JP6675167B2 - ペプチドの遊離方法及び回収方法、並びにペプチド遊離剤及び試薬キット - Google Patents
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Description
Rは−H又は−OHである。)
又は
本実施形態に係るペプチドの遊離方法(以下、単に「遊離方法」ともいう)は、アルブミンと結合して複合体を形成しているペプチドのうち、加熱処理によっても遊離せずに、該加熱処理によって生じたアルブミンの自己会合体に取り込まれたままのペプチドを遊離させる。よって、本実施形態の遊離方法は、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させる方法である。なお、本実施形態の遊離方法において行われる各種の工程及び作業は、すべてインビトロで行われる。
Rは−H又は−OHである。)
又は
本実施形態の遊離方法では、遊離させたペプチドを回収する工程をさらに含んでもよい。すなわち、本発明の範囲には、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させて回収する方法も含まれる(以下、単に「回収方法」ともいう)。なお、本実施形態の回収方法において行われる各種の工程及び作業は、すべてインビトロで行われる。
本発明の範囲には、上記のペプチドの遊離方法及び回収方法に用いられるペプチド遊離剤も含まれる(以下、「遊離剤」ともいう)。すなわち、本実施形態の遊離剤は、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させるための遊離剤である。
Rは−H又は−OHである。)
又は
本発明の範囲には、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させるペプチド遊離剤を調製するための試薬キットも含まれる(以下、「試薬キット」ともいう)。
Rは−H又は−OHである。)
又は
実施例1では、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させるための遊離剤として用いることができる化合物を探索した。具体的には、種々の化合物を含む添加剤を用いて、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させて回収可能であるかを検討した。アルブミンの自己会合体に取り込まれやすいペプチドとして、2種類の酸性ペプチドを用いた。
・添加剤
添加剤として、100 mM CAPS水溶液(pH 11.0)、超純水(18 MΩ・cm)(以下、「DW」とも呼ぶ)、及びトリス-リン酸混合緩衝液(以下、「TBPB」とも呼ぶ)を用いた。なお、CAPS水溶液は、CAPS(製品No.343-00484:同仁化学研究所製)を最終濃度100 mMとなるように水に溶解し、NaOHを用いてpHを11.0に調整して得た。DWは、ELGA PURELAB ultra(ORGANO社製)により調製した。TBPBの組成は、Tris・HCl(pH 7.0、最終濃度100 mM)、リン酸ナトリウム(最終濃度0.4 mM)及びNaCl(最終濃度6mM)である。また、CAPS水溶液、DW及びTBPBのそれぞれに、ジチオスレイトール(DTT)を最終濃度0.1 mMとなるように添加して、DTT含有添加剤も調製した。
ペプチドとして、酸性ペプチドのオキシトシン及びC-ペプチドをテトラメチルローダミン(TMR)で蛍光標識したTMR-オキシトシン(pI=5.51、Cys残基2個:株式会社スクラム)、及びTMR-C-ペプチド(pI=3.45、Cys残基なし:株式会社バイオロジカ)を用いた。なお、オキシトシン及びC-ペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
・オキシトシン:CYIQNCPLG (配列番号1)
・C-ペプチド:EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ (配列番号2)
健常者由来の全血(ProMedDx社から購入)0.3 mlを、CAPS水溶液(pH 11.0)で5倍に希釈した。得られた希釈液に、TMR-オキシトシン又はTMR-C-ペプチドを最終濃度が2μMとなるように添加して、ペプチドと血中タンパク質(アルブミン)との複合体を含む液体試料を調製した。
上記のペプチドと血中タンパク質との複合体を含む液体試料に、ZnCl2(ナカライテスク株式会社)を最終濃度が100 mMとなるように添加した。得られた混合物の一部を取り、対照サンプルとして保存した。残りの混合物を10 mL容のガラス試験管に移し、次にテフロン(登録商標)製の試験管用耐圧密封ホルダー(マイルストーンゼネラル株式会社)にて封じてから、マイクロ波照射装置(MultiSYNTH型、マイルストーンゼネラル株式会社)を用いて、室温(25℃)から100℃まで30秒間で昇温し、その後100℃から160℃まで1分間で昇温することにより加熱処理を行った。加熱処理後の冷却は、前記のマイクロ波照射装置に接続されたエアコンプレッサー(YC-3R型、株式会社八重崎空圧)から圧縮空気を前記の耐圧密封ホルダーに吹き付けることで行った。加熱処理後の液体試料中には、アルブミンの自己会合体を含む不溶性画分(以下、単に「不溶性画分」ともいう)が生じた。
加熱処理後の液体試料から上清を回収し、対照サンプルとして保存した。不溶性画分を、スパーテルを用いて2mL容のマイクロチューブ(eppendorf社製)に移した。マイクロチューブに100 mM CAPS水溶液、超純水又はTBPBを添加し、マイクロペッスルを用いて不溶性画分を1分間ホモジナイズした。ホモジナイズした不溶性画分を15,000 rpmで5分間遠心して、上清を得た。得られた上清をサンプルとして保存した。
上記の各サンプルを、SDS-PAGEとそれに続く蛍光イメージング及び銀染色によって分析した。具体的な操作は次のとおりである。まず、60%(w/w)グリセロール溶液とサンプルとを混合し、ニューページ4-12%ビス-トリスゲル及びニューページMES SDSランニングバッファー(いずれもライフテクノロジーズジャパン株式会社)を用いて200V(定電圧)で30分間、電気泳動を行った。泳動槽にはエクセルシュアロックミニセル(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)を用い、電源装置にはパワーステーション1000XP(アトー株式会社)を用いた。電気泳動後のゲルを蛍光イメージャ(Pharos FX Molecular Imager型、バイオラッドラボラトリーズ株式会社)により分析して、TMR-オキシトシン及びTMR-C-ペプチドを検出した。次に、蛍光イメージャから取り出したゲルを、Ez Stain silver(製品No.AE-1360、アトー株式会社製)を用いて銀染色し、サンプルに含まれる夾雑タンパクの検出を行った。結果を図1に示す。
図1に示されるゲルの写真において、各レーンにアプライしたサンプルは、以下のとおりである。「M」は、サイズマーカーをアプライしたレーンである。
レーン1:加熱処理していない、TMR-オキシトシンとアルブミンとの複合体を含む液体試料を遠心分離して得た上清。
レーン2:TMR-オキシトシンとアルブミンとの複合体を含む液体試料を加熱処理して得た上清。
レーン3:TMR-オキシトシンを取り込んだアルブミンの自己会合体と、CAPS水溶液とを接触させ、ホモジナイズして得た上清。
レーン4:TMR-オキシトシンを取り込んだアルブミンの自己会合体と、DTT含有CAPS水溶液とを接触させ、ホモジナイズして得た上清。
レーン5:加熱処理していない、TMR-C-ペプチドとアルブミンとの複合体を含む液体試料を遠心分離して得た上清。
レーン6:TMR-C-ペプチドとアルブミンとの複合体を含む液体試料を加熱処理して得た上清。
レーン7:TMR-C-ペプチドを取り込んだアルブミンの自己会合体と、CAPS水溶液とを接触させ、ホモジナイズして得た上清。
レーン8:TMR-C-ペプチドを取り込んだアルブミンの自己会合体と、DTT含有CAPS水溶液とを接触させ、ホモジナイズして得た上清。
レーン9:TMR-オキシトシン標品。
レーン10:TMR-C-ペプチド標品。
レーン12:TMR-オキシトシンを取り込んだアルブミンの自己会合体と、DTT含有DWとを接触させ、ホモジナイズして得た上清。
レーン13:TMR-オキシトシンを取り込んだアルブミンの自己会合体と、TBPBとを接触させ、ホモジナイズして得た上清。
レーン14:TMR-オキシトシンを取り込んだアルブミンの自己会合体と、DTT含有TBPBとを接触させ、ホモジナイズして得た上清。
レーン15:TMR-C-ペプチドを取り込んだアルブミンの自己会合体と、DWとを接触させ、ホモジナイズして得た上清。
レーン16:TMR-C-ペプチドを取り込んだアルブミンの自己会合体と、DTT含有DWとを接触させ、ホモジナイズして得た上清。
レーン17:TMR-C-ペプチドを取り込んだアルブミンの自己会合体と、TBPBとを接触させ、ホモジナイズして得た上清。
レーン18:TMR-C-ペプチドを取り込んだアルブミンの自己会合体と、DTT含有TBPBとを接触させ、ホモジナイズして得た上清。
レーン19:TMR-オキシトシン標品とTMR-C-ペプチド標品の混合物。
実施例2では、CAPSを種々の濃度で含む添加剤を用いて、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させて回収可能であるかを検討して、遊離剤として適切なCAPS濃度の範囲を決定した。
・添加剤
添加剤として、CAPS濃度が0.1、1、10、20、50、80、100、500及び1000 mMのCAPS水溶液(pH 11.0)を用いた。これらのCAPS水溶液は、3-(シクロヘキシルアミノ)-1-プロパンスルホン酸(製品No.343-00484:同仁化学研究所製)を上記の濃度となるように水に溶解し、NaOHを用いてpHを11.0に調整して得た。また、これらのCAPS水溶液に、DTTを最終濃度0.1 mMとなるように添加して、DTT含有CAPS水溶液(pH 11.0)も調製した。さらに、100 mM CAPS水溶液(pH 5.7)を調製した。
ペプチドとして、合成ペプチドSA21をTMRで標識したTMR-SA21(株式会社バイオロジカ)を用いた。SA21は自身のアミノ酸配列内にCys残基を2つ有する酸性ペプチド(pI=4.11)である。なお、SA21は、アルブミンと最も高い親和性で結合して、強固で安定な複合体を形成することが知られている(特許文献1参照)。SA21のアミノ酸配列は、DDEWLCGWRPLCIDEILR (配列番号3)である。
健常者由来の全血(ProMedDx社から購入)0.3 mlを、CAPS水溶液(pH 11.0)で5倍に希釈した。得られた希釈液に、TMR-SA21を最終濃度が2μMとなるように添加して、ペプチドと血中タンパク質(アルブミン)との複合体を含む液体試料を調製した。
上記のペプチドと血中タンパク質との複合体を含む液体試料に、ZnCl2(ナカライテスク株式会社)を最終濃度が100 mMとなるように添加した。得られた混合物を10 mL容のガラス試験管に移し、実施例1と同様にして加熱処理及び冷却処理を行った。加熱処理後の液体試料中には、アルブミンの自己会合体である不溶性画分が生じた。
加熱処理後の液体試料から不溶性画分を、スパーテルを用いて2mL容のマイクロチューブ(eppendorf社製)に移した。マイクロチューブに上記のCAPS水溶液を添加し、マイクロペッスルを用いて不溶性画分を1分間ホモジナイズした。ホモジナイズした不溶性画分を15,000 rpmで5分間遠心して、上清を得た。得られた上清をサンプルとして保存した。
上記の各サンプルを、実施例1と同様にして、SDS-PAGEとそれに続く蛍光イメージング及び銀染色を行った。電気泳動後のゲルの蛍光イメージング及び銀染色の結果を、図2及び図3に示す。図2中、蛍光イメージングしたゲルのレーン11及び20の「*」が付されたバンドはTMR-SA21の単量体のバンドを示し、「**」が付されたバンドは、TMR-SA21の多量体のバンドを示す。
(式中、S1はバックグラウンドのデンシトメトリ値、
S2はTMR-SA21標品のデンシトメトリ値、
S3は目的レーンのデンシトメトリ値、
W1はバックグラウンドのデンシトメトリ定量時のスリット幅、
W2はTMR-SA21標品のデンシトメトリ定量時のスリット幅、
W3は目的レーンのデンシトメトリ定量時のスリット幅である。)
(式中、S1はバックグラウンドのデンシトメトリ値、
S2はマーカーのデンシトメトリ値、
S3は目的レーンのデンシトメトリ値、
W1はバックグラウンドのデンシトメトリ定量時のスリット幅、
W2はマーカーのデンシトメトリ定量時のスリットの幅、
W3は目的レーンのデンシトメトリ定量時のスリット幅である。)
回収効率=収率の相対値(Y)/不純物の相対量の相対値(D)・・・式3
図2及び表1に示されるように、CAPS濃度が0.1 mM〜50 mMの範囲では、SA21ペプチドは不溶性画分から遊離されなかった。また、図2に示されるように、CAPS濃度が0.1 mM〜50 mMである場合、添加剤に還元剤のDTTをさらに加えても、SA21ペプチドは不溶性画分から遊離されなかった。これに対し、CAPS濃度が80 mM〜1000 mMの範囲では、不溶性画分からSA21ペプチドを遊離できた。一方、夾雑物はほとんど遊離されなかったので、回収されたSA21ペプチドの純度は高いと考えられる。よって、遊離剤として適切なCAPS濃度の範囲は、80 mM〜1000 mMであることが示された。また、図2に示されるように、CAPS濃度が80 mM〜1000 mMである場合、添加剤にDTTをさらに加えても、不溶性画分からSA21ペプチドを遊離及び回収できた。一方、図3に示されるように、CAPS水溶液のpHが5.7であるとき、CAPS濃度が100 mMであっても、不溶性画分からはSA21ペプチドはほとんど遊離させることができなかった。pHが中性よりも低い場合、ペプチドの回収効率が低下することが示唆された。
CAPSに類似する構造を有するCHESを種々の濃度で含む添加剤を用いて、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させて回収可能であるかを検討した。また、遊離剤として適切なCHES濃度の範囲を決定した。
・添加剤
添加剤として、CHES濃度が0.1、1、10、50、80、100、500及び1000 mMのCHES水溶液(pH 10.0)を用いた。これらのCHES水溶液は、2-(シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸(製品No.340-08331:同仁化学研究所製)を上記の濃度となるように水に溶解し、NaOHを用いてpHを10.0に調整して得た。また、これらのCHES水溶液に、DTTを最終濃度0.1 mMとなるように添加して、DTT含有CHES水溶液(pH 10.0)も調製した。
実施例2と同じTMR-SA21(株式会社バイオロジカ)を用いた。
・液体試料
実施例2と同様にして、健常者由来の全血の希釈液にTMR-SA21を最終濃度2μMで含むように添加して、液体試料を調製した。
実施例2と同様にして、液体試料の加熱処理及び冷却処理を行い、液体試料中にアルブミンの自己会合体である不溶性画分を生成させた。そして、添加剤として上記のCHES水溶液を用いたこと以外は実施例2と同様にして、不溶性画分をホモジナイズして上清を得た。得られた上清をサンプルとして保存した。
上記の各サンプルを、実施例1と同様にして、SDS-PAGEとそれに続く蛍光イメージング及び銀染色を行った。電気泳動後のゲルの蛍光イメージング及び銀染色の結果を、図4に示す。図4中、蛍光イメージングしたゲルのレーン11及び18の「*」が付されたバンドはTMR-SA21の単量体のバンドを示し、「**」が付されたバンドは、TMR-SA21の多量体のバンドを示す。また、実施例2と同様にして、蛍光イメージング及び銀染色の結果から、収率の相対値(Y)、不純物の相対量の相対値(D)、及び回収効率を算出した。算出した値を、表2に示す。
図4及び表2に示されるように、CHES濃度が0.1 mM〜50 mMの範囲では、SA21ペプチドは不溶性画分から遊離されていないことがわかる。また、図4に示されるように、CHES濃度が0.1 mM〜50 mMである場合、添加剤に還元剤のDTTをさらに加えても、SA21ペプチドは不溶性画分から遊離されなかった。これに対し、CHES濃度が80 mM〜1000 mMの範囲では、不溶性画分からSA21ペプチドを遊離及び回収できた。よって、遊離剤として適切なCHES濃度の範囲は、80 mM〜1000 mMであることが示された。また、図4に示されるように、CHES濃度が80 mM〜1000 mMである場合、添加剤にDTTをさらに加えても、不溶性画分からSA21ペプチドを効率よく遊離及び回収できた。
CAPSに類似する構造を有するCAPSOを種々の濃度で含む添加剤を用いて、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させて回収可能であるかを検討した。また、遊離剤として適切なCAPSO濃度の範囲を決定した。
・添加剤
添加剤として、CAPSO濃度が50、80、100、500及び1000 mMのCAPSO水溶液(pH 10.2)を用いた。これらのCAPSO水溶液は、3-(シクロヘキシルアミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(製品No.C2278-100G、シグマアルドリッチ社製)を上記の濃度となるように水に溶解し、NaOHを用いてpHを10.2に調整して得た。
実施例2と同じTMR-SA21(株式会社バイオロジカ)を用いた。
・液体試料
実施例2と同様にして、健常者由来の全血の希釈液にTMR-SA21を最終濃度2μMで含むように添加して、液体試料を調製した。
実施例2と同様にして、液体試料の加熱処理及び冷却処理を行い、液体試料中にアルブミンの自己会合体である不溶性画分を生成させた。そして、添加剤として上記のCAPSO水溶液を用いたこと以外は実施例2と同様にして、不溶性画分をホモジナイズして上清を得た。得られた上清をサンプルとして保存した。
上記の各サンプルを、実施例1と同様にして、SDS-PAGEとそれに続く蛍光イメージング及び銀染色を行った。電気泳動後のゲルの蛍光イメージング及び銀染色の結果を、図5に示す。図5中、蛍光イメージングしたゲルのレーン5の「*」が付されたバンドはTMR-SA21の単量体のバンドを示し、「**」が付されたバンドは、TMR-SA21の多量体のバンドを示す。また、実施例2と同様にして、蛍光イメージング及び銀染色の結果から、収率の相対値(Y)、不純物の相対量の相対値(D)、及び回収効率を算出した。算出した値を、表3に示す。
図5及び表3に示されるように、CAPSO濃度が50 mMの場合では、SA21ペプチドは不溶性画分からほとんど遊離されなかった。これに対し、CAPSO濃度が80 mM〜1000 mMの範囲では、不溶性画分からSA21ペプチドを遊離及び回収できた。よって、遊離剤として適切なCAPSO濃度の範囲は、80 mM〜1000 mMであることが示された。
CAPSに類似する構造を有するCABSを種々の濃度で含む添加剤を用いて、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させて回収可能であるかを検討した。また、遊離剤として適切なCABS濃度の範囲を決定した。
・添加剤
添加剤として、CABS濃度が10、80、100、500及び1000 mMのCABS水溶液(pH 11.5)を用いた。これらのCABS水溶液は、4-(シクロヘキシルアミノ)-1-ブタンスルホン酸(製品No.C5580-25G、シグマアルドリッチ社製)を上記の濃度となるように水に溶解し、NaOHを用いてpHを11.5に調整して得た。
実施例2と同じTMR-SA21(株式会社バイオロジカ)を用いた。
・液体試料
実施例2と同様にして、健常者由来の全血の希釈液にTMR-SA21を最終濃度2μMで含むように添加して、液体試料を調製した。
実施例2と同様にして、液体試料の加熱処理及び冷却処理を行い、液体試料中にアルブミンの自己会合体である不溶性画分を生成させた。そして、添加剤として上記のCABS水溶液を用いたこと以外は実施例2と同様にして、不溶性画分をホモジナイズして上清を得た。得られた上清をサンプルとして保存した。
上記の各サンプルを、実施例1と同様にして、SDS-PAGEとそれに続く蛍光イメージング及び銀染色を行った。電気泳動後のゲルの蛍光イメージング及び銀染色の結果を、図6に示す。図6中、蛍光イメージングしたゲルのレーン7の「*」が付されたバンドはTMR-SA21のバンドを示す。なお、レーン1には、加熱処理していない液体試料を遠心分離して得た上清をアプライし、レーン2には、液体試料を加熱処理して得た上清をアプライした。実施例2と同様にして、蛍光イメージング及び銀染色の結果から、収率の相対値(Y)、不純物の相対量の相対値(D)、及び回収効率を算出した。算出した値を、表4に示す。
図6及び表4に示されるように、CABS濃度が10 mMの場合では、SA21ペプチドは不溶性画分から遊離されなかった。これに対し、CABS濃度が80 mM〜1000 mMの範囲では、不溶性画分からSA21ペプチドを遊離及び回収できた。よって、遊離剤として適切なCABS濃度の範囲は、80 mM〜1000 mMであることが示された。
実施例6では、CAPSとは異なる構造を有する化合物を含む添加剤を用いて、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させて回収可能であるかを検討した。
・添加剤
添加剤として、100 mM CHAPS水溶液(pH 7.6又は10.8)、DW(18 MΩ・cm)、TBPB(pH 7.0又は11.2)、100 mM ADA水溶液(pH 7.4又は10.5)、100 mM ビシン水溶液(pH 9.0又は10.3)及び5mM水酸化ナトリウム水溶液を用いた。また、対照として、100 mM CAPS水溶液(pH 11.0)及び100 mM CHES水溶液(pH 10.0)を用いた。なお、CHAPS水溶液は、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート(製品No.C008、同仁化学研究所製)を最終濃度100 mMとなるように水に溶解し、NaOHを用いてpHを7.6又は10.8に調整して得た。ADA水溶液は、N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸(製品No.349-08281、同仁化学研究所製)を最終濃度100 mMとなるように水に溶解し、NaOHを用いてpHを7.4又は10.5に調整して得た。ビシン水溶液は、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン(製品No.349-08301、同仁化学研究所製)を最終濃度100 mMとなるように水に溶解し、NaOHを用いてpHを9.0又は10.3に調整して得た。また、上記の各添加剤に、DTTを最終濃度0.1 mMとなるように添加して、DTT含有添加剤も調製した。
実施例2と同じTMR-SA21(株式会社バイオロジカ)を用いた。
・液体試料
実施例2と同様にして、健常者由来の全血の希釈液にTMR-SA21を最終濃度2μMで含むように添加して、液体試料を調製した。
実施例2と同様にして、液体試料の加熱処理及び冷却処理を行い、液体試料中にアルブミンの自己会合体である不溶性画分を生成させた。そして、上記の添加剤を用いたこと以外は実施例2と同様にして、不溶性画分をホモジナイズして上清を得た。得られた上清をサンプルとして保存した。
上記の各サンプルを、実施例1と同様にして、SDS-PAGEとそれに続く蛍光イメージング及び銀染色を行った。電気泳動後のゲルの蛍光イメージング及び銀染色の結果を、図7に示す。なお、図7は、100 mM CHAPS水溶液(pH 7.6)、DW、TBPB(pH 7.0)、100 mM ADA水溶液(pH 7.4)、100 mM ビシン水溶液(pH 9.0)、100 mM CAPS水溶液(pH 11.0)及び100 mM CHES水溶液(pH 10.0)を用いて処理したサンプルを泳動したゲルの写真である。図7中、蛍光イメージングしたゲルのレーン7及び16の「*」が付されたバンドはTMR-SA21の単量体のバンドを示し、「**」が付されたバンドは、TMR-SA21の多量体のバンドを示す。実施例2と同様にして、蛍光イメージング及び銀染色の結果から、収率の相対値(Y)、不純物の相対量の相対値(D)、及び回収効率を算出した。算出した値を、表5に示す。
図7及び表5より、添加剤としてCHAPS、TBPB及びDWを用いた場合、不溶性画分からSA21ペプチドを遊離できなかった。また、水酸化ナトリウム水溶液、並びにpHを10以上に調製したCHAPS及びTBPBを用いてもSA21ペプチドを遊離できなかった。よって、不溶性画分からのペプチドの遊離には、pHではなく遊離剤の構造が重要であることが示唆された。添加剤としてADAを用いた場合、不溶性画分からSA21ペプチドを遊離できたが、夾雑物も多量に遊離されていた。よって、ADA水溶液により遊離されたペプチドは、純度が低いと考えられる。一方、添加剤としてビシン水溶液を用いた場合、不溶性画分からSA21ペプチドを遊離及び回収できた。また、ビシン水溶液はpHが高いほうが、夾雑物の遊離が少なく、SA21ペプチドの回収効率がより向上していた。よって、100 mMビシン水溶液(pH 9.0又は10.3)は、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させるための遊離剤として使用できることがわかった。
実施例7では、CAPSに類似する構造を有するN-シクロヘキシルスルファミン酸、及び、CAPSと同様にアミノ基及びスルホン酸基を有するタウリンを含む添加剤を用いて、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させて回収可能であるかを検討した。
・添加剤
添加剤として、100 mM N-シクロヘキシルスルファミン酸水溶液(pH 12.5)及び100 mMタウリン水溶液(pH 9.5)を用いた。また、対照として、100 mM CAPS水溶液(pH 11.0)及び100 mM ADA水溶液(pH 7.4)を用いた。なお、N-シクロヘキシルスルファミン酸水溶液は、N-シクロヘキシルスルファミン酸を最終濃度100 mMとなるように水に溶解して、NaOHでpHを12.5に調整して得た。タウリン水溶液は、2-アミノエタンスルファミン酸(製品No.A12403、Alfa Aesar社製)を最終濃度100 mMとなるように水に溶解して、NaOHでpHを9.5に調整して得た。
実施例2と同じTMR-SA21(株式会社バイオロジカ)を用いた。
・液体試料
実施例2と同様にして、健常者由来の全血の希釈液にTMR-SA21を最終濃度2μMで含むように添加して、液体試料を調製した。
実施例2と同様にして、液体試料の加熱処理及び冷却処理を行い、液体試料中にアルブミンの自己会合体である不溶性画分を生成させた。そして、上記の添加剤を用いたこと以外は実施例2と同様にして、不溶性画分をホモジナイズして上清を得た。得られた上清をサンプルとして保存した。
上記の各サンプルを、実施例1と同様にして、SDS-PAGEとそれに続く蛍光イメージング及び銀染色を行った。電気泳動後のゲルの蛍光イメージング及び銀染色の結果を、図8に示す。図8中、蛍光イメージングしたゲルのレーン7の「*」が付されたバンドはTMR-SA21のバンドを示す。なお、レーン1には、加熱処理していない液体試料を遠心分離して得た上清をアプライし、レーン2には、液体試料を加熱処理して得た上清をアプライした。実施例2と同様にして、蛍光イメージング及び銀染色の結果から、収率の相対値(Y)、不純物の相対量の相対値(D)、及び回収効率を算出した。算出した値を、表6に示す。
図8及び表6より、添加剤としてタウリンを用いた場合、不溶性画分からSA21ペプチドを遊離できなかった。一方、添加剤としてN-シクロヘキシルスルファミン酸を用いた場合、不溶性画分からSA21ペプチドを遊離及び回収できた。よって、100 mM N-シクロヘキシルスルファミン酸水溶液(pH 12.5)は、アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させるための遊離剤として使用できることがわかった。
実施例8では、ペプチドを取り込んだアルブミンの自己会合体と遊離剤との接触においてホモジナイズを行わずに、該自己会合体からのペプチドの遊離及び回収を試みた。
・添加剤
添加剤として、100 mM CAPS水溶液(pH 11.0)、100 mM ADA水溶液(pH 7.4)、100 mM ビシン水溶液(pH 9.0)及びTBPB(pH 7.0)を用いた。
実施例2と同じTMR-SA21(株式会社バイオロジカ)を用いた。
・液体試料
実施例2と同様にして、健常者由来の全血の希釈液にTMR-SA21を最終濃度2μMで含むように添加して、液体試料を調製した。
実施例2と同様にして、液体試料の加熱処理及び冷却処理を行い、液体試料中にアルブミンの自己会合体である不溶性画分を生成させた。加熱処理後の液体試料から不溶性画分を、スパーテルを用いて2mL容のマイクロチューブ(eppendorf社製)に移した。マイクロチューブに上記の添加剤を加え、室温にて2日間静置した。2日後、不溶性画分を15,000 rpmで5分間遠心し、分離された沈殿物及び上清を撮影した。写真を図9Aに示す。そして、得られた上清をサンプルとして保存した。
上記の各サンプルを、実施例1と同様にして、SDS-PAGEとそれに続く蛍光イメージング及び銀染色を行った。電気泳動後のゲルの蛍光イメージング及び銀染色の結果を、図9Bに示す。図9B中、「FL」は蛍光イメージングを示し、「Ag」は銀染色を示す。また、「*」が付されたバンドはTMR-SA21のバンドを示す。
図9Aに示されるように、CAPS、ビシン又はTBPBと不溶性画分とを接触させた場合、得られた上清は清澄であった。一方、図9Aに示されるように、ADAを用いた場合、得られた上清はかなり濁っていた。図9Bを参照すると、CAPSを用いた場合、上清には、SA21が遊離していたが、夾雑物はほとんど見られなかった(レーン1及び2参照)。ADAを用いた場合、上清には、SA21が遊離していたが、夾雑物も多量に含まれていた(レーン3及び4参照)。ビシンを用いた場合は、上清には、SA21が遊離していたが、少量の夾雑物も認められた(レーン5及び6参照)。TBPBを用いた場合、上清には、SA21も夾雑物も見られなかった(レーン7及び8参照)。これらのことから、遊離剤としてCAPS又はビシンを用いる場合、ホモジナイズや撹拌などの物理的処理を行わなくても、アルブミンの自己会合体からペプチドを遊離できることが示された。一方、TBPBは、不溶性画分からSA21ペプチドを遊離させることができず、また、ADAは、不溶性画分を溶解していることが示された。
22:式(I)又は(II)で表される化合物を収容した容器
33:式(I)又は(II)で表される化合物を溶解するための溶媒を収容した容器
Claims (15)
- ペプチドを取り込んだアルブミンの自己会合体と、以下の式(I)又は(II)で表される化合物を80 mM以上1000 mM以下の濃度で含有し、且つpHがアルカリ性である溶液とを接触させて、前記アルブミンの自己会合体から前記ペプチドを前記溶液中に遊離させる工程を含み、
前記アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドが、システイン残基を含むペプチド、又は酸性ペプチドである、ペプチドの遊離方法。
Rは−H又は−OHである。)
又は
- ペプチドを取り込んだアルブミンの自己会合体と、以下の式(I)又は(II)で表される化合物を80 mM以上1000 mM以下の濃度で含有し、且つpHがアルカリ性である溶液とを接触させて、前記アルブミンの自己会合体から前記ペプチドを前記溶液中に遊離させる工程と、
前記溶液中に遊離した前記ペプチドを回収する工程と
を含み、
前記アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドが、システイン残基を含むペプチド、又は酸性ペプチドである、ペプチドの回収方法。
Rは−H又は−OHである。)
又は
- 前記アルブミンの自己会合体が、ペプチドとアルブミンとの複合体を含む液体試料を加熱処理して形成されたものである請求項1又は2に記載の方法。
- 前記式(I)で表される化合物が、3-(シクロヘキシルアミノ)-1-プロパンスルホン酸(CAPS)、2-(シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸(CHES)、3-(シクロヘキシルアミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、4-(シクロヘキシルアミノ)-1-ブタンスルホン酸(CABS)及びN-シクロヘキシルスルファミン酸から選択される少なくとも1種である請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化合物が、CAPS又はCHESである請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを遊離させる工程が、前記アルブミンの自己会合体と、前記化合物を含む溶液とを撹拌する工程を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドが、生体から採取された生体試料中に存在するペプチドである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生体から採取された生体試料が、血液、血漿又は血清である請求項7に記載の方法。
- 前記アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドが、血液中に存在するバイオマーカーを含む請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- ペプチドとアルブミンとの複合体を含む液体試料を加熱処理してアルブミンの不溶性自己会合体を形成させることにより、前記複合体からペプチドを溶液中に遊離させる工程と、
前記複合体から遊離したペプチドを含む溶液を回収する工程と、
前記加熱処理によって形成された前記アルブミンの自己会合体と、以下の式(I)又は(II)で表される化合物を80 mM以上1000 mM以下の濃度で含有し、且つpHがアルカリ性である溶液とを接触させて、前記アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドを溶液中に遊離させる工程と、
前記アルブミンの自己会合体から遊離したペプチドを含む溶液を回収する工程と
を含み、
前記アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドが、システイン残基を含むペプチド、又は酸性ペプチドである、ペプチドの回収方法。
Rは−H又は−OHである。)
又は
- 前記式(I)又は(II)で表される化合物を含有する溶液のpHが、7.7以上11.1以下である請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- ペプチドを取り込んだアルブミンの自己会合体から前記ペプチドを遊離させるペプチド遊離剤であって、前記アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドが、システイン残基を含むペプチド、又は酸性ペプチドであり、
以下の式(I)又は(II)で表される化合物を80 mM以上1000 mM以下の濃度で含有し、且つpHがアルカリ性であることを特徴とする、ペプチド遊離剤。
Rは−H又は−OHである。)
又は
- pHが7.7以上11.1以下である請求項12に記載のペプチド遊離剤。
- ペプチドを取り込んだアルブミンの自己会合体から前記ペプチドを遊離させるペプチド遊離剤を調製するための試薬キットであって、
以下の式(I)又は(II)で表される化合物と、
前記化合物を溶解するための溶媒と
を含み、
前記化合物と前記溶媒とが混合されたときに、前記化合物の濃度が80 mM以上1000 mM以下であり、且つpHがアルカリ性になるように前記ペプチド遊離剤が調製されることを特徴とし、前記アルブミンの自己会合体に取り込まれたペプチドが、システイン残基を含むペプチド、又は酸性ペプチドである、試薬キット。
Rは−H又は−OHである。)
又は
- 前記ペプチド遊離剤のpHが、7.7以上11.1以下である請求項14に記載の試薬キット。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP2015169198A JP6675167B2 (ja) | 2015-08-28 | 2015-08-28 | ペプチドの遊離方法及び回収方法、並びにペプチド遊離剤及び試薬キット |
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