比較する。
本工程（ｅ）では、比較対象の既知ペプチドは、１種類であってもよく、複数種類（２種類以上）であってもよい。比較対象の既知ペプチドの種類の上限は、本実施形態に係る方法の用途などに応じて適宜決定することができる。
第１情報の比較では、標的ペプチドの解離速度定数が特定の既知ペプチドの解離速度定数と同じ値または近似の値であるかどうかを評価する。「特定の既知ペプチドの解離速度定数と近似」は、例えば、以下の条件の少なくとも１つを満たすことを意味する。
・ 式（ＩＩ）：
（［特定の既知ペプチドの解離速度定数の値］−［標的ペプチドの解離速度定数の値］）／［特定の既知ペプチドの解離速度定数の値］ （ＩＩ）
で求められる値が０．３１５以下、好ましくは０．１２９以下であること。
・ 式（ＩＩＩ）：
（ＡＶＥ−ＳＤ）＜Ｍ＜（ＡＶＥ＋ＳＤ） （ＩＩＩ）
（式中、ＡＶＥは既知ペプチドを用いて繰り返し測定を行なうことで得られた解離速度定数の平均の値、ＳＤは標準偏差の値、Ｍは近似か否かの判断対象の標的ペプチドの解離速度定数を示す）
で表わされる条件を満たすこと。
なお、「ＡＶＥ−ＳＤ」および「ＡＶＥ＋ＳＤ」は、既知ペプチドの解離速度定数である。既知ペプチドの解離速度定数は、参照されるべき既知ペプチドに固有の値である。
第２情報の比較では、標的ペプチドを用いたときの層厚の変化量の最大値が特定の既知ペプチドを用いたときの層厚の変化量の最大値と同じ値または近似の値であるかどうかを評価する。「特定の既知ペプチドを用いたときの層厚の変化量の最大値と近似」は、例えば、以下の条件の少なくとも１つを満たすことを意味する。
・ 式（ＩＶ）：
（［特定の既知ペプチドを用いたときの層厚の変化量の最大値］−［標的ペプチドを用いたときの層厚の変化量の最大値］）／［特定の既知ペプチドを用いたときの層厚の変化量の最大値］ （ＩＶ）
で求められた値が０．２４９以下、好ましくは０．１１２以下であること。
・ 式（Ｖ）：
（ａｖｅ−ｓｄ）＜ｍ＜（ａｖｅ＋ｓｄ） （Ｖ）
（式中、ａｖｅは既知ペプチドを用いて繰り返し測定を行なうことで得られた層厚の変化量の最大値の平均の値、ｓｄは標準偏差の値、ｍは近似か否かの判断対象の標的ペプチドを用いたときの層厚の変化量の最大値を示す）
で表わされる条件を満たすこと。
第３情報の比較では、標的ペプチドとタンパク質との解離様式が特定の既知ペプチドとタンパク質との解離様式（単調様式または複相様式）と同じであるかどうかを評価する。
その後、本実施形態に係る方法では、工程（ｆ）において、工程（ｅ）で比較結果に基づいて標的ペプチドが既知ペプチドであるか否かを判定する。本工程（ｆ）においては、後述の判定装置を用いることができる。
工程（ｅ）で、１種類の既知ペプチドの解離速度定数、層厚の変化量の最大値および解離様式を用いる場合、工程（ｆ）において、工程（ｅ）で得られた比較結果に基づいて標的ペプチドが既知ペプチドであるか、または既知ペプチドに該当しないと判定する。一方、工程（ｅ）で、複数種類の既知ペプチドそれぞれの解離速度定数、層厚の変化量の最大値および解離様式を用いる場合、工程（ｆ）において、工程（ｅ）で得られた比較結果に基づいて標的ペプチドが複数種類の既知ペプチドのうちのいずれであるか、または複数種類の既知ペプチドのいずれにも該当しないと判定する。
工程（ｆ）においては、標的ペプチドの解離速度定数および層厚の変化量の最大値が特定の既知ペプチドの解離速度定数および層厚の変化量の最大値と同じ値または近似の値であり、かつ標的ペプチドの解離様式が、特定の既知ペプチドの解離様式と同じである場合、標的ペプチドが特定の既知ペプチドである可能性が高いと判断することができる。これに対し、標的ペプチドの解離速度定数および層厚の変化量の最大値が特定の既知ペプチドの解離速度定数および層厚の変化量の最大値と同じ値および近似の値のいずれでもなく、かつ標的ペプチドの解離様式が、特定の既知ペプチドの解離様式と異なる場合、標的ペプチドが特定の既知ペプチドではない可能性が高いと判断することができる。
本実施形態に係る方法では、既知ペプチドの第１〜第３情報をプロットしたグラフ（以下、「ペプチドマップ」ともいう。）を用いて、標的ペプチドの種類を判定してもよい。本実施形態に係る方法において、ペプチドマップを用いる場合、標的ペプチドが特定の既知ペプチドであるかどうかを視覚的に容易に判定することができる。ペプチドマップとしては、例えば、単調様式の既知ペプチドの第１情報をＸ軸とし、第２情報をＹ軸とする第１のマップと、複相様式の既知ペプチドの第１情報をＸ軸とし、第２情報をＹ軸とする第２のマップとを含むペプチドマップ；単調様式の既知ペプチドの第２情報をＸ軸とし、第１情報をＹ軸とする第１のマップと、複相様式の既知ペプチドの第２情報をＸ軸とし、第１情報をＹ軸とする第２のマップとを含むペプチドマップなどが挙げられるが、特に限定されない。
工程（ｆ）において、ペプチドマップを用いて標的ペプチドの種類を判定する場合、例えば、標的ペプチドを示す座標点と特定の既知ペプチドを示す座標点との距離、標的ペプチドを示す座標点を中心点とする所定範囲と特定の既知ペプチドを示す座標点を中心点とする所定範囲とが重複する部分の面積の大きさなどを指標として用いることができる。指標として座標点間の距離を用いる場合、標的ペプチドは、当該標的ペプチドの座標点からの距離が最も近い座標点の既知ペプチドであると判断することができる。また、指標として重複する部分の面積を用いる場合、標的ペプチドは、重複する面積が最も大きい既知ペプチドであると判断することができる。
３．判定装置およびプログラム
つぎに、前述した標的ペプチドの種類の判定方法に用いることができる判定装置を、添付の図面を参照しながら、より詳細に説明するが、本発明は、かかる実施形態のみに限定されるものではない。
図１に示される判定装置１０は、コンピュータシステム１１と、コンピュータシステム１１に接続された測定部１３とを含む。コンピュータシステム１１は、コンピュータ本体１１ａと、入力部１１ｂと、表示部１１ｃとを含んでいる。
コンピュータ本体１１ａは、入力部１１ｂおよび測定部１３から第１〜第３情報を取得する取得する取得手段である取得部１０１と、第１〜第３情報を記憶する記憶手段である記憶部１０２と、標的ペプチドが前記既知ペプチドであるか否かを判定する制御手段である制御部１０３と、判定結果を表示部１１ｃなどに出力する出力部１０５とを備えている。取得部１０１は、入力部１１ｂおよび測定部１３から第１〜第３情報を取得し、制御部１０３に送信する。記憶部１０２は、標的ペプチドおよび既知ペプチドの双方の第１〜第３情報と、標的ペプチドの種類の判断基準とを記憶する。制御部１０３は、取得部１０１から得た第１〜第３情報を記憶部１０２に送信する。また、制御部１０３は、記憶部１０２に記憶された標的ペプチドおよび既知ペプチドの双方の第１〜第３情報を用い、記憶部１０２に記憶された標的ペプチドの種類の判断基準にしたがって標的ペプチドの種類を判定する。さらに、制御部１０３は、判定結果に基づき、標的ペプチドの第１〜第３情報および複数種類の既知ペプチドの第１〜第３情報を示すグラフと、前記標的ペプチドの判定結果とを含む画面情報を生成する。出力部１０５は、標的ペプチドの第１〜第３情報および複数種類の既知ペプチドの第１〜第３情報を示すグラフと、標的ペプチドの判定結果とを表示部１１ｃなどに出力する。表示部１１ｃは、グラフおよび判定結果を表示する。なお、出力部１０５にプリンタが接続されている場合には、出力部１０５は、プリンタに判定結果などを印刷させることができる。
記憶部１０２は、複数種類の既知ペプチドの第１〜第３情報を記憶していてもよい。この場合、制御部１０３は、標的ペプチドの第１〜第３情報と、複数種類の既知ペプチドの第１〜第３情報とをそれぞれ比較し、得られた比較結果に基づいて標的ペプチドが複数種類の既知ペプチドのうちのいずれであるか、または複数種類の既知ペプチドのいずれにも該当しないと判定する。
本実施形態において、測定部１３は、白色光干渉を検出することにより、被検試料に含まれる標的ペプチドの第１〜第３情報を測定する装置である。
つぎに、図１に示された判定装置のハードウェア構成を説明する。図２に示されるコンピュータ本体１１ａは、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）１１０と、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）１１１と、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）１１２と、ハードディスク１１３と、入出力インターフェイス１１４と、読出装置１１５と、通信インターフェイス１１６と、画像出力インターフェイス１１７とを備えている。ＣＰＵ１１０、ＲＯＭ１１１、ＲＡＭ１１２、ハードディスク１１３、入出力インターフェイス１１４、読出装置１１５、通信インターフェイス１１６および画像出力インターフェイス１１７は、バス１１８によってデータ通信可能に接続されている。
ＣＰＵ１１０は、アプリケーションプログラムを実行することにより、コンピュータを前述した各機能ブロックとして機能させる。これにより、コンピュータシステムが、標的ペプチドの種類の判定装置としての端末として機能する。ハードディスク１１３は、ＣＰＵ１１０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム（標的ペプチドの種類の判定を行なうためのコンピュータプログラム）などのコンピュータプログラムおよび当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。読出装置１１５は、可搬型記録媒体５０に記録されたコンピュータプログラムまたは既知ペプチドの第１〜第３情報などのデータを読み出すことができる。入出力インターフェイス１１４には、キーボード、マウスなどの入力部１１ｂが接続されている。操作者は、入力部１１ｂを使用することにより、コンピュータ本体１１ａにデータを入力することが可能である。通信インターフェイス１１６は、例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）インターフェイスなどである。コンピュータシステム１１は、通信インターフェイス１１６により、プリンタ１４への印刷データの送信が可能である。画像出力インターフェイス１１７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部１１ｃに接続されている。これにより、表示部１１ｃは、ＣＰＵ１１０から与えられた判定結果などの画像データに応じた映像信号を出力することができる。
つぎに、判定装置１０による標的ペプチドの種類の判定の処理手順を説明する。図１に示された判定装置１０を用いた標的ペプチドの種類の判定のフローチャートを図３に示す。なお、図３においては、複数種類の既知ペプチドを用いる場合を例として説明する。しかし、本実施形態に係る判定装置１０による標的ペプチドの種類の判定においては、複数種類の既知ペプチドを用いる代わりに１種類の既知ペプチドを用いてもよい。
まず、ステップＳ１−１において、判定装置１０の取得部１０１は、測定部１３より標的ペプチドの第１〜第３情報を取得する。本ステップＳ１−１では、必要に応じ、制御部１０３は、取得された標的ペプチドの第１〜第３情報を記憶部１０２に送信してもよい。つぎに、ステップＳ１−２において、記憶部１０２に記憶された既知ペプチドの第１〜第３情報を取得する。その後、ステップＳ１−３において、取得された既知ペプチドの第１〜第３情報から特定の既知ペプチドの第１〜第３情報を抽出する。つぎに、ステップ１−４において、制御部１０３は、取得された標的ペプチドの第１〜第３情報と、ステップ１−３で抽出された特定の既知ペプチドの第１〜第３情報とを比較する。つぎに、ステップ１−５において、制御部１０３は、標的ペプチドの第１〜第３情報が特定の既知ペプチドの第１〜第３情報のすべてと同じまたは近似であるかどうかを判定する。ステップＳ１−５において、制御部１０３が、標的ペプチドの第１〜第３情報が特定の既知ペプチドの第１〜第３情報のすべてと同じまたは近似であると判定すると、制御部１０３は、ステップＳ１−６へ処理を進める。そして、ステップＳ１−６において、制御部１０３は、標的ペプチドが特定の既知ペプチドであると判定し、出力部１０５に判定結果の情報などを出力する。その後、処理は終了する。一方、ステップＳ１−５において、制御部１０３が、標的ペプチドの第１〜第３情報が特定の既知ペプチドの第１〜第３情報のすべてと同じまたは近似ではないと判定すると、ステップＳ１−３に戻り、制御部１０３は、再度特定の既知ペプチドの第１〜第３情報を抽出し、以下、Ｓ１−４〜Ｓ１−６を実行する。
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これら実施例のみに限定されるものではない。
（実施例１）
（１）ヒト血清アルブミン溶液の調製
本実施例１では、ペプチドと結合するタンパク質としてヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」という）（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を用いた。ＨＳＡ粉末を、精製脱塩水に溶解してＨＳＡ水溶液を得た。つぎに、得られたＨＳＡ水溶液を、ＨＳＡの濃度が０．２μＭとなるように、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．９）で希釈してＨＳＡ溶液を得た。
（２）ＨＳＡセンサーチップの作製
支持体としての基板〔コニカミノルタ（株）製、商品名：ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）専用センサーチップ(無修飾)、型式名ＬＣＳ−０１〕と、フローセル〔コニカミノルタ（株）製、商品名：ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）専用フローセル、形式名ＬＣＦ−０１〕とを、分子間相互作用測定装置〔コニカミノルタ（株）製、商品名：ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）〕にセットした。なお、基板は、シリコンウェハの表面上に窒化シリコン薄層が設けられた基板である。
つぎに、基板とフローセルとの間に形成された流路に、ランニングバッファとして０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．９）を流速１００μＬ／ｍｉｎで３０分間以上流して基板の表面の平衡化を行なった。その後、流路に、実施例１（１）で得られたＨＳＡ溶液１００μＬを流速１００μＬ／ｍｉｎで注入し、ＨＳＡを基板の表面に吸着させた。なお、ランニングバッファの送液および試料の注入には、高速液体クロマトグラフ用送液ポンプ〔（株）島津製作所製、商品名：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＵＦＬＣ〕およびオートサンプラ〔（株）日立製作所製、商品名：Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ〕を用いた。これにより、ＨＳＡが基板の表面に固定化された固相担体（以下、「ＨＳＡセンサーチップ」ともいう）を得た。また、流路へのＨＳＡ溶液の注入を行なう際に、流路に白色光を照射したときの反射光の分光反射率曲線のボトム波長の波長変化量Δλを経時的に測定することにより、波長変化量Δλの経時的変化を示すセンサグラムを得た。
その結果、得られたセンサグラムは、流路へのＨＳＡ溶液の注入時点直後から、一定の波長変化量Δλを示した。波長変化量Δλは、層厚の変化に伴って反射光の波長の干渉が生じることに関連している。そのため、波長変化量Δλは、固相担体の層厚の変化量（以下、「層厚変化量Δλ」ともいう）を反映している。また、基板の表面へのＨＳＡの吸着により、層厚が変化していると考えられる。したがって、得られたセンサグラムから、流路へのＨＳＡ溶液の注入時点直後から、一定の層厚変化量Δλを示すことがわかる。
つぎに、センサグラムに基づき、基板から解離する際のＨＳＡの解離速度定数ｋoffを求めた。センサグラムから、基板からのＨＳＡの解離がほとんど見られないことがわかる。そのため、解離速度定数ｋoffをカーブフィッティングによって求めることができなかった。しかし、センサグラムから、ＨＳＡは、２８時間以上にわたって基板の表面に固定化されていることがわかる。したがって、ＨＳＡセンサーチップは、高い保存安定性を有し、センサーチップとして実用性に優れていることがわかる。
自然対数（ｌｎ２）をＨＳＡの解離速度定数ｋoffで除算することにより、半減期〔基板の表面に吸着しているＨＳＡが、初めの量の２分の１になるのに要する時間〕を求めた。その結果、ＨＳＡは、７時間以上にわたって基板の表面に固定化されていることがわかる。したがって、ＨＳＡセンサーチップは、高い保存安定性を有し、センサーチップとして実用性に優れていることがわかる。
（３）ペプチド溶液の調製
副腎皮質刺激ホルモン（以下、「ＡＣＴＨ」という）ＡＣＴＨ部分ペプチド１−２４位（以下、「ＡＣＴＨ２４」という）、ＡＣＴＨ部分ペプチド１−３９位（以下、「ＡＣＴＨ３９」という）、ＡＣＴＨ部分ペプチド１−４１位（以下、「ＡＣＴＨ４１」という）、アルブミン結合ペプチドＳＡ２１、インター−α−トリプシンインヒビター重鎖４（以下、「ＩＴＩＨ４」という）、グルカゴン、脳性ナトリウム利尿ペプチド （以下、「ＢＮＰ」という）、フィブリノゲンα、アルギニンデカペプチド〔以下、「（Ａｒｇ）１０」という〕またはヒスチジンエイコサペプチド〔以下、「（Ｈｉｓ）２０」という〕のペプチド粉末〔（株）バイオロジカ製〕を脱塩精製水に溶解し、ペプチド水溶液を得た。つぎに、得られたペプチド水溶液を、ペプチドの濃度が２μＭになるように０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で希釈し、ペプチド溶液を得た。各ペプチドの情報を表１に示す。
（４）反射干渉分光法によるＨＳＡとペプチドとの間の結合および解離の観察
実施例１（２）における基板の表面へのＨＳＡの吸着後３０分間経過時に、実施例１（３）で得られたペプチド溶液１００μＬを、流路に流速１００μＬ／ｍｉｎで注入した。流路に白色光を照射したときの反射光の分光反射率曲線のボトム波長の波長変化量Δλ（層厚変化量Δλ）を経時的に測定してセンサグラムを得た。得られたセンサグラムの一例として、ＡＣＴＨ３９をペプチドとして用いたときのセンサグラムを図４に示す。図中、ＨＳＡの矢印はＨＳＡ溶液の注入時点、ＡＣＴＨ３９の矢印はＡＣＴＨ３９のペプチド溶液の注入時点を示す。また、図中、黒三角は解離開始時点、白三角は解離終了時点を示す。
図４に示された結果から、流路へのＨＳＡ溶液の注入直後に層厚変化量Δλが上昇することがわかる。また、ＨＳＡ溶液の注入時点からＡＣＴＨ３９のペプチド溶液の注入時点までの間では、一定の層厚変化量Δλを維持することがわかる。したがって、この結果から、ＨＳＡは基板の表面上に安定的に固定されていることが示唆される。一方、流路にＡＣＴＨ３９のペプチド溶液を注入した場合、層厚変化量は、一旦上昇することがわかる。その後、層厚変化量は、ＡＣＴＨ３９のペプチド溶液の注入前の層厚変化量と同程度にまで減少することがわかる。したがって、この結果から、ＡＣＴＨ３９は、ＨＳＡに結合してＡＣＴＨ３９とＨＳＡとの複合体を形成した後、ＨＳＡから解離することが示唆される。
（５）解離速度定数および層厚の変化量の最大値の算出
解離速度定数は、以下の手順により算出した。まず、ペプチドの解離開始時点から解離終了時点までの間の層厚変化量Δλの経時的変化を示すセンサグラムを作成する。つぎに、得られたセンサグラムについて、統計解析／グラフ作成ソフトウェア〔（株）ヒューリンクス製、商品名：カレイダグラフ〕を用いて最小二乗法によりカーブフィッティングを行なうことにより、センサグラムの近似曲線（ａ）を得る。センサグラムに対するカーブフィッティングを行なった一例を図５に示す。得られた近似曲線（ａ）は、式（Ｉ）：
（式中、Δλは層厚の変化量、ａ、ｂ、ｋ1およびｋ2はカーブフィッティングで定まる任意の数、ｔは経過時間を示す）
で表わされる曲線である。その後、式（Ｉ）において、ａ値がｂ値よりも大きい場合（ａ＞ｂ）、ｋ1の値をペプチドの解離速度定数ｋoffの値とし、ａ値がｂ値よりも小さい場合（ａ＜ｂ）、ｋ2の値をペプチドの解離速度定数ｋoffの値として用いる。なお、図５に示されるセンサグラムを示すペプチドの解離速度定数ｋoffは、１．４３×１０-3ｓｅｃ-1と算出される。
ＡＣＴＨ２４、ＡＣＴＨ３９、ＡＣＴＨ４１、ＳＡ２１、ＩＴＩＨ４、グルカゴン、ＢＮＰ、フィブリノゲンα、（Ａｒｇ）１０および（Ｈｉｓ）２０の各ペプチドのセンサグラムに対してカーブフィッティングを行なうことにより、センサグラムの近似曲線を得た。得られた近似曲線を表わす式から、前記の手順にしたがい、各ペプチドの解離速度定数ｋoffを求めた。その結果、ペプチドの種類に応じて、各ペプチドが異なる解離速度定数ｋoffを有する傾向が見られた。
各ペプチドのセンサグラムの近似曲線を表わす式を用い、層厚の変化量の最大値（以下、「最大層厚変化量」ともいう）を求めた。その結果、ペプチドの種類に応じて、各ペプチドがＨＳＡに結合したときの最大層厚変化量を有する傾向が見られた。
（６）ＨＳＡからの各ペプチドの解離様式の判別
ＨＳＡからのペプチドの解離様式は、式（Ｉ）のｂ値の大きさが所定の閾値よりも小さいことおよび式（Ｉ）のｂ値の大きさが所定の閾値以上であることに基づいて判別することができる。本実施例で用いた具体的な判断基準は、以下のとおりである。
＜判断基準＞
ｂ値が０．２４１よりも小さい場合（ｂ＜０．２４１）、タンパク質からのペプチドの解離様式は、「単調様式」である。
ｂ値が０．２４１以上である場合（ｂ≧０．２４１）、タンパク質からのペプチドの解離様式は、「複相様式」である。
したがって、これらの結果より、ペプチドの種類に応じて、
（Ｉ）ペプチドと結合するタンパク質が基板に固定化された固相担体（以下、「タンパク質センサーチップ」ともいう）上において、タンパク質からペプチドが解離する際の解離速度定数ｋoff（第１情報）、
（ＩＩ）タンパク質センサーチップの最大層厚変化量（第２情報）、
（ＩＩＩ）ペプチドとタンパク質との解離様式が単調様式および複相様式のいずれであるか（第３情報）
のそれぞれが異なることがわかる。
以上の結果から、既知ペプチドの第１〜第３の情報と標的ペプチドの第１〜第３情報を用いることにより、標的ペプチドの種類の判定（例えば、特定の既知ペプチドであるかどうかの判定など）を行なうことができることが示唆される。
（７）１種類の既知ペプチドのペプチドマップの生成
ＨＳＡセンサーチップと、既知ペプチドとして１種類のペプチド（ＡＣＴＨ３９）とを用いたときの解離速度定数ｋoff（第１情報）、最大層厚変化量（第２情報）および解離様式の種類（第３情報）に基づき、１種類の既知ペプチドのペプチドマップを作成した。その結果を図６に示す。図中、黒丸は複相様式を示す。
ペプチドマップにおいて、解離速度定数ｋoff（第１情報）は、ＨＳＡとペプチドとの親和性の指標となると考えられる。また、最大層厚変化量（第２情報）は、ＨＳＡとペプチドとの複合体の構造変化の大きさの指標となると考えられる。単調様式および複相様式（第３情報）は、ＨＳＡからのペプチドの解離様式の違いの指標となると考えられる。
ペプチドマップを用いることにより、既知ペプチドの第１〜第３情報との比較が容易になる。したがって、１種類の既知ペプチドの第１〜第３情報に基づくペプチドマップによれば、容易にペプチドの種類を判定できることが示唆される。
（実施例２）
実施例１と同様の操作を行ない、ＨＳＡセンサーチップと、既知ペプチドとして複数種類のペプチド〔ＡＣＴＨ２４、ＡＣＴＨ３９、ＡＣＴＨ４１、ＳＡ２１、ＩＴＩＨ４、グルカゴン、ＢＮＰ、フィブリノゲンα、（Ａｒｇ）１０および（Ｈｉｓ）２０〕とを用いたときの解離速度定数ｋoff（第１情報）、最大層厚変化量（第２情報）および解離様式の種類（第３情報）を取得した。ＨＳＡセンサーチップと、複数種類の既知ペプチド〔ＡＣＴＨ２４、ＡＣＴＨ３９、ＡＣＴＨ４１、ＳＡ２１、ＩＴＩＨ４、グルカゴン、ＢＮＰ、フィブリノゲンα、（Ａｒｇ）１０および（Ｈｉｓ）２０〕とを用いたときの第１〜第３情報に基づき、複数種類の既知ペプチドのペプチドマップを作成した。その結果を図７に示す。図中、白丸は単調様式、黒丸は複相様式を示す。
図７に示されるように、第１〜第３情報に基づくペプチドマップでは、複数種類の既知ペプチドのそれぞれが区別可能に分離してプロットされていることがわかる。したがって、複数種類の既知ペプチドの第１〜第３情報に基づくペプチドマップによれば、容易にペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
（実施例３）
（１）被検試料の調製
ＡＣＴＨ２４、ＡＣＴＨ３９、ＡＣＴＨ４１、ＳＡ２１、ＩＴＩＨ４、グルカゴン、ＢＮＰ、フィブリノゲンα、（Ａｒｇ）１０および（Ｈｉｓ）２０のペプチド粉末〔（株）バイオロジカ製〕を脱塩精製水に溶解し、ペプチド水溶液を得た。つぎに、得られたペプチド水溶液を、ペプチドの濃度が２μＭになるように０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で希釈し、ペプチド溶液を得た。つぎに、各ペプチド名が記載されたシールが貼られた１．５ｍＬチューブに、対応するペプチド溶液５００μＬを入れた。
（２）被検試料の無作為抽出
第１の実験協力者に、実施例３（１）で得られた各チューブのペプチド名のシールを、１〜１０の番号の記載されたシールにランダムに貼り替えさせた。ブラインド試験では、第１の実験協力者のみが、シールの番号とペプチド溶液の種類との対応を知得している。つぎに、第２の実験協力者に、１〜１０のなかから無作為に３つの番号を選ばせ、被検試料として３種類のペプチド溶液（Ｎｏ．２、Ｎｏ．６およびＮｏ．１０）を抽出した。
（３）第１〜第３情報の取得
実施例１（２）と同様の操作を行ない、ＨＳＡを基板の表面に吸着させてＨＳＡセンサーチップを得た。基板へのＨＳＡの吸着後３０分間経過時に、実施例３（１）で無作為抽出された３種類の被検試料のうちの１つの被検試料１００μＬを、ＨＳＡセンサーチップとフローセルとの間に形成された流路に流速１００μＬ／ｍｉｎで注入した。流路に白色光を照射したときの反射光の分光反射率曲線のボトム波長の波長変化量Δλ（層厚変化量Δλ）を経時的に測定し、センサグラムを得た。ＨＳＡセンサーチップの作成および波長変化量Δλ（層厚変化量Δλ）の測定の一連の実験を４回以上行なった。得られたセンサグラムについて、統計解析／グラフ作成ソフトウェア〔（株）ヒューリンクス製、商品名：カレイダグラフ〕を用いて最小二乗法によりカーブフィッティングを行なうことにより、センサグラムの近似曲線を得た。得られた近似曲線および近似曲線を表わす式を用い、実施例１と同様の操作を行ない、第１〜第３情報を取得した。なお、第１情報は、解離速度定数ｋoffについて、４回以上の実験で得られた各値の平均値および標準偏差を求めることによって得た。また、第２情報は、最大層厚変化量について、４回以上の実験で得られた各値の平均値および標準偏差を求めることによって得た。
（４）標的ペプチドの種類の判定
実施例３（３）で得られた複数種類の既知ペプチドの第１〜第３情報と被検試料に含まれる標的ペプチドの第１〜第３情報とを用い、以下の２つの方法により、標的ペプチドの種類を判定した。
第１の方法では、ます、複数種類の既知ペプチドの第１〜第３情報と被検試料に含まれる標的ペプチドの第１〜第３情報とを比較した。つぎに、下記判断基準に基づき、標的ペプチドが特定の既知ペプチドであるかどうかを調べ、標的ペプチドの種類を判定した。
＜判断基準＞
（Ｉ）標的ペプチドの解離速度定数ｋoffが特定の既知ペプチドの解離速度定数ｋoffと同じ値または近似の値（式（ＩＩ）で求められる値が０．３１５以下）であること
（ＩＩ）標的ペプチドを用いたときのタンパク質センサーチップの最大層厚変化量が特定の既知ペプチドの最大層厚変化量と同じ値または近似の値であること、
（ＩＩＩ）標的ペプチドとタンパク質との解離様式が特定の既知ペプチドとタンパク質との解離様式（単調様式または複相様式）と同じであること。
また、第２の方法では、まず、第１〜第３情報に基づき、既知ペプチドのペプチドマップを作成した。つぎに、得られたペプチドマップ上に、被検試料に含まれる標的ペプチドの第１〜第３情報をプロットした。その後、標的ペプチドに対応する座標点から最も近い距離に位置する座標点に対応する既知ペプチドを同定した。
第１の方法を行なった結果、Ｎｏ．２の被検試料に含まれる標的ペプチドは、ＩＴＩＨ４であると判定された。また、Ｎｏ．６の被検試料に含まれる標的ペプチドは、ＡＣＴＨ３９であると判定された。さらに、Ｎｏ．１０の被検試料は、ＢＮＰであると判定された。つぎに、第１実験者に、得られた判定結果と、実際に用いられた被検試料のペプチド溶液の種類とを照合させた。その結果、判定結果が正しいことが示された。
また、第２の方法を行なった結果を図８に示す。図８（Ａ）はＨＳＡから単調様式で解離する既知ペプチドのペプチドマップ、図８（Ｂ）はＨＳＡから複相様式で解離する既知ペプチドのペプチドマップを示す。図中、白丸は単調様式、黒丸は複相様式、矩形は標的ペプチドを示す。図８に示された結果から、Ｎｏ．２の被検試料に含まれる標的ペプチドの座標点は、ＩＴＩＨ４の座標点に近い位置にある。したがって、Ｎｏ．２の被検試料に含まれる標的ペプチドは、ＩＴＩＨ４であると判定された。また、Ｎｏ．６の被検試料に含まれる標的ペプチドの座標点は、ＡＣＴＨ３９の座標点に近い位置にある。したがって、Ｎｏ．６の被検試料に含まれる標的ペプチドは、ＡＣＴＨ３９であると判定された。さらに、Ｎｏ．１０の被検試料に含まれる標的ペプチドの座標点は、ＢＮＰの座標点に近い位置にある。Ｎｏ．１０の被検試料は、ＢＮＰであると判定された。つぎに、第１の実験協力者に、得られた判定結果と、実際に用いられた被検試料のペプチド溶液の種類とを照合させた。その結果、判定結果が正しいことが示された。
以上の結果から、複数種類の既知ペプチドの第１〜第３情報を用いることにより、容易にペプチドの種類を判定することができることがわかる。
（比較例１）
実施例３（４）において、第１〜第３情報を用いる代わりに、第１情報および第２情報を用いたことを除き、実施例３における第２の方法と同様の操作を行ない、標的ペプチドの種類を判定した。その結果を図９に示す。図中、グラフ（ｂ）はグラフ（ａ）の一部分の拡大図である。
図９に示された結果から、Ｎｏ．６の被検試料に含まれる標的ペプチドの座標点は、ＡＣＴＨ２４の座標点およびＡＣＴＨ３９の座標点の双方に近い距離にあることがわかる。また、Ｎｏ．１０の被検試料に含まれる標的ペプチドの座標点は、ＢＮＰの座標点および（Ｈｉｓ）２０の座標点の双方に近い距離にあることがわかる。これらの結果から、第１情報および第２情報だけでは、ペプチドの種類を判定することが困難であることがわかる。
（実施例４）
（１）全血溶液の調製
本実施例４では、ペプチドと結合するタンパク質として、ヒト全血〔（株）東京未来スタイル製〕を用いた。ヒト全血を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．９）で１００００〜２００００倍希釈して全血溶液を得た。
（２）全血センサーチップの作製
基板〔コニカミノルタ（株）製、商品名：ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）専用センサーチップ(無修飾)、型式名ＬＣＳ−０１〕と、フローセル〔コニカミノルタ（株）製、商品名：ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）専用フローセル、形式名ＬＣＦ−０１〕とを、分子間相互作用測定装置〔コニカミノルタ（株）製、商品名：ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）〕にセットした。
つぎに、基板とフローセルとの間に形成された流路に、ランニングバッファとして０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．９）を流速５０μＬ／ｍｉｎで３０分間以上流して基板の表面の平衡化を行なった。その後、流路に、実施例４（１）で得られた全血溶液１００μＬを流速５０μＬ／ｍｉｎで注入し、全血の成分を基板の表面に吸着させた。なお、ランニングバッファの送液および全血溶液の注入には、高速液体クロマトグラフ用送液ポンプ〔（株）島津製作所製、商品名：ＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅＵＦＬＣ〕およびオートサンプラ〔（株）日立製作所製、商品名：Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ〕を用いた。これにより、全血の成分が基板の表面に固定化された固相担体（以下、「全血センサーチップ」ともいう）を得た。また、流路への全血溶液の注入を行なう際に、流路に白色光を照射したときの反射光の分光反射率曲線のボトム波長の波長変化量Δλ（層厚変化量Δγ）を経時的に測定することにより、センサグラムを得た。得られたセンサグラムを図１０（Ａ）に示す。また、得られたセンサグラムについて、統計解析／グラフ作成ソフトウェア〔（株）ヒューリンクス製、商品名：カレイダグラフ〕を用いて最小二乗法によりカーブフィッティングを行なうことにより、センサグラムの近似曲線を得た。得られた近似曲線および近似曲線を表わす式を用い、実施例１と同様の操作を行ない、基板から解離する際の全血の成分の解離速度定数ｋoffを求めた。
図１０（Ａ）に示された結果から、得られたセンサグラムは、流路への全血溶液の注入時点直後から、一定の波長変化量Δλ（層厚変化量Δλ）を示すことがわかる。また、センサグラムに基づき、基板から解離する際の全血の解離速度定数ｋoffを求めた。その結果、全血の解離速度定数ｋoffは、基板からの全血の解離はほとんど見られなかった。そのため、解離速度定数ｋoffをカーブフィッティングによって求めることができなかった。しかし、センサグラムから、全血は、５６時間以上にわたって基板の表面に固定化されていることがわかる。したがって、全血センサーチップは、高い保存安定性を有し、センサーチップとして実用性に優れていることがわかる。
（３）ペプチド溶液の調製
アミロイドβ４０ペプチド（以下、「ＡＢ４０」という）、アミロイドβ４２ペプチド（以下、「ＡＢ４２」という）、ＡＣＴＨ２４、ＡＣＴＨ１５」という）、ＡＣＴＨ３９、ＡＣＴＨ４１、ダイノルフィン（Ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ）ＡまたはＳＡ２１を精製脱塩水に溶解させ、ペプチド水溶液を得た。つぎに、得られたペプチド水溶液を、ペプチドの濃度が表２に示される濃度となるように０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で希釈し、ペプチド溶液を得た。
（４）第１〜第３情報の取得
実施例４（２）で得られた全血センサーチップと、実施例４（３）で得られた各ペプチド溶液とを用い、実施例１と同様の操作を行ない、解離速度定数ｋoff（第１情報）、最大層厚変化量（第２情報）および解離様式の種類（第３情報）を取得した。その結果、ペプチドの種類に応じて、第１情報、第２情報および第３情報のそれぞれが異なっていた。これらの結果から、全血センサーチップを用いることにより、標的ペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
（５）ペプチドマップの生成
実施例４（４）で得られた第１〜第３情報に基づき、複数種類の既知ペプチド〔ＡＢ４０、ＡＢ４２、ＡＣＴＨ２４、ＡＣＴＨ１５、ＡＣＴＨ３９、ＡＣＴＨ４１、ダイノルフィンＡおよびＳＡ２１〕のペプチドマップを作成した。その結果を図１０（Ｂ）に示す。図中、白丸は単調様式、黒丸は複相様式を示す。
図１０（Ｂ）に示されるように、全血センサーチップを用いて得られたペプチドマップでは、複数種類の既知ペプチドのそれぞれが区別可能に分離してプロットされていることがわかる。したがって、全血センサーチップを用いて得られたペプチドマップによれば、容易にペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
（実施例５）
（１）ヒトγグロブリン溶液の調製
本実施例５では、ペプチドと結合するタンパク質として、ヒトγグロブリン（以下、「ＨγＧ」という）〔和光純薬工業（株）製〕を用いた。ＨγＧを精製脱塩水に溶解させ、ＨγＧ水溶液を得た。つぎに、得られたＨγＧ水溶液を、ＨγＧの濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．９）で希釈してＨγＧ溶液を得た。
（２）ＨγＧセンサーチップの作製
実施例４（２）において、全血溶液を用いる代わりにＨγＧ溶液を用いたことを除き、実施例４（３）と同様の操作を行ない、ＨγＧセンサーチップを得た。また、流路へのＨγＧ溶液の注入を行なう際に、流路に白色光を照射したときの反射光の分光反射率曲線のボトム波長の波長変化量Δλ（層厚変化量Δγ）を経時的に測定することにより、センサグラムを得た。得られたセンサグラムを図１１（Ａ）に示す。
図１１（Ａ）に示された結果から、基板からのＨγＧの解離は、ほとんど見られなかった。そのため、解離速度定数ｋoffを求めることができなかった。しかし、センサグラムから、ＨγＧは、５６時間以上にわたって基板の表面に固定化されていることがわかる。したがって、ＨγＧセンサーチップは、高い保存安定性を有し、センサーチップとして実用性に優れていることがわかる。
（３）ペプチド溶液の調製
ＡＢ４０、ＡＢ４２、ＡＣＴＨ２４、ＡＣＴＨ１５、ＡＣＴＨ３９、ＡＣＴＨ４１、ダイノルフィンＡまたはＳＡ２１を精製脱塩水に溶解させ、ペプチド水溶液を得た。つぎに、得られたペプチド水溶液を、ペプチドの濃度が１０μＭとなるように０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で希釈し、ペプチド溶液を得た。
（４）第１〜第３情報の取得
実施例５（２）で得られたＨγＧセンサーチップと、実施例５（３）で得られた各ペプチド溶液とを用い、実施例１と同様の操作を行ない、解離速度定数ｋoff（第１情報）、最大層厚変化量（第２情報）および解離様式の種類（第３情報）を取得した。その結果、ペプチドの種類に応じて、第１情報、第２情報および第３情報のそれぞれが異なっていた。これらの結果から、ＨγＧセンサーチップを用いることにより、標的ペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
（５）ペプチドマップの生成
実施例５（４）で得られた第１〜第３情報に基づき、複数種類の既知ペプチド〔ＡＢ４０、ＡＢ４２、ＡＣＴＨ２４、ＡＣＴＨ１５、ＡＣＴＨ３９、ＡＣＴＨ４１、ダイノルフィンＡおよびＳＡ２１〕のペプチドマップを作成した。その結果を図１１（Ｂ）に示す。図中、白丸は単調様式、黒丸は複相様式を示す。
図１１（Ｂ）に示されるように、ＨγＧセンサーチップを用いて得られたペプチドマップでは、複数種類の既知ペプチドのそれぞれが区別可能に分離してプロットされていることがわかる。したがって、ＨγＧセンサーチップを用いて得られたペプチドマップによれば、容易にペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
（実施例６）
（１）トランスサイレチン溶液の調製
本実施例６では、ペプチドと結合するタンパク質として、トランスサイレチン〔ＡＢＤ社製〕を用いた。トランスサイレチンを精製脱塩水に溶解させ、トランスサイレチン水溶液を得た。つぎに、得られたトランスサイレチン水溶液を、トランスサイレチンの濃度が０．２μＭとなるように、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．９）で希釈してトランスサイレチン溶液を得た。
（２）トランスサイレチンセンサーチップの作製
実施例４（２）において、全血溶液を用いる代わりにトランスサイレチン溶液を用いたことを除き、実施例４（３）と同様の操作を行ない、トランスサイレチンセンサーチップを得た。また、流路へのトランスサイレチン溶液の注入を行なう際に、流路に白色光を照射したときの反射光の分光反射率曲線のボトム波長の波長変化量Δλ（層厚変化量Δγ）を経時的に測定することにより、センサグラムを得た。得られたセンサグラムを図１２（Ａ）に示す。
図１２（Ａ）に示された結果から、得られたセンサグラムは、流路へのトランスサイレチン溶液の注入時点直後から、一定の波長変化量Δλ（層厚変化量Δλ）を示すことがわかる。また、センサグラムに基づき、基板から解離する際のトランスサイレチンの解離速度定数ｋoffを求めた。その結果、基板からのトランスサイレチンの解離は、ほとんど見られなかった。そのため、解離速度定数ｋoffを求めることができなかった。しかし、センサグラムから、トランスサイレチンは１７時間以上にわたって基板の表面に固定化されていることがわかる。したがって、トランスサイレチンセンサーチップは、高い保存安定性を有し、センサーチップとして実用性に優れていることがわかる。
（３）ペプチド溶液の調製
ＡＢ４０、ＡＢ４２、ＡＣＴＨ２４、ＡＣＴＨ１５、ＡＣＴＨ３９、ＡＣＴＨ４１、ダイノルフィンＡまたはＳＡ２１を精製脱塩水に溶解させ、ペプチド水溶液を得た。つぎに、得られたペプチド水溶液を、ペプチドの濃度が表３に示される濃度となるように０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で希釈し、ペプチド溶液を得た。
（４）第１〜第３情報の取得
実施例６（２）で得られたトランスサイレチンセンサーチップと、実施例６（３）で得られた各ペプチド溶液とを用い、実施例１と同様の操作を行ない、解離速度定数ｋoff（第１情報）、最大層厚変化量（第２情報）および解離様式の種類（第３情報）を取得した。その結果、ペプチドの種類に応じて、第１情報、第２情報および第３情報のそれぞれが異なっていた。これらの結果から、トランスサイレチンセンサーチップを用いることにより、標的ペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
（５）ペプチドマップの生成
実施例６（４）で得られた第１〜第３情報に基づき、複数種類の既知ペプチド〔ＡＢ４０、ＡＢ４２、ＡＣＴＨ２４、ＡＣＴＨ１５、ＡＣＴＨ３９、ＡＣＴＨ４１、ダイノルフィンＡおよびＳＡ２１〕のペプチドマップを作成した。その結果を図１２（Ｂ）に示す。図中、白丸は単調様式、黒丸は複相様式を示す。
図１２（Ｂ）に示されるように、トランスサイレチンセンサーチップを用いて得られたペプチドマップでは、複数種類の既知ペプチドのそれぞれが区別可能に分離してプロットされていることがわかる。したがって、トランスサイレチンセンサーチップを用いて得られたペプチドマップによれば、容易にペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
（実施例７）
（１）ウシ血清アルブミン溶液の調製
本実施例７では、ペプチドと結合するタンパク質として、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」という）（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を用いた。ＢＳＡを、濃度が０．５〜１μＭとなるように精製脱塩水に溶解させ、ＢＳＡ水溶液を得た。
（２）ＢＳＡセンサーチップの作製
実施例４（２）において、全血溶液を用いる代わりにＢＳＡ溶液を用いたことを除き、実施例４（３）と同様の操作を行ない、ＢＳＡセンサーチップを得た。また、流路へのＢＳＡ溶液の注入を行なう際に、流路に白色光を照射したときの反射光の分光反射率曲線のボトム波長の波長変化量Δλ（層厚変化量Δγ）を経時的に測定することにより、センサグラムを得た。得られたセンサグラムを図１３（Ａ）に示す。
図１３（Ａ）に示された結果から、得られたセンサグラムは、流路へのＢＳＡ溶液の注入時点直後から、一定の波長変化量Δλ（層厚変化量Δλ）を示すことがわかる。また、センサグラムに基づき、基板から解離する際のＢＳＡの解離速度定数ｋoffを求めた。その結果、基板からのＢＳＡの解離は、ほとんど見られなかった。そのため、解離速度定数ｋoffを求めることができなかった。しかし、センサグラムから、ＢＳＡは、１１１時間以上にわたって基板の表面に固定化されていることがわかる。したがって、ＢＳＡセンサーチップは、高い保存安定性を有し、センサーチップとして実用性に優れていることがわかる。
（３）ペプチド溶液の調製
ＡＣＴＨ２４、ＡＢ４０、ＳＡ２１、ダイノルフィンＡ、キニノゲン、ＩＴＩＨ４、フィブリノゲンまたはグルカゴンを精製脱塩水に溶解させ、ペプチド水溶液を得た。つぎに、得られたペプチド水溶液を、ペプチドの濃度が表４に示される濃度となるように０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で希釈し、ペプチド溶液を得た。
（４）第１〜第３情報の取得
実施例７（２）で得られたＢＳＡセンサーチップと、実施例７（３）で得られた各ペプチド溶液とを用い、実施例１と同様の操作を行ない、解離速度定数ｋoff（第１情報）、最大層厚変化量（第２情報）および解離様式の種類（第３情報）を取得した。その結果、ペプチドの種類に応じて、第１情報、第２情報および第３情報のそれぞれが異なっていた。これらの結果から、ＢＳＡセンサーチップを用いることにより、標的ペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
（５）ペプチドマップの生成
実施例７（４）で得られた第１〜第３情報に基づき、複数種類の既知ペプチド〔ＡＣＴＨ２４、ＡＢ４０、ＳＡ２１、ダイノルフィンＡ、キニノゲン、ＩＴＩＨ４、フィブリノゲンおよびグルカゴン〕のペプチドマップを作成した。その結果を図１３（Ｂ）に示す。図中、白丸は単調様式、黒丸は複相様式を示す。
図１３（Ｂ）に示されるように、ＢＳＡセンサーチップを用いて得られたペプチドマップでは、複数種類の既知ペプチドのそれぞれが区別可能に分離してプロットされていることがわかる。したがって、ＢＳＡセンサーチップを用いて得られたペプチドマップによれば、容易にペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
（実施例８）
（１）熱変性ウシ血清アルブミン溶液の調製
本実施例８では、ペプチドと結合するタンパク質として、熱変性ウシ血清アルブミン（以下、「熱変性ＢＳＡ」という）を用いた。
BSA（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）の粉末を、濃度が１．０質量％となるように精製脱塩水に溶解させた。得られた溶液をオートクレーブにて１１０℃で１５分間加熱し、熱変性ＢＳＡを得た。加熱後の溶液を熱変性ＢＳＡの濃度が０．２〜１μＭとなるように精製脱塩水に溶解させ、熱変性ＢＳＡ水溶液を得た。
（２）熱変性ＢＳＡセンサーチップの作製
実施例４（２）において、全血溶液を用いる代わりに熱変性ＢＳＡ水溶液を用いたことを除き、実施例４（３）と同様の操作を行ない、熱変性ＢＳＡセンサーチップを得た。また、流路への熱変性ＢＳＡ水溶液の注入を行なう際に、流路に白色光を照射したときの反射光の分光反射率曲線のボトム波長の波長変化量Δλ（層厚変化量Δγ）を経時的に測定することにより、センサグラムを得た。得られたセンサグラムを図１４（Ａ）に示す。
図１４（Ａ）に示された結果から、得られたセンサグラムは、基板からの熱変性ＢＳＡの解離はほとんど見られなかった。そのため、解離速度定数ｋoffを求めることができなかった。したがって、熱変性ＢＳＡセンサーチップは、極めて高い保存安定性を有し、センサーチップとして実用性に極めて優れていることがわかる。
（３）第１〜第３情報の取得
実施例８（２）で得られた熱変性ＢＳＡセンサーチップと、実施例７（３）と同様にして得られた各ペプチド溶液とを用い、実施例１と同様の操作を行ない、解離速度定数ｋoff（第１情報）、最大層厚変化量（第２情報）および解離様式の種類（第３情報）を取得した。その結果、ペプチドの種類に応じて、第１情報、第２情報および第３情報のそれぞれが異なっていた。これらの結果から、熱変性ＢＳＡセンサーチップを用いることにより、標的ペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
（５）ペプチドマップの生成
実施例８（４）で得られた第１〜第３情報に基づき、複数種類の既知ペプチド〔ＡＣＴＨ２４、ＡＢ４０、ＳＡ２１、ダイノルフィンＡ、キニノゲン、ＩＴＩＨ４、フィブリノゲンおよびグルカゴン〕のペプチドマップを作成した。その結果を図１４（Ｂ）に示す。図中、白丸は単調様式、黒丸は複相様式を示す。
図１４（Ｂ）に示されるように、熱変性ＢＳＡセンサーチップを用いて得られたペプチドマップでは、複数種類の既知ペプチドのそれぞれが区別可能に分離してプロットされていることがわかる。したがって、熱変性ＢＳＡセンサーチップを用いて得られたペプチドマップによれば、容易にペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
以上の結果から、ペプチドと結合するタンパク質が基板に固定化された固相担体からの標的ペプチドの解離速度定数ｋoff（第１情報）、固相担体の最大層厚変化量（第２情報）および標的ペプチドの解離様式の種類（第３情報）を用いることにより、例えば、質量分析計のように操作が複雑な装置などを用いなくても、簡便に標的ペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
（実施例９）
表５に示される複数種類のペプチドを用い、実施例1と同様の操作を行い、複数種類のペプチドの解離速度定数ｋoff（第1情報）、最大層厚変化量（第2情報）および解離様式の種類（第3情報）を取得した。なお、表５中、「ＩＳ １３ｍｅｒ」とは、ＨＳＡのアミノ酸配列の２３７〜２４９番目のフラグメントである。「ＥＬＮ １１ｍｅｒ」とは、エラスチンのアミノ酸配列の５４８〜５５８番目のフラグメントである。

各ペプチドの解離速度定数ｋoff、最大層厚変化量Δλ、およびｂ値を表６に示す。
表６に示された結果から、様々なアミノ酸残基数のペプチドについて解離速度定数ｋoff、最大層厚変化量Δλ、およびｂ値を測定・算出することができることがわかる。これらの結果から、未知の標的ペプチドの第１〜第３情報を取得した場合、表６に示される値と比較することにより、簡便に標的ペプチドの種類を判定することができることが示唆される。
１０ 判定装置
１１ コンピュータシステム
１１ａ コンピュータ本体
１１ｂ 入力部
１１ｃ 表示部
１３ 測定部
５０ 可搬型記録媒体
１０１ 取得部
１０２ 記憶部
１０３ 制御部
１０５ 出力部
１１３ ハードディスク
１１４ 入出力インターフェイス
１１５ 読出装置
１１６ 通信インターフェイス
１１７ 画像出力インターフェイス
１１８ バス
配列番号：９は、Ａｒｇデカペプチドの配列である。
配列番号：１０は、Ｈｉｓエイコサペプチドの配列である。
配列番号：１８は、Ｈｉｓデカペプチドの配列である。
配列番号：１８は、Ｌｙｓデカペプチドの配列である。
配列番号：２０は、Ｇｌｕデカペプチドの配列である。

Claims (15)

  1. 被検試料に含まれる標的ペプチドの第１〜第３情報を取得する取得部と、
    既知のペプチドを含む標準試料を用いて取得された当該既知ペプチドの第１〜第３情報を予め記憶する記憶部と、
    前記取得部において取得された前記標的ペプチドの第１〜第３情報と、予め前記記憶部に記憶された前記既知ペプチドの第１〜第３情報とを比較し、前記標的ペプチドが前記既知ペプチドであるか否かを判定する制御部と、を備え、
    前記第１情報が、ペプチドと結合するタンパク質を介して前記標的ペプチドが支持体に固定化された固相担体において、前記タンパク質から前記標的ペプチドが解離する際の解離速度定数であり、
    前記第２情報が、前記支持体上の層厚の変化量の最大値であり、かつ、
    前記第３情報が、ペプチドと前記タンパク質との解離様式が、ペプチドとタンパク質との解離方法が実質的に１種類の態様である単調様式およびペプチドとタンパク質との解離方法が複数種類の態様である複相様式のいずれであるかについての情報である、標的ペプチドの種類の判定装置。
  2. 前記記憶部が複数種類の既知ペプチドの第１〜第３情報を記憶しており、
    前記制御部が、前記標的ペプチドの第１〜第３情報と、前記複数種類の既知ペプチドの第１〜第３情報とをそれぞれ比較し、得られた比較結果に基づいて前記標的ペプチドが前記複数種類の既知ペプチドのうちのいずれであるか、または前記複数種類の既知ペプチドのいずれにも該当しないと判定する、請求項１に記載の判定装置。
  3. 表示部をさらに備えており、
    前記制御部が、前記標的ペプチドの第１〜第３情報および前記複数種類の既知ペプチドの第１〜第３情報を示すグラフと、前記標的ペプチドの判定結果とを含む画面情報を生成し、前記画面情報を前記表示部に出力し、
    前記表示部は、前記画面情報に基づいて、前記グラフと前記判定結果を表示する、請求項２に記載の判定装置。
  4. 前記第１〜第３情報を得るための測定部をさらに備えている、請求項１〜３のいずれかに記載の判定装置。
  5. 標的ペプチドの種類を判定するためにコンピュータを、
    被検試料に含まれる前記標的ペプチドの第１〜第３情報を取得する取得手段、
    既知ペプチドを含む標準試料を用いて取得された当該既知ペプチドの第１〜第３情報を予め記憶する記憶手段、および
    前記取得部において取得された前記標的ペプチドの第１〜第３情報と、予め前記記憶部に記憶された前記既知ペプチドの第１〜第３情報とを比較し、前記標的ペプチドが前記既知ペプチドであるか否かを判定する制御手段
    として機能させ、
    前記第１情報が、ペプチドと結合するタンパク質を介して前記標的ペプチドが支持体に固定化された固相担体において、前記タンパク質から前記標的ペプチドが解離する際の解離速度定数であり、
    前記第２情報が、前記支持体上の層厚の変化量の最大値であり、かつ、
    前記第３情報が、ペプチドと前記タンパク質との解離様式が、ペプチドとタンパク質との解離方法が実質的に１種類の態様である単調様式およびペプチドとタンパク質との解離方法が複数種類の態様である複相様式のいずれであるかについての情報である、標的ペプチドの種類判定プログラム。
  6. （ａ）ペプチドと結合するタンパク質が支持体に固定化されたタンパク質固定化担体に、前記標的ペプチドを含む被検試料を接触させることにより、前記標的ペプチドと前記タンパク質との複合体を前記支持体上に形成させた固相担体を調製する工程、
    （ｂ）前記タンパク質に標的ペプチドが結合する際の前記タンパク質固定化担体の支持体上の層厚の変化、前記タンパク質から標的ペプチドが解離する際の前記固相担体の支持体上の層厚の変化またはこれらの両方を測定することにより、支持体上の層厚の変化量の最大値を取得する工程、
    （ｃ）前記固相担体の支持体上の層厚の変化を測定することにより、前記タンパク質から前記標的ペプチドが解離する際の標的ペプチドの解離速度定数を取得する工程、
    （ｄ）前記標的ペプチドと前記タンパク質との解離様式が、ペプチドとタンパク質との解離方法が実質的に１種類の態様である単調様式およびペプチドとタンパク質との解離方法が複数種類の態様である複相様式のいずれであるかを判別する工程、
    （ｅ）前記標的ペプチドの解離速度定数、前記層厚の変化量の最大値および前記解離様式と、既知ペプチドを用いて予め前記標的ペプチドと同様に測定して得られた解離速度定数、層厚変化量の最大値および解離様式とを比較する工程、および
    （ｆ）前記工程（ｅ）で比較結果に基づいて前記標的ペプチドが前記既知ペプチドであるか否かを判定する工程
    を含む、標的ペプチドの種類の判定方法。
  7. 前記固相担体の層厚変化の測定が、反射干渉分光法によって行なわれる、請求項６に記載の方法。
  8. 前記工程（ｄ）において、前記解離様式の判別が、層厚変化量が最大値を示す時間以降のセンサグラムから最小二乗法によって求められた近似曲線を表わす式の係数に基づいて行われる、請求項６または７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記近似曲線を表わす式が、下記式（Ｉ）：

    （式中、Δλは層厚変化量、ａ、ｂ、ｋ1およびｋ2はカーブフィッティングで定まる任意の数、ｔは経過時間を示す）
    で表される式である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記工程（ｄ）において、前記式（Ｉ）におけるｂ値が、解離様式を単調様式および複相様式に分けるための所定の閾値よりも小さい場合には、タンパク質からのペプチドの解離様式が単調様式であり、
    前記式（Ｉ）におけるｂ値が、前記閾値以上である場合には、タンパク質からのペプチドの解離様式が複相様式である、
    と判別する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ｂ値が、０．１０９〜０．５１９の間で設定される、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記支持体が、窒化シリコン基板である、請求項６〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記タンパク質が、血液中に存在するタンパク質である、請求項６〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. 前記タンパク質が、アルブミン、トランスサイレチンおよびグロブリンのうちの少なくとも１つである、請求項６〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記工程（ｅ）において、複数種類の既知ペプチドそれぞれの解離速度定数、層厚変化量の最大値および解離様式を用い、
    前記工程（ｆ）において、前記（ｅ）で得られた比較結果に基づいて前記標的ペプチドが前記複数種類の既知ペプチドのうちのいずれであるか、または前記複数種類の既知ペプチドのいずれにも該当しないと判定する、請求項６〜１４のいずれかに記載の方法。
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