JP2006524040A - 新規リンカー類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類 - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明はマンガン塩存在下において末端リン酸標識ヌクレオチド類を用いてさまざまな酵素類に対するそれらの基質性を高める方法類が記載される。特に、マンガン塩存在下において末端リン酸標識ヌクレオチド類を核酸ポリメラーゼ類の基質類として用いることに基づくサンプル中の核酸検出方法類が記載される。さらに、末端リン酸標識ヌクレオチド類ならびに基質性を高め新規リンカー類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類のマンガン錯体類が提供される。
【解決手段】 マンガン塩を存在させることにより末端リン酸標識ヌクレオチド類の酵素基質性を高め、それを利用したサンプル中の核酸検出方法類及びそのための新規リンカー類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類のマンガン錯体類を提供する。
Description
a)式I:
ここでLは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)による1種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、
c)ホスファターゼ、及び
d)マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
a)下記の式I:
ここでLは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)による1種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、及び
c)マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
a)式II:
b)核酸ポリメラーゼを含む。
a)式II:
b)核酸ポリメラーゼ、及び
c)金属イオン結合緩衝液を含む。
本発明の別の態様では、ヌクレオシドポリリン酸(テトラ−(四)、ペンタ−(五)、ヘキサ−(六))を本発明に用いた標識に連結しそれらをポリメラーゼのためのよりすぐれた基質とするリンカーを有する新規末端リン酸標識ヌクレオチド類を提供する。これらの化合物は、式
本発明の方法類及び新規組成物類のため、有用な環式炭素部分が、Ferraro,M.及びGotor,V.によってChem Rev.2000、第100巻、4319−48に記載されている。適切な糖部分は、Joeng,L.S.ら、J. Med. Chem.1993、第356巻、2627−38、Kim H.O.ら、J. Med.Chem.193、第36巻、30−7、及びEschenmosser A.、Science 1999、第284巻、2118−2114によって記載されている。さらに、有用な非環式部分が、Martinez,C.I.ら、Nucleic Acids Research 1999,vol.27,1271−1274によって、Martinez,C.I.ら、Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 1997,vol.7、3013−3016によって、及びTrainer,G.L.の米国特許5,558,91において記載されている。これらの部分の構造類を下記に示したが、全ての部分について、Rは、H、OH、NHR、F、N3、SH、SR、OR低級アルキル及びアリルであり、糖部分について、X及びYは独立して、O、S又はNHであり、非環式部分について、Xは、O、S、NH又はNRである。
表3:標識がポリリン酸鎖に直接結合している標識ヌクレオシドポリリン酸類の例
アデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちA3P−DDAO
グアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちG3P−DDAO
シチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちC3P−DDAO
チミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちT3P−DDAO
ウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちU3P−DDAO
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdA3P−DDAO
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdG3P−DDAO
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdC3P−DDAO
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdT3P−DDAO
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdU3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddA3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddG3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddC3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddT3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddU3P−DDAO
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dA3P−DDAO
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dG3P−DDAO
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dC3P−DDAO
3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dT3P−DDAO
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dU3P−DDAO
アデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちA4P−DDAO
グアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちG4P−DDAO
シチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちC4P−DDAO
チミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちT4P−DDAO
ウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちU4P−DDAO
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdA4P−DDAO
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdG4P−DDAO
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdC4P−DDAO
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdT4P−DDAO
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdU4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddA4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddG4P−DDAO
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2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddT4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddU4P−DDAO
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわち3′−dA4P−DDAO
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3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわち3′−dU4P−DDAO
アデノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちA5P−DDAO
グアノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちG5P−DDAO
シチジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちC5P−DDAO
チミジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちT5P−DDAO
ウリジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちU5P−DDAO
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2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdG5P−DDAO
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdC5P−DDAO
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdT5P−DDAO
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2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちddU5P−DDAO
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dA5P−DDAO
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dG5P−DDAO
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3′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dU5P−DDAO
アデノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちA6P−DDAO
グアノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちG6P−DDAO
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チミジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちT6P−DDAO
ウリジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちU6P−DDAO
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2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちdT6P−DDAO
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちdU6P−DDAO
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2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちddT6P−DDAO
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3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dG6P−DDAO
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dC6P−DDAO
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dT6P−DDAO
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dU6P−DDAO
アデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちA3P−Umb
グアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)))三リン酸すなわちG3P−Umb
シチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちC3P−Umb
チミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちT3P−Umb
ウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちU3P−Umb
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdA3P−Umb
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdG3P−Umb
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdC3P−Umb
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdT3P−Umb
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdU3P−Umb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddA3P−Umb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddG3P−Umb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddC3P−Umb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddT3P−Umb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddU3P−Umb
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dA3P−Umb
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dG3P−Umb
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dC3P−Umb
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dT3P−Umb
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dU3P−Umb
アデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちA4P−Umb
グアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)))四リン酸すなわちG4P−Umb
シチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちC4P−Umb
チミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちT4P−Umb
ウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちU4P−Umb
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdA4P−Umb
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdG4P−Umb
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdC4P−Umb
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdT4P−Umb
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdU4P−Umb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddA4P−Umb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddG4P−Umb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddC4P−Umb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddT4P−Umb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddU4P−Umb
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dA4P−Umb
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dG4P−Umb
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dC4P−Umb
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dT4P−Umb
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dU4P−Umb
アデノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちA5P−Umb
グアノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちG5P−Umb
シチジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちC5P−Umb
チミジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちT5P−Umb
ウリジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちU5P−Umb
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdA5P−Umb
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdG5P−Umb
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdC5P−Umb
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdT5P−Umb
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdU5P−Umb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddA5P−Umb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddG5P−Umb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddC5P−Umb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddT5P−Umb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddU5P−Umb
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dA5P−Umb
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dG5P−Umb
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dC5P−Umb
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dT5P−Umb
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dU5P−Umb
アデノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちA6P−Umb
グアノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちG6P−Umb
シチジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちC6P−Umb
チミジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちT6P−Umb
ウリジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちU6P−Umb
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdA6P−Umb
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdG6P−Umb
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdC6P−Umb
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdT6P−Umb
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdU6P−Umb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddA6P−Umb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddG6P−Umb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddC6P−Umb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddT6P−Umb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddU6P−Umb
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dA6P−Umb
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dG6P−Umb
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dC6P−Umb
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dT6P−Umb
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dU6P−Umb
アデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちA3P−MeUmb
グアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))))三リン酸すなわちG3P−MeUmb
シチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちC3P−MeUmb
チミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちT3P−MeUmb
ウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちU3P−MeUmb
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdA3P−MeUmb
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdG3P−MeUmb
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdC3P−MeUmb
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdT3P−MeUmb
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdU3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddA3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddG3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddC3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddT3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddU3P−MeUmb
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dA3P−MeUmb
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dG3P−MeUmb
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dC3P−MeUmb
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dT3P−MeUmb
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dU3P−MeUmb
アデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちA4P−MeUmb
グアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))))四リン酸すなわちG4P−MeUmb
シチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちC4P−MeUmb
チミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちT4P−MeUmb
ウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちU4P−MeUmb
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdA4P−MeUmb
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdG4P−MeUmb
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdC4P−MeUmb
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdT4P−MeUmb
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdU4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddA4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddG4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddC4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddT4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddU4P−MeUmb
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dA4P−MeUmb
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dG4P−MeUmb
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dC4P−MeUmb
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dT4P−MeUmb
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dU4P−MeUmb
アデノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちA5P−MeUmb
グアノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちG5P−MeUmb
シチジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちC5P−MeUmb
チミジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちT5P−MeUmb
ウリジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちU5P−MeUmb
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdA5P−MeUmb
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdG5P−MeUmb
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdC5P−MeUmb
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdT5P−MeUmb
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdU5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddA5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddG5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddC5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddT5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddU5P−MeUmb
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dA5P−MeUmb
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dG5P−MeUmb
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dC5P−MeUmb
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dT5P−MeUmb
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dU5P−MeUmb
アデノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちA6P−MeUmb
グアノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちG6P−MeUmb
シチジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちC6P−MeUmb
チミジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちT6P−MeUmb
ウリジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちU6P−MeUmb
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdA6P−MeUmb
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdG6P−MeUmb
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdC6P−MeUmb
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdT6P−MeUmb
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdU6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddA6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddG6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddC6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddT6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddU6P−MeUmb
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dA6P−MeUmb
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dG6P−MeUmb
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dC6P−MeUmb
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dT6P−MeUmb
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dU6P−MeUmb
アデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちA3P−RR
グアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)))三リン酸すなわちG3P−RR
シチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちC3P−RR
チミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちT3P−RR
ウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちU3P−RR
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdA3P−RR
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdG3P−RR
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdC3P−RR
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdT3P−RR
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdU3P−RR
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddA3P−RR
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddG3P−RR
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddC3P−RR
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddT3P−RR
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddU3P−RR
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dA3P−RR
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dG3P−RR
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dC3P−RR
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dT3P−RR
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dU3P−RR
アデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちA4P−RR
グアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)))四リン酸すなわちG4P−RR
シチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちC4P−RR
チミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちT4P−RR
ウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちU4P−RR
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdA4P−RR
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdG4P−RR
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdC4P−RR
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdT4P−RR
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdU4P−RR
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddA4P−RR
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddG4P−RR
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddC4P−RR
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddT4P−RR
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddU4P−RR
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dA4P−RR
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dG4P−RR
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dC4P−RR
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dT4P−RR
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dU4P−RR
アデノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちA5P−RR
グアノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちG5P−RR
シチジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちC5P−RR
チミジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちT5P−RR
ウリジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちU5P−RR
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdA5P−RR
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdG5P−RR
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdC5P−RR
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdT5P−RR
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdU5P−RR
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddA5P−RR
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddG5P−RR
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddC5P−RR
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddT5P−RR
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddU5P−RR
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dA5P−RR
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dG5P−RR
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dC5P−RR
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dT5P−RR
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dU5P−RR
アデノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちA6P−RR
グアノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちG6P−RR
シチジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちC6P−RR
チミジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちT6P−RR
ウリジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちU6P−RR
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdA6P−RR
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdG6P−RR
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdC6P−RR
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdT6P−RR
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdU6P−RR
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddA6P−RR
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddG6P−RR
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddC6P−RR
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddT6P−RR
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddU6P−RR
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dA6P−RR
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dG6P−RR
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dC6P−RR
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dT6P−RR
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dU6P−RR
アデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちA3P−FlEt
グアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))))三リン酸すなわちG3P−FlEt
シチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちC3P−FlEt
チミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちT3P−FlEt
ウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちU3P−FlEt
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdA3P−FlEt
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdG3P−FlEt
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdC3P−FlEt
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdT3P−FlEt
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdU3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddA3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddG3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddC3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddT3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddU3P−FlEt
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dA3P−FlEt
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dG3P−FlEt
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dC3P−FlEt
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dT3P−FlEt
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dU3P−FlEt
アデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちA4P−FlEt
グアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))))四リン酸すなわちG4P−FlEt
シチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちC4P−FlEt
チミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちT4P−FlEt
ウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちU4P−FlEt
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdA4P−FlEt
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdG4P−FlEt
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdC4P−FlEt
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdT4P−FlEt
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdU4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddA4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddG4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddC4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddT4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddU4P−FlEt
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dA4P−FlEt
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dG4P−FlEt
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dC4P−FlEt
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dT4P−FlEt
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dU4P−FlEt
アデノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちA5P−FlEt
グアノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちG5P−FlEt
シチジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちC5P−FlEt
チミジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちT5P−FlEt
ウリジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちU5P−FlEt
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdA5P−FlEt
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdG5P−FlEt
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdC5P−FlEt
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdT5P−FlEt
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdU5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddA5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddG5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddC5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddT5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddU5P−FlEt
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dA5P−FlEt
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dG5P−FlEt
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dC5P−FlEt
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dT5P−FlEt
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dU5P−FlEt
アデノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちA6P−FlEt
グアノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちG6P−FlEt
シチジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちC6P−FlEt
チミジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちT6P−FlEt
ウリジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちU6P−FlEt
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdA6P−FlEt
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdG6P−FlEt
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdC6P−FlEt
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdT6P−FlEt
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdU6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddA6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddG6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddC6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddT6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddU6P−FlEt
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dA6P−FlEt
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dG6P−FlEt
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dC6P−FlEt
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dT6P−FlEt
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dU6P−FlEt
表4:リン酸を除去せずに検出可能な標識を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の例
FAM−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシンン−三リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
ROX−アミドプロピル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
REG−アミドプロピル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
R110−アミドプロピル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
TAMRA−アミドプロピル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
TAMRA−アミドドデシル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
TAMRA−アミドシクロヘキシル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
TAMRA−アミドキシレン−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
FAM−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
Cy3−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
Cy5−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
アレキサ(Alexa)−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
FAM−アミド−トリエチレングリコール−デオキシアデノシン−5′−三リン酸
FAM−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
REG−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
TAMRA−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
ROX−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
Cy3−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
Cy5−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
Cy5−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
TAMRA−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
ROX−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
Cy3−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
TAMRA−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
TAMRA−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−五リン酸
TAMRA−(Lys)n−アミドへプチル−アミド−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
TAMRA−(Lys)n−アミドへプチル−アミド−チミジン−5′−四リン酸
式I中のリン酸化標識が蛍光源部分である時、それは、望ましくは、下記(全て、ホスホモノエステルとして記載)のひとつから選択される:ELF97の名称で市販されている2−(5′−クロロ−2′−ホスホリルオキシフェニル)−6−クロロ−4−(3H)−キナゾリノン(Molecular Probes社)、フルオレセインジホスフェート(四アンモニウ塩)、フルオレセイン3′(6′)−O−アルキル−6′(3′)−リン酸、9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)リン酸(ニアンモニウム塩)、4−メチルウンベリフェリルリン酸(遊離酸)、レゾルフィンリン酸、4−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、3−シアノウンベリフェリルリン酸、9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イルリン酸、6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルリン酸及びその誘導体類。これらの色素類の構造を下記に示した。
a)式I:
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)による1種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、
c)ホスファターゼ、及び
d)マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
a)式I:
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)による1種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、及び
c)マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
a)下記の式II:
b)核酸ポリメラーゼを含む。
a)式II:
b)核酸ポリメラーゼ、及び
c)金属イオン結合緩衝液を含む。
前記塩基には、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類が含まれるが、それらに限定されない。
本発明の化合物類は、下記の図に示した方法類によって合成することもできる。
末端リン酸標識ヌクレオシド三リン酸類の合成:
Yは、NH、O、S、ONH、CH2、CO又は色素部分と共有結合を形成可能な別の官能基であり、及びPがH又はハライド又はスルホネートのような脱離基である。
末端リン酸標識ヌクレオシド−5′−四リン酸類の合成:
Yは、NH、O、S、ONH、CO、CH2又は色素部分と共有結合を形成可能な別の官能基であり、及びPがH又はハライド又はスルホネートのような脱離基である。
末端リン酸標識ヌクレオシド−5′−五リン酸類の合成:
Yは、NH、O、S、ONH、CH2、CO又は色素部分と共有結合を形成可能な別の官能基であり、及びPがH又はハライド又はスルホネートのような脱離基である。
γ−(4−トリフルオロメチルクマリニル)ddGTP(γCF 3 クマリン−ddGTP)の調製
ddGTP(純度96%を超える46.4mM溶液200μl)を、無水ジメチルホルムアミド(DMF、2×0.5ml)とともに共蒸発した。これに、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、9.6mg、5当量)を添加し、混合物を再度、無水DMF(0.5ml)とともに共蒸発した。残渣を無水DMF(0.5ml)に取り、混合物を一晩、攪拌した。約20%の環化されていない三リン酸がまだ存在していた(おそらく、カラム上での環状三メタリン酸の加水分解によるのであろう)。この混合物に対して、さらにDCC 2当量を添加し、2時間攪拌後、7−ハイドロキシ−4−トリフルオロメチルクマリン(4−トリフルオロメチルウンベリフェロン、42.7mg、20当量)とトリエチルアミン(26μl、20当量)を添加し、混合物を室温で攪拌した。2日後、HPLC(0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸(TEAA)中0−30%のアセトニトリルにより15分間、30−50%のアセトニトリルにより5分間及び50−100%のアセトニトリルにより10分間、C18 3.9×150mmカラム、流速1ml/分)により、9.7分のところに新規産物が示され、出発環式三リン酸が示された(254nmにおいて、77対5)。混合物をさらにもう1日攪拌した。P−31 NMRにより、反応混合物の主成分としてガンマ標識ヌクレオシド−三リン酸が示された。反応混合物をロータリエバポレータで濃縮した。残渣を水で抽出した(5×1ml)。HPLCにより、254nmにおいて純度82%及び335nmにおいて81%が示された。水溶液をまとめ、ロータリエバポレータで濃縮し、水で再度溶解させた(1ml)。流速15ml/分で0.1Mトリエチルアンモニウムバイカーボネート(TEAB,pH8.3)中0−30%アセトニトリルを30分間、30−50%アセトニトリルを10分間用いて、1インチ×300cmのC18カラムで精製した。生成物ピークを、3個の分画で採取した。分画1は、上記と同じ調製HPLC方法により再度精製したが、ただしTEAB緩衝液のpHはCO2を通気することにより6.7に低下させた。生成物ピークを濃縮し、MeOH(2回)と水(1回)で共蒸発させた。サンプルを水1mlに溶解させた。HPLCは、254nmと335nmにおいて99%を超える純度を示した。UVにより、322nmにおける吸光係数11,000を示す濃縮物2.2mM(7−ハイドロキシ−4−トリフルオロメチルクマリンのベータガラクトシド誘導体について報告、Molecular Probes Catalog)が示された。MS:M−=702.18(理論値702.31)、UVλA=253,276&322nm。ddGTPのガンマリン酸に結合したトリフルオロクマリン色素は、322nmの励起最大値を有しかつ約415nmの発光最大値を有する蛍光である。前記リン酸エステルを加水分解すると遊離クマリン色素が放出され、そのスペクトルは、約385nmの励起最大と約502nmの発光最大に変化する。この変化は、簡易な蛍光測定又は色の変化により容易に検出される。ガンマヌクレオチド類の合成は、一般的に、Arzumanov,A.ら、J.Biol.Chem(1996)、10月4日、271(40):24389−94に記載されている。
実施例2
γ−(3−シアノクマリニル)ddATP(γCNクマリン−ddATP)の調製
ddATP(純度96%を超える89mM溶液100μl)を、無水DMF(2×1ml)とともに共蒸発した。これに、DCC(9.2mg、5当量)を添加し、混合物を再度、無水DMF(1ml)とともに共蒸発した。残渣を無水DMF(0.5ml)に取り、反応物を室温で攪拌した。一晩した後、7−ハイドロキシ−3−シアノクマリン(33.3mg、20当量)とTEA(25μl、20当量)を添加し、混合物を室温で攪拌した。1日後、主成分(254nmにおいて55%)が8.1分後に観察され、別のマイナーな産物(約10%)が10分で観察された。もう1日しても有意な変化が起こらなかった。反応混合物をロータリエバポレータで濃縮し、残渣を水3×2mlで抽出した後、ろ過した。水溶液を濃縮し、流速15ml/分で0.1M TEAB(pH6.7)中0−30%アセトニトリルを30分間、30−50%アセトニトリルを10分間用いて、C−18カラムで精製した。主ピークを、3個の分画で採取した。主ピーク(分画2)のHPLCは、254nmにおいて純度95.6%及び335nmにおいて98.1%の純度を示した。それをロータリエバポレータで(室温で)濃縮し、MeOH(2×)と水(1×)で共蒸発した。残渣を水0.5mlに溶解させた。サンプル5μlを希釈し、UV分析用に1mlに希釈した。A346nm=0.784。吸光係数20,000(7−エトキシ−3−シアノクマリンについて報告されている、Molecular Probes Catalog)を想定すると、濃度は7.84mMであった。収率=3.92μM、44%。サンプルは、再度、上記と同一方法を用いてC−18カラムで精製した。サンプルピークは、3個の分画で採取した。分画2&3は254nmにおいて98%を超える純度を有しており、340nmにおいては99.5%を超えており、それらをまとめた。濃縮後、残渣をMeOH(2×)と水(1×)で共蒸発した。サンプルを水(1ml)に溶解させ、2.77mM溶液を得た。MS:M−=642.98au(理論値643.00au)、UVλA=263&346nm。ddATPのガンマリン酸に結合したシアノクマリン色素は、346nmの励起最大値を有しかつ約411nmの発光最大値を有する蛍光である。前記リン酸エステルを加水分解すると遊離クマリン色素が放出され、そのスペクトルは、約408nmの励起最大と約450nmの発光最大に変化する。この変化は、簡易な蛍光測定又は色の変化により容易に検出される。ガンマヌクレオチド類の合成は、一般的に、Arzumanov,A.ら、J.Biol.Chem(1996)、10月4日、271(40):24389−94に記載されている。
実施例3
δ−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)−ジデオキシチミジン−5′−四リン酸(ddT4P−DDAO)の調製
ddTTP(80mM溶液100μl)を、無水ジメチルホルムアミド(DMF、2×1ml)とともに共蒸発した。これに、ジシクロゲキシルカルボジイミド(8.3mg、5当量)を添加し、混合物を再度、無水DMF(1ml)とともに共蒸発した。残渣を無水DMF(1ml)に取り、反応物を室温で一晩、攪拌した。HPLCにより、ほとんどが環化された三リン酸(約82%)を示していた。この反応混合物を濃縮し、残渣を無水ジエチルエーテルで3回洗浄した。それを再度、無水DMFに溶解させ、ロータリエバポレータで乾燥するまで濃縮した。残渣を、200μlの無水DMF中にDDAO−一リン酸アンモニウム塩(5mg、1.5当量)とともに入れ、週末中ずっと40℃で攪拌した。HPLCは、所望のUV特徴を11.96分に有する新規生成物が形成されたことを示していた。(HPLC法: 0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸(pH7)中0.30%のアセトニトリルにより15分間、30−50%のアセトニトリルにより5分間、Novapak C−18 3.9×150mmカラム、流速1ml/分)。LCMS(ES−)はまた、M−1ピークについて主要マスピーク834を示した。反応混合物を濃縮し、Deltapak C18、19×300mmカラムで0.1M TEAB(pH6.7)とアセトニトリルを用いて精製した。生成物を有する分画を、上記と同様の方法を用いてHPLCによって精製した。純粋な生成物を含む分画を濃縮し、MeoH(2×)と水(1×)で共蒸発させた。残渣を水(1.2ml)に溶解させ、1.23mM溶液を得た。254nmにおけるHPLC純度は、97.5%を超えており、455nmにおいては、96%を超えていた、UVλA=267nmと455nm、MS:M−1=834.04(理論値8.33.95)。δ−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)−ジデオキシシチジン−5′−四リン酸(ddC4P−DDAO)、δ−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)−ジデオキアデノシン−5′−四リン酸(ddA4P−DDAO)、及びδ−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−イル)−ジデオキシグアノシン−5′−四リン酸(ddG4P−DDAO)を、同様に合成し精製した。これらの精製化合物類の分析により、下記のデータを得た:ddC4P−DDAO:UVλA=268nmと454nm、MS:M−1=819.32(理論値818.96)、ddA4P−DDAO:UVλA=263nmと457nm、MS:M−1=843.30(理論値842.97)、ddG4P−DDAO:UVλA=257nmと457nm、MS:M−1=859.40(理論値858.97)。
ε−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)−ジデオキシチミジン−5′−五リン酸DDAO−ddT−五リン酸(ddT5P−DDAO)
A.DDAOピロリン酸の調製
DDAO−リン酸ジアンモニウム塩(11.8μmol)を無水DMF(3×10.25ml)とともに共蒸発し、DMF(0.5ml)に溶解させた。これに、カルボニルジイミダゾール(CDI、9.6mg、5当量)を添加し、混合物を室温で一晩、攪拌した。過剰のCDIをMeoH(5μl)を添加し30分間攪拌することによって分解した。この混合物に対し、トリブチルアンモニウムジハイドロゲンリン酸(10当量、0.5M DMF溶液236ml)を添加し、この混合物を室温で4日間攪拌した。反応混合物をロータリエバポレータで濃縮した。残渣を緩衝液Aとして0.1M TEAB/アセトニトリル(3:1)及び緩衝液Bとして1M TEAB/アセトニトリル(3:1)を用いて0−100%Bを用いるHiPrep 16.10 Q XLカラムで精製した。主ピーク(HPLC純度98%)を採取し、濃縮しメタノール(2×)で共蒸発した。残渣を水1mlに溶解させ、5.9mM溶液を得た。UV/VISλmax=456nm。
B.ddT5P−DDAOの調製
ddTTP(47.5mM水溶液100μl)を無水DMF(2×1ml)とともに共蒸発した。これに対して、DCC(5当量、4.9mg)を添加し、混合物をDMF(1×1ml)とともに共蒸発した。残渣を無水DMF(0.5ml)にとり、室温で3時間攪拌した。これに対して、別に無水DMF(2×1ml)とともに共蒸発したDDAOピロリン酸1.03当量をDMF溶液として添加した。この混合物を乾燥するまで濃縮し、その後、無水DMF200μlに取った。混合物を38℃で2日間加熱した。反応混合物を濃縮し、水で希釈し、ろ過し、2段階勾配を用いて0−100%A−BによりHiTrap 5ml イオン交換カラムで精製した。溶媒A=0.1M TEAB/アセトニトリル(3:1)及び溶媒B=1M TEAB/アセトニトリル(3:1)。生成物の大半を含む分画12×13をまとめ、濃縮しメタノール(2×)で共蒸発した。残渣を5カラム容量の0.30%アセトニトリルの0.1MTEAB溶液と2カラム容量の30−50%アセトニトリルを用いて、流速10ml/分でXterra RP C−18 30−100mmカラムで再度精製した。純粋な生成物を含む分画を濃縮し、メタノール(2×)と水(1×)で共蒸発した。455nmにおけるHPLC純度は99%を超えていた。UV/VIS=268nm及び455nm。MS:M−1=914.03(理論値913.93)。
A)dCTP−ジアミノヘプチル−REG(dCTP−NH(CH 2 ) 7 −NH−REG又はdCTP−DAH−REGの合成
b:ジアミノへプタン500μmolを無水DMF5mlに溶解し、乾燥するまで蒸発させた。この後、乾燥DMFによる共蒸発を2回行った。残渣を乾燥DMF2mlに溶解させた。この溶液をDCC−dCTP反応物(16時間のDCC−dCTP反応後)とまとめた。4時間後、HPLCは、ジアミノヘプチルdCTPに86%が変換したことを示していた。
c:dCTP−ジアミノへプタン(上記より)1μmolを0.1M NaHCO3pH9.3により400μlに希釈した。これに対して、200μlDMF中5−REG NHSエステル2μmolを添加した。反応は、室温で2時間進行させた。反応物を水で10mlに希釈し、HR10/10Mono Qカラムに載せた。カラムを0.1M TEAB/25% アセトニトリルから1M TEAB/25%アセトニトリルまでの勾配により溶出した。dCTP−DAH−REGを含む分画をまとめ、乾燥するまで濃縮し、エタノールによる共蒸発を2回、行った。生成物を水で溶解し、収量190nmolを得た。
B)dA4P−ジアミノヘプチル−TAMRA(dA4P−NH(CH 2 ) 7 −NH−TAMRAの合成
b:dA4−ジアミノヘプチルの合成:下記の試薬類をまとめた:
水2ml中dA4P 50μmol、0.2M 1−メチルイミダゾール−HCl、pH6を2.5ml、EDAC96mg、及びジアミノへプタン162mg。pHは、HClで6に調整し、反応を5時間進行させた。反応物を水で50mlに希釈し、Q Sepharose XL16/10カラムにのせ、0.1M TEAB/1M TEABの0−100%勾配で溶出させた。純粋な生成物を含む分画をまとめて、乾燥するまで濃縮させ、メタノールで2回、共蒸発させた。HPLC:Xterra RP C18 0−80% 0.1M TEAA/アセトニトリル12分。純度85%。滞留時間4.4分。収量7μM。
c:dA4P−ジアミノへプチル−TAMRAの合成:dA4P−ジアミノヘプチル2.5μMを0.1M NaHCO3 pH9.2 500μlに溶解させ、DMF400μlに溶解させたTAMRA5−NHSエステル3.5mgと混合した。反応は、室温で一晩進行させた。反応物を水で10mlに希釈し、HR10/10Mono Qカラムで0.1M TEAB/25% MeCNから1M TEAB/25%MeCNまでの勾配により精製した。生成物を含む分画を濃縮し、アセトニトリルを除去し、Xterra RP C18 19×100カラムに載せ、0−40%の0.1M TEAB/アセトニトリル勾配で溶出した。純粋な生成物を含む分画を乾燥するまで濃縮し、メタノールで2回、共蒸発させた。HPLC:Xterra RP 4.6×150mm、0.1M TEAA/アセトニトリル勾配。純度99%。収量450nM。
ガンマリン酸標識ddGTPのポリメラーゼ取り込みによる核酸配列検出
反応は、実施例(1)のジデオキシヌクレオチドを用いて、室温(23℃)で組み立てた。反応物は、dC又はdTのいずれかにより、プライマーの3′末端に隣接する次のテンプレートヌクレオチドとしてそれぞれ配列番号2及び配列番号3に対応する2つの異なるオリゴヌクレオチドテンプレート類のひとつにアニーリングさせた単一ヌクレオチドプライマー(配列番号1によって表される)を有するプライマー−テンプレート組合せを含有していた。
反応条件:25mM Tris,pH8.0、5%グリセロール、5mM MgCl2,0.5mM ベータ−メルカプトエタノール、0.01% tween−20、0.25単位のエビアルカリホスファターゼ、テンプレート(次のテンプレートヌクレオチドは、示したようにdCMP又はdTMPのいずれかである)にアニーリングさせた100nMプライマー、及び2μM ddGTP−CF3−クマリンを含む反応物70μlを、LS−55ルミネセンススペクトロメータ(Perkin Elmer)中の石英蛍光超ミクロチューブ中で調製し、タイムドライブモードで作動させた。励起及び発光波長は、それぞれ、390nmと500nmであった。スリット幅は、励起スリットについて5nmとし、発光スリットについて15nmであった。反応を、3′、5′エキソヌクレアーゼ活性、5′、3′エキソヌクレアーゼ活性及びジデオキシヌクレオチド類に対する識別を消滅させるように遺伝子工学で作製したクローニングしたDNAポリメラーゼIを0.35μl(11単位)と0.25mM MnCl2を添加し、開始させた。
ガンマリン酸標識ddATPのポリメラーゼ取り込みによる核酸配列検出
反応は、実施例(2)のジデオキシヌクレオチドを用いて、室温(23℃)で組み立てた。反応物は、dC又はdTのいずれかによりプライマーの3′末端に隣接するテンプレートヌクレオチドとしてそれぞれ配列番号2及び配列番号3に対応する2つの異なるオリゴヌクレオチドテンプレート類のひとつにアニーリングさせた単一ヌクレオチドプライマー(配列番号1)を有するプライマー:テンプレート組合せを含有していた。
反応条件:25mM Tris、pH8.0、5%グリセロール、5mM MgCl2、0.5mM ベータ−メルカプトエタノール、0.01% tween−20、0.25単位のエビアルカリホスファターゼ、テンプレートにアニーリングさせた100nMプライマー、及び2μM ddATP−CN−クマリンを含む反応物70μlを、LS−55ルミネセンススペクトロメータ(Perkin Elmer)中の石英蛍光超ミクロチューブ中で調製し、タイムドライブモードで作動させた。励起及び発光波長は、それぞれ、410nmと450nmであった。スリット幅は、励起スリットについて5nmとし、発光スリットについて15nmであった。反応を、3′−5′エキソヌクレアーゼ活性、5′−3′エキソヌクレアーゼ活性及びジデオキシヌクレオチド類に対する識別を消滅させるように遺伝子工学で作製したクローニングしたDNAポリメラーゼIを0.35μl(11単位)と0.25mM MnCl2を添加し、開始させた。
マグネシウム又はマンガンを含有する緩衝液中におけるリン酸標識ヌクレオチド類対塩基標識ヌクレオチド類の相対的取り込み速度
反応物(10μl、50℃、10分)は、1×反応緩衝液(25mM HEPES 8.5、0.01%tween−20)、活性化DNA3μg(染色体DNA)、5mMのMnCl2(丸)又はMgCl2(四角)のいずれか、FAM−TAM−11−ddTTP(点線)又はddT4P−DDAO(実線)のいずれか1μMと、1回の反応当たり10単位から1回の反応当たり0.01単位としたThermo Sequenase I(商標) DNAポリメラーゼを4倍ずつ希釈した溶液を含んでいた。結果(図3)を、線型及び対数スケールの両者でプロットし、酵素と相対的取り込み効率に対して両者とも直線性であることを示している。この結果、マグネシウム緩衝液に対してマンガン緩衝液における塩基標識ヌクレオチドの取りこみ効率が1.4倍低下したが、マグネシウム緩衝液に対してマンガン緩衝液中でリン酸標識ヌクレオチドの取りこみ効率が28倍増加したことを示している。
5mM塩化マグネシウム存在下におけるdGTP−DAH−REGの取りこみに及ぼす種々の濃度の塩化マンガンの効果
下記の反応混合物を調製した:200nM dGTP−DAH−REG(DAH=ジアミノヘプチルリンカー)、100nM プライマー/テンプレート、0.01mg/ml Phi 29 exo−、25mM Tris pH8、50mM KCl、1mM ベータメルカプトエタノール、エビアルカリホスファターゼ0.25単位、5mM MgCl2、及び種々の濃度のMnCl2。取りこみ速度は、REG−ピロリン酸放出に伴うREG蛍光の傾きの変化を測定することによって測定した。図4は、検討した濃度範囲でMnCl2添加により有意に速度が大きくなることを明らかにしている。
MgCl 2 を添加しないMnCl 2 存在下における核酸合成
上記の操作を用いて、dGTP−DAH−REGの取りこみ速度を、プライマー(配列番号1)と正確及び正確でないテンプレート1と2(それぞれ、配列番号2と配列番号3)を用いて測定した。図5に示したように、正確なテンプレートによる速度がミスマッチテンプレートによる速度よりもはるかに速いことを示している。
dCTP−DAH−ROXの取りこみの忠実性
実施例9と同じプライマー及びテンプレート(配列番号4)を用いて、反応開始後さまざまな時点におけるdCTP−DAH−ROXの取り込みを調べた。アッセイ条件は下記のようであった:総反応容量:30μlで、100nMプライマー/テンプレート、100nM Phi 29 exo−ポリメラーゼ、50mM Tris pH7.5、75mM KCl、0.7mM MnCl2,0.1mM DTT、0.3mg/ml BSA。反応は、濃縮物25μMに対してROX−dCTPを添加することによって開始した。生成物をゲル上で分離し、それらは明らかに、単一塩基の伸長とdCTP−DAH−ROXのそれ以上の取り込みがないことを示しており、強制条件下においてさえも取りこみミスが起こらないことを示唆している。
さまざまなポリメラーゼ類による末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込みに及ぼすMnCl 2 の効果
オリゴdT(35mer)は、各等量を20μM濃度で混合し80℃で4分間インキュベーションし氷上で急激に冷却することによって、ポリdAによりアニーリングした。この溶液1μlを25mM Hepes,pH8.0、0.01% Tween−20,10μM dT4P−DDAO,0.005u/μlBAP、図7に示した濃度のポリメラーゼ及び種々の濃度のMnCl2及びMgCl2を含む反応物20μlに混合した。反応物を、図7に示したように60℃で15分又は30分間インキュベーションした。図7は、試験したすべてのポリメラーゼについて、MnCl2は単独又はMgCl2存在下において取りこみ速度に大きな正の効果を及ぼすことを明らかにしている。実際、MnCl2が存在していないと、速度は非常に遅い。
4種のガンマ標識dNTP類をすべて用いた伸長合成
実施例9と同一のプライマー/テンプレート(配列番号1及び配列番号2)を用いて、下記の反応を組み立てた。反応容量:70μlで、25mM Tris、pH8.0、50mM KCl、0.7mM MnCl2、0.5mM ベータ−メルカプトエタノール、0.1mg/mlBSA、0.005単位/μl SAP、それぞれ75nMのプライマー及びテンプレート、それぞれ1μMのDDAO−dNTP(ここで、N=A、T、G、C)及び0.12mg/mlのPhi 29 exo−ポリメラーゼを6μl含んで反応を開始した。図8に示したように、核酸合成は、およそ30分で完了した。マンガン不在下でほとんどか又は全く合成は起こらなかった。
標識と末端リン酸の間にリンカーを有する末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の取りこみ速度に及ぼすリンカー類の効果
さまざまなリンカーを有する下記末端リン酸標識ヌクレオチド類を調べた:TAMRA−NH−リンカー−NH−dTTP(2′−デオキシチミジン誘導体)及びREG−NH−リンカーdATP。リンカーは図9に示し、さらに得られたデータも示した。プライマー及びテンプレート配列は、実施例9に述べたものであるが、ただし、取りこみ部位のテンプレート塩基は、入ってくるヌクレオチドの塩基に依存して、さまざまであった(SEQ ID 1,3及び5)。
異なるDNAポリメラーゼによる取りこみ速度に対して末端リン酸と色素部分の間のリンカーにポリペプチドを添加することが有する効果
dNTPに結合させた最適リンカー(末端リン酸と色素部分の間のNH(CH2)7NH)の取りこみ速度を、さらにペンタリシンを結合させたdNTPと比較した。いくつかの異なるDNAポリメラーゼ類を本研究に用いて、ヌクレオチド取り込みに及ぼすリンカー中のリシン部分の効果を確認した。反応は、下記に示したように実施し、結果を下記の表5に示した。
a.DNAポリメラーゼを除いて全成分を混合し0.0015U/μlのBAP存在下25℃で5分間インキュベーションし、標識されていないヌクレオチドをすべて加水分解した。
b.反応混合物1μlを時点ゼロで取り除き、95%ホルムアミド/25mM EDTA4μl中でクエンチングさせた。
c.DNAポリメラーゼ1μlを添加し反応を開始させた。異なる時点でアリコット2μlを取り(短い時間コースでは、15、30及び60秒)、95%ホルムアミド/25mM EDTA8μl中でクエンチングさせた。
d.サンプルを沸騰水中で4分間変性させ、氷で急激に冷却し、2μlを25%(19:1−アクリルアミド:ビスアクリルアミド)、8M尿素、1×TBE PAGEに載せた。ゲルを約1時間、500Vで流した。
e.DNA生成物をStorm860で可視化し、21mer生成物に変換された20merプライマーの総量分画を計算することによって定量した。
リンカーを有していない三、四、及び五リン酸類と色素と末端リン酸の間にC7又はTEGリンカーを有する上記リン酸類とのPhi29 DNAポリメラーゼを用いた取り込み速度の比較
下記のプライマー/テンプレートを使用した A(デオキシグアノシンアナログ用、配列番号1及び配列番号2)及びB(チミジンアナログ用、配列番号1及び配列番号5)
Claims (66)
- 末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動速度を高め前記酵素又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の活性を検出する方法で、
a)マンガン塩を含む反応緩衝液中における末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応から前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動を行なわせ、それによって、マンガン不在下における反応速度を上回るように前記反応速度を高めること
を含む、方法。 - 前記酵素が核酸ポリメラーゼ、リガーゼ、テロメラーゼ、プリマーゼ又はヌクレオチドハイドロラーゼから選択される請求項1記載の方法。
- 前記核酸ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素又は末端トランスフェラーゼ類から選択される請求項2記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、Phi29 DNAポリメラーゼ、クレノウexo−、シークエナーゼ(Sequenase)、Taq DNAポリメラーゼ、Thermo Sequenase I、Thermo Sequenase II,Thermo Sequenase E681M、T.hypogea(ThyB)、T.neapolitana(Tne)、T.subterranea(Tsu)、T.barossii(Tba)、T.litoralis(NEB Vent)、T.kodakaraensis(Novagen)、P.furiosis(Strategene)、P.GB−D(NEB Deep Vent)、Human Pol beta,Tsp JS1,AMV−逆転写酵素、MMLV−逆転写酵素及びHIV−逆転写酵素から選択される請求項2記載の方法。
- マンガン塩の濃度が以上0.01mMである請求項1記載の方法。
- マンガン塩濃度が、0.01乃至50mMの間である請求項1記載の方法。
- マンガン塩濃度が、0.1乃至10mMの間である請求項1記載の方法。
- マンガン以外に他の金属塩もまた末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸とともに存在する請求項1記載の方法。
- 前記他の金属塩が、マグネシウム又はカルシウム塩である請求項8記載の方法。
- 前記他の金属塩が、0.01mM乃至50mMの濃度で存在する請求項8記載の方法。
- さらに金属イオン緩衝液存在下で前記反応を行なわせ遊離金属イオン濃度を調節することを含む請求項1記載の方法。
- 前記金属イオン緩衝液がジカルボン酸である請求項11記載の方法。
- 核酸配列の存在を検出する方法で、
a)マンガン塩存在下で請求項3記載の核酸ポリメラーゼ反応を行なわせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高め、前記ポリメラーゼ反応が、1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド類を反応させること及び標識ポリリン酸を生成させることを含み、
b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及び
c)前記検出可能な種の存在を検出すること
を含む、方法 - 段階(a)がさらにホスファターゼ存在下で前記ポリメラーゼ反応を行なわせることを含む請求項13記載の方法。
- 前記核酸配列がRNAである請求項13記載の方法。
- 段階a)がさらに、明確な標識類を有する2種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド類の存在下で前記ポリメラーゼ反応を行なわせることを含む請求項13記載の方法。
- 前記標識類が、化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される酵素活性化可能な標識類である請求項16記載の方法。
- 前記1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドが前記ポリリン酸鎖中に4個以上のリン酸基を含む請求項13記載の方法。
- さらに前記核酸配列を定量化する段階を含む請求項13記載の方法。
- 前記検出可能な種が核酸配列量に実質的に比例する量で産生される請求項13記載の方法。
- 前記核酸配列が天然又は合成オリゴヌクレオチドである請求項13記載の方法。
- 前記核酸配列が染色体又は染色体の一部である請求項13記載の方法。
- 前記核酸配列がDNAである請求項13記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ反応がさらに、1種以上のDNA又はRNAポリメラーゼの存在下で核酸配列をインキュベーションする段階を含む請求項13記載の方法。
- さらに、前記ポリメラーゼ反応において1種以上の他の検出試薬類を含む段階を含む請求項13記載の方法。
- 前記他の検出試薬類が、前記検出可能な種と検出可能な程異なる応答が可能である請求項25記載の方法。
- 前記他の検出試薬が抗体である請求項25記載の方法。
- 前記検出可能な種が、色、蛍光発光、化学発光、質量変化、還元/酸化電位及びその組合せから構成される群から選択された性質により検出可能である請求項13記載の方法。
- 前記検出可能な種によって産生されたスペクトルを公知のスペクトルと比較することによって前記核酸配列を定量化する段階をさらに含む請求項13記載の方法。
- 核酸配列中の単一ヌクレオチドを同定確認する方法で、
a)請求項13記載のポリメラーゼ反応を行なわせること、及び
b)取り込まれたヌクレオシドを同定すること
を含む、方法。 - 前記1種以上の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の1種以上が4個以上のリン酸基を含む請求項13記載の核酸配列存在検出方法。
- 前記酵素活性化可能な標識が、化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項32記載の方法。
- 前記リン酸化標識が、2−(5′−クロロ−2′−ホスホリルオキシフェニル)−6−クロロ−4−(3H)−キナゾリノン、フルオレセインジホスフェート、フルオレセイン3′(6′)−O−アルキル−6′(3′)−リン酸、9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−イル)リン酸、4−メチルウンベリフェリルリン酸、レゾルフィンリン酸、4−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、3−シアノウンベリフェリルリン酸、9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イルリン酸、6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルリン酸、及びその誘導体類から構成される群から選択された蛍光源性部分である請求項32記載の方法。
- 前記リン酸化標識が、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸、3−インドリルリン酸、p−ニトロフェニルリン酸、及びその誘導体類から構成される群から選択された発色源性部分である請求項32記載の方法。
- 前記化学発光化合物がホスファターゼ活性化1,2−ジオキセタン化合物である請求項32記載の方法。
- 前記1,2−ジオキセタン化合物が、2−クロロ−5−(4−メトキシスピロ[1,2−ジオキセタン−3,2′−(5−クロロ−)トリシクロ[3,3,1−13,7]−デカン]−1−イル)−1−フェニルリン酸、クロロアダマンチ−2′−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、3−(2′−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4−(3″−ホスホリルオキシ)フェニル−1,2−ジオキセタン及びその誘導体類から構成される群から選択される請求項36記載の方法。
- 前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アジドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボキシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項32記載の方法。
- 前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項32記載の方法。
- a)式I
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)による1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、
c)ホスファターゼ、及び
d)マンガン塩を含む反応緩衝液、
を含む核酸検出キット。 - a)式I
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)による1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)1種以上のDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素、
c)ホスファターゼ、
d)マンガン塩を含む反応緩衝液、及び
e)金属イオン結合緩衝液、
を含む核酸検出キット。 - 前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アジドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項40又は41のいずれか1項に記載のキット。
- 前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項40又は41のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標識が、化学発光化合物類、蛍光化合物類、着色色素類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項40又は41のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標識が、蛍光色素類、着色色素類、化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類又はその組合せから構成される群から選択される請求項45記載の方法。
- 前記標識が、フルオロセイン類、ローダミン類、シアニン類、ピレン類、ダンシル類、クマリン類、テキサスレッド、アレキサ色素類、ロドール色素類、オレゴングリーン類及びその誘導体類から構成される群から選択された蛍光部分である請求項45記載の方法。
- 前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アジドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボキシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項45記載の方法。
- 前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項45記載の方法。
- a)式I
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)による1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)1種以上のDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素、及び
c)マンガン塩を含む反応緩衝液、
を含む核酸検出キット。 - a)式I
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)による1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)1種以上のDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素、
c)マンガン塩を含む反応緩衝液、及び
d)金属イオン結合緩衝液、
を含む核酸検出キット。 - 前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アチドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項50又は51のいずれか1項に記載のキット。
- 前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項50又は51のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標識が、化学発光化合物類、蛍光化合物類、着色色素類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項50又は51のいずれか1項に記載のキット。
- 単位としてのx−Z−yが、ジアミノへプタン、ジアミノシクヘキサン、ジアミノキシレン、p−アミノフェノール、9−(2−アミノエチル)−トリエチレングリコール、アミノ−トリエチレングリコール、アミノ−テトラエチレングリコール、ジアミノヘプチル−リシン類、エチレン又は高級グリコール類、ジアミノヘプチルペンタリシン、又は2−(2−アミノエトキシ)エタノールから構成される群から選択される請求項55記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
- 前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アジドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボキシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項55記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
- 前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項55に記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
- xが1又は10である請求項59記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
- 前記ヌクレオシドポリリン酸が天然又は修飾ヌクレオシドである請求項59記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
- Lが、構造x−Z−yのリンカーを介してNPPに結合している請求項59記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
- 単位としてのx−Z−yが、ジアミノへプタン、ジアミノシクヘキサン、ジアミノキシレン、p−アミノフェノール、9−(2−アミノエチル)−トリエチレングリコール、アミノ−トリエチレングリコール、アミノ−テトラエチレングリコール、ジアミノヘプチル−リシン類、グリコール類、ジアミノヘプチルペンタリシン、又は2−(2−アミノエトキシ)エタノールから構成される群から選択される請求項62記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
- 前記標識が、化学発光化合物類、蛍光化合物類、着色色素類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項64又は65のいずれか1項に記載のキット。
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