JP2017515887A - タグ付けされたヌクレオチドを製造するための化学的方法 - Google Patents

タグ付けされたヌクレオチドを製造するための化学的方法 Download PDF

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Abstract

この開示は、ヌクレオチドにナノポアで検出可能なタグを結合させるためのシステム及び方法を提供する。本開示はまた、開示されたタグ付けされたヌクレオチドを用いて核酸をシークエンシングするための方法を提供する。本明細書において、結合されたタグを有するヌクレオチド及びヌクレオチドにタグを結合するための方法が提供される。タグは、「クリックケミストリー」のような化学反応により結合することができる。１つの側面において、本開示は、（ａ）末端リン酸を有するポリリン酸基、及び（ｂ）トリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、第２級アミン、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によって、ヌクレオチドの末端リン酸に共有結合したタグを含む、タグ付けされたヌクレオチドを提供する。【選択図】図１

Description

この出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の下で、参照によりその内容が本明細書に援用される２０１４年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／９６９，６２８号の利益を主張する。
この発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された認可番号第５Ｒ０１ＨＧ００７４１５号の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
この出願は、「１５０８０５_０５７５_８５６２５_ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ_ＪＡＫ.ｔｘｔ」と称するファイル中に示されるヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を参照により援用し、そのファイルは５２キロバイトのサイズであり、２０１５年３月２３日にＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）と互換性のあるオペレーティングシステムを有するＩＢＭ−ＰＣ機械フォーマットにおいて作成され、この出願の一部として２０１５年３月２３日に出願されたテキストファイルに含まれる。
技術分野
この出願は、タグ付けされたヌクレオチド組成物、核酸をシークエンシングするための、開示されたタグ付けされたヌクレオチド組成物を調製し及び使用する方法、並びに、特に、ナノポアベースのシークエンシング方法に関する。
参照による援用
この明細書内で言及された全ての刊行物、特許及び特許出願は、各個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的かつ個別に参照により援用されることが示されたのと同程度に参照により援用される。
背景
核酸のシークエンシングは、核酸のヌクレオチド配列を決定するためのプロセスである。そのような配列情報は、対象を診断及び／又は治療することにおいて有用であり得る。例えば、対象の核酸の配列は、遺伝子疾患を特定し、診断し及びそのための治療法を潜在的に開発するために用いることができる。他の例として、病原体の研究は、伝染病の治療につながり得る。幾つかの疾患は、数百万のヌクレオチドの鎖のうち、わずか１つのヌクレオチドの違いによってキャラクタリゼーションされることから、高度に正確なシークエンシングが不可欠である。
核酸をシークエンシングするために用いることのできる、利用可能な方法がある。そのような方法は、しかしながら、高価で、かつ対象の診断及び／又は治療に必要であり得る時間内及び正確性で配列情報を提供できない可能性がある。
幾つかの場合において、一本鎖核酸分子にナノポアを通過させる核酸シークエンシングの方法は、感度が十分ではない。ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及び／又はウラシル（Ｕ））は、互い十分に異なる信号を提供しない可能性がある。特に、プリン（即ち、Ａ及びＧ）は、互いに同様なサイズ、形状及び電荷であり、幾つかの場合において、十分に異なる信号を提供しない。また、ピリミジン（即ち、Ｃ、Ｔ及びＵ）も、互いに同様なサイズ、形状及び電荷であり、幾つかの場合において、十分に異なる信号を提供しない。
クマール（Ｋｕｍａｒ）ら（２０１２）は、ｄＧヌクレオチドに５’末端−ホスホルアミデートを介して結合している４つの異なる長さのＰＥＧ−クマリンタグを区別するためにナノポアを用いることを開示し、かつ別に、ＤＮＡポリメラーゼによるそれら４つのＰＥＧ−クマリンでタグ付けされたｄＧヌクレオチドの効率的かつ正確な組み込みを実証している。米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号及び第２０１３／０２６４２０７Ａ１号も参照のこと。
本明細書において、ヌクレオチドの特定及び核酸のシークエンシングのための改善された組成物及び方法の必要性が認識される。
概要
本明細書において、結合されたタグを有するヌクレオチド及びヌクレオチドにタグを結合するための方法が提供される。タグは、「クリックケミストリー」のような化学反応により結合することができる。
１つの側面において、本開示は、（ａ）末端リン酸を有するポリリン酸基、及び（ｂ）トリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、第２級アミン、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によって、ヌクレオチドの末端リン酸に共有結合したタグを含む、タグ付けされたヌクレオチドを提供する。
タグ付けされたヌクレオチドの幾つかの実施形態において、タグは、トリアゾールによって末端リン酸に共有結合されている。幾つかの実施形態において、トリアゾールは、構造：
Figure 2017515887
を有し、
Ｒ１は、タグを含み、Ｒ２は、ヌクレオチドを含み；或いは、Ｒ１は、ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、タグを含む。幾つかの実施形態において、トリアゾールは、構造：
Figure 2017515887
を有し、
Ｒ１及びＲ３は、結合して環状部を形成し；及び結合したＲ１及びＲ３は、タグを含み、Ｒ２は、ヌクレオチドを含み；或いは、結合したＲ１及びＲ３は、ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、タグを含む。幾つかの実施形態において、トリアゾールは、アジド及びアルキン間の反応によって形成される。
タグ付けされたヌクレオチドの幾つかの実施形態において、タグは、１，２−ジアジンによって末端リン酸に共有結合されている。幾つかの実施形態において、１，２−ジアジンは、ジヒドロピリダジン基を含む。幾つかの実施形態において、１，２−ジアジン又はジヒドロピリダジン基は、テトラジン及びトランス−シクロオクテン間の反応によって形成される。
タグ付けされたヌクレオチドの幾つかの実施形態において、ポリリン酸基は、ヌクレオチドの５’位にある。幾つかの実施形態において、ポリリン酸基は、少なくとも３つのリン酸、少なくとも４つのリン酸、少なくとも５つのリン酸、少なくとも６つのリン酸、又は少なくとも７つのリン酸を含む。幾つかの実施形態において、ポリリン酸基は、４つから６つまでのリン酸を含む。幾つかの実施形態において、ポリリン酸基は、６つのリン酸を含む。
幾つかの実施形態において、タグ及び末端リン酸間の共有結合は、リンカー又はスペーサー基を含み得る。幾つかの実施形態において、リンカー又はスペーサー基は、少なくとも２個の炭素から約１２個の炭素までのアルキル基を含む。
タグ付けされたヌクレオチドの幾つかの実施形態において、タグは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴ糖、炭水化物、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ビニルポリマー、他の水溶性ポリマー、又はそれらの何れかの組み合わせを含む。
タグ付けされたヌクレオチドの幾つかの実施形態において、タグは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは、少なくとも７個のモノマー単位、少なくとも１０個のモノマー単位、少なくとも１５個のモノマー単位、少なくとも２０個のモノマー単位、少なくとも２５個のモノマー単位、少なくとも３０個のモノマー単位、少なくとも３５個のモノマー単位、少なくとも４０個のモノマー単位、又は少なくとも５０個以上のモノマー単位を含む。
タグ付けされたヌクレオチドの幾つかの実施形態において、タグは、オリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、非天然のヌクレオチドは、Ｌ−ヌクレオチド、２’，５’結合、α−Ｄ−ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド間結合、非天然塩基、非天然糖基、及びそれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される基を含む。幾つかの実施形態において、非天然ヌクレオチドは、二トロピロール、ニトロインドール、ネブラリン、ゼブラリン、ベンゼン及びベンゼン誘導体からなる群から選択される非天然塩基を含む。幾つかの実施形態において、非天然ヌクレオチドは、リン酸トリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボロノリン酸、ホスホロアミド酸及びモルホリノ基からなる群から選択される非天然ヌクレオチド間結合を含む。
タグ付けされたヌクレオチドの幾つかの実施形態において、タグは、オリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドの５’末端は、ポリリン酸基の末端リン酸と共有結合している。幾つかの実施形態において、５’末端が末端リン酸と共有結合したオリゴヌクレオチドは、更に、それをエキソヌクレアーゼ分解から保護する化学修飾をその３’末端に含む。幾つかの実施形態において、３’末端の化学修飾は、リン酸化、及びＣ３アルキルからＣ１２アルキルまでのスペーサーとの共有結合から選択される。タグ付けされたヌクレオチドの他の実施形態において、タグは、オリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドの３’末端は、ポリリン酸基の末端リン酸と共有結合している。幾つかの実施形態において、３’末端が末端リン酸と共有結合したオリゴヌクレオチドは、更にそれをエキソヌクレアーゼ分解から保護する化学修飾をその５’末端に含む。幾つかの実施形態において、５’末端の化学修飾は、リン酸化、及びＣ３アルキルからＣ１２アルキルまでのスペーサーとの共有結合から選択される。
タグ付けされたヌクレオチドの幾つかの実施形態において、タグは、オリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドは、シアニン色素基を含むリンカーを含む。幾つかの実施形態において、シアニン色素基は、Ｃｙ３基である。
他の側面において、本開示は、タグ付けされたヌクレオチドを作製するプロセスであって、（ａ）末端リン酸を含むポリリン酸基を含むヌクレオチドを提供すること、ただし、末端リン酸は第１の反応性官能基を含むリンカーと結合しており、（ｂ）第２の反応性官能基を含むタグを提供すること、及び（ｃ）タグにヌクレオチドを結合させるために、第１の反応性官能基を第２の反応性官能基と反応させること、ただし、第１の反応性官能基は、（ｉ）チオール、イミダゾール、アミン、アルキン及びジエンからなる群から選択され、第２の反応性官能基は、（ｉｉ）マレイミド、ハロアセトアミド、アルデヒド、イソチオシアネート、イソシアネート、ビニルスルホン、アジド及びテトラジンからなる群から選択されるか、或いは、その逆である（即ち、第１の反応性官能基は（ｉｉ）から選択され、第２の反応性官能基は、（ｉ）から選択される）を含む方法を提供する。
幾つかの実施形態において、第１の反応性官能基は、第２の反応性官能基と異なる。
幾つかの実施形態において、第１の反応性官能基は、チオール、イミダゾール、アミン、アルキン及びジエンからなる群から選択される。
幾つかの実施形態において、第２の反応性官能基は、マレイミド、ハロアセトアミド、アルデヒド、イソチオシアネート、イソシアネート、ビニルスルホン、アジド及びテトラジンからなる群から選択される。
幾つかの実施形態において、第１の反応性官能基は、アルキンであり、第２の反応性官能基は、アジドである。
幾つかの実施形態において、アルキンは、シクロオクチンである。
幾つかの実施形態において、第１の反応性官能基は、マレイミド、ハロアセトアミド、アルデヒド、イソチオシアネート、イソシアネート、ビニルスルホン、アジド及びテトラジンからなる群から選択される。
幾つかの実施形態において、第２の反応性官能基は、チオール、イミダゾール、アミン、アルキン及びジエンからなる群から選択される。
幾つかの実施形態において、第１の反応性官能基は、アジドであり、第２の反応性官能基は、アルキンである。
幾つかの実施形態において、アルキンは、シクロオクチンである。
幾つかの実施形態において、反応は、銅、ルテニウム、銀、又はそれらの何れかの組合せを含む不均一触媒によって促進される。
幾つかの実施形態において、反応は、不均一触媒によって促進されない。
他の側面において、本開示は、少なくとも１種のタグ付けされたヌクレオチドを含む、核酸をシークエンシングするためのキットを提供する。
本発明の幾つかの実施形態において、タグは、表４に掲げたタグからなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態において、タグ付けされたヌクレオチドは、表４に掲げたタグ付けされたヌクレオチドからなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態において、タグは、表５に掲げたタグからなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態において、タグは、表６に掲げた化学修飾からなる群から選択される化学修飾を含む。
本発明の幾つかの実施形態において、タグ付けされたヌクレオチドは、ヌクレオチドにタグを連結するリンカー内にシアニン色素基を含み、タグ付けされたヌクレオチドは、シアニン色素基を含まないタグ付けされたヌクレオチドと比較して、ポリメラーゼによる改善された補足速度を有する。
本開示は、本明細書に開示されたタグ付けされたヌクレオチドを使用する、一本鎖核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）のヌクレオチド配列を決定するための方法を提供する。従って、別の側面において、本開示は、
（ａ）膜中のナノポアと接触している電解質溶液中にあり、かつ一部にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖核酸を、核酸ポリメラーゼと少なくとも４つのタグ付けされたヌクレオチドとに、それが、前記プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し、直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記核酸ポリメラーゼにプライマーへのタグ付けされたヌクレオチドの一つの組み込みを触媒させることを許容する条件のもとで、核酸伸長生成物を形成させるために、接触させること、
ただし、前記少なくとも４つのタグ付けされたヌクレオチドの各々は、末端リン酸、アデニン、グアニン、シトシン、チミン若しくはウラシルである塩基、又はそれらそれぞれの誘導体、及びトリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、ヒドラゾン、第２級アミン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によってヌクレオチドの末端リン酸に共有結合したタグを有するポリリン酸基を含み、
ただし、（ｉ）各タグ付けされたヌクレオチド中の塩基の種類は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々中の塩基の種類と異なっており、及び（ｉｉ）各タグ付けされたヌクレオチドのポリリン酸基中のリン酸の数は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドのポリリン酸基中のリン酸の数と異なっているか、或いは、各タグ付けされたヌクレオチドのポリリン酸基中のリン酸の数は、同じであり、かつ各タグ付けされたヌクレオチド上のタグの種類は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々のタグの種類とは異なっており、
ただし、タグ付けされたヌクレオチドの組み込みは、タグが結合したリン酸の解離をもたらし、
（ｂ）前記膜を通して電圧を印加し、及びナノポアに入っていく、ナノポア中に位置するようになる、及び／又はナノポアを通り抜けて転座する、工程（ａ）において生成した、タグが結合したポリリン酸に起因する、ナノポアを通した電子的変化を測定することによって、工程（ａ）における核酸伸長生成物を形成するために、どのタグ付けされたヌクレオチドがプライマーに組み込まれたかを決定すること、ただし、電子的変化は、ポリリン酸基中のリン酸の各異なる数、若しくはタグの各異なる種類のうち、適切な方について異なり、それによって組み込まれたタグ付けされたヌクレオチドに相補的な一本鎖核酸中のヌクレオチド残基を特定し、
（ｃ）シークエンシングされている一本鎖核酸の各核酸残基について、工程（ａ）及び（ｂ）を反復して繰り返すこと、ただし、工程（ａ）の各反復において、タグ付けされたヌクレオチドは、それが、前記核酸伸長生成物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し、直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記工程（ａ）の先行の反復に起因する核酸伸長生成物中に組み込まれ、
それによって、一本鎖核酸の配列を決定すること
を含む、一本鎖核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）のヌクレオチド配列を決定する方法を提供する。
当該方法の他の側面において、本開示は、
（ａ）膜中のナノポアと接触している電解質溶液中にあり、かつ一部にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖核酸を、核酸ポリメラーゼとタグ付けされたヌクレオチドとに、前記核酸ポリメラーゼが、前記プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し、直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記核酸ポリメラーゼにプライマーへのタグ付けされたヌクレオチドの一つの組み込みを触媒させることを許容する条件のもとで、核酸伸長生成物を形成させるために、接触させること、
ただし、前記タグ付けされたヌクレオチドは、末端リン酸、アデニン、グアニン、シトシン、チミン若しくはウラシルである塩、又はそれらそれぞれの誘導体、及びトリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、第２級アミン、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によってヌクレオチドの末端リン酸に共有結合したタグを有するポリリン酸基を含み、
ただし、タグ付けされたヌクレオチドの組み込みは、結合しているタグを有するポリリン酸の解離をもたらし、タグ付けされたヌクレオチドが組み込まれない場合、タグ付けされたヌクレオチドが組み込まれるまで、異なるタグ付けされたヌクレオチドを接触させることを反復して繰り返し、ただし、（１）各タグ付けされたヌクレオチド中の塩基の種類は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々中の塩基の種類と異なっており、及び（２）各タグ付けされたヌクレオチドのポリリン酸基中のリン酸の数のは、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドのポリリン酸基中のリン酸の数と異なっているか、或いは、各タグ付けされたヌクレオチドのポリリン酸基中のリン酸の数は、同じであり、各タグ付けされたヌクレオチド上のタグの種類は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々のタグの種類とは異なっており、
（ｂ）前記膜を通して電圧を印加し、及びナノポアに入っていく、ナノポア中に位置するようになる、及び／又は通り抜けて転座する、工程（ａ）において生成された、タグが結合したポリリン酸に起因する、ナノポアを通した電子的変化を測定することによって、工程（ａ）における核酸伸長生成物を形成するために、どのタグ付けされたヌクレオチドがプライマーに組み込まれたかを決定すること、ただし、電子的変化は、ｎの各値、又はタグの各異なる種類のうちの適切な方について異なり、それによって組み込まれたタグ付けされたヌクレオチドに相補的な一本鎖核酸中のヌクレオチド残基を特定すること;
（ｃ）シークエンシングされている一本鎖核酸の各核酸残基について、工程（ａ）及び（ｂ）を反復して繰り返すこと、ただし、工程（ａ）の各反復において、タグ付けされたヌクレオチドは、それが、前記核酸伸長生成物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し、直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記工程（ａ）の先行の反復に起因する核酸伸長生成物中に組み込まれ、
それによって、一本鎖核酸のヌクレオチド配列を決定すること
を含む、一本鎖核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）のヌクレオチド配列を決定するための方法を提供する。
当該方法の幾つかの実施形態において、各ポリリン酸基は、少なくとも３つのリン酸、少なくとも４つのリン酸、少なくとも５つのリン酸、少なくとも６つのリン酸、少なくとも７つのリン酸、又は幾つかの実施形態においては少なくとも８つのリン酸を含む。幾つかの実施形態において、ポリリン酸基は、４つから６つまでのリン酸を含む。幾つかの実施形態において、ポリリン酸基は、６つのリン酸を含む。
当該方法の幾つかの実施形態において、各タグは、トリアゾールによって末端リン酸に共有結合されている。幾つかの実施形態において、各トリアゾールは、構造：
Figure 2017515887
を有し、
Ｒ１は、タグを含み、Ｒ２は、ヌクレオチドを含み；又は、
Ｒ１は、ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、タグを含む。
当該方法の幾つかの実施形態において、各トリアゾールは、構造：
Figure 2017515887
を有し、
Ｒ１及びＲ３は、結合して環状部を形成し；及び
結合したＲ１及びＲ３は、タグを含み、Ｒ２は、ヌクレオチドを含み；或いは、
結合したＲ１及びＲ３は、ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、タグを含む。
当該方法の幾つかの実施形態において、各トリアゾールは、アジド及びアルキン間の反応によって形成される。
当該方法の幾つかの実施形態において、各タグは、１，２−ジアジンによって末端リン酸に共有結合されている。
当該方法の幾つかの実施形態において、各タグは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴ糖、炭水化物、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ビニルポリマー、他の水溶性ポリマー、又はそれらの何れかの組み合わせを含む。
幾つかの実施形態において、各タグは、表６に掲げた化学修飾からなる群から選択される化学修飾を含む。
幾つかの実施形態において、各タグ付けされたヌクレオチドは、表４に掲げたタグ付けされたヌクレオチドからなる群から選択される。
幾つかの実施形態において、各タグ付けされたヌクレオチドは、タグをヌクレオチドに連結しているリンカー内のシアニン色素基を含み、タグ付けされたヌクレオチドは、シアニン色素基を含まないタグ付けされたヌクレオチドと比較して、ポリメラーゼによる改善された補足速度を有する。
幾つかの実施形態において、４つのタグ付けされたヌクレオチドは、ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴ−Ｔ２３−Ｃ３、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２−ｄＳｐ８−Ｔ２０−Ｃ３、ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６、及びｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ｄＳｐ３−Ｔ２３−Ｃ３である。
本開示の更なる側面及び利点は、本開示の単なる例示の実施形態が示され、かつ記載されている以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかとなるであろう。理解されるように、本開示は、他の及び異なる実施形態が可能であり、その幾つかの詳細は、全てが本開示から逸脱することのない種々の明白な点において変更が可能である。従って、図面及び記載は、限定としてではなく、本質的に例示としてみなされるべきである。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のよりよい理解は、その中で本発明の原理が利用される例示の実施形態を説明する以下の詳細な記載及び添付の以下の図面（“図”又は“ＦＩＧｓ.”とも称する）を参照することによって得られるであろう：
図１は、ヌクレオチドの末端リン酸に結合したタグを示す。 図２は、大体のタグ位置を示す。 図３は、タグ付けされたヌクレオチドの一例を示す。 図４は、タグ付けされたヌクレオチドの一例を示す。 図５は、タグ付けされたヌクレオチドの構造を示す。タグ５０５は、末端リン酸に結合している。 図６は、クリックケミストリーによって結合させることができるヌクレオチド（左）とタグ（右）を示す。 図７は、４つの切断されたタグについてのセル電流測定値の一例を示す。 図８は、本明細書に記載のシークエンシング方法の操作を概略的に示す。 図９Ａは、ナノポア検出器の例を示し、図９Ａは、電極上に配置されたナノポアを有する。 図９Ｂは、ナノポア検出器の例を示し、図９Ｂは、ウェル上の膜に挿入されたナノポアを有する。 図９Ｃは、ナノポア検出器の例を示し、図９Ｃは、突出した電極の上にナノポアを有する。 図１０は、核酸シークエンシングの方法を例示する。 図１１は、タグのナノポアの通過によって生じる信号の一例を示す。 図１２は、ナノポアを含むチップの例示的な配置を示す。 図１３は、ナノポア検出器のアレイを示す。 図１４は、シーケンサーを制御するように構成されたコンピュータシステムを示す。 図１５は、検出可能なＴＡＧ−ポリリン酸及び検出可能なＴＡＧを示す。 図１６は、クマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐでタグ付けされたヌクレオチドの合成の一例を示す。 図１７は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる解離されたタグのキャラクタリゼーションの一例を示す。 図１８は、セル電流測定値のヒストグラムを示す。 図１９は、４つの異なるタグについて、秒単位で測定された時間に対するピコアンペアで測定された電流のプロットを示す。 図２０は、結合反応の例を示す。 図２１は、本開示のタグ付けされたヌクレオチドを作製するのに有用な例示的なクリックケミストリー反応を示し、（Ａ）は、トリアゾール共有結合でＡ−Ｂ複合体を生成するために、アジド修飾されたＡ化合物とアルキン修飾されたＢ化合物との間のクリック反応を示し、（Ｂ）は、トリアゾール共有結合でＡ−Ｂ複合体を生成するために、アジド修飾されたＡ化合物とシクロオクチン修飾されたＢ化合物との間のクリック反応（例えば、銅無しのクリック反応におけるように）を示し、（Ｃ）は、ジヒドロピリジン互変異性型において１，２−ジアジンの共有結合でＡ−Ｂ複合体を生成するために、テトラジン修飾されたＡ化合物とトランス−シクロオクテン修飾されたＢ化合物との間のクリック反応（例えば、ＩＥＤＤＡクリック反応）を示す。 図２２は、ｄＡ６Ｐ−Ｎ３とＤＢＣＯ−Ｃｙ３との間のクリック反応の結果を示す。 図２３は、アジド−ヌクレオチドの、生成物、ＤＢＣＯ−Ｃｙ３への変換を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す。 図２４は、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２５タグを形成するｄＴ６Ｐ−Ｎ３とヘキシニル−Ｃｙ３−Ｔ２５オリゴヌクレオチドとの間のクリック反応を示す。 図２５は、２’−デオキシアデノシン−５’−六リン酸の合成及びクリックケミストリーを用いた末端リン酸へのタグの結合の例を示す。 図２６は、ｄＴ６Ｐ−Ｎ３とオリゴアルキンとの間のクリック反応の一例を示す。 図２７は、ヌクレオチドへのタグのチオール（ジスルフィド結合）カップリングの一例を示す； 図２８は、タグ−ヌクレオチドｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２５のマススペクトルと伸長反応を示す；及び 図２９は、アミダイトケミストリーを用いてオリゴヌクレオチドに組み込むことができるモノマーの例を示す。 図３０は、アジド−アルキンクリックケミストリーを用いて調製した、４つの異なるオリゴヌクレオチド−Ｃｙ３タグを含む４つの異なるタグ付けされたヌクレオチドを示す。 図３１は、（Ａ）異なるオリゴヌクレオチド−Ｃｙ３タグを含む４つの異なるタグ付けされたヌクレオチドを用いたＤＮＡポリメラーゼ伸長反応からの試料の変性ゲル画像を示し、当該反応は、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われた；及び（Ｂ）反応に用いられた４つの異なるオリゴヌクレオチド−Ｃｙ３でタグ付けされたヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を示す。 図３２は、本開示のオリゴヌクレオチドタグに使用することができる例示的なＬ−ヌクレオチドを示す。 図３３は、本開示のオリゴヌクレオチドタグに使用することができる例示的なα−Ｄ−ヌクレオシド、β−Ｄ−ヌクレオシド及び２’，５−連結ヌクレオチドを示す。 図３４は、本開示のオリゴヌクレオチドタグに使用することができる例示的な非天然ヌクレオチド間結合及び非天然の糖を示す。 図３５は、オリゴヌクレオチドタグの３’化学修飾が、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ分解からタグを保護することができることを実証する結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像を示す。 図３６は、ＤＮＡ鋳型（配列番号１２０）の一部をシークエンシングするためにナノポアアレイチップ、プライマー（配列番号１１８）及び４つの異なるオリゴヌクレオチドでタグ付けされたヌクレオチド（ｄＴ−Ｔａｇ１は、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−ｄＴ２−ｄＳｐ８−ｄＴ２０−Ｃ３であり；ｄＣ−Ｔａｇ２は、ｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−ｄＴ４−ｄＳｐ３−ｄＴ２３−Ｃ３であり;ｄＧ−Ｔａｇ３は、ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−ｄＴ３０−Ｃ６であり；ｄＡ−Ｔａｇ４は、ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−ｄＴ４−ＦｌｄＴ−ｄＴ−ＦｌｄＴ−ｄＴ２３−Ｃ３である）を用いて僅かに異なる条件下で測定したタグの組み込み事象に対応した電流値のトレースを示す。（Ａ）及び（Ｂ）両方に用いた条件は以下であった：１５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５の緩衝液；ポアのトランス側において、３．０ｍＭのＳｒＣｌ２;１６０ｍＶの電位を印加し、維持した。以下に示すポアのシス側の条件は、異なっていた：（Ａ）シス側において、０．１ｍＭのＭｎＣｌ２；（Ｂ）シス側において３．０ｍＭのＭｇＣｌ２＋０．７ｍＭのＳｒＣｌ２。 図３７は、トレースの上に示したれたダブルヘアピン鋳型の１２塩基ホモポリマー領域の合成による単一分子、リアルタイムでの電子シークエンシングのために、ナノポアアレイチップ及びオリゴヌクレオチドでタグ付けされたヌクレオチドを用いて僅かに異なる条件下で測定したタグの組み込み事象に対応した電流値のトレースを示す。使用条件は、ポアのシス側において、１５０ｍＭのＫＣｌ、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、ポアのトランス側において３．０ｍＭのＳｒＣｌ２、及び１００ｍＶの電位が印加され、維持された。タグ付けされたヌクレオチドは、図３６に示した。 図３８は、ナノポアへのプライマー（配列番号１２１）の結合、ＤＮＡシークエンシングのための鋳型（配列番号１２２）、タグ付けされたヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼの追加を示す。当該図に示されるように、電流遮断による検出のために、タグ付けされた「Ａ」ヌクレオチドは、そのタグがナノポアに挿入するように位置するようにポリメラーゼ活性部位に結合する。
詳細な説明
本発明の種々の実施形態が、本明細書に示され、記載されているが、それらの実施形態が単なる例として提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱しないで、多数の変形、変更及び置換を当業者が思いつくであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態の種々の代替物が採用されうることが理解されるべきである。
本明細書で用いられる用語「ナノポア」は、一般に膜において形成、又はそうでなければ提供されるポア、チャネル又は通路をいう。膜は、脂質二重膜のような生体膜、又はポリマー材料でできた膜のような合成膜であり得る。ナノポアは、例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）又は電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路などのセンシング回路に隣接又は近接して配置され得る。ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）から約１０００ｎｍまでの範囲の特有の幅又は直径を有し得る。幾つかのナノポアはタンパク質である。α溶血素は、タンパク質ナノポアの一例である。
本明細書で使用する用語「核酸」は、一般に、１つ以上のヌクレオチドサブ単位を含む分子をいう。ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）から選択される１つ以上のサブ単位を含み得る。幾つかの例において、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、或いはそれらの誘導体である。核酸は一本鎖又は二本鎖であり得る。
本明細書で使用される用語「タグ」は、一般に、タグに結合されている分子複合体の検出又は同定を可能にする原子又は分子をいう。タグは、静電、電気化学的及び／又は光学的な標識（光）のような、検出可能な標識を提供し得る。
本明細書で用いられる用語「ヌクレオチド」は、成長核酸鎖を伸長させるために、核酸ポリメラーゼの基質又は阻害剤として作用することが可能なヌクレオシド−５’−ポリリン酸化合物、又はヌクレオシド−５’−ポリリン酸の構造類似体をいう。例示的なヌクレオチドは、限定されるものではないが、ヌクレオシド−５’−三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰ）；４以上のリン酸の長さの５’−ポリリン酸鎖（例えば、５’−テトラポリリン酸、５’−ペンタポリリン酸、５’−ヘキサポリリン酸、５’−へプタポリリン酸、５’−オクタポリリン酸）を有するヌクレオシド（例えば、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、及びｄＵ）；及び修飾塩基（例えば、置換されたプリン又はピリミジン塩基）、修飾された糖（例えば、Ｏ−アルキル化糖）、及び／又は修飾されたポリリン酸基（例えば、リン酸間にチオリン酸、メチレン及び／又は他の結合を含むポリリン酸）を有し得るヌクレオシド−５’−三リン酸の構造類似体を含む。
本明細書で使用される用語「タグ付けされたヌクレオチド」は、ポリリン酸基、塩基、又は糖基に結合したナノポアで検出可能なタグを有する何れかのヌクレオシド−５’−ポリリン酸をいう。ナノポアで検出可能なタグは、ナノポアに入る、ナノポア中に配置されるようになる、ナノポアに捕捉されている、ナノポアを貫通して転座する、及び／又はナノポアを横断することが可能であって、それによってポアを通過する電流における検出可能な変化をもたらす何れかの分子の群又は基（例えば、リンカー、オリゴマー、ポリマー）を含む。例示的なナノポアで検出可能なタグは、限定されないが、何れも任意に色素基、又はフルオロフォアのような化学基で修飾されるか又はそれに結合され得るポリエチレングリコール、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、ペプチド核酸ポリマー、ロックド核酸ポリマーのような天然又は合成ポリマーを含み、それらは検出可能なポア電流変化をもたらし得る。
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドモノマー単位のオリゴマーをいい、オリゴマーは、任意に非ヌクレオチドモノマー単位並びに／或いはオリゴマーの内部及び／又は外部の位置に結合された他の化学基を含む。オリゴマーは、天然又は合成であってよく、天然に存在するオリゴヌクレオチド、或いは非天然（若しくは修飾）塩基、糖基、ホスホジエステル類似結合及び／又は別のモノマー単位のキラリティーを含むヌクレオシド並びに異性体構造（例えば、５’−から−２’結合、L−ヌクレオシド、αアノマーヌクレオシド）を含むオリゴマーであり得る。本開示の組成物及び方法におけるナノポアで検出可能なタグとして有用な例示的なオリゴヌクレオチドは、表４に示したオリゴヌクレオチドタグの構造を含む。
本明細書で使用すされる用語「ヌクレオチド類似体」は、ヌクレオシド−５’−三リン酸と構造的に類似しており、かつ成長核酸鎖を伸長するために、核酸ポリメラーゼの基質又は阻害剤として用いられることが可能な化学化合物をいう。ヌクレオチド類似体は、修飾塩基、例えば、置換されたプリン又はピリミジン塩基、Ｏ−アルキル化糖のような修飾された糖、及び／又は修飾されたポリリン酸基、例えば、チオホスフェート、メチレン、及び／又はリン酸間の他のブリッジを含むポリリン酸を有し得る。それは、ポリリン酸鎖中に３つ以上のリン酸を有し得、かつそれは、塩基、糖又はポリリン酸基の何れかに検出可能にタグ付けされ得る。
本明細書には、ナノポアを用いて核酸をシークエンシングするために有用な方法、装置及びシステムが記載されている。当該方法は、核酸ポリメラーゼによる鋳型核酸鎖に相補的な成長鎖へのヌクレオチドの組み込みのような、個々のヌクレオチドの組み込み事象を正確に検出することができる。酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、成長するポリヌクレオチド鎖にヌクレオチドを組み込むことができ、ただし、添加されたヌクレオチドは、成長鎖にハイブリダイズされた対応する鋳型核酸鎖に対して相補的である。これらのヌクレオチドの組み込み事象は、ヌクレオチドを捕えること、ポア中の結合されたタグを読み取ること、ヌクレオチドからタグを解離することを含み、解離されたタグはその後、ナノポアを通過する。このようにして、特有のタグが最初に読み取られた後、各種類のヌクレオチド（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵ）から解離されるため、組み込まれた塩基が同定され得る（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵ）。
ヌクレオチドの組み込み事象は、ナノポアの補助によりリアルタイムで（即ち、それらが起こった時に）、又はシークエンシング反応に続いてナノポアのデータを分析することにより検出され得る。幾つかの場合において、ナノポアに結合した又は近接した酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、ナノポアを通過する又は近接する核酸分子の流れを促進し、検出のために相補的なヌクレオチドのタグをナノポア内に配置し得る。従って、（タグの解離に先立って）酵素に結合している相補的なタグ付けされたヌクレオチドは、ナノポアのポア中へのタグの配置をもたらし得、それはその後、ナノポアを介した電流値の変化によって検出され得る。或いは、１つ以上のタグ分子（本明細書では「タグ」とも称する）は、タグがナノポアを通過して又は隣接して流れる際に解離した後、検出され得る。幾つかの場合においてはナノポアに結合した又は近接した酵素は、タグ又は１つ以上のヌクレオチドの組み込みによって解離される他の副産物の検出を補助し得る。例えば、それぞれが参照によってその全てが本明細書に援用される、米国特許第８，８８９，３４８号；米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０２６４２０７Ａ１号、及びＰＣＴ国際出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３５６３０号及び第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３５６３５号を参照のこと。
本発明に記載の方法は、単一分子法であり得る。即ち、検出される信号は、単一の分子（例えば、単一のヌクレオチドの組み込み）から生じたものであり、複数のクローン性分子から生じたものではない。当該方法は、ＤＮＡの増幅を必要としない。
ヌクレオチドの組み込み事象は、複数のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ、ここで、Ｎは、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）、又はウリジン（Ｕ）及びそれらの誘導体である））を含む混合物によって生じうる。ヌクレオチドの組み込み事象は、単一の種類のヌクレオチド(例えば、ｄＡＴＰ)を含む溶液にからは、必ずしも生じない。ヌクレオチドの組み込み事象は、複数のヌクレオチド(例えば、ｄＡＴＰ、続いてｄＣＴＰ、続いてｄＧＴＰ、続いてｄＴＴＰ、続いてｄＡＴＰ)の交互溶液からは、必ずしも生じない。加えて、本開示全体に記載されているように、ヌクレオチドの組み込み事象は、タグ付けされたヌクレオチドの混合物にからも生じ得、タグ付けされたヌクレオチドは、４個以上のリン酸の長さの５’−ポリリン酸鎖（例えば、５’−テトラリン酸、５’−ペンタリン酸、５’−六リン酸、５’−ヘプタリン酸、５’−オクタリン酸）を含み得、かつタグ中に更なる化学基を含み得る。
「クリックケミストリー」のような化学結合方法
本明細書には、化学結合を用いてヌクレオチドにタグを結合させるための方法が記載されている。幾つかの実施形態において、タグは、「クリックケミストリー」反応又は「クリック反応」を用いてヌクレオチドに結合されている。クリック反応は、アジド及びアルキン（若しくはシクロオクチン）、又はテトラジン及びトランス−シクロオクテンのような特定の化学基のペア間の高速の不可逆反応である。クリック反応に使用される特定の化学基のペアは、共有結合の一部としてのトリアゾール、又は１，２−ジアジン(若しくはその互変異性体、ジヒドロピリジン)のような特定の化学基を含む共有結合を提供する。図２１は、本発明に開示されたタグ付けされたヌクレオシド結合を調製するのに有用な３つの例示的なクリック反応を示す一般的な反応スキームを示す。それらの３つの例示的な反応を更に下で記載する。
アジドとアルキンとの間の例示的なクリック反応は、アジド−アルキンヒュスゲン環化付加である。アジド−アルキンヒュスゲン環化付加は、１，２，３−トリアゾール共有結合を有する生成物化合物を得るための、アジド基を有する化合物及び末端又は内部のアルキン基を有する化合物間の１，３−双極子環化付加反応である。例示的なアジド−アルキンヒュスゲンクリック反応は、図２１の一般的なスキーム（Ａ）に従い、更に下のスキームにおいて詳述する。
Figure 2017515887
上記の例示的なアジド−アルキン環化付加反応のスキーム（例えば、９８℃で１８時間行われる）において、化合物２のアジド基は、化合物１のアルキン基と反応して、１，４−トリアゾール及び１，５−トリアゾール付加物の混合物である生成物組成物３が得られる。
銅触媒によるアジド−アルキン環化付加反応は、共有トリアゾール結合で連結されたクリック反応生成物も提供するが、非触媒１，３−双極子環化付加と比較して約１０７倍〜１０８倍という膨大な速度促進をもって進行し。更に、この銅触媒によるクリック反応は、広い温度範囲で起こり得、水性条件及び約４から１２までの範囲のｐＨに対して非感受性であり得、広い範囲の官能基を許容することができ、適切な条件下において、単一の異性体を得ることが可能である。例えば、参照によってその全てが本明細書に援用されるヒモ（Ｈｉｍｏ）ら（２００５）を参照のこと。銅触媒による化学反応は、図２１のスキーム（Ａ）に示す、２つの化合物（Ａ及びＢ）を結合するための一般的なスキームに従い、下記のスキームにおいて更に詳述される。
Figure 2017515887
水性条件に対する耐性故に、銅触媒によるアジド−アルキンクリック反応は、生物学的分子の共有結合のために用いられてきている。例えば、ワング（Ｗａｎｇ）ら（２００３）、プレソルスキー（Ｐｒｅｓｏｌｓｋｉ）ら（２０１１）を参照のこと。この銅触媒によるアジド−アルキンクリック反応は、本開示の方法に従ってヌクレオチドにタグを結合するためにも用いられることができ、また、タグとヌクレオチドとの間の共有結合内にトリアゾールを含むタグ付けされたヌクレオチドを提供することができる。
アジド修飾化合物とシクロオクチン修飾化合物（例えば、ジベンジルシクロオクチン「ＤＢＣＯ」で修飾）との間の、共有トリアゾール結合を含む両化合物の生成物複合体を得るための環化付加を用いる銅無しクリック反応も開発されてきている。例えば、ジェウェット（Ｊｅｗｅｔｔ）及びベルトッツィ（Ｂｅｒｔｏｚｚｉ）（２０１０）を参照のこと。トリアゾールによって２つの化合物Ａ及びＢを結合させるための銅無しのアジド−シクロオクチンクリック反応の使用のための一般的なスキームは、図２１の（Ｂ）に記載されている。幾つかの実施形態において、この銅無しクリック反応は、本開示の方法に従ってヌクレオチドにタグを結合するために使用することができ、タグとヌクレオチドとの間の共有結合中にトリアゾールを含むタグ付けされたヌクレオチドを提供し得る。
本開示のタグ付けされたヌクレオチドを提供するために有用な他のクリックケミストリー反応は、逆電子要請型ディールス−アルダー（ＩＥＤＤＡ）反応である。例えば、レイナー（Ｒｅｉｎｅｒ）ら（２０１４）並びに米国特許出願公開第２０１３／０２６６５１２Ａ１号及び第２０１３／００８５２７１Ａ１号を参照のこと。ＩＥＤＤＡクリック反応は、テトラジン修飾化合物とトランス−シクロオクテン修飾化合物との間の高速不可逆反応を用いて共有１，２−ジアジン結合、より具体的には、１，２−ジアジンの互変異性同等物のジヒドピリダジンを含む複合体生成物を提供する。１，２−ジアジン（ジヒドロピリダジン互変異性体）基で２つの化合物Ａ及びＢを結合するためのテトラジンとトランス−シクロオクテンとの間のＩＥＤＤＡクリック反応の使用のための一般的なスキームは、図２１の（Ｃ）に示されている。従って、幾つかの実施形態において、このＩＥＤＤＡクリック反応は、本開示の方法に従ってヌクレオチドにタグを結合するためにも使用することができ、タグとヌクレオチドとの間の共有結合内に１，２−ジアジン（ジヒドロピリダジン互変異性体）を含むタグ付けされたヌクレオチドを提供し得る。
タグへのヌクレオチドポリリン酸の結合は、ジスルフィドの形成（容易に切断可能な結合の形成）、アミドの形成、エステルの形成により、アルキル化（例えば、置換されたヨードアセトアミド試薬の使用）により、又はアルデヒドとアミン若しくはヒドラジンを用いた付加体の形成によっても達成され得る。参照によってその全てが本明細書に援用されるハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）（２００８年５月２日）に多くの結合化学を見つけることができる。
タグ付けされたヌクレオチド
幾つかの場合において、タグ付けされたヌクレオチドは、ポリメラーゼで触媒されたヌクレオチドの組み込み事象の間、ヌクレオチドから解離されるタグ（又は標識）を含む。タグは、ヌクレオチドの５’−リン酸又は５’−ポリリン酸鎖に結合され得る。幾つかの場合において、タグは、フルオロフォアを含まない。タグは、ナノポアによって検出されることが可能であり、その電荷、形状、サイズ、又はそれらの何れかの組み合わせによって同定（例えば、他のタグと区別）され得る。タグの例は、種々のポリマーを含む。各種類のヌクレオチド（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ）は、一般的に、一意的に認識可能なタグを含む。
本開示のタグは、静電的、電気化学的、及び／又は光学的な方法を用いて検出可能であり得る分子であり得る。幾つかの例において、タグは、所定の核酸分子（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ）に独特の電子的署名を提供し得る。
タグは、ヌクレオチド上の適切な何れかの位置に配置され得る。図１は、可能性のあるタグ付けされたヌクレオチドを示し、ここで、Ｒ１は、ＯＨであり得、Ｒ２は、Ｈ（即ち、デオキシリボヌクレオチド用）又はＯＨ（即ち、リボヌクレオチド用）であり得るが、Ｒ１及びＲ２のための他の選択も許容できる。図１において、Ｘは、何れかの適切なリンカーである。幾つかの場合において、リンカーは、切断可能である。リンカーの例は、限定されるものではないが、Ｏ、ＮＨ、Ｓ又はＣＨ２を含む。リンカーは、例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、又はＰ原子も含み得る。リンカーは、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、異なる長さ及び分子量のＰＥＧ、有機又は無機色素、蛍光又は蛍光性色素、薬剤、オリゴヌクレオチド、質量タグ、化学発光タグのような直接的に又は間接的に検出可能な基であり得、援用によりその全てが本明細書に援用される、米国特許出願第１３／９９４，４３１号で考察されるように正又は負の電荷を含み得る。
幾つかの実施形態において、適切なリンカーは、Ｃｙ３及びＣｙ３．５のような、蛍光シアニン色素（又は「ＣｙＤｙｅ」）を含む。そのような実施形態において、リンカー内のＣｙＤｙｅ基は、タグ付けされたヌクレオチドを検出するのに用いることが可能な追加的な基を提供するために用いられるか、又はＣｙＤｙｅ基は検出されず、リンカーに結合したタグ基を検出する能力を高める更なる構造を単に提供し得る。実際、オリゴヌクレオチドタグのリンカー部におけるＣｙＤｙｅ基の存在は、ナノポアによるタグ付けされたヌクレオチドの補足及び検出を向上させ得る。例１５は、ナノポアに結合したＤＮＡポリメラーゼに結合した際に、リンカー部にＣｙ３基を有するオリゴヌクレオチドタグが、タグ付けされたヌクレオチドのナノポアによる補足及び検出をどのように向上させるかを実証している。従って、幾つかの実施形態において、本開示は、タグ付けされたヌクレオチドを提供し、ここで、タグは、ＣｙＤｙｅ基を含み、幾つかの実施形態においてＣｙＤｙｅ基は、Ｃｙ３である。タグ付けされたヌクレオチドの幾つかの実施形態において、タグは、オリゴヌクレオチド及びリンカーを含み、リンカーは、更にＣｙＤｙｅ基を含む。
位置Ｚのための適切な化学基の例は、Ｏ、Ｓ、又はＢＨ３を含む。塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、又はそれらの誘導体を含む、核酸に組み込まれるのに適切な何れかの塩基であり得る。ユニバーサル塩基（即ち、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、及びＵの２つ以上と対になることが可能な塩基）も幾つかの場合（例えば、２’デオキシイノシン、ニトロインドール誘導体）において、受け入れられる。
リン酸の数（ｎ）は、何れかの適切な整数の値（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）である（例えば、ポリメラーゼによって核酸分子にヌクレオチドが組み込まれ得るリン酸の数）。幾つかの場合において、全ての種類のタグ付けされたヌクレオチドは、同じ数のリン酸を有するが、これは必要とされるものではない。幾つかの応用において、各種類のヌクレオチドに対して異なるタグがあり、リン酸の数は、種々のタグを区別するために使われる必要は必ずしもない。しかしながら、幾つかの場合において、２つ以上の種類のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ又はＵ）は、同じタグを有し得、１つのヌクレオチドを他と区別する能力は、リン酸の数によって（異なるｎの値を有する種々の種類のヌクレオチドによって）、少なくとも部分的に決定される。幾つかの実施形態において、ｎの値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上である。
適切なタグを以下に記載する。幾つかの場合において、タグは、ヌクレオチドの残りの部分の電荷に対して逆の符号である電荷を有する。タグが結合された場合、化合物全体の電荷は、中性であり得る。タグの解離は、２つの分子、即ち、荷電タグ及び荷電ヌクレオチドを生じさせ得る。荷電タグは、幾つかの場合において、ナノポアに進入し、それによって検出される。
適切なタグ付けされたヌクレオチドの更なる例を図２に示す。タグは、糖基、塩基、ポリリン酸基又はそれらの何れかの組み合わせに結合され得る。図２を参照して、Ｙは、タグであり、Ｘは、リンカー（幾つかの場合において、切断可能）である。更に、Ｒ１は、存在する場合には、一般的に−ＯＨ、−ＯＣＨ２Ｎ３又は−Ｏ−２−ニトロベンジルであり、Ｒ２は、存在する場合には、一般的に−Ｈ又は−ＯＨである。また、Ｚは、一般的にＯ、Ｓ、又はＢＨ３であり、ｎは、１、２、３、４、５、６、又は７を含む何れかの整数である。幾つかの場合において、Ａは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＦＦ、又はＮＨである。
続けて図２を参照して、４つの異なるタグ付けされたヌクレオチドのセットを使用することができ、これはタグ付けされたヌクレオチド上の各塩基の種類は、一般的に、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドのそれぞれの塩基の種類と異なり、各タグ付けされたヌクレオチド上のダグの種類は、一般的に、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドそれぞれのタグの種類と異なる。適切な塩基は、限定されるものではないが、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミン、或いはそれらそれぞれの誘導体を含む。幾つかの場合において、塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、又は５−メチルシトシン、或いはニトロピロール、ニトロインドール、ネブラリン、ゼブラリン、ベンゼン、若しくはそれらの誘導体のような非天然塩基（例えば、図２９参照のこと）のうちの１つである。
Ｒ１が−Ｏ−ＣＨ２Ｎ３である場合において、ヌクレオチドは、−ＣＨ２Ｎ３を取り除き、３’位に結合した−ＯＨ基をもたらし、それによって更なるタグ付けされたヌクレオチドの組み込みを可能とさせるために、組み込まれたタグ付けされたヌクレオチドを処理することを更に含む方法において用いることができる。
Ｒ１が−Ｏ−２−ニトロベンジルである場合において、タグ付けされたヌクレオチドは、−２−ニトロベンジルを取り除き、その結果として−ＯＨ基が３’位に結合し、それによって更なるタグ付けされたヌクレオチドの組み込みを生じさせるように、タグ付けされたヌクレオチドの組み込みを行うことを更に含む方法において用いられ得る。
タグは、ナノポアの中で又はナノポアの補助によって検出されることが可能な何れかの化学基であり得る。幾つかの場合において、タグは、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、オリゴヌクレオチド（６量体を超える長さのもの）、ポリヌクレオチド、脂肪族酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、又はそれらの組み合わせのうち１種以上を含む。
化合物中のリン酸の数をバランスさせるために、タグが適切な数のリシン又はアルギニンを更に含むことも企図されている。
幾つかの場合において、タグはポリマーである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ポリマーの一例であり、以下の構造を有する。
Figure 2017515887
何れかの数のエチレングリコール単位（Ｗ）を用いることができる。幾つかの場合において、Ｗは、０〜１００の整数である。幾つかの場合において、エチレングリコール単位の数は、ヌクレオチドの各種類について異なる。一つの実施形態において、４つの種類のヌクレオチドは、１６、２０、２４又は３６個のエチレングリコール単位を有するタグを含む。幾つかの場合において、タグは、クマリン系色素のような追加の特定可能な基を更に含む。幾つかの場合において、ポリマーは荷電している。幾つかの場合において、ポリマーは荷電しておらず、タグは高濃度の塩（例えば、３〜４Ｍ）中で検出される。幾つかの場合において、ポリマーはリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。加えて、ポリマーはアミノ酸サブ単位を含むポリペプチドであり得る。
幾つかの場合において、タグは、複数のＰＥＧ鎖を含む。１つの例においては、タグは、以下の構造：
Figure 2017515887
を有し、ここで、Ｒは、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、ＳＨ、又はＮ３であり、Ｗは、０から１００までの整数である。例えば、参照によりその全てが本明細書に援用される、米国特許出願第１３／９９４，４３１を参照のこと。
上述したように、幾つかの実施形態において、タグ付けされたヌクレオチドのタグはそれ自体がオリゴヌクレオチドを含み得る。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは、天然塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）、非天然（又は修飾）ヌクレオチド塩基、又はそれらの混合物を含み得る。幾つかの例示的な非天然（又は修飾）塩基は、図２９に示され、限定されないが、ニトロピロール、ニトロインドール、ネブラリン、ゼブラリン、及びベンゼン、並びにそれらの誘導体を含む。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは天然のホスホジエステルヌクレオチド間結合を含み得るか、又はリン酸トリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、又はボロノホスフェートのような非天然ヌクレオチド間結合を有し得る。幾つかの場合において、ヌクレオチド間結合は、モルホリノ基である。
更に後述するように、オリゴヌクレオチドタグは、ナノポアにより、ナノポアに関連付けられたセンサーにおける検出可能な電流の変化を生じさせる該タグのポア中における存在によって検出され得る。しかしながら、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする必要はない。実際、オリゴヌクレオチドタグの鋳型配列へのハイブリダイゼーションは、ナノポアによるシークエンシングにおいて必要な適切な電流遮断信号の提供において問題を生じさせる可能性がある。従って、幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは、１つ以上の非天然塩基（例えば、上述したようなもの）又は非天然糖基（更に後述する）を有するヌクレオチドを含み得る。そのような非天然塩基及び糖基は、天然ヌクレオチドと水素結合を形成せず、それゆえ、シークエンシングされる核酸鋳型にハイブリダイズしない。
加えて、幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは、Ｌ−ヌクレオチド（Ｄ−ヌクレオチドではなくて）を含み得る。本開示のオリゴヌクレオチドタグに用いられ得る例示的なＬ−ヌクレオチドは、図３２のＡ）に示される。Ｌ−核酸は、一般的に、一本鎖天然ＤＮＡ及びＲＮＡを識別しない（例えば、アッセリン（Ａｓｓｅｌｉｎｅ）ら（１９９１）及びガルベシ（Ｇａｒｂｅｓｉ）ら（１９９３）を参照のこと）。オリゴヌクレオチドタグは、全てＬ−ヌクレオチドであるか、又は、Ｌ−及びＤ−ヌクレオチドのそれらがシークエンシングされる核酸鋳型とハイブリダイズしない割合の混合物を含み得ることが企図されている。従って、本開示は、（ａ）末端リン酸を有するヌクレオチドポリリン酸基、及び（ｂ）トリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、アミド、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミドチオ付加物を介して末端リン酸に直接に、又は更なるリンカー部によって共有結合しているＬ−ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドタグを含む、タグ付けされたヌクレオチドを提供する。
天然ヌクレオチドは、リボースの１’位に関してのβ−Ｄ立体配置及び核酸塩基を有する。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは、α−Ｄ−ヌクレオチドを含み得る（図３３（Ａ））。オリゴヌクレオチドタグは、α−Ｄ−ヌクレオチド及びβ−Ｄ−ヌクレオチドの全て又はそれらがシークエンシングされる核酸鋳型とハイブリダイズしない割合の混合物を含み得る（図３３（Ｂ））。従って、本開示は（ａ）末端リン酸を有するヌクレオチドポリリン酸基、及び（ｂ）トリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、アミド、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミドチオ付加物を介して当該ヌクレオチドの末端リン酸に直接に、又は更なるリンカー部によって共有結合しているα−Ｄ−ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドタグを含む、タグ付けされたヌクレオチドを提供する。
他の実施形態において、本開示は、キム（Ｋｉｍ）ら（２００５）、セファー（Ｓｅｆａｈ）ら（２０１４）、並びにロメスバーグ（Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ）ら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１４）に記載されている非天然合成ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドタグを提供する。これらの刊行物に記載された非天然合成ヌクレオチドは、天然ヌクレオチド（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、デアザプリン又はそれらの誘導体）とＨ結合を形成せず、それゆえ、天然の核酸鋳型とはハイブリダイズしない。そのような非天然合成ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドタグは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり得、また、全ての非天然ヌクレオチド又は幾つかの天然ヌクレオチドを含む混合物を含み得る。
他の側面において、本開示は、タグ付けされたヌクレオチドを提供し、ここで、タグは、タグ中のヌクレオチドの対の間に少なくとも１つの２’，５’結合を（天然３’，５’結合よりも）有するオリゴヌクレオチドを含む。図３３（Ｂ）は、２’，５’結合及び３’，５’結合ヌクレオチドを比較した図を示す。このような２’，５’結合オリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡに選択的に結合し、ＤＮＡ鋳型には結合しない（ブハン（Ｂｈａｎ）ら（１９９７））。それゆえ、２’，５’結合オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドタグは、シークエンシングされる核酸鋳型には結合しないと予想される。オリゴヌクレオチドタグは、２’，５’結合ヌクレオチドのみを含み得るか、又は２’，５’結合及び３’，５’結合ヌクレオチドの混合物を含み得ると企図される。従って、本開示は（ａ）末端リン酸を有するヌクレオチドポリリン酸基、及び（ｂ）トリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、アミド、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミドチオ付加物によって、ヌクレオチドの末端リン酸に直接に、又は更なるリンカー部によって共有結合している１〜１００個の２’，５’結合ヌクレオチド単位の鎖を含むタグを含む、タグ付けされたヌクレオチドを提供する。
他の側面において、本開示は、タグ付けされたヌクレオチドを提供し、ここで、タグは、少なくとも１種類の修飾された糖及び／又はリン酸基を有するオリゴヌクレオチドを含む。本開示のオリゴヌクレオチドタグに使用することができる例示的な修飾された糖及び／又はリン酸基は、図３４に示される。オリゴヌクレオチドタグは、オリゴヌクレオチドタグ中に、修飾された糖及び／又はリン酸基のみを含むか、又は修飾された糖及び／又はリン酸基並びに天然（例えば、リボース）ヌクレオチドの混合物を含み得ると企図される。従って、本開示は（ａ）末端リン酸を有するヌクレオチドポリリン酸基、及び（ｂ）トリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、アミド、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミドチオ付加物によってヌクレオチドの末端リン酸に直接に、又は更なるリンカー部によって共有結合している修飾された糖及び／又はリン酸基を含む１〜１００個のヌクレオシド単位の鎖を含むタグを含む、タグ付けされたヌクレオチドを提供する。
本開示によって提供されるタグ付けされたヌクレオチドの実施形態において、天然又は合成のオリゴヌクレオチドタグは、その５’又は３’末端のどちらかを介して直接に、又はリンカー部によってヌクレオチドの末端リン酸に共有結合され得ると企図される。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは、その５’末端を介して直接に、又はリンカー部によってヌクレオチドの末端リン酸に共有結合されている。そのような実施形態において、オリゴヌクレオチドタグの他方の末端にある３’ヒドロキシル基は、潜在的なエキソヌクレアーゼ分解からオリゴヌクレオチドを保護するように修飾されると企図される。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドタグの３’ヒドロキシ末端は、化学的修飾によってエキソヌクレアーゼ活性から保護される。３’ヒドロキシ末端の例示的な化学的修飾は、リン酸化、又は末端ヒドロキシル基を有するＣ３アルキルからＣ１２アルキルまでのスペーサーとの共有結合を含み得る。
幾つかの例において、タグは、分子（ｄＣｐ）ｍ、（ｄＧｐ）ｍ、（ｄＡｐ）ｍ、及び（ｄＴｐ）ｍ、又は（ｄＣｐ）、（ｄＧｐ）、（ｄＡｐ）、及び（ｄＴｐ）の１つ以上の単位の組み合わせから選択される。図３及び図４は、ヌクレオチドに結合されたこれらの分子を示す。ここで、ｍは、独立に、０から１００までの整数であり、ｍが０である場合、ｄＮＰＰの末端リン酸は、構造の左手側に示されるヌクレオシドの３’のＯ原子に直接結合されている。幾つかの場合において、ｎの値は、各塩基の種類によって異なる。
幾つかの場合において、タグは、アルキル、アルケニル、アルキニルのような置換又は非置換のヒドロカルビルであり、３０００ダルトン以下の質量を有する。
本明細書で用いられる用語「アルキル」は、特定の数の炭素原子を有し、非置換の又は置換されていてもよい分岐鎖及び直鎖両方の飽和脂肪族炭化水素基を含む。本明細書で用いられる用語「アルケニル」は、直鎖又は分岐鎖であり、少なくとも１つの炭素から炭素への二重結合を含み、可能な最大数までの非芳香族炭素−炭素二重結合が存在し得、非置換又は置換されていてもよい非芳香族炭化水素基をいう。用語「アルキニル」は、直鎖又は分岐鎖であり、少なくとも１つの炭素から炭素への三重結合を含み、可能な最大数までの非芳香族炭素−炭素三重結合が存在し得、非置換又は置換されていてもよい炭化水素基をいう。用語「置換された」は、アルキルのような上述の機能的な基、又は、ヒドロカルビルであって、それらに含まれる少なくとも１つの水素原子への結合が、通常の原子価が維持され、置換によって安定な化合物が生じるという条件の下で、非水素又は非炭素原子への結合に変えられているものをいう。置換基もまた、炭素又は水素原子への１つ以上の結合がヘテロ原子への二重又は三重結合を含む１つ以上の結合に変えられている基を含む。
図５は、末端リン酸に結合したタグ５０５を有するヌクレオシドを示す。ここに示されるように、塩基は何れかの塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕ又はそれらの誘導体）であり得、Ｒは、何れかの化学基（例えば、Ｈ、ＯＨ）であり得、ｎは、何れかの整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）であり得、Ｘは、何れかの化学基（例えば、Ｏ、ＮＨ、Ｓ）であり得、Ｙは、Ｘと共有結合を形成し、かつタグに結合する何れかの機能的な基であり得る。タグの例は、限定されないが、何れかのサイズ（例えば、２〜１００個の塩基、５〜５０個の塩基、又は２〜４０個の塩基を含む）のオリゴヌクレオチドタグを含む。幾つかの場合において、オリゴヌクレオチドタグは、ホモポリマー又はヘテロポリマーとしてのニトロピロール、ニトロインドール、ネブラリン、ゼブラリン、ベンゼン、又はそれらの誘導体を有する。幾つかの場合において、タグは、リン酸トリエステル、リン酸ジエステル、ホスホロアミド酸、ホスホロチオエート、メチルホスホネート又はボロノホスフェートのヌクレオチド間結合を有する。幾つかの場合において、ヌクレオチド間結合は、モルホリノ基である。
幾つかの実施形態において、タグは、「クリックケミストリー」として知られるアジド−アルキンヒュスゲン環化付加を用いてヌクレオチドへ結合されている。例えば、図６は、クリックケミストリーを用いて、６つの炭素スペーサー及び反応性アルキン基を有するタグ（右）と反応する、６個の炭素スペーサー及び反応性アジド基を末端リン酸に結合した６個のリン酸を有するヌクレオチド（左）を示す。本明細書の他の箇所に記載されるように、図２１の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、２つの化合物（Ａ及びＢ）を結合するための３つの例示的なクリックケミストリー反応を示す。これらの３つの例示的なクリック反応は、ヌクレオチドへのタグの結合における使用のために適用することが可能であり、それによって本開示のタグ付けされたヌクレオチドが製造される。このようなクリック反応の使用の詳細な記載は、例において提供される。
ある側面において、タグ付けされたヌクレオチドは、末端リン酸を含むポリリン酸尾部を含むヌクレオチドの提供によって形成される。ヌクレオチドの末端リン酸は、アルキン又はアジドに類似するリンカーによって共有結合し得る。タグは、「クリック」反応を用いてヌクレオチド末端リン酸−アジドに共有結合し、トリアゾールを形成し得る。トリアゾールは、アジドとアルキンとの間の反応によって形成され得る。幾つかの実施形態において、ポリリン酸尾部は、少なくとも３つのリン酸、少なくとも４つのリン酸、少なくとも５つのリン酸、少なくとも６つのリン酸、又は少なくとも７つのリン酸を含む。幾つかの実施形態において、ポリリン酸基は、４から６個までのリン酸を含む。幾つかの実施形態において、ポリリン酸基は、少なくとも６つのリン酸を含む。タグは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴ糖、炭水化物、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ビニルポリマー、他の水溶性ポリマー、ペプチド、及びそれらの何れかの組み合わせを含み得る。
幾つかの場合において、トリアゾールは構造：
Figure 2017515887
を有し、
Ｒ１は、タグを含み、Ｒ２は、ヌクレオチドを含み；或いは、Ｒ１は、ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、タグを含む。
幾つかの場合において、トリアゾールは、構造：
Figure 2017515887
を有し、
Ｒ１及びＲ３は、結合して環状部を形成し；及び結合したＲ１及びＲ３は、タグを含み、Ｒ２は、ヌクレオチドを含み；或いは、結合したＲ１及びＲ３は、ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、タグを含む。
本明細書において、タグ付けされたヌクレオチド製造する方法も提供され、当該方法は、ポリリン酸尾部を含むヌクレオチドを提供することを含み、ポリリン酸尾部は、末端リン酸を含む。末端リン酸は、アジド基又はアルキン基のどちらかを含み得る。当該方法は、アジド基又はアルキン基のどちらかを含むタグ分子を提供することを含み、ヌクレオチド及びタグ分子は、それぞれがアジド基を含むことはなく、ヌクレオチド及びタグ分子は、それぞれがアルキン基を含むことはない。当該方法は、ヌクレオチドをタグ分子と結合させるためにアジド基をアルキン基と反応させることも含み得る。幾つかの場合において、当該反応は、銅、ルテニウム、銀、又はそれらの何れかの組み合わせの塩を含む触媒によって促進される。
幾つかの場合において、当該反応は、触媒を必要としない。触媒は、アルキンがシクロオクチン（例えば、ジメンジルシクロオクチン）である場合必要でない可能性がある。
幾つかの場合において、（ａ）環状トリメタリン酸の生成が起こる条件下でヌクレオシド三リン酸をジシクロヘキシルカルボジイミド/ジメチルホルムアミドと接触させること；（ｂ）−ＯＨ又は−ＮＨ２で官能化された化合物を形成するように操作（ａ）から生じた生成物を求核試薬と接触させること；及び（ｃ）タグが間接的に末端リン酸に結合し、それによってタグ付けされたヌクレオチドが形成される条件下において、操作（ｂ）の生成物をタグに結合した−ＣＯＲ基を有するタグと反応させることによって、タグは、末端リン酸に結合され得る。
幾つかの場合において、求核試薬は、Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＮＨ２、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＯＨ、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＮＨ２、又は、
Figure 2017515887
である。
幾つかの場合において、当該方法は、操作（ｂ）において、操作（ａ）から生じた生成物を構造：
Figure 2017515887
を有する化合物と接触させること、及びその後又はそれと同時に、構造：
Figure 2017515887
を有する化合物を形成させるように当該生成物をＮＨ４ＯＨと接触させることを含む。
操作（ｂ）の生成物は、その後、タグが間接的に末端リン酸に結合し、それによって構造：
Figure 2017515887
を有するタグ付けされたヌクレオチドが形成される条件下において、タグに結合した−ＣＯＲ基を有するタグと反応させられ得、
Ｒ１は、ＯＨであり、Ｒ２は、Ｈ又はＯＨであり、塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリン又は５−メチルピリミジンである。
ヌクレオチドポリリン酸のタグへの結合は、ジスルフィドの形成（容易に切断可能な結合の形成）、アミドの形成、エステルの形成により、アルキル化（例えば、置換されたヨードアセトアミド試薬の使用）により、又は、アルデヒド及びアミン若しくはヒドラジンを用いた付加体の形成によっても達成され得る。参照によってその全てが本明細書に援用されるハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）（２００８）に多くの結合化学を見つけることができる。
末端リン酸又はオリゴヌクレオチドタグ上の反応性官能基及び官能基と反応することが可能な官能基を表１に提供する。それらの官能基と反応することが可能な反応性官能基は、リンカー上又はタグ上のどちらかに存在し得る。
Figure 2017515887
本開示の他の側面において、検出用電極に隣接した膜中のナノポアの補助による核酸試料のシークエンシングのための方法を提供する。当該方法は、ナノポアを含む反応チャンバー内に、トリアゾールによって末端リン酸に結合されたタグを有するタグ付けされたヌクレオチドを提供することを含み、当該タグ付けされたヌクレオチド中の個々のタグ付けされたヌクレオチドは、ナノポアの補助によって検出可能なヌクレオチドに結合したタグを含む。ポリメラーゼ反応は、ポリメラーゼの補助によって実行され、それによって、核酸試料からの一本鎖核酸分子に相補的な成長鎖中に、タグ付けされたヌクレオチド中の個々のタグ付けされたヌクレオチドが組み込まれる。ナノポアを用いて、個々のタグ付けされたヌクレオチドに関連付けられたタグは、ポリメラーゼの活性において三重複合体を形成した状態で検出され、当該形成によって、隣接したポア内にタグが進入若しくは配置され、及び／又はその後ポリメラーゼによって成長鎖に個々のタグ付けされたヌクレオチドが組み込まれ、それによってタグがヌクレオチドから切断された際にナノポアの補助によりタグが検出される。図７は、クリックケミストリーを用いて結合された４つの異なるタグにおけるセル電流測定値を示す。４つの異なるタグは、個別に分解し得、Ａ残基、Ｔ残基、Ｇ残基及びＣ残基に対応し得る。
分子の検出及び／又は特定のための方法
本開示は、分子の検出及び／又は特定のための方法を提供する。そのような方法は、核酸、タンパク質及び抗体などの様々な種類の生物学的なスピーシーズを検出するのに用いられ得る。幾つかの実施形態において、分子の特定のための方法が核酸分子をシークエンシングするために用いられる。
ある例において、核酸をシークエンシングするための方法は、シークエンシングされる核酸を有する生物学的試料を回収すること、当該生物学的試料から核酸試料を抽出又はそうでなければ単離すること、及び幾つかの場合においては、シークエンシングのための核酸を調製することを含む。
図８は、核酸試料をシークエンシングするための方法を模式的に示す。当該方法は、生物学的試料（例えば、組織試料、液体試料）から核酸分子を単離すること、及びシークエンシングのための核酸試料を調製することを含む。幾つかの場合において、核酸試料は細胞から抽出される。核酸を抽出するための幾つかの例示的な技術は、リゾチーム、超音波処理、抽出、高圧又はそれらの何れかの組み合わせの使用である。核酸は、幾つかの場合において無細胞核酸であり、核酸からの抽出は必要ではない。
幾つかの場合において、核酸試料は、タンパク質、細胞壁破片、及び核酸試料からの他の成分の除去を含むプロセスによって、シークエンシングのために調製され得る。このことを達成するための利用可能な多くの市販品があり、それは例えば、スピンカラムなどである。エタノール沈殿及び遠心分離も用いられ得る。
核酸試料は、複数の断片に分割（又は破断）され得、そのことは、例えば、アレイ状の複数のナノポアを含む装置の補助などによる核酸シークエンシングを容易にする。しかしながら、シークエンシングされる核酸分子の破断は、必ずしも必要ではない。
幾つかの場合において、長い配列が決定される（即ち、「ショットガンシークエンシング」法は必要でない可能性がある）。何れかの適切な長さの核酸配列が決定され得る。例えば、少なくとも約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、又は約１０００００等の塩基がシークエンシングされ得る。幾つかの場合において、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも８００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも３５００、少なくとも４０００、少なくとも４５００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００、少なくとも２００００、少なくとも４００００、少なくとも６００００、少なくとも８００００、又は少なくとも１０００００等の塩基がシークエンシングされる。幾つかの例においては、シークエンシングされる塩基は、隣接している。幾つかの場合において、核酸試料はシークエンシングの前に分割され得る。
タグは、何れかの方法によって解離され得る。タグは、ポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドの組み込みの間又は後に解離され得る。幾つかの場合において、タグは、ヌクレオチドのポリリン酸基に結合され（例えば、図１５）、核酸分子へのヌクレオチドの組み込みは、それに結合したタグを有するポリリン酸の解離を引き起こす（例えば、それを残りのヌクレオチド及び成長核酸鎖から離す）。当該組み込みは、ナノポアに結合することができる少なくとも１つのポリメラーゼによって触媒され得る。幾つかの場合において、少なくとも１つのホスファターゼ酵素もポアに結合されている。ホスファターゼ酵素は、解離されたポリリン酸タグからリン酸を切断し得る。幾つかの場合において、ホスファターゼ酵素は、タグがポアに入る前にポリメラーゼからのポリリン酸生成物がホスファターゼ酵素と相互作用するように配置される。
幾つかの場合において、タグは、ポリリン酸に結合していない（例えば、図２を参照のこと）。これらの場合、タグは、切断可能なリンカー（Ｘ）によって結合されている。切断可能にキャップされた及び／又は切断可能に結合されたヌクレオチドの製造のための方法は、参照により全てが本明細書に援用される米国特許第６，６６４，０７９号に開示されている。リンカーは、必ずしも切断可能である必要はない。
リンカーは、何れかの適切なリンカーであり得、何れかの適切な方法によって切断され得る。リンカーは、光分解性であり得る。ある実施形態において、光化学的に切断可能なリンカー又は基を光化学的に切断するためにＵＶライトが用いられる。ある実施形態において、光分解性リンカーは、２−ニトロベンジル基である。
−ＣＨ２Ｎ３基は、ヌクレオチドの３’−Ｏ−原子からそれを取り除き、それによって３’−ＯＨ基を形成するようにＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）で処理され得る。
幾つかの場合において、ポリメラーゼは、複数の異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及び／又はＵ）を含むタグ付けされたヌクレオチドのプールから引き込む。ポリメラーゼを、異なる塩基を個々に及び連続的に含む種々の種類のタグ付けされたヌクレオチドと接触させることも可能である。このような場合において、何れかの特定の反応の間１つのヌクレオチドのみが存在していることから、各種類のヌクレオチドが固有のタグを有する必要はない。
図１５は、核酸分子へのタグ付けされたヌクレオチドの組み込み（例えば、鋳型に対応するプライマー塩基を伸長するためにポリメラーゼを用いる）は、幾つかの実施形態において、検出可能なＴＡＧポリリン酸を解離し得る。幾つかの場合において、ＴＡＧ−ポリリン酸は、それがナノポアを通過することによって検出される。
幾つかの場合において、当該方法は、ポリリン酸を含むリン酸の数に基づいてヌクレオチドを特定する（例えば、タグが同一である場合であっても）。それにもかかわらず、各種類のヌクレオチドは、独特なタグを有し得る。
図１５を参照して、タグがナノポアの中へ及び／又は通して通過すること及びイオン電流を計測する前に、ＴＡＧ−ポリリン酸化合物は、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）で処置され得る。
タグは、それらがヌクレオチドから解離された後、ナノポアを通過し得る。幾つかの場合において、タグをナノポア中に配置する又はタグを引き入れるために電圧が印加される。解離されたタグの少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％が、ナノポアに入る、中に配置される、捕えられている、貫通して転位している、及び／又は通過し得る。
幾つかの場合において、タグは、それらが検出される時間に亘りナノポアに留まる。幾つかの場合において、ナノポア内にタグを引き入れるため、タグを検出するため、又はそれらの何れかの組み合わせのために電圧が印加される。タグは、ヌクレオチドの組み込み事象において解離され得る。
幾つかの実施形態において、ナノポアにおける電流変化事象は、タグがタグ付けされたヌクレオチドにまだ結合している間に、タグがその後ヌクレオチドから解離され、ナノポアチャネルを通過するときよりも、モニタリングされ、検出される。そのような実施形態において、タグは、タグ付けされたヌクレオチドがポリメラーゼの活性部位においてそれに相補的な鋳型ヌクレオチドと一緒に三重複合体中にある間、即ち、ヌクレオチドの組み込み及びリン酸転位の前に検出される。そのような実施形態において、タグの長い「尾部」は、三重複合体の形成中に隣接したナノポアのポア中に配置され（又は「捕捉され」）、それによってナノポアを介した電流値の変化（即ち、電流封鎖事象）が生じる。三重複合体に結合している間のタグの検出は、ポリメラーゼの使用、及び、ヌクレオチドの組み込み速度を、ナノポアにおけるタグ補足及び電流封鎖の測定速度よりも遅くなるように遅くした反応条件（例えば、ｐＨ、金属塩等）によって促進される。加えて、適切なポリメラーゼのナノポアへの共有結合連結は、マイクロ秒の単位での急速なタグの補足を引き起こし得る。
タグは、その電荷によってナノポアにおいて検出され得る（少なくとも部分的に）。幾つかの場合において、タグ化合物は、或いは、第１の正味電荷、及び、化学的、物理的又は生物学的反応の後、異なる第２の正味電荷を有する電荷化合物である。幾つかの場合において、タグにおける電荷の大きさは、化合物の残りの部分の電荷の大きさと同じである。ある実施形態において、タグは、正に荷電しており、タグの除去によって化合物の電荷が変化する。
幾つかの場合において、タグは、ナノポアに入っていく、ナノポア中に配置されるようになる、ナノポアの中に入る及び／又は通過し、それが電子的変化を生じさせ得る。幾つかの場合において、電子的な変化は、電流振幅の変化、ナノポアの伝導性の変化、又はそれらの何れかの組み合わせである。
ナノポアは、生物学的又は合成の或いは混合のナノポアであり得る。ポアは、タンパク質性であることも企図され、例えば、ポアはα溶血素タンパク質である。合成のナノポアの一例は、固体ポア又はグラフェンである。
幾つかの場合において、ポリメラーゼ酵素及び／又はホスファターゼ酵素は、ナノポアに結合されている。融合タンパク質又はタンパク質複合体を調製するための種々の技術が採用され得る。融合タンパク質又はジスルフィド結合は、タンパク質性のナノポアに結合するための方法の例である。固体のナノポアの場合において、ナノポア付近の表面への結合は、ビオチンストレプトアビジン結合を介したものであり得る。ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ基で官能化されたアルカンチオール自己組織化単分子層で修飾された金表面を介して固体表面に結合され、ここで、アミノ基は、ＤＮＡポリメラーゼ上のアミノ基への結合のために、ＮＨＳエステルに修飾されている。当該方法は、何れかの適した温度で行われ得る。幾つかの実施形態において、温度は、４℃〜１０℃である。幾つかの実施形態において、温度は、周囲温度である。当該方法は、何れかの適切な溶液及び／又は緩衝液中で行われ得る。幾つかの場合において、緩衝液は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳでｐＨ７．０から８．０までに中和された３００ｍＭのＫＣｌである。幾つかの場合において、緩衝液は二価の陽イオンを含まない。幾つかの場合において、当該方法は、二価の陽イオンの存在によって影響を受けない。
他の実施形態において、ナノポアタンパク質にポリメラーゼを結合するために「スパイキャッチャー（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）」法が用いられ得る。そのような方法において、化膿連鎖球菌フィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢのコラーゲン接着ドメイン（ＣｎａＢ２）の２つのフラグメントは、互いを認識し、その後、１つのフラグメント（即ち、「スパイキャッチャー」）中のリシンのε−アミノ基及び他方のフラグメント(即ち、「スパイタグ（ＳｐｙＴａｇ）」)中のアスパラギン酸のカルボキシル側基の間のペプチド結合を生じる。例えば、ザケリ（Ｚａｋｅｒｉ）とハワース（Ｈａｗａｒｔｈ）（２０１０）ＪＡＣＳ １３２：４５２６−７を参照のこと。従って、幾つかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、スパイタグがポアタンパク質モノマー（例えば、α溶血素）のアスパラギン酸残基へ結合すること、スパイキャッチャーがＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｉ２９又はＢｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼ）のＮ末端へ結合すること、及びスパイタグ及びスパイキャッチャーを介して共有ペプチド結合が形成することを生じさせることによって、ナノポアに結合され得る。
他の実施形態において、ポリメラーゼ及びナノポアタンパク質の共有結合は、参照により本明細書に援用される米国仮特許出願第６２／１３０，３２６号に記載されているように、逆電子要請型ディールス−アルダー（ＩＥＤＤＡ）反応を用いて調製され得る。そのような実施形態において、当該結合は、ナノポアを形成しているタンパク質（例えば、α溶血素）のモノマーにトランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）基を含むリンカーを結合すること、及びポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼ）に６−メチル−テトラジン（６−Ｍｅ−ＴＺ）基を含むリンカーを結合することによって調整される。穏やかな水性条件下で混合することによって、６−Ｍｅ−ＴＺ修飾ポリメラーゼ及びＴＣＯ修飾ナノポアは、すぐに（１ｈ）及びほぼ定量的に共有結合を形成し、それは、ナノポア検出の応用において用いられ得るポリメラーゼ及びナノポアタンパク質の結合を提供する。
幾つかの場合において、電流は、異なる印加電圧で測定され得る。これを達成するために、所望の電位が電極に印加され得、印加された電位は、その後、測定の間中維持され得る。ある実施において、オペアンプの積分器トポロジーは、本明細書に記載されるように、この目的のために使用され得る。積分器は容量帰還の方法により、電極における電位を維持する。
電位「Ｖｌｉｑｕｉｄ」は、チップ上の全てのセルに共通の電位（例えば、３５０ｍＶ）を提供するチャンバーに適用され得る。積分回路は、電極（電気的に積分コンデンサの天板である）を共通液電位よりも大きい電位に初期化し得る。例えば、４５０ｍＶでのバイアスは電極及び液体の間に１００ｍＶの正電位を与え得る。この正電位は、電極から液体チャンバー接点に流れる電流を引き起こし得る。この場合、キャリアは、（ａ）二重膜の電極（トランス）側から二重膜の液体リザーバ（シス）側へとポアを通して流れるＫ＋イオン、及び（ｂ）以下の電気化学反応：Ａｇ＋Ｃｌ−→ＡｇＣｌ＋ｅ−に従って銀電極と反応するトランス側の塩素（Ｃｌ−）イオンである。
幾つかの場合において、Ｋ＋は、閉鎖的なセルの外へ流れ（二重膜のトランスからシス側へ）、一方で、Ｃｌ−は、塩化銀に変換される。二重膜の電極側は、電流の流れの結果として、脱塩され得る。幾つかの場合において、銀／塩化銀液多孔質材料又は基質は、回路を完成するために、電気的チャンバーの接点で発生する逆反応においてＣｌ−イオンを供給するためのリザーバとして働き得る。
幾つかの場合において、電子は最終的に、測定される電流を生成する積分コンデンサの上面側に流れる。電気化学反応は、銀を塩化銀に変換し、電流は、変換される利用可能な銀がある限り流れ続けるであろう。銀の限定的な供給は、幾つかの場合において、電流に依存する電極寿命につながる。幾つかの実施形態において、空乏化されない電極材料（例えば、白金）が使用される。
分子の検出及び／又は特定のための装置及びシステム
本開示は、分子の検出及び／又は特定のためのシステムを提供する。そのようなシステムは、核酸、タンパク質及び抗体などの様々な種類の生物学的なスピーシーズを検出するのに用いられ得る。幾つかの実施形態において、分子の検出及び／又は特定のためのシステムは、核酸分子をシークエンシングするために用いられる。
核酸をシークエンシングするためのシステムは、積分回路のような検出回路の検出電極に隣接して配置される膜中に形成された又はそうでなければ埋め込まれたナノポアを含み得る。積分回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）であり得る。幾つかの例において、積分回路は、電界効果トランジスタ又は相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。検出回路は、ナノポアを有するチップ又は他の装置の内部に、或いは、オフチップ構成におけるようにチップ又は装置と離れて位置され得る。半導体は、限定されないが、ＩＶ族（例えば、シリコン）及びＩＩＩ〜Ｖ族（例えば、ヒ化ガリウム）の半導体を含む何れかの半導体であり得る。
幾つかの場合において、核酸又はタグがナノポアを通過する又は近接すると、検出回路は、核酸又はタグに関連づいた電気的信号を検出する。核酸は、より大きな鎖のサブ単位であり得る。タグは、ヌクレオチドの組み込み事象、或いはタグ付けされたヌクレオチドと、ナノポア又は、タグがポア中に入るか又は配置されるようにタグ付けされたヌクレオチドを留めておき、その後、核酸伸長生成物へのヌクレオチドの組み込みにおいてヌクレオチドからタグを切断する酵素のようなナノポアに結合したスピーシーズとの間の他の相互作用の副生成物であり得る。検出された信号は、回収され、記憶部に蓄積され、後で核酸の配列を組み立てるのに用いられ得る。回収された信号は、エラーのような、検出された信号における何れかの異常について説明するために処理されてもよい。
図９は、それぞれが参照によって全てが本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０１９３５７０Ａ１号、第２０１３／０２４４３４０Ａ１号及び第２０１３／０２６４２０７Ａ１号に記載された方法に従って調製することができる、温度制御を有するナノポア検出器（又はセンサー）の例を示す。図９Ａを参照して、ナノポア検出器は、導電性溶液（例えば、塩溶液）９０７と接触している上部電極９０１を含む。底部導電性電極９０２は、膜９０５に挿入されているナノポア９０６に、近いか、隣接しているか、又は極めて接近している。幾つかの場合において、底部導電性電極９０２は、半導体９０３に埋め込まれており、電気回路は半導体基板９０４中に埋め込まれている。半導体９０３の表面は、疎水性となるように処理されていてもよい。検出される試料は、ナノポア９０６中のポアを通過する。半導体チップセンサーは、容器９０８内に配置され、次に、これは、温度制御素子９０９の近傍にある。温度制御素子９０９は、熱電加熱及び／又は冷却装置（例えば、ペルチェ素子）であり得る。複数のナノポア検出器が、ナノポアアレイを形成し得る。
図９Ｂを参照して、同様の符号は同様の要素を表し、膜９０５は、ウェル９１０の上部に形成され得、センサー９０２は、ウェルの表面の一部を形成している。図９Ｃは、電極９０２が、処理された半導体表面９０３から突出している一例を示す。
幾つかの例において、膜９０５は、半導体９０３上ではなく、底部導電性電極９０２上に形成される。膜９０５は、そのような場合、底部導電性電極９０２と結合相互作用を形成し得る。幾つかの場合においては、しかしながら、膜９０５は、底部導電性電極９０２及び半導体９０３上に形成される。そうでなければ、膜９０５は、底部導電性電極９０２上ではなく、半導体９０３上に形成され得るが、底部導電性電極９０２の上部に伸びていてもよい。
ナノポアは、幾つかの場合においては電気的検出によって、間接的に核酸分子をシークエンシングするのに用いられ得る。間接的シークエンシングは、成長鎖へ組み込まれたヌクレオチドがナノポアを通過しない何れかの方法であり得る。核酸分子は、ナノポアから何れかの適切な距離を取って及び／又はナノポアの極めて近く、幾つかの場合において、ヌクレオチドの組み込み事象から解離されたタグがナノポア中で検出されるような距離で通り得る。
ヌクレオチドの組み込み事象の副生成物は、ナノポアによって検出され得る。「ヌクレオチドの組み込み事象」は、成長するポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドの組み込みである。副生成物は、特定の種類のヌクレオチドの組み込みと相関があり得る。ヌクレオチドの組み込み事象は、一般的に、ＤＮＡポリメラーゼのような酵素で触媒され、各位置で組み込みのために利用可能なヌクレオチドの中から選択するために、鋳型分子との塩基対相互作用を使用する。
核酸試料は、タグ付けされたヌクレオチドを用いてシークエンシングされ得る。幾つかの例において、核酸分子をシークエンシングするための方法は、（ａ）タグ付けされたヌクレオチドを組み込むこと（例えば、重合）、ただし、個々のヌクレオチドに関連付けられたタグは、組み込みによって解離される、及び（ｂ）組み込みプロセス中に、タグがヌクレオチド−酵素複合体に接着し結合している間又はその解離のどちらかによって、ナノポアの補助によりタグを検出することを含む。幾つかの場合において、当該方法は、ナノポアを通して、個々のヌクレオチドに結合した又は個々のヌクレオチドから解離されたタグを移動させることを更に含む。解離された又は結合されているタグは、何れかの適切な技術によって、幾つかの場合においては酵素（若しくは分子モーター）及び／又はポアを通した電圧の差の補助によって移動させられ得る。そうでなければ、解離された又は結合されているタグは、酵素の使用無しでナノポア通して移動させられ得る。例えば、タグは、本明細書に記載したようにナノポアを通した電圧の差によって移動させられ得る。
幾つかの場合において、副生成物は、ナノポアを通過し、及び／又はナノポアにおいて検出可能な信号を生ずる。解離されたタグは、副生成物の一例である。幾つかの場合において、副生成物は、プロトン（即ち、ｐＨの変化）である。他の場合において、副生成物はリン酸（例えば、ヌクレオチド組み込み事象で解離されたリン酸）である。例えば、異なる種類のヌクレオチドの各々は異なる数のリン酸を含み得、解離されたリン酸の検出によって、組み込まれたヌクレオチドの種類を決定することができる。
方法の一例を図１０に示した。ここでは、核酸鎖１０００はナノポア１００２を通過するか又はその極めて近くを通る（しかし１００１の矢印で示したようには通らない）。酵素１０３（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、鋳型１０００として最初の核酸分子を用いて１回に１つのヌクレオチドを組み込むことによって、成長核酸鎖１００４を伸長する（即ち、酵素がヌクレオチド組み込み事象を触媒する）。
酵素１００３は、ナノポア１００２に結合されていてもよい。ナノポアに酵素を結合するための適切な方法は、分子内ジスルフィド結合の形成のような、又は、参照により本明細書に援用される米国仮特許出願第６２／１３０，３２６号に記載されているような逆電子要請型ディールス−アルダー（ＩＥＤＤＡ）反応のような他の共有結合反応を介した結合を含む。ナノポア及び酵素は、単一のポリペプチド鎖によってコードされた融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質を製造するための方法は、当技術分野で知られており、当該酵素のためのコード配列をフレーム単位でナノポアのためのコード配列に隣接して融合すること（その間に終止コドンを有しない）、及び単一のプロモーターからこの融合配列を発現することを含む。幾つかの場合において、ホスファターゼ酵素もナノポアに結合される。
一般的に、本開示の方法に用いられるポリメラーゼは、５’→３’ＤＮＡポリメラーゼ活性及び強い鎖置換活性を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く何れかの天然又は非天然（例えば、合成された）酵素を含み得る。幾つかの場合において、ＤＮＡポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ又はそれらの異形、Ｅ・コーライＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、バチル・ススアロサーモフィラスからのＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎポリメラーゼ（ｅｘｏ−）Ａ４８５Ｌ／Ｙ４０９Ｖ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、ＤＮＡポリメラーゼＶ、或いはＶｅｎｔＲＤＮＡポリメラーゼである。
一般的に、ポリメラーゼは、酵素によって伸長され、それによってシークエンシングされる鋳型ＤＮＡ鎖にバイブリダイズするプライマー鎖の存在を必要とする。従って、本開示のナノポア装置の他の可能な構成において、プライマー鎖はポアタンパク質に結合され、鋳型ＤＮＡ鎖はこの結合したプライマー鎖にハイブリダイズされ、ポリメラーゼは鋳型プライマー混合物に結合し、それによってナノポア装置に非共有結合される。そのような実施形態は図３８に示される。相補的なタグ付けされたヌクレオチドに結合したタグは、静磁場勾配によってナノポアの内腔に引き付けられ、それが検出され、ポアにおける電流をモニタリングすることによって特定されることができることを確かにする。
核酸試料は、タグ付けされたヌクレオチドを用いてシークエンシングされ得る。幾つかの例において、核酸分子をシークエンシングするための方法は、（ａ）タグ付けされたヌクレオチドを重合すること、ただし、個々のヌクレオチドに関連付けられたタグは、重合において解離され、及び（ｂ）ナノポアの補助により解離されたタグを検出することを含む。
幾つかの例において、方法は、個々のヌクレオチドから解離されたタグを、ナノポアを通して移動させることを更に含む。解離されたタグは、幾つかの場合においては酵素（又は分子モーター）の補助によって、何れかの適切な技術によって、移動させられ得る。そうでなければ、解離されたタグは酵素の使用無しでナノポアを通して移動させられ得る。例えば、タグは、本明細書に記載されているように、ナノポアを通した電圧の差によって移動させられ得る。
続けて図１０を参照して、酵素は、タグ（１００５で示す白丸）に結合しているヌクレオチド（１００５で示す黒丸）のプールから引き込む。各種類のヌクレオチドは、タグが解離されてナノポア１００６を通過する際、それらがナノポアにおいて生じる信号に基づいて互いに差別化され得るように、異なるタグに結合され得る。
図１１は、異なるタグによって、それらがナノポアを通過した際に生じる異なる信号の例を示す。４つの異なる信号強度（１１０１、１１０２、１１０３及び１１０４）が検出される。これらは４つの異なるタグに対応する。例えば、アデノシン（Ａ）の組み込みによって解離されたタグは、振幅１１０１を有する信号を生じうる。シトシン（Ｃ）の組み込みによって解離されたタグは、より高い振幅１１０３を有する信号を生じうる。グアノシン（Ｇ）の組み込みによって解離されたタグは、更に高い振幅１１０４を有する信号を生じうる。チミン（Ｔ）の組み込みによって解離されたタグは、更に高い振幅１１０２を有する信号を生じうる。ナノポアを通るタグがないときの期間中の信号の欠乏は、１１０５によって表される。
ヌクレオチドの組み込み事象の速度は、一般的に、ヌクレオチドの組み込み事象で解離されたタグ分子が、ナノポアを通過する、及び／又はナノポアによって検出される速度よりも遅い（又は同じ）。一般的に、ヌクレオチドの組み込み事象の速度は、ヌクレオチドの組み込み事象で解離されタグ分子が、ナノポアを通過する、及び／又はナノポアによって検出される速度より早くない（即ち、そうでなければヌクレオチドの組み込み事象は正確に及び／又は正確な配列で検出されない）。
本開示は、分子の特定及び／又は検出のための種々の装置を提供する。図１２は、核酸の配列をシークエンシングする及び／又は本明細書に記載したタグを検出するために用いられ得るナノポア装置１００（又はセンサー）の模式図である。脂質二重膜を含むナノポアは、抵抗及び容量によってキャラクタリゼーションされ得る。ナノポア装置１００は、導電性固体基板１０６の脂質二重膜互換性表面１０４上に形成された脂質二重膜１０２を含み、脂質二重膜互換性表面１０４は、脂質二重膜非互換性表面１０５によって隔離され得、導電性固体基板１０６は絶縁材料１０７によって電気的に隔離され得、ここで、脂質二重膜１０２は脂質二重膜非互換性表面１０５上に形成されたアモルファス脂質１０３によって取り囲まれていてもよい。脂質二重膜１０２は、脂質二重膜１０２の２つの側の間を、キャラクタリゼーションされたタグ及び／又は小イオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋、Ｃｌ−）の通過のために十分に大きいナノポア１１０を有する単一のナノポア構造１０８に埋め込まれている。水分子の層１１４は、脂質二重膜互換性表面１０４上に吸着され得、かつ脂質二重膜１０２と脂質二重膜互換性表面１０４との間に挟まれていてもよい。親水性の脂質二重膜互換性表面１０４上に吸着されている水性膜１１４は、脂質分子の整列を補助し、及び脂質二重膜互換性表面１０４上の脂質二重膜の形成を促進し得る。核酸分子１１２及びタグ付けされたヌクレオチドの溶液を含む試料チャンバー１１６は、脂質二重膜１０２の上部に備えられ得る。溶液は、電解質を含む水性溶液であり得、最適なイオン濃度に中和されており、ナノポア１１０が開いた状態で維持される最適なｐＨに維持され得る。当該装置は、脂質二重膜を通過する電気刺激（例えば、電圧バイアス）を付与するため及び脂質二重膜の電気的特性（例えば、抵抗、容量及びイオン電流フロー）を検出するために可変電圧源１２０と接続されている、一対の電極１１８（負のノード１１８ａ及び正のノード１１８ｂをｈ含む）を含む。正電極１１８ｂの表面は、脂質二重膜互換性表面１０４の一部であるか、又は一部を形成している。伝導性固体基板１０６は、電極１１８のうち１つの一部と接続されているか、又は一部を形成し得る。装置１００は、電気刺激を制御するため及び検出された信号を処理するための電気回路１２２も含み得る。幾つかの実施形態において、可変電圧源１２０は、電気回路１２２の一部として含まれる。電気回路１１２は、増幅器、積分器、ノイズフィルタ、フィードバック制御ロジック、及び／又は種々の他の構成要素を含み得る。電気回路１２２は、シリコン基板１２８に集積されていてもよく、メモリー１２６に接続されているコンピュータプロセッサ１２４と更に接続されていてもよい。
脂質二重膜互換性表面１０４は、脂質二重膜の形成を促進するイオン伝達及びガス発生に適した種々の材料から形成され得る。幾つかの実施形態において、導電性又は反導電性の親水性の材料は、それらが脂質二重膜の電気的特性における変化の良好な検出を可能にし得ることから、用いられ得る。例示的な材料は、Ａｇ−ＡｇＣｌ、Ａｕ、Ｐｔ、又はドープされたシリコン、或いは他の半導体材料を含む。幾つかの場合において電極は、犠牲電極ではない。
脂質二重膜非互換性表面１０５は、脂質二重膜の形成に適していない種々の材料から形成され得、それらは、一般的に疎水性である。幾つかの実施形態において、非導電性の疎水性材料は、それが脂質二重膜領域を互いに分離することに加えて、脂質二重膜領域を電気的に絶縁するため、好ましい。例示的な脂質二重膜非互換性材料は、例えば、窒化ケイ素（例えば、Ｓｉ３Ｎ４）及びテフロン（登録商標）を含む。
ある例において、ナノポア装置１００は、アルミニウム材料１０６上にを被覆する脂質二重膜互換性Ｐｔ表面１０４の上部に形成されたジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）脂質二重膜１０２に埋め込まれた単一のアルファ溶血素（αＨＬ）タンパク質１０８を有するアルファ溶血素（αＨＬ）ナノポア装置であり得る。脂質二重膜互換性Ｐｔ表面１０４は、脂質二重膜非互換性窒化ケイ素表面１０５によって隔離され、アルミニウム材料１０６は、窒化ケイ素材料１０７によって電気的に絶縁されている。アルミニウム１０６は、シリコン基板１２８に集積されている電気回路１２２と接続されている。チップ上に配置された又はカバー板１２８から下に伸びている銀−塩化銀電極は、核酸分子を含む水性溶液に接する。
αＨＬナノポアは、７つの個別のペプチドの集合である。αＨＬナノポアの入り口又は前庭の直径は、約２６オングストロームであり、それはｄｓＤＮＡ分子の一部を収容するのに十分に広い。前庭から、αＨＬナノポアは、最初は広がっており、その後約１５オングストロームの直径を有するバレルまで狭まり、これは、単一のｓｓＤＮＡ分子（又は解離されたタグ）が通過することができる程度に十分に広いが、ｄｓＤＮＡが通過することができるには十分に広くない。
ＤＰｈＰＣに加えて、ナノポア装置の脂質二重膜は、用いられるナノポアの種類と、キャラクタリゼーションされる分子の種類と、形成される脂質二重膜の安定性及び透過性、抵抗並びに容量のような、形成される脂質二重膜の種々の物理的、化学的及び／又は電気的特性とのような種々の考慮に基づいて選択される、種々の他の適切な脂肪族の材料から構成され得る。例示的な脂肪族の材料は、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジル−コリン（ＰＯＰＣ）及びジオレオイル−ホスファチジル−メチルエステル（ＤＯＰＭＥ）、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びスフィンゴミエリンのような種々のリン脂質を含む。
上記のαＨＬナノポアに加えて、ナノポアは、種々の他の種類のナノポアであり得る。例は、γ溶血素、ロイコシジン、メリチン、並びに種々の他の天然の、修飾された天然の、及び合成のナノポアを含む。適切なナノポアは、ナノポアのポア径に関連する分析物分子のサイズのような、分析物分子の種々の特性に基づいて選択することができる。例えば、約１５オングストロームの制限されたポアサイズを有するαＨＬのナノポア。
図１３は、複数の核酸分子がナノポア検出器のアレイによってシークエンシングされ得ることを示す。ここでは、各ナノポア位（例えば、１３０１）は、幾つかの場合において、ポリメラーゼ酵素及び／又はホスファターゼ酵素が結合しているナノポアを含む。本明細書の他の箇所に記載されているように、一般的に、各アレイの位置にセンサーも存在する。
幾つかの例において、核酸ポリメラーゼと結合しているナノポアのアレイが提供され、タグ付けされたヌクレオチドは、ポリメラーゼによって重合される。重合中に、タグは解離され、ナノポアによって検出される。ナノポアのアレイは、何れかの適切な数のナノポアを有し得る。幾つかの場合において、アレイは、約２００個、約４００個、約６００個、約８００個、約１０００個、約１５００個、約２０００個、約３０００個、約４０００個、約５０００個、約１００００個、約１５０００個、約２００００個、約４００００個、約６００００個、約８００００個、約１０００００個、約２０００００個、約４０００００個、約６０００００個、約８０００００個、約１００００００個等のナノポアを含む。幾つかの場合において、アレイは、少なくとも２００個、少なくとも４００個、少なくとも６００個、少なくとも８００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１００００個、少なくとも１５０００個、少なくとも２００００個、少なくとも４００００個、少なくとも６００００個、少なくとも８００００個、少なくとも１０００００個、少なくとも２０００００個、少なくとも４０００００個、少なくとも６０００００個、少なくとも８０００００個、少なくとも１００００００個等のナノポアを含む。
幾つかの場合において、単一のタグは、単一のヌクレオチドの組み込みによって解離され、１つのナノポアによって検出される。他の場合において、複数のタグが複数のヌクレオチドの組み込みによって解離される。ナノポアに隣接しているナノポアセンサーは、個々の解離されたタグ又は複数の解離されたタグを検出し得る。複数の解離されたタグに関連した１つ以上の信号が検出され得、平均の信号が得られるように処理され得る。
タグは、時間の関数としてセンサーによって検出され得る。時間と一緒に検出されるタグは、例えば、センサーデータを記録するようにプログラムされ、データから配列情報を作製するコンピュータシステム（例えば、図１４参照のこと）の補助などによって、核酸試料の核酸配列を決定するために用いられ得る。
シークエンシングチップに基づくナノポアは、アレイとして配置されている自律動作される又は個別にアドレス可能な大量のセルを含み得る。例えば、１００万個のセルのアレイが、１０００個のセルの列によって１０００個のセルの行から構成され得る。このアレイは、例えば、ヌクレオチドの組み込み事象で解離されたタグがナノポアを通過する際に、導電性の差を測定することによって、核酸分子の平行したシークエンシングを可能にする。更に、この回路の実施は、特定のタグの区別において大変価値のあり得る、ポア−分子複合体の伝導特性を決定することを可能にする。
統合されたナノポア／二重膜電子的セル構造物は、電流測定を実行するために適切な電圧を印加し得る。例えば、（ａ）電極電位を制御すること、及び（ｂ）正確に実行するために電極電流を同時にモニタリングすることの両方が必要であり得る。
更に、セルを互いに独立に制御することが必要であり得る。セルの独立した制御は、異なる物理的状態におかれ得る大量のセルを管理するために必要であり得る。電極に印加される区分的線形電圧波形刺激の正確な制御は、セルの物理的状態間を遷移するために使用され得る。
回路のサイズ及び複雑さを低減するために、２つの別々の電圧を印加するためのロジックが提供されることが十分であり得る。これは、セル及び対応する状態遷移刺激の２つの独立したグループ分けが適用されることを可能にする。状態の遷移は、比較的低い発生率で、本質的に確率論的である。従って、適切な制御電圧をアサートし、その後、所望の状態の遷移が発生したか否かを決定するための測定を実行することができることは、非常に有用であり得る。例えば、適切な電圧がセルに印加され、次いでポアが形成されたかどうかを決定するために電流が測定される。セルは、２つのグループに分けられる：（ａ）ポアの形状を有しているものであり、電圧を印加される必要がない。それらのセルは、ヌル操作（ＮＯＰ）に影響を与えるために０Ｖのバイアスを印加され得、それは、同じ状態のままであり、及び（ｂ）ポアの形状を有していないもの。それらのセルは、再びポア形成電圧を印加されるであろう。
実質的な単純化及び回路サイズの縮小は、許容印加電圧を２つに拘束すること、及び物理的状態間のバッチ内へセルを反復的に移行することによって達成することができる。例えば、許容印加電圧の拘束によって、少なくとも１．１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００倍の縮小が達成され得る。
コンピュータ制御システム
本開示の核酸シークエンシングシステム及び方法は、コンピュータシステムの補助によって制御され得る。図１４は、核酸シークエンシングシステム１４０２と接続したコンピュータシステムを含むシステム１４００を示す。コンピュータシステム１４０１は、１つのサーバ又は複数のサーバであり得る。コンピュータシステム１４０１は、試料調整及び処理、並びにシークエンシングシステム１４０２による核酸シークエンシングを制御するようにプログラムされ得る。シークエンシングシステム１４０２は、本明細書の他の箇所に記載されるように、ナノポアに基づくシークエンサー（又は検出器）であり得る。
コンピュータシステムは、本発明の方法を実施するためにプログラムされ得る。コンピュータシステム１４０１は、中央処理ユニット（本明細書では、ＣＰＵ、また「プロセッサ」）１４０５を含み、それは単一のコア又は複数のコアプロセッサ、或いは平行プロセッシングのための複数のプロセッサであり得る。コンピュータシステム１４０１は、メモリ１４１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶ユニット１４１５（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース１４２０（例えば、ネットワークアダプタ）、並びに、キャッシュ、他のメモリ、データストレージ、及び／又は電子ディスプレイアダプタのような周辺機器１４２５も含む。メモリ１４１０、記憶ユニット１４１５、インターフェース１４２０及び周辺機器１４２５は、マザーボードのような通信バス（実線）を介してＣＰＵと接続している。記憶ユニット１４１５は、データを保存するためのデータ記憶ユニット（又はデータレポジトリ）であり得る。コンピュータシステム１４０１は、通信インターフェース１４２０の補助により、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）と作動可能に接続され得る。ネットワークは、インターネット、インターネット及び／又はエクストラネット、或いはインターネットと通信しているイントラネット及び／又はエクストラネットであり得る。ネットワークは、１つ以上のコンピュータサービスを含み得、それは、コンピューティングとは区別され得る。
本発明の方法は、例えば、メモリ１４１０又は電子記憶ユニット１４１５のようなコンピュータシステム１４０１の電子記憶部に保存された、機械（又はコンピュータプロセッサ）で実行可能なコード（又はソフトウェア）によって実装されることができる。使用の間、コードは、プロセッサ１４０５によって実行され得る。幾つかの場合において、コードは、記憶ユニット１４１５から取り出され得、プロセッサ１４０５によってアクセス可能なようにメモリ１４１０に保存され得る。幾つかの状況において、電子記憶ユニット１４１５は外部であり得、機械で実行可能な命令は、メモリに保存される。
コードは、コードを実行するために適合させたプロセッサを機械が有するような使用のために、プリコンパイル又は変更され得るか、或いは実行中にコンパイルされ得る。コードは、プリコンパイル又は実行時コンパイルされた方法において、コードを実行可能にできるように選択され得るプログラミング言語で提供され得る。
コンピュータシステム１４０１は、例えば、名称、物理的アドレス、Ｅメールアドレス、電話番号、インスタントメッセージ（ＩＭ）名、学歴、職歴、社会的に好きなもの及び／又は嫌いなもの、並びに使用者若しくは他の使用者に潜在的に関連する他の情報のような使用者のプロファイル情報を保存するように適用され得る。そのようなプロファイル情報は、コンピュータシステム１４０１の記憶ユニット１４１５に保存され得る。
コンピュータシステム１４０１のような本明細書に提供されるシステム及び方法の側面は、プログラミングにおいて実施され得る。技術の種々の側面は、例示的に、機械が読み込み可能な媒体の形式において実行又は実施される、機械（又はプロセッサ）で実行可能なコード及び／又は関連するデータの形の「商品」又は「製品」と企図され得る。機械で実行可能なコードは、メモリ（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ）又はハードディスクのような電子記憶ユニットに保存され得る。「記憶」型の媒体は、コンピュータ、プロセッサ等の実体メモリ、又は、ソフトウェアプログラミングにおいていつでも非一過性のストレージを提供し得る、種々の半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブ等のようなそれらの関連モジュールの何れか又は全てを含み得る。全て又は一部のソフトウェアは、時々、インターネット又は種々の他の電気通信ネットワークを介して接続される。それらの通信は、例えば、１つのコンピュータ又はプロセッサから他へ、例えば、管理サーバ又はホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアの読み込みを可能にし得る。それゆえ、ソフトウェア要素を保持し得る他の形式の媒体は、有線及び光学的な地上線のネットワークを介して並びに種々のエアリンク上でローカルデバイス間の物理的インターフェースを通じて用いられるような、光学的、電気的及び電磁的波を含む。有線又は無線のリンク、光学的リンク等のような波を運ぶ物理的な要素は、ソフトウェアを保持する媒体と企図され得る。本明細書で用いられる通り、非一過性の実体のある「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータ又は機械で「読み込み可能な媒体」のような用語は、実行のためのプロセッサへの命令の提供に参加する何れかの媒体をいう。
従って、コンピュータで実行可能なコードのような、機械で読み取り可能な媒体は、限定されないが、実体の記憶媒体、搬送波の媒体又は物理的伝達媒体を含む多くの形態を取り得る。非揮発性記憶媒体は、例えば、図面に示す、当該データベース等を実装するのに用いられ得るような、何れかのコンピュータ内の何れかの記憶装置等のような、光学的又は電磁的ディスクを含む。電圧記憶媒体は、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリのような、動的メモリを含む。実体の伝達媒体は、同軸ケーブル、即ち、コンピュータシステム内にバスを含むワイヤを含む導線及び光ファイバーを含む。搬送波伝達媒体は、電気的又は電磁的信号、或いは無線周波数（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生ずるような音響又は光波の形体を取りうる。従って、一般的なコンピュータで読み取り可能な媒体の形式は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、何れかの他の磁気的な媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ又はＤＶＤ−ＲＯＭ、何れかの他の光学的媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンによる何れかの他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、何れかの他のメモリチップ又はカートリッジ、搬送波伝達データ又は命令、そのような搬送波を伝達するケーブル又はリンク、或いは、プログラミングコード及び／又はデータを読み込み得るコンピュータからの何れかの他の媒体を含む。これらの多くの形式のコンピュータで読み込み可能な媒体は、実行するためのプロセッサに１つ以上の命令の１つ以上の配列を運ぶことに従事し得る。
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され記載されたが、そのような実施形態が単なる例示として提供されることは、当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、及び置き換えが可能であろう。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物によってカバーされることが意図される。
例
例１ クマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐでタグ付けされたヌクレオチドの合成
この例において、ヌクレオチドは、１５０ｘ４．６ｍｍカラム（スペルコ）での逆相ＨＰＬＣによって精製され、移動相は、Ａは、水（ｐＨ８．１）中の８．６ｍＭのＥｔ３Ｎ／１００ｍＭの１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、Ｂは、メタノールである。溶出は、１００％のＡの定組成で１０分間、続いて、０％〜５０％のＢの直線勾配で２０分間、その後５０％のＢの定組成で更に３０分間で行った。
クマリン−ＰＥＧｎ−ｄＧ４Ｐの合成は、図１６のスキームに示すようなＡ、Ｂ及びＣの３つの合成操作を含む。
Ａ． ２’−デオキシグアノシン−５’−テトラリン酸（ｄＧ４Ｐ）及びｄＧ４Ｐ−ＮＨ２の合成。最初に、２’−ｄＧ４Ｐの合成が、２’−ｄＧ４Ｐから開始されて行われる。３００ｕｍｏｌの２’−ｄＧＴＰ（トリエチルアンモニウム塩）を、無水ピリジン（５ｍｌ）中の１．５ｍｍｏｌ（５ｅｑ）のトリブチルアミンを用いて、トリブチルアンモニウム塩に変換する。得られた溶液を乾燥及び無水ＤＭＦ（ｘ２）との共蒸発によって濃縮する。ｄＧＴＰ（トリブチルアンモニウム塩）を５ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、１．５ｍｍｏｌの１，１−カルボニルジイミダゾールを添加する。反応物を６時間撹拌し、その後１２ｕｌのメタノールを添加し、３０分間連続して撹拌する。この溶液に、１．５ｍｍｏｌのリン酸（ＤＭＦ中のトリブチルアンモニウム塩）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で希釈し、０．１Ｍから１ＭまでのＴＥＡＢ勾配（ｐＨ７．５）を用いてセファデックス（登録商標）Ａ２５カラム上で精製した。ｄＧ４Ｐを勾配の終わりで溶出した。適切な画分を併せ、更に逆相ＨＰＬＣで精製し、１７５ｕｍｍｏｌの純粋なテトラリン酸（ｄＧ４Ｐ）を得る。３１Ｐ−ＮＭＲ：δ、−１０．７（ｄ、１Ｐ、α−Ｐ）、−１１．３２（ｄ、１Ｐ、δ−Ｐ）、−２３．２３（ｄｄ、２Ｐ、β、γ−Ｐ）、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｖｅモード）：Ｃａｌｃ.５８７．２；Ｆｏｕｎｄ５８５．９（Ｍ−２）。
２ｍｌの水及び３．５ｍｌの０．２Ｍの１−メチルイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ６）中の８０μｍｏｌのｄＧ４Ｐに、１５４ｍｇのＥＤＡＣ及び２６０ｍｇのジアミノヘプタンを加える。得られた溶液のｐＨを、濃ＨＣｌで６に調節し、室温で一晩撹拌する。この溶液を水で希釈し、セファデックス（登録商標）Ａ２５イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、続いて逆相ＨＰＬＣにより、約２０μｍｏｌのｄＧ４Ｐ−ＮＨ２が得られる。これは、ＥＳＩ−ＭＳデータ（−ｖｅモード）：ｃａｌｃ．６９９；Ｆｏｕｎｄ（６９８．１、Ｍ−１）によって確認される。
Ｂ． クマリン−ＰＦＧ−酸及びＮＨＳエステルの合成。市販のアミノ−ｄＰＥＧ（登録商標）−酸[アミノ−ｄ（ＰＥＧ）（登録商標）１６、２０、２４、３６−酸；クワンタ・バイオデザイン（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）]を６−メトキシクマリン−ＮＨＳエステルと反応させ、対応するクマリン−（ＰＥＧ）ｎ−酸が得られる。アミノ−ＰＥＧ−酸（１ｅｑ）を、炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ８．６）に溶解し、続いてＤＭＦ中のクマリン−ＮＨＳ（１ｅｑ）を添加し、反応混合物を一晩撹拌する。クマリン−ＰＥＧ−酸を、ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（５％〜１５％）混合物及び適切な併せた画分を用いて、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。これらの混合物は、１Ｈ ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析によって分析される。結果を表２に示す。
Figure 2017515887
クマリン−ＰＥＧ−酸は、１．５ｅｑの炭酸ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）及び２ｅｑの無水ＤＭＦ中のトリエチルアミンと２時間に亘り反応させることによって、対応するＮＨＳエステルに変換される。得られたＮＨＳエステルは、シリカゲルプレート上で酸よりもわずかに高く移動し、ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（５％〜１５％）混合物を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製され、次の操作で用いられる。
クマリン−ＰＥＧｎ−ｄＧ４Ｐを形成する、操作Ａ及びＢの生成物のカップリング。上記操作ＡからのｄＧ４Ｐ−へプチル−ＮＨ２を、０．１Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ８．６）中に取り、この撹拌された溶液（ＤＭＦ中）にクマリン−ＰＥＧ−ＮＨＳ化合物のうち一つを加える。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、その後シリカゲルカートリッジ上で精製する（反応しないクマリン−酸又は−ＮＨＳを取り除くためのＣＨ２Ｃｌ２中の１５％〜２５％のＭｅＯＨ、その後、６：４：１のイソプロパノール／ＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ）。これを逆相ＨＰＬＣによって更に２回精製し、純粋なクマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐを得る。構造をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳでの分析によって確認する。クマリン−ＰＥＧ１６−ｄＧ４Ｐの保持時間は、３１．７分、クマリン−ＰＥＧ２０−ｄＧ４Ｐの保持時間は、３２．２分、クマリン−ＰＥＧ２４−ｄＧ４Ｐの保持時間は、３３．０分、クマリン−ＰＥＧ３６−ｄＧ４Ｐの保持時間は、３４．３分である。結果を表３に示す。
Figure 2017515887
例２ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる解離されたタグのキャラクタリゼーション
予想されるクマリン−ＰＦＧ−ＮＨ２分子は、ＨＰＬＣ精製の後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によって確認される（図１７）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、酸加水分解によって生成されるクマリン−ＰＥＧ−ＮＨ２タグは、アルカリホスファターゼ処理後にポリメラーゼ反応中に生成される解離されたタグと同一であることを示す。
図１７を参照して、クマリン−ＰＥＧ１６−ＮＨ２が得られるクマリン−ＰＥＧ１６−ｄＧ４Ｐ、クマリン−ＰＥＧ２０−ＮＨ２が得られるクマリン−ＰＥＧ２０−ｄＧ４Ｐ、クマリン−ＰＥＧ２４−ＮＨ２が得られるクマリン−ＰＥＧ２４−ｄＧ４Ｐ、及びクマリン−ＰＥ３６−ＮＨ２が得られるクマリン−ＰＥＧ３６−ｄＧ４Ｐの酸加水分解によって生成するクマリン−ＰＥＧ−ＮＨ２タグは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によって示されるように、アルカリホスファターゼによる処理後にポリメラーゼ伸長反応において生成される対応する解離されたタグと同一である。４つの別々に得られたＭＳスペクトルの合成画像を示す。クマリン−ＰＥＧ−ＮＨ２タグの構造を下に示す。
例３ オリゴヌクレオチドタグの検出
ナノポアアレイ装置（例えば、図１２参照のこと）は、４つの異なるタグにおける４つの異なる電流値を検出するのに用いられる。図１８で見られるように、各タグは他の３つの何れと区別され得る（即ち、ヒストグラムは、対応するタグと一緒に画像にラベルされた４つの別々のピークを示す）。各タグは、約３０塩基長の「Ｔ」のオリゴヌクレオチドホモポリマーであり、潜在的に修飾された鎖中の２つの領域を有する３’末端がビオチン化されている。３０塩基長の分子の各々において、修飾されている領域は、３’末端から１１、１２、及び１３の塩基位置、並びに１７、１８、及び１９の位置である。ここにおいて用いられる「ｘ」は、無塩基部位（塩基が無い）、「Ｔ」はチミンである。４つのタグは、
（ａ）「フェイクタグ−ＸＸＸ＿ＸＸＸ」は、ストレプトアビジン−ビオチン−１０Ｔ−ｘｘｘ−３Ｔ−ｘｘｘ−１１Ｔ（配列番号１）の配列を有し、
（ｂ）「フェイクタグ−ＴＴＴ＿ＸＸＸ」は、ストレプトアビジン−ビオチン−１０Ｔ−ＴＴＴ−３Ｔ−ｘｘｘ−１１Ｔ（配列番号２）の配列を有し、
（ｃ）「３０Ｔ」タグは、ストレプトアビジン−ビオチン−３０Ｔ（配列番号３）の配列を有し、
（ｄ）「フェイクタグ−ｉＦｌｕｏｒＴ」は、ストレプトアビジン−ビオチン−１０Ｔ−ＴＴＴ−３Ｔ−ｉＦｌｕｏｒＴ−Ｔ−１１Ｔの配列を有し、ここで、１８位のＴはフルオレセインで標識されている（配列番号４）。
結果は、時間をかけて溶液から複数のタグ分子を補足するアレイ中の１つのポアにおけるものである。検出条件は、１ＭのＨＣｌで、２０ｍＭのＨＥＰＥＳにより中和されており、室温でｐＨ７．５である。各分子は、電圧が印加されている間ポア中に補足又は留められている。印加電圧は＋１６０ｍＶまで増加され、新しい分子が捕捉され、電圧は０Ｖまで減少され、タグ分子はポアを抜ける。この周期がその後繰り返される。４つの異なるタグは、すぐに試料混合物内に入る。
図１８に示されるように、ランプダウン時の電流もプロットされるため、ヒストグラムにおける１６０ｍＶの印加中に見られる明確なバンドは結合しているか又は少しついている。それにもかかわらず、各タグについて明確で再現性のある捕捉バンドが見られる。
図１９に示されるように、プロットの横軸は時間（秒単位で測定された）であり、対して電流（ピコアンペアの単位で測定された）が縦軸である。印加電圧波形は、示していない。印加電圧波形は、０Ｖ以下で開始し、＋１６０ｍＶまで急激に増加し、約２、３秒そのままである。電圧は、その後、０Ｖまで減少する。電流測定値は、印加電圧に従い、印加電圧が＋１６０ｍＶである間は、補足された分子の電流は平らであり、その後、電圧が減少するのにしたがって減少する。
例４ 結合反応の例
結合反応の例を図２０に示す。示されるように（ｉ）アミンはＮＨＳエステルと結合してアミドを形成し、（ｉｉ）アミンは酸ハロゲン化物と反応してアミドを形成し、（ｉｉｉ）アミン又はオキシアミンは、ケトンと反応してオキシムを形成し、（ｉｖ）アミンはアルデヒドと反応して還元によりシッフ塩基及びメチルアミノを形成し、及び（ｖ）ヒドラジンは、アルデヒドと反応してヒドラジドを形成する。示されるように、チオールは、チオール、マレイミド又はハロアセトアミドと反応する。
例５ クリックケミストリーの例
アジド、アルキン、アルケン及びテトラジンを含む官能基を有する化合物を用いたクリックケミストリーの例を図２１に示す。示されるように、結合は、トリアゾール又は１，２−ジアジン（ジヒドロピリダジン互変異性体）結合を提供するように達成され得る。アジドを含む分子Ａは、アルキンを含む分子Ｂと反応してトリアゾールを介したＡ及びＢの結合を形成する。また、アジドを含む分子Ａは、シクロオクチンを含む分子Ｂと反応してシクロオクチルと融合したトリアゾールを介したＡ及びＢの結合を形成し得る。そうでなければ、テトラジンを含む分子Ａは、トランス−シクロオクテンを含む分子Ｂと反応し、ジヒドロピリダジンを介したＡ及びＢの結合を形成する。
例６ タグ付けされたヌクレオチドの例
表４は、合成され、ポリメラーゼの基質として働き得ることが見いだされたタグ付けされたヌクレオチドの例を示す。表４に示される全ての例示的なタグ付けされたヌクレオチドは、５’−アジド−六リン酸−ヌクレオチド（「ｄＮ６Ｐ−Ｎ３」）及びアルキン−タグから、アジド−アルキン又はアジド−シクロオクチン「クリック」反応（例えば、図２１を参照のこと）の何れかを用いて合成された。アジド−アルキン又はアジド−シクロオクチンクリック反応合成のための更なる試薬及び条件の更なる説明を以下の例７〜例１１に提供する。
表４は、天然又は非天然オリゴヌクレオチドを含む多くのタグ構造を含む。それらのオリゴヌクレオチドタグは、５’から３’の順列で示され、ホスホラミダイト合成によって調整され、インテクレーテッドＤＮＡテクノロジーズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（コーラルビル、アイオワ州、ＵＳＡ）又はトリリンクバイオテクノロジーズ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（サンディエゴ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）又はグレンリサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（スターリング、バージニア州、ＵＳＡ）のようなカスタムオリゴヌクレオチドの販売業者から購入可能である。公開され、カスタムオリゴヌクレオチドの販売業者から購入することができ、タグとして有用なカスタム合成されたオリゴヌクレオチドに簡単に組み込むことができる何百もの非標準的なホスホアミダイトモノマー単位「ビルディングユニット」が存在する。それらの非標準的なホスホアミダイトモノマー単位の多くがスペーサー(例えば、「ｉＳｐ」)、色素（例えば、「ｉＣｙ３」）、及びリンカー（例えば、「ヘキシニル」）として分類される。表４の全てのオリゴヌクレオチドタグ構造は、非標準的なモノマー単位を示すために、周知のオリゴヌクレオチド合成の用語を用いて説明される。（例えば、慣習的に使用されるオリゴヌクレオチドの用語の更なる詳細については、ｗｗｗ.ｉｄｔＤＮＡ.ｃｏｍにあるインテクレーテッドＤＮＡテクノロジーズのウェブサイトを参照のこと。）例えば、非標準的なモノマー単位は、ユニット間のスラッシュ「／」及びアスタリスク「＊」で囲まれており、それはチオリン酸ジエステル結合を示す。それゆえ、「／５ヘキシニル／／ｉＳｐＣ３／／ｉＣｙ３／Ｔ」は、５’−ヘキシン−リン酸−ジヒドロキシプロパン−リン酸−シアニン３（色素）−リン酸−チミジン-３’（ＯＨ）を示す。更に選択した略語の説明は、表４に含まれている。
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例７ ｄＴ６Ｐ−ＤＢＣＯ−Ｃｙ３の合成
図２２は、ｄＡ６Ｐ−Ｎ３とＤＢＣＯ−Ｃｙ３との間のクリック反応の結果を示す。この例において、ｄＴ６Ｐ−Ｎ３（５００ｎｍｏｌ、１００μｌＨ２Ｏ）及びＤＢＣＯ−Ｃｙ３（７００ｎｍｏｌ、１００μｌＤＭＦ）を１つに混合し、室温で２時間撹拌する。図２３は、アジド−ヌクレオチドの、生成物、ＤＢＣＯ−Ｃｙ３−ｄＴ６Ｐへの変換を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。生成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析及び単一塩基伸長反応によってキャラクタリゼーションされる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによれば、分子量は、１９３３ダルトンである。
例８ ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−ｄＴ２５の合成
図２４は、タグ付けされたヌクレオチド、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−ｄＴ２５を形成する、５’−アジド−六リン酸−ヌクレオチドのｄＴ６Ｐ−Ｎ３及び５’−アルキン−オリゴヌクレオチドタグである５’−ヘキシニル−Ｃｙ３−Ｔ２５間のクリック反応を示す。ｄＴ６Ｐ−Ｎ３（７５０ｎｍｏｌ）の溶液を５’−ヘキシニル−Ｃｙ３−Ｔ２５オリゴヌクレオチド（トリリンク社から得た，２００μｌＨ２Ｏ中に５００ｎｍｏｌ）に添加し、続いて、臭化銅（５０μｌ、３：１のＤＭＳＯ／ｔ−ＢｕＯＨ中の０．１Ｍの溶液）及びＴＢＴＡ（１００μｌ、３：１のＤＭＳＯ／ｔ−ＢｕＯＨ中の０．１Ｍの溶液）を添加する。反応混合物を４０℃で１６時間撹拌した。精製を、ＨＰＬＣによって、０．１ＭのＴＥＡＣ緩衝液（ｐＨ７．５）及びアセトニトリル勾配を用いて行った。タグ付けされたヌクレオチド生成物、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−ｄＴ２５をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析及び単一塩基伸長反応によってキャラクタリゼーションした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、質量が９１７９ダルトンであることを示す。
例９ ２’−デオキシチミジン−５’−六リン酸−アジド（ｄＴ６Ｐ−Ｎ３）の合成。
Ｆｍｏｃ−６−アミノへキシル三リン酸の合成。Ｆｍｏｃ−６−アミノヘキサノール（１ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（２ｘ２０ｍｌ）と共蒸発した後、リン酸トリエチル（１０ｍｌ）に溶解した。オキシ塩化リン（５５０μｌ、５．８８ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、一度冷却し、２時間撹拌する。反応混合物に、トリブチルアンモニウムピロリン酸（５当量、１５ｍｍｏｌ、無水ＤＭＦ中の０．５Ｍ溶液）を添加し、２０分間撹拌する。溶液を０．１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（２００ｍｌ、ｐＨ７．５）でクエンチし、ｐＨを約７に調節した。
この溶液をセファデックス（登録商標）Ａ２５カラムに充填し、０．１Ｍから１．０ＭまでのＴＥＡＢ緩衝液（ｐＨ７．０）勾配を用いて精製する。適切な画分をプールし、更にＨＰＬＣで精製し、純粋な三リン酸が提供される。３１Ｐ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）σ−１０．５（ｄ、２Ｐ）、−２２．８４（Ｔ、１Ｐ）。
ｄＴ６Ｐ−ＮＨ２の合成。Ｆｍｏｃ−アミノへキシル三リン酸（２００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（２ｘ１０ｍｌ）と共蒸発した後、無水ＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解する。カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（４当量、１．４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４時間撹拌する。メタノール（６当量、８５ｍｌ）を添加し、更に３０分撹拌する。これに、ＤＭＦ及びＭｇＣｌ２（１０当量、３．５ｍｍｏｌ）中の２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸（ｄＴＴＴ、トリエチル又はトリブチルアンモニウム塩、０．４ｍｍｏｌ）溶液を添加する。反応混合物を１８時間撹拌し、次いで、水（２５ｍｌ）中の１０％トリエチルアミンを添加し、Ｆｍｏｃ基を加水分解する。反応混合物を更に１６時間撹拌し、沈殿した固体を濾過し、溶液をエーテルで抽出する。水性の層を濃縮し、０．１ＭのＴＥＡＣ緩衝液（ｐＨ７．５）及びアセトニトリル勾配を用いたＨＰＬＣで精製する。これは、３１Ｐ ＮＭＲ及び質量分析データによってキャラクタリゼーションされる。３１Ｐ−ＮＭＲ：ｄ−１０．６３（ｂｓ、１Ｐ）、−１１．６５（ｂｓ、１Ｐ）、−２３．３５（ｂｍ．４Ｐ）。
ｄＴ６Ｐ−Ｎ３の合成。ｄＴ６Ｐ−ＮＨ２（１０μｍｏｌ）を０．１Ｍ重炭酸−炭酸緩衝液（５００μｌ、ｐＨ８．７）に溶解し、２００μｌのＤＭＦ中のアジド酪酸−ＮＨＳ（２５μｍｏｌ）を添加する。反応混合物を一晩撹拌する。反応混合物を０．１ＭのＴＥＡＣ緩衝液（ｐＨ７．５）及びアセトニトリル勾配を用いたＨＰＬＣで精製する。
例１０ ２’−デオキシアデノシン−５’−六リン酸の合成及びクリックケミストリーを用いた末端リン酸へのタグの結合
この例は、アルキン−アジド環化付加クリック反応を用いてタグ付けされたヌクレオチドを作製するための一般的な合成スキームを示す。図２５は、２’−デオキシアデノシン-５’−六リン酸（「ｄＡ６Ｐ」）の合成及びアジド−アルキンクリックケミストリーを用いた末端リン酸へのタグの結合を示す。最初から最後まで反応矢印に従って、試薬は、（ｉ）ＰＯＣｌ３及びピロリン酸、（ｉｉ）ＣＤＩ及びＤＭＦ、（ｉｉｉ）ｄＡＴＰ、（ｉｖ）トリエチルアミン及びアジド−酪酸ＮＨＳ、並びに（ｖ）ＴＡＧ−アルキンを含む。
図２５に示すように、ここではタグ付けされたｄＡＴＰ（２５）で例示的されているが、タグ付けされたヌクレオチドの合成は、６−のＦｍｏｃ−アミノヘキサノール（２９）で始まり、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）及び０℃の溶媒としてのリン酸トリエチルを有するピロリン酸と反応して、６−アミノへキシル三リン酸（３０）を形成する。６−アミノヘキシル三リン酸は、Ｎ，Ｎカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）により活性化され、化合物（３１）を形成し、それはｄＡＴＰと反応し、各アミノヘキシル−ｄＡ６Ｐ（３２）が得られる。ついで、修飾されたｄＡ６Ｐを、アジド−酪酸−ＮＨＳと反応させ、アジド基を含む誘導体（３３）が得られる。最後に、アジド誘導体及びヘキシン誘導体化タグ（ＴＡＧ−アルキン）を、アルキン−アジド環化付加クリック反応を介して、目的のタグ付けされたヌクレオチドＴＡＧ−ｄＡ６Ｐ（２５）を得るために反応させる。
例１１ ｄＴ６Ｐ−Ｎ３とオリゴアルキンとの間のクリック反応
図２６は、５’−アジド六リン酸ヌクレオチドのｄＴ６Ｐ−Ｎ３と５’−アルキンオリゴヌクレオチドタグの５’−ヘキシン−Ｃｙ３−Ｔ２５との間のクリック反応の例を示す。反応は、ｄＴ６Ｐ−Ｎ３で始まり、それに５’−ヘキシン−Ｃｙ３−Ｔ２５をＣｕＢｒ／ ＴＢＴＡ及びＤＭＳＯの存在中で添加し、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２５が形成される。
例１２ チオール−チオール（Ｓ−Ｓ）カップリングの例
図２７は、ヌクレオチドへのタグのチオール（ジスルフィド結合）カップリングの一例を示す。
例１３ タグ付けされたヌクレオチドを用いたＤＮＡポリメラーゼプライマー伸長反応
図２８は、タグ付けされたヌクレオチド六リン酸を用いたＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の一例を示す。伸長反応は、鋳型ループプライマーを用いて行われ、そこにおいて、鋳型上の次の相補的な塩基は、単一の相補的なヌクレオチド塩基による伸長を可能にする、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴの何れかである。各伸長反応は３μＭ鋳型ループプライマー、２単位のターミネーター(登録商標)γＤＮＡポリメラーゼ若しくはＢｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））、及び１５μＭのオリゴヌクレオチドでタグ付けされたｄＮ６Ｐヌクレオチドのうち１種類からなる２０μｌの反応物において、２５分間、６５℃のサーマルサイクラー中で実施される。ＤＮＡ伸長生成物を、エタノールで沈殿させ、Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐ（登録商標）カラム（ミリポワ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社）を通して精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析によってキャラクタリゼーションされる。
図２８に示されるように、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２５でタグ付けされたヌクレオチド（分子量８２７０）からの次のヌクレオチドＴＭＰの添加による１００％のプライマー（分子量７９８３）の伸長がある。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおける他の２つのピークは、無傷のタグ付けされたヌクレオチド（分子量８８３７）及び伸長反応から解離された生成物（分子量９１４２）である。図２９は、アミダイトケミストリーを用いてオリゴヌクレオチドに組み込むことができるモノマーの例を示す。
例１４ ５’−オリゴヌクレオチド−Ｃｙ３でタグ付けされたヌクレオチドの合成及びキャラクタリゼーション
この例は、５’がＣｙ３基に結合しているオリゴヌクレオチドを含み、かつ四つの異なるヌクレオチド六リン酸の末端リン酸に共有結合された、四つの異なるタグの合成、並びにポリメラーゼ伸長反応におけるこれらのタグ付けされたヌクレオチドの特徴付けを示す。
この例において調製され、キャラクタリゼーションされる４つのタグ付けされた２’−デオキシ−５’−六リン酸ヌクレオチドは、ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴ−Ｔ２３−Ｃ３、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２−ｄＳｐ８−Ｔ２０−Ｃ３、ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６、及びｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ｄＳｐ３−Ｔ２３−Ｃ３であった。図３０に示すように、各オリゴヌクレオチドタグは、約３０塩基長であり、ｄＴヌクレオチド単位並びにスペーサー及び修飾塩基の混合物を含む。オリゴヌクレオチドタグにおけるこれらの違いは、ナノポア内の狭窄部位におけるサイズ及び電荷の差を生じさせるために設計されており、それによって、ナノポアへの印加電圧の下で独特な電流遮断特性を提供する。例えば、無塩基ＤＳＰ３及びｄＳｐ８スペーサー残基は、ｓｓＤＮＡ中のヌクレオチドよりも小さい直径を有し、一方でＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴタグ中のチミジンに結合した蛍光は大きな直径を有する。
オリゴヌクレオチド−Ｃｙ３でタグ付けされたヌクレオチドの合成
図２５に示した一般的な反応スキームに従い、６−Ｆｍｏｃ−アミノヘキサノール（２９、１ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（２ｘ２０ｍｌ）で共蒸発した後、リン酸トリエチル（１０ｍｌ）に溶解させた。冷却し、撹拌したこの溶液に、新鮮な蒸留オキシ塩化リン（５５０μＬ、５．８８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を０℃で２時間攪拌した。トリブチルアンモニウムピロリン酸（５ｅｑ、１５ｍｍｏｌ、無水ＤＭＦ中の０．５Ｍ溶液）及びトリブチルアミン（１５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２０分間撹拌した。溶液を、０．１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢ、２００ｍｌ、ｐＨ７．５）でクエンチし、ｐＨ約７に調整した。この溶液をセファデックス（登録商標）Ａ２５カラムに充填し、０．１Ｍから１．０ＭまでのＴＥＡＢ緩衝液（ｐＨ７．０）勾配を用いて溶出した。適切な画分をプールし、ＳＵＰＥＬＣＯＳＩＬ（登録商標）ＬＣ−１８−Ｔ（スペルコ社）３μＭ、１５ｃｍｘ４．６ｍｍでの逆相ＨＰＬＣで更に精製した。移動相は、Ａは、８．６ｍＭのＥｔ３Ｎ、ｐＨ８．１の水中の１００ｍＭのＨＦＩＰ、Ｂは、１００％メタノールである。１００％Ａ／０％Ｂから開始し、４０分で０％Ａ／１００％Ｂへ。純粋な三リン酸、３１Ｐ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：−７．６８（ｄ、１Ｐ）、−１０．５（ｄ、１Ｐ）、−２２．６５（ｔ、１Ｐ）。製造されたＦｍｏｃ−アミノヘキシル三リン酸（３０、２００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（２ｘ１０ｍｌ）で共蒸発させた後、無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した。ＣＤＩ（４当量、１．４ｍｍｏｌ）を加え、溶液を４時間室温で撹拌した。メタノール（６当量、８５μＬ）を添加し、更に撹拌を３０分間行った。上記の生成物（３１）に、ＤＭＦ及びＭｇＣｌ２（１０当量、３．５ｍｍｏｌ）中の所望の２’−デオキシヌクレオシド−５’−三リン酸（ｄＮＴＰ、トリブチルアンモニウム塩、０．５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を１８時間撹拌し、次いで水中（２５ｍｌ）の１０％のトリエチルアミンを添加することによって、Ｆｍｏｃ基を加水分解し、ｄＮ６Ｐ−ＮＨ２（３２）を得た。反応混合物を１６時間更に攪拌し、沈殿した固体を濾過し、溶液をエーテルで抽出した。水性の層を濃縮し、逆相ＨＰＬＣで精製した。
生成物ｄＮ６Ｐ−ＮＨ２は、３１Ｐ−ＮＭＲ:δ−１０．６３（ｂｓ、１Ｐ）、−１１．６５（ｂｓ、１Ｐ）、−２３．３５（ｂｍ．４Ｐ）によってキャラクタリゼーションされる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳデータ（図示せず）：ｄＡ６Ｐ−ＮＨ２（３１）；８３２．０２（精密質量８２９）、ｄＴ６Ｐ−ＮＨ２（図示せず）；８２５．９７（精密質量８２０）、ｄＧ６Ｐ−ＮＨ２（図示せず）；８４８．３３（精密質量８４５）、ｄＣ６Ｐ−ＮＨ２（図示せず）；８２６．０８（精密質量８２８．０）。
ｄＮ６Ｐ−ＮＨ２（３２、１０μｍｏｌ）のアジド（３３）を、３２を溶解することにより調整し、０．１Ｍの重炭酸−炭酸緩衝液（５００μｌ、ｐＨ８．７）及び２００μｌのＤＭＦ中のアジド酪酸−ＮＨＳ（２５μｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩撹拌し、０．１ＭＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７．５）及びアセトニトリルの勾配を用いてＨＰＬＣにより精製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳデータ（図示せず）：ｄＡ６Ｐ−Ｎ３（３３）；９６３．７５（Ｎａ＋塩として、精密質量９６３．３）、ｄＴ６Ｐ−Ｎ３；９３４．５８（精密質量９３２．３）、ｄＧ６Ｐ−Ｎ３；９６０．２７（精密質量９５７．４）、ｄＣ６Ｐ−Ｎ３；９１９．０９（精密質量９１７．４）。
５’−ヘキシニル修飾オリゴヌクレオチドタグ（トライリンクから入手、２００μｌのＨ２Ｏ中５００ｎｍｏｌ）に、ｄＮ６Ｐ−Ｎ３（３３）（７５０ｎｍｏｌ）の溶液を加え、次いで、臭化銅（５０μｌ、３：１のＤＭＳＯ／ｔ−ＢｕＯＨの０．１Ｍの溶液）及びＴＢＴＡ（１００μｌ、３：１のＤＭＳＯ／ｔ−ＢｕＯＨ中の０．１Ｍ溶液）を加えた。反応混合物を１６時間４０℃で撹拌し、次いで、０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７．５）及びアセトニトリルの勾配を用いたＨＰＬＣ精製を行い、オリゴヌクレオチドでタグ付けされたヌクレオチド（図３０（２５）−（２８）を参照のこと）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ及び伸長反応によってキャラクタリゼーションした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳデータ（図３１（Ｂ））：ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴ−Ｔ２３−Ｃ３（２５）：１１８３４（精密質量１１８３５）；ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２−ｄＳｐ８−Ｔ２０−Ｃ３（２６）：９８０６（精密質量９８０８）；ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６（２７）：１０８２５（精密質量１０８２６）；及びｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＤＳＰ３−Ｔ２３−Ｃ３（２８）：１０４１８（精密質量１０４１３）。
サンプル（２５、２６、２７、２８、３２及び３３）については、以下のＨＰＬＣ法をＳＵＰＥＬＣＯＳＩＬ（登録商標）ＬＣ−Ｃ１８−Ｔ（スペルコ社）、粒子サイズ３．０μｍ、１５ｃｍｘ４.６ｍｍ、１００％Ａ／０％Ｂで４分、次いで上３０分間で７０％Ａ／３０％Ｂへの直線勾配での変化、最後に、更に４５分間室温で、１ｍｌ／分の流速で０％Ａ、１００％Ｂで行った。（移動相：Ａは、０．１ＭのＴＥＡＡ、Ｂは、１００％のＡＣＮ）。
ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応
基質としてのこれらの４つのオリゴｄＮ６Ｐｓによるポリメラーゼ伸長反応活性のスクリーニングは、室温で迅速かつ正確にプライマー伸長を実施することを可能にするものとしてＢｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ２．０ＤＮＡＰ）を特定した。更に、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡＰは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くという追加的な利点を有した。
ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応は、これら四つのオリゴヌクレオチド−Ｃｙ３でタグ付けされたヌクレオチド、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡＰ、及び「シンプルベル（ＳｉｍｐｌｅＢｅｌｌ）」プライマーループ鋳型ＤＮＡ（５‘−ＧＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＴＡＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＣ ＧＴＡ ＡＧＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＧ−３’）（配列番号１１０）を用いて行った。それぞれの反応は１．５μＭ鋳型ループプライマー、１Ｘ等温増幅緩衝液［２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、２５℃でｐＨ８．８］、４単位のＢｓｔ２．０ＤＮＡＰ、２．２５μＭの天然のｄＮＴＰ又は３．７５μＭのオリゴヌクレオチドでタグ付けされたヌクレオチド、１ｍＭのＭｎＳＯ４を含んでも含まなくてもよい、からなる２０μＬの反応物中で３０分間６５℃で行った。ＤＮＡ伸長生成物を、５分間９５℃で変性した後、急激に４℃に冷却した。変性した伸長生成物は、２５分間、２５０ｍＶの下で１５％ＴＢＥ尿素プレキャストゲル（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社）で分離した。
結果
ＤＮＡポリメラーゼ伸長生成物を変性ゲル上で分離し、ゲル画像を図３１（Ａ）に示す。レーン１は、プライマーループ鋳型ＤＮＡのみを用いたネガティブコントロールを示し、レーン２は、４つの天然ｄＮＴＰの添加後のポジティブコントロールであり、レーン３は、４つのオリゴヌクレオチド−Ｃｙ３でタグ付けされたヌクレオチドを用いた伸長反応である。レーン２及び３における同様の伸長の結果は、プライマーループ鋳型が、タグ付けされたヌクレオチド及びＢｓｔ２．０ＤＮＡＰのみを用いて、４８塩基まで正常に伸長されることができることを実証する。反応中のオリゴヌクレオチドタグの解離は、レーン３において下側のバンドを観察することによって実証された。
オリゴヌクレオチドでタグ付けされたｄＮ６Ｐｓもまた精製され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定され、それらの観察された分子量はそれぞれの計算された数字と相関していた（図３１（Ｂ）を参照のこと）。
結果は、Ｂｓｔ２．０ポリメラーゼが、タグと末端リン酸との間のトリアゾール共有結合を生成するアジド−アルキンクリック反応を介して合成された４つのオリゴヌクレオチドでタグ付けされたヌクレオチド六リン酸基質と完全伸長反応を行うことが可能であることを示す。
例１５ ３’修飾によるオリゴヌクレオチドタグのエキソヌクレアーゼ保護
この例は、本開示の実施形態においてヌクレオチドをタグ付けすることにおいて有用なオリゴヌクレオチドタグが、どのように３’−ヒドロキシルの化学修飾によってエキソヌクレアーゼ活性から保護され得るかを示す。簡潔には、様々な３’修飾を有するオリゴヌクレオチドを調製し、次いでＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（有意なエキソヌクレアーゼ活性を有する）と共にインキュベートし、インキュベートした試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣで分析し、オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ分解を検出した。
材料及び方法。以下の表５に示すような５’−ビオチン及び種々の３’化学修飾を有するｄＴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を用いて調製した。
Figure 2017515887
表５のオリゴヌクレオチド構造に掲げられる種々の化学修飾は、以下の表６に記載される。
Figure 2017515887
オリゴヌクレオチド/エキソヌクレアーゼ反応の試料は、以下のように調整した。１μＬのオリゴヌクレオチド（濃度２００μＭ）、５単位のＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、イプスウィッチ、ＭＡ、ＵＳＡ）、及び１μＬの１０ＸＰｈｉ２９反応緩衝液（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、イプスウィッチ、ＭＡ、ＵＳＡ）（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び４ｍＭのＤＴＴ）を体積１０μＬの緩衝液中で混合した。この反応試料を３７℃で１５分間インキュベートした。５μＬのＰＡＧＥローディング色素（５０％のグリセロール、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のブロモフェノールブルー）を添加することによって反応を停止させた。停止した反応試料の３μＬのアリコートを、５０％尿素を含有する１５％ポリアクリルアミドゲルに入れ、ＴＢＥ（ＭｉｎｉＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ハーキュリーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）で中和した。ＳｙｂｒＧｏｌｄ（登録商標）（サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）、ＵＳＡ）を用いて、オリゴヌクレオチド生成物を染色し、３００ｎｍのＵＶ照射下で撮影した。ＰＡＧＥの結果は、反応試料のＨＰＬＣ分析によって確認した。
結果
図３５に示すように、３’修飾を有さないＴ３０オリゴヌクレオチド反応試料は、これらの条件下でエキソヌクレアーゼ活性によって完全に分解された。未修飾３’末端及び内部メチル−リン酸（「Ｔｍｐ」）結合を有するＴ３０オリゴヌクレオチドも分解されたが、未修飾３’末端から最初のＴｍｐ結合へのみであった。一方、リン酸を有する３’修飾を有するオリゴヌクレオチド又はアルキル炭素スペーサー基（例えば、ＳｐＣ３、ＳｐＣ６又はｄＳｐ）は無傷のままであり、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に対するそれらの耐性を実証した。
例１５ ＣｙＤｙｅ基を含むオリゴヌクレオチドタグは、ナノポアに付着したポリメラーゼによる補足速度が改善されている
この例は、オリゴヌクレオチドでタグ付けされたヌクレオチドの、α溶血素ナノポアに結合したポリメラーゼによるヌクレオチドの捕捉を検出するための使用を示す。更に、当該例は、オリゴヌクレオチドタグとヌクレオチドとの間のリンカー中におけるシアニン色素（「ＣｙＤｙｅ」）基の含有により、ポリメラーゼ−ナノポア複合体による捕捉速度が優位に改善されることを示す。
タンパク質α溶血素は脂質二重膜の存在中で自己集合して七量体のナノポアを形成する。 本明細書の他の箇所で考察及び参照されるように、これらのナノポアは、ポアに隣接して共有結合したＤＮＡポリメラーゼ（ハイブリダイズしたＤＮＡプライマー及び鋳型を含む）で修飾することができる。ナノポアは、ＣＭＯＳマイクロチップ上に作製されたウェルを含む電極上に固定化された脂質二重膜中に挿入することができ、ナノポアを通した電流値の変化は、ポリメラーゼの活性部位でのタグ付けされたヌクレオチドの結合によって検出することができる。
この例に記載の実験を実施するために、七量体のα溶血素ポア中の７つのモノマーのそれぞれのＣ末端付近に提示された単一のビオチン基を有するナノポアを調製した。次いで、ストレプトアビジン（ビオチン結合部位を４つ有する）及びビオチン化ヘアピンバイオシングルベル（ＢｉｏＳｉｎｇｌｅＢｅｌｌ）Ｃプライマー／鋳型ＤＮＡ（５’−ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＡＣＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＧＴ ＡＡＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＧＡ ＧＧＴ ＣＡＣ−３’）（配列番号１１８）を添加した。ストレプトアビジンの存在によって、ポアに隣接して結合した１つ以上のヘアピンプライマー／鋳型分子を有する強い結合複合体の形成が可能となった。このナノポア複合体を精製して過剰のバイオシングルベルＣＤＮＡプライマー／鋳型を除去し、次いでＤＮＡポリメラーゼを加え、プライマー／鋳型に少なくとも室温で３０分間結合することが可能とした。得られたＤＮＡポリメラーゼ／ナノポア／ＤＮＡ複合体をゲニア（Ｇｅｎｉａ）チップ上の脂質二重膜に露出し、ポアを形成させた。結合したヘアピンＤＮＡ分子は、それらの露出した３’末端が二本鎖であり、ポアに入ることができないため、ポアを通って流れるイオン電流に干渉しない。
この例で使用した２つのタグ付けされたヌクレオチドを以下の表７に示す。
Figure 2017515887
含まれるタグ付けされたヌクレオチドの両方は、本明細書の他の箇所に開示されるアルキン／アジド環化付加クリックケミストリー反応を用いて２’−デオキシグアノシン六リン酸ヌクレオチド（「ｄＧ６Ｐ」）から調製された。簡潔に述べると、ｄＧ６Ｐを、その末端リン酸を介して５’−ヘキシニル−オリゴ−ｄＴ３０又は５’−ヘキシニル−Ｃｙ３−オリゴ−ｄＴ３０の何れかに共有結合させた。両方のタグは、ヘキサノールスペーサー（略語「３Ｃ６」で示される）を有するｄＴ３０の３’末端で修飾された。
タグ付けされたヌクレオチド（１μＭ）、ポリメラーゼ、プライマー鋳型、及びＳｒ２＋（３ｍＭ）の混合物を、上記の精製されたナノポア複合体に添加し、何れかの過剰のポアを洗い流した。Ｓｒ２＋が存在するこれらの条件下で、タグ付けされたヌクレオチドは、プライマー鋳型と共にポリメラーゼ活性部位に結合し、そのオリゴヌクレオチドタグをポアに提示するが、触媒金属イオンの存在中におけるように、プライマー鋳型鎖に対して触媒重合を起こさない。これらの非触媒的結合事象は、平均約３００ミリ秒〜６００ミリ秒持続するナノポアを通るイオン電流の急激な減少として容易に観察される。
結果
リンカー中にＣｙ３を有するオリゴヌクレオチドタグを有するタグ付けされたヌクレオチドがナノポアアレイチップに添加される際に、約１２ｐＡから約５ｐＡまでイオン電流を減少させる有意な電流値変化又は「電流遮断」事象が、１分あたり約４６の速度で検出された。各電流遮断事象は、Ｃｙ３−ｄＴ３０−Ｃ６タグがナノポアに捕捉されていることを示した。リンカー中にＣｙ３基が無いｄＧ６Ｐ−ｄＴ３０−Ｃ６でタグ付けされたヌクレオチドを続いて同じナノポアアレイチップに添加した場合、タグの捕捉を示す遮断事象の速度は実質的に毎分約１３に低下した。対照として、続いてｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−ｄＴ３０−Ｃ６でタグ付けされたヌクレオチドをナノポアアレイに戻し、タグの捕捉を示す遮断事象の速度がほぼ元の値にまで増加した。
リンカーにＣｙ３を有しないｄＧ６Ｐ−ｄＴ３０−Ｃ６でタグ付けされたヌクレオチドから開始し、次に、Ｃｙ３を有するｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−ｄＴ３０−Ｃ６でタグ付けされたヌクレオチドに変え、最後にｄＧ６Ｐ−ｄＴ３０−Ｃ６に戻す逆実験も行った。Ｃｙ３基がタグ捕捉速度を増加させると予想されたように、ナノポアにおけるヌクレオチド捕捉の増加、数及び速度は、ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−ｄＴ３０−Ｃ６でタグ付けされたヌクレオチドが使用された場合にのみ増加し、Ｃｙ３を含まないタグ付けされたヌクレオチドを使用した場合には有意に減少した。
表８は、結果を要約し、リンカー中にＣｙ３の存在がある及びない、これらのタグ付けされたヌクレオチドを使用して実施されたナノポア捕捉実験からの捕捉速度、滞留時間及び待機時間の比較を示す。
Figure 2017515887
上記のように、オリゴヌクレオチドタグの一部として存在するＣｙ３基を有する場合、平均の電流遮断事象の速度（１分あたりの平均捕獲数として）がほぼ４倍増加した。同様に、捕獲された時間の割合も増加し、ほぼ６倍であった。他方、タグがナノポア内に留まる時間に対応する滞留時間は、わずか１．５倍増加しただけであり、これも、Ｃｙ３基の存在が、ナノポアによるタグの解離速度における有意な差の原因ではないことを示しているため有益である。
例１６ ナノポア−ポリメラーゼ複合体における異なる電流遮断信号による４つの異なるタグ付けされたヌクレオチドの同定
この例は、ナノポアに結合したＢｓｔ２.０ＤＮＡポリメラーゼの活性部位で相補的なプライマー−鋳型ＤＮＡ鎖に結合したときに、それぞれが提供する別個の電流遮断信号に基づいて４つの異なるタグ付けされたヌクレオチドを同定するためのナノポアアレイチップの使用を示す。この例で使用した４つの異なるタグ付けされたヌクレオチドは、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２−ｄＳｐ８−Ｔ２０−Ｃ３、ｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ｄＳｐ３−Ｔ２３−Ｃ３、ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６、ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴ−Ｔ２３−Ｃ３であった。Ｂｓｔ２．０−α−ＨＬナノポア複合体は、６−メチル−テトラジン（６−Ｍｅ−ＴＺ）試薬に対してトランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）及びＩＥＤＤＡクリック反応を用いて調製され、米国仮特許出願第６２／１３０，３２６号に記載の膜に挿入された。
簡潔には、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼ−ナノポア複合体は、タグ付けされたヌクレオチドに結合して、自己プライミング鋳型を有するポリメラーゼ活性部位において複合体を形成する。同時に、印加電圧下で、タグ基の「尾部」は、隣接するα溶血素ナノポアのポア内に配置される。ナノポア内へのタグの配置は、開いた状態のナノポア電流と比較して電流減少（又は「電流遮断」）を引き起こす。例えば、ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６でタグ付けされたヌクレオチドは、ナノポア結合Ｂｓｔ２．０ポリメラーゼによって捕捉された場合、ミリ秒の範囲における電流遮断の継続を伴った、約１５ｐＡの開いた状態のポア電流から約７ｐＡまでの一定した電流遮断を生じることが見いだされた。
ナノポア−ポリメラーゼ複合体の一般的な調製方法は、α溶血素（「α−ＨＬ」）の七量体複合体を調製する工程を含み、ここで、７つの単量体単位のうちの１つは、α−ＨＬ−Ｃ４６変異体である。α−ＨＬ−Ｃ４６は、精製のためにシステインで置換された４６位の天然に存在するリジン及びＮ末端６−Ｈｉｓタグを有する。このα−ＨＬ−Ｃ４６変異体モノマー単位中のシステインの存在は、複合体への単一のＴＣＯ−マレイミドリンカー試薬の結合を可能にする。次いで、このＴＣＯ基は、ＩＥＤＤＡクリック反応を介して、修飾ＤＮＡポリメラーゼ上のＴＺ基と結合することができる。この例では、ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ２．０の単一の天然システイン残基を、６−Ｍｅ−ＴＺ−マレイミド試薬で修飾した。次いで、この６−Ｍｅ−ＴＺ−Ｂｓｔ２．０付加物をＴＣＯ−α−ＨＬ付加物と１０：１の比で混合して、ポリメラーゼＢｓｔ２．０酵素と結合したα−ＨＬ七量体複合体が提供された。マレイミドリンカー試薬によるα−ＨＬ−Ｃ４６修飾のための材料及び方法、及びα−ＨＬ−Ｃ４６を組み込んだ七量体α溶血素ポアの形成もまた、例えば、バレーバ（Ｖａｌｅｖａ）ら（２００１）及びそこに引用されている参考文献に記載されている。
６：１のα−ＨＬ：α−ＨＬ−Ｃ４６ナノポアの調製。標準的なタンパク質工学技術を用いて、６−Ｈｉｓタグ（「α−ＨＬ−Ｃ４６」）を有するスタフィロコッカス・アウレウスα−ＨＬモノマーのＫ４６Ｃ（システインで置換された４６位のリジン）突然変異体を調製した（例えば、バレーバ（Ｖａｌｅｖａ）ら（２００１）及びパルマー（Ｐａｌｍｅｒ）ら（１９９３）を参照のこと）。「プレップイース（ＰｒｅｐＥａｓｅ）（登録商標）」Ｈｉｓでタグ付けされたタンパク質精製キット（ＵＳＢ−アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、ＵＳＡ）のプロトコールに記載されているように、α−ＨＬ−Ｃ４６を精製し、１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でｐＨ７．２の１ｍＭのトリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む１ＸＰＢＳに交換した。この精製されたα−ＨＬ−Ｃ４６を、脂質の存在中で野生型α−ＨＬと混合し、以下のように七量体を形成した。
α−ＨＬ−Ｃ４６変異体モノマーに対する天然のα−ＨＬモノマーの、最適な６：１比を得るために、１１：１比のものをオリゴマー化に使用した。脂質（１，２−ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、粉末、アバンティポーラリピッド）を、５０ｍＭのトリス、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０中、４０℃で３０分間、５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。５％オクチル−ベータ−グルコシド（β−ＯＧ）をポップ小胞に添加し、透明化によって評価して、タンパク質を可溶化した。次いで、試料を１００ＫのＭＷＣＯフィルターを用いて濃縮し、２４０００ＲＰＭで３０分間回転させて、沈殿したタンパク質をペレット化した。３０ｍＭのβＯＧ、７５ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．５の２０ｍＭＨＥＰＥＳでサイズ排除カラムを平衡化した後、５００μLの濃縮サンプルを低圧で充填して、モノマーから七量体６：１α−ＨＬナノポア複合体を分離した。２つの連続したサイズ排除カラムで５ｍＬに濃縮した後、試料をＭｏｎｏＳ５／５０ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア、ニュージャージー州、ＵＳＡ）に充填した。異なるサブユニット化学量論（例えば、７：０，５：２）を含むものから６：１のα−ＨＬ：α−ＨＬ−Ｃ４６ナノポアを分離するために、更に、ＦＰＬＣを用いた。移動相は、Ａとして、ランニング緩衝液：２０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ５、Ｂとして、溶出緩衝液：２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭＥＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ５、からなる。精製は、２１分間の１００％Ａ定組成から、続いて０％〜１００％Ｂの直線勾配で２０分間、次いで、１００％Ｂ定組成で更に２分間で行った。流速は１ｍｌ／分であった。純粋な天然の７：０α−ＨＬポアが最初に溶出し、６：１のα−ＨＬ：α−ＨＬ−Ｃ４６ポア複合体が約２４．５分から約２５．５分までの保持時間で溶出した。
ＴＣＯ−ＰＥＧ３−α−ＨＬ試薬の調製。６：１α−ＨＬポア複合体の溶液をリン酸反応緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に交換し、１００Ｋカットオフ脱塩スピンカラムを用いて、約１００μＬ容量中に、約３００μｇの６：１α−ＨＬポア複合体となるまで濃縮した。５０ｍＭのＴＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミド（イエナバイオサイエンス（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ）、イエナ、ドイツ）原溶液をＤＭＳＯ中で調製した。ＴＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミド原液を６：１のα−ＨＬポア溶液（上記）に添加して、１００倍モル過剰のマレイミド試薬を有する反応混合物を得た。この混合物を４℃で一晩回転させて反応させた。得られたＴＣＯ−ＰＥＧ３−α−ＨＬ試薬をセファデックス（登録商標）Ｇ−５０で精製し、下記のように調製した６−Ｍｅ−ＴＺ−ＰＥＧ４−Ｂｓｔ２．０ポリメラーゼ試薬とのＩＥＤＤＡクリック反応で使用した。
６−Ｍｅ−ＴＺ−ＰＥＧ４−Ｂｓｔ２．０試薬の調製。リン酸反応緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中のＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ２．０（ニューイングランドバイオラッド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州、ＵＳＡ）を、１０Ｋカットオフ脱塩スピンカラムを用いて約１００μＬ容量中約５８０μｇまで濃縮した。ＤＭＳＯ中の６−Ｍｅ−ＴＺ−ＰＥＧ４−マレイミド（イエナバイオサイエンス（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ）、イエナ、ドイツ）の５０ｍＭのストック溶液を調製した。６−Ｍｅ−ＴＺ−ＰＥＧ４−マレイミドストック溶液をＢｓｔ２．０溶液に添加して、１００倍の過剰のマレイミド試薬を有する反応混合物を得た。ローター上で４℃で一晩インキュベートした後、１ＭのＤＴＴを５ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベーションを室温で実施して反応を停止させた。得られた６−Ｍｅ−ＴＺ−ＰＥＧ４−Ｂｓｔ２．０試薬をセファデックス（登録商標）Ｇ−５０で精製し、下記のようにＴＣＯ−ＰＥＧ３−α−ＨＬ試薬とのＩＥＤＤＡクリック反応で使用した。
６−Ｍｅ−ＴＺ及びＴＣＯの複合体のＩＥＤＤＡクリック反応。ＴＣＯ−ＰＥＧ３−α−ＨＬ及び６−Ｍｅ−ＴＺ−ＰＥＧ４−Ｂｓｔ２．０間のＩＥＤＤＡクリック反応は、５：１のモル過剰の６−Ｍｅ−ＴＺ−ＰＥＧ４−Ｂｓｔ２．０試薬対ＴＣＯ−ＰＥＧ３−α−ＨＬ試薬を用いて行われた。一般に、所望の５：１のモル過剰を提供するために、１ＸＰＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０において、大量のＴＣＯ−ＰＥＧ３−α−ＨＬ溶液に６Ｍｅ−ＴＺ−ＰＥＧ４−Ｂｓｔ２．０溶液を混合しながら添加した。混合物を室温で１時間回転させて反応させた。次いで、反応混合物からの試料を、スピンフィルター（１００Ｋ）によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びバイオアナライザー（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ））分析のために調製し、続いてセファデックス（登録商標）２００ゲル濾過カラムによって精製した。熱変性した試料を、９５℃で５分間加熱することによって調製した。複合体の更なる精製は、Ｎｉ２＋カラム（プレップイース（ＰｒｅｐＥａｓｅ）ヒスチジンでタグ付けされたタンパク質精製ミニキット高収率カラム、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いることによって、α−ＨＬ−Ｃ４６上のＨｉｓタグを用いて行った。Ｎｉ２＋カラムは、製造業者のプロトコールに従って行った。α−ＨＬナノポア−ＢＳＴ２．０複合体生成物を、ナノポアアレイの調製における更なる使用の前に、１ＸＰＢＳ緩衝液中に４℃で保存した。
２６４ウェルナノポアアレイマイクロチップ。ナノポア電流遮断測定は、浅いウェル（ゲニアテクノロジー（Ｇｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マウンテンビュー、ＣＡ、ＵＳＡ製のチップ）内に２６４個の銀電極（直径５μｍ）のアレイを有する約１ｘ１ｍｍのＣＭＯＳマイクロチップを用いて行った。このようなナノポアアレイマイクロチップを製造し、使用する方法はまた、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号及び米国特許出願公開第２０１３／０２６４２０７Ａ１号に見出すことができ、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。アレイ内の各ウェルは、生物学的試薬及び導電性塩との絶え間のない接触を可能にする表面修飾を有する標準的なＣＭＯＳプロセスを用いて製造される。各ウェルは、そこに埋め込まれたナノポア複合体を有するリン脂質二重膜膜を支持することができ、コンピュータインターフェースによって個々にアドレス可能である。使用される全ての試薬は、コンピュータ制御のシリンジポンプを用いてチップの上方の単純なフローセルに導入される。このチップはアナログからデジタルへの変換をサポートし、全ての電極からの電気測定値を毎秒１０００ポイント以上の速度で独立して報告する。電流遮断測定は、アレイ内の２６４個のアドレス指定可能なナノポアを含む膜の各々において、ミリ秒（ｍｓｅｃ）毎に少なくとも１回、非同調的に行われ、インターフェースされたコンピュータ上に記録することができる。
チップ上の脂質二重膜の形成。チップ上のリン脂質二重膜膜は、１，２−ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（アバンティポーラリピッド（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ））を用いて調製した。脂質粉末をデカン中に１５ｍＭで溶解し、次いでチップ上の２６４個のウェルを横切る層に塗布した。次いで、ウェルのシス側に空気を入れることにより薄化プロセスを開始し、これにより多層の脂質膜を減少させ単一の二重層とした。二重層形成を、０ｍＶから１０００ｍＶまでの傾斜電圧を用いて試験した。例示的な単一二重層は、３００ｍＶから５００ｍＶまでの印加電圧で一時的に開く。
膜におけるナノポア結合体の挿入。チップの２５６個のウェルに脂質二重膜を形成した後に、０．０５μｇのＢｓｔ２．０−α−ＨＬナノポア複合体（上述した）を含む溶液（１５０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＳｒＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２５℃）、３μＭの所望の「シンプルベル」ＤＮＡ鋳型、及び３０μＭの１種類以上の４つのタグ付けされたヌクレオチドをチップのシス側に添加した。混合物中のＢｓｔ２．０−α−ＨＬナノポア複合体は、脂質二重膜中に自発的に挿入される。この実験において、Ｓｒ２＋は、存在する唯一の金属イオンであるため、ＤＮＡポリメラーゼでの三重複合体は活性部位に形成されることができたが、ヌクレオチドは組み込まれず、５’−リン酸結合タグは解離されなかった。
シンプルベルＤＮＡ鋳型は、配列５’−ＧＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＴＡＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＸＣ ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＣ ＧＴＡ ＡＧＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＧ−３’（配列番号１１９）を有する８３量体の自己プライミング一本鎖であり、ここで、Ｘは鋳型上の最初の開放位置であり、４つの塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴの何れか１つであり得る。これらのナノポアの実験で使用される４つのシンプルベルＤＮＡ鋳型は、相補的なヌクレオチドへの結合及びポリメラーゼによる組み込みのための鋳型上の最初の利用可能な位置のみが異なっている。
ナノポアの実験で使用した４つの異なるタグ付けされたヌクレオチドは、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２−ｄＳｐ８−Ｔ２０−Ｃ３、ｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ｄＳｐ３−Ｔ２３−Ｃ３、ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６、ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴ−Ｔ２３−Ｃ３である（上述の表４も参照のこと）。４つのタグ付けされたヌクレオチドの各々は、ｄＴヌクレオチド、フルオロ修飾塩基ｄＴヌクレオチド（ＦｌｄＴ）、無塩基スペーサー（ｄＳｐ）及び３’エキソヌクレアーゼ保護基を含む様々な３０量体の配列からなるオリゴヌクレオチドタグに連結されたＣｙ３基を有していた。
ナノポア電流値測定。ナノポア複合体及びＤＮＡ鋳型（１５０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＳｒＣｌ２、２０ｍＭ のＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２５℃）を挿入ために使用したものと同じ溶液もまた、ナノポア電流遮断測定のための電解質溶液として使用した。１００ｍＶ（シス対トランス）電圧を、膜及びポアに片方ずつ配置された２つのＡｇ／ＡｇＣｌ電極間のチップボードを通るように印加した。ポアを通した電圧の印加により、異なるタグ付けされたヌクレオチドの各々について多数の電流遮断事象がプロットされた。プロットは、観察された２つのタイプの電流遮断事象に基づいて記録され、（１）ポア電流Ｉ０の割合としての遮断振幅I及び（２）ミリ秒での平均滞留時間。それぞれの異なるタグ付けされたヌクレオチドについて観察された電流遮断事象の滞留時間のヒストグラムは、指数関数ｙ＝Ａｅ−Ｂｘ、及び算出された平均滞留時間として使用される定数Ｂの逆数に適合された。１０ｍｓより長い平均滞留時間及び０．６から０．２までの遮断振幅を有する電流遮断事象は、ナノポアに結合したＢｓｔ２．０ポリメラーゼによるタグ付けされたヌクレオチドの生産的な捕捉を示すと考えられた（即ち、ポリメラーゼ活性部位における相補的な鋳型塩基及び隣接するポア内に位置するタグ付けされたヌクレオチドの「尾部」を有するタグ付けされたヌクレオチドの結合）。
実験を行い、ここで、４つの異なるタグ付けされたヌクレオチドのそれぞれの電流遮断値を、アレイ上の膜に埋め込まれたナノポア−ポリメラーゼ複合体に結合した、それに相補的なシンプルベルＤＮＡ鋳型のアレイに露出した場合で測定した。結果は、それぞれの異なるタグ付けされたヌクレオチドに関連する、明確で好ましい電流遮断信号について分析された。
更に、シンプルベルＤＮＡ鋳型に相補的でなく、タグ付けされたヌクレオチドのみがナノポアアレイに露出された溶液中に含まれている「ミスマッチ」対照実験を行った。具体的には、アレイ上で使用されるシンプルベル鋳型は、鋳型上の次の位置にアデニンを有し、適用された３つのミスマッチでタグ付けされたヌクレオチドは、ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴ−Ｔ２３−Ｃ３、ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６、及びｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ｄＳｐ３−Ｔ２３−Ｃ３である。ミスマッチ実験に用いた条件は、相補的なタグ付けされたヌクレオチドについての電流遮断信号を検出するための上記の通りのものであった。
結果
以下の表９に示すように、４つの異なるオリゴヌクレオチドでタグ付けされたヌクレオチドは、それぞれ、明確な遮断振幅及び平均滞留時間を示した。
Figure 2017515887
しかしながら、ミスマッチタグ付けされたヌクレオチドについてのナノポアの電流値の変化は、相補的なタグ付けされたヌクレオチドについて測定された遮断事象と有意に異なった。ミスマッチ電流値の変化のプロットは、電流遮断を示す大きな変化をほとんど示さず、ミスマッチ「事象」の大部分は、オープン状態のポア電流値に非常に近いものであった。更に、測定された電流値の変化においてミスマッチ滞留時間のヒストグラムは、事象の大部分が、相補的なタグ付けされたヌクレオチドのバックグラウンド信号の範囲に対応して、２０ミリ秒よりも短いことを示した。検出された総量１０４１個のミスマッチ「事象」うち、ミスマッチヌクレオチドの３４．９％の事象しか通常の電流遮断の範囲になく、１９．８％しか電流遮断の例示的な滞留時間を示さなかった。これらの結果に基づいて、タグ付けされたヌクレオチドのミスマッチによる全体的なエラー率は６．９％と推定された。
例１７ ４つの異なるタグ付けされたクレオチドを用いたナノポアアレイチップ上でのシークエンシング
この例は、ＤＮＡ鋳型の配列を検出するために、ナノポアアレイチップ上での４つの異なるタグ付けされたヌクレオチドの使用を示す。４つの異なるタグ付けされたヌクレオチド（ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２−ｄＳｐ８−Ｔ２０−Ｃ３、ｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ｄＳｐ３−Ｔ２３−Ｃ３、ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６及びｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴ−Ｔ２３−Ｃ３）、ナノポアタンパク質（α溶血素）、ＤＮＡ鋳型（シンプルベル８３量体）及び使用されたナノポアアレイチップ（即ち、浅いウェル中の直径５μｍの銀電極の２６４個のアレイを有する約１ｘ１ｍｍのＣＭＯＳマイクロチップ、ゲニアテクノロジー（Ｇｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製、マウンテンビュー、ＣＡ、ＵＳＡ製）は、例１６で用いたものと同じである。しかしながら、この例において使用されたＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼであり、ザケリ（Ｚａｋｅｒｉ）及びホワース（Ｈｏｗａｒｔｈ）（２０１０）に記載されたスパイキャッチャー法を用いてα溶血素ナノポアに付着された。
更に、このシークエンシングの例は、４つの異なるタグ付けされたヌクレオチド及び触媒金属イオン塩ＭｇＣｌ２の存在を含み、完全なポリメラーゼ反応が、相補的なタグ付けされたヌクレオチドの伸長プライマー鎖への組み込み及びタグの解離によって起こることを可能にした。
α−ＨＬ−Ｐｈｉ２９複合体の調製。この方法では、プトレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）フィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢのコラーゲン接着ドメイン（ＣｎａＢ２）の２つのフラグメントが互いを認識し、続いて、１つのフラグメント（即ち、「スパイキャッチャー」）中のリジンのε−アミノ基及び他のフラグメント（即ち、「スパイタグ」）中のアスパラギン酸のカルボキシル側基間にペプチド結合を生成する。本例において、スパイタグフラグメントを短いペプチドリンカーを介してα−ＨＬモノマーのＮ末端に結合させ、スパイキャッチャーフラグメントを同様の短いペプチドリンカーを介してＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端に結合させた。スパイタグを含む及び含まないα−ＨＬモノマーを混合して七量体ナノポアの集合を可能にし、スパイタグ修飾α−ＨＬモノマーを１つだけ有するそれらの七量体ナノポアをクロマトグラフィーにより精製し、所望の６：１のα−ＨＬナノポアを得た。次いで、６：１のα−ＨＬナノポア溶液をスパイキャッチャー修飾Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと併せて６：１α−ＨＬ−Ｐｈｉ２９複合体を形成させた。
ナノポアアレイチップの調製。例１６に記載されているように、脂質二重膜を２６４ウェルＣＭＯＳチップアレイ上に調製し、６：１α−ＨＬ−Ｐｈｉ２９複合体を、１５０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＳｒＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５、２５℃）の緩衝溶液中のＤＮＡ鋳型とともに二重膜中に挿入した。２つの異なるＤＮＡ鋳型を本例に記載のシークエンシング反応に用いた。最初の２つの反応（図３６の（Ａ）及び（Ｂ）を参照のこと）において、鋳型は、例１６で使用された８３量体自己プライミング一本鎖シンプルベルＤＮＡ鋳型であり、Ｘ位置で選択されたＡヌクレオチドは、自己プライミング領域：５’−ＧＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＴＡＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＣ ＧＴＡ ＡＧＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＧ−３’（配列番号１１９）の始まりの開始を示す。第３のシークエンシング反応（図３７参照）において、ホモポリマー領域を有する自己プライミング一本鎖ＤＮＡ鋳型：５’−ＧＣＡ ＣＡＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＣＣ ＴＴＴ ＴＧＧ ＴＡＡ ＧＣＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ＡＡＴ ＴＴＴ ＣＣＣ ＣＴＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＡＧＴ ＧＴＴ ＴＴＣ ＡＣＴ ＴＧＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＡＧ ＧＧＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＴＴ−３’（配列番号１２０）を使用した。
ナノポアアレイチップを用いたシークエンシング。アレイ上の脂質二重膜中の自己プライミングＤＮＡ鋳型を有する６：１α−ＨＬ−Ｐｈｉ２９複合体の挿入後、ＳｒＣｌ２金属イオン塩のみを含む膜のシス側の緩衝溶液を、１５０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＳｒＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５℃、ｐＨ７．５、及び０．１ｍＭのＭｎＣｌ２（図３６の（Ａ）の電流トレースを参照のこと）か、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２と０．７ｍＭのＳｒＣｌ２との混合物（図３６の（Ｂ）の電流トレースを参照のこと）か、又は３．０ｍＭのＭｇＣｌ２（図３７の電流トレースを参照のこと）のいずれかを含む緩衝液を含む緩衝溶液で置き換えた。シス側の触媒二価Ｍｎ２＋又はＭｇ２＋イオンの存在は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの触媒作用の開始をもたらした。ポアを通過して印加された電位も変化した。図３６の（Ａ）及び（Ｂ）の実験においては、１６０ｍＶの電位が印加され、維持され、一方で、図３７の実験においては、１００ｍＶの電位が印加され、維持された。膜のシス及び／又はトランス側の種々の量の非触媒性Ｓｒ２＋もまた、ポリメラーゼの作用及び得られたイオン電流値のトレースに影響を及ぼした（図３６の（Ａ）、（Ｂ）及び図３７に示すように）。アレイ中のナノポアを通したイオン電流値の変化を３分〜１０分間測定した。
結果
図３６に示すように、オープン状態の電流値よりも低い４つの異なる電流値が一時的に観察され、４つの異なるヌクレオチドのそれぞれに関する、４つの異なるタグのナノポアによる捕捉を示している。存在する４つのタグ付けされたヌクレオチドの全てによるこのシークエンシング実験中に観察された相対的電流値の変化は、単一のタグ及び非触媒Ｓｒ２＋二価金属イオンのみ存在するナノポアアレイ測定の間に観察されたものと一致した（例えば例１６参照のこと）。予想されたように、４つの異なるタグ付けされたヌクレオチドについて観察された最低から最高への残留電流（Ｉ／Ｉ０）のランク付けは、例１６のナノポアアレイチップを用いたこれらのタグ付けされたヌクレオチドについて観察された相対的残留電流と一致した：ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴ−Ｔ２３−Ｃ３(〜０．１５)、＜ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６（〜０．２５）、＜ｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ｄＳｐ３−Ｔ２３−Ｃ３（〜０．４２）、＜ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２−ｄＳｐ８−Ｔ２０−Ｃ３（〜０．５０）。更に、電流値変化のトレースは、図３６の上部に示される「伸長プライマー」配列、５’―――ＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴ―――３'（配列番号１２１）である自己プライミングシンプルベルＤＮＡ鋳型の相補的な配列に基づく正確なヌクレオチド配列の組み込みに対応するタグ捕捉事象を示す。
図３７に示すように、ナノポアアレイチップを用いてタグ付けされたヌクレオチドの署名電流値の変化を検出することにより、ホモポリマー鋳型領域、５’―――ＧＧＧＧＡＡＡＡＴＴＴＴ―――３’（配列番号１２２）をシークエンシングすることができた。電流の急激な減少は、ポア内へのタグ捕捉、マークされた４つのタグの異なる構造のたわみ特性の深さを示すものであり、非常に小さな（＜２ｍｓ）バックグラウンドのたわみは無視した。図３７の電流トレースは、後の処理又はノイズ減少のない生のデータ出力である。
特定の例が示され記載されているが、それに対する様々な変更をすることが可能であり、本明細書で検討されることは前述から理解されるべきである。また、本発明は、本明細書中に提供される特定の例によって限定されることを意図していない。本発明を、前述の明細書を参照して説明してきたが、本明細書の好ましい実施形態の説明及び図解は、限定的な意味で解釈されることを意味するものではない。更に、本発明の全ての側面は、様々な条件及び変数に依存する本明細書に記載の特定の描写、構成又は相対的な比率に限定されないことを理解されたい。本発明の実施形態の形態及び詳細における様々な変更は、当業者には明らかであろう。従って、本発明は、そのような修正、変形及び等価物のいずれもカバーするものと考えられる。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義するものであり、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにその均等物は、それによってカバーされるものと考えられる。
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２００３年１２月１６日に発行されたジュらの米国特許第６，６６４，０７９号。
２０１４年１１月１８日に発行されたジュらの米国特許第８，８８９，３４８号。
２０１２年１２月４日に発行されたチェンらの米国特許第８，３２４，９１４号。
２０１３年４月４日に公開されたワイスラーらの米国特許出願公開第２０１３／００８５２７１Ａ１号。
２０１３年９月１９日に公開されたデイビスらの米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号。
２０１３年１０月１０日に公開されたフォックスらの米国特許出願公開第２０１３／０２６６５１２Ａ１号。
２０１３年１０月１０日に公開されたジュらの米国特許出願公開第２０１３／０２６４２０７Ａ１号。
２０１５年３月９日に出願されたジュらの米国仮特許出願第６２／１３０，３２６号。
２０１３年４月８日に出願されたジュールらのＰＣＴ国際出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３５６３０号。
２０１３年４月８日に出願されたジュらのＰＣＴ国際出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３５６３５号。

Claims (47)

  1. タグ付けされたヌクレオチドであって、末端リン酸を有するポリリン酸基、及びトリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、第２級アミン、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によって、前記ヌクレオチドの前記末端リン酸に共有結合したタグを含む、タグ付けされたヌクレオチド。
  2. 前記タグは、トリアゾールによって前記末端リン酸に共有結合されている請求項１に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  3. 前記トリアゾールは、構造：
    Figure 2017515887
     を有し、
    Ｒ１は、前記タグを含み、Ｒ２は、前記ヌクレオチドを含み、或いは、
    Ｒ１は、前記ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、前記タグを含む
    請求項２に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  4. 前記トリアゾールは、構造：
    Figure 2017515887
     を有し、
    Ｒ１及びＲ３は、結合して環状部を形成し、及び
    結合したＲ１及びＲ３は、前記タグを含み、Ｒ２は、前記ヌクレオチドを含み、或いは、
    結合したＲ１及びＲ３は、前記ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、前記タグを含む
    請求項２に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  5. 前記タグは、１，２−ジアジンによって前記末端リン酸に共有結合されている請求項１に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  6. 前記ポリリン酸基は、前記ヌクレオチドの５’位にある請求項１に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  7. 前記ポリリン酸基は、少なくとも３つのリン酸、又は４つから６つまでのリン酸を含む請求項１〜６の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  8. 前記タグは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴ糖、炭水化物、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ビニルポリマー、他の水溶性ポリマー、又はそれらの何れかの組み合わせを含む請求項１〜７の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  9. 前記タグは、オリゴヌクレオチドを含む請求項８に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  10. 前記タグの前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも７個のモノマー単位、又は少なくとも３０個のモノマー単位を含む請求項９に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  11. 前記オリゴヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドを含む請求項９に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  12. 前記非天然のヌクレオチドは、Ｌ−ヌクレオチド、２’，５’結合、α−Ｄ−ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド間結合、非天然塩基、非天然糖基、及びそれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される基を含み、或いは、前記非天然のヌクレオチドは、二トロピロール、ニトロインドール、ネブラリン、ゼブラリン、ベンゼン及びベンゼン誘導体からなる群から選択される非天然塩基を含み、或いは、前記非天然のヌクレオチドは、リン酸トリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボロノリン酸、ホスホロアミド酸及びモルホリノ基からなる群から選択される非天然ヌクレオチド間結合を含む請求項１１に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  13. 前記オリゴヌクレオチドの５’末端は、ポリリン酸基の前記末端リン酸と共有結合している請求項９〜１２の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  14. 前記オリゴヌクレオチドは、それをエキソヌクレアーゼ分解から保護する、その３’末端の化学修飾を含む請求項１３に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  15. 前記３’末端の化学修飾は、リン酸化、及びＣ３アルキルからＣ１２アルキルまでのスペーサーとの共有結合から選択される請求項１４に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  16. 前記オリゴヌクレオチドの３’末端は、ポリリン酸基の前記末端リン酸に共有結合している請求項９〜１２の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  17. 前記オリゴヌクレオチドは、それをエキソヌクレアーゼ分解から保護する、その５’末端の化学修飾を含む請求項１６に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  18. 前記５’末端の化学修飾は、リン酸化、及びＣ３アルキルからＣ１２アルキルまでのスペーサーとの共有結合から選択される請求項１４のタグ付けされたヌクレオチド。
  19. 前記オリゴヌクレオチドは、シアニン色素基、又はＣｙ３基であるシアニン色素基を含むリンカーを含む請求項９〜１８の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  20. 前記オリゴヌクレオチド及び／又は前記リンカーは、少なくとも２個の炭素から約１２個の炭素までのアルキル基を含むスペーサー基を含む請求項９〜１９に何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  21. 請求項１〜２０の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチドを含む、核酸をシークエンシングするためのキット。
  22. タグ付けされたヌクレオチドを作製するためのプロセスであって、
    （ａ）（ｉ）末端リン酸を有するポリリン酸基を含むヌクレオチド、ここで、前記末端リン酸は第１の反応性官能基を含むリンカーと結合しており、及び（ｉｉ）第２の反応性官能基を含むタグを提供すること、
    ただし、
    （１）前記第１の反応性官能基は、チオール、イミダゾール、アミン、アルキン及びジエンからなる群から選択され、前記第２の反応性官能基は、マレイミド、ハロアセトアミド、アルデヒド、エステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ビニルスルホン、アジド及びテトラジンからなる群から選択され、或いは、
    （２）前記第１の反応性官能基は、マレイミド、ハロアセトアミド、アルデヒド、エステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ビニルスルホン、アジド及びテトラジンからなる群から選択され、前記第２の反応性官能基は、チオール、イミダゾール、アミン、アルキン及びジエンからなる群から選択され、及び
    （ｂ）前記タグに前記ヌクレオチドを結合させるために、前記第１の反応性官能基を前記第２の反応性官能基と反応させること
    を含むプロセス。
  23. 前記第１の反応性官能基は、チオール、イミダゾール、アミン、アルキン及びジエンからなる群から選択され、前記第２の反応性官能基は、マレイミド、ハロアセトアミド、アルデヒド、エステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ビニルスルホン、アジド及びテトラジンからなる群から選択される請求項２２に記載のプロセス。
  24. 前記第１の反応性官能基は、アルキンであり、前記第２の反応性官能基は、アジドであるか、又は前記第１の反応性官能基は、アジドであり、前記第２の反応性官能基は、アルキンである請求項２２に記載のプロセス。
  25. 前記アルキンは、シクロオクチンである請求項２４に記載のプロセス。
  26. 前記第１の反応性官能基は、マレイミド、ハロアセトアミド、アルデヒド、イソチオシアネート、イソシアネート、ビニルスルホン、アジド及びテトラジンからなる群から選択され、前記第２の反応性官能基は、チオール、イミダゾール、アミン、アルキン及びジエンからなる群から選択される請求項２２に記載のプロセス。
  27. 前記工程（ｂ）は、銅、ルテニウム、銀、又はそれらの何れかの組合せを含む不均一触媒によって促進される請求項２２〜２６の何れか１項に記載のプロセス。
  28. 前記工程（ｂ）は、不均一触媒によって促進されない請求項２２〜２６の何れか１項に記載のプロセス。
  29. 前記タグは、表４に掲げられたタグからなる群から選択される請求項１〜７の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド又は請求項２２〜２８の何れか１項に記載のプロセス。
  30. 前記タグ付けされたヌクレオチドは、表４に掲げられたタグ付けされたヌクレオチドからなる群から選択される請求項１〜７の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド又は請求項２２〜２８の何れか１項に記載のプロセス。
  31. 前記タグは、表５に掲げられたタグからなる群から選択される請求項１〜７の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド又は請求項２２〜２８の何れか１項に記載のプロセス。
  32. 前記タグは、表６に掲げられた化学修飾からなる群から選択される化学修飾を含む請求項１〜７の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド又は請求項２２〜２８の何れか１項に記載のプロセス。
  33. 前記タグ付けされたヌクレオチドは、ポリメラーゼによる改善された補足速度を有する請求項１９に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
  34. 一本鎖核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
    （ａ）膜中のナノポアと接触している電解質溶液中にあり、かつ一部にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖核酸を、核酸ポリメラーゼと少なくとも４つのタグ付けされたヌクレオチドとに、それが、前記プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記核酸ポリメラーゼに前記プライマーへの前記タグ付けされたヌクレオチドの一つの組み込みを触媒させることを許容する条件のもとで、核酸伸長生成物を形成させるために、接触させること、
    ただし、前記少なくとも４つのタグ付けされたヌクレオチドの各々は、末端リン酸、アデニン、グアニン、シトシン、チミン若しくはウラシルである塩基、又はそれらそれぞれの誘導体、及びトリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、第２級アミン、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によって前記ヌクレオチドの前記末端リン酸に共有結合したタグを有するポリリン酸基を含み、ただし、（ｉ）各タグ付けされたヌクレオチド中の塩基の種類は、他の３つのタグ付けされた前記ヌクレオチドの各々中の塩基の種類と異なっており、及び（ｉｉ）各タグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数は、前記他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数と異なっているか、或いは、各タグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数は、同じであり、かつ各タグ付けされたヌクレオチド上のタグの種類は、前記他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々のタグの種類とは異なっており、
    ただし、前記タグ付けされたヌクレオチドの組み込みは、前記タグが結合したリン酸の解離をもたらし、
    （ｂ）前記膜を通して電圧を印加し、及び前記ナノポアに入っていく、前記ナノポア中に位置するようになる、及び／又は前記ナノポアを通り抜けて転座する、工程（ａ）において生成した、前記タグが結合した前記ポリリン酸に起因する、前記ナノポアを通した電子的変化を測定することによって、前記工程（ａ）における核酸伸長生成物を形成するために、どのタグ付けされたヌクレオチドが前記プライマーに組み込まれたかを決定すること、ただし、前記電子的変化は、前記ポリリン酸基中のリン酸の各異なる数、若しくは前記タグの各異なる種類のうち、適切な方について異なり、それによって前記組み込まれたタグ付けされたヌクレオチドに相補的な前記一本鎖核酸中のヌクレオチド残基を特定し、
    （ｃ）シークエンシングされている前記一本鎖核酸の各核酸残基について、前記工程（ａ）及び（ｂ）を反復して繰り返すこと、ただし、前記工程（ａ）の各反復において、前記タグ付けされたヌクレオチドは、それが、前記核酸伸長生成物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記工程（ａ）の先行の反復に起因する前記核酸伸長生成物中に組み込まれ、
    それによって、前記一本鎖核酸の配列を決定すること
    を含む方法。
  35. 一本鎖核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
    （ａ）膜中のナノポアと接触している電解質溶液中にあり、かつ一部にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖核酸を、核酸ポリメラーゼとタグ付けされたヌクレオチドとに、それが、前記プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記核酸ポリメラーゼに前記プライマーへのタグ付けされたヌクレオチドの一つの組み込みを触媒させることを許容する条件のもとで、ＤＮＡ伸長生成物を形成させるために、接触させること、ただし、前記タグ付けされたヌクレオチドは、末端リン酸、アデニン、グアニン、シトシン、チミン若しくはウラシルである塩、又はそれらそれぞれの誘導体、及びトリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、第２級アミン、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によって前記ヌクレオチドの前記末端リン酸に共有結合したタグを有するポリリン酸基を含み、
    ただし、タグ付けされたヌクレオチドの組み込みは、結合しているタグを有するポリリン酸の解離をもたらし、タグ付けされたヌクレオチドが組み込まれない場合、タグ付けされたヌクレオチドが組み込まれるまで、異なるタグ付けされたヌクレオチドを接触させることを反復して繰り返し、ただし、（１）各タグ付けされたヌクレオチド中の塩基の種類は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々の塩基の種類と異なっており、及び（２）各タグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数と異なっているか、或いは、各タグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数は、同じであり、各タグ付けされたヌクレオチド上のタグの種類は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々のタグの種類とは異なっており、
    （ｂ）前記膜を通して電圧を印加し、及び前記ナノポアに入っていく、前記ナノポア中に位置するようになる、及び／又は前記ナノポアを通り抜けて転座する、工程（ａ）において生成された、前記タグが結合した前記ポリリン酸に起因する、前記ナノポアを通した電子的変化を測定することによって、前記工程（ａ）における核酸伸長生成物を形成するために、タグ付けされたヌクレオチドがプライマーに組み込まれたかどうかを決定すること、ただし、前記電子的変化は、ｎの各値、又はタグの各異なる種類のうちの適切な方について異なり、それによって前記組み込まれたタグ付けされたヌクレオチドに相補的な前記一本鎖核酸中のヌクレオチド残基を特定すること;
    （ｃ）シークエンシングされている前記一本鎖核酸の各核酸残基について、工程（ａ）及び（ｂ）を反復して繰り返すこと、ただし、前記工程（ａ）の各反復において、前記タグ付けされたヌクレオチドは、それが、前記核酸伸長生成物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記工程（ａ）の先行の反復に起因する前記核酸伸長生成物中に組み込まれ、
    それによって、前記一本鎖核酸のヌクレオチド配列を決定すること
    を含む方法。
  36. 前記核酸は、ＤＮＡであり、前記核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼであるか、又は前記核酸は、ＲＮＡであり、前記核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素である請求項３４又は３５に記載の方法。
  37. 前記タグ付けされたヌクレオチドの各々の前記ポリリン酸基におけるリン酸の数は、同じであり、前記タグ付けされたヌクレオチドの各々の種類は、他の３種類のタグ付けされたヌクレオチドの各々のタグの種類と異なる請求項３４又は３５に記載の方法。
  38. 前記各タグは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴ糖、炭水化物、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ビニルポリマー、他の水溶性ポリマー、又はそれらの何れかの組み合わせを含む請求項３４〜３７の何れか１項に記載の方法。
  39. 前記各タグは、チアゾール、又は１，２−ジアジンによって前記末端リン酸に共有結合している請求項３４〜３８の何れか１項に記載の方法。
  40. 各ポリリン酸基は、少なくとも３つのリン酸を含む請求項３４〜３９の何れか１項に記載の方法。
  41. 前記各ポリリン酸基は、４つから６つまでのリン酸を含む請求項３４〜３９の何れか１項に記載の方法。
  42. 前記各タグは、前記トリアゾールによって前記末端リン酸に共有結合されており、前記各トリアゾールは、アジドとアルキンとの間の反応によって形成される請求項３９に記載の方法。
  43. 前記各トリアゾールは、構造：
    Figure 2017515887
     を有し、
    Ｒ１は、前記タグを含み、Ｒ２は、前記ヌクレオチドを含み；又は、
    Ｒ１は、前記ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、前記タグを含む
    請求項３９又は４２に記載の方法。
  44. 前記各トリアゾールは、構造：
    Figure 2017515887
     を有し、
    Ｒ１及びＲ３は、結合して環状部を形成し；及び
    結合したＲ１及びＲ３は、前記タグを含み、Ｒ２は、前記ヌクレオチドを含み；或いは、
    結合したＲ１及びＲ３は、前記ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、前記タグを含む
    請求項３９又は４２に記載の方法。
  45. 前記各タグは、表４又は５に掲げられているタグの群から選択されるか、或いは、前記各タグは、表６に掲げられている化学修飾からなる群から選択される化学修飾を含むか、或いは、前記各タグ付けされたヌクレオチドは、表４に掲げられているタグ付けされたヌクレオチドの群から選択される請求項３４〜４４の何れか１項に記載の方法。
  46. 前記各タグ付けされたヌクレオチドは、前記タグを前記ヌクレオチドに連結しているリンカー内のシアニン色素基を含み、かつ前記タグ付けされたヌクレオチドは、シアニン色素基を含まないタグ付けされたヌクレオチドと比較して、ポリメラーゼによる改善された補足速度を有する請求項３４〜４４の何れか１項に記載の方法。
  47. 前記４つのタグ付けされたヌクレオチドは、ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴ−Ｔ２３−Ｃ３、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２−ｄＳｐ８−Ｔ２０−Ｃ３、ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６、及びｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ｄＳｐ３−Ｔ２３−Ｃ３である請求項３４又は３５に記載の方法。
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