JP5632391B2 - 塩基性ペプチドの検出方法および塩基性ペプチド検出用試薬 - Google Patents
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Description
アルブミンとは、天然中、例えば卵白、血清または乳汁などに含まれるタンパク質である。血清アルブミンを例にとれば、その生理機能として、血液の浸透圧を調節することや、脂肪酸、ヘマチン、ビリルビンなどの血液中の代謝産物、薬剤などの化合物、特殊なペプチドなどと結合して血中を循環することなどが知られている。
例えば、Baczynskyjらは、血中のホルモンとしても知られているブラジキニンがBSAと結合する可能性を示唆している。また、Muramotoらは、血中ホルモンペプチドのACTHがウシ血清アルブミン(BSA)と結合することを報告している。
したがって、上記の複合体を検出するためには、標識物質を利用した検出工程などを別途行うか、または上記の溶液平衡における結合の親和性を増進させる工夫が必要であった。
(1)塩基性ペプチドを含む疑いのある試料と変性アルブミンを含む試薬とを混合して、塩基性ペプチドと変性アルブミンとの複合体を形成させる工程と、
(2)工程(1)で得られた混合液の濁りを検出する工程と
を含む、塩基性ペプチドの検出方法を提供する。
(1)塩基性ペプチドを含む疑いのある試料と変性アルブミンを含む試薬とを混合して、塩基性ペプチドと変性アルブミンとの複合体を形成させる工程、
(2)工程(1)で得られた混合液の濁りを検出する工程。
なお、ペプチドのpIは当業者に公知の方法により測定することができるが、ペプチドのアミノ酸配列が既知である場合は、例えば、ExPASyプロテオミクス サーバ コンピュート プロットパラム ツール(http://expasy.ch/tools/protparam.htmlから利用可能)などのアルゴリズムまたはプログラムにより、ペプチドの理論上のpIを知ることができる。
動物起源のアルブミンとしては、血清に含まれる血清アルブミン、卵白に含まれるオボアルブミン、乳汁に含まれるラクトアルブミンなどが知られている。植物起源のアルブミンとしては、コムギやオオムギなどに含まれるロイコシン、エンドウやダイズなどの種子に含まれるレグメリン、ヒマ種子に含まれるリシンなどが知られている。
本発明の実施形態においては、そのような処理により変性されたアルブミンを含む試薬、好ましくは、熱変性されたアルブミンを含む試薬を用いる。
上記の試薬と試料とを混合すると、変性アルブミンと塩基性ペプチドが結合して複合体を形成する。さらに、該複合体同士が凝集することにより混合液中に濁りが生じる。
本発明の方法は、変性アルブミンと塩基性ペプチドとの複合体により生じた濁りを検出する方法であるので、従来の方法のように標識物質および抗体を必要とせず、変性アルブミンを含む試薬のみを用いて塩基性ペプチドの検出を行うことができる。
直線化式:log{θ/(1−θ)}=nlogC−nlogKd (II)
(式中、θは濁度の測定値、Cは塩基性ペプチドの濃度、Kdは解離定数、nはヒル係数(Hill coefficient)を示す。)
本明細書において、解離定数とは、変性アルブミンが検出対象の塩基性ペプチドで50%飽和される場合の該ペプチドの濃度を意味する。
また、本明細書において、ヒル係数は、検出対象の塩基性ペプチドと変性アルブミンとの結合(複合体形成)における協同性の指標である。すなわち、ヒル係数が1より大きい場合は、両者の結合に正の協同性(アロステリック効果)があることを示し、塩基性ペプチドの濃度が高いほど、該ペプチドと変性アルブミンとの結合は促進される。
なお、Kdおよびnの値は、上記の検量線作成用試料の塩基性ペプチド濃度および濁度の測定値から算出される。
なお、上記の結合の様式は、イオン結合であることが考えられる。該結合様式がイオン結合であることは、本発明の方法が、低塩濃度の条件下では塩基性ペプチドの検出感度が向上することからも示唆される。低塩濃度の条件下では、存在するイオンが少ないので、変性アルブミンと塩基性ペプチドとのイオン結合が促進されると考えられるからである。
したがって、本発明の方法は、様々な塩基性ペプチドの検出に汎用し得ると考えられる。
したがって、本発明の方法は、試料中に含まれる塩基性ペプチドを迅速に検出することができる。
溶媒は、変性アルブミンと塩基性ペプチドとの複合体形成を妨げないものであれば特に限定されないが、例えば、超純水、10 mM Tris-HCl(pH5.5〜7.5)、10 mM リン酸カリウム緩衝液(pH5.5〜7.5)などの緩衝液が挙げられる。それらの中でも、超純水が好ましい。なお、本明細書において、「超純水」とは、25℃における比抵抗値が18 MΩ・cm以上の水を意味する。そのような超純水としては、Milli-Q(登録商標)水が好ましい。
SDSと尿素との混合物を用いて変性させる方法としては、例えば、上記のアルブミン溶液にSDS(終濃度1〜30 w/v%)および尿素(終濃度500 mM〜5M)を添加し混合する方法が挙げられる。
したがって、本発明の試薬に含まれる変性アルブミンは、その構造の詳細は明らかではないが、塩基性ペプチドと静電的に結合する部位を複数有し、塩基性ペプチドとの結合に正の協同性が認められるアロステリックタンパク質であると考えられる。
また、本発明の試薬は、好ましくは配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドと、1より大きく11より小さいヒル係数で結合する変性アルブミンを含む。
なお、解離定数およびヒル係数は、濁度の測定値および塩基性ペプチドの濃度が既知であれば、上記の式(I)のヒルの式から決定できる。また、配列番号1に記載のアミノ酸配列は、ACTHのN末端側の1位〜24位の配列である。
1.実験方法
(1)検出用試薬としての変性されたBSA溶液および未変性BSA溶液の調製
BSA(Sigma-Aldrich社)をMilli-Q(登録商標)水(Millipore社)に溶解して、BSA溶液(1.0 w/v%)を調製した。このBSA溶液を二等分し、一方を未変性BSA溶液とし、他方をオートクレーブにより110℃で15分間加熱して、熱変性されたBSA(以下、「熱変性BSA」ともいう)の溶液とした。
検出対象の塩基性ペプチドとして、ACTHの1位〜24位のアミノ酸からなるACTH部分ペプチド(株式会社ペプチド研究所)を用いた。このペプチドを超純水に溶解して、検出対象の塩基性ペプチドを含む試料(1.0 mg/ml)を調製した。
上記(1)で調製した熱変性BSA溶液50μlと上記(2)で調製した試料とを混合した後、超純水を加えて、全量250μlの混合液(熱変性BSAの終濃度:0.2 w/v%)を調製した。なお、この調製においては、混合液中のACTH部分ペプチドの終濃度が0〜150μMとなる量で、上記の試料を混合した。また、この混合液の調製において、熱変性BSA溶液に代えて未変性BSA溶液を用いて、比較用の混合液も調製した。
上記で調製した各混合液の波長550 nmにおける吸光度(OD550)を、分光光度計UV-2500PC(島津製作所)により測定した。結果を図1に示す。また、得られた結果について、カレイダグラフ(ヒューリンクス社)を用いてヒルプロット解析をすることで、熱変性BSAおよび未変性BSAのKd値およびヒル係数を算出した。各数値を表1に示す。
図1より、未変性BSA溶液を用いた場合は、OD550に顕著な変化は見られなかった。これは、未変性BSAとACTHが結合してもすぐに解離したか、または結合しても濁りを生じないことが原因ではないかと考えられる。
一方、熱変性BSA溶液を用いた場合は、塩基性ペプチドの濃度依存的なOD550の上昇が見られた。また、熱変性BSA溶液を用いた場合、吸光度と塩基性ペプチド濃度との間には、下記のヒルの式に従う関係が認められた。
OD=(塩基性ペプチド濃度)n/{(塩基性ペプチド濃度)n + Kdn}
他方、熱変性BSAとACTHの結合には正の協同性があるので、試料中のACTH濃度が高いほど、熱変性BSAとACTHの結合は促進される。
よって、変性されたアルブミンは、塩基性ペプチドのわずかな濃度変化を吸光度の変化として示すことができるので、本発明の方法は、塩基性ペプチドの存在の検出および濃度の定量に利用できることがわかる。
1.実験方法
(1)熱変性時間を変化させた変性BSA溶液の調製
BSA(Sigma-Aldrich社)をMilli-Q(登録商標)水(Millipore社)に溶解して、BSA溶液(1.0 w/v%)を調製した。このBSA溶液を5等分し、1つを未変性BSA溶液(熱変性時間0分)とし、残りの4つをオートクレーブにより110℃で、それぞれ5、15、60および120分間加熱して、熱変性BSA溶液とした。
検出対象の塩基性ペプチドとして、ACTHの1位〜24位のアミノ酸からなるACTH部分ペプチド(株式会社ペプチド研究所)を用いた。このペプチドを超純水に溶解して、検出対象の塩基性ペプチドを含む試料(1.0 mg/ml)を調製した。
上記(1)で調製した各熱変性時間の変性BSA溶液および上記(2)で調製した試料を用いて、実施例1と同様にして混合液を調製した。
上記で調製した各混合液のOD550を、実施例1と同様にして測定した。結果を図2に示す。また、各熱変性時間のBSAのKd値およびヒル係数を算出した。各数値を表2に示す。
図2より、熱変性時間が0分のBSA溶液を用いた場合はOD550に変化は見られなかったが、熱変性時間が5、15、60および120分間のBSA溶液を用いた場合は、いずれも塩基性ペプチドの濃度依存的なOD550の上昇が見られた。
表2より、熱変性時間が0分のBSA溶液では高いKd値を示したが、熱変性時間が5、15、60および120分間のBSA溶液ではいずれも低いKd値を示した。ヒル係数についても、熱変性時間が0分のBSA溶液では1であったが、熱変性時間が5、15、60および120分間のBSA溶液では4〜8の範囲であった。
他方、熱変性時間が5、15、60および120分間のBSA溶液の間では、Kd値およびヒル係数に顕著な差がなかった。このことから、上記のいずれの熱変性時間であっても、熱変性BSA溶液は、ACTH部分ペプチドに対して同様の親和性および正の協同性を有することがわかる。
1.実験方法
(1)検出用試薬としての変性されたBSA溶液の調製
上記の実施例1と同様にして、熱変性BSA溶液を調製した。
検出対象の塩基性ペプチドとして、ACTHの1位〜24位のアミノ酸からなるACTH部分ペプチド(株式会社ペプチド研究所)を用いた。このペプチドを超純水に溶解して、検出対象の塩基性ペプチドを含む試料(1.0 mg/ml)を調製した。
上記(1)で調製した各熱変性時間の変性BSA溶液および上記(2)で調製した試料を用いて、実施例1と同様にして混合液を調製した。また、混合液に、核酸としてサケ精子DNA(商品名:Sonicated Salmon Sperm DNA、BioDynamics Laboratory Inc社)をさらに添加した比較用の混合液(核酸の終濃度10μM)も調製した。
上記で調製した各混合液のOD550を、実施例1と同様にして測定した。結果を図3に示す。また、各混合液についてのKd値およびヒル係数を算出した。各数値を表3に示す。
図3より、混合液中に核酸が含まれる場合も、核酸が含まれない場合と同様に塩基性ペプチドの濃度依存的なOD550の上昇が見られた。また、表3より、混合液中に核酸を含む場合と含まない場合とにおいて、Kd値およびヒル係数に顕著な差がないことがわかる。
したがって、本発明の方法は、用いる試料に核酸が含まれていても、塩基性ペプチドの検出に影響をほとんど受けないことがわかる。
1.実験方法
(1)検出用試薬としての変性されたBSA溶液の調製
上記の実施例1と同様にして、熱変性BSA溶液を調製した。
検出対象の塩基性ペプチドとして、ダイノルフィンAの1位〜13位のアミノ酸からなるダイノルフィンA部分ペプチド(配列番号2;株式会社ペプチド研究所)を用いた。また、比較用の検出対象として、中性ペプチドであるα−エンドルフィン(配列番号3;株式会社ペプチド研究所)を用いた。これらのペプチドを超純水に溶解して、それぞれのペプチドを含む試料(1.0 mg/ml)を調製した。
上記(1)で調製した変性BSA溶液50μlを、上記(2)で調製した各試料に混合した後、それぞれに超純水を加えて、全量250μlの各ペプチドを含む混合液を調製した。なお、この調製において、各混合液中のペプチドの終濃度が0〜150μMとなる量で、上記の試料を混合した。
上記で調製した各混合液のOD550を、実施例1と同様にして測定した。結果を図4に示す。なお、ダイノルフィンAの部分ペプチドを含む試料についてのKd値は30であり、ヒル係数は8であった。
中性ペプチドであるα−エンドルフィンを用いた場合は、OD550に変化は見られなかった(図4−1参照)。これは、熱変性BSAとα−エンドルフィンとが結合しなかったか、または結合してもすぐに解離したことが原因ではないかと考えられる。
一方、塩基性ペプチドであるダイノルフィンAの部分ペプチドを用いた場合は、該ペプチドの濃度依存的なOD550の上昇が見られた(図4−2参照)。
また、得られたKd値から、熱変性BSAが塩基性ペプチドであるダイノルフィンAに対して非常に高い親和性を有することがわかる。さらに、熱変性BSAのヒル係数は8であったことから、熱変性BSAとダイノルフィンAとの結合には正の協同性があることがわかる。
以上から、本発明の方法は、塩基性ペプチドの存在の検出および濃度の定量に特異的に利用できることがわかる。
1.実験方法
(1)検出用試薬としての変性されたBSA溶液の調製
上記の実施例1と同様にして、熱変性BSA溶液を調製した。
検出対象の塩基性ペプチドとして、癌転移マーカーとして知られるキニノーゲンのフラグメント(439位〜457位(配列番号4);株式会社バイロジカにより合成)およびITIH4のフラグメント(611〜642位(配列番号5);株式会社バイロジカにより合成)を用いた。これらのペプチドを超純水に溶解して、それぞれのペプチドを含む試料(1.0 mg/ml)を調製した。
上記(1)で調製した変性BSA溶液50μlを、上記(2)で調製した各試料に混合した後、それぞれに超純水を加えて全量を250μlとして、各ペプチドを含む混合液を調製した。なお、この調製において、各混合液中のペプチドの終濃度が0〜80μMとなる量で、上記の試料を混合した。
上記で調製した混合液のOD550を、実施例1と同様にして測定した。結果を図5−1および図5−2に示す。また、それぞれの試料についてのKd値およびヒル係数を算出した。各数値を表4に示す。
キニノーゲンのフラグメントを含む試料の場合、そのフラグメントの濃度依存的なOD550の上昇が見られた(図5−1参照)。また、Kd値およびヒル係数より、熱変性BSAがキニノーゲンのフラグメントに対して高い親和性を有し、熱変性BSAとキニノーゲンのフラグメントとの結合には正の協同性があることがわかる。
同様に、ITIH4のフラグメントを含む試料の場合も、そのフラグメントの濃度依存的なOD550の上昇が見られた(図5−2参照)。また、Kd値およびヒル係数より、熱変性BSAがITIH4のフラグメントに対して高い親和性を有し、熱変性BSAとITIH4のフラグメントの結合には正の協同性があることがわかる。
以上から、本発明の方法は、癌マーカーである塩基性ペプチドの存在の検出および濃度の定量に利用できることがわかる。
1.実験方法
(1)検出用試薬としての変性されたHSA溶液および変性されたOA溶液の調製
HSA(Wako社)を超純水に溶解してHSA溶液(1.0 w/v%)を調製した。このHSA溶液をオートクレーブにより115℃で15分加熱して、熱変性されたHSA(以下、「熱変性HSA」ともいう)の溶液を得た。また、OA(Worthington社)を超純水に溶解して、OA溶液(1.0 w/v%)を調製した。このOA溶液のpHを5〜7になるように水酸化ナトリウムで調整し、オートクレーブにより115度で15分加熱して、熱変性されたOA(以下、「熱変性OA」ともいう)の溶液を得た。
検出対象の塩基性ペプチドとして、ACTHの1位〜24位のアミノ酸からなるACTH部分ペプチド(株式会社 バイオロジカ)を用いた。このペプチドを超純水に溶解して、検出対象の塩基性ペプチドを含む試料(1.0 mg/ml)を調製した。
上記(1)で調製した熱変性HSA溶液50μlと上記(2)で調製した試料とを混合した後、超純水を加えて、全量250μlの混合液(熱変性HSAの終濃度:0.2 w/v%)を調製した。なお、この調製において、混合溶液中のACTH部分ペプチドの終濃度が0〜80μMとなる量で、上記の試料を混合した。また、上記の混合液の調製において、熱変性HSA溶液に代えて、熱変性OA溶液を用いた混合液(熱変性OAの終濃度:0.2 w/v%)も調製した。
上記で調製した各混合液の波長550 nmにおける吸光度(OD550)を、分光光度計UV-2500PC(島津製作所)により測定した。結果を図6に示す。また、得られた結果について、カレイダグラフ(ヒューリンクス社)を用いてヒルプロット解析をすることで、熱変性HSAおよび熱変性OAのKd値ならびにヒル係数を算出した。各数値を表5に示す。
図6より、熱変性HSAおよび熱変性OA溶液を用いた場合、塩基性ペプチドの濃度依存的なOD550の上昇が見られた。また、表5より、Kd値は比較的低い値を示した。さらに、ヒル係数についても、3または11となった。よって、上記のHSAおよびOAのいずれの試薬も、それらを熱変性させることにより、ACTH部分ペプチドに対して親和性および正の協同性を有することがわかる。
以上から、変性されたHSAおよび変性されたOAを用いた試薬であっても、塩基性ペプチドの存在の検出および濃度の定量を行うことができる。
1.実験方法
(1)検出用試薬としての変性されたBSA溶液の調製
BSA(Sigma-Aldrich社)超純水に溶解して、BSA溶液(5.0 w/v%)を調製した。このBSA溶液をオートクレーブにより115℃で15分加熱して、熱変性BSA溶液を得た。
検出対象の塩基性ペプチドとして、ACTHの1位〜24位のアミノ酸からなるACTH部分ペプチド(株式会社 バイオロジカ)を用いた。このペプチドを超純水に溶解して、検出対象の塩基性ペプチドを含む試料(1.0 mg/ml)を調製した。
上記(1)で調製した熱変性BSA溶液と、上記(2)で調製した試料30μlおよび60μlとを混合した後、超純水を加えて、全量250μlの混合液を調製した。なお、この調製において、混合液中の検出用試薬の終濃度が0.1〜5%となる量で、検出用試薬(熱変性BSA溶液)と上記の各試料とを混合した。
上記で調製した各混合液の波長550 nmにおける吸光度(OD550)を、分光光度計UV-2500PC(島津製作所)により測定した。濁度が認められた場合を「Y」とし、認められない場合を「N」として、表6に示す。
表6より、混合液における検出用試薬の終濃度が0.1〜5%(変性BSAの終濃度として、0.005〜0.25 w/v%)のいずれの場合でも、塩基性ペプチドを検出することができた。
1.実験方法
(1)検出用試薬としての変性されたBSA溶液の調製
上記の実施例1と同様にして、熱変性BSA溶液を調製した。
塩基性ペプチド以外の比較用の検出対象として、中性ペプチドFibrinogenα(配列番号6;株式会社 バイオロジカ)、ならびに酸性ペプチドC3f(配列番号7;株式会社 バイオロジカ)およびFactor XIII(配列番号8;株式会社 バイオロジカ)を用いた。これらのペプチドを超純水に溶解して、それぞれのペプチドを含む試料(1.0 mg/ml)を調製した。
上記(1)で調製した変性BSA溶液 50μLを、上記(2)で調製した各試料に混合した後、それぞれに超純水を加えて、全量250μlの各ペプチドを含む混合液を調製した。なお、この調製において、各混合液中のペプチドの終濃度が0〜80μMとなる量で、熱変性BSA溶液と上記試料とを混合した。
上記で調製した各混合液のOD550を、実施例1と同様にして測定した。結果を図7−1〜図7−4に示す。
中性ペプチドであるFibrinogenαを用いた場合はOD550に変化は見られなかった(図7−1参照)。これは、熱変性BSAとFibrinogenαが結合しなかったか、または結合してもすぐに解離したことが原因ではないかと考えられる。
また、酸性ペプチドであるC3fを用いた場合もOD550に変化は見られず(図7−2参照)、Factor XIIIを用いた場合もOD550に変化は見られなかった(図7−3参照)。これらの場合でも、熱変性BSAとC3f、および熱変性BSAとFactorXIIIが結合しなかったか、または結合してもすぐに解離したことが原因ではないかと考えられる。
ここで、上記結果と、実施例1の塩基性ペプチドを検出した結果とを合わせたグラフを、図7−4に示す。このグラフから明らかなように、本発明の方法は、酸性ペプチドや中性ペプチドに対して検出能を有さず、塩基性ペプチドにのみ特異的な検出能を発揮することがわかる。
1.実験方法
(1)検出用試薬としての変性されたBSA溶液の調製
上記の実施例1と同様にして、熱変性BSA溶液を調製した。
上記の実施例6と同様にして、塩基性ペプチドを含む試料を調製した。
上記の(1)で調製した熱変性BSA溶液600μlと上記の(2)で調製した試料とを混合した後、超純水を加えて、全量3mlの混合液(熱変性BSAの終濃度:0.2 w/v%)を調製した。なお、この調製において、混合液中のACTH部分ペプチドの終濃度が0〜1.6μMとなる量で、熱変性BSA溶液と上記の試料とを混合した。
上記で調製した各混合液を二分割し、一方の各混合液の励起波長510 nmにおける520 nmの蛍光強度を、分光蛍光光度計 F-7000(株式会社日立ハイテクノロジーズ)により測定した。結果を図8に示す。得られた結果について、カレイダクラフ(ヒューリンクス社)を用いてヒルプロット解析することにより、ペプチド濃度限界(LoD)を評価した。また、他方の各混合液をプランクトン計算板(松浪硝子工業株式会社)に滴下し、顕微鏡(×400 オリンパス社)により、843μm×843μm内に存在する凝集物をカウントした。結果を図9に示す。また、得られた結果について、カレイダクラフ(ヒューリンクス社)を用いてヒルプロット解析することで、ペプチド濃度限界(LoD)を評価した。
図8より、ペプチド濃度が数百nMオーダー領域おいて、塩基性ペプチドの濃度依存的な蛍光強度の上昇が見られた。また、蛍光強度と塩基性ペプチド濃度との間には、ヒルの式に従う関係が認められた。
図9より、顕微鏡による凝集体のカウント数においても、塩基性ペプチドの濃度依存的な蛍光強度の上昇が見られた。また、カウント数と塩基性ペプチド濃度との間には、ヒルの式に従う関係が認められた。
以上から、本発明の方法は、塩基性のペプチドの濃度が数百nMであっても、該ペプチドの存在の検出および濃度の定量に利用することができる。
1.実験方法
(1)検出用試薬としての変性されたBSA溶液の調製
上記の実施例1と同様にして、熱変性BSA溶液を調製した。
検出対象の塩基性ペプチドとして、ACTHの1位〜24位のアミノ酸からなるACTH部分ペプチド(株式会社 バイオロジカ)を用いた。このペプチドを超純水に溶解した後、USA健常者(女性, 16 age)の血清(SUNFCO社)と混合して、検出対象の塩基性ペプチドおよび血清を含む試料を調製した。なお、この試料において、ACTH部分ペプチドの濃度および血清濃度は、それぞれ、次の(3)に示される終濃度となるように調製した。
上記(1)で調製した熱変性BSA溶液50μlと、上記(2)で調製した試料とを混合した後、超純水を加えて、全量250μlの血清を含む混合液(以下、「血清溶液」という)を調製した。なお、この調製において、混合液中のACTH部分ペプチドの終濃度が0〜80μMとなる量で、血清の終濃度が100倍希釈となる量で上記の試料を混合した。また、比較実験用の混合液として、血清を含まない混合液(以下、「対照液」という)を調製した。
上記で調製した各混合液の波長550 nmにおける吸光度(OD550)を、分光光度計UV-2500PC(島津製作所)により測定した。結果を図10に示す。また、得られた結果について、カレイダグラフ(ヒューリンクス社)を用いてヒルプロット解析することで、熱変性BSAのKd値およびヒル係数、HSA濃度(CHSA)、HSAとACTHの解離定数(Ki値)を算出した。各数値を表7に示す。
図10より、実施例1〜9のような検出対象の塩基性ペプチドのみが含まれる純粋な検体ではなく、被験者から採取した実際の検体のように血清を含む検体であっても同様に塩基性ペプチドを検出できることが明らかとなった。
また、図10において、所定のOD値に対応する血清溶液および対照液のACTH部分ペプチドの濃度を比較すると、血清溶液では対照液の約2倍のACTH部分ペプチド量であることがわかる。これは、血清中のHSAによる競合阻害の影響であると考えられる。血清溶液の場合は、血清中のHSAとACTH部分ペプチドの解離定数を考慮する必要があり、吸光度と塩基性ペプチド濃度との間には、下記のヒルの式に従う関係が認められる。
OD=(ペプチド濃度)n/[(ペプチド濃度)n+[Kd×(1+CHSA/Ki)]n]
(式中、KdはACTH部分ペプチドと熱変性BSAの解離定数、CHSAはHSAの濃度、KiはACTH部分ペプチドとHSAの解離定数、nはヒル係数を示す。)
以上から、本発明の方法は、実検体中でも塩基性ペプチドの検出および濃度の定量を簡便に行うことができる。
1.実験方法
(1)検出用試薬としての変性されたBSA溶液の調製
上記の実施例1と同様にして、熱変性BSA溶液を調製した。
検出対象の塩基性ペプチドとして、ACTHの1位〜24位のアミノ酸からなるACTH部分ペプチド(株式会社 バイオロジカ)を用いた。このペプチドを超純水に溶解した後、USA健常者(女性, 16age)血清(SUNFCO社)と混合して、検出対象の塩基性ペプチドを含む実検体血清試料を調製した。なお、この試料において、ACTH部分ペプチドの濃度および血清濃度は下記(3)の濃度に合うように調製した。
Glycerol溶液(Agilent technologies社)6mlおよびOFFGEL Buffer(Agilent technologies社)600μlを混合した後、超純水を加えて、全量50 mlのpH3-10ペプチドbuffer溶液(×1.25)を調製した。この溶液と上記(2)の試料を混合して、ACTH部分ペプチドの濃度20μMおよび血清1000倍希釈ペプチドbuffer溶液(×1)を調製した。この溶液とpH 3-10 Fraction用High Resolution IPG ゲルを用いて、OFFGEL分画装置(Agilent technologies社)にて分画操作を行った。その後、ACTH部分ペプチドが含まれているFraction(陰極部が接している溶液)を回収し、超純水100μlを添加した溶液を、塩基性ペプチド濃縮試料とした。
上記(1)で調製した熱変性BSA溶液50μlと上記(3)で調製した試料とを混合した後、MES-HCl buffer(pH5.0)と超純水を加えて全量250μl(MES 終濃度50μM)とし、pHを調整して、混合液を調製した。また、熱変性BSA溶液を含まない溶液を、比較用混合液として調製した。
上記で調製した各混合液の波長550 nmにおける吸光度(OD550)を、分光光度計UV-2500PC(島津製作所)により測定した。結果を表8に示す。
熱変性BSAが含まれている試料では濁度上昇が確認できることから、OFFGEL分画した後の溶液においても、本発明の検出用試薬を用いてACTH部分ペプチドを検出できることが明らかとなった。
以上から、本発明の方法は、前処理としてOFFGEL分画装置で塩基性ペプチドを濃縮することで、実検体中の極微量の塩基性ペプチドを検出することができる。
Claims (10)
- (1)塩基性ペプチドを含む疑いのある試料と変性アルブミンを含む試薬とを混合して、塩基性ペプチドと変性アルブミンとの複合体を形成させる工程と、
(2)工程(1)で得られた混合液の濁りを検出する工程と
を含む、塩基性ペプチドの検出方法。 - 前記変性アルブミンが、熱変性アルブミンである、請求項1に記載の方法。
- 前記混合液における変性アルブミンの終濃度が、0.2〜0.6 w/v%である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記工程(2)が、前記混合液に光を照射して光学的情報を得る工程である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記光学的情報が、吸光度である、請求項4に記載の方法。
- 変性アルブミンを含む塩基性ペプチド検出用試薬。
- 前記変性アルブミンが、熱変性アルブミンである、請求項6に記載の試薬。
- 前記変性アルブミンが、血清アルブミン、オボアルブミンまたはラクトアルブミンから得られる、請求項6または7に記載の試薬。
- 前記変性アルブミンが、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドに対して5〜220μMの解離定数を有する、請求項6〜8のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記変性アルブミンが、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドに対して1より大きく11より小さいヒル係数を有する、請求項6〜9のいずれか1項に記載の試薬。
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