KR102430323B1 - 전하-태그 뉴클레오타이드 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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일루미나, 싱가포르 피티이 엘티디
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Abstract

폴리머라제에 의해 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상보적인 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥으로 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서, 폴리머라제는 테더에 의해 고체 지지체 전도성 채널에 테더링되며, 표지된 뉴클레오타이드는 화학식 I의 화합물이다:
Figure 112021128458083-pat00107

Description

전하-태그 뉴클레오타이드 및 이의 사용 방법{Charge-Tagged Nucleotides and Methods of Use thereof}
본 출원은 2018년 2월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 No. 62/710,327, 2018년 2월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 No. 62/710,333, 2018년 2월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 No. 62/710,362 및 2018년 2월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 No. 62/710,461에 대한 우선권을 주장한다; 모든 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 전하-태그 뉴클레오타이드 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
현재 시퀀싱 플랫폼의 대부분은 검출을 위해 "합성에 의한 시퀀싱(SBS)" 기술 및 형광 기반 방법을 사용한다. 보다 비용 효율적이고 신속하며 편리한 시퀀싱 및 핵산 검출을 가능하게 하는 대안적인 시퀀싱 방법이 SBS에 대한 보완으로서 바람직하다. 전하 기반 시퀀싱은 매력적인 접근법이다.
현재 합성에 의한 시퀀싱(SBS) 기술은 두 위치: 1) 데옥시리보오스의 3' 하이드록실(3'-OH) 및 2) 피리미딘의 5 위치 또는 질소성 염기(A, T, C, G)의 퓨린의 7 위치에서 변형된 뉴클레오타이드를 사용한다. 3'-OH 기는 아지도메틸기로 차단되어 가역적 뉴클레오타이드 터미네이터를 생성한다. 이는 단일 뉴클레오타이드의 첨가 후 추가 신장을 방지할 수 있다. 질소성 염기 각각은 단일 염기 혼입을 식별하는 형광 판독 값을 제공하기 위해 형광단으로 개별적으로 변형된다. 이어서, 3'-OH 차단기와 형광단이 제거되고 사이클이 반복된다.
변형된 뉴클레오타이드의 현재 비용은 데옥시리보스의 3'-OH 및 질소성 염기 둘 모두를 변형시키는 합성 과제로 인해 높을 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드의 비용을 감소시키는 몇 가지 가능한 방법이 있다. 하나의 방법은 판독 라벨을 질소성 염기 대신 5'-말단 포스페이트로 이동시키는 것이다. 한 예에서, 이것은 별도의 절단 단계에 대한 필요성을 제거하고 들어오는 뉴클레오타이드의 실시간 검출을 허용한다. 혼입 동안, 태그와 함께 피로포스페이트는 신장 과정의 부산물로서 방출되므로, 절단 가능한 연결이 관여되지 않는다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
본 발명에 제공된 예는 폴리머라제에 의해 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥에 혼입된 뉴클레오타이드를 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 조성물을 포함한다. 본 발명에 제공된 한 예는 이러한 혼입 동안 하전된 태그를 갖는 뉴클레오타이드, 및 이러한 하전된 태그를 갖는 이러한 뉴클레오타이드의 화합물을 전도성 채널로 검출하는 방법이다. 한 예는 포스포다이에스터기, 아미노산, 덴드론 구조, 및 전하 밀도를 향상시키는 다른 구조적 구조를 포함하는 전하 태그를 갖는 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드를 향상된 전하 밀도를 갖는 전하 태그에 연결하는 방법, 및 향상된 전하 밀도를 갖는 전하 태그를 갖는 뉴클레오타이드를 사용하는 방법을 제공한다.
한 양태에서, 폴리머라제에 의해 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상보적인 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥으로 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서, 폴리머라제는 테더에 의해 고체 지지체 전도성 채널에 테더링되며, 표지된 뉴클레오타이드는 화학식 I의 화합물이다:
Figure 112021128458083-pat00001
n은 3 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 10의 정수이고, t는 0 내지 50의 정수이며, X1은 직접 결합, C1-C10 알킬, C1-C10 옥사알킬, C1-C10 티아알킬 또는 C1-C10 아자알킬이고, X2는 C1-C20 알킬이며, 선택적으로 하나 이상의 개별 CH2 잔기는 하나 이상의 펩타이드 결합 및 (-O-CH2-CH2-)a로 치환되며, 여기서 a는 1 내지 24의 정수이고, X3은 직접 결합 또는 올리고뉴클레오타이드이며, 여기서 표지가 전도성 채널에 근접할 때 올리고뉴클레오타이드가 테더의 수용체 영역에 혼성화하고, F1은 형광단 및 직접 결합으로부터 선택되고 F2는 존재하지 않거나 형광단이고,
A는
Figure 112021128458083-pat00002
또는 아마이드 결합이고
Y는
Figure 112021128458083-pat00003
및
Figure 112021128458083-pat00004
로부터 선택되고, q는 1 내지 100의 정수이고,
B는 아미노산, 뉴클레오타이드,
Figure 112021128458083-pat00005
로부터 선택되며, 여기서 R은 Y 및 수소, 및 덴드론으로부터 선택되고; B가 덴드론인 경우 q는 1이고, q 수의 B는 전하 및 전하 밀도를 가지며, 전도성 채널은 혼입 동안 표지된 뉴클레오타이드를 검출하는 것이다.
한 예에서, 전하는 약 -100e 내지 약 +100e이다. 다른 예에서, 전하 밀도는 입방 나노미터당 약 -100e 내지 입방 나노미터당 약 +100e이다. 또 다른 예에서, 전하는 약 -200e 내지 약 +200e이다. 또 다른 예에서, 전하 밀도는 입방 나노미터당 약 -200e 내지 입방 나노미터당 약 +200e이다.
추가의 예에서, q 수의 B는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 분지형 폴리뉴클레오타이드 및 하나 이상의 헤어핀 루프로부터 선택된다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 2개 내지 5개의 헤어핀 루프를 포함한다.
다른 예에서, q 수의 B는 폴리펩타이드를 포함한다. 또 다른 예에서, 폴리펩타이드는 분지형 폴리펩타이드, 코일형 폴리펩타이드 및 코일형 코일 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 예에서, B는 아미노산을 포함하고 q 수의 B의 하나 이상은 메틸리신, 다이메틸리신 또는 트라이메틸리신을 포함한다.
다른 예에서, B는 하나 이상의 구조 반복 단위 및 복수의 말단 단위를 포함하는 z 세대의 덴드론이고, 여기서 z는 1 내지 6의 정수이며, 구조 말단 단위는 다음 중에서 선택된다:
Figure 112021128458083-pat00006
및
Figure 112021128458083-pat00007
여기서 p1은 1 내지 3의 정수이며, 여기서 p1-CH2-기 중 임의의 하나 이상은 임의로 1 내지 3개의 -O-CH2-CH2-기로 대체되고, p2는 1 내지 3의 정수이며, 여기서 p2-CH2-기 중 임의의 하나 이상은 임의로 1 내지 3개의 -O-CH2-CH2-기로 대체되고, 말단기는 카복실산, 술폰산, 포스폰산, 스퍼미닐기, 아미노기 및 4차 암모늄기로부터 선택된다.
또 다른 예에서, A는 연결 반응을 포함하는 반응에 의해 형성되었고, 연결 반응은 아자이드-알카인 구리-보조 클릭(click) 반응, 테트라진-트랜스-사이클로옥텐 결찰, 아자이드-다이벤조사이클로옥타인기 무 구리 클릭 반응 및 티올-말레이미드 접합으로부터 선택된다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 복수의 표지된 뉴클레오타이드를 연속적으로 혼입하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 복수의 표지된 뉴클레오타이드 각각의 전하는 각각의 Y 및 임의의 다른 것의 Y가 서로 상이할 때 복수의 표지된 뉴클레오타이드 중 어느 하나의 전하와 상이하다. 추가의 예에서, 상기 방법은 전도성 채널에 의해 검출된 전하에 기초하여 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥에 혼입된 하나 이상의 표지된 폴리뉴클레오타이드의 Y를 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 예에서, X2는 (-O-CH2-CH2-)a이고, 여기서 a는 1 내지 24의 정수이다. 한 예에서, a는 24이다. 다른 예에서, a는 12이다. 다른 예에서, a는 8이다. 또 다른 예에서, a는 4이다.
다른 양태에서, 폴리머라제에 의해 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상보적인 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥으로 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서, 폴리머라제는 테더에 의해 고체 지지체 전도성 채널에 테더링되며, 표지된 뉴클레오타이드는 화학식 I의 화합물이다:
Figure 112021128458083-pat00008
n은 3 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 10의 정수이고, t는 0 내지 50의 정수이며, X1은 직접 결합, C1-C10 알킬, C1-C10 옥사알킬, C1-C10 티아알킬 또는 C1-C10 아자알킬이고, X2는 C1-C20 알킬이며, 선택적으로 하나 이상의 개별 CH2 잔기는 하나 이상의 펩타이드 결합 및 (-O-CH2-CH2-)a로 치환되며, 여기서 a는 1 내지 24의 정수이고, X3은 직접 결합 또는 올리고뉴클레오타이드이며, 여기서 표지가 전도성 채널에 근접할 때 올리고뉴클레오타이드가 테더의 수용체 영역에 혼성화하고, F1은 형광단 및 직접 결합으로부터 선택되고 F2는 존재하지 않거나 형광단이고,
A는
Figure 112021128458083-pat00009
또는 아마이드 결합이고
Y는
Figure 112021128458083-pat00010
및
Figure 112021128458083-pat00011
로부터 선택되고, q는 1 내지 100의 정수이고,
B는 아미노산을 포함하며, q 수의 B는 전하 및 전하 밀도를 가지며, 전도성 채널은 혼입 동안 표지된 뉴클레오타이드를 검출하는 것이다.
한 예에서, 전하는 약 -100e 내지 약 +100e이다. 다른 예에서, 전하 밀도는 입방 나노미터당 약 -100e 내지 입방 나노미터당 약 +100e이다. 또 다른 예에서, 전하는 약 -200e 내지 약 +200e이다. 또 다른 예에서, 전하 밀도는 입방 나노미터당 약 -200e 내지 입방 나노미터당 약 +200e이다.
추가의 예에서, q 수의 B는 폴리펩타이드를 포함한다. 또 다른 예에서, 폴리펩타이드는 분지형 폴리펩타이드, 코일형 폴리펩타이드 및 코일형 코일 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 예에서, B는 아미노산을 포함하고 q 수의 B의 하나 이상은 메틸리신, 다이메틸리신 또는 트라이메틸리신을 포함한다.
또 다른 예에서, A는 연결 반응을 포함하는 반응에 의해 형성되었고, 연결 반응은 아자이드-알카인 구리-보조 클릭 반응, 테트라진-트랜스-사이클로옥텐 결찰, 아자이드-다이벤조사이클로옥타인기 무 구리 클릭 반응 및 티올-말레이미드 접합으로부터 선택된다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 복수의 표지된 뉴클레오타이드를 연속적으로 혼입하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 복수의 표지된 뉴클레오타이드 각각의 전하는 각각의 Y 및 임의의 다른 것의 Y가 서로 상이할 때 복수의 표지된 뉴클레오타이드 중 어느 하나의 전하와 상이하다. 추가의 예에서, 상기 방법은 전도성 채널에 의해 검출된 전하에 기초하여 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥에 혼입된 하나 이상의 표지된 폴리뉴클레오타이드의 Y를 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 예에서, X2는 (-O-CH2-CH2-)a이고, 여기서 a는 1 내지 24의 정수이다. 한 예에서, a는 24이다. 다른 예에서, a는 12이다. 다른 예에서, a는 8이다. 또 다른 예에서, a는 4이다.
또 다른 양태에서, 폴리머라제에 의해 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상보적인 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥으로 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서, 폴리머라제는 테더에 의해 고체 지지체 전도성 채널에 테더링되며, 표지된 뉴클레오타이드는 화학식 I의 화합물이다:
Figure 112021128458083-pat00012
n은 3 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 10의 정수이고, t는 0 내지 50의 정수이며, X1은 직접 결합, C1-C10 알킬, C1-C10 옥사알킬, C1-C10 티아알킬 또는 C1-C10 아자알킬이고, X2는 C1-C20 알킬이며, 선택적으로 하나 이상의 개별 CH2 잔기는 하나 이상의 펩타이드 결합 및 (-O-CH2-CH2-)a로 치환되며, 여기서 a는 1 내지 24의 정수이고, X3은 직접 결합 또는 올리고뉴클레오타이드이며, 여기서 표지가 전도성 채널에 근접할 때 올리고뉴클레오타이드가 테더의 수용체 영역에 혼성화하고, F1은 형광단 및 직접 결합으로부터 선택되고 F2는 존재하지 않거나 형광단이고,
A는
Figure 112021128458083-pat00013
또는 아마이드 결합이고
Y는
Figure 112021128458083-pat00014
및
Figure 112021128458083-pat00015
로부터 선택되고, q는 1 내지 100의 정수이고,
B는 뉴클레오타이드,
Figure 112021128458083-pat00016
로부터 선택되며, 여기서 R은 Y 및 수소로부터 선택되고, 전도성 채널은 혼입 동안 표지된 뉴클레오타이드를 검출하는 것이다.
한 예에서, 전하는 약 -100e 내지 약 +100e이다. 다른 예에서, 전하 밀도는 입방 나노미터당 약 -100e 내지 입방 나노미터당 약 +100e이다. 또 다른 예에서, 전하는 약 -200e 내지 약 +200e이다. 또 다른 예에서, 전하 밀도는 입방 나노미터당 약 -200e 내지 입방 나노미터당 약 +200e이다.
추가의 예에서, q 수의 B는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 분지형 폴리뉴클레오타이드 및 하나 이상의 헤어핀 루프로부터 선택된다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 2개 내지 5개의 헤어핀 루프를 포함한다.
또 다른 예에서, A는 연결 반응을 포함하는 반응에 의해 형성되었고, 연결 반응은 아자이드-알카인 구리-보조 클릭 반응, 테트라진-트랜스-사이클로옥텐 결찰, 아자이드-다이벤조사이클로옥타인기 무 구리 클릭 반응 및 티올-말레이미드 접합으로부터 선택된다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 복수의 표지된 뉴클레오타이드를 연속적으로 혼입하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 복수의 표지된 뉴클레오타이드 각각의 전하는 각각의 Y 및 임의의 다른 것의 Y가 서로 상이할 때 복수의 표지된 뉴클레오타이드 중 어느 하나의 전하와 상이하다. 추가의 예에서, 상기 방법은 전도성 채널에 의해 검출된 전하에 기초하여 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥에 혼입된 하나 이상의 표지된 폴리뉴클레오타이드의 Y를 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 예에서, X2는 (-O-CH2-CH2-)a이고, 여기서 a는 1 내지 24의 정수이다. 한 예에서, a는 24이다. 다른 예에서, a는 12이다. 다른 예에서, a는 8이다. 또 다른 예에서, a는 4이다.
추가 양태에서, 폴리머라제에 의해 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상보적인 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥으로 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서, 폴리머라제는 테더에 의해 고체 지지체 전도성 채널에 테더링되며, 표지된 뉴클레오타이드는 화학식 I의 화합물이다:
Figure 112021128458083-pat00017
n은 3 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 10의 정수이고, t는 0 내지 50의 정수이며, X1은 직접 결합, C1-C10 알킬, C1-C10 옥사알킬, C1-C10 티아알킬 또는 C1-C10 아자알킬이고, X2는 C1-C20 알킬이며, 선택적으로 하나 이상의 개별 CH2 잔기는 하나 이상의 펩타이드 결합 및 (-O-CH2-CH2-)a로 치환되며, 여기서 a는 1 내지 24의 정수이고, X3은 직접 결합 또는 올리고뉴클레오타이드이며, 여기서 표지가 전도성 채널에 근접할 때 올리고뉴클레오타이드가 테더의 수용체 영역에 혼성화하고, F1은 형광단 및 직접 결합으로부터 선택되고 F2는 존재하지 않거나 형광단이고,
A는
Figure 112021128458083-pat00018
또는 아마이드 결합이고
Y는
Figure 112021128458083-pat00019
및
Figure 112021128458083-pat00020
로부터 선택되고, q는 1이고, B는 덴드론을 포함하며, B는 전하 및 전하 밀도를 가지며, 전하 센서는 혼입 동안 표지된 뉴클레오타이드를 검출하는 것이다.
한 예에서, 전하는 약 -100e 내지 약 +100e이다. 다른 예에서, 전하 밀도는 입방 나노미터당 약 -100e 내지 입방 나노미터당 약 +100e이다. 또 다른 예에서, 전하는 약 -200e 내지 약 +200e이다. 또 다른 예에서, 전하 밀도는 입방 나노미터당 약 -200e 내지 입방 나노미터당 약 +200e이다.
다른 예에서, B는 하나 이상의 구조 반복 단위 및 복수의 말단 단위를 포함하는 z 세대의 덴드론이고, 여기서 z는 1 내지 6의 정수이며, 구조 말단 단위는 다음 중에서 선택된다:
Figure 112021128458083-pat00021
및
Figure 112021128458083-pat00022
여기서 p1은 1 내지 3의 정수이며, 여기서 p1-CH2-기 중 임의의 하나 이상은 임의로 1 내지 3개의 -O-CH2-CH2-기로 대체되고, p2는 1 내지 3의 정수이며, 여기서 p2-CH2-기 중 임의의 하나 이상은 임의로 1 내지 3개의 -O-CH2-CH2-기로 대체되고, 말단기는 카복실산, 술폰산, 포스폰산, 스퍼미닐기, 아미노기 및 4차 암모늄기로부터 선택된다.
또 다른 예에서, A는 연결 반응을 포함하는 반응에 의해 형성되었고, 연결 반응은 아자이드-알카인 구리-보조 클릭 반응, 테트라진-트랜스-사이클로옥텐 결찰, 아자이드-다이벤조사이클로옥타인기 무 구리 클릭 반응 및 티올-말레이미드 접합으로부터 선택된다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 복수의 표지된 뉴클레오타이드를 연속적으로 혼입하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 복수의 표지된 뉴클레오타이드 각각의 전하는 각각의 Y 및 임의의 다른 것의 Y가 서로 상이할 때 복수의 표지된 뉴클레오타이드 중 어느 하나의 전하와 상이하다. 추가의 예에서, 상기 방법은 전도성 채널에 의해 검출된 전하에 기초하여 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥에 혼입된 하나 이상의 표지된 폴리뉴클레오타이드의 Y를 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 예에서, X2는 (-O-CH2-CH2-)a이고, 여기서 a는 1 내지 24의 정수이다. 한 예에서, a는 24이다. 다른 예에서, a는 12이다. 다른 예에서, a는 8이다. 또 다른 예에서, a는 4이다.
이하에서 더 상세히 논의되는 (이러한 개념이 서로 일치하지 않는 경우) 전술한 개념 및 추가 개념의 모든 조합은 본 발명에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
본 발명의 이들 및 다른 특징, 양태 및 이점은 첨부 도면을 참조하여 다음의 상세한 설명을 읽을 때 더 잘 이해될 것이다.
도 1은, 한 예에서, 테더를 통해 전도성 채널에 부착된 폴리머라제를 나타낸다.
도 2는, 한 예에서, 핵산 테더를 통해 전도성 채널에 부착되고 전하 또는 전하 검출기에 근접한 것에 기초하여 구별될 수 있는 뉴클레오타이드에 결합된 폴리머라제를 도시한다.
도 3은, 한 예에서, 핵산 테더를 통해 전도성 채널에 부착되고 전하에 기초하여 구별될 수 있는 뉴클레오타이드에 결합된 폴리머라제를 나타낸다.
도 4는, 한 예에서, 전도성 채널에 테더링된 폴리머라제를 도시하며, 여기서 전도성 채널은 또한 이 예에서 뉴클레오타이드에 대해 링커 내의 특이성 영역에 결합할 수 있는 복수의 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 혼성화)를 포함하는 수용체 영역에 부착된다.
도 5는 본 발명에 따른 전하 태그를 갖는 뉴클레오타이드 유사체의 비 제한적인 예를 도시한다. 뉴클레오타이드 유사체는 뉴클레오타이드 폴리포스페이트(예를 들어, dT 헥사포스페이트와 같은), 특이성 영역을 임의로 포함하는 링커 영역, 및 전하 태그를 포함할 수 있다. 이 비 제한적인 예에서, 링커는 아자이드-알카인 클릭 화학에 의해 형성된 공유 부착물을 포함한다. 아래에 추가로 설명되는 바와 같이, 특이성 영역은 링커에 포함될 수 있고 폴리머라제에 의한 뉴클레오타이드 혼입 동안 전도성 채널과의 전하 태그 근접성을 촉진하는 것을 도울 수 있다.
도 6은, 한 예에서, 표지의 올리고뉴클레오타이드 모이어티의 포스포다이에스터 골격에서 음으로 하전된 산소를 갖는 뉴클레오타이드 표지를 도시한다.
도 7은, 한 예에서, 전도성 채널을 사용하여 검출될 수 있는 분지형 전하 태그를 제작하기 위한 예시적인 멀티플라이어 유닛을 도시한다.
도 8은, 한 예에서, 핵산 서열(일반적으로 10 N의 서열로 나타냄)을 갖는 테더를 통해 폴리머라제(Pol)에 부착된 전도성 채널을 도시한다. N 뉴클레오타이드는 전하 태그에 부착된 링커(예를 들어, 특이성 영역)에서 뉴클레오타이드에 상보적인 보편적 염기 및 염기로부터 선택된다.
도 9는, 한 예에서, 수용체 영역, 이 예에서, 핵산 서열(일반적으로 ABC 영역을 갖는 7N의 서열로 표시됨; 도시되지 않은 전하 태그)을 갖는 테더를 통해 폴리머라제(Pol)에 부착된 전도성 채널을 도시한다. 폴리머라제는 표적 핵산 및 표지된 CTP 유사체에 복합체화된다. CTP 유사체 상의 링커는 이노신(I)을 갖는 핵산 영역 및 테더 상의 수용체 영역(ABC)에 혼성화되는 특이성 영역(A'B'C')을 포함한다.
도 10은, 한 예에서, 테더의 수용체 영역과 각각의 링커의 특이성 영역을 통한 4개의 상이한 뉴클레오타이드 유사체 각각의 결합으로 인해 전도성 채널에 대한 4개의 상이한 위치 상태의 테더링된 폴리머라제를 도시한다. 이 예시적인 예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 ATP, GTP, CTP 및 TTP로 식별되지만, 임의의 뉴클레오타이드 유사체가 사용될 수 있다(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드 유사체가 사용될 수 있다). 각각의 뉴클레오타이드 유사체는 다른 3개의 뉴클레오타이드 유사체와 동일한 길이의 올리고뉴클레오타이드 모이어티를 갖지만, 각각의 뉴클레오타이드 유사체는 다른 뉴클레오타이드 유사체 링커가 결합하는 영역과 비교하여 테더에서 수용체 영역의 상이한 영역에 결합하는 특이적 결합 서열을 갖는다. 이 예에서 올리고뉴클레오타이드 또는 다른 예에서 다른 포스포다이에스터 함유 전하 태그인 전하 태그는 뉴클레오타이드 반대편의 링커의 말단에서 혼성화 영역 외부로 연장된다.
도 11은, 한 예에서, 폴리머라제 phi29에 의한 포스포다이에스터 기반 전하 태그의 단일 뉴클레오타이드 혼입을 보여준다.
도 12a-12d는 본 발명의 양태에 따른 펩타이드 기반 전하 태그의 예를 도시한다.
도 13a, 13b 및 13c는, 한 예에서, 전하 태그로서 구조화된 올리고뉴클레오타이드를 갖는 변형된 뉴클레오타이드의 몇몇 구조를 도시한다. 그로부터 연장된 전하 태그를 갖는 변형된 뉴클레오타이드가 도시되며, 여기서 전하 태그는 수용체 영역에 결합된 특이성 영역("Glue"로 표시됨)을 포함한다. 도 13a는 스템 앤 루프 형상의 전하 태그를 도시하고 도 13c는 클로버잎형 전하 태그를 도시한다.
도 14a 및 14b는 십자형 전하 태그의 한 예를 도시한다. 도 14a는 할러데이(Holliday) 구조-유사 구성으로 함께 결합된 4개의 올리고 뉴클레오타이드 및 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 오버행을 포함하는 십자형 전하 태그를 도시한다. 도 14b는 펩타이드 핵산 서열이 올리고뉴클레오타이드 오버핸드에 결합되고 펩타이드 핵산 서열의 말단으로부터 연장되는 코일형 폴리펩타이드 구조에 결합된 도 14a로부터의 구조를 도시한다. 이 예에서, 폴리펩타이드 서열은 양전하를 갖는다.
도 15는 코일형 폴리펩타이드 및 이들의 어셈블리를 포함하는 폴리펩타이드 전하 태그의 여러 예를 도시한다.
도 16은 코일형- 코일 형태로 배열된 폴리펩타이드를 포함하는 전하 태그의 예를 도시한다.
도 17a 및 17b는 분지형 덴드론형 구조를 갖는 포스포다이에스터 기반 전하 태그의 예를 도시한다.
도 18a 및 18b는 분지형 펩타이드 기반 전하 태그의 예를 도시한다.
도 19a 및 19b는 본 발명의 양태에 따른 스퍼민 기반 전하 태그의 예를 도시한다.
본 발명의 실시예는 일반적으로 핵산 시퀀싱 절차에서 검출된 뉴클레오타이드 혼입 이벤트를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 고 처리량 방식으로 긴 시퀀싱 판독을 허용하는 것과 같이, 전하 차이에 기초하여 뉴클레오타이드의 차등 인식을 제공하는 개선된 검출 시스템에 대한 필요가 존재한다. 본 발명에 제시된 실시예는 이러한 요구를 만족시키고 다른 이점도 제공할 수 있다.
상이한 검출 시스템과 함께 사용하기 위해 상이한 표지를 갖는 뉴클레오타이드 상의 값 비싸고 감광성인 형광 표지가 본 발명에 개시된다. 종래의 형광 라벨의 검출은 검출 기기의 크기를 증가시키는 레이저 및 검출 광학장치와 같은 고가의 하드웨어를 수반할 수 있다. 또한, 더 강력한 소프트웨어는 생성되는 수많은 정보를 디코드하는 데 사용된다. 중요하게는, 본 발명에 개시된 바와 같이, 고가의 형광단이 필요하지 않다. 형광 표지를 전하 표지로 교체함으로써, 전하는 시스템에서 전류를 모니터하는 전도성 채널에 의해 검출될 수 있다. 이것은 "실시간" 시퀀싱이 수행될 수 있게 하고 각각의 뉴클레오타이드 혼입의 사이클 시간을 감소시킴으로써 더 빠른 처리 시간을 달성할 수 있는 가능성을 갖는다.
"실시간" 시퀀싱을 가능하게 함으로써, 한 실시예에서 3'-OH에서의 차단기는 수반되지 않을 것이다. 이것은 더 적은 합성 단계가 수반됨으로써 변형된 뉴클레오타이드의 비용을 낮춘다. 추가의 이점은 폴리머라제가 화학적으로 변형된 부피가 큰 3' 보호기와 비교하여 천연 시스템에 더 가까운 3' OH를 갖는 뉴클레오타이드를 혼입하는데 더 적합하다는 것이다.
전하를 포함하는 변형된 뉴클레오타이드를 검출하기 위한 전도성 채널은 주변 전기장에 반응할 수 있다. 이 필드는 전하를 갖는 변형된 뉴클레오타이드를 전도성 채널의 표면에 근접하게 위치시킴으로써 조절된다. 용액 내의 염 또는 다른 이온이 전도성 채널에 의한 검출로부터 전하를 차단할 수 있는 경우와 같이, 일부 경우에 전하 태그를 표면에 근접시키는 것이 중요할 수 있다. 특징 선별 길이는 디바이(Debye) 길이라고 하며, 이 길이 이상에서 전도성 채널은 전하를 감지하지 못할 수 있다.
변형된 뉴클레오타이드에 포함된 전하는 -200e 내지 +200e 사이의 임의의 위치일 수 있으며, 이는 선형으로 완전히 신장될 때 160 옹스트롬을 초과할 수 있는 반면, 전도성 채널의 디바이 구역은 약 1nm일 수 있다. 따라서, 전도성 채널에 의한 검출을 촉진하기 위해 뉴클레오타이드의 전하 운반 변형의 구조화가 바람직할 것이다.
본 발명에서 사용된 용어는 달리 명시되지 않는 한 일반적인 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다. 본 발명에서 사용된 여러 용어 및 그 정의의 예는 다음과 같다.
본 발명에 사용된 용어 "어레이"는 전도성 채널 또는 분자가 그들의 상대 위치에 따라 서로 구별될 수 있도록 하나 이상의 고체상 기판에 부착된 전도성 채널 또는 분자 집단을 지칭한다. 어레이는 고체상 기판상의 상이한 어드레스 지정 가능 위치(예를 들어, 상이한 전도성 채널)에 각각 위치한 상이한 분자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 어레이는 각각 상이한 분자를 보유하는 개별 고체상 기판을 포함할 수 있으며, 여기서 상이한 프로브 분자는 고체상 기판이 부착된 표면상의 고체상 기판의 위치에 따라 또는 유체 스트림과 같은 액체에서 고체상 기판의 위치에 따라 식별될 수 있다. 어레이의 분자는 핵산 프라이머, 핵산 프로브, 핵산 주형 또는 폴리머라제 및 엑소뉴클레아 제와 같은 핵산 효소일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "부착된"은 서로 접합, 고정, 접착, 연결 또는 결합되는 두 가지의 상태를 의미한다. 예를 들어, 폴리머라제와 같은 반응 성분은 공유 또는 비공유 결합에 의해 전도성 채널과 같은 고체상 성분에 부착될 수 있다. 공유 결합은 원자 사이의 전자 쌍의 공유를 특징으로 한다. 비 공유 결합은 전자 쌍의 공유를 수반하지 않는 화학 결합이며, 예를 들어, 수소 결합, 이온 결합, 반데르발스 힘, 친수성 상호 작용 및 소수성 상호 작용을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "전기 전도성 채널"은 표면 또는 주변 전기장에서의 섭동을 전기 신호로 변환하는 검출 장치의 일부를 의미하는 것으로 의도된다. 전도성 채널은 전기 전도성 채널일 수 있다. 예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같이, 전기 전도성 채널(5)은 반응 성분(예를 들어, 표지된 뉴클레오타이드)의 도착 또는 출발을 전기 신호로 변환할 수 있다. 본 발명에 개시된 예에서, 전기 전도성 채널(5)은 또한 2개의 반응 성분(템플레이트 핵산 및 표지된 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드) 사이의 상호 작용을 표지된 뉴클레오타이드의 산화 환원-활성 전하 태그와의 상호 작용을 통해 검출 가능한 신호로 변환할 수 있다.
전기 전도성 채널(5)은 전도성 채널(2)의 채널일 수 있다. 전도성 채널(2)은 소스 및 드레인 단자(S, D) 및 단자(S, D)를 연결하는 채널(5)을 포함할 수 있다. 채널은 임의의 적합한 기하학적 구조 - 예를 들어, 튜브, 와이어, 플레이트 등을 가질 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "전도성 채널"은 표면 또는 주변 전기장에서의 섭동을 전기 신호로 변환하는 검출 장치를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 전도성 채널은 반응 성분의 도착 또는 출발을 전기 신호로 변환할 수 있다. 전도성 채널은 또한 2개의 반응 성분 사이의 상호 작용, 또는 단일 반응 성분의 형태적 변화를 전기 신호로 변환할 수 있다. 예시적 전도성 채널은 탄소 나노튜브(CNT), 단일 벽 탄소 나노튜브(SWNT) 기반 FET, 실리콘 나노와이어(SiNW) FET, 그래핀 나노리본 FET(및 MoS2, 실리센 등과 같은 2D 재료로 제조된 관련 나노리본 FET), 터널 FET(TFET) 및 가파른 하위임계 슬로프 장치(steep subthreshold slope devices)(예를 들어, Swaminathan et al., Proceedings of the 51st Annual Design Automation Conference on Design Automation Conference, pg 1-6, ISBN: 978-1-4503-2730-5 (2014) and Ionescu et al., Nature 479, 329-337 (2011) 참조; 이의 각각은 전문이 참조로 본 발명에 포함된다)와 같은 전계 효과 트랜지스터(FET)이다. 본 발명의 방법 및 장치에 사용될 수 있는 FET 및 SWNT 전도성 채널의 예는 전문이 참조로 본 발명에 포함된 미국 특허 출원 제2013/0078622 A1호에 개시된다.
단자(S, D)는 임의의 적절한 전도성 재료일 수 있다. 적합한 소스 및 드레인 재료의 예는 코발트, 코발트 실리사이드, 니켈, 니켈 실리사이드, 알루미늄, 텅스텐, 구리, 티타늄, 몰리브덴, 인듐 주석 산화물(ITO), 인듐 주석 산화물, 금, 백금, 탄소 등을 포함한다.
전도성 채널(5)은 산화 환원 활성 전하 태그를 산화 또는 환원시킬 수 있는 임의의 전도성 또는 반 전도성 재료를 포함할 수 있다. 재료는 유기 재료, 무기 재료 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 적합한 채널 재료의 일부 예는 실리콘, 탄소(예를 들어, 유리질 탄소, 그래핀 등), 전도성 폴리머(예를 들어, 폴리피롤, 폴리아닐린, 폴리티오펜, 폴리(4-스티렌설포네이트)로 도핑된 폴리(3,4-에틸렌다이옥시티오펜(PEDOT-PSS) 등), 금속, 생체 분자 등을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 전도성 채널(5)은 또한 나노스케일에서 적어도 하나의 치수(1 nm 내지 1μm 범위)를 갖는 나노구조일 수 있다. 한 예에서, 이 치수는 가장 큰 차원을 의미한다. 예로서, 전기 전도성 채널(5)은 반 전도성 나노구조, 그래핀 나노 구조, 금속성 나노구조 및 전도성 폴리머 나노구조일 수 있다. 나노구조는 다중 벽 또는 단일 벽 나노튜브, 나노와이어, 나노리본 등일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "상이한"은 핵산과 관련하여 사용될 때 핵산이 서로 동일하지 않은 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 의미한다. 둘 이상의 상이한 핵산은 전체 길이에 따라 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 둘 이상의 상이한 핵산은 이들의 길이의 실질적인 부분을 따라 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 상이한 핵산은 둘 이상의 분자에 대해 상이한 표적 뉴클레오타이드 서열 부분을 가질 수 있고, 또한 둘 이상의 분자 상에서 동일한 범용 서열 부분을 가질 수 있다. 용어 "상이한"은 폴리머라제 및 핵산 효소와 같은 다른 분자에 유사하게 적용될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "각각"은 항목들의 집합을 참조할 때 집합 내의 개별 항목을 식별하도록 의도되지만 반드시 집합 내의 모든 항목을 의미하는 것은 아니다. 명시적 공개 또는 문맥이 달리 명시하지 않는 경우 예외가 발생할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "표지"는 반응 성분과 관련하여 사용될 때 검출 가능한 반응 성분 또는 반응 성분의 검출 가능한 모이어티를 의미하는 것으로 의도된다. 유용한 표지는 전도성 채널에서 검출할 수 있는 전하 표지(전하 태그라고도 함)이다. 표지는 검출될 반응 성분(예를 들어, 폴리머라제의 하전된 아미노산)에 고유하거나 표지는 반응 성분에 고유할 수 있다(예를 들어, 비 천연적으로 발생하는 아미노산의 변형). 일부 예에서, 표지는 별도의 기능을 갖는 여러 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표지는 링커 성분(예를 들어 핵산) 및 전하 태그 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "비 천연"은 분자의 모이어티와 관련하여 사용되는 경우, 인간의 기술적 개입에 의해 방해받지 않은 천연 환경 또는 생물학적 시스템에서 분자에 부착되지 않은 잔기를 의미하는 것으로 의도된다. 전형적으로, 비 천연 모이어티는 분자를 비 변형 분자 또는 천연 변형을 갖는 분자와 구조적으로 또는 화학적으로 구별되게 하는 분자의 합성 변형이다. 본 발명에 사용된 용어 "비 천연"은, 과정에 사용된 유사체와 관련하여 사용될 때, 과정이 일어나는 천연 환경에서 발견되지 않는 유사체를 의미하는 것으로 의도된다. 일반적으로, 비 천연 유사체는 유사체가 속하는 부류의 다른 유형의 분자와 구조적으로 또는 화학적으로 구별되는 합성 유사체이다.
본 발명에 사용된 용어 "핵산"은 당업계에서의 사용과 일치하도록 의도되며 천연 발생 핵산 또는 이의 기능적 유사체를 포함한다. 특히 유용한 기능적 유사체는 서열 특이적 방식으로 핵산에 혼성화할 수 있거나 특정 뉴클레오타이드 서열의 복제를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 천연 발생 핵산은 일반적으로 포스포다이에스터 결합을 함유하는 골격을 갖는다. 유사체 구조는 펩타이드 핵산(PNA) 또는 잠금 핵산(LNA)과 같은 당업계에 공지된 다양한 것 중 임의의 것을 포함하는 대안적인 골격 연결을 가질 수 있다. 천연 발생 핵산은 일반적으로 데옥시리보오스 당(예를 들어, 데옥시리보 핵산(DNA)에서 발견됨) 또는 리보오스 당(예를 들어, 리보 핵산(RNA)에서 발견됨)을 갖는다.
핵산은 당업계에 공지된 이들 당 모이어티의 임의의 다양한 유사체를 함유할 수 있다. 핵산은 천연 또는 비 천연 염기를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 천연 데옥시리보 핵산은 아데닌, 티민, 시토신 또는 구아닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 가질 수 있고, 리보 핵산은 우라실, 아데닌, 시토신 또는 구아닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 가질 수 있다. 핵산에 포함될 수 있는 유용한 비 천연 염기는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 사용된 용어 "뉴클레오타이드"는 천연 뉴클레오타이드, 이의 유사체, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 다이데옥시리보뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드로 알려진 다른 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 용어는, 예를 들어 DNA 또는 RNA 가닥에 존재하는 아단위를 식별하기 위해 사용하는 폴리머에 존재하는 단량체 단위를 의미하는 데 사용될 수 있다. 상기 용어는 또한 폴리머에 반드시 존재하지 않는 분자, 예를 들어, 폴리머라제에 의해 주형 의존 방식으로 폴리뉴클레오타이드에 혼입될 수 있는 분자를 의미하는 데 사용될 수 있다. 상기 용어는 예를 들어 5' 탄소 상에 0, 1, 2, 3개 이상의 포스페이트를 갖는 뉴 클레오사이드 단위를 의미할 수 있다. 예를 들어, 테트라포스페이트 뉴클레오타이드, 펜타포스페이트 뉴클레오타이드 및 헥사포스페이트 뉴클레오타이드는 5' 탄소 상에서 6개 초과의 포스페이트, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 포스페이트를 갖는 뉴클레오타이드와 같이 특히 유용할 수 있다. 예시적 천연 뉴클레오타이드는 ATP, UTP, CTP 및 GTP(총칭하여 NTP) 및 ADP, UDP, CDP 및 GDP(총칭하여 NDP), 또는 AMP, UMP, CMP 또는 GMP(총칭하여 NMP) 또는 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP(총칭하여 dNTP) 및 dADP, dTDP, dCDP 및 dGDP(총칭하여 dNDP) 및 dAMP, dTMP, dCMP 및 dGMP(dNMP)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적 뉴클레오타이드는 예외 없이, 임의의 NMP, dNMP, NDP, dNDP, NTP, dNTP, 및 X는 2 내지 10의 수를 나타내는 기타 NXP 및 dNXP(총칭하여 NPP)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 뉴클레오타이드 유사체로도 지칭되는 비 천연 뉴클레오타이드는 천연 생물학적 시스템에 존재하지 않거나 또는 천연 환경, 예를 들어, 폴리머라제를 발현하는 비 재조합 세포에서 폴리머라제에 의해 폴리뉴클레오타이드에 실질적으로 혼입되지 않는 것들을 포함한다. 특히 유용한 비 천연 뉴클레오타이드는 다른 뉴클레오타이드, 예컨대 동일한 왓슨-크릭과 염기쌍을 이루는 천연 뉴클레오타이드가 폴리머라제에 의해 가닥에 혼입되는 속도보다 실질적으로 더 빠르거나 느린 속도로 폴리머라제에 의해 폴리뉴클레오타이드 가닥에 혼입되는 것들을 포함한다. 예를 들어, 비 천연 뉴클레오타이드는, 천연 뉴클레오타이드의 혼입 속도와 비교할 때 적어도 2배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 1000배, 10000배 이상 상이하다. 비 천연 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드에 혼입된 후에 추가로 연장될 수 있다. 예는 3' 하이드록실을 갖는 뉴클레오타이드 유사체 또는 제거되어 뉴클레오타이드 유사체를 혼입하는 폴리뉴클레오타이드의 추가 연장을 허용할 수 있는 3' 위치의 가역적 터미네이터 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다. 사용될 수 있는 가역적 터미네이터 모이어티의 예는, 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,059,096호, 제7,427,673호; 제7,414,116호; 및 제7,057,026호 및 PCT 공개 WO 91/06678 및 WO 07/123744에 기술되며, 이의 각각은 그 전문이 본 발명에 참조로 포함된다. 일부 예에서, 3' 터미네이터 모이어티를 갖거나 3' 하이드록실이 없는 (예를 들어, 다이데옥시뉴클레오타이드 유사체) 뉴클레오타이드 유사체는 뉴클레오타이드 유사체를 혼입하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 연장되지 않는 조건하에서 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일부 예에서, 뉴클레오타이드(들)는 가역적 터미네이터 모이어티를 포함하지 않나, 뉴클레오타이드(들)는 비가역적 터미네이터 모이어티를 포함하지 않거나 뉴클레오타이드(들)는 어떠한 터미네이터 모이어티도 포함하지 않을 것이다. 5' 위치에서 변형된 뉴클레오타이드 유사체도 유용하다.
본 발명에 사용된 용어 "보호 모이어티"는 반응 성분이 특정 반응을 겪지 않도록 반응 성분에 부착된 화합물 또는 이의 일부를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 핵산 분자는 핵산 효소에 결합되어 핵산 분자가 효소의 분해 또는 변형을 야기할 수 있는 처리에 의해 핵산 효소의 분해 또는 변형을 방지할 수 있다. 항체는 또한 반응 성분을 분해, 불활성화 또는 다른 반응으로부터 보호하기 위해 반응 성분에 결합하는 역할을 할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "반응 성분"은 반응에 참여하는 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 예는 반응에 소비되는 반응물, 반응에 의해 생성된 생성물, 반응을 촉진하는 효소와 같은 촉매, 용매, 염, 완충제 및 기타 분자를 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "반발 모이어티"는 공간에서 다른 분자의 점유를 방지 또는 억제하기 위해 또는 공간 근처에서 다른 분자의 병치를 억제하기 위해 공간을 차지할 분자 또는 이의 부분을 의미하는 것으로 의도된다. 반발 모이어티는 입체 배제, 전하 반발, 소수성-친수성 반발 또는 다른 힘을 통해 작용할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "터미네이터 모이어티"는 뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때 뉴클레오타이드가 제 2 뉴클레오타이드에 대한 공유 결합을 형성하는 것을 억제 또는 방지하는 뉴클레오타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, 펜토스 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드의 경우, 터미네이터 모이어티는 뉴클레오타이드의 3' 산소와 제 2 뉴클레오타이드의 5' 포스페이트 사이의 포스포다이에스터 결합의 형성을 방지할 수 있다. 터미네이터 모이어티는 핵산 폴리머에 존재하는 단량체 단위인 뉴클레오타이드의 일부일 수 있거나 터미네이터 모이어티는 유리 뉴클레오타이드(예를 들어, 뉴클레오타이드 트라이포스페이트)의 일부일 수 있다. 뉴클레오타이드의 일부인 터미네이터 모이어티는 가역적일 수 있어서, 뉴클레오타이드 모이어티가 변형되어 뉴클레오타이드가 제 2 뉴클레오타이드에 대한 공유 결합을 형성할 수 있도록 변형될 수 있다. 특정 예에서, 가역적 터미네이터 모이어티와 같은 터미네이터 모이어티는 뉴클레오타이드 유사체의 펜토스 모이어티의 3' 위치 또는 2' 위치에 부착될 수 있다.
아래에 설명되고 청구 범위에 언급된 실시예는 상기 정의를 고려하여 이해될 수 있다.
본 발명은 무엇보다도 핵산 시퀀싱 절차에서 검출된 뉴클레오타이드 혼입 이벤트에 유용한 조성물, 이러한 조성물의 제조 방법 및 이러한 절차에서 이들을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명에 제시된 조성물 및 방법은, 예를 들어, 단일 분자 핵산 시퀀싱 반응, 예컨대 합성에 의한 시퀀싱에 특히 유용하다. 그러나, 본 발명에 제시된 조성물 및 방법은 단일 분자 검출을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다른 적합한 검출 방식에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명에 개시된 바와 같은 조성물이 사용될 수 있는 핵산 시퀀싱을 위한 장치 및 방법은, 예를 들어, 전문이 본 발명에 참조로 포함된 미국 특허 출원 제14/798,762호에 개시되어 있다.
예를 들어, 핵산 시퀀싱 방법은 (a) 고체 지지체 전도성 채널에 테더링된 폴리머라제를 제공하는 단계; (b) 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드를 제공하여, 표지가 전도성 채널에 근접할 때 표지의 존재가 전도성 채널에 의해 검출될 수 있는 단계; 및 (c) 표지된 뉴클레오타이드의 주형 핵산에 상보적인 초기 가닥으로의 혼입을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
핵산 시퀀싱 방법의 일부 실시예에서, 폴리머라제는 전도성 채널에 대해 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1nm 미만의 근접한 거리로 유지된다.
일부 실시예에서, 표지 또는 이의 일부(예를 들어, 전하 태그)는, 예를 들어, 폴리머라제에 의한 혼입 후 뉴클레오타이드로부터 절단될 수 있다.
본 발명에 제공된 바와 같이, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드는 복수의 전하 태그를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드는 각 유형의 뉴클레오타이드에 대한 고유한 전하 태그를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전하 태그를 갖는 뉴클레오타이드는 주형 서열에 따라 폴리머라제에 의해 DNA 가닥을 합성하는 데 사용될 수 있으며, 이 주형 서열은, 예를 들어, 염기 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신을 포함하는 일련의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같은 전하 태그를 보유하는 뉴클레오타이드는 폴리머라제 효소에 의해 주형 서열에 상보적인 일련의 뉴클레오타이드에 혼입될 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 전하 태그를 보유하는 뉴클레오타이드가 혼입됨에 따라, 전도성 채널은 각각의 뉴클레오타이드 종과 특이적이고 차별적으로 관련된 주어진 원자가 및 크기의 전하를 검출할 수 있으며, 성장하는 가닥에 혼입된 연속적인 뉴클레오타이드의 동일성 및 따라서 성장하는 가닥이 상보적인 주형 가닥에 존재하는 뉴클레오타이드의 서열의 기록을 허용한다. 전하 태그는 음전하 태그 또는 양전하 태그일 수 있으며 -175e 내지 +175e, -150e 내지 +150e 또는 -125e 내지 +125e 또는 -100e 내지 +100e, -75e 내지 +75e 또는 -50e 내지 +50e와 같은 -200e 내지 +200e의 전하를 가질 수 있다.
핵산 시퀀싱 방법에 사용되는 전도성 채널은 나노와이어 FET를 포함할 수 있다. 선택적으로, 전도성 채널은 탄소 나노튜브를 포함할 수 있다. 전도성 채널은 전도성 채널 어레이의 일부일 수 있다. 검출 단계는 복수의 혼입 이벤트를 연속적으로 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 제시된 조성물, 장치 및 방법은 긴 핵산 시퀀싱 판독; 빠른 판독; 시퀀싱을 위한 높은 처리 능력; 및 시퀀싱을 위한 확장 가능한 플랫폼을 제공할 수 있다. 일부 예에서, 단일 판독 정확도에서의 임의의 타협은 병렬로 수행되는 판독 수의 처리량을 제공하기 위해 본 발명에 기술된 방법 및 장치의 능력으로 인해 다중 중첩 판독을 수행함으로써 완화될 수 있다.
예시적인 전도성 채널이 도 1에 도시되어 있다. 여기서, 폴리머라제(1)는 뉴클레오타이드가 프라이밍된 DNA 주형(4)에 혼입될 수 있는 반응 부위를 생성한다. 폴리머라제(1)는 테더(3)를 통해 나노와이어 FET(2)에 부착된다. 장치는 단일 분자 감도를 제공한다. 반응 부위에서의 전하 분포의 변화(예를 들어, 폴리머라제 형태 변화, 뉴클레오타이드 혼입, 하전된 태그의 도착 또는 출발, 전도성 채널에 대한 폴리머라제의 근접성 변화 등)는 게이트로 전달되어 검출될 수 있다.
특정 예에서, 본 발명의 장치 또는 방법은 단일-분자 전도성 채널로서 깊게 스케일된(deeply scaled) FinFET 트랜지스터를 사용할 수 있다. FinFET 전도성 채널은 첨단 반도체 제조업체가 이미 개발중인 기술의 혜택을 받는다. 또한, (1) Choi et al, Science, 335, 319 (2012)에 기술된 바와 같이 효소 가공성을 실시간으로 관찰하기 위해 CNT에 리소자임의 고정화에 사용되는 성분, (2) Olsen et al, J. Amer. Chem. Soc., 135, 7885 (2013)에 기술된 바와 같이 CNT 상에 Pol 1 Klenow 단편을 고정시키고 효소 가공성을 실시간으로 관찰하는 데 사용된 성분, (3) Chi et al, NanoLett 13, 625 (2013)에 기술된 바와 같이 단백질 알로스테릭 운동으로 인한 이동 하전 잔류물로서 형질도입 메커니즘을 밝히는 데 사용된 성분을 포함하나 이에 제한되지 않는 이미 공개된 성분이 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 미국 특허 출원 공개공보 제2013/0078622 A1호에 개시된 장치, 장치의 구성 요소 및 방법을 사용할 수 있다. 상기 참고 문헌 각각은 그 전문이 본 발명에 참조로 포함된다.
표지된 뉴클레오타이드의 일부 예는 또한 특이성 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 표지된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드의 포스페이트기에 부착된 연결 분자 또는 링커, 및 링커에 부착된 전하 태그를 포함할 수 있다. 연결 분자 또는 링커는 전도성 채널에 결합된 테더 상의 수용체 영역에 혼성화될 수 있는 특이성 영역을 포함할 수 있다. 예로서, 특이성 영역은 테더 상의 수용체 영역에 일시적으로 부착 또는 결합할 수 있는 임의의 뉴클레오타이드 서열 또는 펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 특이성 영역은 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, 수용체 영역은 뉴클레오타이드의 서열을 포함하여 쌍 결합이 특이성 영역의 서열과 수용체 영역의 뉴클레오타이드 사이에 형성될 수 있다. 이 경우에 쌍 결합은 뉴클레오타이드 사이, 예를 들어 G와 C 잔기 사이, 또는 A와 T 또는 U 잔기 사이의 표준 쌍 결합을 의미한다.
특이성 영역은 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 수용체 영역은 상응하게 뉴클레오타이드의 상보적 서열을 포함할 수 있다. 한 예에서, 폴리머라제가 주형 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 성장하는 폴리뉴클레오타이드 가닥에 혼입시키기 위해 뉴클레오타이드를 수용할 때, 특이성 영역과 수용체 영역은 그들 사이에 쌍 결합을 형성하기 위해 서로 충분히 근접하게 될 수 있다. 특이성 영역과 수용체 영역 사이의 이러한 쌍 결합은 하전된 태그와 전도성 채널 사이의 충분한 근접성을 촉진하여 뉴클레오타이드의 혼입 동안 전도성 채널에 의한 전하 태그의 검출을 촉진할 수 있다.
한 예에서, 특이성 영역은 약 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 6개의 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 특이성 영역은 뉴클레오타이드 서열의 양 측면을 플랭킹하는 이노신(들)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 특이성 영역은 전하 태그의 일부에 포함된다. 예를 들어, 특이성 영역은 전하 태그의 일부와 같이 선형 서열을 따라 서로 분리된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 단편 또는 부분으로 구성될 수 있으며, 여기서 수용체 영역에 대한 결합은 전하 태그에 의해 소정의 3차원 구조의 채택을 허용하면서 특이성 영역의 개별 영역들이 서로 근접하게 유도할 수 있다.
테더와 연관된 표지된 뉴클레오타이드의 예에서, 표지된 뉴클레오타이드와 테더 사이의 특이적 결합 친화력은 비특이적 결합 상호작용에 의해 생성된 약한 친화력과 결합된다. 표지된 뉴클레오타이드는 테더의 일부에 상보적인 특이성 영역을 포함할 수 있다. 이들 영역들 사이의 특이적 결합은 표준 왓슨-크릭 염기쌍 또는 다른 비공유 결합에 기인할 수 있다. 이 예에서, 특이성 영역은 또한 뉴클레오타이드 서열을 플랭킹하는 이노신(I)을 포함할 수 있다. 이노신은 유니버셜 염기이며, 따라서 DNA의 4개의 천연 뉴클레오타이드와 쌍을 이룰 수 있다. 추가의 결합 상호 작용은 유니버셜 염기(예를 들어, 이노신 I)와 테더 상의 천연 뉴클레오타이드의 상호 작용에 기인할 수 있다. 따라서, 혼입 동안, 표지된 뉴클레오타이드가 폴리머 라제에 결합될 때, 표지된 뉴클레오타이드의 특이성 영역과 테더의 수용체 영역 사이에 상승적 결합이 발생할 수 있으며, 이는 표지된 뉴클레오타이드와 테더 사이의 상호 작용의 안정성을 크게 증가시킬 수 있다.
표지된 뉴클레오타이드와 폴리머라제 또는 폴리머라제와 테더 사이의 상호 작용은 전하 태그가 전도성 채널의 감지 구역 내에 들어오게 할 수 있다. 이러한 상호 작용(들)은 또한 효율적이고 완전한 전하 검출에 충분한 시간 동안 감지 구역 내에 전하 태그를 유지하는 것을 도울 수 있다. 이러한 시간은 최대 수십 밀리 초일 수 있다. 이러한 비교적 긴 상호 작용은 용액에 존재하는 다른 표지된 뉴클레오타이드의 경우와 다르며, 이론상으로는 전도성 채널을 확산시키고 짧게 만지거나 접근할 수 있다. 그러한 짧은 상호 작용은 충분한 전하 검출이 일어나기에 충분히 길지 않을 수 있고, 따라서 이런 경우에, 전하 태그는 전도성 채널에 의해 검출되지 않는다.
본 발명에 개시된 바와 같이, 전하 태그는 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 올리고머 펩타이드 핵산, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 전하 태그는 아미노산, 뉴클레오타이드 및 링커로부터 선택된 복수의 요소를 포함할 수 있다. 이런 분자는 전하 태그의 양태에 의해 운반되는 전하의 응축을 허용하기 위해 3차원 구조를 채택하여 총 전하가 더 작은 영역으로 응축될 수 있다. 이런 증가된 전하 밀도는 폴리머라제에 의해 성장 가닥에 뉴클레오타이드 유사체를 혼입하는 동안 전도성 채널에 의해 검출된 전하를 증가시켜서 이런 합성에서 소정의 뉴클레오타이드 종의 존재가 결정될 수 있다. 이러한 축합 형태를 채택하는 전하 태그는 전도성 채널로부터 또는 전도성 채널의 넓은 표면적, 또는 둘 모두에 대한 전하의 분산을 최소화할 수 있다. 결과적으로, 전도성 채널은 전하 태그의 전하의 더 많은 양 또는 비율을 검출할 가능성이 더 클 수 있다.
본 발명에 개시된 일부 예는 전도성 채널의 감지 구역에 근접하여 전하 태그를 가져오고 유지하기 위해, 폴리머라제 단독 또는 테더와의 조합에 대한 표지된 뉴클레오타이드의 상승적 결합을 이용한다. 테더로 형성된 복합체의 안정성은 비교적 낮아서 복합체는 폴리머라제에 또한 결합되지 않은 표지된 뉴클레오타이드에 대해 형성되지 않는다(즉, 용액에 유리된 표지된 뉴클레오타이드는 테더에 실질적으로 결합하지 않을 수 있다). 즉, 이러한 복합체의 오프 속도(off rate)는 수명이 짧을 정도로 충분히 높을 수 있다. 그러나, 표지된 뉴클레오타이드와 폴리머라제 사이에 안정적인 결합이 형성될 때, 연결 분자의 국소 농도는 테더 주위에서 증가하여 높은 온 속도(on rate)를 초래할 수 있다. 이러한 방식으로, 전체 연관 시간은 비 연관 상태에 비해 폴리머라제 연관 상태에서 크게 증가될 수 있다. 폴리머라제 단독으로 또는 테더와의 조합에 대한 표지된 뉴클레오타이드 친화도의 상승 효과는 전체적으로 실질적인 결합 친화성을 허용하게 될 것이다. 폴리머라제에 의한 절단 후, 상승 효과가 상실되고 전하 태그가 또한 전도성 채널로부터 분리될 수 있다.
특정 예는 감마-포스페이트 표지된 뉴클레오타이드의 폴리머라제 및 테더에 대한 상승적인 결합을 이용할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 모이어티:테더 또는 특이성 영역:수용체 영역 복합체의 안정성은 비교적 낮을 수 있어, 복합체가 폴리머라제에 결합되지 않은 감마-포스페이트 표지된 뉴클레오타이드에 대해 형성되지 않아서, 용액에서 유리된 감마-포스페이트 표지된 뉴클레오타이드가 테더에 실질적으로 결합하지 않는다. 그러나, 폴리머라제에 대한 뉴클레오타이드 모이어티의 친화성 및 테터의 수용체 영역에 대한 올리고뉴클레오타이드 모이어티와 같은 특이성 영역의 친화성의 상승 효과는 전체적으로 실질적인 결합 친화성을 허용하게 될 것이다. 일부 예에서, 상승 효과는 비특이적 결합 상호 작용에 의해 생성된 약한 친화성과 함께 뉴클레오타이드 표지와 테더 사이의 특이적 결합 친화성의 조합을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 바와 같이, 일부 예에서 특이적 결합은 표준 왓슨-크릭 염기쌍으로부터 발생될 수 있고 비특이적 결합 상호 작용은 무차별 염기(예를 들어, 이노신)와 천연 뉴클레오타이드와의 상호 작용에 의해 발생될 수 있다. 따라서, 감마-포스페이트 표지된 뉴클레오타이드가 혼입 동안 폴리머라제에 결합될 때, 올리고뉴클레오타이드 모이어티와 테더 사이의 상호 작용의 안정성을 크게 증가시키는 상승 결합이 일어날 수 있다. 감마 포스페이트가 폴리머라제에 의해 절단된 후, 상승 효과가 상실될 수 있고 올리고뉴클레오타이드 모이어티는 테더로부터 분리될 것이다. DNA, RNA, PNA, 아미노산, 또는 유사체 또는 이들의 조합 사이의 비 공유적 상호 작용을 통한 것과 같은 다른 유형의 뉴클레오타이드 모이어티 : 테더 결합은 이러한 상승 효과에 기여한다.
도 2에 도시된 바와 같이, 폴리머라제는 단일 벽 탄소 나노튜브, 실리콘 나노와이어 또는 FinFET와 같은 전도성 채널에 고정될 수 있다. 고정화는 DNA, RNA, PNA, 아미노산 또는 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 테더를 통해 이루어질 수 있다. 설명의 편의를 위해, 도 2는 전도성 채널에 테더링된 4개의 폴리머라제를 도시하며, 각각의 폴리머라제는 또한 상이한 감마-포스페이트 표지된 뉴클레오타이드 유형에 결합된다. 도시된 바와 같이, 뉴클레오타이드는 감마-포스페이트에 부착된 올리고뉴클레오타이드 모이어티를 가질 수 있다. 표적 핵산의 주형 가닥에 적절하게 일치되는 베타-또는 감마-포스페이트-표지된 뉴클레오타이드는 테터의 수용체 영역에 대한 올리고뉴클레오타이드 모이어티 또는 다른 특이성 영역(예를 들어, 왓슨-크릭 염기 상보성 또는 다른 비공유 결합을 통해)을 일시적으로 혼성화하기에 충분히 긴 주형에 결합될 수 있는 폴리머라제에 의해 제자리에 유지될 수 있다. 혼성화는 전하 태그가 전도성 채널을 통과하는 트랜지스터 전류의 변화에 의해 검출 가능한 신호를 생산할 수 있는 전도성 채널 주위의 필드를 교란시킬 수 있다. 다이어그램은 전도성 채널의 1-2nm 내에 있는 필드에 들어가는 전하 태그를 도시한다. 적절하게 일치된 베타-또는 감마-포스페이트-표지된 뉴클레오타이드는 주형 핵산에 혼성화된 초기 가닥에 혼입될 수 있다. 이것이 차례로 베타 포스페이트와 새로 혼입된 뉴클레오타이드 사이의 결합을 파괴할 것이다. 결과적으로, 전하 태그(뉴클레오타이드의 베타 또는 감마 위치에 부착되든 안 되든)는 테더로부터 자유롭게 분리되고 전도성 채널로부터 확산되어 전도성 채널 주위의 필드를 교란되지 않은 상태로 되돌릴 수 있다. 전도성 채널 주위의 필드가 각각 교란되고 교란되지 않은 상태로 복귀될 때 신호의 출현 및 소멸은 표적 핵산의 초기 가닥 내로 뉴클레오타이드의 혼입과 상관될 수 있다.
주형 가닥의 각 위치에서 초기 가닥에 혼합된 뉴클레오타이드의 유형은 각 유형의 뉴클레오타이드에 혼입된 표지의 고유한 특성에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 4가지 유형의 dNTP는 특이성 영역이 테더의 연관 영역, 특이성 영역의 길이 및/또는 표지상의 하전된 모이어티의 존재, 전하의 원자가 및 전하의 크기에 혼성화되는 위치에 의해 구별될 수 있다. 예를 들어, 소정의 뉴클레오타이드는 상이한 원자가 및/또는 크기를 갖는 전하를 갖는 다른 뉴클레오타이드와 공유되지 않는 소정의 원자가 및 크기의 전하를 가질 수 있다. 전도성 채널은 전하의 원자가 및/또는 크기의 차이를 검출할 수 있다. 전도성 채널에 테더링된 폴리머라제에 의해 하전된 태그를 갖는 뉴클레오타이드를 초기 폴리뉴클레오타이드에 혼입하는 동안, 전도성 채널은 주형 가닥의 뉴클레오타이드에 대한 보체로서 혼입된 뉴클레오타이드의 태그의 원자가 및/또는 크기를 검출할 수 있다. 폴리머라제가 다음 뉴클레오타이드의 주형에 상보적인 다음 종의 뉴클레오타이드를 혼입하기 위해 움직일 때, 초기 가닥에 혼입된 이러한 다음 종의 뉴클레오타이드의 전하의 원자가 및/또는 크기는 또한 전도성 채널에 의해 검출될 수 있다. 그리고 전하 태그를 갖는 연속적인 뉴클레오타이드는 초기 가닥에 혼합된다.
연속적인 전하 태그가 전도성 채널에 의해 검출될 때, 전하 태그의 차이로 인한 전도성 채널을 통한 전류 흐름의 차이는 성장하는 초기 가닥이 각각의 이러한 혼입에 대해 전도성 채널에 의해 검출된 전하의 원자가 및/또는 크기에 기초하여 합성될 때 폴리머라제에 의해 중합된 각각의 혼입에 대해 소정의, 확인된 종의 뉴클레오타이드를 기록하도록 프로그래밍될 수 있는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체에 기록되고 저장될 수 있다.
도 2는 2개의 전하 태그 및 2개의 테더 혼성화 위치를 사용하여 염기 G, A, C 및 T 사이의 4개 상태 식별이 달성되는 예를 제공한다. 구체적으로, dCTP는 음으로 하전된 외인성 모이어티로 고유하게 표지화되고, dTTP는 양으로 하전된 외인성 모이어티로 고유하게 표지화되고, dATP 및 dGTP는 임의의 외인성 전하 모이어티의 부재에 기초하여 다른 2개의 뉴클레오타이드 유형과 구별되고, dATP는 올리고뉴클레오타이드 모이어티가 테더에 혼성화될 때 전도성 채널에 대한 올리고뉴클레오타이드 모이어티의 차별적 근접성에 기초하여 dGTP와 구별된다.
양 전하 모이어티, 음 전하 모이어티 및/또는 테더 혼성화 위치의 다양한 조합 중 임의의 것에 기초하여 상이한 뉴클레오타이드 유형이 구별될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 대안적으로 또는 추가로, 상이한 유형의 뉴클레오타이드를 구별하기 위해 사용되는 전하 모이어티는 전하가 동일한 부호를 갖더라도 전하의 강도가 상이할 수 있다. 도 3에 도시된 예시적인 구성은 단일 테더 혼성화 위치 및 4개의 상이한 전하 모이어티에 기초하여 염기 G, A, C 및 T 사이의 4개 상태 식별을 제공한다. 구체적으로, 이 비 제한적인 예에서, dGTP 및 dCTP는 dATP 및 dTTP와 구별되는 음으로 하전된 모이어티를 함유하고 dGTP는 dCTP의 전하보다 현저히 높은 전하로 인해 dCTP와 구별될 수 있다. 유사하게, dATP 및 dTTP는 dTTP 모이어티에 비해 dATP 모이어티 상의 더 높은 양전하로 인해 서로 구별될 수 있다.
본 발명에서 이전에 언급된 바와 같이, 테더를 따라 특정 혼성화 위치에서 태그 배치의 정확성은 리보뉴클레오타이드를 갖는 테더 및 2'-O-메틸(2'-O-Me) 및 2'-플루오로(2'F) 변형된 RNA 염기를 갖는 뉴클레오타이드 표지의 사용을 통해 향상될 수 있다. 대안적인 구성은 리보뉴클레오타이드를 갖는 라벨을 갖는 2'-O-Me 및 2'F 변형된 리보뉴클레오타이드를 함유하는 테더를 사용할 수 있거나, 테더 및 표지 둘 다는 천연 리보뉴클레오타이드 및 2'-O-Me 및 2'F 변형된 리보뉴클레오타이드의 혼합물을 포함할 수 있다. 주로 RNA로 구성된 테더 및/또는 올리고뉴클레오타이드 모이어티를 사용하는 것이 가능하지만, RNA와 관련된 뉴클레아제 민감성을 피하기 위해 DNA 기반 또는 PNA 기반 또는 아미노산 기반 테더 및/또는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, DNA-기반 또는 PNA-기반 테더 또는 아미노산-기반 테더 및/또는 올리고뉴클레오타이드는 원치 않는 뉴 클레아제 분해 위험을 줄이면서 본 발명에 제시된 결합 이점을 달성하기 위해 천연 리보뉴클레오타이드 또는 비-천연 리보뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 추가의 예에서, 테더는 뉴클레오타이드 표지에서 데옥시리보뉴클레오타이드에 상보적인 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나 대안적으로 테더는 뉴클레오타이드 표지에서 데옥시리보뉴클레오타이드에 상보적인 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
폴리머라제를 전도성 채널에 부착시키는 테더는 본 발명에 개시된 몇몇 실시 예에 제시된 바와 같이 상이한 뉴클레오타이드 서열에 대해 상이한 결합 위치(예를 들어, 수용체 영역)를 가질 수 있다. 2개 이상의 뉴클레오타이드 서열에 대한 결합 위치는 중첩될 수 있거나 중첩되지 않고 구별될 수 있다. 예시의 목적으로, 테더 서열이 일련의 일반적인 "N" 뉴클레오타이드로서 도 8에 도시된다. 상보성 규칙 및 원하는 혼성화 강도 및 특이성에 따라 다양한 서열 중 임의의 서열이 사용될 수 있다. 테더의 길이, 수용체 영역의 길이 및 특이성 영역의 길이에 따라, 테더 상의 결합 위치의 일부, 전체가 겹쳐지거나 또는 결합 위치가 겹치지 않을 수 있다. 일부 양태에서, 상보적 염기는 표준 DNA 염기이지만, 임의의 뉴클레오타이드 유사체가 사용될 수 있다(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드 유사체가 사용될 수 있다).
뉴클레오타이드 유사체의 특이성 영역의 테더-결합 올리고뉴클레오타이드 모이어티는 테더의 수용체 영역 상의 상보적 서열에 특이적으로 혼성화되는 뉴클레오타이드의 서열을 가질 수 있다. 일부 예에서, 테더-결합 올리고뉴클레오타이드 모이어티는 또한 테더에 비 특이적으로 결합하는 무차별 뉴클레오타이드 위치를 포함할 수 있다. 이러한 위치는 테더-결합 올리고 뉴클레오타이드 모이어티와 특정 하이브리드 구조의 형성을 용이하게 하는 테더 사이에 약한 상호 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 도 9에 도시된 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드 모이어티는 DNA의 4개의 천연 뉴클레오타이드 모두와 약하게 무차별적으로 결합하는 것으로 알려진 몇몇 이노신(I)을 포함할 수 있다. 테더-결합 올리고뉴클레오타이드 모이어티 (예를 들어, 특이성 영역) 및 테더(예를 들어, 수용체 영역)는 테더-결합 올리고 뉴클레오타이드 모이어티의 이노신과 테더의 천연 뉴클레오타이드 간의 상호 작용을 통해 약한 복합체를 형성할 수 있다. 이는 서열의 특정 부분(예를 들어, 도면에서 ABC 및 이의 보체 A' B' C'로 표시됨)이 약한 복합체의 부재 형성을 확산시키는 것을 필요로 하는 경우보다 더 빠르게 결합되도록 할 수 있다. 또한, 일단 특이적 복합체가 형성되면 이노신이 추가 안정성을 제공할 수 있다.
도 9의 비 제한적인, 예시적 테더-결합 올리고뉴클레오타이드 모이어티는 특이적 서열의 양 측면을 플랭킹하는 무차별 뉴클레오타이드 위치를 포함한다. 그러나, 하나 이상의 무차별 뉴클레오타이드 위치는 특정 서열의 5 '또는 3' 측에만 위치될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 무차별 뉴클레오타이드 위치의 다른 예는 2종 이상의 뉴클레오타이드와 무차별적으로 혼성화하기 위해 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 합성에 의해 형성된 것 또는 당업계에 공지된 다른 뉴클레오타이드 유사체로 형성된 것을 포함한다.
본 발명에 제시된 몇몇 예는 상이한 길이의 올리고뉴클레오타이드 특이성 영역을 갖는 복수의 상이한 뉴클레오타이드 유사체의 사용을 예시하였다. 이러한 예에서, 상이한 뉴클레오타이드 유사체 유형은 이들의 상이한 길이의 특이성 영역에 기초하여 구별될 수 있다. 대안적으로, 상이한 뉴클레오타이드 유사체는 서로 구별 할 수 없는 동일하거나 유사한 길이의 테더-결합 올리고뉴클레오타이드 모이어티를 가질 수 있다. 그러나, 각각의 뉴클레오타이드 유사체는 수용체 영역 또는 다른 뉴클레오타이드 유사체의 특이성 영역이 결합하는 영역과 비교하여 테더의 상이한 수용체 영역에 결합하는 특이성 서열을 가질 수 있다. 상이한 뉴클레오타이드 유사체에 대한 폴리머라제의 결합이 폴리머라제를 4개의 구별 가능한 상태 중 하나에 위치시키는 예시적 구성이 도10에 도시된다. 도 10에 도시된 비 제한적인 예에서, ATP 유사체의 테더-결합 올리고뉴클레오타이드 모이어티는 폴리머라제에 대한 테더의 부착 지점에 가장 가까운 테더 상의 위치에 결합하고, TTP 유사체의 테더-결합 올리고뉴클레오타이드 모이어티는 폴리머라제에 대한 부착 지점으로부터 가장 먼 테더 상의 구별된 위치에 각각 결합하며, GTP 및 CTP 유사체의 테더-결합 올리고뉴클레오타이드 모이어티는 다른 2개의 뉴클레오타이드 유사체에 대한 테더-결합 올리고뉴클레오타이드 모이어티의 결합 부위로부터 중간 거리에 있는 테더 상의 별개의 위치에 각각 결합한다. 폴리머라제에 대한 상이한 뉴클레오타이드 유사체의 결합은 폴리머라제를 전도성 채널로부터 상이한 거리에 위치시킬 수 있다(예를 들어, 도면에 도시된 바와 같이 테더에 상이한 크기의 루프가 형성되게 함). 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 전하 태그 또는 다른 검출 가능한 모이어티(예를 들어, 폴리머라제에 의해 뉴클레오타이드 서열에 혼입될 뉴클레오타이드로부터 연장되는 말단으로부터 먼 테더-결합 올리고뉴클레오타이드 모이어티의 말단으로부터 연장됨)를 포함하는 예에서, 테더-결합 올리고뉴클레오타이드 모이어티와 테더 사이의 결합은 전하 태그 모이어티를 전도성 채널로부터 상이한 거리에 위치시킬 수 있다. 이러한 경우에, 상이한 유형의 뉴클레오타이드 유사체는 전도성 채널로부터 검출 가능한 전하 태그 모이어티의 상이한 거리에 대해 생성된 신호의 차이에 적어도 부분적으로 기초하여 구별될 수 있다. 이 예시적인 예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 ATP, GTP, CTP 및 TTP로 식별되지만, 임의의 뉴클레오타이드 유사체가 사용될 수 있다(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드 유사체가 사용될 수 있다).
다른 예에서, 도 13a 및 13b에 도시된 바와 같이, 본 발명에 개시된 태그된 뉴클레오타이드의 특이성 영역은 각각 테더의 수용체 영역의 상이한 섹션에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 특이성 영역 서열 사이는 수용체 영역의 일부에 혼성화되지 않는 짧은 뉴클레오타이드일 수 있다. 따라서, 2개의 서열은 테더의 수용체 영역의 상응하는 상보적 부분 및 특이성 영역의 개재 부분에 혼성화될 수 있고, 개재 서열은 다른 곳(예를 들어, 도 13a에 도시된 헤어핀 구조를 형성하기 위해 서로 혼성화하는 특이성 영역의 이러한 개재 서열의 2개의 상보적 부분)에 자유롭게 혼성화하거나 (도 13a에 도시된 바와 같이) 자유롭게 혼성화하여 특이적으로 결합되지 않거나 자체로 특이적으로 결합되지 않는다. 도 13a 및 13b에서, "Glue"는 태그된 뉴클레오타이드의 특이성 영역에 혼성화되거나 달리 일시적으로 결합하는 테더의 수용체 부분을 의미한다. 일부 예에서, 이러한 결합은 전도성 채널(테더/수용체 영역/"Glue"가 부착된 와이어에 의해 도 13a 및 13b에 나타냄)에 의해 하전된 태그의 검출을 증가시킬 수 있다.
도 4에 도시된 예에 의해 설명된 바와 같이, 폴리머라제를 전도성 채널에 부착시키는 테더는 아날로그 뉴클레오타이드 상에 존재할 수 있는 전하 태그 또는 특이성 서열에 혼성화할 필요가 없다. 오히려, 전도성 채널은 뉴클레오타이드 유사체의 특이성 영역이 결합할 수 있는 폴리머라제 테더로부터 분리된 수용체 영역의 부착에 의해 기능화될 수 있다. 상이한 뉴클레오타이드의 구별은 수용체 영역이 폴리머라제 테더의 일부인지 또는 전도성 채널에 부착되어 있는지 여부에 관계없이 전하 태그의 전하의 원자가, 전하의 강도, 특이성 영역: 수용체 영역 결합 복합체의 길이, 또는 전도성 채널에 대한 또는 이와 관련한 수용체 영역:특이성 영역 복합체 형성의 근접성 또는 위치 또는 이의 조합에 기초하여 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 전하 태그를 갖는 뉴클레오타이드 유사체의 예시적인 예가 도 5에 도시되어 있다. 이것은 본 발명에 기술되고 개시된 바와 같은 뉴클레오타이드 유사체의 많은 예 중 하나일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 이 비 제한적인 예에서, dT 헥사포스페이트는 특이성 영역을 포함하는 링커 영역을 통해 전하 태그에 연결된다. 이 비 제한적인 예에서 링커는, 본 발명에 추가로 개시된 바와 같이, 다른 화학 반응이 대신 사용될 수 있으나, 아자이드-알카인 클릭 반응에 의해 형성된 공유 결합을 포함한다. 용이한 참조를 위해, 본 발명에서 뉴클레오타이드 유사체의 일부를 기술할 때, 도 5에 도시된 바와 같이 분자의 오른쪽을 향한 영역은 뉴클레오타이드의 데옥시리보스 상의 유리 3' 하이드록실기를 언급하는 관례에 따라, 3' 말단으로 지칭될 것이다. 이에 상응하여, 전하 태그가 이 예에 위치되는 도 5에 도시된 바와 같이 분자의 왼쪽을 향한 영역은 뉴클레오타이드의 리보오스의 5' 탄소에 결합된 포스페이트기의 연장부로서 5' 말단으로 지칭될 것이다.
표 1은 본 발명에 개시된 장치 또는 방법에서 표지로서 사용될 수 있는 일부 유용한 변형 및 전하의 비 제한적 목록을 제공한다.
5' 말단 시약 최종 전하 상태
5' OH N/A 중성
5' 포스페이트 CPR 10-1900 (Glen Res.) -2
5' 포스페이트 (x2) CPR 10-1900 및 symmetric doubler (Glen Res.) -4
5' 포스페이트 (x3) CPR 10-1900 및 symmetric trebler (Glen Res.) -6
5' 1차 아민 5' amino-modifier 5 +1
한 양태에서, 본 발명은 뉴클레오타이드; 뉴클레오타이드의 포스페이트기에 부착된 연결 분자; 및 연결 분자에 부착된 전하 태그, 여기서 전하 태그는 뉴클레오타이드 및 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 복수의 요소, 및 요소들 사이의 임의의 링커를 포함하는 변형 뉴클레오타이드에 관한 것이며, 전하 태그는 내부 접힘 또는 2차 구조를 포함한다. 한 예에서, 전하 태그는 하나 이상의 포스 포다이에스터기, 및 요소들 사이의 선택적 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드 또는 변형된 뉴클레오타이드이다. 변형된 뉴클레오타이드 구조는 당업자에게 공지되어 있으며 염기 또는 당 모이어티에 대한 구조적 변형(예를 들어, 알킬화, 아미노기 또는 보호기)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 연결 분자는 특이성 영역을 포함한다. 일부 예에서, 특이성 영역은 1 내지 6개의 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 예에서, 전하 태그는 약 1개 내지 약 100개 또는 약 200개 전하를 포함한다. 일부 예에서, 연결 분자는 -X2 내지 (CH2)m기를 통해 화학식(I)에 하기에 나타낸 구조를 포함한다. 한 예에서, 전하 태그는 본 발명의 방법에 사용된 폴리머라제(예를 들어, Phi29)에 결합하지 않는다. 일부 예에서, 전하 태그는 폴리머라제 테더에서 수용체 영역에 결합하여 전하 태그에 헤어핀 구조를 형성하는 2개의 비 연속 영역을 포함하는 복수의 뉴클레오타이드를 포함한다.뉴클레오타이드 유사체 또는 표지된 뉴클레오타이드의 한 예는 하기 화학식 I의 화합물로 표시된다:
Figure 112021128458083-pat00023
n은 3 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 10의 정수이고, t는 0 내지 50의 정수이며, X1은 직접 결합, C1-C10 알킬, C1-C10 옥사알킬, C1-C10 티아알킬 또는 C1-C10 아자알킬이고, X2는 C1-C20 알킬이며, 선택적으로 하나 이상의 개별 CH2 잔기는 하나 이상의 펩타이드 결합 및 (-O-CH2-CH2-)a로 치환되며, 여기서 a는 1 내지 24의 정수이고, X3은 직접 결합 또는 올리고뉴클레오타이드이며, 여기서 표지가 전도성 채널에 근접할 때 올리고뉴클레오타이드가 테더의 수용체 영역에 혼성화하고, F1은 형광단 및 직접 결합으로부터 선택되고 F2는 존재하지 않거나 형광단이고,
A는
Figure 112021128458083-pat00024
또는 아마이드 결합이고
Y는
Figure 112021128458083-pat00025
및
Figure 112021128458083-pat00026
이고, q는 1 내지 100의 정수이고,
B는 아미노산, 뉴클레오타이드,
Figure 112021128458083-pat00027
로부터 선택되며, 여기서 R은 Y 및 수소, 및 덴드론으로부터 선택되고; B가 덴드론인 경우 q는 1이고, q 수의 B는 전하 및 전하 밀도를 가진다. 한 예에서, 폴리머라제에 의해 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상보적인 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥 내로 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 폴리머라제는 테더에 의해 고체 지지체 전도성 채널에 테더링되고, 표지된 뉴클레오타이드는 화학식 I의 화합물이고, 및 전도성 채널은 혼입 동안 표지된 뉴클레오타이드를 검출하는 것이다.
한 예에서, B는 전하 태그를 포함하고 전하 태그는 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 아미노산, 펩타이드 핵산 또는 이들의 조합을 포함하며, 여기서 전하 태그는 내부 접힘 또는 2차 구조를 갖는다.
본 발명에서 추가로 설명되는 바와 같이, 화학식 I의 화합물을 제조하는 단계는 연결 반응을 포함하는 반응에 의해 A를 형성하는 단계를 포함할 수 있고, 연결 반응은 아자이드-알카인 구리-보조 클릭 반응, 테트라진-트랜스-사이클로옥텐 결찰, 아자이드-다이벤조사이클로옥타인기 무 구리 클릭 반응 및 티올-말레이미드 접합으로부터 선택된다.
또한, 화학식 I의 화합물의 뉴클레오타이드 부분을 폴리뉴클레오타이드의 초기 가닥에 혼입시키는 동안과 같이, 화학식 1의 화합물의 전하 태그를 전하 검출기로 검출하는 방법이 제공된다. 비 제한적인 예에서, 검출은 (a) 고체 지지체 전도성 채널에 테더링된 폴리머라제를 제공하는 단계; (b) 하나 이상의 화학식 I의 화합물을 제공하여, 라벨이 전도성 채널에 근접할 때 전도성 채널에 의해 화합물의 존재가 검출되는 단계; 및 (c) 전도성 채널을 사용하여 주형 핵산에 상보적인 초기 가닥으로 화합물의 혼입을 검출하는 단계를 포함하는 핵산 시퀀싱 동안 일어날 수 있다.
화학식 I의 화합물이 또한 제공되며, 여기서 B는 하나 이상의 줄기-루프 모양, 하나 이상의 클로버잎 모양, 하나 이상의 관 모양, 하나 이상의 고리 모양, 하나 이상의 입방형, 하나 이상의 십자형, 하나 이상의 구형, 하나 이상의 직사각형, 하나 이상의 피라미드, 하나 이상의 다이아몬드, 하나 이상의 층 모양, 하나 이상의 기둥 모양, 하나 이상의 주름진 모양 형상, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의의 조합을 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 화학식 I의 화합물의 다른 예에서, B는 하나 이상의 코일 형태를 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다. 화학식 I의 화합물이 또한 제공되며, B는 십자형을 형성하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 결합된 하나 이상의 펩타이드 핵산 분자, 및 하나 이상의 펩타이드 핵산 분자에 결합된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다.
화학식 I의 화합물이 또한 제공되며, B는 약 -100e 내지 약 +100e의 전하를 가진다. 화학식 I의 화합물이 또한 제공되며, B는 약 -100e 내지 약 +100e의 전하 및 입방 나노미터당 약 -100e 내지 입방 나노미터당 약 +100e의 전하 밀도를 가진다. 화학식 I의 화합물이 또한 제공되며, B는 약 -200e 내지 약 +200e의 전하 및 입방 나노미터당 약 -200e 내지 입방 나노미터당 약 +200e의 전하 밀도를 가진다.
일부 예에서, 화학식 I의 화합물은 임의로 F1, F2 또는 둘 다로 표시되는 형광단을 포함할 수 있다. 형광단의 일부 비 제한적인 예는 시아닌 염료(예를 들어, Cy2, Cy3 또는 Cy5), 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민 형광단(예를 들어, 테트라메틸 로다민) 또는 기타를 포함한다. 화학식 I의 화합물에서 형광단의 선택적 존재는 형광단을 포함하는 태그된 뉴클레오타이드의 검출과 같은 추가 용도를 제공할 수 있다. 예를 들어, 형광단 함유 전하 태그의 존재는 태그에 의해 운반되는 전하의 존재, 원자가 및 크기의 검출뿐만 아니라 형광 공명 에너지 전달과 같은 형광 방출을 검출하는 방법에 의해 검출될 수 있다.
전하 태그가 하나 이상의 펩타이드 핵산을 포함하는 태그된 뉴클레오타이드가 또한 제공된다. 일부 예에서, 전하 태그는 하나 이상의 펩타이드 핵산을 포함하고, 하나 이상의 펩타이드 핵산은 하나 이상의 하전된 아미노산에 부착된다.
화학식 I의 화합물을 형성하는 방법이 또한 제공되며, 전하 태그는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고 DNA 종이 접기(origami)에 의해 형성된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, DNA 종이 접기는 나노스케일에서 비 임의적 형태의 생성에서 DNA를 접는 것을 수반한다. 압축된 종이 접기 DNA 구조는 높은 전하 밀도를 허용하여, 화학식 I의 상이한 화합물에서 전하 밀도의 변화를 허용할 수 있다. 전하 태그의 전하 및 전하 밀도 변화에 있어서의 높은 전하, 높은 전하 밀도 및 더 큰 유연성은 전도성 채널에 의한 전하 태그의 검출의 가능성을 증가시킬 수 있고 또한 전도성 채널에 의해 검출된 상이한 전하 태그를 구별할 수 있게 한다. 전하 태그에 의해 운반될 수 있는 더 큰 범위의 전하는 화학식 I의 화합물의 상이한 예에 의해 운반된 전하 사이의 더 큰 분화를 허용한다. 일부 예에서, 상이한 뉴클레오타이드는 이들이 화학식 I의 화합물로서 연결되는 태그에 의해 운반되는 전하에 의해 서로 구별될 수 있다. 전도성 채널은 상이한 이러한 뉴클레오타이드에 의해 운반된 전하의 크기의 차이에 기초하여 화학식 I의 화합물의 일부를 구성하는 상이한 뉴클레오타이드를 차별적으로 검출할 수 있다.
B는 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 아르기닌, 히스티딘 및 리신을 포함할 수 있어서, 양전하를 갖는 전하 태그를 생성한다. B는 대신 아스파르트산 및 글루탐산을 포함할 수 있어서, 음전하를 갖는 전하 태그를 생성한다. 일부 예에서, B는 분지형 폴리펩타이드, 선형 폴리펩타이드 또는 사이클릭 폴리펩타이드이다. 일부 예에서, B는 단일 아미노산 또는 2 내지 10 또는 11 내지 20개의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 예에서, B의 일부 아미노산은 하전되지 않을 수 있고, 다른 예에서 B는 B의 다른 아미노산과 반대로 하전된 일부 아미노산을 함유할 수 있지만, B는 전체적으로 양전하 또는 음전하를 유지할 수 있다.
화학식 I의 이 비 제한적인 예에서, n 포스페이트기에 직접 결합된 뉴클레오타이드는 폴리머라제에 의해 인식될 수 있고 이로써 주형 서열에 상보적으로 합성된 뉴클레오타이드 서열에 혼입된 뉴클레오타이드일 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 성장하는 합성된 폴리뉴클레오타이드 서열에 첨가하는 동안 폴리머라제에 의해 제자리에 유지되지만, 유사체의 나머지는 이로부터 연장될 수 있고, 본 발명에 개시된 바와 같이, 전도성 채널에 근접한 폴리머라제의 경우, 전하 태그(화학식 I 및 직접 결합된 하전된 펩타이드에서 에서 B로 나타내어짐)는 전도성 채널과 근접하게 이동하거나 근접하게 될 수 있어서 전도성 채널이 전하의 원자가 및 크기를 감지할 수 있다. 상이한 뉴클레오타이드 유사체는 유사체의 3' 말단에 상이한 뉴클레오타이드, 및 상응하게 유사체의 5' 말단에 상이한 펩타이드 전하 태그를 함유할 수 있어서, 폴리머라제에 테더링된 전도성 채널은 폴리머라제가 상이한 뉴클레오타이드 유사체와 연관되어 합성되는 뉴클레오타이드 서열에 뉴클레오타이드를 혼입시킬 때 전하 원자가 및 크기의 차이를 검출할 수 있다. 이들 예에서, 폴리머라제는 뉴클레오타이드 유사체의 5' 뉴클레오타이드에 직접 결합된 하나의 포스페이트기를 제외한 모든 뉴클레오타이드 유사체를 절단하여 뉴클레오타이드 유사체의 dNMP 부분이 합성 뉴클레오타이드 서열에 잔존하며 5' 포스페이트기가 혼입될 다음 뉴클레오타이드에 자유롭게 결합되고 뉴클레오타이드 유사체의 절단된 나머지는 복합체로부터 자유롭게 분리된다.
3' 뉴클레오타이드에 직접 결합된 포스페이트 또는 일련의 포스페이트기는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 포스페이트기를 포함할 수 있다. 다른 예는 10개 초과의 포스페이트기를 포함할 수 있다. 이어서 뉴클레오타이드 유사체의 이 부분은 1-10개 -CH2- 기를 포함하는 알킬 결합에 의해 연결될 수 있다. 다른 예는 이 위치에서 11-20개의 이런 기를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 이들 1-10개, 또는 11-20개, -CH2- 기 중 하나 이상은 C1 내지 C20 탄화수소로 치환될 수 있다.
뉴클레오타이드 유사체의 이 부분은 -O-CH2-CH2- 기와 같은 0 내지 50개의 옥사알킬기에 의해 추가로 연결될 수 있다. 다른 예에서, 이들 0-50개 -O-CH2-CH2- 기 중 하나 이상은 C1 내지 C150 탄화수소로 치환될 수 있다.
뉴클레오타이드 유사체의 이 부분은 X1로 표시되는 0-10개 -CH2- 기를 포함하는 알킬 결합에 의해 추가로 연결될 수 있다. X1의 다른 예는 이 위치에서 11 내지 20개의 이러한 기를 포함할 수 있다. X1의 다른 예에서, 이들 1-10개, 또는 11-20개, -CH2 기 중 하나 이상은 C1 내지 C20 탄화수소로 치환될 수 있다. X1은 또한 직접 결합, C1-C10 알킬, C1-C10 옥사알킬, C1-C10 티아알킬 또는 C1-C10 아자알킬일 수 있다.
아래에보다 상세히 기술된 바와 같이, A는 연결기를 나타내며 이에 의해 뉴클레오타이드 유사체의 5' 말단이 뉴클레오타이드 유사체의 3' 말단을 향한 전하 태그에 연결될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 폴리포스페이트는 데옥시리보오스(또는 리보오스)에 대해 가장 멀리 있는 5' 포스페이트기에 부가된 작용기를 가질 수 있으며, 이의 말단에서 작용기는 반응 그룹일 수 있다. 반응 그룹은 다른 화학 그룹 - 2개의 반응 그룹-과 함께 반응하여 특정 시약 또는 시약들의 존재하에서 또는 특정 pH 또는 온도 등에서와 같은 제어된 조건하에서 이들의 사이에 공유 결합 또는 결합을 형성할 수 있는 화학 그룹이다. 예를 들어, 3' 뉴클레오타이드로부터의 A가 없는 결합의 최대 또는 일부 숫자까지 화학식 I과 유사하거나 일부의 예와 유사한 조성물은 구입 가능하거나 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다. 이어서, 반응 그룹은 이런 화합물의 말단에 부가될 수 있어서 다른 반응기와 첫 번째가 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 다른 반응 그룹을 가진 전하 태그는 함께 반응하여 전하 태그가 3' 뉴클레오타이드에 공유 결합하여 화학식 I의 화합물을 형성한다.
A에 부착된 것은 X2일 수 있다. X2는 C1-C20 알킬일 수 있고, 여기서 개별 CH2 잔기는 하나 이상의 펩타이드 결합 및 (-O-CH2-CH2-)a로 독립적으로 대체될 수 있으며, 여기서 a는 1 내지 24의 정수이다. X2의 다른 예에서, a는 6 내지 20의 정수일 수 있다. 또 다른 예에서, X2의 1-20개의 알킬기 중 하나 이상은 C1 내지 C20 탄화수소로 치환될 수 있다.
한 예에서, B는 포스페이트 결합에 의해 X2에 연결된 전하 태그를 나타낼 수 있다. B는 포스포다이에스터기를 함유하는 1 내지 100개의 모이어티를 포함할 수 있다. 한 예에서, B는 포스포다이에스터기를 함유하는 1 내지 200개의 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 포스포다이에스터기에서 산소 원자에 의해 운반된 음전하는 B 전하 태그에 음전하를 부여할 수 있으며, 크기는 모이어티의 수에 비례한다. B의 q 모이어티 각각은 다른 B 모이어티 중 임의의 것과 상이한 모이어티일 수 있거나, 또는 서로 동일할 수 있다. B의 임의의 하나 이상의 모이어티는, 예를 들어, 아데닌, 티민, 시토신 또는 구아노신 염기를 갖는 dNMP일 수 있다. 임의의 하나 이상의 B 모이어티는 다음과 같다:
C3 spacer
Figure 112021128458083-pat00028
또는 dSpacer
Figure 112021128458083-pat00029
여기서 R은 수소이다.
일부 예에서, B의 임의의 모이어티는 임의의 NPP(뉴클레오타이드 폴리포스페이트)를 포함할 수 있다. 전하 원자가, 크기 또는 둘 다가 다른 3' 뉴클레오타이드가 결합된 다른 전하 태그와 상이한 전하 태그는 폴리뉴클레오타이드 합성 동안 테더링된 폴리머라제에 의해 보유될 때 전도성 채널에 의해 뉴클레오타이드 유사체의 분화된 식별을 허용한다. 일부 예에서, 일부 뉴클레오타이드 유사체는 본 발명에 개시된 화학식 I의 화합물 또는 유사한 화합물이다. 일부 예에서, 합성에 의한 시퀀싱 반응에 사용된 모든 뉴클레오타이드는 예를 들어 화학식 I의 화합물 또는 관련 화합물의 예와 같이, 본 발명에 개시된 하나 이상의 포스포다이에스터기를 포함하는 하전된 태그를 함유하는 반면, 합성에 의한 시퀀싱 반응에 사용된 다른 뉴클레오타이드는 이런 화합물을 포함하지 않는 하전된 태그를 함유한다.
다른 예에서, 각각의 B는 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로부터 독립적으로 선택되어 양전하를 갖는 전하 태그를 생성할 수 있다. 다른 예에서, 각각의 B는 아스파르트산 및 글루탐산으로부터 독립적으로 선택되어 음전하를 갖는 전하 태그를 생성할 수 있다. 일부 예에서, q 수의 B는 분지형 폴리펩타이드, 또는 선형 폴리펩타이드 또는 사이클릭 폴리펩타이드이다. 일부 예에서, q 수의 B는 단일 아미노산 또는 2 내지 10, 또는 11 내지 20개의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 예에서, B의 일부 아미노산은 하전되지 않을 수 있고, 다른 예에서 B는 다른 B의 아미노산과 반대로 하전된 일부 아미노산을 함유할 수 있지만, B는 전체적으로 양 또는 음전하를 유지할 수 있다. 일부 예에서, B는 비 천연 아미노산을 포함할 수 있다.
다른 예에서, B는 하나 이상의 구조 반복 단위 및 복수의 말단 단위를 포함하는 z 세대의 덴드론이고, 여기서 z는 1 내지 6의 정수이며, 구조 말단 단위는 다음 중에서 선택된다:
Figure 112021128458083-pat00030
및
Figure 112021128458083-pat00031
여기서 p1은 1 내지 3의 정수이며, 여기서 p1-CH2-기 중 임의의 하나 이상은 임의로 1 내지 3개의 -O-CH2-CH2-기로 대체되고, p2는 1 내지 3의 정수이며, 여기서 p2-CH2-기 중 임의의 하나 이상은 임의로 1 내지 3개의 -O-CH2-CH2-기로 대체되고, 말단기는 카복실산, 술폰산, 포스폰산, 스퍼미닐기, 아미노기 및 4차 암모늄기로부터 선택된다.
B는 자유 원자가 말단에 의해 X2에 연결된 덴드론 전하 태그를 나타낼 수 있다. 일부 예에서, 본 발명에 개시된 덴드론은 화학적으로 결합되기 전과 같이 뉴클레오타이드 유사체에 부착되지 않을 수 있다. B는 다음과 같이 2도의 분기를 갖는 구조 반복 단위를 포함할 수 있다:
Figure 112021128458083-pat00032
.
또는, B는 다음과 같이 3도의 분기를 갖는 구조 반복 단위를 포함할 수 있다:
Figure 112021128458083-pat00033
.
본 발명에 추가로 개시된 바와 같이, 덴드론 전하 태그는 1 내지 6 세대 크기일 수 있다. 말단 구조 반복 단위 상의 말단기는 양 또는 음으로 하전될 수 있다. 따라서 2도의 분기를 갖는 덴드론은 2z의 전하를 갖는 전하 태그를 생성할 수 있고, 3도의 분기를 갖는 덴드론은 3z의 전하를 갖는 전하 태그를 생성할 수 있다 (말단기당 전하의 크기는 1이다).
B가 덴드론을 나타내는 예에서, 말단기는 다수의 하전된 작용기, 예컨대 카복실산, 술폰산, 포스폰산, 아미노기 또는 4차 암모늄기 중 임의의 것일 수 있거나 또는 임의의 다른 하전된 작용기일 수 있다. 일부 예에서, 덴드론의 구조 반복 단위는 말단 구조 반복 단위의 말단기 이외의 원자 상에 및 말단기 상에 전하를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 비 제한적인 예로서, 구조 반복 단위는 분기점에서 4차 암모늄기를 함유할 수 있으며, 이는 양전하를 옮길 수 있다. 말단 구조 반복 단위 상에만 존재하는 하전된 말단기와 달리, 이러한 내부 전하 덴드론에서 모든 경우의 구조 반복 단위 상에 존재할 수 있다.
화학식 I에서 X2에 임의로 나타낸 펩타이드 결합이 존재할 수 있다. 다른 예에서, 화학식 I에 나타낸 펩타이드 결합 대신에, C1 내지 C20 탄화수소 또는 직접 결합이 존재할 수 있다.
A의 경우, 뉴클레오타이드를 전하 태그에 연결하는 링커는 반응 그룹 사이의 연결 반응에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, A는 아자이드(또는 알카인)기를 갖는 뉴클레오타이드와 알카인(또는 아자이드)기를 갖는 전하 태그 사이의 아자이드-알카인 구리 보조 클릭 반응에 의해 형성될 수 있으며, 다음과 같은 화학 구조 또는 이의 등가물을 생성한다:
Figure 112021128458083-pat00034
.
또는, A는 테트라진(또는 트랜스-사이클로옥텐)기를 갖는 뉴클레오타이드와 트랜스사이클로옥텐(또는 테트라진)기를 갖는 전하 태그 사이의 테트라진(TET)-트랜스-사이클로옥텐(TCO) 결찰에 의해 형성될 수 있으며, 하기와 같은 화학 구조 또는 이의 등가물을 생성한다:
Figure 112021128458083-pat00035
.
또는, A는 아자이드(또는 다이벤조사이클로옥타인)기를 갖는 뉴클레오타이드와 다이벤질사이클로옥틸(또는 아자이드)기를 갖는 전하 태그 사이의 아자이드-다이벤조사이클로옥타인(DBCO)기 무 구리 클릭 반응에 의해 형성될 수 있으며, 다음과 같은 구조 또는 이의 등가물을 생성한다:
Figure 112021128458083-pat00036
.
또는, A는 티올(또는 말레이미드)기를 갖는 뉴클레오타이드와 말레이미드(또는 티올)기를 갖는 전하 태그 사이의 티올-말레이미드 접합에 의해 형성될 수 있으며, 다음과 같은 구조 또는 이의 등가물을 생성한다:
Figure 112021128458083-pat00037
.
또는, A는 아민(또는 N-하이드록시숙신이미드 에스터)기를 갖는 뉴클레오타이드와 N-하이드록시숙신이미드 에스터(또는 아민)기를 갖는 하전된 태그 사이의 N-하이드록시숙신이미드 에스터-아민 연결 반응에 의해 형성될 수 있으며, 아미드 결합을 형성한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 적합한 반응 그룹 사이의 다른 결찰 화학에 의해 형성된 다른 연결기는 본 발명에 혼입되어 A에 대한 다른 구조를 형성할 수 있으며 이에 의해 3' 뉴클레오타이드가 전하 태그에 연결될 수 있다.
화학식 I의 B는 전하 태그를 나타낸다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 전하 태그는 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 올리고머 펩타이드 핵산, 또는 덴드론, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 전하 태그의 충전은 포스포다이에스터 결합, 아마이드기, 카복실산기 또는 하나 이상의 설폰산, 포스폰산과 같은 이러한 화합물에 첨가될 수 있는 다른 하전된 작용기 또는 4차 암모늄기와 같은 모이어티의 하전된 작용기에 의해 수행될 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 전하 태그는 특정한 3차원 배향을 채택할 수 있어서 이의 요소에 의해 운반된 전하가 함께 유지되고 전도성 채널로부터 벌어져 떨어져 나가는 것을 방지한다. 전하 태그의 전하 밀도를 증가시킴으로써 전하의 이러한 응축은 전도성 채널에 의해 검출된 전하를 증가시킬 수 있다.
전하 태그는 전술한 바에 따라 클릭 화학 또는 결찰 반응을 형성하기에 적합한 반응 그룹을 갖도록 합성될 수 있다. 예를 들어, 전하 태그는 아자이드 또는 알카인기(예컨대 아자이드-알카인 구리-보조 클릭 반응에 의한 전하 태그로서 뉴클레오타이드 유사체에 공유 부착 및 포함) 또는 테트라진(TET) 또는 트랜스-사이클로옥텐기(예컨대 테트라진(TET)-트랜스-사이클로옥텐(TCO) 결찰에 의한 전하 태그로서 뉴클레오타이드 유사체에 공유 부착 및 포함) 또는 아자이드기 또는 DBCO기(예컨대 아자이드-DBCO기 무 구리 클릭 반응에 의해 전하 태그로서 뉴클레오타이드 유사체에 공유 부착 및 포함), 티올(예를 들어, 시스테인 잔기) 또는 말레이미드기(예컨대, 티올-말레이미드 결찰에 의한 전하 태그로서 뉴클레오타이드 유사체에 공유 부착 및 포함)를 가질 수 있다. 전하 태그에 부착된 상응하는 반응 그룹이 뉴클레오타이드 유사체에의 공유 부착을 허용하는 다른 공지된 결찰, 클릭 화학 또는 다른 공유 부착 화학이 또한 사용될 수 있다.
화학식 I에서 A와 5' 뉴클레오타이드 사이에 도시된 바와 같은 펩타이드 결합이 존재할 수 있다. 다른 예에서, 화학식 I에 도시된 펩타이드 결합 대신에, C1 내지 C20 탄화수소 또는 직접 결합이 존재할 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 일부 예는 어떻게 테더(이에 의해 폴리머라제가 전도성 채널에 테더링된다)의 수용체 영역이 혼성화하거나 뉴클레오타이드 유사체의 특이성 영역과 비 공유 결합을 형성하는지와 관련하여 상기 논의된 특징을 포함하는 화학식 I의 화합물의 변형 또는 변이를 포함한다. 예를 들어, 3' 뉴클레오타이드와 5' 전하 태그 사이의 유사체 뉴클레오타이드의 일부 부분은 뉴클레오타이드, PNA 잔기 또는 폴리머라제가 전도성 채널 또는 자체가 이런 테더의 일부가 아닐 수 있는 전도성 채널로부터 연장되고 부착된 수용체 영역과 기능화된 부분 에 연결되는 터터와 비 공유 결합을 형성할 수 있는 아미노산을 혼입할 수 있고 뉴클레오타이드, PNA 잔기 또는 아미노산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기는 5' 전하 태그와 3' 뉴클레오타이드 사이에 본 발명에 개시된 바와 같은 화학식 I의 화합물의 영역에 대해 치환되거나 첨가될 수 있다. 이러한 치환 또는 첨가는 유사체 뉴클레오타이드의 폴리머라제 및 테더(또는 이런 치환 또는 첨가에 결합하기 위해 테더와는 별개의 전도성 채널의 기능화된 부분)에 대한 상승적인 결합에 기여하여 적절하게 긴 기간 동안의 전하 검출기의 검출 영역과 전하 태그의 연관을 촉진하여 본 발명에 개시된 바와 같이 이런 전하를 보유하는 뉴클레오타이드 유사체의 혼입을 등록하고 표시하는 전하 태그의 검출을 허용한다.
일부 예에서, 전하 태그의 3차원 구조의 채택은 특이성 영역의 다른 공간적으로 분리된 요소들을 함께 모아서 그렇게 조립된 특이성 영역을 수용체 영역에 결합할 수 있게 하는 특이성 영역의 형성을 유도할 수 있다. 이러한 특이성 영역 형성 및 수용체 영역 결합은 전하 태그의 특정 3차원 구조의 채택이 없을 때 발생하지 않거나 발생하지 않을 것 같거나 매우 일시적으로만 발생할 수 있다. 다른 예에서, 수용체 영역에 결합할 때 특정 영역의 다른 이질적인 요소들을 함께 모으는 것은 소정의 3차원 입체 구조의 전하 태그의 채택을 유도하거나 촉진할 수 있다. 일부 예에서, 하전 태그의 3차원 입체 구조의 채택 및 특정 영역의 공간적으로 멀리 있는 요소들이 함께 모이는 것은 서로 상승 작용을 낼 수 있어서 각각이 다른 것을 촉진시킨다. 일부 경우에, 전하 태그에 의해 채택된 3차원 입체 형태는 달리 발생할 수 있는 것보다 더 높은 전하 밀도를 초래하고 전도성 채널에 의한 전하 태그의 검출을 증가시킬 수 있다.
펩타이드 전하 태그의 다양한 디자인이 사용될 수 있다. 고상 펩타이드 합성을 사용하여, 21개 아미노산 중 임의의 것이 전하 태그에 포함될 수 있다. 또한, 변형된 아미노산은 또한 구입 가능하며 펩타이드 전하 태그에 첨가되어 이의 특성을 추가로 조절할 수 있다. 아르기닌, 히스티딘 및 라이신(양성) 및 아스파르트산 및 글루탐산(음성)과 같은 전자적으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산을 사용하는 것 외에도, 다른 아미노산이 펩타이드 전하 태그에 혼입되어 친수성, 길이 및 크기를 조정할 수 있다.
상기 개시된 바와 같이, 하나의 예에서, 펩타이드 전하 태그는 선형(도 12a 참조), 분지형(도 12b 및 12c 참조) 또는 고리형 사슬(도 12d 참조)의 형태로 제공될 수 있다.
다양한 길이의 KKKKK 또는 EEEEE와 같은 상이한 조합의 아미노산(또는 추가의 비 하전된 아미노산을 갖거나 갖지 않는 하전된 아미노산의 다른 조합)을 사용함으로써, 4개의 상이한 뉴클레오타이드 유사체가 시퀀싱을 위해 구별될 수 있거나 다양한 뉴클레오타이드 유사체는 각각의 펩타이드 전하 태그로부터의 특징적인 전류 시그니처에 기초하여 구별될 수 있다. 다른 보다 복잡한 3차원 형태도 가능하다. 예를 들어, 펩타이드 전하 태그는 α-나선과 같은 코일 형태를 채택할 수 있다. 이러한 구조는 양성 및 음성 아미노산을 포함할 수 있지만, 전체적인 양성 또는 음성 전하를 포함할 수 있다. 예를 들어, 반대로 하전된 아미노산의 배치는 그들 사이의 결합을 유도하고 α- 나선형 또는 다른 구조의 채택을 유도할 수 있으며, 여기서 초과 양전하 또는 음전하가 근접하여 함께 유지되어 전하 밀도를 증가시킨다. 다른 예에서, 유사한 결합은 순 양전하 또는 음전하의 밀도를 포함하는 코일형 코일 구조의 채택을 촉진할 수 있다.
하전 태그는 또한 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 전하 태그는 펩타이드 전하 태그를 뉴클레오타이드 유사체에 부착시키기 위해 상기된 클릭 화학 및 결찰 화학 반응을 사용하여 뉴클레오타이드 유사체에 부착될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 전하 태그는 높은 전하 밀도에서 전하를 압축하는 것을 촉진하는 다양한 3차원 배향을 채택할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터 결합은 음전하를 가질 수 있다. 축합된 3차원 구조를 채택함으로써, 올리고뉴클레오타이드의 음전하가 서로 근접하여 유지될 수 있으며, 이러한 전하 태그의 검출을 증가시켜 전도성 채널이 될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 스템-앤-루프 구조, 클로버잎 구조 또는 십자형 구조(예를 들어, 할러데이 접합부)와 같은 주지된 구조를 채택할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 종이 접기 기술은 또한 전하 밀도를 증가시키는 다른 형태를 채택하는 폴리뉴클레오타이드 전하 태그를 디자인하는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 전하 태그는 관형, 환형, 입방형 또는 구형을 채택할 수 있다. 이러한 형상은 동일한 뉴클레오타이드 조성을 갖지만 선형 입체 형태로 뻗어있는 경우와 같이 3차원 입체 구조를 채택하지 않은 올리고뉴클레오타이드가 가질 수 있는 높은 전하 밀도를 갖는 올리고뉴클레오타이드 전하 태그를 초래할 수 있다.
편의성과 명확성을 위해, 명세서, 실시예 및 청구 범위에 사용된 특정 용어가 본 발명에 기술되어 있다.
달리 명시되지 않는 한, 알킬은 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 구조 및 이들의 조합을 포함하는 것으로 의도된다. 알킬은 1 내지 20개의 탄소 원자, 예를 들어 1 내지 10개의 탄소 원자, 예컨대 1 내지 6개의 탄소 원자 등의 알킬기를 의미한다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, n-부틸, s-부틸, t-부틸 등을 포함한다.
사이클로알킬은 탄화수소의 서브 세트이고 3 내지 8개의 탄소 원자의 사이클릭 탄화수소기를 포함한다. 사이클로알킬기의 예는 c-프로필, c-부틸, c-펜틸, 노르본일 등을 포함한다.
C1 내지 C20 탄화수소는 알킬, 사이클로알킬, 폴리사이클로알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴 및 이들의 조합을 포함한다. 예는 벤질, 펜에틸, 프로파질, 알릴, 사이클로헥실메틸, 아다만틸, 캄포릴 및 나프틸에틸을 포함한다. 탄화수소는 유일한 원소 성분으로서 수소 및 탄소로 구성된 임의의 치환기를 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "카보사이클"은 고리 원자가 모두 탄소이지만 임의의 산화 상태인 고리 시스템을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서 (C3-C12) 카보사이클은 사이클로프로페인, 벤젠 및 사이클로헥센과 같은 시스템을 포함하여 비 방향족 및 방향족 시스템 둘 다를 의미한다. 카보사이클은 달리 제한되지 않는 한, 모노사이클, 바이사이클 및 폴리사이클을 의미한다. (C8-C12) 카보폴리사이클은 노르 보네인, 데칼린, 인단 및 나프탈렌과 같은 시스템을 의미한다.
알콕시 또는 알콕실은 산소를 통해 모 구조에 부착된 직쇄형 또는 분지형 구조의 1 내지 20개의 탄소 원자, 예를 들어 1 내지 10개의 탄소 원자, 예컨대 1 내지 6개의 탄소 원자 등의 기를 의미한다. 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 아이소프로폭시 등을 포함한다.
옥사알킬은 하나 이상의 탄소(및 이들의 관련된 수소)가 산소로 대체된 알킬 잔기를 의미한다. 예는 메톡시프로폭시, 3,6,9-트라이옥사데실 등을 포함한다. 옥사알킬이라는 용어는 당업계에서 이해되는 것으로 의도된다[Naming and Indexing of Chemical Substances for Chemical Abstracts, published by the American Chemical Society, 2002 edition, ¶196, 127(a)의 제한 없음 - 전문이 참조로 본 발명에 포함됨]-산소가 단일 결합을 통해 인접 원자에 결합된 화합물(에터 결합 형성)을 의미하며; 카본일기에서 발견되는 바와 같이 이중 결합된 산소를 의미하지 않는다. 유사하게, 티아알킬 및 아자알킬은 하나 이상의 탄소가 각각 황 또는 질소로 대체된 알킬 잔기를 의미한다. 아자알킬의 예는 에틸아미노에틸 및 아미노헥실을 포함한다.
헤테로사이클은 1 내지 4개의 탄소가 N, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 헤테로원자로 대체된 사이클로알킬 또는 아릴카보사이클릭 잔기를 의미한다. 헤테로아릴은 헤테로사이클이 방향족인 헤테로사이클의 서브 세트이다. 헤테로방향족 고리의 예는 푸란, 벤조푸란, 아이소벤조푸란, 피롤, 인돌, 아이소인돌, 티오펜, 벤조티오펜, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 퓨린, 피라졸, 인다졸, 옥사졸, 벤조옥사졸, 아이소옥사졸, 벤즈아이소옥사졸, 티아졸, 벤조티아졸, 트라이아졸, 테트라 졸, 피리딘, 퀴놀린, 아이소퀴놀린, 피라진, 퀴녹살린 아크리딘, 피리미딘, 퀴나졸린, 피리다진, 신놀린, 프탈라진 및 트라이아진을 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "임의로 치환된"은 "치환되지 않은 또는 치환된"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "치환된"은 특정 기에서 하나 이상의 수소 원자를 특정 라디칼로 대체하는 것을 의미한다. 예를 들어, 치환된 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 등은 알킬, 아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클일을 의미하며 여기서 각각의 잔기에서 하나 이상의 H 원자가 할로겐, 할로알킬, 알킬, 아실, 알콕시알킬, 하이드록시저급알킬, 카본일, 페닐, 헤테로아릴, 벤젠설폰일, 하이드록시, 저급알콕시, 할로알콕시, 옥사알킬, 카복시, 알콕시카본일[-C(= O)O-알킬], 알콕시카본일아미노[HNC(=O)O-알킬], 카복사미도[-C(=O)NH2] 알킬아미노 카본일[-C(=O)NH-알킬], 사이아노, 아세톡시, 나이트로, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, (알킬)(아릴)아미노알킬, 알킬아미노알킬(사이클로알킬아미노알킬 포함), 다이알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알콕시, 헤테로사이클일알콕시, 머캅토, 알킬티오, 설폭사이드, 설폰, 설폰일아미노, 알킬설핀일, 알킬설폰일, 알킬설폰일아미노, 아릴설폰일, 아릴설폰일아미노, 아실아미노알킬, 아실아미노알콕시, 아실아미노, 아미디노, 아릴, 벤질, 헤테로사이클일, 헤테로사이클일알킬, 페녹시, 벤질옥시, 헤테로아릴옥시, 하이드록시이미노, 알콕시이미노, 옥사알킬, 아미노설폰일, 트라이틸, 아미디노, 구아니디노, 우레이도, 벤질옥시페닐 및 벤질 옥시로 대체된다. "옥소"는 또한 "임의로 치환된"에 언급된 치환체 중에 포함되며; 옥소가 2가 라디칼이기 때문에, 치환기(예를 들어, 페닐 상의)로서 적합하지 않은 환경이 존재한다는 것이 당업자에게 이해될 것이다. 한 예에서, 1, 2 또는 3개의 수소 원자는 특정 라디칼로 대체될 수 있다. 알킬 및 사이클로알킬의 경우, 3개 초과의 수소 원자가 불소로 대체될 수 있고; 실제로, 이용 가능한 모든 수소 원자는 불소로 대체될 수 있다. 이런 화합물(예를 들어, 퍼플루오로알킬)은 "플루오로탄화수소"의 부류에 속한다. 명백하게, 일반적인 용어는 하나 이상의 치환기를 포함할 수 있는데, 예를 들어, "할로알킬" 또는 "할로페닐"은 적어도 하나이나 아마도 1개 초과의 수소가 할로겐으로 대체되는 알킬 또는 페닐을 의미한다. 일부 예에서, 치환기는 할로겐, 할로알킬, 알킬, 아실, 하이드록시알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 옥사알킬, 카복시, 사이아노, 아세톡시, 나이트로, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬티오, 알킬설핀일, 알킬설폰일, 알킬설폰일아미노 아릴설폰일, 아릴설폰일아미노 및 벤질옥시이다.
본 발명의 화합물을 기술할 때, "하나 이상의 산소화된 치환체로 치환된"이라는 용어가 사용된다. 산소화된 치환기는 탄소 및 수소 외에 산소를 함유하는 치환기이며; 산소화된 치환기는 또한 질소(예를 들어, 카복사미드 또는 메테인설폰일)와 같은 추가 헤테로 원자를 포함할 수 있다. 산소화된 치환기의 전형적인 예는 알콕시, 하이드록시, 플루오로알콕시, 포르밀, 아세틸 및 다른 C1 내지 C6 아실 사슬을 포함한다.
비 제한적 실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정 실시예를 예시하기 위한 것이지, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 발명에 따라 제조된 뉴클레오타이드 내로의 도입을 위한 전하 태그의 일부 예는 다음을 포함한다:
Figure 112021128458083-pat00038
(폴리-T 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 조합).
Figure 112021128458083-pat00039
(폴리 dSpacer) 및
Figure 112021128458083-pat00040
(폴리 Cspacer) 또는 상기한 것 중 임의의 것의 조합.
이러한 전하 태그에 대한 전하는 예를 들어 포스페이트기 함유 모이어티의 수, 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 그 사이의 임의의 수 또는 범위를 변경함으로써 변화될 수 있다. 최대 40개 또는 1 내지 40의 수가 포함될 수 있다. 40개 이상이 포함될 수 있다. 이들 실시예에 도시된 트랜스사이클로옥텐기 이외의 적합한 반응 그룹이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 서열은 포스포다이에스터 결합에서 포스페이트에 의해 다양한 길이의 전하가 부여되는 전하 태그로서 사용될 수 있다. 또한, dSpacer 및 C3 spacer 뉴클레오타이드와 같은 변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 상이한 친수성 및 크기를 갖는 전하 태그를 생성하는 데 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 서열은 서열 특이성을 조절하고, 폴리머라제에 대한 억제를 최소화하며, 표면 및 링커와의 상호 작용을 최적화하기 위해 상이한 염기 및 소수성 변형을 사용하여 변형될 수 있다.
포스포다이에스터 기반 전하 태그는 뉴클레오타이드의 5'-말단 포스페이트에 부착될 수 있다. 주형 가닥에 대한 보체의 합성 동안 폴리머라제에 의해 각각의 뉴클레오타이드를 성장 가닥으로 도입시, 전하 표지는 피로포스페이트 부산물의 일부로서 방출될 수 있다. 표지상의 전하는 전도성 채널 상의 검출 시스템에 의해 검출된다. 각각의 태그(예를 들어, 전하 크기)로부터의 특징적인 전류 시그니처에 기초하여, 합성 가닥에 혼입된 염기는 태그에 의해 부여된 차등 크기의 전하를 사용하여 구별될 수 있다.
본 발명에 따른 유사체 뉴클레오타이드의 예는 제한 없이 다음을 포함한다:
Figure 112021128458083-pat00041
Figure 112021128458083-pat00042
포스포다이에스터 기반 전하 태그를 포스포르아미다이트 화학 및 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성을 사용하여 합성하였다. 이들을 합성 후 정제한 후, 직교 화학 방법을 통해 특정 뉴클레오타이드에 부착시켰다. 직교 화학 방법은 구리 촉매화된 알카인-아자이드, DBCO 및 아자이드를 사용한 무 구리 클릭 화학, TCO-테트라진 결찰 또는 티올-말레이미드 결찰을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
하기의 비 제한적인 예는 포스포다이에스터 전하 태그에 직교 부착 화학 반응을 허용하기 위해 다양한 링커로 5' 아미노 뉴클레오타이드 헥사포스페이트의 변형을 나타낸다. 5'-아민 데옥시-티민 헥사 포스페이트(dT6P)(또는 다른 NPP)(1)를 아지도-부티르산 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스터(2a) 또는 메틸테트라진 NHS 에스터(2b)로 기능화시켜 아자이드 dT6P(3a) 또는 메틸테트라진 dT6P(3b)을 각각 형성할 수 있다(반응식 1).
Figure 112021128458083-pat00043
반응식 1. 5'-아민 dT6P의 기능화.
아자이드 dT6P(3a)를 CuSO4, 트리스-하이드록시프로필트라이아졸릴메틸아민(THPTA) 리간드 및 아스코르브산 나트륨의 존재하에 구리(I)-보조된 아자이드-알카인 고리 첨가(CuAAC)를 통해 5'-헥사인일기를 갖는 폴리-T 올리고뉴클레오타이드(4)의 선형 가닥에 접합되어 올리고 뉴클레오타이드 접합체(5a)를 형성할 수 있다. C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 정제를 수행하고 50mM TEAA(pH 7.5) 및 아세토나이트릴로 용리시켰다. 폴리-T 올리고뉴클레오타이드와의 CuAAC 반응의 대표적인 예가 반응식 2에 도시된다.
Figure 112021128458083-pat00044
반응식 2. 대표적인 CuCCA 반응.
메틸테트라진 dT6P(3b)를 50mM 포스페이트 완충액(pH 7.4)에서 5'-트랜스사이클로옥텐(TCO) 그룹으로 폴리-T 올리고뉴클레오타이드(6)의 선형 가닥에 접합시켜 올리고 뉴클레오타이드 접합체(5b)를 형성하였다. 정제를 C18 역상 HPLC 상에서 수행하고 50mM TEAA(pH 7.5) 및 아세토나이트릴로 용리시켰다. 메틸테트라진-TCO 결찰의 대표적인 예가 반응식 3에 도시된다.
Figure 112021128458083-pat00045
반응식 3. 대표적 메틸테트라진-TCO 결찰.
아자이드 dT6P(3a)를 50mM 포스페이트 완충제(pH 7.4)에서 무 구리 변형 촉진 아자이드-알킨 사이클로 첨가(SPAAC)를 통해 5'-다이벤조사이클로옥틸(DBCO) 그룹과 폴리-T 올리고뉴클레오타이드(7)의 선형 가닥에 접합시켜 올리고뉴클레오타이드 접합체(5c)를 형성하였다. 정제를 C18 역상 HPLC 상에서 수행하고 50mM TEAA(pH 7.5) 및 아세토나이트릴로 용리시켰다. 폴리-T 올리고뉴클레오타이드와의 SPAAC 반응의 대표적인 예가 반응식 4에 도시된다.
Figure 112021128458083-pat00046
반응식 4. 대표적인 DBCO- 아자이드 접합.
다음 반응식에서, 아자이드-알카인 클릭 반응은 뉴클레오타이드 폴리포스페이트를 전하 태그에 연결시켰다:
Figure 112021128458083-pat00047
반응식 5. 클릭 화학에 의한 대표적인 접합.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상기 예는, 예를 들어 결찰 반응 또는 클릭 화학 반응의 각각의 반응성 그룹의 배치를 역전시킴으로써 변형될 수 있고, 유사체 뉴클레오타이드의 5 '및 3' 말단에 대해 반대 방향으로 배향되는 상기 결합을 생성할 수 있다.
반응 그룹 및 링커 화학은 본 발명에 따른 다양한 적용 가능한 화학에 따라 뉴클레오타이드 및 전하 태그에 부가될 수 있다. 일부 비 제한적인 예에서, 아자이드 또는 메틸테트라진 테일은 다양한 길이의 링커 부분, 예컨대 PEG4 링커 또는 다양한 길이의 PEG 링커를 포함할 수 있는 적절한 NHS 잔기와의 반응에 의해 아민화 NPP에 첨가될 수 있다. 이러한 합성 반응식의 비 제한적 예는 다음 및 그의 변형을 포함한다:
Figure 112021128458083-pat00048
상이한 NHS-모이어티를 사용하여 다양한 링커 길이로 아자이드 또는 메틸테트라트라진 반응 그룹을 첨가하였다. 비 제한적인 예는 다음을 포함한다:
Figure 112021128458083-pat00049
클릭 또는 결찰 화학 반응에 대해 상이한 반응성 그룹으로 다양한 NPP를 형성하여 이들을 전하 태그와 공유 결합시켰다. 일부 비 제한적인 예는 다음을 포함한다:
Figure 112021128458083-pat00050
은
알카인 함유 전하 태그와 반응하여, 예를 들어, 다음을 생성하였다:
Figure 112021128458083-pat00051
.
선택적으로,
Figure 112021128458083-pat00052
와 같은 메틸테트라진 함유 NPP는 TCO-함유 전하 태그와 반응하여 다음을 형성하였다:
Figure 112021128458083-pat00053
다른 실시예에서, NPP와 전하 태그 사이의 DBCO-아자이드 클릭 화학을 사용하여 다음과 같은 화합물을 형성하였다:
Figure 112021128458083-pat00054
다른 실시예에서, 뉴클레오타이드 또는 전하 태그 상의 말레이미드기는 각각 전하 태그 또는 뉴클레오타이드 상의 티올 기와 반응하여 말레이미드-티올 반응을 통해 둘을 연결시킬 수 있다:
(트리스(2-카복시에틸)포스핀)과 같은 환원제의 존재하에서 전하 태그 또는 티올-함유기를 함유하는 NPP와 반응한 말레이미드기
Figure 112021128458083-pat00055
를 함유하는 NPP 또는 전하 태그는 둘 사이에 공유 결합, 예를 들어,
Figure 112021128458083-pat00056
을 초래하였다.
표 2에 도시된 바와 같이, 다양한 구리염, 리간드, 첨가제, 용매, 반응 시간 및 반응 온도가 상이한 구리 보조 클릭 화학에 사용될 수 있다.
구리 보조 클릭 화학
Cu 염 리간드 첨가제 용매 기간 T
Deg. C		 소견
CuBr (10) TBTA (20) - DMSO/t-BuOH 밤새 40 생성물 없음, N3-dT6P 회수
CuSO4 (25) THPTA (50) Na Asc (50) H2O 2h RT 불완전 반응, 생성물 형성
CuSO4 (500) PMDETA (3500) Na Asc (10000) H2O 1h RT N3-dT6P 회수
CuSO4 (500) THPTA (3500) Na Asc (10000) H2O 밤새 RT 낮은 수율로 생성물 형성
CuSO4 (25) THPTA (50) Na Asc (eq) H2O 밤새 RT 생성물 형성, 불완전 반응
4 생성물 형성, 불완전 반응, 일련의 높은 수율
-20 생성물 형성, 불완전 반응, 일련의 낮은 수율
CuSO4 (10) TBTA (20) Na Asc (200) DMSO/t-BuOH 밤새 RT 생성물 없음, 모두 SMs 존재
CuSO4 (10) THPTA (20) Na Asc (200) H2O 밤새 RT 생성물 형성, 불완전 반응
CuSO4 (100) THPTA (300) Na Asc (1000) H2O 24 h RT 생성물 형성, 불완전 반응
알 수 있는 바와 같이, 일반적으로, 높은 Cu 로딩에서, 반응은 완료될 수 있지만 수율은 낮을 수 있다. 상대적으로, 낮은 Cu 로딩으로, 반응이 완전히 완료되지 않을 수 있지만 수율은 더 높을 수 있다. 중간 Cu 로딩으로, 반응이 완료될 수 있고 HPLC에 의해 반응 생성물을 86% 수율로 분리할 수 있다.포스포다이에스터 기반 전하 태그 변형 뉴클레오타이드의 혼입이 입증되었다. 혼입은 합성에 의한 시퀀싱에 사용된 phi29(및 이의 변이체) 및 클레노프 단편, 또는 다른 것들과 같은 상이한 폴리머라제와 함께 수행될 수 있다. 두 폴리머 라제는 전하 태그를 성공적으로 혼입할 수 있다. 이 실시예의 경우 phi29에 의한 혼합이 도 11에 도시되어 있다. 이 실시예에서, 단일 가닥 DNA 주형 폴리뉴클레오타이드 서열을 중합된 기질에 고정시키고 주형에 기초하여 프라이머에 단일-뉴클레오타이드 혼입을 위해 이런 주형 서열의 일부에 상보적인 100nM 5'-Cy5-표지된 DNA 프라이머(22-mers), 1μM phi29 및 10μM의 소정의 뉴클레오타이드를 함유하는 완충 용액(50 mM Tris pH 7.5, 5mM MnCl2, 4 mM DTT)과 함께 배양하였다. 섭씨 30도에서 다양한 시간 동안 배양한 후, 전하-태그된 티미딘의 5' 혼입(주형 가닥 상의 아데노신 잔기에 상보적인 부분이 프라이머에 상보적인 부분에 즉시 5')을 허용하기 위해, 폴리머라제 반응을 급랭하고, 프라이머를 탈혼성화하고 단일 뉴클레오타이드 혼입을 검출하기 위해 겔 상에서 분리하였다. 데옥시리보-티미딘 5'-헥사포스페이트(dT6P) 사이의 결합은 전하 태그로서 티미딘 뉴클레오타이드의 표시된 반복체를 갖는 T5, T10 및 T15를 포함하고; T5, T10 및 T15는 클릭 화학을 통해 부착되는 반면, T5-Tet은 테트라진-TCO 결찰을 통해 부착된다. C3 Spacer(C3) 및 dSpacer(d) 올리고는 또한 TCO-테트라진 결찰을 통해 부착된 하전된 태그로서 사용되었다. TMR은 하기 화학식을 갖는 테트라메틸로다민-표지된 dT6P이다:
Figure 112021128458083-pat00057
dTTP는 대조군으로서 작용하는 전하 또는 표지가 없는 데옥시-티미딘 트라이포스페이트이다.
도 1을 참조하면 도 11, 1110, 1120 및 1130은 각각 개별적으로 dTTP, T10 또는 T5의 각각 % 혼입을 나타내고(도표가 서로 겹쳐서 도 11에서 서로 거의 구별 할 수 없음), 1140은 T15에 의한 혼입을 나타내고 1150은 T5-Tet에 의한 혼입을 나타내고, 1160, 1170 및 1180은 각각 개별적으로 TMR, d 및 C3의 혼입 %를 나타낸다(도표가 서로 겹쳐서 도 11에서 서로 거의 구별 할 수 없음).
본 발명에 따른 펩타이드 전하 태그를 갖는 뉴클레오타이드 유사체를 합성하는 데 사용되는 합성 계획식의 비 제한적인 예는 아래에 도시된다.
Figure 112021128458083-pat00058
다른 예에서, 상기 예시된 바와 같이 양으로 하전된 리신 잔기 대신에, 다음과 같은 음으로 하전된 아미노산으로 하전 태그를 합성하기 위해 유사한 반응식이 사용되었다:
Figure 112021128458083-pat00059
당업자에게 명백한 바와 같이, 이 방식에 대한 많은 변형이 본 발명에 따라 가능할 것이다. 예를 들어, 상기 기재된 하전된 또는 하전되지 않은 아미노산 중 임의의 것을 포함하여 리신 이외의 아미노산이 사용될 수 있으며, 이들은 본 실시예에 도시된 펩타이드 전하 태그 길이보다 많거나 적을 수 있다. 따라서 다른 원자가 및 크기의 전하를 갖는 펩타이드 전하 태그가 사용될 수 있다.
또한, 추가의 비 제한적인 예와 같이, 상이한 반응 그룹이 상이한 유형 및 길이의 링커 부분으로 뉴클레오타이드 유사체의 5' 말단에 첨가될 수 있다:
Figure 112021128458083-pat00060
Figure 112021128458083-pat00061
이들 첨가는 비 제한적인 예로서 다음을 포함하는 다양한 유형 및 길이의 링커에 의해 부가된 아자이드 또는 메틸테트라트라진 반응 그룹을 포함하는 다양한 반응 그룹을 갖는 뉴클레오타이드 유사체를 수득할 수 있다:
Figure 112021128458083-pat00062
또 다른 실시예에서, 알카인, TCO 또는 DBCO 그룹이 유사하게 또는 티올기가 첨가되었다. 이어서, 상응하는 반응 그룹이 펩타이드 전하 태그에 첨가되어 둘이 상기 개시된 클릭 또는 결찰 화학, 또는 당업자에게 공지된 다른 것에 의해 연결될 수 있다. 펩타이드 기반 전하 태그는 고체상 펩타이드 합성을 위해 플루오레닐메틸옥시카본일(Fmoc) 및 tert-부틸옥시카본일(Boc) 보호기 화학을 사용하여 합성될 수 있다. 뉴클레오타이드 또는 핵산과의 접합을 허용하기 위해, 말단에서 펩타이드 합성에 직교 "핸들" 반응 그룹이 도입될 수 있다. 직교 화학 방법은 아자이드-알카인 구리 보조 클릭 반응, DBCO 및 아자이드와의 무 구리 클릭 화학 및 TCO-테트라진 결찰을 포함한다. 시스테인의 티올과 같은 아미노산의 반응성 측쇄가 또한 티올-말레이미드 화학에 사용될 수 있다.
상이한 pKas를 갖는 측쇄를 함유하는 아미노산의 이용 가능성은 상이한 pH에서 하전될 펩타이드 하전 태그를 허용한다. 예를 들어, 히스티딘은 6.04의 pKa를 갖는 반면, 리신은 10.54의 pKa를 갖는 측쇄를 갖는다. 따라서, 중성 pH에서, 리신 만이 충전될 수 있다. 이것은 또한 완충액 환경의 pH를 변형하여 전하 수와 전하 밀도의 추가 조절을 가능하게 한다.
또한, 펩타이드 및 PNA 둘 모두가 동일한 고상 펩타이드 화학으로 합성되기 때문에, 펩타이드 전하 태그를 펩타이드 핵산(PNA) 올리고머에 용이하게 첨가할 수 있다. 이는 펩타이드 전하 태그의 특성을 추가로 변형시키거나 전하 태그의 연관 특성을 핵산 기반 링커와 같은 링커에 추가하는 데 사용될 것이다.
덴드론 전하 태그의 합성에 사용되는 화합물 및 말단 구조 반복 단위당 상응하는 전하의 예는 다음을 포함한다 :
Figure 112021128458083-pat00063
이들 실시예에서, 개별 구조 반복 단위의 분지점과 자유 말단 사이의 상이한 잠재적 스템 길이뿐만 아니라, 덴드론의 자유 원자가 말단에 상이한 반응 그룹이 도시되어 있지만, 이들은 단지 비-제한적인 예이다.
다음의 반응식은 가능한 덴드론 전하 태그 구조의 예시적인 예를 제공한다:
Figure 112021128458083-pat00064
예를 들어, 아마이드 결합 및 (A) 말단 카복실산 또는 (B) 아미노기를 갖는 덴드론; 폴리(프로필렌 이민)(PPI) 결합 및 (C) 말단 카복실산 또는 (D) 아미노기를 갖는 덴드론; 및 에스터 결합 및 (E) 말단 카복실산 또는 (F) 아미노기를 갖는 덴드론이 도시된다.
일반적으로, 덴드론 전하 태그는 다음의 대표적인 반응식에 따라 발산 또는 수렴 합성 방법에 따라 합성될 수 있다:
Figure 112021128458083-pat00065
발산 합성(A)에서, 덴드론은 코어로부터 일련의 외향 연장 반응에 의해, 일반적으로 반복적인 마이클 첨가에 의해 조립된다. 수렴 합성(B)에서, 덴드론은 주변으로부터 일련의 내부 건축 반응에 의해 만들어져 결국 코어에 부착된다.
본 발명에 따른 이러한 발산 합성 방식의 일부 예는 다음과 같다:
Figure 112021128458083-pat00066
이들 실시예에서, 메타크릴레이트기를 마이클 첨가에 의해 알카인 줄기에 첨가한 다음, 아세틸기를 탈보호하여 카복실산기을 형성하거나 에틸렌다이아민을 첨가하여 아미노기를 형성한다. 마이클 첨가의 반복 사이클은 이전 세대에 비해 2배의 말단 작용기 수를 갖는 연속적인 덴드론 생성을 초래하였다. 추가 세대가 첨가될 수 있으며, 다른 반응성 그룹이 스템/자유 원자가 말단에 사용될 수 있다. 일부 예에서, 태그에 의해 운반되는 전하를 증가시키기 위해 전술한 합성 방식에 따라 추가 세대 이상이 반복적으로 첨가될 수 있다. 전하의 원자가는 말단기에 양 또는 음으로 하전된 아미노산을 혼입함으로써 변할 수 있다. 예가 도 18a 및 18b에 도시되어있다. 비 제한적인 예에서, 시스테인 잔기에서 종결되는 전하 태그가 도시되어 있으며, 이는 본 발명에 개시된 바와 같이 뉴클레오타이드를 충전하기 위한 링커 섹션에 연결될 수 있으나 본 발명에 개시된 다른 화학도 또한 예로서 의도된다. 도 18a에서, 2, 3 또는 4개의 분지 후 말단 그룹에 대해 양으로 하전된 리신 잔기는 상이한 말단 전하 크기를 생성한다. 대안적으로, 도 18b에 도시된 바와 같이, 글루타메이트와 같은 음으로 하전된 아미노산은 다양한 분지의 분지 후에 말단기를 형성할 수 있고, 다시 상이한 크기의 말단 전하를 생성할 수 있다.
다른 예에서, 전하 태그 내의 하나 이상의 리신 잔기는 메틸화(예를 들어, 트라이메틸화)될 수 있다. 비 메틸화 리신과 달리, 트라이메틸화 리신의 전하는 pH 의존적이지 않다.
자유 원자가 말단에 DBCO를 갖는 다른 예는 다음과 같다:
Figure 112021128458083-pat00067
덴드론 전하 태그 및 이들의 합성을 위한 아마이드 기반 및 PPI 덴드론 디자인의 일부 예는 다음을 포함한다:
Figure 112021128458083-pat00068
실시예 C-1 및 C-2에 포함된 4차 암모늄기의 일부 장점은 이들이 합성 및 처리 동안 pH에 영향을 받지 않을 수 있고, 금속을 배위할 수 없으며, 폴리(바이닐포스폰산)(PVPA)에 부착될 가능성이 적다는 것이다.
다른 실시예에서, 3도의 분지까지 구조 반복이 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 발산 합성보다는 수렴 합성이 사용될 수 있다. 3도의 분지를 갖는 단위를 사용하는 것의 이점은 단지 2도의 분지를 갖는 단위를 갖는 덴드론과 비교하여 세대당 더 많은 전하가 추가될 수 있고, 소정의 바람직한 전하를 얻는 데 필요한 세대가 더 적다는 것이다. 한 예는 다음과 같다:
Figure 112021128458083-pat00069
이 예에서, 구조 반복 단위는 tert-부틸옥시카본일(Boc)기로 기능화된다. 그 후,
Figure 112021128458083-pat00070
DBCO기를 첨가하고 아세틸기를 탈보호할 때 카복실산기를 형성하였다. 이 경우, 생성된 화합물은 -3 전하를 갖는다. 후속 반응에서, 상기 화합물 A를 2세대 덴 드론에 첨가하여 하기와 같이 9의 전하를 수득하였다:
Figure 112021128458083-pat00071
전술한 단계들을 반복적으로 조합함으로써, 다음의 예에 따라, 수렴 합성을 통해 -27의 전하를 갖는 제 3 세대 덴드론을 생성하기 위해 3개의 2도 덴드론이 결합될 수 있다:
Figure 112021128458083-pat00072
음으로 하전된 카복실산기를 갖는 덴드론을 다음과 같이 양으로 하전된 아민기를 갖는 덴드론으로 전환시켰다:
Figure 112021128458083-pat00073
다른 예에서, 카복실산기를 다음 반응식에 따라 아민기로 전환시켰다:
Figure 112021128458083-pat00074
제 2 세대의 경우, +9 전하로, 다음 반응식을 사용하였다:
Figure 112021128458083-pat00075
또한, 수렴 합성 방식에 의해 제 3 세대 덴드론을 합성하여 다음과 같이 +27 전하의 덴드론을 생성할 수 있다:
Figure 112021128458083-pat00076
상기 기술된 임의의 예를 제한 없이 포함할 수 있는 본 발명에 따라 합성된 덴드론의 자유 원자가 말단의 반응 그룹에 따라, 상응하는 한 쌍의 반응 그룹은 뉴클레오타이드 유사체에 부가되어 뉴클레오타이드 유사체로의 하전 태그 덴드론의 결찰을 허용할 수 있다. 상기에 따르면, -32, -27, -16, -9, -8, -4, -3, -2, +2, +3, +4, +8, +9, +16, +27, 및 +32를 포함하는 광범위한 전하가 뉴클레오타이드 유사체에 포함될 수 있다. 상기 비 제한적이고 예시적인 합성 반응식에 예시된 것 이외의 하전된 작용기가 또한 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 이러한 분지 구조는 다수의 포스포다이에스터-기반 전하를 전하 태그에 첨가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드의 단일 선형 가닥 또는 다른 포스포다이에스터 함유 전하보다는, 본 발명에 도시된 덴드론 구조에 따른 것과 같은 분지형 구조는 말단기로서 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같은 덴드론 구조에 따라 연속적인 세대에서 이러한 포스포다이에스터-함유 태그의 분지를 기초로 함으로써, 다수의 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 포스포다이에스터-기반 전하가 단일 전하 태그로 조합될 수 있다. 예를 들어, 덴드론-기반 구조가 도 17a 및 b에 도시되어 있다. 도 17a는 3개의 폴리-T 서열을 단일 태그로 조합하는 태그의 예를 도시하며, 이는 본 발명에 따른 방법에 따라 화학식 I의 화합물에 혼입될 수 있다. 이 예에서 태그는 -30의 전하를 운반할 수 있다. 도 17b는 포스포다이에스터-함유 태그를 조합하여 소정의 전하(이 예에서, -30)를 생성하는 여러 방법을 예시한다: 30개의 포스포다이에스터 전하의 선형 서열, 10의 3개의 포스포다이에스터 서열로 종결되는 삼중-분지형 구조, 또는 중복 분지화 3회 및 5의 6개의 포스포다이에스터 서열에서 종결되는 구조. 첫 번째와 비교하여 마지막 예에서와 같이 증가된 분지의 장점은 전도성 채널로부터 멀리 확장될 수 있는 단일 확장 서열과 반대로 서로 근접한 짧은 전하 서열의 높은 농도로 더 높은 전하 밀도일 수 있다.
다른 실시예에서, 전하는 전하 태그의 스퍼민-기반 성분에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 스퍼민-기반 올리고 양이온 전하가 뉴클레오타이드에 첨가될 수 있고 본 발명에 따라 전하 태그로서 양전하를 제공할 수 있다. 올리고-스퍼민 접합체는 pH 7에서 대략 2.5개의 양성자화된 아민을 갖는다. 이러한 전하 태그된 뉴클레오타이드의 예는 도 19a 및 19b에 도시되어 있다. 도 19a는 본 발명의 한 양태에 따른 올리고-스퍼민 접합체의 예를 도시하며 도 19b는 전하 태그의 말단에 위치할 수 있는 전하량을 확대하기 위해 스퍼민-유래 말단기를 갖는 덴드론 구조화된 태그를 도시한다. 두 실시예에서, 뉴클레오타이드에 전하 태그를 부착하기 위해 본 발명에 개시된 화학은 본 발명의 양태에 따라 이런 스퍼민-유래 전하 태그를 뉴클레오타이드에 부착하기 위해 당업자에 의해 조정될 수 있다.
하기의 비 제한적인 예는 덴드론 전하 태그에 직교 부착 화학 반응을 허용하기 위한 다양한 링커를 이용한 5' 아미노뉴클레오타이드 헥사포스페이트의 변형을 보여준다. 5'-아민 데옥시-티민 헥사포스페이트(dT6P)(또는 다른 NPP)(1)는 아지도-부티르산 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스터(2a) 또는 메틸테트라진 NHS 에스터(2b)로 기능화되어 각각 아자이드 dT6P(3a) 또는 메틸테트라진 dT6P(3b)를 형성할 수 있다(반응식 6).
Figure 112021128458083-pat00077
반응식 6. 5'-아민 dT6P의 기능화.
아자이드 dT6P(3a)를 CuSO4, 트리스-하이드록시프로필트라이아졸릴메틸아민(THPTA) 리간드 및 아스코르브산 나트륨의 존재하에 구리(I)-보조된 아자이드-알카인 고리 첨가(CuAAC)를 통해 5'-헥사인일기를 갖는 폴리-T 올리고뉴클레오타이드(4)의 선형 가닥에 접합되어 올리고 뉴클레오타이드 접합체(5a)를 형성할 수 있다. C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 정제를 수행하고 50mM TEAA(pH 7.5) 및 아세토나이트릴로 용리시켰다. 이어서, 메틸 테트라진 dT6P(3b)를 50mM 포스페이트 완충액(pH 7.4)에서 트랜스사이클로옥텐(TCO)기를 갖는 덴드론에 접합시켜 덴드론 전하 태그를 갖는 뉴클레오타이드 유사체를 형성할 수 있다.
대안적으로, 아자이드 dT6P(3a)를 또한 50mM 포스페이트 완충액(pH 7.4)에서 무 구리 변형 촉진 아자이드-알카인 사이클로첨가(SPAAC)를 통해 다이벤조사이클로 옥틸(DBCO)기를 갖는 덴드론 전하 태그에 접합하여 덴드론 전하 태그를 갖는 뉴클레오타이드 유사체를 형성할 수 있다.
하기 반응식에서, 아자이드-알카인 클릭 반응은 자유 원자가 말단에서 알카인기를 갖는 덴드론 전하 태그와 같은 뉴클레오타이드 폴리포스페이트를 전하 태그에 연결시키기 위해 이루어질 수 있다:
Figure 112021128458083-pat00078
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상기 예는, 예를 들어 결찰 반응 또는 클릭 화학 반응의 각각의 반응성 그룹의 배치를 역전시킴으로써 변형될 수 있고, 유사체 뉴클레오타이드의 5 '및 3' 말단에 대해 반대 방향으로 배향되는 상기 결합을 생성할 수 있다.
반응 그룹 및 링커 화학은 본 발명에 따른 다양한 적용 가능한 화학에 따라 뉴클레오타이드 및 전하 태그에 부가될 수 있다. 일부 비 제한적인 예에서, 아자이드 또는 메틸테트라진 테일은 다양한 길이의 링커 부분, 예컨대 PEG4 링커 또는 다양한 길이의 PEG 링커를 포함할 수 있는 적절한 NHS 잔기와의 반응에 의해 아민화 NPP에 첨가될 수 있다. 이러한 합성 반응식의 비 제한적 예는 다음 및 그의 변형을 포함한다:
Figure 112021128458083-pat00079
상이한 NHS-모이어티를 사용하여 다양한 링커 길이로 아자이드 또는 메틸테트라트라진 반응 그룹을 첨가하였다. 비 제한적인 예는 다음을 포함한다:
Figure 112021128458083-pat00080
클릭 또는 결찰 화학 반응에 대해 상이한 반응성 그룹으로 다양한 NPP를 형성하여 이들을 전하 태그와 공유 결합시켰다. 일부 비 제한적인 예는 다음을 포함한다:
Figure 112021128458083-pat00081
이것은 자유 원자가 말단에서 알카인기를 갖는 덴드론 전하 태그와 같은 알카인-함유 전하 태그와 반응할 수 있다.
선택적으로,
Figure 112021128458083-pat00082
와 같은 메틸테트라진 함유 NPP는 자유 원자가 말단에서 TCO기를 갖는 덴드론 전하 태그와 같은 TCO-함유 전하 태그와 반응할 수 있다.
다른 예에서, NPP와 덴드론 전하 태그 사이의 DBCO-아자이드 클릭 화학이 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 뉴클레오타이드 또는 전하 태그 상의 말레이미드기는 각각 전하 태그 또는 뉴클레오타이드 상의 티올 기와 반응하여 말레이미드-티올 반응을 통해 둘을 연결시킬 수 있다:
(트리스(2-카복시에틸)포스핀)과 같은 환원제의 존재하에서 전하 태그 또는 티올-함유기를 함유하는 NPP와 반응한 말레이미드기
Figure 112021128458083-pat00083
를 함유하는 NPP 또는 전하 태그는 둘 사이에 공유 결합, 예를 들어,
Figure 112021128458083-pat00084
을 초래하였다.
높은 전하 밀도를 야기할 수 있는 3차원 형태를 갖는 전하 태그의 일부 비 제한적이고 예시적인 예가 도 13a-c, 14a, 14b, 15 및 16에 도시된다. 도 13-c는 올리고뉴클레오타이드 전하 태그를 갖는 뉴클레오타이드 유사체의 3가지 예를 도시한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 전하 태그는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40개 이상의 올리고뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 또한 전도성 채널, 이 경우 나노와이어, 및 전도성 채널에 대한 기능화된 부착물, 특히 수용 영역이 도시되어있다. 수용 영역은 "Glue"로 표시된다. 올리고뉴클레오타이드 전하 태그는 변형된 뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 연장되는 점선으로 도시된다. 전하 태그가 취할 수 있는 3가지 다른 형태가 도시된다. 예를 들어, 도 13a는 인식 가능한 스템-앤- 루프 구조를 도시한다. 이러한 구조에서, 스템 부분을 따라 뉴클레오타이드는 서로 쌍을 이루며, 이들 사이에 루프 부분을 남기고, 이 예에서는 수용체 영역으로부터 멀어지는 방향으로 도시된다. 이에 의해, 올리고뉴클레오타이드 전하 태그의 뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터 결합으로부터의 음전하는 서로 근접하여 유지될 수 있고, 이들이 선형의 신장-배치 형태를 채택한 경우 얻을 수 있는 것보다 더 높은 전하 밀도를 유지한다.
예를 들어, 도 13b는 스템 앤 루프 구조를 도시하지 않으나 전하 태그의 돌출 영역을 도시하는 다른 예를 도시한다. 이 경우, 도 13a에서와 같이, 전하 태그는 수용체 영역에 결합되는 것으로 도시된 특이성 영역을 포함한다. 여기서, 특이성 영역은 올리고뉴클레오타이드가 선형으로 신장되는 상황하에서 공간적으로 서로 이격된 올리고뉴클레오타이드의 세그먼트를 포함한다. 그러나, 수용체 영역과 연관시키기 위해 정전기적 인력에 의해 유도될 때, 특이성 영역의 부분은 서로 더 가깝게 끌어 당겨진다. 이 형태는 충전 태그의 전하 밀도의 증가를 야기하는 스템 앤 루프 형태(도 13a) 또는 돌출 형태(도 13b)의 채택과 일치한다.
도 13c는 클로버잎 구조를 채택한 전하 태그를 도시한다. 스템 앤 루프 입체 형태와 유사하게, 중앙 허브로부터 연장되는 스템은 왓슨-크릭 쌍 결합 규칙에 의해 서로 끌리는 뉴클레오타이드 가닥에 의해 형성되며, 이들 사이의 루프에 의해 함께 유지된다. 중심 허브에서 방출되는 줄기 사이에 올리고뉴클레오타이드의 연결 가닥이 있다. 다른 예에서와 같이, 전하 태그에서 뉴클레오타이드 염기의 쌍 결합은 태그가 뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터 결합의 음전하가 함께 축합하여 올리고뉴클레오타이드가 선형으로 뻗어 있는 경우의 밀도에 비해 전하 밀도를 증가시킨다.
올리고뉴클레오타이드 전하 태그의 다른 3차원 입체 구조가 가능하다. 뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터 결합의 음전하는 왓슨-크릭 염기쌍으로 인해 높은 전하 밀도로 모이도록 유도될 수 있다. 예를 들어, DNA 종이 접기 방법론을 사용하여, 관형, 원형, 직육면체, 나선형, 응축된 나선형, 구형 또는 회전 타원체, 또는 높은 전하 밀도를 생성하는 다른 형태로 올리고뉴클레오타이드 전하 태그를 생성하는 다양한 3차원 형태가 채택될 수 있다.
도 14는 올리고뉴클레오타이드 서열(왼쪽 14a)을 포함하고 다른 하나는 펩타이드 핵산 서열 및 폴리펩타이드(오른쪽 14b) 외에 이러한 서열을 포함하는 2개의 전하 태그의 예를 도시한다. 이들 전하 태그와 뉴클레오타이드 유사체 사이의 연결은 도시되어 있지 않지만, 이러한 부착은 본 발명에 개시되거나 달리 공지된 것과 같은 화학적 연결 기술에 의해 수행될 수 있다. 좌측 14a의 형태는 십자형이다. 4개의 올리고뉴클레오타이드 서열은 (DNA 재조합 이벤트 동안 발생할 수 있는 바와 같이) 홀리데이 구조와 유사한 형태로 함께 결합된다. 14a에 도시된 바와 같이, 4개의 폴리뉴클레오타이드의 일부는 왓슨-크릭 염기쌍에 따라 서로 결합한다. 각각의 올리고뉴클레오타이드는 또한 쌍 결합 중앙 부분으로부터 단일 가닥 오버행으로 연장된다. 쌍 결합은 올리고뉴클레오타이드 내에서 포스포다이에스터 결합의 음전하를 서로 근접하게 유지하여 전하 밀도를 증가시킨다.
오른쪽 14b에서, 펩타이드 핵산 및 폴리펩타이드 서열이 14a에 도시된 전하 태그에 첨가되어, 전하 태그의 또 다른 비 제한적인 예를 생성한다. 이 예에서, 펩타이드 핵산의 4개 서열은 각각 그 말단에서 폴리펩타이드 서열을 연결한다. 폴리펩타이드 서열은 폴리펩타이드 내의 일부 아미노산 사이의 정전기적 인력으로 인해 나선형 구조를 형성한다. 그러나, 이들 예에서, 폴리펩타이드는 (순수한 입체 형태의 채택을 보조하는 일부 음으로 하전된 아미노산의 포함에도 불구하고) 순 양전하를 갖는다. 폴리펩타이드 쌍을 연결하는 펩타이드 핵산 서열의 일부는 또한 염기쌍 코어로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분에 혼성화된다. 양으로 하전된 폴리펩타이드의 펩타이드 핵산과 강화된 코일 형태 사이의 강한 결합은 하전 태그의 순-양전하 및 높은 하전 밀도를 허용한다. 유사한 구조를 채택하는 전하 태그의 다른 예는 순 음전하를 가질 수 있다.
도 15는 폴리펩타이드가 높은 전하 밀도를 초래하는 상이한 3차원 구조를 채택하는 폴리펩타이드 전하 태그의 일부 예를 도시한다. 폴리펩타이드의 코일 부분은 링커 서열에 의해 연결될 수 있다. 링커 서열이 상당히 짧은 경우, 코일 구조는 대략 전체 선형 어레이에서 서로 결합할 수 있다. 이런 형태는 폴리펩타이드 내에서 양으로 및 음으로 하전된 아미노산 사이의 정전 기적 인력으로 인해 가능하다. 그러나, 전체적으로, 폴리펩타이드 전하 태그는 순 양전하 또는 순 음전하를 가질 수 있다. 그러나, 전하 태그의 폴리펩타이드의 코일 부분 사이에 더 긴 링커를 사용하면, 감소된 입체 장애는 인접한 코일 부분 사이에서 더 큰 굽힘을 허용하여, 도 15의 하부에 도시된 바와 같이 보다 복잡한 구조의 채택을 허용한다. 이러한 가능성이 더 높은 전하 밀도를 초래할 수 있다. 도 14a 및 14b에 도시된 바와 같이, 이러한 예시적인 전하 태그는 뉴클레오타이드 유사체(미도시)에 부착될 수 있다.
도 16은 코일형 코일 구조를 채택하는 폴리펩타이드 전하 태그의 예를 도시하며, 여기서 나선 내의 아미노산 사이 및 상이한 나선의 아미노산 사이의 정전 기적 인력은 폴리펩타이드가 축합 구조를 형성하도록 유도할 수 있다. 그 결과, 코일 코일은 순 음전하 또는 순 양전하를 가질 수 있으며, 순 전하는 (올리고뉴클레오타이드가 선형으로 뻗어 있는 경우의 밀도에 비해) 높은 전하 밀도로 유지된다.
뉴클레오타이드 유사체를 전하 태그에 부착시키기 위해 상기 기재된 클릭 또는 결찰 화학 반응, 또는 공유 결합을 형성하기 위한 다른 화학 반응을 사용하여 상기 전하 태그 중 임의의 것을 뉴클레오타이드 유사체에 부착시킬 수 있다.
따라서, 펩타이드 핵산이 있거나 없는 올리고뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 둘 다를 포함하는 전하 태그는 선형으로 신장된 선형 전하 태그와 비교하여 높은 전하 밀도를 갖는 상이한 3차원 구조를 채택하도록 만들어질 수 있다. 전하 태그는 양전하에 비해 과량의 포스포다이에스터 또는 음의 아미노산을 함유하는 경우와 같은 순 음전하, 또는 음으로 하전된 그룹보다 양으로 하전된 아미노산을 더 많이 갖는 경우와 같은 순 양전하를 가질 수 있다. 코일형 코일은 아미노산 성분 사이의 잘 특징화된 분자 상호 작용에 기초하여 특정 소형 구조를 채택하도록 계산적으로 디자인될 수 있다. 사용될 수 있는 코일형 코일의 예는 예를 들어 길이 및 직경이 제어된 이량체 또는 삼량체 형태일 수 있는 류신 지퍼를 포함한다. 또한, 코일형 코일 컴팩트 구조를 제어하는 상호 작용이 내부에 국한되어 있기 때문에, 표면은 독립적으로 디자인되어 광범위한 전하를 운반할 수 있다.
본 발명에 개시된 바와 같은 전하 태그는 -200e와 + 200e 사이, 또는 -100e와 +100e 사이, 또는 -40e와 +40e 사이, 또는 -20e와 +20e 사이, -40과 +40 사이 또는 그 안의 임의의 범위로부터의 전하를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 전하 태그의 순 전하 또는 부분 순 전하는 입방 나노 미터당 -200e 내지 +200e, 또는 입방 나노 미터당 -100e 내지 +100e, 또는 -40e 내지 +40e 또는 입방 나노 미터 당 -20e 내지 +20e, 또는 그 안의 임의의 범위의 밀도로 압축될 수 있다.
본 발명에 개시된 기술의 일부 실시예에서, 컴퓨터에 의해 실행될 때 컴퓨터가 본 발명에 개시된 방법 중 적어도 하나를 수행하게 하는 하나 이상의 컴퓨터 판독 가능 저장 장치 또는 컴퓨터 판독 가능 명령을 저장하는 메모리가 제공된다. 일부 실시예에서, 시스템은 본 발명에 개시된 방법 중 임의의 하나의 적어도 일부를 수행하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 시스템은 실행될 때 시스템이 본 발명에 개시된 방법 중 적어도 하나를 수행하게 하는 하나 이상의 컴퓨터 판독 가능 저장 장치 또는 컴퓨터 판독 가능 명령을 저장하는 메모리에 결합된다.
특허, 특허 출원, 기사, 서적, 논문 및 웹 페이지를 포함하나 이에 제한되지 않는, 본 출원에 인용된 모든 문헌 및 유사한 물질은 이러한 문헌 및 유사한 물질의 형식에 관계없이 전체가 참조로 명백히 포함된다. 하나 이상의 통합된 문헌 및 유사한 물질이 정의된 용어, 용어 사용, 설명된 기술 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 출원과 상이하거나 상반되는 경우, 본 출원이 제어한다.
이하에서 더 상세히 논의되는 (이러한 개념이 서로 일치하지 않는 경우) 전술한 개념 및 추가 개념의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다는 것을 이해해야 한다. 특히, 본 발명의 끝에 나타나는 청구 된 주제의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다. 또한 본 발명에 참고로 포함된 임의의 개시에서 나타날 수 있는 본 발명에서 명시적으로 사용된 용어는 본 발명에 개시된 특정 개념과 가장 일치하는 의미가 부여되어야 함을 이해해야 한다.
명세서 전체에 걸쳐 "한 실시예", "다른 실시예", "실시예" 등에 대한 언급은 실시예와 관련하여 설명된 특정 요소(예를 들어, 형상, 구조 및/또는 특징)를 의미한다. 본 발명에 기술된 적어도 하나의 실시예는 본 발명에 기술된 적어도 하나의 실시예에 포함되며, 다른 실시예에 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다. 또한, 임의의 실시예에 대해 설명된 요소는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 다양한 실시예에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있음을 이해해야 한다.
몇몇 실시예들이 상세하게 설명되었지만, 개시된 실시예들은 수정될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 상기 설명은 비 제한적인 것으로 간주되어야 한다. 비록 일부 실시예들이 본 발명에서 상세하게 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 다양한 수정, 추가, 대체 등이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이며, 따라서, 이것은 다음의 청구 범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

Claims (70)

  1. 폴리머라제에 의해 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상보적인 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥으로 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 검출하는 단계를 포함하는 방법으로서, 여기서, 폴리머라제는 테더에 의해 고체 지지체 전도성 채널에 테더링되며,
    표지된 뉴클레오타이드는 화학식 I의 화합물인 방법:
    Figure 112022013935223-pat00132

    n은 3 내지 10의 정수이고,
    m은 1 내지 10의 정수이고,
    t는 0 내지 50의 정수이며,
    X1은 직접 결합, C1-C10 알킬, C1-C10 옥사알킬, C1-C10 티아알킬 또는 C1-C10 아자알킬이고,
    X2는 C1-C20 알킬이며, 선택적으로 하나 이상의 개별 CH2 잔기는 하나 이상의 펩타이드 결합 및 (-O-CH2-CH2-)a로 치환되며, 여기서 a는 1 내지 24의 정수이고,
    X3은 직접 결합 또는 올리고뉴클레오타이드이며, 여기서 표지가 전도성 채널에 근접할 때 올리고뉴클레오타이드가 테더의 수용체 영역에 혼성화하고,
    F1은 형광단 및 직접 결합으로부터 선택되고 F2는 존재하지 않거나 형광단이고,
    A는
    Figure 112022013935223-pat00133
    또는 아마이드 결합이고
    Y는
    Figure 112022013935223-pat00134
    및
    Figure 112022013935223-pat00135
    로부터 선택되고,
    q는 1 내지 100의 정수이고,
    B는 아미노산을 포함하며,
    전도성 채널은 혼입 동안 표지된 뉴클레오타이드를 검출하는 것이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    전하는 -100e 내지 +100e인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    전하 밀도는 입방 나노미터당 -100e 내지 입방 나노미터당 +100e인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    전하는 -200e 내지 +200e인 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    전하 밀도는 입방 나노미터당 -200e 내지 입방 나노미터당 +200e인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    q 수의 B는 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    폴리펩타이드는 분지형 폴리펩타이드, 코일형 폴리펩타이드 및 코일형 코일 폴리펩타이드로부터 선택되는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    q 수의 B의 하나 이상은 메틸리신, 다이메틸리신 또는 트라이메틸리신을 포함하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    A는 연결 반응을 포함하는 반응에 의해 형성되었고, 연결 반응은 아자이드-알카인 구리-보조 클릭(click) 반응, 테트라진-트랜스-사이클로옥텐 결찰, 아자이드-다이벤조사이클로옥타인기 무 구리 클릭 반응 및 티올-말레이미드 접합으로부터 선택되는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    복수의 표지된 뉴클레오타이드를 연속적으로 혼입하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 복수의 표지된 뉴클레오타이드 각각의 전하는 각각의 Y 및 임의의 다른 것의 Y가 서로 상이할 때 복수의 표지된 뉴클레오타이드 중 어느 하나의 전하와 상이한 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    전도성 채널에 의해 검출된 전하에 기초하여 초기 폴리뉴클레오타이드 가닥에 혼입된 하나 이상의 표지된 폴리뉴클레오타이드의 Y를 식별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X2는 (-O-CH2-CH2-)a이고, 여기서 a는 1 내지 24의 정수인 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    a는 24인 방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    a는 16인 방법.
  15. 제 12 항에 있어서,
    a는 12인 방법.
  16. 제 12 항에 있어서,
    a는 8인 방법.
  17. 제 12 항에 있어서,
    a는 4인 방법.
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