JP2018537969A - Ｄｎａポリメラーゼシータによる核酸の３’末端の修飾 - Google Patents

Ｄｎａポリメラーゼシータによる核酸の３’末端の修飾 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＤＮＡポリメラーゼθターミナルトランスフェラーゼ活性を用いて核酸の３’末端を改変するための組成物及び方法を提供する。
【選択図】 図１Ａ

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０１５年１０月２９日に出願された米国仮出願第６２／２４８，０８３号、及び２０１６年５月１８日に出願された第６２／３３８，１１９号に対する優先権を主張する。これらの全ての出願は、本明細書中にその全体が参照して援用される。
連邦支援の研究又は開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された１Ｒ０１ＧＭ１１５４７２−０１及び４Ｒ００ＣＡ１６０６４８−０３に基づく政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
発明の背景
ＤＮＡポリメラーゼ（polymerases,Ｐｏｌｓ）は、遺伝情報の増殖及び維持に必要であるため、生命にとって重要である。興味深いことに、ヒト細胞はいくつかの異なるタイプのＰｏｌｓをコードしており、その多くは、それらがオープンな活性部位のために本質的に誤りを起こしやすいため、特定のＤＮＡ損傷を許容することができる（Ｓａｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：１４１−５２； Ｗａｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ７３：１３４−５４）。そのような酵素は、損傷乗り越え(translesion)ポリメラーゼと呼ばれ、且つ、主にポリメラーゼのＹファミリーの中にある。しかし、ＰＯＬＱによってコードされるユニークなＡファミリーポリメラーゼも、かさ高い損傷を許容し、且つ、最も致命的な損傷である二本鎖切断（double-strand break,ＤＳＢ）を超えて複製することができる（Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２：２３０−７； Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８９：１３１７７−８５； Ｙｏｕｓｅｆｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ １０：ｅ１００４６５４； Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔｕｒｅ ５１８：２５４−７； Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０５：６４２−５２； Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：６１１７−２６； Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ６：ｅ１００１００５； Ｋｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５：３２１６）。例えば、近年の研究は、ヒトのＰＯＬＱ（本明細書ではＰｏｌθと称する）によってコードされたポリメラーゼドメインの、マイクロホモロジー媒介性末端結合（microhomology-mediated end-joining,ＭＭＥＪ）（代替非相同末端結合（alternative non-homologous endjoining,ａｌｔ−ＮＨＥＪ）とも称する）を行う能力を実証する。これは、最小量の配列相同性によって安定化されたＤＮＡシナプスを介して複製を行うポリメラーゼの能力を含む（Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２：２３０−７）。さらなる研究は、ＰｏｌθがＭＭＥＪ／ａｌｔ−ＮＨＥＪに必須であること（Ｙｏｕｓｅｆｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ １０：ｅ１００４６５４； Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔｕｒｅ ５１８：２５４−７； Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ６：ｅ１００１００５； Ｋｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５：３２１６）、及びこの潜在的な結果として、正確な相同組換え（homologous recombination,ＨＲ）経路が欠損した癌細胞の生存を促進すること（Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔｕｒｅ ５１８：２５４−７）を示している）。
無脊椎動物及び哺乳動物細胞における研究は、ＰｏｌθのＤＮＡ合成活性に依存することが示されたａｌｔ−ＮＨＥＪ修復接合部における非鋳型ヌクレオチド挿入の存在を実証する（Ｙｏｕｓｅｆｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ １０：ｅ１００４６５４； Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔｕｒｅ ５１８：２５４−７； Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ６：ｅ１００１００５； Ｋｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５：３２１６）。しかし、今まで(insofar)鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性がｉｎ ｖｉｔｒｏで証明されていない（Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４０：２６１１−２２）。例えば、初期のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、３’オーバーハングを有するｓｓＤＮＡ及び部分的ｓｓＤＮＡ（partial ssDNA,ｐｓｓＤＮＡ）基質を伸長させるＰｏｌθの特異な能力を示した（Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４０：２６１１−２２）。この活性は鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性の結果であると示唆されたが、ポリメラーゼは相補的なｄＮＴＰが存在しない単一のタイプの塩基を含むホモポリマーｓｓＤＮＡ鋳型を伸長することができなかった（Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４０：２６１１−２２）。したがって、これらの以前の研究は、Ｐｏｌθによる鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性の欠如を実証した（Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４０：２６１１−２２）。より最近の研究は、ポリメラーゼが逆平行に(in an anti-parallel manner)２つのオリゴヌクレオチドを一緒に過渡的にアニーリングすることによりｓｓＤＮＡを伸長させ、反対のｓｓＤＮＡをトランスの鋳型として繰り返し使用することを示唆する証拠を示した（Ｙｏｕｓｅｆｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ １０：ｅ１００４６５４）。これは、ＰｏｌθがｐｓｓＤＮＡのＭＭＥＪを促進する能力を与えられた正式な可能性であるが、最近の研究は、ポリメラーゼが同じ鋳型上で「スナップバック(snap-back)」複製を行うことによってｓｓＤＮＡを伸長することを代わりに示した（Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２：２３０−７）。以前の研究で使用された特定の条件下でポリメラーゼがｓｓＤＮＡを伸長させた機序にかかわらず、現在まで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を実行するＰｏｌθの能力は実証されていない。従って、ｉｎ ｖｉｖｏでａｌｔ−ＮＨＥＪの間にポリメラーゼがどのようにランダムヌクレオチド挿入を生成するかは依然として不明である。例えば、Ｐｏｌθテンプレート非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性を活性化するために補助タンパク質又は補因子が必要であるかどうかは不明のままである。
ＤＮＡ及びＲＮＡへの標準的な(canonical)及び修飾されたデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの鋳型非依存性移入が、バイオテクノロジー及びバイオメディカル研究における多くの用途にとって重要であることを考慮すると、ＰｏｌθがＤＮＡ及びＲＮＡ基質を伸長する能力を調べることは、鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性の新しい機構を同定するために潜在的に重要である。現在、ＤＮＡの３’末端(terminal ends)を改変するために市販されている唯一の酵素は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（terminal deoxynucleotidyl transferase,ＴｄＴ）である。しかし、ＴｄＴはこの活動において多くの点で制限されている。
したがって、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方への標準的な及び修飾されたデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの効果的な鋳型非依存性の転写(transfer)を提供する組成物及び方法が当該分野で必要とされている。本発明は、この満たされていない必要性を満たすものである。
発明の概要
一態様では、本発明は、基質を用いて核酸の３’末端を改変する方法を提供する。一実施形態では、当該方法は、Ａファミリーポリメラーゼ、基質、核酸、及び反応溶液を含む混合物を形成するステップであって、前記反応溶液が少なくとも１つの二価金属を含むステップと；前記混合物をインキュベートするステップと；３’末端修飾核酸を単離するステップと；を含む。
一実施形態では、核酸は、一本鎖ＤＮＡ（single stranded DNA,ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ、部分ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ又はテロメアｓｓＤＮＡである。
一実施形態では、前記ＡファミリーポリメラーゼはＰｏｌθ又はその活性断片である。一実施形態では、ＰｏｌθはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、標識ｄＮＴＰは、ｃｙ３−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、ビオチン−１６ＡＡ−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−５−ｄＣＴＰ、シアニン３−ＡＡ−ＵＴＰ、４−チオ−ＵＴＰ、ビオチン−１６−ＡＡＣＴＰ、ガンシクロビル三リン酸(Triphosphate)、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−アデノシン−５’−三リン酸、又は５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸である。
一実施形態では、前記二価金属は、マンガン（Ｍｎ２＋）、コバルト（Ｃｏ２＋）、又はそれらの組み合わせである。一実施形態では、前記二価金属は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、前記二価金属は約５ｍＭの濃度で存在する。
一実施形態では、前記反応溶液は、グリセロール、非イオン性界面活性剤、及び緩衝液をさらに含む。一実施形態では、前記反応溶液中の前記グリセロールの濃度は２０％以下である。一実施形態では、前記反応溶液中のグリセロールの濃度は１０％である。一実施形態では、前記非イオン性界面活性剤の濃度は１％未満である。一実施形態では、前記非イオン性界面活性剤の濃度は０．１％である。一実施形態では、前記緩衝液はＭＥＳ／ＴＲＩＳであり、且つ、ＭＥＳ／ＴＲＩＳは約２０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在する。一実施形態では、前記緩衝液のｐＨは６．５〜８．８である。一実施形態では、前記緩衝液のｐＨは８．２である。
一実施形態では、前記混合物をインキュベートするステップは、前記混合物を少なくとも２時間インキュベートすることを含む。一実施形態では、前記混合物をインキュベートするステップは、前記混合物を２５℃〜４２℃でインキュベートすることを含む。一実施形態では、前記混合物をインキュベートするステップは、前記混合物を４２℃でインキュベートすることを含む。
本発明はまた、基質を用いて核酸の３’末端(terminal end)を改変するためのキットを提供する。一実施形態では、前記キットは、Ａ−ファミリーポリメラーゼ及び反応溶液を含む。一実施形態では、前記キットは前記基質をさらに含む。
一実施形態では、前記ＡファミリーポリメラーゼはＰｏｌθである。
一実施形態では、前記反応溶液は、５ｍＭ Ｍｎ２＋、２０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．２、１０％グリセロール、０．０１％ＮＰ−４０及び０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む。
本発明はまた、核酸のデノボ(de novo)合成方法を提供する。一実施形態では、当該方法は、Ａファミリーポリメラーゼ、少なくとも１つの核酸塩基(nucleobase)、及び反応溶液を含む混合物を形成するステップであって、前記反応溶液は、少なくとも１つの二価金属を含むステップと；前記混合物をインキュベートするステップと；核酸を単離するステップと；を含む。
一実施形態では、ＡファミリーポリメラーゼはＰｏｌθである。
一実施形態では、前記少なくとも１つの核酸塩基は、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びそれらのいずれの組み合わせから選択される。
一実施形態では、少なくとも１つの二価金属はＭｎ ２＋である。
図面の簡単な説明
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばよりよく理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、図面には現在好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示された実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
図１Ａ〜図１Ｅを含む図１は、Ｐｏｌθがマンガン及びコバルトの存在下で鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を示すことを実証する実験結果を示す。 図１Ａは、示された二価カチオンの存在下でｄＴＴＰを用いたポリｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性(denaturing)ゲルを示す。 図１Ｂは、増加する量のＭｎ２＋の存在下でｄＴＴＰを用いたポリｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図１Ｃは、示されたｐＨレベル及び緩衝液濃度の存在下でｄＴＴＰを用いたポリｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図１Ｄは、示された量の塩の存在下でｄＴＴＰを用いたポリｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図１Ｅは、増加する濃度のグリセロール及びＮＰ−４０の存在下でｄＴＴＰを用いたポリｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図２Ａ及び図２Ｂを含む図２は、Ｐｏｌθ鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性の最適化を実証する実験の結果を示す。 図２Ａは、増加する量のＰｏｌθの存在下でｄＴＴＰを用いたポリｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図２Ｂは、指示された温度で増加する時間間隔でｄＴＴＰを用いたポリｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図３Ａ〜図３Ｇを含む図３は、ＰｏｌθがｓｓＤＮＡ及びｐｓｓＤＮＡに対して優先的ターミナルトランスフェラーゼ活性を示すことを実証する実験結果を示す。 図３Ａは、示されたｄＮＴＰを用いたポリｄＣ（左）及びポリｄＴ（右）ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図３Ｂは、指示されたｄＮＴＰを用いた示されたｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図３Ｃは、マグネシウム及びマンガンの存在下で示された非ホモポリマーｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図３Ｄは、示されたｄＮＴＰを用いた示されたｄｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図３Ｅは、二本鎖ＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図３Ｆは、示されたｄＮＴＰを用いた、示されたｐｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図３Ｇは、示されたｄＮＴＰでテロメア配列の後にモデル化されたｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図４Ａ〜図４Ｄを含む図４は、ｓｓＤＮＡに対するＰｏｌθ、Ｐｏｌμ及びＴｄＴ活性の比較を実証する実験の結果を示す。 図４Ａは、示されたｄＮＴＰを用いたポリ−ｄＣ（左）及び非ホモポリマーｓｓＤＮＡ（右）のＰｏｌθ（レーン１〜６）及びＰｏｌμ（レーン７〜１２）伸長を示す変性ゲルを示す。 図４Ｂは、示されたｄＮＴＰを用いたｓｓＤＮＡのＰｏｌθ（レーン１〜５）及びＴｄＴ（レーン６〜１０）伸長を示す変性ゲルを示す。 図４Ｃは、示されたリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）を用いたｓｓＤＮＡのＰｏｌθ及びＴｄＴ伸長を示す変性ゲルを示す。 図４Ｄは、以下の修飾ヌクレオチド類似体： １ ｃｙ３−ｄＵＴＰ； ２ ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ； ３ ビオチン−１６ＡＡ−ｄＵＴＰ； ４ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−５−ｄＣＴＰ； ５ Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−ＡＴＰ； ６ シアニン３−ＡＡ−ＵＴＰ； ７ ４−チオ−ＵＴＰ； ８ ビオチン−１６−ＡＡＣＴＰ； ９ ガンシクロビル三リン酸； １０ ５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸；を用いたｓｓＤＮＡのＰｏｌθ及びＴｄＴ伸長を示す変性ゲルを示す。 修飾されたヌクレオチド １ ｃｙ３−ｄＵＴＰ； ２ ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ； ３ ビオチン−１６ＡＡ−ｄＵＴＰ； ４ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−５−ｄＣＴＰ； ５ Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−ＡＴＰ； ６ シアニン３−ＡＡ−ＵＴＰ； ７ ４−チオ−ＵＴＰ； ８ ビオチン−１６−ＡＡＣＴＰ； ９ ガンシクロビル三リン酸；及び １０ ５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸；の構造を示すイメージである。 図６Ａ及び図６Ｂを含む図６は、Ｐｏｌθが標準的な(canonical)ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドでＲＮＡを伸長することを実証する実験の結果を示す。 図６Ａは、デオキシリボヌクレオチドの存在下でのＲＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図６Ｂは、示された修飾されたヌクレオチド（図５参照）を用いたＲＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図７Ａ〜図７Ｇを含む図７は、Ｐｏｌθがマンガンの存在下でロバストな(robust)鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を示すことを実証する実験結果を示す。 図７Ａは、Ｐｏｌθ依存性ＤＮＡ末端結合(end-joining)のモデルを示す。そこでは、ＰｏｌθがＤＮＡ末端結合を容易にするために既存の配列マイクロホモロジーを使用する。 図７Ｂは、Ｐｏｌθ依存性ＤＮＡ末端結合のモデルを示す。そこでは、Ｐｏｌθが鋳型非依存性機構によってｓｓＤＮＡを伸長し、次いでＤＮＡ末端結合を促進するため、新たに生成された配列を使用する。 図７Ｃは、Ｐｏｌθ依存性ＤＮＡ末端結合のモデルを示す。そこで、Ｐｏｌθが、反対側のオーバーハングをトランスでの(in trans)鋳型として使用してｓｓＤＮＡを伸長し、次いで、ＤＮＡシナプス解離後にＰｏｌθがＤＮＡ末端結合を促進するために新たに生成された配列を使用する。 図７Ｄは、示されたｄＮＴＰ及び１０ｍＭ Ｍｇ２＋の存在下でのポリｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図７Ｅは、ｄＴＴＰ、及び示された２価のカチオン濃度及び時間間隔の存在下で、ポリ−ｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図７Ｆは、ｄＴＴＰ、及び示された２価のカチオン濃度及び温度の存在下で、ポリ−ｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図７Ｇは、全部で４つのｄＮＴＰ及び１０ｍＭのＭｇ２＋又は５ｍＭのＭｎ２＋の存在下、示されたｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図８は、図８Ａ及び８Ｂを含み、Ｐｏｌθ鋳型非依存性活性がＭｎ２＋及びＭｇ２＋の生理学的濃度によって刺激されることを実証する実験の結果を示す。 図８Ａは、示された濃度のＭｎ２＋及びＭｇ２＋を有するｄＣＴＰの存在下でのポリｄＴのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図８Ｂは、パネルＡで観察されたｓｓＤＮＡ伸長パーセントのプロットを示す。伸長パーセントは、伸長産物(extended products)の合計の強度を各レーンのすべてのＤＮＡの強度の合計で割ることによって計算した。 図９Ａ〜図９Ｅを含む図９は、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性の最適化を実証する実験の結果を示す。 図９Ａは、指示された［Ｍｎ２＋］を有するｄＴＴＰの存在下でのポリ−ｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ−Ｍｎ２＋伸長を示す変性ゲルを示す。 図９Ｂは、５ｍＭ Ｍｎ２＋及び示された緩衝液を有するｄＴＴＰの存在下でのポリｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ−Ｍｎ２＋伸長を示す変性ゲルを示す。 図９Ｃは、５ｍＭ Ｍｎ２＋及び指示された塩を有するｄＴＴＰの存在下でのポリｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ−Ｍｎ２＋伸長を示す変性ゲルである。 図９Ｄは、５ｍＭ Ｍｎ２＋及び指示された界面活性剤及びグリセロールを有するｄＴＴＰの存在下でのポリ−ｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ−Ｍｎ２＋伸長を示す変性ゲルである。 図９Ｅは、５ｍＭのＭｎ２＋及び示されたＰｏｌθ濃度を有するｄＴＴＰの存在下でのポリｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ−Ｍｎ２＋伸長を示す変性ゲルである。 図１０Ａ〜図１０Ｄを含む図１０は、Ｐｏｌθ−Ｍｇ２＋鋳型依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性の配列分析を実証する実験の結果を示す。 図１０Ａは、Ｐｏｌθ−Ｍｇ２＋伸長産物を配列決定するために使用される方法の概略図を示す。 図１０Ｂは、１０ｍＭのＭｇ２＋、全４つのｄＮＴＰ、及びｓｓＤＮＡ ＲＰ３４７の存在下でＰｏｌθにより生成された伸長産物の配列を示す。ＲＰ３４７ ｓｓＤＮＡの最初の配列が最上部に示されている。伸長産物の配列は、５’−３’方向に示される。黒い下線、テンプレートからコピーされた配列。 図１０Ｃは、Ｐｏｌθ−Ｍｇ２＋が、スナップバック複製を介してＲＰ３４７ ｓｓＤＮＡから産物１−８を繰り返し生成する方法のモデルを示す。 図１０Ｄは、同一ではない配列決定反応及びファイル(files)を示す産物１−８の代表的な配列トレースを示す。特定の配列は、プラスミドベクターへのクローニングから生じるそれらの特定の方向性のために相補体として表される。 図１１Ａ〜図１１Ｅを含む図１１は、３つの異なるモードのターミナルトランスフェラーゼ活性間でＰｏｌθが振動する(oscillates)ことを実証する実験の結果を示す。 図１１Ａは、５ｍＭ Ｍｎ２＋の存在下でのＰｏｌθ ｓｓＤＮＡ伸長産物の配列を示す。最初のｓｓＤＮＡ配列は、最上部に示されている。黒い下線、元の鋳型、又は元の鋳型から生成された相補的な配列のいずれかからコピーされた配列；マッチした色の線、スナップバック複製による相補的な配列。 図１１Ｂは、１０ｍＭ Ｍｇ２＋及び１ｍＭ Ｍｎ２＋の存在下でのＰｏｌθ ｓｓＤＮＡ伸長産物の配列を示す。最初のｓｓＤＮＡ配列は、最上部に示されている。黒い下線、元の鋳型、又は元の鋳型から生成された相補的な配列のいずれかからコピーされた配列；マッチした色の線、スナップバック複製による相補的な配列。 図１１Ｃは、Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性のモデルを示す。（最上部）Ｐｏｌθは、Ｍｇ２＋及びＭｎ２＋の存在下で、鋳型非依存性の活性を優先的に示す。Ｐｏｌθはまた、ｃｉｓで(in cis)（最低部左）及びｔｒａｎｓで（in trans）（最低部右）で鋳型ｓｓＤＮＡ伸長を行い、且つ、これらの３つの機構の間を振動する。 図１１Ｄは、図１１Ｂの配列３及び８に基づくＰｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性のモデルを示す。 図１１Ｅは、示された二価カチオンの存在下でＰｏｌθによって生成されたｓｓＤＮＡ産物の長さを示すプロットを示す。 図１２は、ＰｏｌθがＭｎ２＋の存在下で初期鋳型と同一の配列領域(tracts)をどのように生成するかのモデルを示す。赤、コピーされた元のシーケンス。黒色、赤色配列の相補(complement)。黒の相補的配列はまた、in transでの鋳型伸長を介して生成され得る。 図１３Ａ〜図１３Ｄを含む図１３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの代替末端結合の間にターミナルトランスフェラーゼ活性の３つの異なる様式の間でＰｏｌθが振動することを実証する実験結果を示す。 図１３Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪの再構成のスキーム（最上部）と、１０ｍＭのＭｇ２＋及び１ｍＭのＭｎ２＋を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでＰｏｌθにより生成されたａｌｔ−ＥＪ産物の配列（最底部）とを示す。赤いテキスト、挿入；黒いテキスト、元のＤＮＡ配列；黒と灰色の下線、元のテンプレートからコピーされた配列；赤い下線、スナップバック複製による相補的な配列；下線なしの赤い配列、ランダム挿入；上付き文字１は、ａｌｔ−ＥＪの間に後で削除されたテンプレート部分からシーケンスがコピーされたことを示唆する；上付き文字２は、シーケンスが複数の方法でテンプレートからコピーされたことを示唆する。元のＤＮＡ配列が最上部に示される。青色文字、突然変異。 図１３Ｂは、図１３Ａにおいて生成された挿入領域(tract)長さのプロットを示す。 図１３Ｃは、非鋳型伸長、cisでの鋳型伸長及びtransでの鋳型伸長による個々のヌクレオチド挿入事象のパーセントを示すチャートを示す。ｔ検定は、非鋳型化及び鋳型化ｉｎ ｃｉｓ挿入のパーセント間に有意差がないことを示す。 図１３Ｄは、図１３Ａからの末端結合産物１及び２に基づくＰｏｌθ活性のモデルを示す。 図１４Ａ〜図１４Ｄを含む図１４は、ｉｎ ｖｉｖｏでの代替末端結合の間にターミナルトランスフェラーゼ活性の３つの異なるモード間でＰｏｌθが振動することを実証する実験結果を示す。 図１４Ａは、マウス胚性幹細胞における部位特異的ＤＳＢのＰｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪのスキーム（最上部）と、細胞内のＰｏｌθによって生成されたａｌｔ−ＥＪ産物の配列（最低部）とを示す。 図１４Ｂは、図１４Ａにおいて生成された挿入領域長さのプロットを示す。 図１４Ｃは、非鋳型伸長、cisでの鋳型伸長及びtransでの鋳型伸長による個々のヌクレオチド挿入事象のパーセントを示すチャートを示す。ｔ検定は、非鋳型化及び鋳型化ｉｎ ｃｉｓ挿入のパーセント間に有意差がないことを示す。 図１４Ｄは、図１４Ａからの末端結合産物１及び２に基づくＰｏｌθ活性のモデルを示す。 図１５Ａ〜図１５Ｄを含む図１５は、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋鋳型非依存性活性についての対照実験の結果を示す。 図１５Ａは、実験条件の概略図を示す。 図１５Ｂは、プライマー−鋳型（最上部）上のＰｏｌθ−Ｍｎ２＋の連続的な活性のモデルを示す。５ｍＭのＭｎ２＋の存在下で固相でのプライマー伸長中にＰｏｌθ−Ｍｎ２＋により生成された配列。黒い配列、鋳型依存性；赤い配列、鋳型非依存性；青い配列、誤った組み込み(misincorporation)。ダッシュ、フレームシフト突然変異。着色された線、スナップバック複製によって生成される相補的な配列。 図１５Ｃは、Ｍｇ２＋及びＭｎ２＋の存在下でのプライマー鋳型上のＰｏｌθ活性のモデルを示す（最上部）。１０ｍＭ Ｍｇ２＋（左）及び５ｍＭ Ｍｎ２＋（右）の存在下でＰｏｌθプライマー伸長産物を示す変性ゲル。 図１５Ｄは、ｄＡＴＰの存在下でのプライマー鋳型及びｓｓＤＮＡ上のＰｏｌθ−Ｍｎ２＋活性のモデルを示す（最上部）。５ｍＭのＭｎ２＋及びｄＡＴＰの存在下で、それぞれプライマー鋳型（左）及びプライマー（右）上の鋳型依存性（左）及び鋳型非依存性（右）Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋活性を示す変性ゲル。 図１６は、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋がデノボ(de novo)ＤＮＡ及びＲＮＡ合成活性を示すことを示す実験結果を示す。５ｍＭのＭｎ２＋及び指示されたヌクレオチドの存在下でのＰｏｌθによるデノボ（de novo）核酸合成を示す変性ゲルである。 図１７Ａ及び図１７Ｂを含む図１７は、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋がプロセッシブ（processive）ターミナルトランスフェラーゼ活性を示すことを実証する実験の結果を示す。 図１７Ａは、実験の模式図（左）と、ｓｓＤＮＡトラップによるＰｏｌθ−Ｍｎ２＋ターミナルトランスフェラーゼ活性の阻害を示す変性ゲル（右）とを示す。 図１７Ｂは、実験の模式図（左）と、ｓｓＤＮＡトラップの存在下及び非存在下におけるＰｏｌθ−Ｍｎ２＋ターミナルトランスフェラーゼ活性の時間経過を示す変性ゲル（右）とを示す。 図１８Ａ〜図１８Ｄを含む図１８は、ＤＮＡトラップの存在下で異なるターミナルトランスフェラーゼ活性の間でＰｏｌθ−Ｍｎ２＋が振動することを実証する実験の結果を示す。 図１８Ａは、固相で行った実験計画を示す。 図１８Ｂは、１０ｍＭのＭｇ２＋及び１ｍＭのＭｎ２＋を有する過剰ｓｓＤＮＡの存在下（橙色）及び非存在下（灰色）のＰｏｌθによって生成されたｓｓＤＮＡ産物の長さを示す棒グラフを示す。 図１８Ｃは、１０ｍＭのＭｇ２＋、１ｍＭのＭｎ２＋、及び全部で４つのｄＮＴＰを有する過剰のｓｓＤＮＡトラップの存在下で、示されたｓｓＤＮＡ基質とともにインキュベートしたＰｏｌθによって生成された配列を示す。黒い下線、初期のｓｓＤＮＡ基質と同一又は相補的な配列；赤い下線、ｓｓＤＮＡトラップに相補的な配列；テキストの上の色のついた線、個々のｓｓＤＮＡ産物内の相補的配列。 図１８Ｄは、１０ｍＭのＭｇ２＋、１ｍＭのＭｎ２＋、及び全部で４つのｄＮＴＰを有する過剰のｓｓＤＮＡトラップの非存在下で、示されたｓｓＤＮＡ基質とともにインキュベートされたＰｏｌθによって生成された配列を示す。黒い下線、初期のｓｓＤＮＡ基質と同一又は相補的な配列；赤い下線、ｓｓＤＮＡトラップに相補的な配列；テキストの上の色のついた線、個々のｓｓＤＮＡ産物内の相補的配列。 図１９は、生理学的濃度のＭｇ２＋及びＭｎ２＋の存在下で鋳型の(templated)と非鋳型のターミナルトランスフェラーゼ活性との間でＰｏｌθが振動することを示す実験結果を示す。１ｍＭのＭｇ２＋及び５０μＭのＭｎ２＋の存在下でのｓｓＤＮＡ伸長の間にＰｏｌθによって生成された配列。黒の下線及び灰色の下線、初期のｓｓＤＮＡ基質に相補的な配列；赤い下線、初期のｓｓＤＮＡ基質と同一の配列；青色の線、スナップバック複製によって生成された相補的な配列；線がない赤いテキスト、ランダムな挿入。初期のｓｓＤＮＡ配列が最上部に示されている。 図２０Ａ〜図２０Ｃを含む図２０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪを実証する実験の結果を示す。 図２０Ａは、ａｌｔ−ＥＪ反応の概略図と、末端結合(endjoining)産物の増幅及び配列決定に使用されるその後の手順とを示す。対照(control)ａｌｔ−ＥＪ反応は、１０ｍＭ Ｍｇ ２＋及び１ｍＭ Ｍｎ ２＋を用いて行った。 図２０Ｂは、Ｐｏｌθ及びＬｉｇ３（最上部左）、Ｐｏｌθ単独（最上部の中央）の存在下で、及びＰｏｌθ及びＬｉｇ３の非存在下(最上部右)で行われたａｌｔ−ＥＪ反応から精製されたＤＮＡを含有するか、又はプライマーのみのＤＮＡがないか（最低部中央）のいずれかである、ＰＣＲ反応の産物を示す非変性（non-denaturing）ゲルを示す。最上部中央及び最上部右のゲル中の産物は、プライマーのみのコントロール（最低部中央ゲル）において示されるプライマー二量体事象に起因する。レーン１〜８は、以下の各温度： ６１℃、６０．８℃、６０．４℃、５９．９℃、５９．２℃、５８．６℃、５８．２℃、５８℃において行われたＰＣＲ反応を表す。レーン９〜１３は、ＰＣＲプライマーＲＰ４３５及びＲＰ４３１の非存在下で、且つ、以下の各温度： ６１℃、６０．４℃、５９．９℃、５９．２℃、５８．２℃において行ったＰＣＲ反応を表す。レーン９−１３におけるＰＣＲ産物の不在は、Ｔａｑポリメラーゼは、末端結合又は他の機構を介して元のｐｓｓＤＮＡ鋳型を増幅することができないことを示している。 図２０Ｃは、示されたタンパク質を含む末端結合反応後のクローニングベクターで観察される末端結合産物のパーセントを示すプロットを示す。赤色、挿入を伴う末端結合産物；灰色、挿入を伴わない末端結合産物。ｎ＝６４（＋Ｐｏｌθ，＋Ｌｉｇ３）、ｎ＝７２（＋Ｐｏｌθ，−Ｌｉｇ３）、ｎ＝１２（−Ｐｏｌθ，−Ｌｉｇ３）。Ｐｏｌθ及びＬｉｇ３の非存在下での末端結合産物は、ＰＣＲの稀な副生成物による可能性が高い。 図２１Ａ及び図２１Ｂを含む図２１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでａｌｔ−ＥＪ中にＰｏｌθがプロセッシブに(processively)作用することを実証する実験の結果を示す。図２１Ａは、ｓｓＤＮＡトラップを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪの再構成のスキーム(最上部)と、１０ｍＭ Ｍｇ２＋及び１ｍＭ Ｍｎ２＋を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰｏｌθによって生成されたａｌｔ−ＥＪ産物の配列（最低部）とを示す。 図２１Ｂは、図２１Ａにおいて生成された挿入領域(tract)長さのプロットを示す。 図２２Ａ〜図２２Ｃを含む図２２は、Ｐｏｌθが低濃度のＭｇ２＋及びＭｎ２＋の存在下でａｌｔ−ＥＪの間に挿入を生成することを実証する実験の結果を示す。 図２２Ａは、１ｍＭのＭｇ２＋及び５０μＭのＭｎ２＋を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪの再構成のスキーム（最上部）と、挿入が＞２ｂｐのＰｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪ産物と（最低部）を示す。 図２２Ｂは、図２２Ａに示される挿入領域長さのプロットを示す。 図２２Ｃは、挿入あり又は挿入なしのＰｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪ産物のパーセンテージを示すプロットを示す。ｎ＝３２。 図２３は、遠隔ドナー位置からコピーされた大きな挿入を示す実験結果を示す。マウス胚性幹細胞における部位特異的ＤＳＢのＰｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪのためのスキーム（最上部）。細胞内でＰｏｌθによって生成されたａｌｔ−ＥＪ産物の挿入配列（最低部３パネル）。予想される遠隔ドナーサイトは、配列の類似性に基づいて右側にリストされている。遠隔ドナー位置からコピーされた大きな鋳型挿入は、二重鎖ＤＮＡへの鎖の侵入に続いて、Ｄループの伸長及び解離に起因する可能性が高い。 図２４Ａ及び図２４Ｂを含む図２４は、ｉｎ ｖｉｖｏで生成された代替末端結合産物の追加の配列分析を実証する実験の結果を示す。 図２４Ａは、マウス胚性幹細胞における部位特異的ＤＳＢのＰｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪのためのスキーム（最上部）と、及び細胞内Ｐｏｌθによって生成されたａｌｔ−ＥＪ産物の配列（最低部）とを示す。 図２４Ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏで生成された挿入領域長さの円グラフを示す。ｎ＝１１８。 図２５Ａ〜図２５Ｆを含む図２５は、ＰｏｌθがｐｓｓＤＮＡ上の優先的ターミナルトランスフェラーゼ活性を示すことの実験結果を示す。 図２５Ａは、５ｍＭ Ｍｎ２＋及び示されたｄＮＴＰを用いたポリ−ｄＣ（左）及びポリ−ｄＴ（右）ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図２５Ｂは、５ｍＭ Ｍｎ２＋及び示されたｄＮＴＰを用いた、示されたｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図２５Ｃは、５ｍＭ Ｍｎ２＋及び示されたｄＮＴＰを用いた、示されたｄｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図２５Ｄは、５ｍＭのＭｎ２＋及び全部で４つのｄＮＴＰを用いたプライマー−鋳型のＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。プライマー−鋳型上のＰｏｌθ−Ｍｎ２＋活性のモデル（右）。 図２５Ｅは、５ｍＭのＭｎ２＋及び示されたｄＮＴＰを用いた、示されたｐｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図２５Ｆは、５ｍＭのＭｎ２＋及び示されたｄＮＴＰを用いた、テロメア配列の後にモデル化されたｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長を示す変性ゲルを示す。 図２６Ａ及び図２６Ｂを含む図２６は、Ｍｎ２＋を用いたＰｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性とＰｏｌμターミナルトランスフェラーゼ活性との比較を実証する実験結果を示す。 図２６Ａは、Ｍｎ２＋及び指示されたヌクレオチドの存在下でのポリｄＣのＰｏｌθ及びＰｏｌμ伸長を示す変性ゲルを示す。 図２６Ｂは、Ｍｎ２＋及び示されたヌクレオチドの存在下でのＲＰ３４７ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ及びＰｏｌμ伸長を示す変性ゲルを示す。 図２７Ａ〜図２７Ｇを含む図２７は、保存された残基がＰｏｌθ処理能力(processivity)及び鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性に寄与することを示す実験結果を示す。 図２７Ａは、Ｐｏｌθ及び関連するＡファミリーＰｏｌｓの配列アライメントを示す。保存された正に帯電した残基（２２０２、２２５４）及びＰｏｌθにおけるループ２(loop 2)は、それぞれ黄色及び灰色で強調表示される。黒いボックスは保存されたモチーフを示す。＊＝同一残基、 ：＝非常に似た性質を共有する残基、 ．＝いくつかの特性を共有する残基。 図２７Ｂは、ｓｓＤＮＡプライマーを用いたＰｏｌθの構造を示す（ＰＤＢコード４Ｘ０Ｐ）（Ｚａｈｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。残基Ｒ２２０２及びＲ２２５４は青色で示されている。点線の青い線はイオン相互作用を示す。ループ２は暗赤色で表示される。thumbとpalmのサブドメインが表示される。 図２７Ｃは、５ｍＭのＭｎ２＋及び全部で４つのｄＮＴＰを用いた、ｓｓＤＮＡのＰｏｌθＷＴ及びＰｏｌθＬ２伸長を示す変性ゲルを示す。 図２７Ｄは、５ｍＭのＭｎ２＋及び全部で４つのｄＮＴＰを有するプライマー−鋳型のＰｏｌθＷＴ及びＰｏｌθＬ２伸長を示す変性ゲルと、プライマー鋳型上のＰｏｌθＷＴ−Ｍｎ２＋及びＰｏｌθＬ２−Ｍｎ２＋活性のモデルとを示す。 図２７Ｅは、１０ｍＭのＭｇ２＋及び全部で４つのｄＮＴＰの存在下でのプライマー鋳型のＰｏｌθＷＴ及びＰｏｌθＲＲ伸長の経時変化を示す変性ゲルを示す。 図２７Ｆは、５ｍＭのＭｎ２＋及び示されたｄＮＴＰを有するポリｄＣ ｓｓＤＮＡのＰｏｌθＷＴ（左）及びＰｏｌθＲＲ（右）伸長を示す変性ゲルを示す。 図２７Ｇは、アッセイ及び変性(denaturing)の概略図と、１５０倍過剰の標識されていないＤＮＡトラップの存在下又は非存在下のいずれかで全部で４つのｄＮＴＰ及び１０ｍＭ Ｍｇ２＋を用いた過剰放射標識プライマー−鋳型のＰｏｌθＷＴ及びＰｏｌθＲＲ伸長を示す変性ゲルとを示す。 図２８Ａ〜図２８Ｅを含む図２８は、Ｐｏｌθ及びＴｄＴターミナルトランスフェラーゼ活性の比較を示す。 図２８Ａは、示されたｄＮＴＰを用いたｓｓＤＮＡのＰｏｌθ−Ｍｎ２＋（レーン１〜５）及びＴｄＴ（レーン６〜１０）伸長を示す変性ゲルを示す。 図２８Ｂは、示されたリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）を用いたｓｓＤＮＡのＰｏｌθ−Ｍｎ２＋（レーン１〜６）及びＴｄＴ（レーン７〜１２）伸長を示す変性ゲルを示す。 図２８Ｃは、図２８Ｄに示す、示されたヌクレオチド類似体を用いたｓｓＤＮＡのＰｏｌθ−Ｍｎ２＋（レーン１〜１１）及びＴｄＴ（レーン１２〜２２）伸長を示す変性ゲルを示す。ボックスで囲まれたレーンは、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋によって排他的に転写されるヌクレオチド類似体を示す。 図２８Ｄは、ヌクレオチド類似体： １、ｃｙ３−ｄＵＴＰ； ２、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ； ３、ビオチン−１６ＡＡ−ｄＵＴＰ； ４、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−５−ｄＣＴＰ； ５、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−ＡＴＰ； ６、シアニン３−ＡＡ−ＵＴＰ； ７、４−チオ−ＵＴＰ； ８、ビオチン−１６ＡＡ−ＣＴＰ； ９、ガンシクロビル三リン酸； １０、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸。下線を付したヌクレオチド類似体（４，５，９）はＰｏｌθ−Ｍｎ２＋によって排他的に転写される。 図２８Ｅは、非標識ｓｓＤＮＡの存在下（レーン３）及び非存在下（レーン２）の全部で４つのｄＮＴＰを用いたＲＮＡのＰｏｌθ−Ｍｎ２＋伸長を示す変性ゲル（左パネル）と、示されたヌクレオチド類似体を用いたＲＮＡのＰｏｌθ−Ｍｎ２＋伸長を示す変性ゲル（右パネル）とを示す。 図２９は、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ Ｐｏｌθが末端トランスフェラーゼ活性を示すことを実証する実験結果を示す図である。示されているのは、全部で４つのｄＮＴＰ及び指示された二価カチオン及び緩衝液ｐＨの存在下で、示されたｓｓＤＮＡのヒトＰｏｌθ及びＣ． ｅｌｅｇａｎｓ Ｐｏｌθ伸長を示す非変性(non-denaturing)ゲルである。 図３０は、ヒトＰｏｌθが長いＲＮＡに対して効率的なターミナルトランスフェラーゼ活性を示すことを実証する実験結果を示す。示されているのは、５ｍＭのＭｎ２＋を含有する８．２ｐＨ緩衝液中の全部で４つのｄＮＴＰの存在下で示されたＲＮＡのヒトＰｏｌθ伸長を示す非変性ゲルである。 図３１は、ヒトＰｏｌθが５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−一リン酸(monophosphate)（５−ブロモ−ｄＵＭＰ）をｓｓＤＮＡに効率的に転写させることを実証する実験結果を示す。示されているのは、５ｍＭのＭｎ２＋を含有する８．２ｐＨ緩衝液中の全部で４つのｄＮＴＰ（レーン２）又は５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸（レーン３）の存在下で、示されたｓｓＤＮＡのヒトＰｏｌθ伸長を示す非変性ゲルである。５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸の構造（右）。
詳細な説明
本発明は、ＰｏｌθがＤＮＡ及びＲＮＡに対するロバストな鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するという発見に基づく。いくつかの場合には、Ｐｏｌθは、マンガンの存在下でのみ、ロバストな鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を有する。他の場合では、Ｐｏｌθは、コバルトの存在下でのみ、ロバストな鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を有する。これらの条件下で、Ｐｏｌθは、デオキシリボヌクレオチドを、一本鎖ＤＮＡ（single-strand DNA,ｓｓＤＮＡ）、部分ｓｓＤＮＡ（partial ssDNA,ｐｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（double-strand DNA,ｄｓＤＮＡ）及び一本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ）の３’末端に効率的に転写させる。Ｐｏｌθはまた、リボヌクレオチド、及びフルオロフォア(fluorophores)、ビオチン、及びジゴキシゲニンなどの様々な大きな官能基を含有する変性ヌクレオチド類似体を、ＤＮＡ及びＲＮＡに効率的に転写させる。予想外に、Ｐｏｌθは、市販のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と比較して、リボヌクレオチド及び変性ヌクレオチドをｓｓＤＮＡに転写させる上でより効果的である。
したがって、本発明は、核酸のターミナル３’末端を改変するための方法及び組成物を提供する。
一実施形態では、本発明の方法は、Ａ−ファミリーポリメラーゼを改変される核酸と３’末端、二価金属を含む反応溶液中の核酸を改変するための基質、で反応させること、反応をインキュベートすること、及び次いで３’末端修飾核酸を単離することを含む。
いくつかの場合において、改変される核酸オリゴは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、部分ｓｓＤＮＡ（ｐｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、又はテロメアｓｓＤＮＡである。
一実施形態では、ＡファミリーポリメラーゼはＰｏｌθである。いくつかの実施形態では、ＡファミリーポリメラーゼはＰｏｌθのフラグメントである。特定の実施形態では、Ｐｏｌθのフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １で表されるＰｏｌθ１７９２−２５９０である。特定の実施形態において、Ｐｏｌθは、ヒトＰＯＬＱ遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、ＰｏｌθはＣ． ｅｌｅｇａｎｓ ｐｏｌｑ−１遺伝子によってコードされる。
一実施形態では、基質はヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、デオキシリボヌクレオチドはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ又はｄＵＴＰである。いくつかの実施形態では、リボヌクレオチドは、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、又はＵＴＰである。他の実施形態では、ヌクレオチドは改変される。特定の非限定的な実施形態では、変性ヌクレオチドは、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、ビオチン−１６ＡＡ−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−５−ｄＣＴＰ、シアニン３−ＡＡ−ＵＴＰ、４−チオ−ＵＴＰ、ビオチン−１６−ＡＡＣＴＰ、ガンシクロビル三リン酸、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−アデノシン−５’−三リン酸、及び５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸であり得る。いくつかの実施形態において、基質は、ヌクレオチド及び変性ヌクレオチドの任意の組み合わせであり得る。
一実施形態では、二価金属はＭｎ２＋又はＣｏ２＋である。一実施形態では、反応溶液中の二価金属の濃度は約１〜５０ｍＭであり、約２〜５ｍＭが好ましく、約５ｍＭが最も好ましい。
一実施形態では、反応溶液は緩衝液をさらに含む。特定の実施形態では、緩衝液はＭＥＳ／ＴＲＩＳである。一実施形態では、反応溶液中の緩衝液の濃度は約２０〜１００ｍＭであり、約２０ｍＭが好ましい。さらに別の実施形態において、緩衝液のｐＨは約６．５〜８．８であり、約７〜８．２のｐＨが好ましく、約８．２のｐＨがより好ましい。
一実施形態では、反応溶液はグリセロールをさらに含む。一実施形態では、反応溶液中のグリセロールの濃度は約０〜２０％であり、約１０％が好ましい。
一実施形態では、反応溶液は、非イオン性界面活性剤をさらに含む。特定の実施形態では、非イオン性界面活性剤はＮＰ−４０である。いくつかの実施形態では、反応溶液中の非イオン性界面活性剤の濃度は約０−１％であり、約０．１％が好ましい。
一実施形態では、反応混合物を少なくとも２時間インキュベートする。一実施形態では、反応混合物を約２５℃〜４２℃の温度でインキュベートする。別の実施形態では、反応混合物を約４２℃の温度でインキュベートする。
本発明はまた、基質を用いて核酸の３’末端を改変するためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、Ａ−ファミリーポリメラーゼ及び反応溶液を含む。別の実施形態において、キットは、基質をさらに含む。
一実施形態では、ＡファミリーポリメラーゼはＰｏｌθである。
一実施形態では、反応溶液は、５ｍＭ Ｍｎ２＋、２０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ ８．２、１０％グリセロール、０．０１％ＮＰ−４０及び０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は等価な任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料が記載される。
本明細書中で使用される場合、以下の用語の各々は、このセクションにおいてそれに関連する意味を有する。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、その冠詞の文法的目的の１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「ある要素」は、１つの要素又は１より多い要素を意味する。
量、時間的持続時間などのような測定可能な値を指すときに本明細書で使用する「約」は、そのような変形が適切であるため、指定値から±４０％又は±２０％又は±１０％、±５％、±１％又は±０．１％の非限定的なバリエーションを包含することを意味する。
「増幅」とは、例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、及びリガーゼ連鎖反応などにより、ポリヌクレオチド配列がコピーされ、及び従ってより多数のポリヌクレオチド分子に拡大される任意の手段を指す。ポリヌクレオチドの増幅は、様々な化学的及び酵素的プロセスを包含する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）中の標的又は鋳型ＤＮＡ分子の１コピー又は数コピーからの複数のＤＮＡコピーの生成は、増幅の形態である。増幅は出発分子の厳密な複製に限定されない。例えば、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを用いたサンプル中の限られた量のＲＮＡからの複数のｃＤＮＡ分子の生成は、増幅の一形態である。さらに、転写プロセス中の単一のＤＮＡ分子からの複数のＲＮＡ分子の生成も、増幅の一形態である。
「相補的」は、２つの核酸鎖(stands)の領域間、又は同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性の広い概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、その残基がチミン又はウラシルである場合、第１の領域に対して逆平行(antiparallel)である第２の核酸領域の残基と特異的な水素結合（「塩基対形成」）を形成することができることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、その残基がグアニンであれば、第１の鎖とは逆平行である第２の核酸鎖の残基と塩基対合することができることが知られている。２つの領域が逆平行に配置されている場合、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が、第２の領域の残基と塩基対合することができるならば、核酸の第１の領域は、同一又は異なる核酸の第２の領域に相補的である。好ましくは、第１の領域は第１の部分を含み、且つ、第２の領域は第２の部分を含み、それによって、第１及び第２の部分が逆平行に配置されたとき、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、及び好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が、第２の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。より好ましくは、第１の部分のすべてのヌクレオチド残基は、第２の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。
「コードする」とは、定義されたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）か、又は定義されたアミノ酸配列のいずれかと、及びそれから生じる生物学的特性とを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的配列の固有の特性を指す。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、遺伝子はタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖、及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方は、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすると称することができる。他に特定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重した(degenerate)バージョンであり、且つ、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を包含する。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを包含し得る。
本明細書中で使用される、用語「フラグメント」は、核酸に適用される場合、より大きな核酸の部分配列(subsequence)をいう。核酸の「フラグメント」は、少なくとも約１５ヌクレオチド長；例えば、少なくとも約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド；少なくとも約１００〜約５００ヌクレオチド、少なくとも約５００〜約１０００ヌクレオチド、少なくとも約１０００ヌクレオチド〜約１５００ヌクレオチド、又は約１５００ヌクレオチド〜約２５００ヌクレオチド；又は約２５００ヌクレオチド（及びその間の任意の整数値）であり得る。
本明細書で使用される「相同の、相同性」又は「同一の、同一性」は、アミノ酸及び核酸配列間の比較をいう。核酸分子に言及する場合、「相同性」、「同一性」又は「パーセント同一」は、配列分析プログラムによって同一のヌクレオチドにマッチした対象の核酸配列のヌクレオチドのパーセントを指す。相同性は、公知の方法によって容易に計算することができる。核酸配列及びアミノ酸配列は、核酸又はアミノ酸の同様の配列を整列させ、及びしたがって相違を定義するコンピュータプログラムを使用して比較することができる。好ましい方法では、ＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ）及びその中で使用されるパラメーターが用いられ、ＥｘＰａＳｙは、ゲノムＤＮＡ配列の配列フラグメントを整列させるために使用される。しかし、同等のアラインメントアセスメントは、任意の標準アラインメントソフトウェアの使用によって得ることができる。
本明細書で使用される場合、「相同の」とは、２つのポリマー分子間、例えば２つの核酸分子間、例えば２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子間、又は２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性を指す。２つの分子の両方のサブユニット位置が同じサブユニットによって占有される場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおけるある位置がアデニンによって占められている場合、それらはその位置で相同である。２つの配列間の相同性は、一致する又は相同な位置の数の一次関数である。例えば、２つの化合物配列中の位置の半分（例えば、ポリマー１０サブユニット長さ中の５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば１０分の９）が一致する又は相同である場合、２つの配列は９０％の相同性を共有する。一例として、ＤＮＡ配列５’ΑＴＴＧＣＣ３’及び５’ＴＡＴＧＧＣ３’は、５０％の相同性を共有する。
「ハイブリダイゼーションプローブ」は、核酸の相補鎖に塩基特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドである。このようなプローブには、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４， １４９７−１５００に記載されているようなペプチド核酸、及び他の核酸類似体及び核酸模倣体が含まれる。米国特許第６，１５６，５０１号を参照されたい。
「ハイブリダイゼーション」という用語は、２つの一本鎖核酸が非共有結合して二本鎖核酸を形成するプロセスを指す。三本鎖ハイブリダイゼーションも理論的に可能である。核酸中の相補的配列は互いに対になって二重らせんを形成する。得られる二本鎖核酸は、「ハイブリッド」である。ハイブリダイゼーションは、例えば、２つの相補的又は部分的に相補的な配列の間であり得る。ハイブリッドは、二本鎖領域及び一本鎖領域を有し得る。ハイブリッドは、例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡであり得る。ハイブリッドは、改変された核酸の間に形成されてもよい。核酸の一方又は両方を固体支持体上に固定化することができる。特定の配列を検出及び単離し、相同性を測定し、又は一方又は両方の鎖の他の特性を定義することに、ハイブリダイゼーション技術を使用することができる。
ハイブリッドの安定性は、相補性の長さ、相補領域内のミスマッチの存在、温度及び反応における塩の濃度を含む様々な要因に依存する。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下で、例えば、１Ｍ以下の塩濃度及び少なくとも２５℃の温度で行われる。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）又は１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ Ｎａ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び２５〜５０℃の温度の条件は、対立遺伝子(allele)特異的プローブハイブリダイゼーションに適している。特に好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは４０〜５０℃で行われる。アセチル化ＢＳＡ及びニシン精子ＤＮＡをハイブリダイゼーション反応に添加することができる。マイクロアレイに適したハイブリダイゼーション条件は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）から入手可能なＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ及びＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｍａｐｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｍａｎｕａｌに記載されている。
第１のオリゴヌクレオチドは、「高ストリンジェンシー」を有する第２のオリゴヌクレオチドとアニールする。２つのオリゴヌクレオチドが条件下でアニールするならば、それによって、少なくとも約７５％、及び好ましくは少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％において存在するオリゴヌクレオチドのみが、相互に相補的にアニールする。２つのオリゴヌクレオチドをアニールするために使用される条件のストリンジェンシーは、その他の要因の中でも、温度、アニール媒体のイオン強度、インキュベーション時間、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含量、及び、既知の場合、２つのオリゴヌクレオチド間の非相同性の程度の関数である。アニーリング条件のストリンジェンシーを調整する方法は公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．を参照。）。
本明細書中で使用される、「教材(instructional material)」は、本明細書中に列挙される様々な疾患又は障害の緩和を達成するためのキットにおいて、本発明の、化合物、組成物、ベクター又は送達系の有用性を伝達するために使用され得る刊行物、レコーディング、ダイアグラム、又はいずれの他の表現媒体(medium of expression)を包含する。任意に、又は代替的に、教材は、哺乳動物の細胞又は組織における疾患又は障害を緩和する１以上の方法を記述することができる。本発明のキットの教材は、例えば、本発明の同定された化合物、組成物、ベクター、又は送達系を収容する容器に添付され得るか、又は同定された化合物、組成物、ベクター、又は送達システムを収容する容器と一緒に出荷することができる。あるいは、教材は、教材と化合物が受取人によって協調的に使用されることを意図して、容器とは別に出荷することができる。
本明細書中で使用される、「単離物(isolate)」とは、個体から、又は個体から得られたサンプルから得られた核酸を指す。核酸は、それが得られた後の任意の時点（例えば、実験室培養の前又は後、増幅の前又は後）で分析することができる。
本明細書で使用される「精製された」又は「精製する」という用語は、サンプルから成分（例えば、汚染物質）を除去することを指す。例えば、核酸は、混入する細胞タンパク質又は他の望ましくない核酸種の除去によって精製される。汚染物質の除去は、サンプル中の所望の核酸の百分率の増加をもたらす。
用語「標識」は、本明細書で使用される場合、「標識された」プローブを生成するためにプローブに直接的又は間接的に結合された(conjugated)検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体で検出可能であり得る（例えば、放射性同位元素標識もしくは蛍光標識）か、又は酵素標識の場合、検出可能である基質化合物もしくは組成物（例えば、アビジン−ビオチン）の化学的変化を触媒し得る。場合によっては、ＰＣＲ産物を検出するためにプライマーを標識することができる。
用語「ミスマッチ」、「ミスマッチ制御」又は「ミスマッチプローブ」は、その配列が特定の標的配列に完全に相補的でない核酸を指す。ミスマッチは、１つ以上の塩基を含み得る。ミスマッチ(複数可)は、ミスマッチプローブのどこにでも位置し得るが、ターミナルミスマッチは、標的配列のハイブリダイゼーションを妨げる可能性が低いため、ターミナルミスマッチはあまり望ましくない。特に好ましい実施形態では、ミスマッチは、試験ハイブリダイゼーション条件下で標的配列との２重鎖(duplex)を不安定化する可能性が最も高いように、プローブの中心又はその近くに位置する。
本明細書中で使用される、用語「核酸」は、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの天然に存在する分子の両方を指すが、様々な誘導体及び類似体も指す。一般に、本教示のプローブ、ヘアピンリンカー、及び標的ポリヌクレオチドは核酸であり、典型的にはＤＮＡを含む。当業者には理解されるように、追加の誘導体及び類似体を使用することができる。
本明細書中で使用される、用語「ヌクレオチド塩基」は、置換又は非置換芳香族環(複数可)を指す。特定の実施形態において、芳香族環(複数可)は、少なくとも１つの窒素原子を含む。特定の実施形態では、ヌクレオチド塩基は、適切に相補的なヌクレオチド塩基とのワトソン−クリック及び／又はフーグスティーン水素結合を形成することができる。典型的なヌクレオチド塩基及びその類似体は、天然に存在するヌクレオチド塩基アデニン、グアニン、シトシン、６メチル−シトシン、ウラシル、チミン、及び前記天然に存在するヌクレオチド塩基の類似体、例えば７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、Ｎ６−デルタ２−イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６−デルタ２−イソペンテニル−２−メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ２−ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７メチルグアニン（７ｍＧ）、イノシン、ネブラリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン、７−デアザグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ６−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｏ４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン（例えば、米国特許第６，１４３，８７７号及び第６，１２７，１２１号及びＰＣＴ公開出願ＷＯ０１／３８５８４）、エテノアデニン、インドール、例えばニトロインドール及び４−メチルインドール、及びピロール、例えばニトロピロール、を包含するが、それらに限定されない。特定の例示的なヌクレオチド塩基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ， １９８９， Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｐ． ３８５−３９４， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ．及びそこに引用されている参考文献に見出すことができる。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、リボース、アラビノース、キシロース、及びピラノースなどの糖のＣ−１’炭素に連結されたヌクレオチド塩基及びその糖類似体を含む化合物を指す。ヌクレオチドという用語は、ヌクレオチド類似体も包含する。糖は置換されていても無置換であってもよい。置換リボース糖としては、これらに限定されないが、炭素原子の１つ以上、例えば２’−炭素原子が、１つ以上の同一又は異なるＣｌ、Ｆ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲ２又はハロゲン基で置換されており、ここで、各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はＣ５−Ｃ１４アリールである。例示的リボースには、２’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース及び２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、及び２’−アルキルリボース、例えば２’−Ｏ−メチル，４’−アノマーヌクレオチド、１’−アノマーヌクレオチド、２’−４’−及び３’−４’−結合及び他の「ロックされた」又は「ＬＮＡ」、二環式糖修飾が含まれるが、但しこれらに限定されない（例えば、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９８／２２４８９、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６参照）。用語「核酸」は、典型的には、大きなポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される「ヌクレオチド類似体」という用語は、修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを意味し、
７−デアザプリン（すなわち、７−デアザ−ｄＡＴＰ及び７−デアザ−ｄＡＴＰ）のような変化したスタッキング相互作用を有する類似体；ｄＧＴＰ）；代替の水素結合構成を有する塩基類似体（例えば、Ｉｓｏ−Ｃ及びＩｓｏ−Ｇ及びＳ.Ｂｅｎｎｅｒの米国特許第６，００１，９８３号に記載され、本明細書中に参考として援用される他の非標準塩基対など）；非水素結合類似体（例えばＢ． Ａ． Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ａｎｄ Ｅ． Ｔ． Ｋｏｏｌ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９９４， ５９， ７２３８−７２４２； Ｂ． Ａ． Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ａｎｄ Ｅ． Ｔ． Ｋｏｏｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９５， １１７， １８６３−１８７２に記載された２，４−ジフルオロトルエンのような非極性芳香族ヌクレオシド類似体）；５−ニトロインドール及び３−ニトロピロールのような「ユニバーサル」塩基；及びユニバーサルプリン及びピリミジン（例えばそれぞれ、「Ｋ」及び「Ｐ」ヌクレオチド；Ｐ． Ｋｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９８９， １７， １０３７３−１０３８３， Ｐ． Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０， ５１４９−５１５２）；
が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチド類似体には、ジデオキシヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドなどのリン酸部分、塩基部分又は糖部分に１つ以上の修飾を有するヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド類似体は、リボヌクレオチドと同様にデオキシリボヌクレオチドの修飾形態を含む。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、短いポリヌクレオチドを指し、一般的には約５０ヌクレオチド以下である。
ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表される場合、これはまた、「Ｔ」が「Ｕ」によって置換されているＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）を包含することが理解されるであろう。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中で使用される、核酸及びポリヌクレオチドは交換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、これを加水分解してモノマー「ヌクレオチド」にすることができるという一般的な知識を有する。モノマーヌクレオチドを加水分解してヌクレオシドにすることができる。本明細書中で使用される、ポリヌクレオチドには、当技術分野で利用可能ないずれの手段によって（限定されるものではないが、組換え手段、すなわち、組換えライブラリー又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、通常のクローニング及び増幅技術の使用などが含まれる)、及び合成手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」は、典型的には長さが１００塩基未満の短いポリヌクレオチドを指す。
ポリヌクレオチド配列を記載するために、従来の表記を本明細書で使用する。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端である。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コード鎖」と呼ばれる。ＤＮＡ上の参照点の５’に位置するＤＮＡ鎖上の配列を「上流配列」と称し、ＤＮＡ上の参照点の３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列は、「下流配列」と呼ばれる。本明細書に記載の配列において：
Ａ ＝アデニン、
Ｇ ＝グアニン、
Ｔ ＝チミン、
Ｃ ＝シトシン、
Ｕ ＝ウラシル、
Ｈ ＝ Ａ、Ｃ又はＴ／Ｕ、
Ｒ ＝ Ａ又はＧ、
Ｍ ＝ Ａ又はＣ、
Ｋ ＝ Ｇ又はＴ／Ｕ、
Ｓ ＝ Ｇ又はＣ、
Ｙ ＝ Ｃ又はＴ／Ｕ、
Ｗ ＝ Ａ又はＴ／Ｕ、
Ｂ ＝ Ｇ又はＣ又はＴ／Ｕ、
Ｄ ＝ Ａ又はＧ、又はＴ／Ｕ、
Ｖ ＝ Ａ又はＧ又はＣ、
Ｎ ＝ Ａ又はＧ又はＣ又はＴ／Ｕ。
当業者であれば、順方向で本明細書に記載された全ての核酸配列は、それらの逆方向、ならびに順方向及び逆方向の相補的方向で本発明の組成物及び方法においても有用であること、且つ、本明細書に明示的に記載される場合と同様に、本明細書に記載されることを理解するであろう。
「プライマー」は、指定されたポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズすることができ、且つ、相補的なポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供することができるポリヌクレオチドを指す。そのような合成は、ポリヌクレオチドプライマーが、例えばヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチド鋳型、及びＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在下で、合成が誘導される条件下に置かれる場合に生じる。プライマーは、典型的には一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは典型的にはデオキシリボ核酸であるが、多種多様な合成プライマー及び天然に存在するプライマーが多くの用途に有用である。プライマーは、合成開始のための部位として機能するようにハイブリダイズするように設計された鋳型に相補的であるが、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。そのような場合、鋳型へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、検出可能な標識、例えば発色性、放射性、又は蛍光性部分で標識され得、且つ、検出可能な部分として使用され得る。蛍光性部分の例は、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、フィコクリセリン(phycocrytherin)、フィコシアニン、スペクトラムオレンジ、スペクトラムグリーン、及び／又は上記のいずれの１以上の誘導体を包含するが、これらに限定されない上記。他の検出可能な部分には、ジゴキシゲニン及びビオチンが含まれる。
本明細書中で使用される、「プローブ」は、化学結合の１つ以上のタイプを介して、通常は相補的塩基対形成を介して、通常は水素結合形成を介して、相補配列の標的核酸に結合することができる核酸として定義される。本明細書中で使用される、プローブは、天然塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ又はＴ）又は修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を包含し得る。さらに、ハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホスホジエステル結合以外の結合がプローブ中の塩基に結合していてもよい。したがって、プローブは、構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって連結されたペプチド核酸であってもよい。「一致」、「完全一致」、「完全一致プローブ」又は「完全一致対照」という用語は、特定の標的配列と完全に相補的な配列を有する核酸を指す。核酸は、典型的には、標的配列の部分（部分配列）と完全に相補的である。完全一致（perfect match,ＰＭ）プローブは、「試験プローブ」、「正規化対照」プローブ、発現レベル制御(control)プローブなどであり得る。しかしながら、完全一致対照又は完全一致は、「ミスマッチ」又は「ミスマッチプローブ」と区別される。
本明細書で使用される「標的」という用語は、所与のプローブに対して親和性を有する分子を指す。標的は、天然又は人工分子であってもよい。また、それらは、それらの未改変状態で、又は他の種との凝集体(aggregates)として利用することができる。標的は、直接又は特異的結合物質を介してのいずれかで、結合メンバーに共有結合又は非共有結合させることができる。本発明で用いることができる標的の例としては、オリゴヌクレオチド及び核酸が含まれるが、これに限定されない。
本明細書で用いられる用語「変異体(variant)」は、参照核酸配列又はペプチド配列とそれぞれ配列が異なるが、参照分子の本質的な性質を保持する核酸配列又はペプチド配列である。核酸変異体の配列の変化は、参照核酸によってコードされるペプチドのアミノ酸配列を改変し得ないか、又はアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び短縮(truncations)を生じ得る。核酸又はペプチドの変異体は、対立遺伝子(allelic)変異体などの天然に存在するものであってもよく、又は天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。天然に存在しない核酸及びペプチドの変異体は、突然変異誘発技術によって又は直接合成によって作製することができる。
範囲：
本開示を通じて、本発明の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲の形式の記載は、便宜上のものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲(subranges)並びにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３，１〜４，１〜５，２〜４，２〜６，３〜６のような部分範囲を、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば１，２，２．７，３，４，５，５．３及び６、を具体的に開示したものと考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
説明
本発明は、Ｐｏｌθを用いてＤＮＡ及びＲＮＡの３’末端を改変するための組成物及び方法を提供する。一実施形態では、本発明は、Ｐｏｌθによる基質を有する核酸の３’末端の修飾方法を提供する。
一実施形態では、Ｐｏｌθは、マンガンの存在下でのみ、ロバストな鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する。別の実施形態において、Ｐｏｌθは、コバルトの存在下でのみ、ロバストな鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する。一実施形態では、本発明のＰｏｌθは、市販のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と比較して、リボヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドをｓｓＤＮＡに転写するのにより有効である。一実施形態では、Ｐｏｌθは、特定の配列を含有する核酸を合成する。
遺伝子改変
一実施形態では、本発明は組換えＰｏｌθを提供する。いくつかの態様では、本発明は単離されたタンパク質（例えば、Ｐｏｌθ２）を包含する。その場合、前記タンパク質は核酸の３’末端を改変するために使用される。いくつかの実施形態では、単離されたタンパク質はＡファミリーポリメラーゼである。他の実施形態において、タンパク質はＰｏｌθである。さらに別の実施形態では、タンパク質はＰｏｌθのフラグメント又は活性突然変異体である。特定の実施形態では、タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １のアミノ酸配列を有するＰｏｌ１７９２−２５９０である。
一実施形態では、本発明は組換えＰｏｌθを包含した。したがって、本発明は、組換えＰｏｌθを製造するための組成物及び方法を包含し、発現ベクター、外因性ＤＮＡの細胞における外因性ＤＮＡの同時発現(concomitant expression)を伴う外因性ＤＮＡの細胞への導入方法、及びタンパク質修飾の方法、発現及び単離、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているもの、を包含するが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰｏｌθはヒトＰＯＬＱ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰｏｌθはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ｐｏｌｑ−１遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰｏｌθはマウスＰｏｌｑ遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、３’末端のＤＮＡ末端を改変することができるタンパク質のフラグメント又は突然変異体である。したがって、本発明の別の実施形態は、タンパク質フラグメント又は突然変異タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供することである。本発明によれば、タンパク質フラグメント又は突然変異タンパク質は、野生型タンパク質コード配列を突然変異させることによって得られる。突然変異誘発技術は、化学的、エラープローンＰＣＲ又は部位特異的アプローチによるものであり得る。適切な技術を選択して突然変異を導入するために使用することができ、突然変異した核酸分子をクローニング及び発現させることができ、タンパク質のトランスフェラーゼ活性を決定することができる。
タンパク質フラグメント又は突然変異タンパク質をコードする単離された核酸配列は、当技術分野で公知の多くの組換え方法のいずれかを用いて得ることができる。例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることによって、又は遺伝子を公知のベクターから誘導することによって、それを含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、又は標準的な技術を用いてそれを含有する細胞及び組織から直接単離することによって、である。あるいは、興味対象の遺伝子をクローニングするのではなく、合成的に作製することができる。
単離された核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含するが、それらに限定されない、いずれのタイプの核酸を含み得る。例えば、一実施形態では、組成物は、例えば、変異タンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子又はその機能的断片を包含する、単離されたＤＮＡ分子を含む。一実施形態では、組成物は、突然変異タンパク質又はその機能的断片をコードする単離されたＲＮＡ分子を含む。
所望のポリヌクレオチドは、いくつかのタイプのベクターにクローニングすることができる。しかしながら、本発明は、特定のベクターに限定されると解釈されるべきではない。むしろ、本発明は、容易に入手可能でありかつ／又は当技術分野で周知の広範なベクターを包含すると解釈されるべきである。例えば、本発明の所望のポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを包含するがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に関心のあるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが含まれる。
特定の実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクター及び哺乳類細胞ベクターからなる群から選択される。上記の組成物の少なくとも一部又は全部を含む多くの発現ベクター系が存在する。原核生物の及び／又は真核生物のベクターに基づく系は、ポリヌクレオチド又はそれらの同種のポリペプチドを産生するために本発明と共に使用するために用いることができる。このようなシステムの多くは、商業的に広く入手可能である。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２００１）及びｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７）、及び他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択マーカーを含有する。（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号を参照のこと）。
所望のポリヌクレオチドの発現のために、各プロモーターにおける少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を決定するように機能する。これの最もよく知られた例はＴＡＴＡボックスであるが、哺乳類のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター及びＳＶ４０遺伝子のプロモーターのようなＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーターでは、開始部位自体を覆う個別の要素は、開始場所を修正するのに役立つ。
追加のプロモーターエレメント、すなわちエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の上流の３０−１１０ｂｐの領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流に機能的エレメントを含むことも最近示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であり、その結果、要素が互いに逆転したり動いたりすると、プロモーター機能が維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前に５０ｂｐ離れて増加することができる。プロモーターに依存して、個々の要素が協同的に又は独立して機能して転写を活性化することができるようである。
プロモーターは、コーディングセグメント及び／又はエキソンの上流に位置する５個の非コード配列を単離することによって得られるように、遺伝子又はポリヌクレオチド配列と天然に関連するものであってもよい。そのようなプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置するポリヌクレオチド配列と天然に関連するものであり得る。あるいは、コードするポリヌクレオチドセグメントを、その天然環境においてポリヌクレオチド配列と通常は会合していないプロモーターを指す、組換え又は異種プロモーターの制御下に位置決めすることによって、ある種の利点が得られるであろう。組換え又は異種エンハンサーはまた、その自然環境においてポリヌクレオチド配列と通常は会合しないエンハンサーをも指す。そのようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び任意の他の原核細胞、ウイルス又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然に存在しない」、すなわち異なる転写調節領域の異なるエレメントを含むプロモーター又はエンハンサー、及び／又は発現を変える突然変異、を包含することができる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、本明細書に開示される組成物（米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号）に関連して、ＰＣＲ（商標）を包含する組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を用いて、配列を作製することができる。さらに、非核オルガネラ、例えば、ミトコンドリア、葉緑体などの中の配列の転写及び／又は発現を指示する制御配列も同様に使用することができると考えられる。
当然のことながら、発現のために選択された細胞型、オルガネラ、及び生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することが重要である。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー及び細胞型の組み合わせの使用法を知っている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２００１）を参照）。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質及び／又はペプチドの大規模生産において有利であるように、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示するための適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導可能及び／又は有用であり得る。プロモーターは、異種(heterologous)又は内在性であり得る。
そのようなプロモーター配列の１つは、最初期のサイトメガロウイルス（cytomegalovirus,ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列もまた使用され得る。シミアンウイルス４０（simian virus 40, ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（long terminal repeat, ＬＴＲ）プロモーター、Ｍｏｌｏｎｅｙウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バール（Epstein-Barr）ウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びヘモグロビンプロモーター及び筋クレアチンプロモーターのような（但しこれらに限定されない）ヒト遺伝子プロモーターを包含するが、これらに限定されない。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。本発明における誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が所望される場合に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができるか、又は発現が望ましくない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明は組織特異的プロモーターの使用を包含し、このプロモーターは所望の組織においてのみ活性である。組織特異的プロモーターは当該分野で周知であり、ＨＥＲ−２プロモーター及びＰＳＡ関連プロモーター配列を包含するが、これらに限定されない。
発現ベクターの文脈では、ベクターは宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫細胞に当該分野の任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的又は生物学的手段によって宿主細胞に転写することができる。本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入すると、レギュレーターに関してサイレンシングされた細胞が得られることは容易に理解される。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、及び特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類、例えばヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び第５，５８５，３６２号を参照。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質系システムなどのコロイド分散系が含まれる。in vitro及びin vivoでの送達媒体としての使用に好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。そのようなシステムの調製及び使用は、当技術分野において周知である。
外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞中の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイが実施され得る。このようなアッセイには、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲのような当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）によって、又は本発明の範囲内にある薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの存在又は非存在を検出するなどの「生化学的」アッセイが含まれる。
任意のＤＮＡベクター又は送達ビヒクルを用いて、所望のポリヌクレオチドをin vitro又はin vivoで細胞に転写することができる。非ウイルス送達系が利用される場合、好ましい送達ビヒクルはリポソームである。したがって、上記の送達系及びプロトコルは、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２ｅｄ．， ｐｐ １−３５ （２００２）及びＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｖｏｌ． ７， Ｍｕｒｒａｙ ｅｄ．， ｐｐ ８１−８９ （１９９１）に見ることができる。
「リポソーム」は、密閉された脂質二重層又は凝集体の生成によって形成される多様な単層及び多重層脂質媒体(vehicles)を包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体を有する小胞構造を有するものとして特徴付けられ得る。多重層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。リン脂質を過剰の水溶液中に懸濁させると、それらは自然に形成される。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再構成を受け、脂質二重層の間に水及び溶解した溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｈｈａｗａｔ，１９９１）。しかし、本発明は、正常な小胞構造とは異なる溶液構造を有する組成物も包含する。例えば、脂質は、ミセル構造をとることができ、又は単に脂質分子の不均一な凝集体として存在することができる。また、リポフェクタミン核酸複合体も考えられる。
形質転換は、宿主微生物のゲノムへの核酸（例えば、外因性核酸）の転写を指し、遺伝的に安定した遺伝をもたらす。形質転換された核酸を含む宿主微生物は、「天然に存在しない」又は「組換え」又は「形質転換」又は「トランスジェニック」微生物と呼ばれる。宿主微生物は、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）、真正細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）、又は真核生物（Ｅｕｋａｒｙａ）のドメイン由来の任意の原核生物又は真核生物の微生物種から選択することができ、且つ、非天然に存在する微生物は、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）、真正細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）、又は真核生物（Ｅｕｋａｒｙａ）のドメイン由来の任意の原核生物又は真核生物の微生物種において産生される。例示的な細菌には、大腸菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、 Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、 Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、 Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａが含まれる。例示的な酵母又は真菌種には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、 Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、 Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、 Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、 Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ、 Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、 Ｃａｎｄｉｄａ、 Ｙａｒｒｏｗｉａ、 Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、 Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、 Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが含まれる。本明細書に提供されるような非天然発生微生物を産生する適切な遺伝子改変（例えば、化学的又は環境的ストレスの存在下で安定なメタンモノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外因性核酸）を導入するため、任意の適切な宿主微生物を使用することができると理解される。
「野生型」又は「親」のタンパク質及び核酸としても知られている比較(reference)タンパク質又は核酸は、所望の安定性を有する変異酵素の遺伝子操作のための出発分子として使用される。
組換えタンパク質の発現は、元の宿主の外ではしばしば困難である。例えば、異なる種の細菌にわたってコドン使用偏り(bias)の変動が観察されている（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ３３：１１４１−１１５３）。それらの天然宿主内であっても組換えタンパク質の過剰発現も困難であり得る。本発明の特定の実施形態では、本明細書に開示された実施形態のいずれかに従って微生物に導入される核酸（例えば、化学的ストレス又は環境ストレスの存在下で安定なトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸）は、タンパク質発現を増強するためにコドン最適化を受ける。コドン最適化とは、ＤＮＡがコードするポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドン使用を反映するように生物の形質転換のための遺伝子のコドン又は核酸のコード領域の改変をいう。異種生物における最適な遺伝子発現のためのコドン最適化法は、当該分野で公知であり、且つ、以前に記載されている（例えば、Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００９， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４：ｅ７００２； Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：３４６−３５３； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３５：Ｄ７６−７９； Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ７：２８５；米国特許公開第２０１１／０１１１４１３号；及び米国特許公開第２００８／０２９２９１８号を参照）。
本発明のタンパク質は、化学的方法を用いて作製することができる。例えば、ペプチドは、固相技術により合成され（Ｒｏｂｅｒｇｅ Ｊ Ｙ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ２０２−２０４）、樹脂から切断され、そして分取(preparative)高速液体クロマトグラフィーによって精製され得る。自動合成は、例えば、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、製造者が提供する指示書に従って行うことができる。
あるいは、ペプチドは、組換え手段によって、又はより長いポリペプチドからの切断によって作製され得る。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ株又は他のＥ．ｃｏｌｉ株は、改変タンパク質を発現させるためベクターで形質転換することができ、且つ、フラスコ又は発酵槽で発現させることができる。細胞は、自己誘導培地（１×Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ、０．５％ｗ／ｖグリセロール、０．０５％ｗ／ｖデキストロース、０．２％ｗ／ｖα−ラクトース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）中で増殖させることができ、及び細胞は、接種後６０〜７０時間の間にいつでも収穫された。
発酵又は遠心分離によって得られた細胞ペレットは、適切な量の再懸濁緩衝液の添加後、超音波処理、高圧ホモジナイゼーション、ビーズミル、凍結融解に限定されないいずれの方法によって、又はいずれの化学物質の添加によって溶解され得る。
本発明によれば、発酵によって産生された酵素は、１つ又は複数の方法によって、トランスフェラーゼ活性に使用可能な酵素を得るために富化され得る。タンパク質精製の方法は当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。当該方法は、トリス緩衝液又はリン酸緩衝液の存在下、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）又は他の弱アニオン交換官能基を有するいずれのマトリックスへのタンパク質の結合を、及び０．４Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液で溶出することを含み得る。あるいは、当該方法は、トリス緩衝液もしくはリン酸緩衝液又は他の緩衝液の存在下で、タンパク質をＮｉ２＋又は他の二価金属カチオン親和性官能基でマトリックスに結合させること、及び０．５Ｍ又は他の濃度のイミダゾール溶液で溶出すること、を含むことができる。代替方法は、０．３％（ｖ／ｗ）のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を細胞溶解物に添加すること、及び形成されたペレット中に酵素をトラップすること、又はペレットから酵素を０．４Ｍ ＮａＣｌの添加により溶液に放出することを含むことができる。さらに別の交互法(alternate method)では、０．１％（ｖ／ｖ）ＰＥＩを添加し、適当な時間、好ましくは１時間撹拌し、遠心分離することができる。遠心分離機に６０％硫酸アンモニウム（ｗ／ｗ）を添加した後、一定時間攪拌し、遠心分離することができる。活性タンパク質で得られたペレットは、さらなる加工に使用することができる。上記プロセスのいずれかからこうして得られた活性タンパク質は、溶液として、又は凍結乾燥固体として、又は固定化固体として、又は顆粒として使用することができる。
タンパク質の組成は、アミノ酸分析又は配列決定によって確認することができる。
本発明によるタンパク質の変異体(variants)は、
（ｉ）アミノ酸残基の１つ以上が、保存された又は保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換されており、及びそのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされていても、いなくてもよいもの(one)、
（ｉｉ）１つ以上の修飾されたアミノ酸残基、例えば、置換基の結合によって修飾された残基、が存在するもの(one)、
（ｉｉｉ）ペプチドが本発明のペプチドの選択的(alternative)スプライス変異体であるもの(one)、
（ｉｖ）ペプチドのフラグメント及び／又は
（ｖ）ペプチドが別のペプチド、例えばリーダーもしくは分泌配列又は精製（例えば、Ｈｉｓタグ）もしくは検出（例えば、Ｓｖ５エピトープタグ）のために使用される配列など、と融合されているもの(one)、
であり得る。フラグメントは、元の配列のタンパク質分解的切断（マルチサイトタンパク分解を包含する）によって生成されたペプチドを包含する。変異体は、翻訳後又は化学的に改変されていてもよい。このような変異体は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあるとみなされる。
当技術分野で知られているように、２つのペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換物を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。変異体は、元の配列とは異なるペプチド配列、好ましくは興味対象のセグメント当たり４０％未満の残基が元の配列とは異なる、より好ましくは興味対象のセグメント当たり２５％未満の残基が元の配列とは異なる、より好ましくは興味対象のセグメント当たり１０％未満の残基が元の配列とは異なる、最も好ましくは興味対象のセグメント当たりわずか数残基だけが元の配列とは異なる、及び同時に、元の配列の機能性を維持するために元の配列と十分に相同であるペプチド配列を、及び/又は幹細胞の骨芽細胞系列への分化を刺激する能力を包含すると定義される。本発明は、元のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、又は９５％類似又は同一であるアミノ酸配列を包含する。２つのペプチド間の同一性の程度は、コンピュータアルゴリズム及び当業者に広く知られている方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定される［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０ （１９９０）］。
本発明のタンパク質は、翻訳後改変することができる。例えば、本発明の範囲内にある翻訳後修飾には、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、ポリＡＤＰリボシル化（parylation）、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化(sumolation)、リン酸化、タンパク質フォールディング及びタンパク質分解処理などが含まれる。いくつかの変更又は処理事象は、追加の生物学的機構の導入を必要とする。例えば、シグナルペプチド切断及びコアグリコシル化などの処理事象は、標準翻訳反応にイヌミクロソーム膜又はアフリカツメガエル卵抽出物（米国特許第６，１０３，４８９号）を添加することによって調べられる。
本発明のタンパク質は、翻訳後修飾によってか、又は翻訳中に非天然アミノ酸を導入することによって、形成された非天然アミノ酸を包含することができる。タンパク質翻訳中に非天然アミノ酸を導入するための様々なアプローチが利用可能である。
本発明のペプチド又はタンパク質は、融合タンパク質を調製するために、タンパク質などの他の分子とコンジュゲートして(conjugated)もよい。これは、例えば、得られる融合タンパク質がトランスフェラーゼの機能性を保持する限り、Ｎ末端又はＣ末端融合タンパク質の合成によって達成され得る。
本発明のペプチド又はタンパク質は、従来の方法、例えば、Ｒｅｅｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １１（４）：１３６５，１９９２）に記載の方法を用いてリン酸化することができる。
核酸及び基質
一態様では、本発明は、Ｐｏｌθによって３’末端に基質を付加するように改変することができる核酸を提供する。本発明の核酸並びに基質は、いずれの供給源に由来し得る。本発明の文脈における核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を包含するが、これらに限定されない。ＤＮＡ及びＲＮＡは生物中に天然に存在するが、生存生物(living organisms)の外部に存在していてもよいし、又は生物に加えられていてもよい。核酸は、いずれの起源、例えば、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、リボソーム、真核生物又は原核生物であり得る。それは、いずれの生物学的サンプル及びいずれの生物、組織、細胞又は細胞内区画からの核酸であってもよい。それは、いずれの生物由来の核酸であってもよい。核酸は、定量化の前に、例えば単離、精製又は改変によって、前処理することができる。また、人工又は合成の核酸を使用してもよい。核酸の長さは変化し得る。核酸は改変され得る。例えば、１つ以上の修飾された核酸塩基又は修飾された糖部分を含み得る（例えば、メトキシ基を含む）。核酸の骨格は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）におけるように(as in)、１つ以上のペプチド結合を含み得る。核酸は、非プリン又は非ピリミジン類似体又はヌクレオチド類似体などの塩基類似体を含むことができる。それはまた、タンパク質、ペプチド及び／又はアミノ酸などの付加的な付着物(attachments)を含み得る。
一実施形態では、核酸は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、部分ｓｓＤＮＡ（ｐｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、及びテロメアｓｓＤＮＡを含む。一実施形態では、基質は、ｓｓＤＮＡ、ｐｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、テロメアｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの３’末端に転写される。
一実施形態では、基質はｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、又はヌクレオチド類似体である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を標識化することができる。可能な標識の例は、放射性同位体、酵素、酵素補因子、酵素基質、酵素阻害剤、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、燐光分子、電気化学発光分子、発色団、磁性粒子、親和性標識、発色剤(chromogenic agent)、アジド基又はクリックケミストリーに使用される他の基、及び当該分野で公知の他の部分を包含するが、これらに限定されない。
一実施形態では、基質は、糖部分、三リン酸部分又は塩基部分内の１つ以上の位置で修飾されたデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである。一実施形態では、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド糖部分が改変される。一実施形態では、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド三リン酸部分が修飾される。一実施形態では、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基部分が修飾される。
特定の実施形態において、基質は、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、ビオチン−１６ＡＡ−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−５−ｄＣＴＰ、シアニン３−ＡＡ−ＵＴＰ、４−チオ−ＵＴＰ、ビオチン−１６−ＡＡＣＴＰ、ガンシクロビル三リン酸、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−アデノシン−５’−三リン酸、又は５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸である。いくつかの実施形態において、基質は、３’−Ｏ−ブロック又は３’−ブロックされていない可逆的ヌクレオチドターミネーターである。
メソッド
一態様では、本発明は、基質を用いて３’末端修飾核酸を生成する方法を提供する。当該方法は、
Ａファミリーメンバーポリメラーゼ及び基質を提供するステップと；
前記Ａファミリーメンバーポリメラーゼ、前記基質、又は異なる基質の混合物、前記核酸、及び反応溶液を含む混合物を形成するステップであって、前記反応混合物は、少なくとも１つの二価金属を含む、ステップと；
前記混合物をインキュベートするステップと；
前記３’末端修飾核酸を単離するステップと；
を含む。
一実施形態では、二価金属は、マンガン（Ｍｎ２＋）又はコバルト（Ｃｏ２＋）である。特定の実施形態では、二価金属はＭｎ２＋である。いくつかの実施形態では、反応溶液中の二価金属の濃度は、１〜５０ｍＭ、好ましくは２〜５ｍＭ、及び好ましくは５ｍＭである。特定の実施形態では、Ｍｎ２＋及びＭｇ２＋を包含するがこれに限定されない二価金属の混合物が使用される。
一実施形態では、反応溶液は緩衝液をさらに含む。特定の実施形態では、緩衝液はトリスＨＣｌである。いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨは６．５〜８．８、好ましくは７．０〜８．２、及び好ましくは８．２である。
一実施形態では、反応溶液はグリセロールをさらに含む。いくつかの実施形態では、反応溶液中のグリセロール濃度は２０％未満、好ましくは１０％である。
一実施形態では、反応溶液は、非イオン性界面活性剤をさらに含む。特定の実施形態では、非イオン性界面活性剤はＮＰ−４０である。いくつかの実施形態では、反応溶液中のＮＰ−４０の濃度は１％未満、好ましくは０．１％である。
一実施形態では、反応溶液は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、反応溶液中のＢＳＡの濃度は０．１ｍｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、混合物をインキュベートするステップは、混合物を制御された温度で制御された時間の長さインキュベートするステップを含む。特定の実施形態では、インキュベーション温度は２５℃〜４２℃である。いくつかの実施形態では、温度は２５℃、３７℃、又は好ましくは４２℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は少なくとも２時間である。特定の実施形態では、インキュベーション時間は２時間である。
いくつかの実施形態では、核酸に対するＡ−ファミリーポリメラーゼの比率が定義される。特定の実施形態において、Ｐｏｌθ：核酸のモル比は、少なくとも１：１、好ましくは５：１である。
核酸及び基質を含む改変ＤＮＡ生成物は、連結産物中に存在するプライマー結合部位（すなわち、供与体分子中に存在するプライマー結合部位又は得られるハイブリッド産物）に対応するプライマーを用いて単離又は増幅することができる。
本発明の特定の実施形態では、定量化ステップは、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、その後の検出測定を有する標識反応及び定量的リアルタイムＰＣＲ又は等温標的増幅からなる群から選択される方法を含む。
本発明の好ましい実施形態では、基質は１つ以上の蛍光色素及び／又はクエンチャーで標識され、且つ、定量化ステップはサンプル中の蛍光シグナルを検出することを含む。
特に、蛍光標識されたプライマー又はプローブは、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＩＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ及びＰＥＴ又は同様の励起及び発光特性を有する類似の色素からなる群から選択される色素で標識される。
一実施形態では、プライマー又はプローブはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブ（Ｒｏｃｈｅ）であるか、又は加水分解プローブはＴａｑＭａｎプローブ（Ｒｏｃｈｅ）である。他の実施形態では、プライマー又はプローブは、分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー、Ｓｕｎｒｉｓｅプライマー、ＬＵＸプライマー及びＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマーを包含するが、これらに限定されない。
様々なタイプのヌクレオチド類似体を核酸の３’末端に転写させるＰｏｌθの能力は、この酵素が特定の配列及び長さの核酸を合成するために利用できることを実証する。
したがって、別の態様において、本発明は、核酸の新規(de novo)合成方法を提供する。当該方法は、
Ａファミリーメンバーポリメラーゼ及び基質を提供するステップと；
前記Ａファミリーメンバーポリメラーゼ、少なくとも１つの核酸塩基、及び反応溶液を含む混合物を形成するステップであって、前記反応混合物は、少なくとも１つの二価金属を含む、ステップと；
前記混合物をインキュベートするステップと；
前記合成された核酸を単離するステップと；
を含む。
一実施形態では、Ｐｏｌθは、核酸の３’末端(terminus)をヌクレオチドに転写させることによって核酸を合成する。
一実施形態では、合成された核酸の長さは、個々のステップを介した核酸塩基の連続的な転写によって制御される。
一実施形態では、合成された核酸の配列は、特定の核酸塩基の連続的な転写によって制御され、その場合、順序づけられた個々の転写ステップ中の核酸塩基の特異性(specific)の付加によって合成された核酸配列が決定される(dictates)。
一実施形態では、ＡファミリーポリメラーゼはＰｏｌθである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸塩基は、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びそれらのいずれの組み合わせから選択される。
別の実施形態では、ヌクレオチドは３’−Ｏ−ブロック又は３’−ブロックされていない可逆的ターミネーターである。一実施形態では、可逆的ターミネーターは、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列に依存した様式で、複数の制御された連続した一塩基転写事象を可能にする。
いくつかの実施形態では、混合物をインキュベートするステップは、混合物を制御された温度で制御された時間の長さインキュベートするステップを含む。特定の実施形態では、インキュベーション温度は２５℃〜４２℃である。いくつかの実施形態では、温度は２５℃、３７℃、又は好ましくは４２℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は約３０分〜約２時間である。特定の実施形態では、インキュベーション時間は２時間である。
アプリケーション
本発明の改変されたＤＮＡ又はＲＮＡ組成物は、多種多様なプロトコル及び技術において使用され得る。例えば、特定の実施形態では、修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡは、分子生物学、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、エピジェネティックス、核酸合成、核酸配列決定などの分野で使用される。すなわち、修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡは、修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡのライゲーション(ligation)、結合(attachment)又は合成を必要とし得るか、又はその利益を得ることができる任意の技術において使用され得る。
この方法は、マイクロアレイ、ビーズ、及びフローサイトメトリーを包含するがこれに限定されない多くの技術プラットフォームで使用することができる。当該方法は、ゲノム研究、薬物標的検証、創薬、診断バイオマーカー同定及び治療評価などの多くの用途に有用である。
キット
本発明はまた、上記の方法のいずれかを実施するためのキットにも関する。その場合、当該キットは、
（ａ）Ａ−ファミリーポリメラーゼ、
（ｂ）反応溶液、及び場合により
（ｃ）核酸を改変するための基質、
のうちの１つ以上を含む。
一実施形態では、キットはＰｏｌθをさらに含む。別の実施形態では、キットはさらにポリメラーゼを含む。キットはさらに、ヌクレオチド混合物及び（１つの）反応緩衝液（複数可）を含むことができる。特定の実施形態では、キットは、５ｍＭ Ｍｎ２＋、２０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．２、１０％グリセロール、０．０１％ＮＰ−４０及び０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む反応緩衝液を包含する。
特定の実施形態では、キットは、１つ以上の予め定量されたキャリブレーター(calibrator)核酸、及び前記キャリブレーター核酸の改変のための基質をさらに含む。
いくつかの実施形態では、前記成分の１つ以上を同一反応容器内で予混合する。
実験例
本発明は、以下の実験例を参照してさらに詳細に記載される。これらの実施例は、説明のためにのみ提供されており、且つ、そのように特定されない限り、限定することを意図するものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるものと決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意の及び全ての変形を包含すると解釈されるべきである。
さらなる説明がない限り、当業者は、上記の説明及び以下の実施例を用いて、本発明の化合物を作製及び利用し、且つ、特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘しており、決して本開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１： ＤＮＡポリメラーゼθは、マンガンの存在下でロバストな鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を示す
本明細書中に提示されたデータは、Ｐｏｌθがin vitroで鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性を明らかに示すことを決定する。様々な条件を試みた後、Ｐｏｌθは、二価のカチオンマンガン（Ｍｎ２＋）、又はコバルト（Ｃｏ２＋）の存在に依存する様式で、ロバストな鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を行うことが見出された。Ｍｎ２＋の存在下では、この活性は非常に効率的であり、ｓｓＤＮＡ、ｐｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ及びＲＮＡ末端の３’末端に数百ヌクレオチドの付加をもたらす。さらに、Ｐｏｌθは、商業的に入手可能な末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）よりも、リボヌクレオチド及び嵩高い官能基を含有する改変ヌクレオチド類似体をｓｓＤＮＡに転写させるのにより有効であることが判明した。Ｐｏｌθ依存性非鋳型ヌクレオチド挿入がin vivoでａｌｔ−ＮＨＥＪの間に規則的に生じることを考慮すると（Ｙｏｕｓｅｆｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ １０：ｅ１００４６５４； Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔｕｒｅ ５１８：２５４−７； Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ６：ｅ１００１００５； Ｋｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５：３２１６）、本明細書で発見された鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性は、細胞内のａｌｔ−ＮＨＥＪに関連する挿入突然変異を促進する可能性が高い。
これらの実験に用いた材料及び方法をここで説明する。
タンパク質の精製
Ｐｏｌθ（アミノ酸残基１７９２〜２５９０）を、記載されているように精製した（Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２：２３０−７）。
Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性
以下の手順は、Ｐｏｌθ末端トランスフェラーゼ活性の最適条件を記載する。５００ｎＭ又は２４０ｎＭのＰｏｌθを、指示された放射標識ＤＮＡの５０ｎＭと共に、以下の緩衝液（２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８．２、１０％グリセロール、５ｍＭ ＭｎＣｌ、０．０１％ＮＰ−４０、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）１０μｌ体積中の０．５ｍＭ ｄＮＴＰの存在下で、４２℃で１２０分間インキュベートした。２０ｍＭ ＥＤＴＡ及び４５％ホルムアミドの添加により反応を停止させ、尿素ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動によりＤＮＡを分離し(resolved)、次いでオートラジオグラフィーにより可視化した。Ｐｏｌμターミナルトランスフェラーゼ反応は、Ｐｏｌθと同じ条件を用いて行った。
ＴｄＴターミナルトランスフェラーゼ活性
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓによって推奨される条件を用いてＴｄＴターミナルトランスフェラーゼ反応を実施したが、但し、その活性を同一濃度のＰｏｌθ（２４０ｎＭ）と比較するため、０．６単位／μｌのＴｄＴを用いた。０．６単位／μｌは、サプライヤーが推奨する量よりも３倍多い。ＴｄＴに使用されるサプライヤーの推奨緩衝液及び温度条件は以下の通りであった：３７℃で０．２５ｍＭコバルトを用いた、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸(acetate)、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、ｐＨ７．９。インキュベーション時間はＰｏｌθと同じであった。
次に、実験の結果について説明する。
Ｐｏｌθは、Ｍｎ２＋及びＣｏ２＋の存在下で鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を有する。
Ｐｏｌθが鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を明らかに示すかどうかを決定するために、デオキシシチジン一リン酸（ポリ−ｄＣ）のみからなるホモポリマーｓｓＤＮＡ基質を伸長する、Ｐｏｌθの能力を試験した。以前の研究では、Ｐｏｌθは、テンプレート依存性ＤＮＡ合成を排他的に行う能力を示す相補的デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下でホモポリヌクレオチド基質を伸長することしかできないことが分かった（Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２：２３０−７； Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４０：２６１１−２２）。Ｍｇ２＋以外の二価カチオンが細胞内に存在することを考慮すると、in vitroではなく(but not in vitro)in vivoでＤＮＡ合成を行うＰｏｌθの能力間の相違を説明することができる。したがって、試験した種々の二価陽イオンを、Ｍｇ２＋の存在下及び非存在下で、Ｐｏｌθ及び５’放射標識ポリｄＣ ｓｓＤＮＡ基質２９ヌクレオチド（nucleotides, ｎｔ）長さを包含する反応において試験した（図１Ａ）。結果は、Ｍｎ２＋及びＣｏ２＋が、鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性（すなわち非鋳型ＤＮＡ合成）を示すデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）によるポリｄＣのＰｏｌθ伸長を活性化することを示す。Ｍｎ２＋とＣｏ２＋はＭｇ２＋の非存在下でより大きな刺激効果を有したので、それらは活性部位のＭｇ２＋と同じ位置に結合する可能性が高い（図１Ａ）。
Ｍｎ２＋の存在下でのＰｏｌθ鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性は、Ｃｏ２＋よりも大きな刺激効果を示したので、さらに検討された。図１Ｂは、２〜５ｍＭのＭｎ２＋が、ｄＴＴＰの存在下でポリｄＣ基質の最も効率的な伸長をもたらすことを示す。次いで、異なるｐＨレベル及び緩衝塩濃度がＰｏｌθ鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性に及ぼす影響を調べた。結果は、ｐＨ〜８．２がこの活性に最も適していること、及び比較的高濃度の緩衝塩が阻害性であることを示している（図１Ｃ）。次に、塩、グリセロール及び非イオン性界面活性剤（ＮＰ−４０）が、観察されたＰｏｌθ鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性にどのように影響するかを調べた。大部分の塩は、５０ｍＭの濃度でわずかな阻害効果しか有しなかった（図１Ｄ）。しかし、硫化ナトリウム、リン酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムは、より低い濃度でＰｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性を有意に阻害した（図１Ｄ）。比較的高濃度のグリセロールがこの活性を阻害するのに対し、少量の非イオン性界面活性剤はこのアッセイでＰｏｌθをわずかに刺激したことが判明した（図１Ｅ）。まとめると、これらのデータは、ＰｏｌθがＭｎ２＋の存在下では、及びＣｏ２＋についてはより少ない程度で、鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を有することを実証し、且つ、ポリメラーゼがこの新規な機能を果たす最適条件を同定し始める。
Ｐｏｌθテンプレート非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性の最適化
次に、ｓｓＤＮＡに対するＰｏｌθの濃度が鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性に影響を与えるかどうかを決定した。結果は、最大ターミナルトランスフェラーゼ活性のためには、ｓｓＤＮＡよりも約５倍モル過剰のポリメラーゼが必要であることを示している（図２Ａ）。さらに、最大トランスフェラーゼ活性は４２℃の最適温度で少なくとも２時間のインキュベーションを必要とすることが判明した（図２Ｂ）。これらのデータは、ｄＴＴＰの存在下、ポリｄＣ鋳型上で得られたので、これらのデータは、Ｐｏｌθを堅牢な鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を有するものとして明確に実証し、且つ、このプロセスの最適条件を特定する可能性が高い。
ＰｏｌθはｓｓＤＮＡ及びｐｓｓＤＮＡに対して優先的ターミナルトランスフェラーゼ活性を示す
次に、種々の他の基質上のＭｎ２＋の存在下でＰｏｌθ末端トランスフェラーゼ活性を調べた。例えば、この活性を、デオキシチミジン−一リン酸（ポリ−ｄＴ）又はデオキシシチジン−一リン酸（ポリ−ｄＣ）のいずれかからなるホモポリマーｓｓＤＮＡ、及び可変配列を含有するｓｓＤＮＡについて、さらに試験した。興味深いことに、ポリメラーゼは、配列構成(sequence context)にかかわらず、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）の存在下で、これらの基質を１００ｎｔよりも多く優先的に伸長した（図３Ａ及び３Ｂ）。ポリメラーゼは、Ａ−規則とみなされる、非塩基(abasic)部位の反対側のデオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）を優先的に取り込むことを考慮すると、これらのデータはＰｏｌθ鋳型非依存性活性と一致する。Ｐｏｌθはまた、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰの存在下でｓｓＤＮＡを伸長するが、伸長産物の長さはｄＡＴＰによるものよりも短い（図３Ａ及び３Ｂ）。非ホモポリマーｓｓＤＮＡの場合、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、又はｄＧＴＰの存在下でＰｏｌθは約３０〜７０ｎｔを転写し、且つ、ｄＡＴＰが存在する場合には少なくとも１００ｎｔを転写する（図３Ｂ）。興味深いことに、Ｐｏｌθは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対するターミナルトランスフェラーゼ活性において非効率的であるようである（図３Ｄ）。ここでは、ｓｓＤＮＡで観察された結果とは対照的に、わずかな割合のｄｓＤＮＡ基質のみが伸長される。しかしながら、更なる実験は、Ｐｏｌθが「ランニングスタート(running start)」反応が行われる場合にｄｓＤＮＡを効率的に伸長することを示す（図３Ｅ）。例えば、従来のプライマー−鋳型基質では、Ｐｏｌθは鋳型鎖の５’末端を通り越して(past)数百ヌクレオチドのプライマーを伸長させる（図３Ｅ）。
ＰｏｌＥがＭＭＥＪ／ａｌｔ−ＮＨＥＪ３の間にＭｒｅ１１によって部分的に切除されたＤＳＢに作用すると考えられるので、そのターミナルトランスフェラーゼ活性を３’オーバーハングを含有する部分的なｓｓＤＮＡ（ｐｓｓＤＮＡ）鋳型で調べた。注目すべきことに、ポリメラーゼはｐｓｓＤＮＡに対して最も効率的なターミナルトランスフェラーゼ活性を示した（図３Ｆ）。例えば、ポリメラーゼは、ほとんどのｄＮＴＰを用いてこれらの基質をより長い長さまで伸長させた（図３Ｆと図３Ｂを比較する）。しかし、ｄＧＴＰＰｏｌθの存在下では、トランスフェラーゼ活性はあまり効率的ではないようである（図３Ｆ）。テロメア保護タンパク質及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）因子が欠損した細胞におけるテロメアのａｌｔ−ＮＨＥＪを促進する役割と一致して（Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔｕｒｅ ５１８：２５４−７）、Ｐｏｌθはまた、安定なＧ四重鎖（Ｇ４）二次構造を含有することが知られているテロメア後にモデル化されたｓｓＤＮＡに対する効率的なターミナルトランスフェラーゼ活性を示す（図３Ｇ）。ここで再び、ｄＧＴＰの存在下での伸長は、最も効率的ではなかった。テロメア反復配列中に複数のグアノシンが存在することを考えると、それらは、ポリメラーゼによるデオキシリボヌクレオシド一リン酸（ｄＧＭＰ）の転写を抑制する可能性が高い。対照的に、他の全てのヌクレオチドは、テロメアｓｓＤＮＡ基質に効率的に転写される（図３Ｇ）。まとめると、図３の結果は、ＭＭＥＪ／ａｌｔ−ＮＨＥＪにおけるその役割と一致する、ＰｏｌθがｐｓｓＤＮＡに対して最も効果的なターミナルトランスフェラーゼ活性を示すこと、及びポリメラーゼが種々のｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ基質を伸長するのにも有効であることを示す。
ｓｓＤＮＡ上のＰｏｌθ、Ｐｏｌμ、及びＴｄＴ活性
以前の研究は、ＮＨＥＪを促進するＸファミリーＰｏｌμがＭｎ２＋の存在下で鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を示すことを示唆している（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０００， ＥＭＢＯ Ｊ １９：１７３１−４２）。しかしながら、より最近の報告は、Ｐｏｌμが鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を欠いていると述べている（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ａｐｒ． ２００３， ｐ． ２３０９−２３１５）。同じ条件下でＰｏｌθとＰｏｌμによる鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を直接比較した。結果は、ＰｏｌμがポリｄＣ基質上に観察可能な鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性を欠いていることを示している（図４Ａ、左）。Ｐｏｌμターミナルトランスフェラーゼ活性は、同一条件で数百ヌクレオチドを加えるＰｏｌθと比較して、ホモポリマーでないｓｓＤＮＡにおいても非常に貧弱である（図４Ａ、右）。したがって、これらのデータは、ＰｏｌθがＰｏｌμよりも効率的なターミナルトランスフェラーゼ活性を示し、且つ、細胞内のＮＨＥＪ接合部と比較してａｌｔ−ＮＨＥＪ接合部でより長い挿入が観察される理由の説明を提供することを実証する。
重要なことに、ターミナルトランスフェラーゼ活性は、バイオテクノロジー、バイオメディカルリサーチ、及び合成生物学を包含する様々なタイプの用途のためにｓｓＤＮＡ末端を改変するために広く使用されている。現在、これらの用途のために開発され販売されている唯一の酵素は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）であり、その細胞機能は、抗体遺伝子成熟の間にＶ、Ｄ、及びＪエキソン領域にテンプレート化されていないヌクレオチドを付加することである（Ｍｏｅｔａ ａｎｄ Ｂｅｒｄｉｓ，２０１０，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８０４：１１５１−６６）。図４Ｂは、Ｐｏｌθ及びＴｄＴの活性を比較する。注目すべきことに、Ｐｏｌθは、供給業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；図４Ｂ）によって推奨される条件下でアッセイされたＴｄＴと同様のｓｓＤＮＡを伸長する同様の能力を示す。この結果はまた、Ｐｏｌθ及びＴｄＴが、この反応のために、それぞれｄＡＴＰ及びｄＴＴＰを優先的に利用することを示す（図４Ｂ）。多くのバイオテクノロジー及び生物医学研究のアプリケーションでは、固体表面又は他の種類の分子へのＤＮＡ付着を可能にするような、フルオロフォア又は他の化学基で修飾されたｓｓＤＮＡ基質が必要である（図５参照）。したがって、異なる官能基と結合したデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’末端に転写させるＰｏｌθの能力を調べた（図５参照）。ＴｄＴのための供給業者によって推奨される緩衝液及び温度条件、及び現在記載されているポリメラーゼの最適条件下での同一濃度のＰｏｌθを使用すると、ＰｏｌθがＴｄＴと比較してリボヌクレオチドをｓｓＤＮＡに転写するのに有意により有効であることが分かった（図４Ｃ）。したがって、以前の研究は、Ｐｏｌθがリボヌクレオチドを強く差別することを示したが（Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４０：２６１１−２２）、この忠実度メカニズムは、現在記載されているターミナルトランスフェラーゼ反応の間に損なわれるようである。再び同じ条件を使用して、Ｐｏｌθが、ＴｄＴよりも最も（１０個のうち８個が）修飾されたデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドをｓｓＤＮＡへより効果的に転写させることが予想外に見出された（図４Ｄ）。例えば、多くの場合、Ｐｏｌθは、より長い伸長産物をもたらすＴｄＴと比較して、より修飾されたヌクレオチドをｓｓＤＮＡに転写する（図４Ｄ、図５）。他の場合では、ＴｄＴは、ＰｏｌθがｓｓＤＮＡに効率的に付加する特定の修飾ヌクレオチドを完全に転写することができない（図４Ｄ）。例えば、ＰｏｌθはＴｅｘａｓ Ｒｅｄ ｄＣＴＰ、Ｎ６−ｄＡＴＰ、及びガンシクロビルを効率的に転写するのに対し、ＴｄＴの同一濃度はこれらの修飾ヌクレオチドを組み込むことができない（図４Ｄ、図５）。一般に、これらの修飾されたデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの多くは、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｃｙ３及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄを包含する官能基に結合した長いリンカーを包含する（図５）。したがって、これらの結果は、Ｐｏｌθが、それらの塩基部分（すなわち、ウラシル、シトシン）及び糖修飾（すなわち、ガンシクロビル一リン酸）に大きな修飾を含有するリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドを効率的に転写させることができることを示す。まとめると、これらのデータは、市販のＴｄＴと比較して、Ｐｏｌθが、標準的な(canonical)リボヌクレオチド及び修飾されたリボヌクレオチド及び嵩高い基を含有するデオキシリボヌクレオチド類似体の転写においてより効果的であることを示す。Ｐｏｌθが損傷乗り越え(translesion)合成活性を示すことを考慮すると、これらの結果は、その活性部位に嵩高いヌクレオチドを収容するその天然の能力に起因し得る。
バイオテクノロジー及び生物医学研究における多くのタイプの用途にＲＮＡがますます使用されているので、ＰｏｌθがＲＮＡの３’末端を改変する能力をさらに調べた。ＰｏｌθはデオキシリボヌクレオチドをＲＮＡの３’末端に転写することができることが観察された。さらに、Ｐｏｌθは修飾されたヌクレオチドをＲＮＡに転写することができる（図６Ｂ；図５）。したがって、これらの結果は、Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性がＤＮＡに限定されないことを実証する。
核酸基質を改変するためのＰｏｌθ
Ｐｏｌθは、それ以外に保存されたポリメラーゼドメイン中に３つの挿入モチーフが存在するために、エラーが起こりやすく乱雑である、異常なＡファミリーポリメラーゼである（Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２：２３０−７； Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０５：６４２−５２； Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４０：２６１１−２２； Ａｒａｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ３６：３８４７−５６； Ｚａｈｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２：３０４−１１）。最近の研究は、この酵素が、化学療法に使用されるものを包含する、ＤＮＡ損傷剤に対する染色体再編成及び耐性を促進する、哺乳類細胞におけるＭＭＥＪ／ａｌｔ−ＮＨＥＪに必須であることを発見した（Ｙｏｕｓｅｆｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ １０：ｅ１００４６５４； Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔｕｒｅ ５１８：２５４−７）。重要なことに、これらの以前の細胞研究は、Ｐｏｌθに依存した、ａｌｔ−ＮＨＥＪによって生成されたＤＮＡ修復接合部において非鋳型（ランダム）ヌクレオチド挿入の存在を示した（Ｙｏｕｓｅｆｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ １０：ｅ１００４６５４）。したがって、これらの報告は、Ｐｏｌθが、おそらく鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を介して、ａｌｔ−ＮＨＥＪの間にランダムなヌクレオチド挿入を生成することを示している。しかし、今まで、Ｐｏｌθテンプレート非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性はin vitroで証明されていない。
本明細書中に提示されたデータは、Ｐｏｌθが、金属Ｍｎ２＋によって活性化される頑強な鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を示すことを実証する。Ｐｏｌθの活性部位内の二価カチオンの異なる結合がその局所立体配座をわずかに変化させることを考慮すると（Ｚａｈｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２：３０４−１１）、Ｍｎ２＋結合は、非鋳型ＤＮＡ合成に一層有利な活性部位立体配座を容易にする可能性がある。Ｐｏｌθ非鋳型ヌクレオチド挿入は細胞内のａｌｔ−ＮＨＥＪと関連するので、これらの知見は、Ｍｎ２＋がin
vivoでＰｏｌθの補因子であることを示している。例えば、Ｍｎ２＋は、細胞中のＭｇ２＋よりも有意に低い濃度で存在するが（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４１：２４２８−３６）、本明細書中に提示されるデータは、Ｍｇ２＋が豊富である場合に、Ｐｏｌθ鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性を刺激するために少量のＭｎ２＋しか必要でないことを示す（図１Ａ）。したがって、比較的低い細胞濃度のＭｎ（＜１ｍＭ）は、Ｐｏｌθ鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性を活性化する可能性が高い。最後に、Ｐｏｌθが、供給業者の推奨する最適条件のもとでアッセイされた市販のＴｄＴの同一濃度よりも、ｓｓＤＮＡの３’末端に、リボヌクレオチド及び大きな官能基を含有する多くの修飾されたヌクレオチド類似体を転写するのに、より効果的であることを考慮すると、Ｐｏｌθは、バイオテクノロジー、生物医学研究及び合成生物学の応用のためのＲＮＡ基質と同様にＤＮＡの改変に有用であると予想される。さらに、Ｐｏｌθは、ＴｄＴのような毒性反応成分、例えばＣｏ２＋塩又はカコジル酸(cadodylic acid)の塩を必要としないので、Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼアッセイは、研究及びバイオテクノロジー用途にとってより安全な選択肢である。
実施例２：ペプチド及び核酸配列
ペプチド配列及び計算されたペプチドの核酸配列がここに提示される。アミノ酸配列は、ＥＭＢＯＳＳ Ｂａｃｋｔｒａｎａｍｂｉｇ（タンパク質配列を読み込み、且つ、それが来た可能性がある核酸配列を書き込むプログラム）を用いて計算された。これは、各アミノ酸のすべての可能なコドンを表すヌクレオチド曖昧性（ambiguity）コードを使用することによってこれを行う（表１）。
Ｐｏｌθ １７９２−２５９０
アミノ酸配列：
ＧＦＫＤＮＳＰＩＳＤＴＳＦＳＬＱＬＳＱＤＧＬＱＬＴＰＡＳＳＳＳＥＳＬＳＩＩＤＶＡＳＤＱＮＬＦＱＴＦＩＫＥＷＲＣＫＫＲＦＳＩＳＬＡＣＥＫＩＲＳＬＴＳＳＫＴＡＴＩＧＳＲＦＫＱＡＳＳＰＱＥＩＰＩＲＤＤＧＦＰＩＫＧＣＤＤＴＬＶＶＧＬＡＶＣＷＧＧＲＤＡＹＹＦＳＬＱＫＥＱＫＨＳＥＩＳＡＳＬＶＰＰＳＬＤＰＳＬＴＬＫＤＲＭＷＹＬＱＳＣＬＲＫＥＳＤＫＥＣＳＶＶＩＹＤＦＩＱＳＹＫＩＬＬＬＳＣＧＩＳＬＥＱＳＹＥＤＰＫＶＡＣＷＬＬＤＰＤＳＱＥＰＴＬＨＳＩＶＴＳＦＬＰＨＥＬＰＬＬＥＧＭＥＴＳＱＧＩＱＳＬＧＬＮＡＧＳＥＨＳＧＲＹＲＡＳＶＥＳＩＬＩＦＮＳＭＮＱＬＮＳＬＬＱＫＥＮＬＱＤＶＦＲＫＶＥＭＰＳＱＹＣＬＡＬＬＥＬＮＧＩＧＦＳＴＡＥＣＥＳＱＫＨＩＭＱＡＫＬＤＡＩＥＴＱＡＹＱＬＡＧＨＳＦＳＦＴＳＳＤＤＩＡＥＶＬＦＬＥＬＫＬＰＰＮＲＥＭＫＮＱＧＳＫＫＴＬＧＳＴＲＲＧＩＤＮＧＲＫＬＲＬＧＲＱＦＳＴＳＫＤＶＬＮＫＬＫＡＬＨＰＬＰＧＬＩＬＥＷＲＲＩＴＮＡＩＴＫＶＶＦＰＬＱＲＥＫＣＬＮＰＦＬＧＭＥＲＩＹＰＶＳＱＳＨＴＡＴＧＲＩＴＦＴＥＰＮＩＱＮＶＰＲＤＦＥＩＫＭＰＴＬＶＧＥＳＰＰＳＱＡＶＧＫＧＬＬＰＭＧＲＧＫＹＫＫＧＦＳＶＮＰＲＣＱＡＱＭＥＥＲＡＡＤＲＧＭＰＦＳＩＳＭＲＨＡＦＶＰＦＰＧＧＳＩＬＡＡＤＹＳＱＬＥＬＲＩＬＡＨＬＳＨＤＲＲＬＩＱＶＬＮＴＧＡＤＶＦＲＳＩＡＡＥＷＫＭＩＥＰＥＳＶＧＤＤＬＲＱＱＡＫＱＩＣＹＧＩＩＹＧＭＧＡＫＳＬＧＥＱＭＧＩＫＥＮＤＡＡＣＹＩＤＳＦＫＳＲＹＴＧＩＮＱＦＭＴＥＴＶＫＮＣＫＲＤＧＦＶＱＴＩＬＧＲＲＲＹＬＰＧＩＫＤＮＮＰＹＲＫＡＨＡＥＲＱＡＩＮＴＩＶＱＧＳＡＡＤＩＶＫＩＡＴＶＮＩＱＫＱＬＥＴＦＨＳＴＦＫＳＨＧＨＲＥＧＭＬＱＳＤＱＴＧＬＳＲＫＲＫＬＱＧＭＦＣＰＩＲＧＧＦＦＩＬＱＬＨＤＥＬＬＹＥＶＡＥＥＤＶＶＱＶＡＱＩＶＫＮＥＭＥＳＡＶＫＬＳＶＫＬＫＶＫＶＫＩＧＡＳＷＧＥＬＫＤＦＤＶ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）．
核酸配列：
ＧＧＮＴＴＹＡＡＲＧＡＹＡＡＹＷＳＮＣＣＮＡＴＨＷＳＮＧＡＹＡＣＮＷＳＮＴＴＹＷＳＮＹＴＮＣＡＲＹＴＮＷＳＮＣＡＲＧＡＹＧＧＮＹＴＮＣＡＲＹＴＮＡＣＮＣＣＮＧＣＮＷＳＮＷＳＮＷＳＮＷＳＮＧＡＲＷＳＮＹＴＮＷＳＮＡＴＨＡＴＨＧＡＹＧＴＮＧＣＮＷＳＮＧＡＹＣＡＲＡＡＹＹＴＮＴＴＹＣＡＲＡＣＮＴＴＹＡＴＨＡＡＲＧＡＲＴＧＧＭＧＮＴＧＹＡＡＲＡＡＲＭＧＮＴＴＹＷＳＮＡＴＨＷＳＮＹＴＮＧＣＮＴＧＹＧＡＲＡＡＲＡＴＨＭＧＮＷＳＮＹＴＮＡＣＮＷＳＮＷＳＮＡＡＲＡＣＮＧＣＮＡＣＮＡＴＨＧＧＮＷＳＮＭＧＮＴＴＹＡＡＲＣＡＲＧＣＮＷＳＮＷＳＮＣＣＮＣＡＲＧＡＲＡＴＨＣＣＮＡＴＨＭＧＮＧＡＹＧＡＹＧＧＮＴＴＹＣＣＮＡＴＨＡＡＲＧＧＮＴＧＹＧＡＹＧＡＹＡＣＮＹＴＮＧＴＮＧＴＮＧＧＮＹＴＮＧＣＮＧＴＮＴＧＹＴＧＧＧＧＮＧＧＮＭＧＮＧＡＹＧＣＮＴＡＹＴＡＹＴＴＹＷＳＮＹＴＮＣＡＲＡＡＲＧＡＲＣＡＲＡＡＲＣＡＹＷＳＮＧＡＲＡＴＨＷＳＮＧＣＮＷＳＮＹＴＮＧＴＮＣＣＮＣＣＮＷＳＮＹＴＮＧＡＹＣＣＮＷＳＮＹＴＮＡＣＮＹＴＮＡＡＲＧＡＹＭＧＮＡＴＧＴＧＧＴＡＹＹＴＮＣＡＲＷＳＮＴＧＹＹＴＮＭＧＮＡＡＲＧＡＲＷＳＮＧＡＹＡＡＲＧＡＲＴＧＹＷＳＮＧＴＮＧＴＮＡＴＨＴＡＹＧＡＹＴＴＹＡＴＨＣＡＲＷＳＮＴＡＹＡＡＲＡＴＨＹＴＮＹＴＮＹＴＮＷＳＮＴＧＹＧＧＮＡＴＨＷＳＮＹＴＮＧＡＲＣＡＲＷＳＮＴＡＹＧＡＲＧＡＹＣＣＮＡＡＲＧＴＮＧＣＮＴＧＹＴＧＧＹＴＮＹＴＮＧＡＹＣＣＮＧＡＹＷＳＮＣＡＲＧＡＲＣＣＮＡＣＮＹＴＮＣＡＹＷＳＮＡＴＨＧＴＮＡＣＮＷＳＮＴＴＹＹＴＮＣＣＮＣＡＹＧＡＲＹＴＮＣＣＮＹＴＮＹＴＮＧＡＲＧＧＮＡＴＧＧＡＲＡＣＮＷＳＮＣＡＲＧＧＮＡＴＨＣＡＲＷＳＮＹＴＮＧＧＮＹＴＮＡＡＹＧＣＮＧＧＮＷＳＮＧＡＲＣＡＹＷＳＮＧＧＮＭＧＮＴＡＹＭＧＮＧＣＮＷＳＮＧＴＮＧＡＲＷＳＮＡＴＨＹＴＮＡＴＨＴＴＹＡＡＹＷＳＮＡＴＧＡＡＹＣＡＲＹＴＮＡＡＹＷＳＮＹＴＮＹＴＮＣＡＲＡＡＲＧＡＲＡＡＹＹＴＮＣＡＲＧＡＹＧＴＮＴＴＹＭＧＮＡＡＲＧＴＮＧＡＲＡＴＧＣＣＮＷＳＮＣＡＲＴＡＹＴＧＹＹＴＮＧＣＮＹＴＮＹＴＮＧＡＲＹＴＮＡＡＹＧＧＮＡＴＨＧＧＮＴＴＹＷＳＮＡＣＮＧＣＮＧＡＲＴＧＹＧＡＲＷＳＮＣＡＲＡＡＲＣＡＹＡＴＨＡＴＧＣＡＲＧＣＮＡＡＲＹＴＮＧＡＹＧＣＮＡＴＨＧＡＲＡＣＮＣＡＲＧＣＮＴＡＹＣＡＲＹＴＮＧＣＮＧＧＮＣＡＹＷＳＮＴＴＹＷＳＮＴＴＹＡＣＮＷＳＮＷＳＮＧＡＹＧＡＹＡＴＨＧＣＮＧＡＲＧＴＮＹＴＮＴＴＹＹＴＮＧＡＲＹＴＮＡＡＲＹＴＮＣＣＮＣＣＮＡＡＹＭＧＮＧＡＲＡＴＧＡＡＲＡＡＹＣＡＲＧＧＮＷＳＮＡＡＲＡＡＲＡＣＮＹＴＮＧＧＮＷＳＮＡＣＮＭＧＮＭＧＮＧＧＮＡＴＨＧＡＹＡＡＹＧＧＮＭＧＮＡＡＲＹＴＮＭＧＮＹＴＮＧＧＮＭＧＮＣＡＲＴＴＹＷＳＮＡＣＮＷＳＮＡＡＲＧＡＹＧＴＮＹＴＮＡＡＹＡＡＲＹＴＮＡＡＲＧＣＮＹＴＮＣＡＹＣＣＮＹＴＮＣＣＮＧＧＮＹＴＮＡＴＨＹＴＮＧＡＲＴＧＧＭＧＮＭＧＮＡＴＨＡＣＮＡＡＹＧＣＮＡＴＨＡＣＮＡＡＲＧＴＮＧＴＮＴＴＹＣＣＮＹＴＮＣＡＲＭＧＮＧＡＲＡＡＲＴＧＹＹＴＮＡＡＹＣＣＮＴＴＹＹＴＮＧＧＮＡＴＧＧＡＲＭＧＮＡＴＨＴＡＹＣＣＮＧＴＮＷＳＮＣＡＲＷＳＮＣＡＹＡＣＮＧＣＮＡＣＮＧＧＮＭＧＮＡＴＨＡＣＮＴＴＹＡＣＮＧＡＲＣＣＮＡＡＹＡＴＨＣＡＲＡＡＹＧＴＮＣＣＮＭＧＮＧＡＹＴＴＹＧＡＲＡＴＨＡＡＲＡＴＧＣＣＮＡＣＮＹＴＮＧＴＮＧＧＮＧＡＲＷＳＮＣＣＮＣＣＮＷＳＮＣＡＲＧＣＮＧＴＮＧＧＮＡＡＲＧＧＮＹＴＮＹＴＮＣＣＮＡＴＧＧＧＮＭＧＮＧＧＮＡＡＲＴＡＹＡＡＲＡＡＲＧＧＮＴＴＹＷＳＮＧＴＮＡＡＹＣＣＮＭＧＮＴＧＹＣＡＲＧＣＮＣＡＲＡＴＧＧＡＲＧＡＲＭＧＮＧＣＮＧＣＮＧＡＹＭＧＮＧＧＮＡＴＧＣＣＮＴＴＹＷＳＮＡＴＨＷＳＮＡＴＧＭＧＮＣＡＹＧＣＮＴＴＹＧＴＮＣＣＮＴＴＹＣＣＮＧＧＮＧＧＮＷＳＮＡＴＨＹＴＮＧＣＮＧＣＮＧＡＹＴＡＹＷＳＮＣＡＲＹＴＮＧＡＲＹＴＮＭＧＮＡＴＨＹＴＮＧＣＮＣＡＹＹＴＮＷＳＮＣＡＹＧＡＹＭＧＮＭＧＮＹＴＮＡＴＨＣＡＲＧＴＮＹＴＮＡＡＹＡＣＮＧＧＮＧＣＮＧＡＹＧＴＮＴＴＹＭＧＮＷＳＮＡＴＨＧＣＮＧＣＮＧＡＲＴＧＧＡＡＲＡＴＧＡＴＨＧＡＲＣＣＮＧＡＲＷＳＮＧＴＮＧＧＮＧＡＹＧＡＹＹＴＮＭＧＮＣＡＲＣＡＲＧＣＮＡＡＲＣＡＲＡＴＨＴＧＹＴＡＹＧＧＮＡＴＨＡＴＨＴＡＹＧＧＮＡＴＧＧＧＮＧＣＮＡＡＲＷＳＮＹＴＮＧＧＮＧＡＲＣＡＲＡＴＧＧＧＮＡＴＨＡＡＲＧＡＲＡＡＹＧＡＹＧＣＮＧＣＮＴＧＹＴＡＹＡＴＨＧＡＹＷＳＮＴＴＹＡＡＲＷＳＮＭＧＮＴＡＹＡＣＮＧＧＮＡＴＨＡＡＹＣＡＲＴＴＹＡＴＧＡＣＮＧＡＲＡＣＮＧＴＮＡＡＲＡＡＹＴＧＹＡＡＲＭＧＮＧＡＹＧＧＮＴＴＹＧＴＮＣＡＲＡＣＮＡＴＨＹＴＮＧＧＮＭＧＮＭＧＮＭＧＮＴＡＹＹＴＮＣＣＮＧＧＮＡＴＨＡＡＲＧＡＹＡＡＹＡＡＹＣＣＮＴＡＹＭＧＮＡＡＲＧＣＮＣＡＹＧＣＮＧＡＲＭＧＮＣＡＲＧＣＮＡＴＨＡＡＹＡＣＮＡＴＨＧＴＮＣＡＲＧＧＮＷＳＮＧＣＮＧＣＮＧＡＹＡＴＨＧＴＮＡＡＲＡＴＨＧＣＮＡＣＮＧＴＮＡＡＹＡＴＨＣＡＲＡＡＲＣＡＲＹＴＮＧＡＲＡＣＮＴＴＹＣＡＹＷＳＮＡＣＮＴＴＹＡＡＲＷＳＮＣＡＹＧＧＮＣＡＹＭＧＮＧＡＲＧＧＮＡＴＧＹＴＮＣＡＲＷＳＮＧＡＹＣＡＲＡＣＮＧＧＮＹＴＮＷＳＮＭＧＮＡＡＲＭＧＮＡＡＲＹＴＮＣＡＲＧＧＮＡＴＧＴＴＹＴＧＹＣＣＮＡＴＨＭＧＮＧＧＮＧＧＮＴＴＹＴＴＹＡＴＨＹＴＮＣＡＲＹＴＮＣＡＹＧＡＹＧＡＲＹＴＮＹＴＮＴＡＹＧＡＲＧＴＮＧＣＮＧＡＲＧＡＲＧＡＹＧＴＮＧＴＮＣＡＲＧＴＮＧＣＮＣＡＲＡＴＨＧＴＮＡＡＲＡＡＹＧＡＲＡＴＧＧＡＲＷＳＮＧＣＮＧＴＮＡＡＲＹＴＮＷＳＮＧＴＮＡＡＲＹＴＮＡＡＲＧＴＮＡＡＲＧＴＮＡＡＲＡＴＨＧＧＮＧＣＮＷＳＮＴＧＧＧＧＮＧＡＲＹＴＮＡＡＲＧＡＹＴＴＹＧＡＹＧＴＮ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）．
表１： Ｐｏｌθ１７９２−２５９０の計算された配列を生成するための核酸コード
Figure 2018537969
実施例３： ポリメラーゼθは、末端結合の際に３つの異なる機構の間で振動するロバストなターミナルトランスフェラーゼである。
この研究は、Ｐｏｌθがａｌｔ−ＥＪの間にどのようにしてゲノム不安定性に寄与する挿入突然変異を生成するかを解明しようとした。本明細書に記載されるのは、マンガン（Ｍｎ２＋）がＰｏｌθ鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性を活性化することである。さらに、Ｐｏｌθは、ターミナルトランスフェラーゼ活性の３つの異なる様式： 非鋳型伸長、cisにおける鋳型伸長及びtransにおける鋳型伸長の間で振動することにより、ａｌｔ−ＥＪの間に鋳型挿入突然変異及び非鋳型挿入突然変異のランダムな組合せを生成することが記載されている。最後に、Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性が特徴付けられる。そして、この活性がターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）よりも熟練している(proficient)ことが意外にも見出された。まとめると、これらのデータは、ａｌｔ−ＥＪ中に遺伝的多様性を生じさせるため、Ｐｏｌθによって用いられる前例のないスイッチングメカニズムを同定し、且つ、Ｐｏｌθを性質上最も熟練したターミナルトランスフェラーゼとして特徴付ける。
これらの実験に用いた材料及び方法をここで説明する。
Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性
５００ｎＭのＰｏｌθを、示された５’ ３２Ｐ標識ＤＮＡの５０ｎＭと共に、指示された二価カチオンを用いて、緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８．２、１０％グリセロール、０．０１％ＮＰ−４０，０．１ｍｇ ／ ｍｌ ＢＳＡ）の１０μｌ容量中の指示されたｄＮＴＰの０．５ｍＭの存在下、４２℃で１２０分間（又は他の指示された時間間隔及び温度）インキュベートした。５ｍＭ ＭｎＣｌ２を用いて最適なＰｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性を行った。２０ｍＭ ＥＤＴＡ及び４５％ホルムアミドの添加により反応を停止させ、そして、尿素ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動によりＤＮＡを分離し(resolved)、次いでオートラジオグラフィーにより可視化した。Ｐｏｌμターミナルトランスフェラーゼ反応は、Ｐｏｌθと同じ条件を用いて行った。５０ｎＭのＰｏｌθを、ｓｓＤＮＡトラップを用いた実験に用いた。１５０倍過剰の未標識ｓｓＤＮＡトラップを指示された時点で反応に添加した。Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性（固相）。５０ｎＭ ＲＰ３４７Ｂを、１００ｍＭ ＮａＣｌを補充した緩衝液Ａ中の磁気ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に固定化した。次に、緩衝液Ａで１００ｍＭ ＮａＣｌで３回ビーズを洗浄することにより、過剰の非結合ＤＮＡを除去した。次に、ビーズ−ＤＮＡ混合物を洗浄し、そして、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び１ｍＭのＭｎＣｌを含有する緩衝液Ａに再懸濁した。次いで、ｓｓＤＮＡ結合を可能にするため、５００ｎＭのＰｏｌθを１０分間加えた。次いで、ビーズを１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ＭｎＣｌ２を補充した２００μｌ緩衝液Ａで４回（４ｘ）洗浄することによって、過剰の非結合Ｐｏｌθを除去した。ビーズを１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ＭｎＣｌ２を補充した緩衝液Ａに再懸濁し、次いで０．５ｍＭ ｄＮＴＰを４２℃で添加した。１５時間後、ｄＨ２Ｏか、又は７．５μＭ ＲＰ４２７のいずれかを添加し、そして、１２０分後に、ＥＤＴＡの添加により、反応を停止した。過剰のｓｓＤＮＡトラップを除去するため、ビーズを十分に洗浄した。次いで、ビーズをｄＨ２Ｏに再懸濁し、続いて１〜２分間沸騰した。上清を回収し、次いで別の沸騰及び上清収集サイクルを行った。上清からのＤＮＡを、Ｚｙｍｏ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ＴＭ−５キットを用いて精製した。次いで、精製したＤＮＡをＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて室温で一晩ＲＰ４３０Ｐに連結した。ＲＮＡリガーゼを６５℃で変性させた(denatured)後、ＤＮＡをＺｙｍｏ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＴｍ−５キットを用いて精製した。次いで、連結したＤＮＡを、ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びプライマーＲＰ３４７及びＲＰ４３１を使用してＰＣＲにより増幅した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＰＣＲ産物を精製した。次いで、純粋なＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥ．ｃｏｌｉベクター内にクローニングした。ＰＣＲ産物を含有する個々のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉで増幅し、単離し、次いで配列決定した。
Ｐｏｌθはin vitroでａｌｔ−ＥＪを媒介する。
等モル濃度（１００ｎＭ）のｐｓｓＤＮＡ基質ＲＰ４２９／ＲＰ４３０−Ｐ及びＲＰ４３４−Ｐ／ＲＰ４０８を、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ＡＴＰを補充した緩衝液Ａ中の５０ｎＭＰｏｌθ及び８８．５ｎＭ Ｌｉｇ３と混合した。次に、１０μＭのｄＮＴＰを３７℃で１２０分間、総容量１００μｌで添加した。８０℃で２０分間のインキュベーションによって反応を停止させた。（陰性対照反応には、Ｌｉｇ３の省略、及びＰｏｌθ及びＬｉｇ３の省略が含まれる。）ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ヌクレオチド除去キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡを精製し、次いでＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び末端結合特異的プライマーＲＰ４３１及びＲＰ４３５を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＧｅｎｅＪＥＴ ＰＣＲ精製キット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製し、次いでｐＣＲ（登録商標） ２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞に形質転換し、そして、単一コロニー由来の個々のプラスミドを精製し、配列決定した。図３においてＰｏｌθはａｌｔ−ＥＪを媒介した。図補足３を上記のように実施したが、但し、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ ＭｎＣｌ２及び１００μＭ ｄＮＴＰを使用した。示されている場合、示された時点で１５０倍過剰量（１５μＭ）のｓｓＤＮＡトラップ（ＲＰ３４７）が反応に添加された。Ｐｏｌθは細胞内でａｌｔ−ＥＪを媒介した。以前に記載されたように、染色体転座を含むＰｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪを実施した（Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。簡潔には、マウス胚性幹（embryonic stem,ＥＳ）細胞を３μｇのＣａｓ９−ｇＲＮＡでトランスフェクトした（Ｒｏｓａ２６；Ｈ３ｆ３ｂ）（Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。トランスフェクション後、９６ウェルプレートにウェル当たり５×１０４細胞を播種し、そして、３日後に４０μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０，０．４５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．４５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で溶解した。溶解物を２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫと共に５５℃で２時間インキュベートした。トランスロケーション検出は、入れ子状(nested,ネステッド)ＰＣＲを用いて行った。第１のＰＣＲ反応で使用されるプライマーには、Ｄｅｒ（６）及びＤｅｒ（１１）のそれぞれについての、
Ｔｒ６−１１−Ｆｗｄ： ５’−ＧＣＧＧＧＡＧＡＡＡＴＧＧＡＴＡＴＧＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）；
Ｔｒ６−１１−Ｒｅｖ： ５’−ＴＴＧＡＣＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＧ −３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）、及び
Ｔｒ１１− ６−Ｆｗｄ： ５’−ＡＡＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＡＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）及び
Ｔｒ１１−６−Ｒｅｖ： ５’−ＧＣＡＣＧＴＴＴＣＣＧＡＣＴＴＧＡＧＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）、
が含まれる。ＰＣＲ増幅の第２ラウンドのために、以下のプライマーを使用した。：
Ｔｒ６−１１ＮＦｗｄ： ５’−ＧＧＣＧＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＡＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）；
Ｔｒ６−１１ＮＲｅｖ： ５’−ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＧＡＧＡＴＴＧＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）及び
Ｔｒ１１−６ＮＦｗｄ： ５’−ＡＧＣＣＡＣＡＧＴＧＣＴＣＡＣＡＴＣＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）及び
Ｔｒ１１−６ＮＲｅｖ： ５’ＴＣＣＣＡＡＡＧＴＣＧＣＴＣＴＧＡＧＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）．
接合配列を決定するため、転座事象に対応する増幅産物はサンガー配列決定を受けた。
ＴｄＴターミナルトランスフェラーゼ活性
ＴｄＴターミナルトランスフェラーゼ反応は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓにより推奨された条件：０．２５ｍＭコバルトを用いた、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、ｐＨ７．９を用いて、指示された５’３２Ｐｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ上で行い、及び３７℃でインキュベートした。インキュベーション時間及びＤＮＡ濃度はＰｏｌθによる実験と同一であった。ＴｄＴは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓによって推奨された濃度（０．２単位／μｌ）か、又はテキストに示されるようにＰｏｌθとして等モル濃度のいずれかで使用された。上記のようにＤＮＡ生成物を分離した。
ＲＰ３４７のＰｏｌθ伸長及び配列決定のためのＤＮＡの調製。
Ｐｏｌθ（５００ｎＭ）を、５０ｍＭ ＲＰ３４７ ｓｓＤＮＡと共に、５ｍＭ ＭｎＣｌ２か、又は１ｍＭ ＭｎＣｌ２及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２のいずれかを補充した１００μｌの緩衝液Ａ中、０．５ｍＭ ｄＮＴＰと共に４２℃で１２０分間インキュベートした。５Ｘ非変性停止緩衝液（０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、８０ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１．５％ＳＤＳ）の２５μｌの添加によって反応を停止させた。その後、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿、次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いた５’−リン酸化ＲＰ３５９−Ｐ ｓｓＤＮＡへのライゲーションを行った。ＤＮＡ生成物をエタノール沈殿させ、次いで水に溶解した。次に、ライゲーション産物のＰＣＲ増幅を、プライマーＲＰ３４７及びＲＰ３５９Ｃ及びＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ＰＣＲ産物をＧｅｎｅＪＥＴ ＰＣＲ精製キット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製し、次いでｐＣＲ（登録商標） ２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞に形質転換し、そして、単一コロニー由来の個々のプラスミドを精製し、且つ、配列決定した。
Ｐｏｌθ−Ｍｇ２＋プライマー−鋳型伸長
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２又は５ｍＭ ＭｎＣｌ２のいずれかを、及び示されたｄＮＴＰ及び時間間隔を用いて、記載されたようにＰｏｌθ−Ｍｇ２＋プライマー伸長を行った（Ｋｅｎｔ，２０１５）。固相におけるプライマー伸長は以下のように行った。ビオチン化プライマー（ＲＰ２５Ｂ）に対する鋳型（ＲＰ４０９）の２：１の比率をアニーリングし、次いで、１００ｍＭ ＮａＣｌを補充した緩衝液Ａで予め洗浄した磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２７０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に固定化した。１００ｍＭのＮａＣｌを用いた、２００ｍＭの緩衝液Ａで３回（３ｘ）洗浄することにより、過剰の非結合ＤＮＡを除去した。次に、ビーズ−ＤＮＡ混合物を洗浄し、そして、５ｍＭのＭｎＣｌ及び０．５ｍＭのｄＮＴＰを含有する緩衝液Ａに再懸濁した。次いで、５００μＭのＰｏｌθを４２℃で１２０分間添加した。次いで、反応を２０ｍＭのＥＤＴＡの添加、続いて１〜２分間の沸騰により停止させた。上清を回収し、次いで別の沸騰及び上清収集サイクルを行った。上清からのＤＮＡを、Ｚｙｍｏ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ＴＭ−５キットを用いて精製した。次いで、精製したＤＮＡをＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて室温で一晩ＲＰ４３０Ｐに連結した。ＲＮＡリガーゼを６５℃で変性させた後、ＤＮＡをＺｙｍｏ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｔｍ−５キットを用いて精製した。次いで、連結したＤＮＡを、ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びプライマーＲＰ２５及びＲＰ４３１を用いてＰＣＲにより増幅した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＰＣＲ産物を精製した。次いで、純粋なＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥ．ｃｏｌｉプラスミドベクターにクローニングした。ＰＣＲ産物を含有する個々のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉで増幅し、単離し、次いで配列決定した。示された場合、プライマー−伸長は、プライマー−鋳型（５０ｎＭ）に対するＰｏｌθＷＴmもしくはＰｏｌθＲＲの１：１比か、又はプライマー−鋳型（５０ｎＭ）に対するＰｏｌθＷＴもしくはＰｏｌθＲＲの１：２５比のいずれかで行った。示された場合、プライマー伸長の開始の１分後に、１５０倍過剰のｓｓＤＮＡトラップ（７．５μＭ ＲＰ３１６）を添加した。
デノボ(de novo)核酸合成。
５００ｎＭのＰｏｌθを、以下の濃度で（５００ｎＭのＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ； ９７ｎＭのｄＣＴＰ、［α−３２Ｐ］−６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの２０ｍＣｉ／ｍｌ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））、５ｍＭのＭｎＣｌを補充した緩衝液Ａ中の４２℃で、示された時間間隔で、示されたヌクレオチドとインキュベートした。核酸産物を変性ポリアクリルアミドゲル中で分離し、そして、オートラジオグラフィーにより可視化した。ＰｏｌθＷＴタンパク質及び突然変異タンパク質ＰｏｌθＬ２及びＰｏｌθＲＲを記載のとおりに精製した（Ｋｅｎｔ，２０１５）。部位特異的突然変異誘発は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。ＴｄＴはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から購入した。Ｐｏｌμ及びＬｉｇ３はＥｎｚｙｍａｘから購入した。ＤＮＡ。ｐＳＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ及びプライマー鋳型を、等モル濃度のｓｓＤＮＡ基質を脱イオン水中で一緒に混合し、次いで９５〜１００℃に加熱し、続いて室温にゆっくりと冷却することによって組み立てた。３２Ｐ−γ−ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を用いてｓｓＤＮＡを５’ ３２Ｐ標識した。ＤＮＡ（Integrated ＤＮＡ technology（ＩＤＴ））及びＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）オリゴヌクレオチド（５’−３’）。
・ＲＰ２５： ＣＡＣＡＧＡＴＴＣＴＧＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
・ＲＰ２５Ｂ： Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＡＣＡＧＡＴＴＣＴＧＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
・ＲＰ３４７： ＣＡＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＧＡＴＡＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
・ＲＰ３４８： ＣＡＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＧＣＣＧＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
・ＲＰ６３： ＣＧＡＡＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＣＧＣＴＧＡＧＧＡＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＣＴＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
・ＲＰ６３Ｃ： ＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
・ＲＰ２７１： ＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
・ＲＰ２７１Ｃ： ＣＣＣＡＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
・ＲＰ３５９： ＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＧＡＣＴＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
・ＲＰ３５９Ｃ： ＧＡＧＴＣＴＣＣＣＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
・ＲＰ２６６： ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
・ＲＰ３３１： ＡＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
・ＲＰ３４０： ＣＡＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＧＡＴＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
・ＲＮＡ−２： ＡＵＣＧＡＧＡＧＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
ＲＰ３４３−Ｐ： ／５Ｐｈｏｓ／ＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＡＧＴＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
・ＲＰ４２９： ＧＧＡＧＧＴＴＡＧＧＣＡＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＧＡＴＡＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
・ＲＰ４３０−Ｐ： ／５Ｐｈｏｓ／ＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＡＧＴＧＣＣＴＡＡＣＣＴＣＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
・ＲＰ４３４−Ｐ： ／５Ｐｈｏｓ／ＧＡＧＣＡＣＧＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
・ＲＰ４０８： ＧＡＧＣＡＣＧＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
・ＲＰ４２７： ＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）
・ＲＰ４０９： ＧＡＧＣＡＣＧＴＣＣＡＣＧＣＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）
・ＲＰ３４７Ｂ： Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＡＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＧＡＴＡＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
・ｐｓｓＤＮＡ基質： ＲＰ３４７／ＲＰ３４３−Ｐ， ＲＰ３４８／ＲＰ３４３−Ｐ， ＲＰ３４０／ＲＰ３４３−Ｐ， ＲＰ４２９／ＲＰ４３０−Ｐ， ＲＰ４３４−Ｐ／ＲＰ４０８．
・テロメアｓｓＤＮＡ，ＲＰ３３１。プライマー鋳型、ＲＰ２５／ＲＰ２６６，ＲＰ２５／４０９，ＲＰ２５Ｂ／４０９。
ヌクレオチド類似体
１、ｃｙ３−ｄＵＴＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）；
２、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Ｓｉｇｍａ）；
３、ビオチン−１６ＡＡｄＵＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）；
４、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−５−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）；
５、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−ＡＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；
６、シアニン３−ＡＡ−ＵＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）；
７、４−チオ−ＵＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）；
８、ビオチン−１６−ＡＡＣＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）；
９、ガンシクロビル三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）；
１０、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）。
次に、実験の結果について説明する。
Ｐｏｌθ鋳型非依存性活性はマンガンを必要とする。
ａｌｔ−ＥＪの理解における現在のパラドックスは、Ｐｏｌθがin vivoで、ＤＮＡ修復接合部で非鋳型（ランダムな）ヌクレオチド挿入を促進するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を欠いていることである。例えば、以前の研究（Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｋｅｎｔ， ２０１５）と同様に、Ｐｏｌθは、マグネシウム（Ｍｇ２＋）による標準緩衝液条件下、相補的デオキシグアノシン−三リン酸（ｄＧＴＰ）の非存在下で、デオキシシチジン一リン酸（ポリ−ｄＣ）を含有するホモポリマーｓｓＤＮＡを伸長することができない（図７Ｄ）。これは、Ｐｏｌθによる効率的なｓｓＤＮＡ伸長には相補的なヌクレオチドが必要であることが示されており、これは、鋳型塩基が、入ってくるヌクレオチドと対形成することによってヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応を促進することを実証する。最近の研究は、この鋳型依存的活性が、ポリメラーゼがcisでの鋳型を使用する「スナップバック」複製に起因することを示唆している（Ｋｅｎｔ，２０１５）。別の生化学的研究はまた、Ｐｏｌθが鋳型非依存性の活性を欠いていることを示した（Ｙｏｕｓｅｆｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。したがって、Ｐｏｌθがゲノム不安定性に寄与するａｌｔ−ＥＪの間にどのようにランダムヌクレオチド挿入を促進するかは依然として不明である（図７Ｂ）。
Ｍｇ２＋以外の二価カチオンが細胞内に存在することを考慮すると、それらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏではなくｉｎ ｖｉｖｏで鋳型非依存性ＤＮＡ合成を行うＰｏｌθの能力間の相違を説明することができる。したがって、Ｍｇ２＋の存在下及び非存在下で、Ｐｏｌθ、ポリｄＣ ｓｓＤＮＡ及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）を包含する反応において種々の二価カチオンを試験した（図７Ｅ）。結果は、Ｍｎ２＋及びより少ない程度でＣｏ２＋が、ｄＴＴＰによるポリ−ｄＣのＰｏｌθ伸長を活性化することを示した（図７Ｅ）。例えば、図７ＤにおいてＭｎ２＋が存在しない場合、ＰｏｌθはｄＴＴＰを有する基質のほんの一部分のみを伸長させた（レーン４）。対照的に、同じ反応条件下でのＭｎ２＋の添加は、Ｍｇ２＋が豊富であっても、Ｐｏｌθによる同じ基質の伸長を促進した（図７Ｅ）。チミジンはシチジンと塩基対を形成することができないので、これらのデータは、Ｍｎ２＋がＰｏｌθ鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性（すなわち非鋳型ＤＮＡ合成）を活性化することを示す。Ｐｏｌθ ＤＮＡ合成活性はＭｎ２＋によって完全に支持されているので（図７Ｅ、レーン２５）、これは、Ｍｎ２＋はヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応に必要なポリメラーゼ活性部位内のＭｇ２＋と同じ位置に結合することを示している。これと一致して、最近の構造解析は、カルシウムなどの他の金属がポリメラーゼ活性部位のＭｇ２＋を置換することができることを示している（Ｚａｈｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。さらに、エビデンスの数行は、Ｍｎ２＋がＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼの補因子として作用することができ、且つ、これらの酵素の忠実度を低下させることが示されている（Ａｎｄｒａｄｅ ｅｔ ａｌ．， ２００９； Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｗａｌｍａｃｑ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。したがって、このデータは、Ｍｎ２＋が、鋳型非依存性活性を促進し、且つ、ポリメラーゼの忠実度を低下させる可能性があるＰｏｌθの補因子として作用することを示している。重要なことに、この鋳型非依存性活性はまた、細胞中に見出される比較的低濃度のＭｎ２＋（０．２ｍＭ）及びＭｇ２＋（１−２ｍＭ）によって３〜８倍刺激された（図８）（ＭａｃＤｅｒｍｏｔｔ， １９９０； Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｖｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。生化学的研究はまた、Ｍｎ２＋が、おそらくＣｔＩＰとともに作用することによって、酵母Ｍｒｅ１１−Ｒａｄ５０−Ｘｒｓ２（ＭＲＸ）ヌクレアーゼ複合体及びａｌｔ−ＥＪ中に３’オーバーハングを生成するために必須である、その哺乳類の対応物(counterpart)、ＭＲＮのために必要な補因子であることも示した（Ｌｅｅ−Ｔｈｅｉｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１； Ｔｒｕｊｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｊａｓｉｎ， ２０１１）。したがって、これら及びエビデンスの他の行は、ＤＮＡ修復酵素の補因子としてのＭｎ２＋の生理学的役割を強く示唆している（Ａｎｄｒａｄｅ ｅｔ ａｌ．， ２００９； Ｃａｎｎａｖｏ ａｎｄ Ｃｅｊｋａ， ２０１４； Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｔｒｕｊｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
最適条件は、図９のＰｏｌθ−Ｍｎ２＋鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性について同定された。異なる温度でこれらの最適条件を使用して、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋がロバストな鋳型非依存性末端トランスフェラーゼ活性を示すことが判明した（図７Ｆ）。これは、Ｍｎ２＋が、細胞内のａｌｔ−ＥＪの間にランダムなヌクレオチド挿入を生成するＰｏｌθの能力を促進することを示唆している。Ｍｎ２＋は、非ホモポリマーｓｓＤＮＡ基質上のＰｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性を大きく刺激することがさらに見出された（図７Ｇ、左及び右）。対照的に、Ｍｇ２＋の存在下では、Ｐｏｌθは約１０〜２０ヌクレオチド（ｎｔ）を転写した後でほとんど停止した(arrested)が、いくらかの大きな別個の(discrete)産物も生成した（図７Ｇ、左及び右）。これらのデータは、図７Ｄに提示されたデータと共に、Ｍｇ２＋が、両基質について観察されるようにポリメラーゼに少数の別個の産物を繰り返し合成するよう指示するテンプレート依存活性を促進することを示す（図７Ｇ、左及び右）。これと一致して、Ｐｏｌθ−Ｍｇ２＋は一貫して、スナップバック複製による可能性が高いＲＰ３４７ ｓｓＤＮＡ鋳型から同様のＤＮＡ配列を生成した（図１０）。他方、Ｍｎ２＋は、Ｐｏｌθが、スメア(smear)によって示されるように異なる長さのランダムな生成物を生成することを可能にする鋳型非依存性活性を促進する（図７Ｇ、左及び右）。
Ｐｏｌθはターミナルトランスフェラーゼ活性の３つの異なるモード間で振動する。
Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性のこれらの機構に対するより詳細な洞察を得るために、細胞条件をモデル化する、Ｍｇ２＋の非存在下で、及びＭｇ２＋の１０倍過剰で、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋により生成されたｓｓＤＮＡ伸長産物の配列を分析した。予想通り、Ｍｇ２＋の非存在下で、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋によって生成されたＤＮＡ配列のほとんどはランダムであり、及びしたがって鋳型非依存性の活性によるものであった（図１１Ａ）。これは、Ｐｏｌθ−Ｍｇ２＋で観察されるような少数の別個のバンドではなく、スメアの出現と一致する（図７Ｇ）。興味深いことに、配列のいくつかは、最初のｓｓＤＮＡと同一又は相補的な短い領域を含んでいた（図１１Ａ、黒い下線）。個々の分子内の他の配列領域は互いに相補的であったが、元のｓｓＤＮＡ鋳型とは相補的ではなかった（図１１Ａ、灰色及び有色の線）。次に、Ｍｎ２＋に対して１０倍過剰のＭｇ２＋の存在下でＰｏｌθにより生成されたＤＮＡ配列を分析したところ、生理学的条件により密接に類似している（図１１Ｂ）。再び、ランダム配列、個々の産物内の相補配列（灰色及び有色の線）、及び初期鋳型（黒色の下線）と同一又は相補的な短い配列領域(tracts)が観察された。興味深いことに、Ｐｏｌθは、過剰のＭｇ２＋により相補的な配列を生成した（図１１Ａ及び図１１Ｂを比較）。さらに、ｓｓＤＮＡ伸長産物の平均長さは、Ｍｇ２＋の過剰でより短かった（図１１Ｅ）。これは図７Ｇの結果と一致する。
一緒に、これらのデータは、Ｍｎ２＋がＭｇ２＋よりも１０倍低い濃度で存在する場合に、Ｐｏｌθが末端トランスフェラーゼ活性の３つの異なるモードを示すことを実証する（図１１Ｃ）。第１の優勢なモードでは、Ｐｏｌθは鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を行う（図１１Ｃ、最上部）。第２のモードでは、Ｐｏｌθは、スナップバック複製とも呼ばれるcisで一時的な(transient)鋳型依存性伸長を行う（図１１Ｃ、最低部左）。この機構は、個々の伸長産物内の相補的配列の出現を説明する（図１１Ａ及び１１Ｂ；灰色及び有色の線）。第３のモードでは、Ｐｏｌθはｔｒａｎｓで一時的な鋳型依存性伸長を行う（図１１Ｃ、最低部右）。これは、最初のｓｓＤＮＡ基質と同一又は相補的な配列領域を説明する（図１１Ａ及び１１Ｂ；黒色の下線）。ｃｉｓでの鋳型伸長はまた、初期鋳型に相補的な配列を促進し得る（図１１Ｃ）。同一の配列領域は、cis又はtransの鋳型伸長によって最初に形成された相補的配列領域のtransでのコピーに起因する可能性が最も高い（図１２）。これらの３つのターミナルトランスフェラーゼ活性の機構についてのさらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの証拠を、それぞれ図１３及び１４に示す。
興味深いことに、伸長産物の多くは、ターミナルトランスフェラーゼ活性の１より多いモードによって生成された（図１１Ｂ）。これは、ポリメラーゼがこれらの異なる機構間で振動することを実証する（図１１Ｃ）。近塩基解像度(near base resolution)でこの酵素的スイッチング現象を特異的に追跡するために生成物配列を利用した（図１１Ｄ）。例えば、図１１Ｂからの配列８は、Ｐｏｌθが最初に５０の連続したランダムなヌクレオチド転写(transfer)事象を行い、その後、一時的なスナップバック複製モード（ｃｉｓの鋳型伸長）に切り替わることを実証する。次に、Ｐｏｌθはランダムモードに切り替わり、その後、４ｎｔを転写した(transferring)後、スナップバックモードにスイッチバックした後、別のスイッチバックでランダム合成に戻る。次にＰｏｌθは、ｔｒａｎｓモードで鋳型伸長に切り替わり、そこで７ｎｔをコピーし、その後、追加の２３ｎｔについてのランダムモードにスイッチバックする。最後に、Ｐｏｌθはスナップバックモードにスイッチバックし、次いで、８ｎｔを転写した後、追加の５ｎｔをランダムに組み込むことにより反応を終了させる。図１１Ｂからの配列３は、これらの異なる機構間の同様の振動を示す（図１１Ｄ、最低部）。ここで、Ｐｏｌθは５５の連続したランダムなヌクレオチド転写(transfer)事象を遂行し、その後スナップバックモードに切り替わり、ここで別の１５ｎｔが組み込まれる。この１５ｂｐ二重鎖(duplex)の融解温度は５０℃であると予測され、反応は４２℃で実施されたため、Ｐｏｌθはスナップバック複製中に形成された二重鎖を巻き戻すことができると思われる。次にＰｏｌθは３つの追加のスイッチング事象を実行し、最終的にランダム配列と鋳型配列の組み合わせからなる１３８ｎｔ産物を生成する。
これらの条件下で、Ｐｏｌθは、鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性に対する選好(preference)を示し（図１１Ｃ）、これはＭｇ２＋を省略した場合、より一般的である（図１１Ａ及び１１Ｂを比較）。したがって、Ｍｎ２＋対Ｍｇ２＋の比は、これらの異なる機構間のバランスを調節する。例えば、より高い濃度のＭｎ２＋は鋳型非依存性の転写事象を促進するのに対し、より低い濃度のＭｎ２＋は、スナップバック複製による鋳型依存活性を増加させながら、ランダムトランスフェラーゼ活性を低下させる（図１１Ａ及び１１Ｂを比較）。より高い濃度のＭｎ２＋も、より長い伸長産物を促進し、これは、これらの同一条件下での鋳型非依存性活性に対するポリメラーゼの選好と相関する（図１１Ｅ；図７Ｇ）。
Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋が、鋳型非依存性であると認識される可能性のある、エラーが起こりやすい鋳型依存活性ではなく、鋳型非依存性活性を行うことを確かめるために(to be certain)、複数の追加の対照(controls)が実施された。第１に、鋳型依存性活性及び非依存性活性を、固相で行った同じ反応で分析した（図１５）。ここでは、ビオチン化プライマー−鋳型をストレプトアビジンビーズに固定化し、次いで、過剰の鋳型鎖を完全に洗浄することによって除去した。その後、Ｍｎ２＋の存在下でのプライマー伸長を行い、伸長産物を配列決定した。結果は、初期の鋳型依存活性が比較的高い忠実度で行われることを示す（図１５Ｂ）。例えば、この短い鋳型では、それぞれ、５．６×１０−２及び６．９×１０−３という誤った取り込み(misincorporation)及びフレームシフトエラー率が観察された。他方、Ｐｏｌθが鋳型の末端に達すると、鋳型非依存性活性を実証する、ほとんどランダムな配列が生成された（図１５Ｂ）。これと一致して、Ｐｏｌθは、Ｍｎ２＋の存在下でのみ鋳型の末端をはるかに超えてＤＮＡ合成を続けることができる（図１５Ｃ）。単一ヌクレオチド（ｄＡＴＰ）の存在下でのプライマー鋳型上でのＰｏｌθ−Ｍｎ２＋による誤った取り込み及びミスマッチ伸長の速度（the rate）は、鋳型鎖が存在しない同一条件下でのその活性よりも劇的に遅い（図１５Ｄ）。したがって、これらのデータは、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋末端トランスフェラーゼ活性が誤った取り込み又はミスマッチ伸長の結果ではないことを実証する。鋳型非依存性活性のための追加の対照として、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋がＤＮＡの非存在下で新規(de novo)合成を行うか否かを試験した。注目すべきことに、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋は、鋳型非依存的な様式で核酸を合成するその能力を明白に実証する、新規の(de novo)ＤＮＡ及びＲＮＡ合成を示す（図１６）。
次に、ｓｓＤＮＡ伸長中にＰｏｌθ−Ｍｎ２＋が逐次的に作用するかどうか、及びポリメラーゼが最初のｓｓＤＮＡ鋳型から解離することなく、ターミナルトランスフェラーゼ活性の３つの異なるモード間を切り替えることができるかどうかを調べた。Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋の処理能力(processivity)を、ｓｓＤＮＡを初期５分間伸長させ、続いて１５０倍過剰の非標識ｓｓＤＮＡを添加することにより、ｓｓＤＮＡ上で試験した。これは、反応中に初期の放射標識ｓｓＤＮＡから解離する場合、ポリメラーゼを隔離する(sequesters)（図１７Ｂ）。注目すべきことに、ｓｓＤＮＡトラップの添加は、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋ターミナルトランスフェラーゼ活性に影響を及ぼさなかった。これは、ポリメラーゼが高い処理能力でｓｓＤＮＡ伸長を行うことを実証する。対照として、１５０倍過剰の非標識ｓｓＤＮＡは、溶液からポリメラーゼを効果的に隔離する（図１７Ａ）。Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋は、同じ条件下で、ターミナルトランスフェラーゼ活性の３つの異なるモードを示すので（図１７Ａ）、これらの結果は、ポリメラーゼが、初期のｓｓＤＮＡから解離することなく、これらの異なる活性の間で切り替わることを示す。
このスイッチング機構のプロセシング性をさらに試験するために、ｓｓＤＮＡトラップの存在下及び非存在下で、固相でｓｓＤＮＡ伸長を行ったところ、溶液から過剰の非結合ポリメラーゼを除去することができた（図１８）。例えば、Ｐｏｌθは最初にストレプトアビジンビーズに固定化されたｓｓＤＮＡに結合することができた。次いで、ビーズを完全に洗浄することによって過剰の未結合のＰｏｌθを除去した。次に、１０ｍＭのＭｎ２＋及び１ｍＭのＭｎ２＋を含有する緩衝液中でのｄＮＴＰの添加によって反応を開始させた。１５秒後、１５０倍過剰のｓｓＤＮＡトラップを添加したのに対して、陰性対照反応にはトラップは含まれなかった。反応の完了後、固定化されたｓｓＤＮＡを単離し、配列決定した。図１７で得られた結果と一致して、ｓｓＤＮＡトラップはＰｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性を抑制しなかった。実際、このデータは、過剰のｓｓＤＮＡの添加が、固相におけるＰｏｌθによって生成されたｓｓＤＮＡ伸長産物の長さを増加させることを示す（図１８Ｂ、１８Ｃ及び１８Ｄ）。これは、ｔｒａｎｓにおける鋳型の使用が、Ｐｏｌθ末端トランスフェラーゼ活性を抑制するのではなく、それを可能にすることを示唆する。これと一致して、配列分析は、Ｐｏｌθがｔｒａｎｓにおける鋳型としてｓｓＤＮＡトラップを頻繁に利用することを示す（図１８Ｄ）。ポリメラーゼはまた、ｓｓＤＮＡトラップが存在する場合、鋳型非依存性及びスナップバック複製活性を行う（図１８Ｄ）。ＰｏｌθはｓｓＤＮＡ伸長の間に硬度にプロセッシブであるので（図１７）、これらのデータは、単一のポリメラーゼが、最初のｓｓＤＮＡ鋳型から解離することなく、ターミナルトランスフェラーゼ活性の３つの異なるモード間で振動するモデルについて強力な支持を提供する。重要なことに、Ｍｇ２＋（１ｍＭ）及びＭｎ２＋（５０μＭ）の細胞内濃度を使用すると、Ｐｏｌθは、ｓｓＤＮＡを伸長するのに有効なままであり、且つ、この活動(activity)の間に鋳型及び非鋳型機構の組み合わせを利用する（図１９）。
Ｐｏｌθは、Ａｌｔ−ＥＪの際、ターミナルトランスフェラーゼ活性の３つのモード間で振動する
次に、ａｌｔ−ＥＪとの関連でＰｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性を調べた。細胞研究は、ａｌｔ−ＥＪ修復接合部における非鋳型及び鋳型挿入の出現にＰｏｌθ発現が必要であることを示しているが、追加の因子又は補因子がこれらの挿入事象を促進するかどうかは不明なままである。例えば、Ｐｏｌθは、マウス及びハエにおけるａｌｔ−ＥＪ修復接合部でランダムなヌクレオチド挿入領域であると思われるものを促進することが示されている（図１Ｂ）（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。ハエ、マウス及びワーム(worms)における証拠はまた、Ｐｏｌθが、transでの鋳型コピー機構に起因すると提案されている、鋳型のヌクレオチド挿入を促進することを示している（図７Ｃ）（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｋｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。Ｐｏｌθがこれらの挿入に単独で関与するかどうか、及び本明細書で同定されたターミナルトランスフェラーゼ活性の３つのメカニズムがこれらの挿入を促進するか否かを決定するために、最小のａｌｔ−ＥＪシステムをin vitroで再構成した。ここでは、３’オーバーハング（本明細書では部分的ｓｓＤＮＡ（ｐｓｓＤＮＡ）と称する）、及びそれらの３’末端に１塩基対のミクロホモロジー（Ｇ：Ｃ）、を含有する２つのＤＮＡ基質を、Ｍｇ２＋対Ｍｎ２＋の高い比率を含有する緩衝液中Ｐｏｌθ、Ｌｉｇ３、ＡＴＰ及びｄＮＴＰと共にインキュベートした。これは、細胞条件をモデル化する（図１３Ａ、最上部）。Ｐｏｌθはtransで鋳型伸長を促進することによりＬｉｇ３なしでＭＭＥＪを行うことができるが（図７Ａ）（Ｋｅｎｔ，２０１５）、現在のアッセイにおけるｐｓｓＤＮＡ基質はＭＭＥＪのための十分なミクロホモロジーを欠くが、その短い鎖上に５’リン酸を含有する。これは、５’ポリメラーゼによって延長された反対側の３’オーバーハングのライゲーションを支持することができる（図１３Ａ、最上部）。対照実験は、効率的なａｌｔ−ＥＪのためにＰｏｌθ及びＬｉｇ３の添加が必要であること、及び、挿入がＰｏｌθに依存することを示す（図２０Ｃ）。Ｌｉｇ３が細胞におけるほとんどのａｌｔ−ＥＪに必要であり、及びしたがって挿入を容易にするＰｏｌθによって機能する可能性があるため、これらの結果が期待される（Ａｕｄｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｓｉｍｓｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。ＥＤＴＡによる反応の終了後、ＤＮＡを精製し、次いで末端結合産物をＰＣＲにより増幅し、そして、クローニングベクターから個々に配列決定した（図２０Ａ及び２０Ｂ）。
ａｌｔ−ＥＪの間のＰｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性の機序について有意な洞察を得るために、長さ２ｎｔ以上の領域を分析した。これは、鋳型依存性に関する情報を明らかにする。注目すべきことに、Ｐｏｌθは、修復接合部でランダム及び鋳型ヌクレオチド挿入の両方を生じた（図１３Ａ）。これは、図１１で得られた結果と同様である。の鋳型挿入の場合、cisにおける(スナップバック複製；赤色の下線）及びtransにおける（灰色の下線）鋳型伸長の両方に生き異すると思われる配列領域が観察された。７ｂｐのメジアン挿入長が観察され（図１３Ｂ）、且つ、個々のヌクレオチド挿入事象の累積分析は、図１１で同定されたターミナルトランスフェラーゼ活性の３つのモード、例えば非鋳型伸長、ｃｉｓにおける鋳型伸長及びｔｒａｎｓにおける鋳型伸長、に起因する挿入のほぼ等しい割合を明らかにする（図１３Ｃ）。Ｐｏｌθスイッチング活性は、この場合ａｌｔ−ＥＪの間で生成された配列に基づいて、モデル化された（図１３Ｄ）。図１１で同定されたメカニズムと一致して、配列トレースは、３つの異なるターミナルトランスフェラーゼ活性間の自発的かつ迅速なスイッチングを強く示唆する（図１３Ｄ）。
次にポリメラーゼがａｌｔ−ＥＪ中に挿入を生成するためにプロセッシブに作用するか否かを調べた。これを試験するために、in vitroでのａｌｔ−ＥＪ反応を、反応が開始されてから１５秒後に、１５０倍過剰のｓｓＤＮＡトラップを添加して繰り返した。結果は、ＰｏｌθがｓｓＤＮＡトラップの存在下及び非存在下で同様の挿入領域長さを生成することを示している（図１３及び図２１を比較）。したがって、これらのデータは、初期基質から解離する前に、異なるターミナルトランスフェラーゼ活性間で単一のポリメラーゼが振動するモデルについてのさらなる支持を提供する。ａｌｔ−ＥＪの間にＰｏｌθが逐次的に作用することも示している。重要なことに、さらなるａｌｔ−ＥＪ実験は、Ｐｏｌθが、細胞内濃度をモデル化する１ｍＭ Ｍｇ２＋及び５０μＭ Ｍｎ２＋の存在下で鋳型及び非鋳型メカニズムの組み合わせによって同様のサイズの挿入を生じさせることを示す（図２２）。
Ｐｏｌθが細胞のａｌｔ−ＥＪの間に挿入を生成するためにこの切り替え機構を使用するかどうかを試験するために、ｉｎ ｖｉｖｏでａｌｔ−ＥＪ中にＰｏｌθにより合成された挿入領域を分析した（図１４）。ここで、マウス胚性幹細胞におけるＰｏｌθ依存ａｌｔ−ＥＪは、以前の研究（Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚら、２０１５）に示されるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって染色体ＤＮＡ中に生成された配列特異的ＤＳＢ間の転座(translocation)を促進する（図１４Ａ、最上部）。染色体転座中の異なるＰｏｌθ媒介活性を区別するために、染色体６及び１１の切断に起因する事象の接合、及びその後のＤｅｒ（６）及び（１１）の形成を注意深く分析した。図１３と同様に、長さ＞２ｂｐの挿入を含有する接合部を分析した。注目すべきことに、細胞ａｌｔ−ＥＪ系において、Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性の３つのモードのすべてに起因すると思われる挿入領域(tracts)が観察された（図１４Ａ）。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｌｔ−ＥＪシステムで得られた結果と同様に（図１３）、ｉｎ ｖｉｖｏで産生された個々のヌクレオチド挿入事象の累積分析は、Ｐｏｌθが、ターミナルトランスフェラーゼ活性の３つの異なるモードに起因して、挿入事象のほぼ等しい割合を生成することを実証する（図１４Ａ、１４Ｂ及び１４Ｃ）。ｔｒａｎｓにおける鋳型伸長は短い配列の複製を説明する（黒及び灰色の下線）のに対し、ｃｉｓにおける鋳型伸長（スナップバック複製）は短い相補的配列領域（赤及び青の下線）の出現を説明する（図１４Ａ）。非鋳型伸長に起因する個々のヌクレオチド挿入事象は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系（３９％）と比較してｉｎ ｖｉｖｏ系（３３．２％）においてわずかに低いようであり、これは、おそらく、細胞中のＭｎ２＋対Ｍｇ２＋の割合が低いためである。これと一致して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系（２８．８％）と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ系（３７．２％）ではｃｉｓにおける鋳型伸長（スナップバック複製）による事象がわずかに高いように見える。ヌクレアーゼ活性による可能性が高い細胞ではより頻繁ではあるにもかかわらず、両方の系でＤＮＡ欠失が観察されたことに留意されたい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ系での欠失は、以前に示されたように、３’オーバーハング内の内部部位でのＰｏｌθ媒介末端結合に起因する可能性が高い（Ｋｅｎｔ，２０１５）。このメカニズムはまた、ｉｎ ｖｉｖｏで観察される欠損に寄与し得る。各系における欠失形成の根底にある特定の機序にかかわらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで観察された挿入領域は、鋳型依存性に関して本質的に類似している（図１３Ｃ及び１４Ｃを比較）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＰｏｌθによって生成されたメジアン挿入領域長さ（７ｂｐ）は同一であった（図１３Ｂ及び１４Ｂを比較）。したがって、これらのデータは、再構成されたａｌｔ−ＥＪシステムが、細胞におけるａｌｔ−ＥＪのメカニズムに非常に似ていることを実証している。遠隔染色体部位及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターからコピーされたいくつかの大きな（＞３０ｂｐ）挿入もｉｎ ｖｉｖｏシステムで観察されたことに留意されたい（図２３）。しかし、これらの挿入は、おそらく二本鎖ＤＮＡへの鎖侵入のような異なる機構に起因する。ｉｎ ｖｉｖｏで生成された末端結合産物の追加の分析は、Ｐｏｌθが＞２ｂｐの長さの挿入を優先的に産生し、及び時には比較的長い挿入（すなわち＞２５ｂｐ）を生じることを実証する（図２４）。重要なことに、ｉｎ ｖｉｖｏで生成された末端結合産物の配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察されたのと同じＰｏｌθスイッチング機構を支持する（図１４Ｄ）。全体として、挿入の形成におけるＰｏｌθの必要性を示す以前の研究とともに、図１３及び１４に示される結果は、Ｐｏｌθがａｌｔ−ＥＪの間に挿入を生成することに関与する主な酵素であることを示している。これらの結果はまた、Ｐｏｌθが、挿入突然変異を生成するため、ターミナルトランスフェラーゼ活性の３つの異なるモード間で振動すること、及びＭｎ２＋がｉｎ ｖｉｖｏでＰｏｌθの補因子として作用する可能性があることを示す。
Ｐｏｌθは、３’オーバーハングを有するＤＮＡ上の優先ターミナルトランスフェラーゼ活性を示す。
次に、様々なＤＮＡ基質上のＰｏｌθ−Ｍｎ２＋末端トランスフェラーゼ活性を特徴付けた。例えば、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋は、デオキシチミジン一リン酸（ポリ−ｄＴ）か、又はデオキシシチジン−一リン酸（ポリ−ｄＣ）のいずれかからなるホモポリマーｓｓＤＮＡ、及び可変配列を含有するｓｓＤＮＡについて試験した。ポリメラーゼは、配列構成にかかわらず、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）の存在下で全ての基質を１００ｎｔより多く、優先的に伸長させた（図２５Ａ及び２５Ｂ）。ポリメラーゼは、鋳型塩基のコーディングが利用できない場合、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）を優先的に取り込むことが知られている。これはＡ−ルールと呼ばれる。例えば、ポリメラーゼは、非塩基(abasic)部位の反対側又は鋳型の末端に単一のｄＡＭＰを優先的に組み込む。したがって、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋によるｄＡＭＰの観察された優先的取り込みは、Ａ−ルール及び鋳型非依存性の活性と一致する。Ｐｏｌθはまた、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰの存在下でｓｓＤＮＡを伸長させたが、これらの産物の長さはｄＡＴＰよりも短かった（図２５Ａ及び２５Ｂ）。例えば、ホモポリマーでないｓｓＤＮＡの場合、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、又はｄＧＴＰの存在下で、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋は約３０〜７０ｎｔを転写した（図２５Ｂ）。これは、好ましいｄＡＴＰが存在しなくても、Ｐｏｌ−Ｍｎ２＋ターミナルトランスフェラーゼ活性が比較的効率的であることを示している。注目すべきことに、非相同末端結合（non-homologous endjoining,ＮＨＥＪ）Ｘ−ファミリーポリメラーゼＰｏｌμは、同一条件下でＰｏｌθと比較して最小ターミナルトランスフェラーゼ活性を示した（図２６）。以前の研究は、同様に、ＴｄＴと最も密接に関連するＰｏｌμによる限定的なターミナルトランスフェラーゼ活性を示した（Ａｎｄｒａｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。従って、現在までに示されたデータは、ＴｄＴの他に、Ｐｏｌθがポリメラーゼ酵素クラスに対して最もロバストなターミナルトランスフェラーゼ活性を有することを示している。
次に、平滑末端二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を伸長するＰｏｌθ−Ｍｎ２＋の能力を調べた。結果は、Ｐｏｌθが二本鎖ＤＮＡを効率的に伸長することを示しているが、これは平滑末端ＤＮＡに対するポリメラーゼの親和性がより低いことによるかもしれないわずか１〜２ヌクレオチドに限られる（図２５Ｃ）。興味深いことに、Ｐｏｌθは鋳型の下流末端をはるかに超えてプライマー鋳型を効率的に伸長させた（図２５Ｄ、左）。従って、ポリメラーゼは、ランニングスタートが与えられたときにｄｓＤＮＡの効率的な長距離伸長を行う（図２５Ｄ、右図）。
ＰｏｌθがＭＭＥＪ／ａｌｔ−ＥＪの間にＭＲＮ及びＣｔＩＰによって部分的に切除されたＤＳＢに作用すると考えられるので（Ｋｅｎｔ，２０１５）、ｐｓｓＤＮＡに対するそのターミナルトランスフェラーゼ活性を調べた。注目すべきことに、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋は、ｐｓｓＤＮＡ上で最も効率的なターミナルトランスフェラーゼ活性を示した（図２５Ｅ）。例えば、ポリメラーゼは、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰを用いてより長い長さにｐｓｓＤＮＡ基質を伸長したのに対し、ｄＧＴＰは依然として限定的であった（図２５Ｅと図２５Ｂを比較）。
Ｐｏｌθは、テロメア保護及びＮＨＥＪ因子が欠損した細胞におけるテロメアのａｌｔ−ＥＪを促進する役割と一致して（Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、Ｐｏｌθは、安定したＧ四重鎖（Ｇ４）二次構造を含有することが知られているテロメア後にモデル化されたｓｓＤＮＡに対して効率的なターミナルトランスフェラーゼ活性を示す（図２５Ｆ）。ここで再び、ｄＧＴＰの存在下での伸長は抑制された。連続するｄＧＭＰ取り込み事象がＰｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性を制限することを考慮すると、テロメア反復に存在する複数のグアノシンが同様の阻害効果を引き起こすと推定される。他の全てのヌクレオチドは、テロメアｓｓＤＮＡ基質に効率的に転写された（図２５Ｆ）。まとめると、図５の結果は、Ｐｏｌθが、ＭＭＥＪ／ａｌｔ−ＥＪにおけるその役割と一致するｐｓｓＤＮＡ上で最もロバストなターミナルトランスフェラーゼ活性を示すこと、及び、ポリメラーゼが、ランニングスタートが与えられた場合に、様々なｓｓＤＮＡ基質及びｄｓＤＮＡを伸長するのにも有効であることを示す。
保存された残基はＰｏｌθ処理能力(processivity)及びターミナルトランスフェラーゼ活性を促進する。
次に、Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性を促進する構造モチーフが同定された。Ｐｏｌθは、３つの挿入ループを含むため、独自のＡファミリーポリメラーゼであり、且つ、以前の研究では、ｓｓＤＮＡのＰｏｌθ伸長にループ２が必要であることが示されている（Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２； Ｋｅｎｔ，２０１５）。このモチーフの位置はＰｏｌθにおいて保存され、且つ、位置２２５４において、保存された正に帯電した残基、アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）のすぐ下流に位置する（図２７Ａ）。プライマー鋳型と入ってくるヌクレオチドとの複合体におけるＰｏｌθの最近の構造研究は、ループ２がプライマーの３’末端に比較的近接していることを示しているが、解像度の欠如のためにこの立体構造において柔軟性がある可能性が高い（図２７Ｂ）（Ｚａｈｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。Ｍｇ２＋を用いたＰｏｌθ ｓｓＤＮＡの伸長がＭｎ２＋によるその活性と関連している可能性があることを考慮すると、ループ２は鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性をももたらす可能性がある。実際、Ｐｏｌθのループ２欠失突然変異体（ＰｏｌθＬ２）は、Ｍｎ２＋を有する最適な鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ条件下でｓｓＤＮＡを伸長することができなかった（図２７Ｃ）。以前の結果と同様に、ＰｏｌθＬ２はプライマー鋳型を完全に伸長した（図２７Ｄ）。ここで、ＰｏｌθＷＴ伸長は、Ｍｎ２＋を有するポリメラーゼのロバストなターミナルトランスフェラーゼ活性のために鋳型を超えて継続した（図２７Ｄ）。
構造解析は、２つの保存された正に荷電した残基Ｒ２２０２及びＲ２２５４が、プライマーの３’部分のリン酸骨格に結合することを示した（図２７Ａ及び２７Ｂ）（Ｚａｈｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。これらの正に荷電した残基はＰｏｌθでは保存されているが、他のＡ−ファミリーのメンバーでは保存されていないので（図２７Ａ）、荷電残基はＰｏｌθ末端トランスフェラーゼ活性に寄与する可能性がある。Ｒ２２０２及びＲ２２５４をそれぞれアラニン（Ａ）及びバリン（Ｖ）に変更したＰｏｌθの二重突然変異型バージョンの第１のプライマー伸長（ＰｏｌθＲＲ）を試験した。最近の研究は、単一のＲ２２０２Ａ及びＲ２２５４Ｖ Ｐｏｌθ突然変異体が、損傷乗り越え(translesion)合成においてわずかに欠陥があることを示した（Ｚａｈｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。ＰｏｌθＲＲはＰｏｌθＷＴと同様の方法でプライマーを伸長させた（図２７Ｅ）。しかし、ＰｏｌθＲＲは、Ｍｎ２＋を用いた同一条件下でＰｏｌθＷＴと比較して、鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性の重大な欠損を示した（図２７Ｆ）。ＰｏｌθＷＴは高い処理能力で末端トランスフェラーゼ活性を行うので、ＰｏｌθＲＲが減少した処理能力を示すかどうかが考えられた。実際、ＰｏｌθＲＲは、大過剰のＤＮＡが存在する場合、ＰｏｌθＷＴと比較してプライマー伸長において有意な欠損を示し、処理能力の低下を確認した（図２７Ｇ）。これらのデータはまた、ＰｏｌθＷＴがｓｓＤＮＡ伸長と比較してプライマー−鋳型伸長の間に低い処理能力を示すことを示唆する（図２７Ｇ及び１７を比較）。ＰｏｌθＲＲは処理能力及び鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性に欠陥があるので、これは、鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を効率的に行うためには、ポリメラーゼがｓｓＤＮＡ上でプロセッシブでなければならないことを示唆する。一緒に、これらのデータは、３’プライマー末端に結合することにより酵素への処理能力を付与することにより、Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性に寄与する保存された残基を同定する。
Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼ活性とＴｄＴターミナルトランスフェラーゼ活性との比較
重要なことに、ターミナルトランスフェラーゼ活性は、バイオテクノロジー、バイオメディカルリサーチ、及び合成生物学を包含する様々なタイプの用途のためにｓｓＤＮＡ末端を改変するために広く使用されている。現在、これらの用途のために開発され市販されている唯一の酵素はターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）であり、その細胞機能は、抗体遺伝子成熟の間に非鋳型ヌクレオチドをＶ、Ｄ及びＪエキソン領域に転写することによって抗体の多様性を促進することである（Ｍｏｔｅａ ａｎｄ Ｂｅｒｄｉｓ，２０１０）。図２８Ａに示すように、Ｐｏｌθ及びＴｄＴの活性を比較した。注目すべきことに、Ｐｏｌθは、供給業者によって推奨される最適条件下でアッセイされたＴｄＴと同様のｓｓＤＮＡを伸長する能力を示した（図２８Ａ）。この結果はまた、この反応において、Ｐｏｌθ及びＴｄＴは、それぞれｄＡＴＰ及びｄＴＴＰを優先的に利用することを示し、これは異なる作用機序を示唆している（図２８Ａ）。
多くのバイオテクノロジー及び生物医学研究の用途は、固体表面へのＤＮＡ付着を可能にするような、フルオロフォア又は他の化学基で修飾されたｓｓＤＮＡ基質を必要とする。したがって、異なる官能基と結合したデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’末端に転写させるＰｏｌθの能力を調べた。再び、ＴｄＴについての供給業者推奨アッセイ条件、及びその最適条件下でのＰｏｌθの同一濃度を用いると、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋は、ＴｄＴと比較してリボヌクレオチドをｓｓＤＮＡに転写するのにより効果的であった（図２８Ｂ）。これまでの研究では、Ｐｏｌθはリボヌクレオチドを強く差別するが（Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）、この忠実度メカニズムはターミナルトランスフェラーゼ活性のために使用されるこれらの条件下で大きく損なわれている。再び、同一濃度においてＰｏｌθ及びＴｄＴのそれぞれの最適条件を用いると、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋は、最も修飾されたデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドをｓｓＤＮＡに転写することに、ＴｄＴよりもより熟練していた（図２８Ｃ及び２８Ｄ）。例えば、Ｐｏｌθは、試験した１０個の修飾ヌクレオチドのうち８個をより効率的に転写した。いくつかの場合において、ＰｏｌθはＴｄＴよりも長い伸長産物を産生した（図２８Ｃ）。他の場合において、Ｐｏｌθは、ＴｄＴが組み込むことができなかったヌクレオチドを転写した（図２８Ｃ、黒色ボックス）。例えば、Ｐｏｌθは、「クリックケミストリー」用途に広く使用されているアジド基に結合したリンカーを含有するヌクレオチドを効率的に転写した（図２８Ｃ、レーン６）。対照的に、ＴｄＴはこのヌクレオチドを完全に転写しなかった（図２８Ｃ、レーン１７）。さらに、ＴｄＴは、改変された糖及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄに結合したリンカーを含有するヌクレオチドを転写しなかったのに対し、これらの基質はＰｏｌθによって効率的に取り込まれた（図２８Ｃ、ヌクレオチド類似体４及び９）。これらの結果は、Ｐｏｌθが、フルオロフォア及びビオチン及びジゴキシゲニンを包含する官能基のような、それらの塩基部分に修飾を含有するリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド、ならびに糖修飾を含有するヌクレオチド（すなわち、ガンシクロビル一リン酸）を効率的に転写させることを示す。Ｐｏｌθもまた、損傷乗り越え合成活性を示すことを考慮すると、これらの結果は、その活性部位に非標準ヌクレオチドを収容するその天然の能力に起因する可能性がある（Ｈｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１； Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。
最後に、ＰｏｌθがＲＮＡに対してターミナルトランスフェラーゼ活性を示すかどうかを調べた。驚くべきことに、Ｐｏｌθは標準ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドの両方をＲＮＡに転写した（図２８Ｅ）。一緒になって、図２８に示された結果は、同定された最も熟練したターミナルトランスフェラーゼとして（as among）Ｐｏｌθを特徴付け、且つ、Ｐｏｌθが生物医学研究及びバイオテクノロジー用途のための核酸基質の改変においてＴｄＴよりも有効であることを実証する。
単一のポリメラーゼがＤＮＡを合成することができるメカニズム
最近の研究では、哺乳類のＰｏｌθはＭＭＥＪ／ａｌｔ−ＮＨＥＪにとって必須であることが発見された。これは、化学療法に使用されるものを包含する、ＤＮＡ損傷剤に対する染色体再編成及び耐性を促進する（Ｋｅｎｔ， ２０１５； Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｙｏｕｓｅｆｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。Ｐｏｌθは、ハエ及びワームのａｌｔ−ＥＪに必須であることが以前に示され（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｋｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、より高度な真核生物におけるこのポリメラーゼのために保存された役割を実証する。これらの細胞研究は、Ｐｏｌθ発現に依存するａｌｔ−ＥＪ修復接合部で２つのタイプの挿入（非鋳型化及び鋳型化）が生成されることを示した（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｋｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４； Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｙｏｕｓｅｆｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。非鋳型挿入の場合、Ｐｏｌθは、推定鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性によりヌクレオチドのランダム転写を促進することが提案されている（Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。しかし、生化学的研究は、Ｐｏｌθが鋳型非依存性のターミナルトランスフェラーゼ活性を欠いていることを示し、細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏのデータの間にパラドックスを形成している（Ｋｅｎｔ， ２０１５； Ｙｏｕｓｅｆｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。鋳型挿入の場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏでも証明されていないtransでのコピーが提案されている（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｋｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４； Ｙｏｕｓｅｆｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。本明細書に提示されるデータは、Ｐｏｌθがａｌｔ−ＥＪの間に鋳型非テンプレートヌクレオチド挿入突然変異及び非鋳型ヌクレオチド挿入突然変異の両方をどのように生成するかを明らかにし、且つ、ポリメラーゼをバイオテクノロジー及び生物医学研究用途のための非常に丈夫なターミナルトランスフェラーゼとして特徴づける。
第１に、ＰｏｌθはＭｎ２＋の存在下でロバストな鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性を示す。構造解析により、Ｐｏｌθの活性部位内の二価カチオンの差次的結合(differential binding)がその局所構造をわずかに変化させることが示されていることを考慮すると（Ｚａｈｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）、Ｍｎ２＋結合は非鋳型ＤＮＡ合成にとってより好ましい活性部位コンホメーションを促進する。Ｐｏｌθ依存性の非鋳型ヌクレオチド挿入は一般に細胞内のａｌｔ−ＥＪと関連するため、これらの知見はＭｎ２＋がｉｎ ｖｉｖｏでＰｏｌθの補因子として作用することを示唆している。例えば、Ｍｎ２＋の濃度は細胞内では比較的低く（〜０．２ｍＭ）、且つ、Ｍｇ２＋（〜１．０ｍＭ）よりもはるかに少ないが、Ｍｎ２＋及びＭｇ２＋のこれらの濃度は、Ｐｏｌθ鋳型非依存性ターミナルトランスフェラーゼ活性を３〜８倍、刺激する。したがって、Ｍｎ２＋の細胞濃度は、Ｐｏｌθ鋳型非依存性活性を活性化する可能性が高い。興味深いことに、Ｍｎ２＋は、ＭＲＸヌクレアーゼ複合体及びその哺乳動物の対応物であるＭＲＮの必要な補因子として作用することが示されている。これは、Ｐｏｌθが作用する３’ｓｓＤＮＡオーバーハングを生成するその役割に起因する、ａｌｔ−ＥＪにも必須である（Ｃａｎｎａｖｏ ａｎｄ Ｃｅｊｋａ， ２０１４； Ｔｒｕｊｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。したがって、ＤＮＡ修復に関与する様々な酵素は、Ｍｇ２＋に加えて補因子としてＭｎ２＋を利用する可能性が高い。
驚くべきことに、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋複合体は、同じ濃度で、リボヌクレオチド及び最も修飾されたヌクレオチド類似体をｓｓＤＮＡの３’末端に転写させるＴｄＴよりも高い効率を示した。例えば、リボヌクレオチドの存在下で、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋は、実質的により長い伸長産物を生成した。これはリボヌクレオチドに対するより低い差別を実証する。Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋はまた、大きな官能基を含有するものを包含する、ほとんどのヌクレオチド類似体の存在下で、ＴｄＴよりも長い伸長産物を産生した。さらに、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋は、ＴｄＴが基質として利用できなかった特定のヌクレオチド類似体を効率的に転写した。例えば、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋は、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄと結合したヌクレオチド及びアジド基を含有するヌクレオチドを排他的に転写し、これは「クリック」ケミストリー用途に広く使用されている。さらに、Ｐｏｌθ−Ｍｎ２＋は、ＤＮＡよりも効率は低いが、標準的なヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドをＲＮＡに転写することができる。これらの予想外の知見に基づいて、本明細書において、Ｐｏｌθは、バイオテクノロジー、生物医学研究及び合成生物学の応用のための核酸基質の改変に、より有用であると考えられる。さらに、ＰｏｌθはＴｄＴのような毒性反応成分、例えばＣｏ２＋塩又はカコジル酸の塩、を必要としないので、Ｐｏｌθターミナルトランスフェラーゼアッセイは研究及びバイオテクノロジーの用途にとってより安全な選択肢である。
本明細書中に提示されたデータは、なぜ２つのロバストなターミナルトランスフェラーゼ： Ｐｏｌθ及びＴｄＴ、について進化が選択されたかという疑問を提起する。ＴｄＴの主要な機能は、強力な免疫系に必要な抗体の多様性を促進するＶ、Ｄ及びＪ抗体遺伝子領域のＮＨＥＪ中に挿入突然変異を生成することであることはよく知られている（Ｍｏｔｅａ及びＢｅｒｄｉｓ、２０１０）。多様な免疫学的防御が生存にとって重要であるため、ＴｄＴに対する明確な選択圧力が存在した。Ｐｏｌθの場合、ポリメラーゼも末端結合の間に挿入突然変異を生成するように選択されているようであるが、この特定のメカニズムに対する進化的圧力は明らかではない。例えば、Ｐｏｌθはａｌｔ−ＥＪに必須であるが、この経路は、ＨＲなどの一次ＤＳＢ修復プロセスと比較して、まれにしか発生しないようである（Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｔｒｕｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。これと一致して、Ｐｏｌθは正常な細胞生存又は発達にとって重要ではない。しかしながら、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓの最近の研究は、驚くべきことに、Ｐｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪが生殖細胞における修復の主要な形態であることを示している（ｖａｎ Ｓｃｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。さらに、Ｐｏｌθ媒介ＡＬＴ−ＥＪは、自然分離株において見いだされるｉｎｄｅｌｓに類似した伝播された実験室株における欠失及び挿入（ｉｎｄｅｌ）シグネチャを促進することが示された（ｖａｎ Ｓｃｈｅｎｄｅｌら、２０１５）。したがって、これらの研究は、Ｐｏｌθが遺伝的多様性を生成するために重要であることを示唆している。興味深いことに、ヒトＰｏｌθは精巣で高度に発現されており、これは、ポリメラーゼが哺乳動物の遺伝的多様性を促進する役割を果たしている可能性があることを示唆している（Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
ａｌｔ−ＥＪもまた、ＨＲへのバックアップとしての複製修復を促進することを考慮すると、Ｐｏｌθは、致命的なＤＳＢが主要なＨＲ経路によって修復されない場合に、ｉｎｄｅｌｓを犠牲にして細胞生存に有益である可能性が高い（Ｔｒｕｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。例えば、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓにおけるＰｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪは、安定なＧ４構造での複製修復を容易にすることが示されていた。これはＨＲ機構に問題を引き起こす可能性があり、及び従って、代替的でより適応性のあるエラーの起こりやすい修復形態を潜在的に必要とする（Ｋｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．, ２０１４）。Ｐｏｌθはまた、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける大きな遺伝子欠失を抑制することも示されており、これはポリメラーゼにとって明らかな利益を示す（Ｋｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．, ２０１４）。しかし、Ｐｏｌθのこれらの様々な機能が哺乳類で保存されているかどうかは、さらなる研究が待たれる。
これらの研究は、Ｐｏｌθが、複数の機構間で振動することにより、Ｐｏｌθがヌクレオチド挿入を生成することを明らかにする。これは、しばしば挿入突然変異を含有する末端結合産物を触媒するために、ほとんど任意の手段によってｓｓＤＮＡを容易に伸長させる無差別(promiscuous)酵素を描写する。例えば、Ｐｏｌθは、ターミナルトランスフェラーゼ活性の３つの異なるモード： 非鋳型伸長、cisでの鋳型伸長、及びtransでの鋳型伸長、の間で自発的に切り替えることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでａｌｔ−ＥＪの間にヌクレオチド挿入を生じることが観察された。重要なことに、これらの挿入の特徴は、細胞におけるＰｏｌθ媒介ａｌｔ−ＥＪによって生成されるものとほぼ同一であり、これはＰｏｌθがｉｎ ｖｉｖｏでのターミナルトランスフェラーゼ活性のこれらの３つのメカニズムをも切り替えることを示す。ポリメラーゼがＤＮＡ合成の３つの異なったモードを自発的に切り替える能力は実証されていない。したがって、このデータは、単一のポリメラーゼがおそらく遺伝的多様性を生成するために、そして突然変異を犠牲にして致命的なＤＳＢを修復するための最後の手段として、ＤＮＡを合成することができる前例のない一組のメカニズムを明らかにする。
実施例４：ポリメラーゼθは末端トランスフェラーゼ活性を示す
図２９は、ｓｓＤＮＡの３’末端を改変する無脊椎動物Ｐｏｌθの能力を示す。無脊椎動物及び脊椎動物Ｐｏｌθのポリメラーゼドメインは、それぞれの挿入ドメイン内で配列同一性に関して異なる。無脊椎動物Ｐｏｌθは、脊椎動物Ｐｏｌθと比較してより小さい挿入ループを含有する。さもなければ、これらのポリメラーゼのポリメラーゼドメインは、配列が非常に類似している。Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓＰｏｌθのポリメラーゼドメインを精製し、そしてその末端トランスフェラーゼ活性を図２９のヒトＰｏｌθと比較した。その結果は、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ ＰｏｌθはＭｎ２＋によって刺激されるターミナルトランスフェラーゼ活性も示すことを示す。したがって、脊椎動物Ｐｏｌθ及び無脊椎動物Ｐｏｌθの両方は、ロバストなターミナルトランスフェラーゼ活性を示し、且つ、基礎及び応用研究のため、ならびに商業的バイオテクノロジー及び合成生物学用途のための様々なタイプのヌクレオチド及びヌクレオチド類似体で核酸の３’末端を改変するために使用することができる。
次に、ＰｏｌθがＲＮＡの効率的な伸長が可能かどうかを調べた。図３０は、ヒトＰｏｌθが、反応緩衝液中に存在するＭｎ２＋を有する最適条件下で長さ３４ｎｔの比較的長いＲＮＡ基質の３’末端にｄＮＭＰを効率的に転写させることを示す。
いくつかのバイオテクノロジー及び研究の用途では、ヌクレオチド類似体５−ブロモ−２’−デオキシウリジン一リン酸によるＤＮＡの修飾が必要である。図３１において、ヒトＰｏｌθは、反応緩衝液中に存在するＭｎ２＋を有する最適な緩衝条件下で、複数の５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−一リン酸をｓｓＤＮＡの３’末端に効率的に転写することが示されている。
本明細書で引用した各特許、特許出願及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して開示されたが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者によって本発明の他の実施形態及び変形が考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態及び同等の変形のすべてを含むと解釈されることが意図される。

Claims (29)

  1. 基質を用いて核酸の３’末端を改変する方法であって、
    Ａファミリーポリメラーゼ、基質、核酸及び反応溶液を含む混合物を形成するステップであって、前記反応溶液が少なくとも１つの二価金属を含むステップと、
    前記混合物をインキュベートするステップと、
    ３’末端修飾核酸を単離するステップと、
    を含む方法。
  2. 前記核酸が、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ、部分ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ及びテロメアｓｓＤＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＡファミリーポリメラーゼがＰｏｌθ又はその活性断片である、請求項１に記載の方法。
  4. ＰｏｌθがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記基質が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、修飾ヌクレオチド、又はそれらのいずれの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  6. 標識ｄＮＴＰが、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、ビオチン−１６ＡＡ−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−５−ｄＣＴＰ、シアニン３−ＡＡ−ＵＴＰ、４−チオ−ＵＴＰ、ビオチン−１６−ＡＡＣＴＰ、ガンシクロビル三リン酸、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−アデノシン−５’−三リン酸、及び５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記二価金属が、マンガン（Ｍｎ２＋）、コバルト（Ｃｏ２＋）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記二価金属が約１ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記二価金属が約５ｍＭの濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記反応溶液が、グリセロール、非イオン性界面活性剤、及び緩衝液をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記反応溶液中の前記グリセロールの濃度が２０％以下である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記反応溶液中のグリセロールの前記濃度が１０％である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記非イオン性界面活性剤がＮＰ−４０である、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記非イオン性界面活性剤の濃度が１％未満である、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記非イオン性界面活性剤の前記濃度が０．１％である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記緩衝液がＭＥＳ／ＴＲＩＳであり、且つ、ＭＥＳ／ＴＲＩＳが約２０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在する、請求項１０に記載の方法。
  17. 前記緩衝液のｐＨが６．５〜８．８である、請求項１０に記載の方法。
  18. 前記緩衝液の前記ｐＨが８．２である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記混合物をインキュベートするステップが、前記混合物を少なくとも２時間インキュベートすることである、請求項１に記載の方法。
  20. 前記混合物をインキュベートするステップが、前記混合物を２５℃〜４２℃でインキュベートすることである、請求項１に記載の方法。
  21. 前記混合物をインキュベートするステップが、前記混合物を４２℃でインキュベートすることである、請求項２０に記載の方法。
  22. 基質を用いて核酸の３’末端を改変するためのキットであって、Ａファミリーポリメラーゼ及び反応溶液を含むキット。
  23. 前記基質をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
  24. 前記ＡファミリーポリメラーゼがＰｏｌθである、請求項２２に記載のキット。
  25. 前記反応溶液が、５ｍＭのＭｎ２＋、２０ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ８．２、１０％のグリセロール、０．０１％のＮＰ−４０及び０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む、請求項２２に記載のキット。
  26. 核酸のデノボ(de novo)合成の方法であって、
    Ａファミリーポリメラーゼ、少なくとも１つの核酸塩基、及び反応溶液を含む混合物を形成するステップであって、前記反応溶液が少なくとも１つの二価金属を含むステップと、
    前記混合物をインキュベートするステップと、
    核酸を単離するステップと、
    を含む方法。
  27. 前記ＡファミリーポリメラーゼがＰｏｌθである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記少なくとも１つの核酸塩基が、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びそれらのいずれの組み合わせから選択される、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記少なくとも１つの二価金属がＭｎ２＋である、請求項２６に記載の方法。
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