SE447339B - Forfarande for separation av erytrocytstroma - Google Patents

Description

4> .så \Q å. N ' -1 Kf) Blodplasma från djurarter behandlas med en vattenlösning av akri- nol, innehållande från omkring 0,1% till omkring 5% 2-etoxi-6,9- æuidindümnn-lædntenmrflmdrat nedan kallat akrinol, för utfällning av blodproteiner av annan typ än gamma-globulin. Bland dessa proteiner finns albumin, alfa- och beta-globulin osv. Plasmat befinner sig vid sitt normala pH-värde på omkring 7-8, men det kan justeras till omkring 7,6 genom tillsats av lämpligt reagens, så- som 1N natriumhydroxid, 0,8M natriumvätekarbonat eller 1M natrium- karbonat e!ler 1N HCI eller ättiksyra. Fällningen sker vanligen vid omkring 25OC, fastän högre och lägre temperaturer kan använ- das. Från 3,5 till 5 volymer, företrädesvis omkring 4 volymer 4%-ig vattenlösning av akrinol användes för varje volym plasma.

Fällningen “illåtes bli fullständig genom sedimentering och flocku- lering sedan vätskan fått stå företrädesvis vid en temperatur av omkring 40C från omring 15 minuter till över natten och längre.

Fällningen separeras från den överstående vätskan innehållande gamma-globulin, företrädesvis genom filtrering, dekantering eller centrifugerinq. Fällningen innehållande akrinol-olösliga blodplas- maprotein tvättas med en 0,1-5%-ig vattenlösning av akrinol. Den tvättade fällningen överföres sedan till en lösning av gamma-glo- bulin aktiverad mot antigen från heterolog källa och omröres under några få minuter till åtskilliga timmar vid omkring 4°C till om- kring 40oC, företrädesvis omkring 25°C, så att antiplasmaprotein- antikropparna i lösningen av gamma-globulin absorberas på det fas- ta plasmaproteinet. En tillräcklig mängd gamma-globulin separeran- de medel hålles i suspension så att multifasabsorptionstillstånd föreligger. Det fasta plasmaproteinet med absorberade antiplasma- proteinantikroppar avsepareras, t.ex. genom dekantering, filtre- ring eller centrifugering. Absorptionsförfarandet kan upprepas så många gånger som är nödvändigt för att minska mängden förorenade antikroppar till önskvärd nivå. Mängden fast plasmaprotein erhål- len från 0,01 till 5 eller flera liter plasma användes för att ab- sorbera antiplasma-proteinantikropparna från heterologt reagerat antihumant lymfocyt-gammaglobulin erhållet från en liter plasma.

Denna metod för absorption har den ytterligare fördelen när akri- nol utnyttjas som gamma-globulinseparerande medel, att hepatitis- virus förefaller att utfällas tillsammans med plasmaprotein, vari- 447 539 ekon mö li heten minskas för he.atitisvirusförorenin av den J slutliga produkten.

Framställning av stromat för kontakt med gamma-globulinet sker på i och för sig känt sätt med undantag för en ny förbättring av ett av isolationsstegen, vilket beskrives nedan. Efter upplösning av erytrocyterna och innan gamma-globulinet sättes i kontakt med stro- mat måste menstrum separeras från stromat så effektivt som möjligt.

Tillsatsen av små mängder akrinol till de upplösta erytrocyterna underlättar separationen av stroma från menstruumet och Centrifu- geringar vid relativt låga hastigheter på 2000 varv per minut un- der 10-15 minuter är tillräckliga för separation i jämförelse med eller flera tvättningar och centrifugeringar vid 3000 varv per minut under mer än 30 minuter, vilka tidigare använts. Tillfreds- ställande separation har i verkligheten ofta erhållits genom före- liggande förbättring enbart genom att låta materialet separera över natten i kyla, exempelvis följt av dekantering. Stromat är tillfreds- ställande fritt från hemoglobin när den karakteristiska färgen av den suspenderade vätskan fullständigt försvunnit eller bestämts spektrofotometriskt vid 555 nanometer. Mängden akrinol som använ- des varierar från omkring 1 till omkring 5 g/l samlade erytrocyter, företrädesvis omkring 3-5 g/l.

De förberedande stegen vid framställning av stroma är i och för sig kända. Till erytrocytfällningen sättes en lika stor volym 0,9% NaCl- lösning. Suspensionen blandas sedan och centrifugeras, följt av av- lägsnande av den gula hinnan. De tvättade erytrocyterna upplöses därefter genom ett standardiserat lys-förfarande, exempelvis digi- tonin, vatten, frysning och tining. Stromat separeras från suspen- sionen med hjälp av akrinol på det sätt som tidigare visats. Det kan vidare påpekas att valet av en akrinollösning av lämplig toni- citet möjliggör att erytrocytstroma kan upplöses och separeras med ett enda reagens, varigenom ett separat lys-steg undvikes.

Stromat tillsättes sedan lösningen av gamma-globulin, vilken fått reagera med heterologt antigen så att absorption av anti-erytrocyt- antikrcpparna med stroma kan erhållas. Absorptionen genomföras så många gånger som nödvändigt för absorbering av anti-erytrocyt-anti- kropparna. Mängden stroma erhållen från 0,01 till 5 eller flera li- ter uppsamlade erytrocyter användes för att absorbera anti-erytro- cyt-antikropparna från heterologt reagerat gamma-globulin, erhållet från 1 liter plasma. Multifasabsorption upprätthålles med en lämp- lig mängd gamma-globulinseparerande medel.

Stroma-absorptionen kan genomföras före, under eller efter plasma- proteinabsorptionen.

Följande exempel belyser förfarandet enligt föreliggande uppfin- ning. Exemplen avses icke begränsa utan tjänar enbart som exempli- fiering av förfarandet enligt uppfinningen.

'Exempel 1 Framställning av anti-human-lymfocyt-gamma-globulin Humana lymfocyter framställdes på något lämpligt känt sätt och en häst injicerades med dessa lymfocyter. När den önskade antikropps- titern uppnåtts, tappades hästen och serumet separerades från hel- blodet och pH-värdet i serumet justerades till omkring 7,6 genom tillsats av 0,8M natriumvätekarbonat. En vattenlösning innehållan- de O,4% akrinol tillsattes långsamt till serumet under omröring för utfällning av blodproteiner av annan typ än gammaglobnlin. Ett överskott av akrinollösning användes för att säkerställa fullständig utfällning. Fällningen tilläts sedimentera över natten vid en tem- peratur av omkring 4°C. Den överstående vätskan innehållande gamma- globulin dekanterades från fällningen.

Absorption av human anti-plasma-protein-antikroppar med helserum på i och för sig känt sätt Till en anti-human-lymfocyt-gamma-globulin-lösning från häst, fram- ställd enligt exempel 1, tillsattes en lika stor volym humant hel- serum. Detta helserum inaktiverade antikropparna mot humant blod- protein i hästantilymfocyt-gamma-globulinet. Emellertid blandas det humana gammaglobulinet med häst-anti-human-lymfocyt-gamma-glo- bulinet och dessa tvâ kan endast separeras med stor svårighet, om de alls kan separeras. ëæm. P61 ä Absorption av human-antiplasma-protein-antikroppar med fast plas- ma-protein En tillräcklig mängd av en vattenlösning innehållande omkring 0,4% 447 339 akrinol tillsattes langsamt till human plasma, vars pH-värde jis- ttrades till omkring 7,6 med 0,8M natriumvätekarbonat, under om- röring för erhållande av en fällning av akrinol-olösliga protei- ner. Den erhållna fällningen separerades från överstâende vätska genom centrifugerinq. Fast plasmiprotein erhållet från 0,2 l human plasma tillsattes till en lösning av?ALG, erhållen ur 1 liter plas- ma framställd som i exempel 1. Den resulterande suspensionen omrör- des kontinuerligt under 3 timmar vid rumstemperatur och kyldes och förvarades vid 4OC över natten. Den överstående vätskan innehållan- de ALG, renat från förorenande humana anti-plasma-protein-antikrop- par, separerades därefter genom centrifugering vid 2000 varv per minut under 10 sekunder. Det därvid erhållna ALG var i huvudsak ~ icke förorenat med skadliga humana blodplasmaproteümr eller lösli- ga antigen-antikropp-komplex.

Eeßsiesli Absorption av humana anti-erytrocyt-antikroppar på i och för sig känt sätt Till en volym uppsamlade humana erytrocyter tillsattes en lika stor volym 0,92 M NaCl-vattenlösning. Denna lösning blandades och Centri- fugerades vid 3000 varv per minut under 30 minuter vid ZÜC och den överstående vätskan och den gula hinnan kastades. Till wnje liter uppsamlad erytrocyter tillsattes 10 volymer destillerat vatten och cellerna upplöstes sedan de fått stå 30 minuter. Stromat tvättades och centrifugerades 10 gånger vid 3000 varv per minut till förmins- kande av hemoglobinet till en tillfredsställande nivå. En viss mängd stroma förlorades under tvättförfarandet. Stroma från 0,1 volym uppsamlade erytrocyter tillsattes till ALG erhållen från 1 liter plasma framställd enligt exempel 1 och omrörd under 3 timmar vid 2OC_ Stromat separerades från ALG-lösningen genom centrifugering och den överstående vätskan behandlades med ytterligare stroma två gån- ger För minskande av anti-erytrocyttitcrn till en acceptabel nivå. êäeiußfll- 5 Absorption av humana anti-erytrocyt-antikroppar från ALG med stro- ma framställd genom tillsats av akrinol Förfarandet enligt exempel 4 upprepades till den punkt där erytro- cyterna upplöstes med destillerat vatten. Vid denna punkt utspäddes

Claims (2)

1. 447 339 den upplösta erytrocytlösningen med 2% volym vatten räknat på den ursprungliga erytrocytvolymen. 5 gram akrinol för varje liter ur- sprungligen uppsamlad erytrocytvolym tillsattes. Denna suspension omrördes 1 timme vid rumstemperatur och placerades i kylskåp över natten. Suspensionen centrifiågerades vid 2000 varv per minut under 10 minuter och ALG-lösniígen separerades från stromat. Två ytter- ligare stroma-absorbtioner genomfördes på ovanstående sätt för minskning av anti-erytrocyttitern till en önskvärd nivå. Patentkrav Förfarande för separation av erytrocytstroma från lyseringsmedium och hemoglobin, k ä n n e t e c k n a t av att en suspension av erytrocyter, vilka genomgått ett lys-förfarande, försättes med

2. -etoxi-6,9-akridindiamin-laktat-monohydrat och att erytrocyt- stromat därefter separeras från suspensionen.