JP2022000029A - 電荷タグ付きヌクレオチドおよびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
7号、2018年2月16日に出願された米国仮特許出願第62/710,333号、2
018年2月16日に出願された米国仮特許出願第62/710,362号、および20
18年2月16日に出願された米国仮特許出願第62/710,461号に対する優先権
を主張する;上記のすべての出願の全内容は参照により本明細書に援用される。
(Sequencing by Synthesis)」(SBS)テクノロジーと蛍光
ベースの検出方法を使用している。SBSを補完するものとして、より費用対効果が高く
、迅速で便利なシークエンシングおよび核酸検出を可能にする代替シーケンシング方法が
望ましい。電荷ベースのシークエンシングは魅力的なアプローチである。
たヌクレオチドを使用する:1)デオキシリボースの3’ヒドロキシル(3’−OH)、
および2)窒素塩基(A、T、C、G)のピリミジンの5位またはプリンの7位。3’−
OH基はアジドメチル基でブロックされ、可逆的なヌクレオチドターミネーターを生成す
る。これは、単一ヌクレオチドの付加後のさらなる伸長を防止し得る。窒素塩基のそれぞ
れはフルオロホアで個別に修飾され、単一塩基の取り込みを識別する蛍光読み取り値を与
える。続いて、3’−OHブロッキング基とフルオロホアが除去され、サイクルが繰り返
される。
、修飾ヌクレオチドの現在のコストは高くなり得る。修飾ヌクレオチドのコストを削減す
るいくつかの可能な方法がある。1つの方法は、窒素塩基の代わりに、5’末端ホスフェ
ートに読み取り標識(readout label)を移動させることである。一例では
、これにより、別々の切断ステップの必要がなくなり、入ってくる(incoming)
ヌクレオチドのリアルタイム検出が可能になる。取り込み中、ピロホスフェートはタグと
一緒に伸長プロセスの副産物として放出されるため、切断可能な結合は関与しない。
れたヌクレオチドを検出するための方法、および前記方法で使用するための組成物を含む
。本明細書で提供される一例は、伝導性チャネルを用いて、そのような取り込み中に電荷
タグを有するヌクレオチド、およびそのような電荷タグを有するそのようなヌクレオチド
の化合物を検出する方法である。一例は、ホスホジエステル基、アミノ酸、デンドロンア
ーキテクチャ(architecture)、および電荷密度を高める他のアーキテクチ
ャ構造を含む電荷タグを有するヌクレオチド、電荷密度を高めた電荷タグにヌクレオチド
を連結する(linking)方法、および電荷密度を高めた電荷タグを有するヌクレオ
チドを使用する方法、を提供する。
チド鎖への標識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、前記ポリメ
ラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、前記標識ヌクレオチドは
下記式Iの化合物であって、
50の整数であって、X1は、直接結合、C1−C10アルキル、C1−C10オキサア
ルキル、C1−C10チアアルキル、またはC1−C10アザアルキルであって、X2は
、1つ以上の個々のCH2残基がペプチド結合および(−O−CH2−CH2−)aの1
つ以上で任意に置換されたC1−C20アルキルであり、ここで、aは、1〜24の整数
であって、X3は直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャ
ネルに近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域に
ハイブリダイズし、F1はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつF2は非存在
であるかまたはフルオロホアであって、Aは、
qは、1〜100の整数であり、Bは、以下から選択され:
式中、Rは、Yおよび水素から選択され、Bがデンドロンである場合、qは1に等しく、
前記q個のBは、電荷および電荷密度を有し、前記伝導性チャネルは、前記取り込み中に
前記標識ヌクレオチドを検出する、方法が提供される。
度は、約−100e/nm3〜約+100e/nm3である。更に別の例では、前記電荷
は、約−200e〜約+200eである。更なる例では、前記電荷密度は、約−200e
/nm3〜約+200e/nm3である。
クレオチドは、分岐ポリヌクレオチドおよび1つ以上のヘアピンループから選択される。
更に別の例では、前記ポリヌクレオチドは、2〜5つのヘアピンループを含む。
ドは、分岐ポリペプチド、コイルドポリペプチド、およびコイルドコイルポリペプチドか
らなる群から選択される。更に別の例では、Bはアミノ酸を含み、かつ前記q個のBのう
ちの1つ以上はメチルリジン、ジメチルリジン、またはトリメチルリジンを含む。
デンドロン(dendron of z generations)であり、ここで、z
は1〜6の整数であり、前記構成末端単位は以下から選択され:
1〜3個の−O−CH2−CH2−基で任意に置換され、p2は1〜3の整数であり、前
記p2個の−CH2−基のいずれか1個以上は、1〜3個の−O−CH2−CH2−基で
任意に置換され、前記末端の基は、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、スペルミニル
基、アミノ基、および第4級アンモニウム基から選択される。
よって形成され、前記連結反応は、アジド−アルキン銅アシストクリック反応(azid
e−alkyne copper−assisted click reaction)
、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲーション(tetrazine−tra
ns−cyclooctene ligation)、アジド−ジベンゾシクロオクチン
基銅フリークリック反応(azide−dibenzocyclooctyne gro
up copper−free click reaction)、およびチオール−マ
レイミドコンジュゲーション(thiol−maleimide conjugatio
n)から選択される。
含み、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記Yと、前記複数の標識ヌクレオチドのそ
の他の前記Yとが互いに異なる場合、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記電荷は、
前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記電荷と異なる。更なる例では、前記方法は、
前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチド
鎖に取り込まれた1つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Yを識別することを更に含む。
の整数である。一例では、aは24である。別の例では、aは12である。別の例では、
aは8である。更に別の例では、aは4である。
オチド鎖への標識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、前記ポリ
メラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、前記標識ヌクレオチド
は下記式Iの化合物であって、
0の整数であって、X1は、直接結合、C1−C10アルキル、C1−C10オキサアル
キル、C1−C10チアアルキル、またはC1−C10アザアルキルであって、X2は、
1つ以上の個々のCH2残基がペプチド結合および(−O−CH2−CH2−)aの1つ
以上で任意に置換されたC1−C20アルキルであり、ここで、aは、1〜24の整数で
あって、X3は、直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャ
ネルに近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域に
ハイブリダイズし、F1はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつF2は非存在
であるかまたはフルオロホアであって、Aは、
qは、1〜100の整数であり、Bは、アミノ酸を含み、前記q個のBは、電荷および電
荷密度を有し、前記伝導性チャネルは、前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出す
る、方法が提供される。
度は、約−100e/nm3〜約+100e/nm3である。更に別の例では、前記電荷
は、約−200e〜約+200eである。更なる例では、前記電荷密度は、約−200e
/nm3〜約+200e/nm3である。
ドは、分岐ポリペプチド、コイルドポリペプチド、およびコイルドコイルポリペプチドか
らなる群から選択される。更に別の例では、Bはアミノ酸を含み、かつ前記q個のBのう
ちの1つ以上はメチルリジン、ジメチルリジン、またはトリメチルリジンを含む。
ド−アルキン銅アシストクリック反応、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲー
ション、アジド−ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応、およびチオール−マ
レイミドコンジュゲーションから選択される。
含み、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記Yと、前記複数の標識ヌクレオチドのそ
の他の前記Yとが互いに異なる場合、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記電荷は、
前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記電荷と異なる。更なる例では、前記方法は、
前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチド
鎖に取り込まれた1つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Yを識別することを更に含む。
の整数である。一例では、aは24である。別の例では、aは12である。別の例では、
aは8である。更に別の例では、aは4である。
クレオチド鎖への標識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、前記
ポリメラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、前記標識ヌクレオ
チドは下記式Iの化合物であって、
0の整数であって、X1は、直接結合、C1−C10アルキル、C1−C10オキサアル
キル、C1−C10チアアルキル、またはC1−C10アザアルキルであって、X2は、
1つ以上の個々のCH2残基がペプチド結合および(−O−CH2−CH2−)aの1つ
以上で任意に置換されたC1−C20アルキルであり、ここで、aは、1〜24の整数で
あって、X3は、直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャ
ネルに近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域に
ハイブリダイズし、F1はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつF2は非存在
であるかまたはフルオロホアであって、Aは、
qは、1〜100の整数であり、Bは、以下から選択され:
式中、Rは、Yおよび水素から選択され、前記伝導性チャネルは、前記取り込み中に前記
標識ヌクレオチドを検出する、方法が提供される。
度は、約−100e/nm3〜約+100e/nm3である。更に別の例では、前記電荷
は、約−200e〜約+200eである。更なる例では、前記電荷密度は、約−200e
/nm3〜約+200e/nm3である。
クレオチドは、分岐ポリヌクレオチドおよび1つ以上のヘアピンループから選択される。
更に別の例では、前記ポリヌクレオチドは、2〜5つのヘアピンループを含む。
ド−アルキン銅アシストクリック反応、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲー
ション、アジド−ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応、およびチオール−マ
レイミドコンジュゲーションから選択される。
含み、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記Yと、前記複数の標識ヌクレオチドのそ
の他の前記Yとが互いに異なる場合、前記複数の標識ヌクレオチドの前記各々の電荷は、
前記複数の標識ヌクレオチドの前記その他の電荷と異なる。更なる例では、前記方法は、
前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチド
鎖に取り込まれた1つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Yを識別することを更に含む。
の整数である。一例では、aは24である。別の例では、aは12である。別の例では、
aは8である。更に別の例では、aは4である。
レオチド鎖への標識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、前記ポ
リメラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、前記標識ヌクレオチ
ドは下記式Iの化合物であって、
0の整数であって、X1は、直接結合、C1−C10アルキル、C1−C10オキサアル
キル、C1−C10チアアルキル、またはC1−C10アザアルキルであって、X2は、
1つ以上の個々のCH2残基がペプチド結合および(−O−CH2−CH2−)aの1つ
以上で任意に置換されたC1−C20アルキルであり、ここで、aは、1〜24の整数で
あって、X3は、直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャ
ネルに近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域に
ハイブリダイズし、F1はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつF2は非存在
であるかまたはフルオロホアであって、Aは、
qは1であり、Bは、デンドロンを含み、Bは、電荷および電荷密度を有し、前記伝導性
チャネルは、前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出する、方法が提供される。
度は、約−100e/nm3〜約+100e/nm3である。更に別の例では、前記電荷
は、約−200e〜約+200eである。更なる例では、前記電荷密度は、約−200e
/nm3〜約+200e/nm3である。
デンドロンであり、ここで、zは1〜6の整数であり、前記構成末端単位は以下から選択
され:
1〜3個の−O−CH2−CH2−基で任意に置換され、p2は1〜3の整数であり、前
記p2個の−CH2−基のいずれか1個以上は、1〜3個の−O−CH2−CH2−基で
任意に置換され、前記末端の基は、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、スペルミニル
基、アミノ基、および第4級アンモニウム基から選択される。
ド−アルキン銅アシストクリック反応、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲー
ション、アジド−ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応、およびチオール−マ
レイミドコンジュゲーションから選択される。
含み、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記Yと、前記複数の標識ヌクレオチドのそ
の他の前記Yとが互いに異なる場合、前記複数の標識ヌクレオチドの前記各々の電荷は、
前記複数の標識ヌクレオチドの前記その他の電荷と異なる。更なる例では、前記方法は、
前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチド
鎖に取り込まれた1つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Yを識別することを更に含む。
の整数である。一例では、aは24である。別の例では、aは12である。別の例では、
aは8である。更に別の例では、aは4である。
うな概念が相互に矛盾しない場合)は、本明細書で開示される本発明の主題の一部として
企図されることを理解されたい。
詳細な説明を読むとよりよく理解されるようになるであろう。
り込みイベントための組成物および方法に関する。例えば、高スループットで長いシーク
エンシング読み取りを可能にするために、電荷の違いに基づいてヌクレオチドの識別認識
を提供する改善された検出システムに対するニーズが存在する。本明細書に記載される例
は、このニーズを満たし、他の利点も提供する。
るヌクレオチド上の高価で感光性の蛍光標識。従来の蛍光標識の検出は、レーザーおよび
検出光学素子などの高価なハードウェアを含む場合があり、それらは検出装置のサイズを
増加させる。さらに、生成される多数の情報をデコードするために、より強力なソフトウ
ェアが使用される。重要なことは、本明細書に開示されているように、高価なフルオロホ
アは必要とされない。蛍光標識を電荷標識に置き換えることにより、システム内の電流を
モニターする伝導性チャネルによって電荷を検出することができる。このことは、「リア
ルタイム」シークエンシングが実施されることを可能とし、各ヌクレオチド取り込みのサ
イクル時間を削減することで、より速いターンアラウンドタイムを達成する可能性を有す
る。
ブロッキング基は関与しない。これにより、合成ステップが少なくなるため、修飾ヌクレ
オチドのコストが削減される。追加の利点は、ポリメラーゼが、化学修飾された嵩高い3
’保護基と比較して、ネイティブシステムにより近い3’OHを有するヌクレオチドを取
り込むのにより適していることである。
あり得る。この電場は、伝導性チャネルの表面に近接した電荷を有する修飾ヌクレオチド
を配置することにより変調される。いくつかの場合では、例えば、溶液中の塩または他の
イオンが、伝導性チャネルによる検出から電荷を遮蔽する場合には、電荷タグの当該表面
への近接性が重要であり得る。特徴的な遮蔽の長さはデバイ長と呼ばれ、デバイ長を超え
ると伝導性チャネルは電荷を検出できない場合がある。
それは完全に直線的に引き伸ばされた場合、160オングストロームを超える場合がある
が、伝導性チャネルのデバイゾーン(Debye zone)は約1nmであり得る。し
たがって、伝導性チャネルによるその検出を促進するために、ヌクレオチドの帯電修飾の
構造化(structuring)が望ましい。
。本明細書で使用されるいくつかの用語の例とその定義を以下に示す。
板に付着した伝導性チャネルまたは分子の集団を指し、伝導性チャネルまたは分子は、そ
れらの相対的な位置によって互いに区別することができる。アレイは、固相基板上の異な
るアドレス可能(addressable)な位置(例えば、異なる伝導性チャネル)に
それぞれ位置する異なる分子を含むことができる。あるいは、アレイは、それぞれ異なる
分子を有する別々の固相基板を含むことができ、異なるプローブ分子は、固相基板が付着
している表面上の当該固相基板の位置、または流体ストリームなどの液体中の固相基板の
位置によって識別され得る。アレイの分子は、核酸プライマー、核酸プローブ、核酸鋳型
、またはポリメラーゼやエキソヌクレアーゼなどの核酸酵素であり得る。
互いに接合、固定、接着、接続、または結合されている状態を指す。例えば、ポリメラー
ゼなどの反応成分は、共有結合または非共有結合によって、伝導性チャネルなどの固相成
分に付着させることができる。共有結合は、原子間で電子対を共有することで特徴付けら
れる。非共有結合は、電子対の共有を伴わない化学結合であり、例えば、水素結合、イオ
ン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用および疎水性相互作用を含むことができ
る。
ductive channel)」という用語は、その表面またはその周囲の電場にお
ける摂動を電気信号に変換する検出デバイスの一部を意味することを意図している。伝導
性チャネル(conductive channel)は、電気伝導性チャネル(ele
ctrically conductive channel)であり得る。例えば、図
1に示すように、電気伝導性チャネル5は、反応成分(例えば、標識ヌクレオチド)の到
着または離脱を電気信号に変換することができる。本明細書に開示される例では、電気伝
導性チャネル5は、標識ヌクレオチドの酸化還元活性のある(redox−active
)電荷タグとの相互作用を通じて、2つの反応成分(鋳型核酸と標識ヌクレオチドのヌク
レオチド)の間の相互作用を検出可能な信号に変換することもできる。
は、ソース端部Sおよびドレイン端部D、ならびに端部S、Dを接続するチャネル5を含
み得る。当該チャネルは、例えばチューブ、ワイヤ、プレートなどの任意の適切な形状を
有し得る。
)」という用語は、その表面またはその周囲の電場における摂動を電気信号に変換する検
出デバイスを意味することを意図している。例えば、伝導性チャネルは、反応成分の到着
または離脱を電気信号に変換することができる。伝導性チャネルは、2つの反応成分の間
の相互作用、または単一の反応成分のコンホメーション変化も電気信号に変換することが
できる。例示的な伝導性チャネルは、カーボンナノチューブ(CNT)、単層カーボンナ
ノチューブ(SWNT)ベースのFET、シリコンナノワイヤ(SiNW)FET、グラ
フェンナノリボンFET(およびMoS2、シリセンなどの2D材料から製造された関連
ナノリボンFET)、トンネルFET(TFET)、および急峻サブスレッショルドスロ
ープデバイス(steep subthreshold slope devices)
などの電界効果トランジスタ(FET)である(例えば、Swaminathan et
al., Proceedings of the 51st Annual Des
ign Automation Conference on Design Auto
mation Conference,1−6頁,ISBN:978−1−4503−2
730−5(2014年)、およびIonescu et al., Nature 4
79,329−337頁(2011年)を参照;それぞれの全体が参照により援用される
)。本開示の方法および装置で使用され得るFETおよびSWNT伝導性チャネルの例は
、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第2013/00786
22 A1号に記載されている。
材料の例は、コバルト、ケイ化コバルト、ニッケル、ケイ化ニッケル、アルミニウム、タ
ングステン、銅、チタン、モリブデン、酸化インジウムスズ(ITO)、酸化亜鉛インジ
ウム、金、プラチナ、カーボンなどを含む。
任意の伝導性(conductive)材料または半伝導性(semi−conduct
ive)材料を含み得る。当該材料は、有機材料、無機材料、またはその両方を含み得る
。適切なチャネル材料のいくつかの例は、シリコン、カーボン(例えば、グラッシーカー
ボン、グラフェンなど)、伝導性ポリマーなどのポリマー(例えば、ポリピロール、ポリ
アニリン、ポリチオフェン、ポリ(4−スチレンスルホネート)でドープされたポリ(3
,4−エチレンジオキシチオフェン)(PEDOT−PSS)など)、金属、生体分子な
どを含む。
on)をナノスケール(1nm〜1μm未満の範囲)で有するナノ構造であり得る。一例
では、この寸法(dimension)は最大寸法を指す。例として、伝導性チャネル5
は、半伝導性ナノ構造、グラフェンナノ構造、金属ナノ構造、および伝導性ポリマーナノ
構造であり得る。ナノ構造は、多層または単層ナノチューブ、ナノワイヤ、ナノリボンな
どであり得る。
使用される場合、核酸が互いに同じではないヌクレオチド配列を有することを意味する。
2つ以上の異なる核酸は、その全長にわたって異なるヌクレオチド配列を有することがで
きる。あるいは、2つ以上の異なる核酸は、それらの長さの相当な(substanti
al)部分にわたって異なるヌクレオチド配列を有し得る。例えば、2つ以上の異なる核
酸は、当該2つ以上の分子で異なる標的ヌクレオチド配列部分を有することができ、一方
で、当該2つ以上の分子で同じであるユニバーサル配列部分も有することができる。「異
なる(different)」という用語は、ポリメラーゼや核酸酵素などの他の分子に
も同様に適用することができる。
ンに関して使用される場合、当該コレクション中の個々のアイテムを識別することを意図
しているが、必ずしもコレクション中のすべてのアイテムを指すわけではない。明示的な
開示または文脈が明らかにそうでないことを示す場合、例外が発生し得る。
れる場合、検出可能な反応成分または反応成分の検出可能な部分を意味することを意図し
ている。有用な標識は、伝導性チャネルによって検出され得る電荷標識(電荷タグとも呼
ばれる)である。標識は、検出対象の反応成分に固有のもの(例えば、ポリメラーゼの荷
電アミノ酸)であり得、または標識は当該反応成分に対して外因性のもの(例えば、アミ
ノ酸の天然に存在しない修飾)であり得る。いくつかの例では、標識は、別々の機能を有
する複数の部分を含むことができる。例えば、標識は、リンカー成分(例えば、核酸)お
よび電荷タグ成分を含むことができる。
分に関連して使用される場合、その自然環境または人間の技術的介入の影響を受けない生
物学的システムにおいて、当該分子に付着していることが判明していない部分を指すこと
を意図している。典型的には、非天然部分は分子の合成修飾であり、当該合成修飾は未修
飾分子または天然修飾を有する分子から、当該分子を構造的または化学的に区別させる。
本明細書で使用される「非天然(non−natural)」という用語は、プロセスに
使用されるアナログに関連して使用される場合、当該プロセスが生じる自然環境では見ら
れないアナログを意味することを意図している。通常、非天然アナログは、当該アナログ
が属するクラス中の他のタイプの分子と構造的または化学的に異なる合成アナログである
。
術分野におけるその使用と一致することを意図しており、天然に存在する核酸またはその
機能的アナログを含む。特に有用な機能的アナログは、配列特異的様式で核酸にハイブリ
ダイズすることができるか、または特定のヌクレオチド配列の複製のための鋳型として使
用することができる。天然に存在する核酸は一般に、ホスホジエステル結合を含む骨格を
有する。アナログ構造は、ペプチド核酸(PNA)またはロックド核酸(LNA)などの
当技術分野で知られている様々なもののいずれかを含む代替の骨格結合を有することがで
きる。天然に存在する核酸は一般に、(例えば、デオキシリボ核酸(DNA)に見られる
)デオキシリボース糖または(例えば、リボ核酸(RNA)に見られる)リボース糖を有
する。
ことができる。核酸は、天然塩基または非天然塩基を含むことができる。これに関して、
天然デオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニンからなる群から
選択される1つ以上の塩基を有することができ、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シト
シン、およびグアニンからなる群から選択される1つ以上の塩基を有することができる。
核酸に含まれ得る有用な非天然塩基は、当技術分野で公知である。
天然ヌクレオチド、そのアナログ、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデ
オキシリボヌクレオチド、およびヌクレオチドとして知られる他の分子を含むことを意図
している。この用語は、例えばDNA鎖またはRNA鎖に存在するサブユニットを識別す
るために、ポリマー中に存在する単量体単位を指すために使用することができる。この用
語はまた、ポリマー中に必ずしも存在しない分子、例えば、ポリメラーゼによって鋳型依
存的な様式でポリヌクレオチドに取り込まれ得る分子を指すためにも使用され得る。この
用語は、例えば、5’炭素上に0、1、2、3またはそれ以上のホスフェートを有するヌ
クレオシド単位を指すことができる。例えば、テトラホスフェートヌクレオチド、ペンタ
ホスフェートヌクレオチド、およびヘキサホスフェートヌクレオチドは、5’炭素上に6
超のホスフェート、例えば7、8、9、10、またはそれ以上のホスフェートを有するヌ
クレオチドと同様に、特に有用であり得る。例示的な天然ヌクレオチドは、ATP、UT
P、CTPおよびGTP(総称してNTP)、ならびにADP、UDP、CDPおよびG
DP(総称してNDP)、またはAMP、UMP、CMPもしくはGMP(総称してNM
P)、またはdATP、dTTP、dCTPおよびdGTP(総称してdNTP)、なら
びにdADP、dTDP、dCDPおよびdGDP(総称してdNDP)、ならびにdA
MP、dTMP、dCMPおよびdGMP(総称してdNMP)を含むが、これらに限定
されない。例示的なヌクレオチドは、例外なく、任意のNMP、dNMP、NDP、dN
DP、NTP、dNTP、ならびに他のNXPおよびdNXPを含み得、ここでXは2〜
10の数を表す(総称してNPP)。
物学的システムに存在しないもの、またはその自然環境、例えばポリメラーゼを発現する
非組換え細胞においてポリメラーゼによってポリヌクレオチドに実質的に取り込まれない
ものを含む。特に有用な非天然ヌクレオチドは、同じワトソン−クリック相補的塩基と塩
基対を形成する天然ヌクレオチドなどの別のヌクレオチドがポリメラーゼによってポリヌ
クレオチド鎖に取り込まれる速度よりも実質的に速いまたは遅い速度で、ポリメラーゼに
よって当該ポリヌクレオチド鎖に取り込まれるものを含む。例えば、非天然ヌクレオチド
は、天然ヌクレオチドの取り込み速度と比較した場合、少なくとも2倍、少なくとも5倍
、少なくとも10倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少な
くとも1000倍、少なくとも10000倍またはそれ以上異なる速度で取り込まれ得る
。非天然ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに取り込まれた後、さらに伸長され得る。例
は、3’ヒドロキシルを有するヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチドアナログを取
り込んだポリヌクレオチドのさらなる伸長を可能にするために除去され得る3’位に可逆
的ターミネーター部分を有するヌクレオチドアナログを含む。使用され得る可逆的ターミ
ネーター部分の例は、例えば、米国特許第7,427,673号;米国特許第7,414
,116号;および米国特許第7,057,026号、ならびに国際公開第91/066
78号および国際公開第07/123744号に記載されており、これらの各々は参照に
よりその全体が本明細書に援用される。いくつかの例では、ヌクレオチドアナログを取り
込んだポリヌクレオチドがさらに伸長されない条件下で、3’ターミネーター部分を有す
るヌクレオチドアナログまたは3’ヒドロキシルを欠くヌクレオチドアナログ(ジデオキ
シヌクレオチドアナログなど)を使用し得ることが理解されよう。いくつかの例では、ヌ
クレオチドは可逆的ターミネーター部分を含まないかもしれず、あるいは当該ヌクレオチ
ドは非可逆的ターミネーター部分を含まないか、または当該ヌクレオチドはターミネータ
ー部分を全く含まないであろう。5’位に修飾を有するヌクレオチドアナログも有用であ
る。
う用語は、反応成分が特定の反応を受けることを防ぐために、反応成分に付着している化
合物またはその部分を意味することを意図している。例えば、核酸分子は、そうでなけれ
ば核酸酵素の分解または修飾を引き起こすであろう処理による分解または修飾から核酸酵
素を防ぐように、核酸酵素に結合することができる。抗体も、反応成分を分解、不活性化
、または他の反応から保護するために、当該反応成分に結合するのに役立ち得る。
いう用語は、反応に関与する分子を意味することを意図している。例は、反応で消費され
る反応物、反応によって生成される生成物、反応を促進する酵素などの触媒、溶媒、塩、
緩衝液、およびその他の分子を含む。
用語は、空間を占有する分子またはその部分を意味することを意図しており、当該空間に
おける別の分子の占有を防止または抑制するか、または当該空間の近くにおける別の分子
の並置(juxtaposition)を抑制する。反発部分は、立体排除、電荷反発、
疎水性−親水性反発、またはその他の力によって作用することができる。
」という用語は、ヌクレオチドに関連して使用される場合、ヌクレオチドが第2のヌクレ
オチドへの共有結合を形成することを阻害または防止するヌクレオチドの一部を意味する
。例えば、ペントース部分を有するヌクレオチドの場合、ターミネーター部分は、ヌクレ
オチドの3’酸素と2番目のヌクレオチドの5’ホスフェートとの間のホスホジエステル
結合の形成を防止することができる。ターミネーター部分は、核酸ポリマー中に存在する
単量体単位であるヌクレオチドの一部であり得るか、またはターミネーター部分は、遊離
ヌクレオチド(例えば、ヌクレオチドトリホスフェート)の一部であり得る。ヌクレオチ
ドの一部であるターミネーター部分は可逆的であり得、その結果、当該ターミネーター部
分は、ヌクレオチドが第2のヌクレオチドへの共有結合を形成できるようにするために修
飾され得る。特定の例では、可逆的ターミネーター部分などのターミネーター部分は、ヌ
クレオチドアナログのペントース部分の3’位または2’位に付着することができる。
慮して理解することができる。
ベントに有用な組成物、そのような組成物を作製する方法、およびそのような手順でそれ
らを使用する方法を提供する。本明細書に記載の組成物および方法は、例えば、合成によ
るシ−クエンシング(sequencing by synthesis)などの単一分
子核酸シ−クエンシング反応において特に有用である。しかしながら、本明細書に記載の
組成物および方法は、単一分子検出を含むがこれに限定されない他の任意の適切な検出ス
キームに使用できることが理解されよう。本明細書に開示される組成物が使用され得る核
酸シ−クエンシングのための装置および方法は、例えば、参照によりその全体が援用され
る米国特許出願番号14/798,762に開示されている。
support conductive channel)につながれたポリメラーゼ
を提供するステップ;(b)1つ以上の標識ヌクレオチドを提供するステップであって、
それにより、前記標識が前記伝導性チャネルに近接している場合に、前記伝導性チャネル
により前記標識の存在を検出することができるステップ;および(c)鋳型核酸に相補的
な新生鎖への前記標識ヌクレオチドの取り込みを検出するステップ、を含むことができる
。
対して10nm未満、9nm未満、8nm未満、7nm未満、6nm未満、5nm未満、
4nm未満、3nm未満、2nm未満、または1nm未満の近傍に保持される。
ゼによる取り込み後に、ヌクレオチドから切断され得る。
得る。例えば、1つ以上の標識ヌクレオチドは、各種類のヌクレオチドについて、固有の
電荷タグを含むことができる。例えば、電荷タグを有するヌクレオチドは、鋳型配列に従
ってポリメラーゼによりDNA鎖を合成する際に使用され得、当該鋳型配列は、例えば、
アデニン塩基、チミン塩基、グアニン塩基、およびシトシン塩基を含むヌクレオチドの列
(string)を含み得る。本明細書に開示されるような電荷タグを有するヌクレオチ
ドは、ポリメラーゼ酵素により、鋳型配列に相補的なヌクレオチドの列に取り込まれ得る
。本明細書に開示されるように、電荷タグを有するヌクレオチドがそのように取り込まれ
ると、伝導性チャネルは、ヌクレオチドの各種に特異的かつ示差的に関連する所定の価数
(valence)および大きさの電荷を検出することができ、伸長中の鎖に取り込まれ
た連続ヌクレオチドのアイデンティティの記録を可能にし、それにより、伸長中の鎖が相
補的な鋳型鎖中に存在するヌクレオチドの配列の記録を可能にする。電荷タグは、負の電
荷タグまたは正の電荷タグであることができ、−200e〜+200e、例えば、−17
5e〜+175e、または−150e〜+150e、または−125e〜+125e、ま
たは−100e〜+100e、または−75e〜+75e、または−50e〜+50eの
どこかに電荷を有し得る。
ことができる。任意で、伝導性チャネルはカーボンナノチューブを含み得る。伝導性チャ
ネルは、伝導性チャネルのアレイの一部であり得る。検出ステップは、複数の取り込みイ
ベントを連続して検出することを含むことができる。
long nucleic acid sequencing reads);高速読み
取り;シークエンシングのための高スループット機能;およびシークエンシングのための
スケーラブルなプラットフォームを提供することができる。いくつかの例では、並行して
実行される読み取りの数においてスループットを提供するための本明細書に記載の方法お
よび装置の能力により、単一読み取り精度におけるいかなる妥協(any compro
mises)も、複数の重複読み取りを実行することで軽減され得る。
生成し、当該反応部位においてヌクレオチドがプライミングされた(primed)DN
A鋳型4に取り込まれ得る。ポリメラーゼ1は、テザー3を介してナノワイヤFET2に
付着している。この装置は、単一分子感度(single molecule sens
itivity)を提供する。反応部位での電荷分布の変化(例えば、ポリメラーゼのコ
ンンホメ−ション変化、ヌクレオチドの取り込み、電荷タグの到着または離脱、ポリメラ
ーゼの伝導性チャネルへの近接性の変化など)がゲートに伝達され、検出され得る。
ケーリングされた(deeply scaled)FinFETトランジスタを使用し得
る。FinFET伝導性チャネルは、最先端の半導体メーカーが既に開発中の技術の恩恵
を受ける。更に、以前に公開されたコンポーネント(component)を使用するこ
とができ、これには、(1)Choi et al, Science, 335, 3
19 (2012年)に記載されるように、CNTにリゾチームを固定化してリアルタイ
ムで酵素の処理能力(processivity)を観察するために使用されるもの、(
2)Olsen et al, J. Amer. Chem. Soc., 135,
7885 (2013年)に記載されるように、Pol 1 Klenowフラグメン
トをCNTに固定し、リアルタイムでDNAの処理能力(processivity)を
観察するために使用されるもの、(3)Chi et al, NanoLett 13
, 625 (2013年)に記載されるように、タンパク質のアロステリックモーショ
ンにより移動する荷電残基のような伝達機構を解明するために使用されるものが含まれる
が、これらに限定されない。本方法はまた、前記装置、前記装置のコンポーネント、およ
び米国特許出願公開第2013/0078622 A1号に記載の方法も使用することが
できる。上記の参考文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。
オチドは、ヌクレオチド、ヌクレオチドのホスフェート基に付着した連結分子(link
ing molecule)またはリンカー、およびリンカーに付着した電荷タグを含み
得る。連結分子またはリンカーは、伝導性チャネルに結合したテザー上のアクセプター領
域にハイブリダイズし得る特異性領域を含み得る。例として、特異性領域は、テザー上の
アクセプター領域に一時的に付着または結合することができる任意のヌクレオチド配列ま
たはペプチドであり得る。例えば、特異性領域はヌクレオチド配列を含み得、アクセプタ
ー領域はヌクレオチド配列を含み得、特異性領域およびアクセプター領域の配列中のヌク
レオチド間で対結合が形成される。この場合の対結合は、G残基とC残基の間、またはA
残基とT残基またはU残基の間など、ヌクレオチド間の標準的な対結合を指す。
オチド配列を含み得る。一例では、ポリメラーゼが、鋳型ポリヌクレオチドに相補的な伸
長中のポリヌクレオチド鎖への取り込みのためにヌクレオチドを受け入れる場合、特異結
合領域とアクセプター領域は、対結合がそれらの間に形成されるほど十分に互いに近接し
得る。特異性領域とアクセプター領域の間のそのような対結合は、電荷タグと伝導性チャ
ネルの間の十分な近接性を促進し得、ヌクレオチドの取り込み中に伝導性チャネルによる
電荷タグの検出を促進し得る。
ド配列を含み得る。別の例では、特異性領域は、ヌクレオチド配列の両側に隣接するイノ
シンを更に含み得る。いくつかの例では、特異性領域は電荷タグの一部に含まれる。例え
ば、特異性領域は、電荷タグの部分などにより線形配列に沿って互いに分離されているヌ
クレオチド配列またはアミノ酸配列のセグメントまたは部分から構成され得、アクセプタ
ー領域への結合は、電荷タグによる所定の三次元構造の採用を可能にしながら、特異性領
域の別個の領域が互いに近接するように誘導することができる。
オチドの一例では、標識ヌクレオチドとテザーとの間の特異的な結合親和性は、非特異的
な結合相互作用により生じる弱い親和性と組み合わされる。標識ヌクレオチドは、テザー
の一部に相補的な特異性領域を含み得る。これらの領域の間の特異的結合は、標準的なワ
トソン−クリック塩基対または他の非共有結合から生じ得る。この例では、特異性領域は
、ヌクレオチド配列に隣接するイノシン(I)も含むことができる。イノシンはユニバー
サル塩基であるため、DNAの4つの天然ヌクレオチドのすべてと対合することができる
。追加の結合相互作用は、テザー上の天然ヌクレオチドとユニバーサル塩基(例えば、イ
ノシンI)との相互作用から生じ得る。したがって、取り込み中に標識ヌクレオチドがポ
リメラーゼに結合すると、標識ヌクレオチドの特異性領域とテザーのアクセプター領域と
の間に相乗的な結合が起こり得、標識ヌクレオチドとテザーの間の相互作用の安定性が大
幅に向上し得る。
間の相互作用は、電荷タグが伝導性チャネルの感知ゾーン内に入ることを引き起こし得る
。そのような相互作用はまた、効率的かつ完全な電荷検出に十分な時間、感知ゾーン内に
電荷タグを維持するのに役立ち得る。このような時間は、最大で数十ミリ秒になり得る。
このような比較的長時間の相互作用は、溶液中に存在する他の標識ヌクレオチドについて
の相互作用とは異なり、当該他の標識ヌクレオチドは理論的には拡散し得、伝導性チャネ
ルに短時間接触または接近し得る。そのような短時間の相互作用は、十分な電荷検出が行
われるほど十分に長くない場合があり、したがって、そのような場合、電荷タグは伝導性
チャネルによって検出されない。
ゴマーペプチド核酸、または前述の2つ以上の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの
例では、電荷タグは、アミノ酸、ヌクレオチド、およびリンカーから選択される複数の要
素を含み得る。そのような分子は三次元構造を形成し、電荷タグのアスペクト(aspe
cts)によって運ばれる電荷の凝縮を可能にし、総電荷がより小さな領域に凝縮され得
るようにすることができる。そのような増加した電荷密度は、ポリメラーゼによる伸長鎖
へのヌクレオチドアナログの取り込み中に伝導性チャネルにより検出される電荷を増加さ
せ得、その結果、そのような合成における所定のヌクレオチド種の存在を決定することが
できる。そのような凝縮されたコンホメーションをとる電荷タグは、伝導性チャネルから
の電荷の分散、または伝導性チャネルの大きな表面積にわたる電荷の分散、またはその両
方を最小限に抑えることができる。結果として、伝導性チャネルが、電荷タグのより大き
な量または割合の電荷を検出する可能性が高くなり得る。
をもたらしかつ保持するために、単独でまたはテザーと組み合わせて、標識ヌクレオチド
のポリメラーゼへの相乗的な結合(synergistic binding)を利用す
る。テザーを用いて形成された複合体の安定性は比較的低いため、複合体は、ポリメラー
ゼにも結合しない標識ヌクレオチドでは形成されない(即ち、溶液中でフリーの標識ヌク
レオチドは、テザーに実質的に結合しない場合がある)。換言すれば、そのような複合体
のオフ速度(off rate)は十分に高く、寿命が短くなり得る。しかしながら、標
識ヌクレオチドとポリメラーゼの間に安定した結合(association)が形成さ
れると、連結分子の局所濃度がテザーの周りで増加し得、したがってオン速度(on r
ate)が高くなる。このようにして、ポリメラーゼ結合状態(polymerase−
associated state)では、非結合状態と比較して、全体的な結合時間(
association time)が大幅に増加し得る。全体的にかなりの(subs
tantial)結合親和性を可能にするために、単独でまたはテザーと組み合わせて、
ポリメラーゼに対する標識ヌクレオチドの親和性の相乗効果が合計され得る。ポリメラー
ゼによる切断後、相乗効果が失われ、電荷タグも伝導性チャネルから解離し得る。
乗的な結合を利用することができる。オリゴヌクレオチド部分:テザー複合体の安定性、
または特異性領域:アクセプター領域複合体の安定性は比較的低いため、複合体は、ポリ
メラーゼにも結合していないガンマホスフェート標識ヌクレオチドでは形成されず、溶液
中でフリーのガンマホスフェート標識ヌクレオチドは、テザーに実質的に結合しない。し
かしながら、ポリメラーゼに対するヌクレオチド部分の親和性と、テザーのアクセプター
領域に対するオリゴヌクレオチド部分などの特異性領域の親和性の相乗効果が合計されて
、全体的にかなりの(substantial)結合親和性を可能にし得る。いくつかの
例では、相乗効果は、非特異的な結合相互作用によって生じる弱い親和性と、ヌクレオチ
ド標識とテザーの間の特異的な結合親和性の組み合わせを利用することができる。例えば
、上記のように、いくつかの例では、特異的な結合は標準的なワトソン−クリック塩基対
から生じ得、非特異的な結合相互作用は、プロミスキャス(promiscuous)塩
基(例えば、イノシン)と天然ヌクレオチドとの相互作用から生じ得る。したがって、取
り込み中にガンマホスフェート標識ヌクレオチドがポリメラーゼに結合すると、相乗的な
結合が起こり得、オリゴヌクレオチド部分とテザーの間の相互作用の安定性が大幅に向上
する。ガンマホスフェートがポリメラーゼによって切断された後、相乗効果が失われ得、
オリゴヌクレオチド部分がテザーから解離する。ヌクレオチド部分:テザー結合の他の種
類、例えば、DNA、RNA、PNA、アミノ酸、またはそれらのアナログもしくは組み
合わせの間の非共有相互作用によるものは、そのような相乗効果に寄与する。
、またはFinFETなどの伝導性チャネルに固定化することができる。固定化は、DN
A、RNA、PNA、アミノ酸、またはそれらのアナログもしくは組み合わせを含むテザ
ーを介して行うことができる。実証の便宜上、図2は、伝導性チャネルにつながれた4つ
のポリメラーゼを示し、各ポリメラーゼは異なるガンマホスフェート標識ヌクレオチドタ
イプにも結合している。示されているように、ヌクレオチドは、ガンマホスフェートに付
着したオリゴヌクレオチド部分を有し得る。標的核酸の鋳型鎖に適切にマッチするベータ
ホスフェート標識ヌクレオチドまたはガンマホスフェート標識ヌクレオチドは、ポリメラ
ーゼによって所定の位置に保持され得、オリゴヌクレオチド部分または他の特異性領域を
テザーのアクセプター領域に(例えば、ワトソン−クリック塩基相補性またはその他の非
共有結合を介して)一時的にハイブリダイズするのに十分に長い間、当該ポリメラーゼは
鋳型に結合していることもできる。ハイブリダイゼーションにより、電荷タグが伝導性チ
ャネルの周りの電場を乱し、伝導性チャネルを通るトランジスタ電流の変化により検出可
能な信号を生成し得る。この図は、伝導性チャネルから1〜2nm以内にある場(fie
ld)に入る電荷タグを示している。適切にマッチしたベータホスフェート標識ヌクレオ
チドまたはガンマホスフェート標識ヌクレオチドは、鋳型核酸にハイブリダイズした新生
鎖に取り込まれ得る。これにより、今度は、ベータホスフェートと新しく取り込まれたヌ
クレオチドとの間の結合が破壊される。その結果、電荷タグは(ヌクレオチドのベータ位
に付着していようと、またはヌクレオチドのガンマ位に付着していようと)、自由にテザ
ーから解離して伝導性チャネルから拡散して、それにより伝導性チャネルの周りの電場を
非摂動状態に戻す。伝導性チャネルの周囲の場が摂動され、そして非摂動状態に戻るのに
伴う信号の出現と消失は、標的核酸の新生鎖へのヌクレオチドの取り込みと相関させる(
correlated)ことができる。
に取り込まれた標識の固有特性に基づいて決定することができる。例えば、4種類のdN
TPは、特異性領域がテザーのアソシエーション領域(association reg
ion)にハイブリダイズする位置、特異性領域の長さ、および/または標識上の電荷部
分の存在、電荷の価数、ならびに電荷の大きさによって識別することができる。例えば、
所定のヌクレオチドは、異なる原子価および/または大きさの電荷を有する他のヌクレオ
チドによって共有されない所定の原子価および大きさの電荷を有し得る。伝導性チャネル
は、電荷の価数および/または大きさの違いを検出可能であり得る。伝導性チャネルにつ
ながれたポリメラーゼによる新生ポリヌクレオチドへの荷電タグを有するヌクレオチドの
取り込み中、伝導性チャネルは、鋳型鎖のヌクレオチドの相補体として取り込まれたヌク
レオチドのタグの原子価および/または大きさを検出し得る。ポリメラーゼが、今度は鋳
型の次のヌクレオチドと相補的な次のヌクレオチド種を取り込むために移動すると、新生
鎖に取り込まれたそのような次のヌクレオチド種の電荷の価数および/または大きさも、
伝導性チャネルによって検出され得る。そして、電荷タグを有する連続したヌクレオチド
が新生鎖に取り込まれるにつれて、以下同様である。
伝導性チャネルを流れる電流の違いが、コンピュータ可読記憶媒体などに記録および保存
され得、当該コンピュータ可読記憶媒体などは、ポリメラーゼによって重合される取り込
みごとに、所定の同定されたヌクレオチド種を記録するようにプログラムされ得る(伸長
中の新生鎖が合成されるにつれて、そのような取り込みごとに伝導性チャネルによって検
出された電荷の価数および/または大きさに基づいて)。
基G、A、C、およびTの間の4状態識別が達成される例を示している。具体的には、d
CTPは負に帯電した外因性部分(extrinsic moiety)で一意に標識さ
れ、dTTPは正に帯電した外因性部分(extrinsic moiety)で一意に
標識され、dATPおよびdGTPは、外因性電荷部分が非存在であることに基づいて他
の2つのヌクレオチドタイプと区別され、dATPは、テザーにハイブリダイズしたとき
の伝導性チャネルへのオリゴヌクレオチド部分の近接差に基づいて、dGTPと区別され
る。
組み合わせのいずれかに基づいて、異なるヌクレオチドの種類を識別できることが理解さ
れるであろう。代替的または追加的に、異なる種類のヌクレオチドを識別するために使用
される電荷部分は、たとえ電荷が同じ符号を有しているとしても、電荷の強度が異なり得
る。図3に示す例示的な構成は、単一のテザーハイブリダイゼーション位置と4つの異な
る電荷部分に基づく、塩基G、A、C、およびTの間の4状態識別を提供する。具体的に
は、この非限定的な例では、dGTPおよびdCTPの両方は、それらをdATPおよび
dTTPと区別する負に帯電した部分を含み、dGTPは、dCTPの電荷よりも明らか
に高い電荷のため、dCTPと区別することができる。同様に、dATPとdTTPは、
dTTP部分に比べてdATP部分の正電荷が高いため、互いに区別することができる。
グ配置の精度は、リボヌクレオチドおよびヌクレオチド標識を有するテザーの使用により
強化することができ、当該ヌクレオチド標識は2’−O−メチル(2’−O−Me)およ
び2’−フルオロ(2’F)修飾RNA塩基を有する。代替の構成は、リボヌクレオチド
を有する標識を備えた2’−O−Meおよび2’F修飾リボヌクレオチドを含むテザーを
使用することができ、またはテザーと標識の両方は、天然リボヌクレオチドと2’−O−
Meおよび2’F修飾リボヌクレオチドとの混合物を含むことができる。主にRNAで構
成されるテザーおよび/またはオリゴヌクレオチド部分を使用することは可能であるが、
RNAに関連するヌクレアーゼ感受性を避けるために、DNAベースのテザーもしくはP
NAベースのテザーもしくはアミノ酸ベースのテザー、および/またはオリゴヌクレオチ
ドを使用することが望ましいかもしれない。例えば、DNAベースのテザーもしくはPN
Aベースのテザーもしくはアミノ酸ベースのテザー、および/またはオリゴヌクレオチド
は、不所望のヌクレアーゼ消化のリスクを低減しながら、本明細書に記載の結合の利点を
達成するために、天然リボヌクレオチドまたは非天然リボヌクレオチドアナログを含むこ
とができる。更なる例では、テザーはヌクレオチド標識中のデオキシリボヌクレオチドに
相補的な1つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含むことができるか、またはテザーはヌ
クレオチド標識中のデオキシリボヌクレオチドに相補的なデオキシリボヌクレオチドを含
むことができる。
の例に示されるように、異なるヌクレオチド配列に対して異なる結合位置(例えば、アク
セプター領域)を有し得る。2つ以上のヌクレオチド配列に対する結合位置は重複してい
ても、重複せずに離散していてもよい。例示の目的で、テザー配列が一連の包括的な(g
eneric)「N」ヌクレオチドとして、図8に描かれている。相補性のルール、およ
び所望のハイブリダイゼーションの強度および特異性に従って、任意の様々な配列を使用
することができる。テザーの長さ、アクセプター領域の長さ、および特異性領域の長さに
応じて、テザー上の結合部位の一部が重複するか、テザー上の結合部位のすべてが重複す
るか、またはテザー上の結合部位は全く重複しないかもしれない。いくつかの態様では、
相補的塩基は標準的なDNA塩基であるが、任意のヌクレオチドアナログを使用すること
もできる(例えば、デオキシリボヌクレオチドアナログを使用してもよい)。
アクセプター領域上の相補配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し得
る。いくつかの例では、テザー結合オリゴヌクレオチド部分は、テザーに非特異的に結合
するプロミスキャス(promiscuous)ヌクレオチド位置も含むことができる。
そのような位置は、テザー結合オリゴヌクレオチド部分とテザーの間に弱い相互作用を提
供することができ、当該相互作用は特定のハイブリッド構造の形成を促進する。例えば、
図9に示すように、オリゴヌクレオチド部分は、DNAの4つのすべての天然ヌクレオチ
ドと弱くはあるがプロミスキャスに(promiscuously)結合することが知ら
れているいくつかのイノシン(I)を含むことができる。テザー結合オリゴヌクレオチド
部分(例えば、特異性領域)およびテザー(例えば、アクセプター領域)は、テザー結合
オリゴヌクレオチド部分中のイノシンとテザー中の天然ヌクレオチドとの間の相互作用を
介して、弱い複合体を形成することができる。これにより、配列の特定の部分(例えば、
図中でABCおよびその相補体A’B’C’として示されている)が、弱い複合体の形成
がない場合に拡散する必要がある場合よりも素早く結合する(associate)こと
ができる。更に、特異的な複合体が形成されると、イノシンは更なる安定性を与えること
ができる。
するプロミスキャス(promiscuous)ヌクレオチド位置を含む。しかしながら
、1つ以上のプロミスキャス(promiscuous)ヌクレオチド位置は、特異的配
列の5’側のみまたは3’側のみに配置され得ることが理解されよう。プロミスキャス(
promiscuous)ヌクレオチド位置の他の例は、縮重(degenerate)
オリゴヌクレオチド合成によって形成されるもの、または2種類以上のヌクレオチドとプ
ロミスキャスに(promiscuously)ハイブリダイズする当技術分野で知られ
ている他のヌクレオチドアナログで形成されるものを含む。
有する複数の異なるヌクレオチドアナログの使用を例示した。そのような例では、異なる
ヌクレオチドアナログの種類が、それらの特異性領域の異なる長さに基づいて識別され得
る。あるいは、異なるヌクレオチドアナログは、互いに区別することができないかもしれ
ない同じまたは類似の長さのテザー結合オリゴヌクレオチド部分を有し得る。しかしなが
ら、各ヌクレオチドアナログは、他のヌクレオチドアナログの特異性領域が結合する1つ
または複数のアクセプター領域と比較して、テザーの異なるアクセプター領域に結合する
特異性配列を有することができる。例示的な構成が図10に示されており、異なるヌクレ
オチドアナログへのポリメラーゼの結合は、ポリメラーゼを4つの識別可能な状態の1つ
に配置する。図10に示す非限定的な例では、ATPアナログのテザー結合オリゴヌクレ
オチド部分は、テザーのポリメラーゼへの付着点に最も近いテザー上の位置に結合し、T
TPアナログのテザー結合オリゴヌクレオチド部分は、テザーのポリメラーゼへの付着点
から最も遠いテザー上の位置に結合し、GTPアナログおよびCTPアナログのテザー結
合オリゴヌクレオチド部分は、他の2つのヌクレオチドアナログのテザー結合オリゴヌク
レオチド部分の結合部位から中間距離にあるテザー上のそれぞれ異なる場所に結合する。
ポリメラーゼへの異なるヌクレオチドアナログの結合は、伝導性チャネルから異なる距離
にポリメラーゼを配置し得る(例えば、図中に示すように、テザーに異なるサイズのルー
プを形成させる)。ヌクレオチドアナログの1つ以上が、電荷タグまたは他の検出可能な
部分(例えば、ポリメラーゼによってヌクレオチド配列に取り込まれるヌクレオチドから
伸びる末端から遠位のテザー結合オリゴヌクレオチド部分の末端から伸びる)を含む例で
は、テザー結合オリゴヌクレオチド部分とテザーとの間の結合は、伝導性チャネルから異
なる距離に電荷タグ部分を配置し得る。そのような場合、伝導性チャネルからの検出可能
な電荷タグ部分の異なる距離に対して生成されるシグナルの差に少なくとも部分的に基づ
いて、異なる種類のヌクレオチドアナログは識別され得る。この例示的な例では、ヌクレ
オチドアナログはATP、GTP、CTPおよびTTPとして識別されるが、任意のヌク
レオチドアナログを使用することができる(例えば、デオキシリボヌクレオチドアナログ
を使用してもよい)。
オチドの特異性領域は、テザーのアクセプター領域の異なる部分にそれぞれハイブリダイ
ズするポリヌクレオチド配列を含み得る。特異性領域のそのような配列の間には、アクセ
プター領域の一部にハイブリダイズしないヌクレオチドのスパン(span)があり得る
。したがって、2つの配列は、テザーのアクセプター領域のそれに対応して相補的な部分
および特異性領域の介在部分にハイブリダイズし得、介在配列は他の場所で自由にハイブ
リダイズする(例えば、図13Aに示すようなヘアピン構造を形成するために互いにハイ
ブリダイズする特異性領域のそのような介在配列の2つの相補的部分)か、または自由に
ハイブリダイズするかそれ自体が特異的に非結合のままになる(例えば、図13Bに示す
ように)。図13Aおよび13Bにおいて、「Glue」は、タグ付きヌクレオチドの特
異性領域にハイブリダイズするか、そうでなければ一時的に結合するテザーのアクセプタ
ー部分を意味する。いくつかの例では、このような結合は、伝導性チャネル(図13Aお
よび13Bにおいて、テザー/アクセプター領域/「Glue」が付着したワイヤによっ
て表される)による電荷タグの検出を増加させ得る。
させるテザーは、アナログヌクレオチド上に存在し得る電荷タグまたは特異性配列にハイ
ブリダイズする必要はない。むしろ、伝導性チャネルは、ヌクレオチドアナログの特異性
領域が結合し得るポリメラーゼのテザーとは別のアクセプター領域の付着によって機能化
することができる。アクセプター領域がポリメラーゼテザーの一部であろうと、伝導性チ
ャネルに付着していようと、電荷タグの電荷の価数、電荷の強度、特異性領域:アクセプ
ター領域の結合複合体の長さ、伝導性チャネルへのまたは伝導性チャネルに対するアクセ
プター領域:特異性領域複合体の形成の近接性もしくは位置、またはそれらの組み合わせ
に基づいて、異なるヌクレオチドの識別を達成することができる。
る。これは、本明細書に記載および開示されるヌクレオチドアナログの多くの例のうちの
1つにすぎず、本開示の範囲を限定するものではない。この非限定的な例では、dTヘキ
サホスフェートは、特異性領域を含むリンカー領域を介して電荷タグに接続されている。
この非限定的な例のリンカーは、アジド−アルキンクリック反応によって形成された共有
結合を含むが、本明細書でさらに開示されるように、他のケミストリーが代わりに使用さ
れてもよい。参照を容易にするために、本明細書でヌクレオチドアナログの部分を説明す
る場合、ヌクレオチドのデオキシリボース上の遊離3’ヒドロキシル基を指す慣例に従っ
て、図5に示す分子の右側の領域は、3’末端と呼ばれる。それに対応して、この例では
電荷タグが配置されている図5に示す分子の左側の領域は、ヌクレオチドのリボースの5
’炭素に結合したホスフェート基の延長(extension)として、5’末端と呼ば
れる。
かの有用な修飾および電荷の非限定的なリストを提供する。
レオチドのホスフェート基に付着した連結分子;および連結分子に付着した電荷タグ。こ
こで、当該電荷タグは、ヌクレオチドおよびアミノ酸からなる群から選択される複数の要
素、および要素間の任意のリンカーを含み、電荷タグは内部折り畳み(internal
folded)構造または二次構造を含む。一例では、電荷タグは、1つ以上のホスホ
ジエステル基、および要素間の任意のリンカーを含む。いくつかの態様では、ヌクレオチ
ドは天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドである。修飾ヌクレオチドの構造は、当業
者に知られており、塩基または糖部分への構造的修飾(例えば、アルキル化、アミノ基、
または保護基)を含み得る。いくつかの例では、連結分子は特異性領域を含む。いくつか
の例では、特異性領域は、1〜6つのヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの例では、電荷タグは、約1の電荷〜約100または約200の電荷を含む。い
くつかの例では、連結分子は、以下の式Iに示す−X2から(CH2)m基までの構造を
含む。一例では、電荷タグは、本明細書の方法で使用されるポリメラーゼ(例えば、Ph
i29)に結合しない。いくつかの例では、電荷タグは、ポリメラーゼテザーのアクセプ
ター領域に結合する2つの非隣接領域を含有する複数のヌクレオチドを含み、それにより
電荷タグにおいてヘアピン構造を形成する。
表される:
0の整数であって、X1は、直接結合、C1−C10アルキル、C1−C10オキサアル
キル、C1−C10チアアルキル、またはC1−C10アザアルキルであって、X2は、
1つ以上の個々のCH2残基がペプチド結合および(−O−CH2−CH2−)aの1つ
以上で任意に置換されたC1−C20アルキルであり、ここで、aは、1〜24の整数で
あって、X3は、直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャ
ネルに近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域に
ハイブリダイズし、F1はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつF2は非存在
であるかまたはフルオロホアであって、Aは、
ここで、Rは、Yおよび水素から選択され、Bがデンドロンである場合、qは1に等しく
、前記q個のBは、電荷および電荷密度を有する。一例では、ポリメラーゼによる鋳型ポ
リヌクレオチド鎖に相補的な新生ポリヌクレオチド鎖への標識ヌクレオチドの取り込みを
検出することを含む方法が提供され、前記ポリメラーゼは、テザーによって固体支持伝導
性チャネルにつながれ、前記標識ヌクレオチドは式Iの化合物であって、前記伝導性チャ
ネルは、前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出する。
アミノ酸、ペプチド核酸、またはそれらの組み合わせを含み、前記電荷タグは内部折り畳
み(internal folded)構造または二次構造を有する。
によってAを形成することを含み得、前記連結反応は、アジド−アルキン銅アシストクリ
ック反応(azide−alkyne copper−assisted click
reaction)、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲーション(tetr
azine−trans−cyclooctene ligation)、アジド−ジベ
ンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応(azide−dibenzocycloo
ctyne group copper−free click reaction)、
およびチオール−マレイミドコンジュゲーション(thiol−maleimide c
onjugation)からなる群から選択される。
どに、式Iの化合物の電荷タグを電荷検出器で検出する方法が提供される。非限定的な例
では、検出は、核酸のシークエンシング中に行われ得、以下を含む:(a)固体支持伝導
性チャネル(solid support conductive channel)に
つながれたポリメラーゼを提供すること;(b)式Iの1つ以上の化合物を提供すること
。それにより、前記標識が前記伝導性チャネルに近接している場合、前記伝導性チャネル
によって前記化合物の存在を検出することができる;および(c)前記伝導性チャネルを
使用して、鋳型核酸に相補的な新生鎖への前記化合物の取り込みを検出すること。
1つ以上のクローバー形(cloverleaf shape)、1つ以上の管状形(t
ubular shape)、1つ以上の環状形(annular shape)、1つ
以上の直方体形(cuboidal shape)、1つ以上の十字形(crucifo
rm shape)、1つ以上の球形(spherical shape)、1つ以上の
長方形(rectangular shape)、1つ以上の角錐形(pyramida
l shape)、1つ以上の菱形(diamond shape)、1つ以上の層形(
laminar shape)、1つ以上の円柱形(columnar shape)、
1つ以上の波形(corrugated shape)、または前述の2つ以上の任意の
組み合わせを有する1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、式Iの化合物も提供される。
式Iの化合物の別の例では、Bは、1つ以上のコイル形(coiled shape)を
有する1つ以上のポリペプチドを含む。また、Bが十字形(cruciform sha
pe)を形成する1つ以上のオリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドの1つ以上に
結合した1つ以上のペプチド核酸分子、および前記1つ以上のペプチド核酸分子に結合し
た1つ以上のポリペプチドを含む、式Iの化合物も提供される。
、Bが−100e〜+100eの電荷、および約−100e/nm3〜約+100e/n
m3の電荷密度を有する式Iの化合物も提供される。また、Bが−200e〜+200e
の電荷を有する、式Iの化合物も提供される。また、Bが−200e〜+200eの電荷
、および約−200e/nm3〜約+200e/nm3の電荷密度を有する式Iの化合物
も提供される。
って表されるものを任意に含み得る。フルオロホアのいくつかの非限定的な例は、シアニ
ン色素(例えば、Cy2、Cy3、またはCy5)、フルオレセインイソチオシアネート
、ローダミンフルオロホア(例えば、テトラメチルローダミン)、またはその他を含む。
式Iの化合物におけるフルオロホアの任意の存在は、フルオロホアを含むタグ付きヌクレ
オチドの検出などの追加の用途を提供し得る。例えば、フルオロホア含有電荷タグの存在
は、当該タグによって運ばれる電荷の存在、価数、および大きさの検出だけでなく、蛍光
共鳴エネルギー移動などの蛍光発光を検出する方法によっても検出され得る。
れる。いくつかの例では、前記電荷タグは1つ以上のペプチド核酸を含み、前記ペプチド
核酸の1つ以上は1つ以上の荷電アミノ酸に付着される。
、式Iの化合物を形成する方法が提供される。当業者によって理解されるように、DNA
オリガミは、ナノスケールでの任意でない形状の作成においてDNAを折り畳むことを含
む。コンパクト化されたオリガミDNA構造は、高い電荷密度を可能にし得、式Iの異な
る化合物において電荷密度の変動を可能にし得る。より高い電荷、より高い電荷密度、な
らびに電荷タグの電荷および電荷密度の変動におけるより高いフレキシビリティ(fle
xibility)は、伝導性チャネルによる電荷タグの検出の可能性を高め得、また伝
導性チャネルによって検出された異なる電荷タグ間の識別を可能にし得る。電荷タグによ
って運ばれ得る、より広い範囲の電荷は、式Iの化合物の異なる例によって運ばれる電荷
間のより大きな差別化(differentiation)を可能にする。いくつかの例
では、異なるヌクレオチドは、それらが式Iの化合物として結合しているタグによって運
ばれる電荷によって互いに区別され得る。それにより、伝導性チャネルは、異なるそのよ
うなヌクレオチドによって運ばれる電荷の大きさの違いに基づいて、式Iの化合物の一部
を構成する異なるヌクレオチドを差別的に検出し得る。
正の電荷を有する電荷タグを生成し得る。代わりに、Bはアスパラギン酸およびグルタミ
ン酸を含み得、負の電荷を有する電荷タグを生成し得る。いくつかの例では、Bは分岐ポ
リペプチド、または直鎖ポリペプチド、または環状ポリペプチドである。いくつかの例で
は、Bは、単一のアミノ酸または2〜10個もしくは11〜20個のアミノ酸を含むポリ
ペプチドであり得る。いくつかの例では、Bのアミノ酸のいくつかは非荷電であり得、他
の例では、BはBの他のアミノ酸と反対に荷電するいくつかのアミノ酸を含み得るが、B
は全体的に正または負の電荷を保持し得る。
ポリメラーゼによって認識可能なヌクレオチドであり、それにより鋳型配列に相補的に合
成されるヌクレオチド配列に取り込まれる。ヌクレオチドアナログは、伸長中の合成ポリ
ヌクレオチド配列への付加中にポリメラーゼによって所定の位置に保持されるが、当該ア
ナログの残り(remainder)はそこから伸長し得、本明細書に開示されるように
、伝導性チャネルに近接するポリメラーゼについて、伝導性チャネルが電荷の価数および
大きさを感知し得るように、電荷タグ(式Iおよびそれが直接結合した荷電ペプチド中の
Bによって表されるものなど)は、伝導性チャネルの近傍にに移動または移動させられる
ことができる。異なるヌクレオチドアナログは、当該アナログの3’末端に異なるヌクレ
オチド、およびそれに対応して当該アナログの5’末端に異なるペプチド電荷タグを含む
ことがあり、その結果、合成中のヌクレオチド配列にヌクレオチドを取り込むためにポリ
メラーゼが異なるヌクレオチドアナログと結合する際に、ポリメラーゼにつながれた伝導
性チャネルは、電荷の価数および大きさの違いを検出し得る。これらの例では、ポリメラ
ーゼは、ヌクレオチドアナログの5’ヌクレオチドに直接結合した1つのホスフェート基
を除くすべてを切断し得、その結果、当該ヌクレオチドアナログのdNMP部分は合成さ
れるヌクレオチド配列中に残り、5’ホスフェート基は取り込まれる次のヌクレオチドに
自由に結合し、ヌクレオチドアナログの切断された残り(remainder)は複合体
から自由に解離する。
、3、4、5、6、7、8、9、または10個のホスフェート基を含み得る。他の例は、
10個を超えるホスフェート基を含み得る。次いで、ヌクレオチドアナログのこの部分は
、1〜10個の−CH2−基を含むアルキル結合(alkyl linkage)により
連結され得る。他の例は、この位置に11〜20個のそのような基を含み得る。他の例で
は、これらの1〜10個または11〜20個の−CH2−基の1つ以上は、C1〜C20
炭化水素で置換され得る。
キサアルキル基によってさらに連結され得る。他の例では、これらの0〜50個の−O−
CH2−CH2−基の1つ以上は、C1〜C150炭化水素で置換され得る。ヌクレオチ
ドアナログのこの部分は、X1で表される0〜10個の−CH2−基を含むアルキル結合
(alkyl linkage)によってさらに連結され得る。X1の他の例は、この位
置に11〜20個のそのような基を含み得る。X1の他の例では、これらの1〜10個ま
たは11〜20個の−CH2の基1つ以上は、C1〜C20炭化水素で置換され得る。X
1はまた、直接結合、C1−C10アルキル、C1−C10オキサアルキル、C1−C1
0チアアルキル、またはC1−C10アザアルキルであり得る。
クレオチドアナログの3’末端に向かって電荷タグに接続され得る連結基を表す。例えば
、ヌクレオチドポリホスフェートは、デオキシリボース(またはリボース)の最も遠位の
5’ホスフェート基に付加された官能基を有してもよく、その末端の官能基は反応基であ
り得る。反応基は、特定の1つ以上の試薬の存在下、または所定のpHもしくは温度など
の制御された条件下で、別の化学基と反応することができる化学基であり(まとめて2つ
の反応基であり)、それらの間に共有結合または結合を形成する。例えば、3’ヌクレオ
チドからA、または3’ヌクレオチドからAの何個かの結合手前まで(from the
3′ nucleotide up to or some number of b
onds short of A)の式Iの部分に類似する組成物または当該部分の例は
、市販されているか、既知の方法に従って合成され得る。次いで、第一の反応基が反応し
て共有結合を形成することができる別の反応基を有する電荷タグも一緒に反応し得るよう
に、そのような化合物の末端に反応基を付加して、それにより電荷タグを3’ヌクレオチ
ドに共有結合させて式Iの化合物を形成する。
−O−CH2−CH2−)aの1つ以上で任意に置換されたC1−C20アルキルであり
得、ここで、aは、1〜24の整数である。X2の他の例では、aは、6〜20の整数で
あり得る。さらに他の例では、X2の1〜20個のアルキル基の1つ以上は、C1〜C2
0炭化水素で置換され得る。
は、ホスホジエステル基を含む1〜100個の部分を含み得る。一例では、Bは、ホスホ
ジエステル基を含む1〜200個の部分を含み得る。そのようなホスホジエステル基の酸
素原子によって運ばれる負電荷は、B電荷タグに負電荷を与え、その大きさは部分の数に
比例する。Bのq個の部分のそれぞれは、Bの他の部分のいずれとも異なる部分であって
もよく、またはそれらはすべて互いに同じであってもよい。Bの任意の1つ以上の部分は
、例えば、アデニン、チミン、シトシン、またはグアノシン塩基を有するdNMPであり
得る。Bのいずれか1つ以上の部分は、
)を含み得る。異なる3’ヌクレオチドが結合している他の電荷タグと、その価数、大き
さ、または両方が異なる電荷タグは、それらがポリヌクレオチド合成中にそこにつながれ
たポリメラーゼによって保持されるため、伝導性チャネルによるヌクレオチドアナログの
差別化された識別を可能にする。いくつかの例では、いくつかのヌクレオチドアナログは
、式Iの化合物または本明細書に開示される類似の化合物である。いくつかの例では、合
成によるシークエンシング反応で使用されるすべてのヌクレオチドは、式Iの化合物また
は関連化合物の例など、本明細書に開示される1つ以上のホスホジエステル基を含む電荷
タグを含有する。他の例では、合成によるシークエンシング反応で使用されるいくつかの
ヌクレオチドは、式Iの化合物または関連化合物の例など、本明細書に開示される1つ以
上のホスホジエステル基を含む電荷タグを含有するのに対し、合成によるシークエンシン
グ反応で使用される他のヌクレオチドは、そのような化合物を含まない電荷タグを含有す
る。
、正電荷を有する電荷タグを生成する。別の例では、各Bはアスパラギン酸およびグルタ
ミン酸から独立して選択され得、負電荷を有する電荷タグを生成する。いくつかの例では
、q個のBは、分岐ポリペプチド、または直鎖ポリペプチド、または環状ポリペプチドで
ある。いくつかの例では、q個のBは、単一のアミノ酸または2〜10個もしくは11〜
20個のアミノ酸を有するポリペプチドであり得る。いくつかの例では、Bのアミノ酸の
いくつかは非荷電であり得、他の例では、BはBの他のアミノ酸と反対に荷電するいくつ
かのアミノ酸を含み得るが、Bは全体的に正または負の電荷を保持し得る。いくつかの例
では、Bは非天然アミノ酸を含み得る。
代(z generations)のデンドロンであり、ここで、zは1〜6の整数であ
り、前記構成末端単位は以下からなる群から選択され:
1〜3個の−O−CH2−CH2−基で任意に置換され、p2は1〜3の整数であり、前
記p2個の−CH2−基のいずれか1個以上は、1〜3個の−O−CH2−CH2−基で
任意に置換され、前記末端の基は、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、アミノ基、お
よび第4級アンモニウム基からなる群から選択される。
れたデンドロン電荷タグを表し得る。いくつかの例では、本明細書に開示されるデンドロ
ンは、ヌクレオチドアナログに化学的に結合される前などに、ヌクレオチドアナログに付
着していなくてもよい。Bは、以下によって表されるような、2度の分岐(2 degr
ees of branching)を有する構成繰り返し単位を含み得る:
こであってもよい。末端構成繰り返し単位の末端基は、正または負のいずれかに帯電し得
る。したがって、2度の分岐を有するデンドロンは2zの電荷を有する電荷タグを生成し
得、3度の分岐を有するデンドロンは3zの電荷を有する電荷タグを生成し得る(末端基
ごとの電荷の大きさは1である)。
ン酸、アミノ基、または第4級アンモニウム基などの多くの荷電官能基、または他の荷電
官能基のいずれかであり得る。いくつかの例では、デンドロンの構成繰り返し単位は、末
端構成繰り返し単位の末端基以外の原子上に電荷を含み得る。例えば、1つの非限定的な
例として、構成繰り返し単位は、分岐点に第4級アンモニウム基を含有し得、当該第4級
アンモニウム基は正電荷を帯びていてもよい。末端構成繰り返し単位にのみ存在する荷電
末端基とは異なり、このような内部電荷は、デンドロン内の構成繰り返し単位のすべての
場合(instance)に存在し得る。
式Iに示されるペプチド結合の代わりに、C1〜C20の炭化水素が存在してもよく、ま
たは直接結合が存在してもよい。
って形成され得る。例えば、Aは、アジド(またはアルキン)基を有するヌクレオチドと
、アルキン(またはアジド)基を有する電荷タグとの間のアジド−アルキン銅アシストク
リック反応(azide−alkyne copper−assisted click
reaction)によって形成され得、以下のような化学構造またはその均等物(e
quivalent)を生成する:
と、トランスシクロオクテン(またはテトラジン)基を有する電荷タグとの間のテトラジ
ン(TET)−トランス−シクロオクテン(TCO)ライゲーション(tetrazin
e (TET)−trans−cyclooctene (TCO) ligation
)によって形成され得、以下のような化学構造またはその均等物(equivalent
)を生成する:
ジベンジルシクロオクチル(またはアジド)基を有する電荷タグとの間のアジド−ジベン
ゾシクロオクチン(DBCO)基銅フリークリック反応(azide−dibenzoc
yclooctyne (DBCO) group copper−free clic
k reaction)によって形成され得、以下のような化学構造またはその均等物(
equivalent)を生成する:
(またはチオール)基を有する電荷タグとの間のチオール−マレイミドコンジュゲーショ
ン(thiol−maleimide conjugation)によって形成され得、
以下のような化学構造またはその均等物(equivalent)を生成する:
クレオチドと、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(またはアミン)基を有する電荷
タグとの間のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル−アミン結合反応(N−hydro
xysuccinimide ester−amine linkage reacti
on)によって形成され得、アミド結合を生成する。
により形成される他の連結基を本開示に取り込んで、3’ヌクレオチドを電荷タグに連結
し得るAの他の構造を形成してもよい。
、オリゴヌクレオチド、オリゴマーペプチド核酸、デンドロン、または前述の少なくとも
2つの組み合わせを含み得る。電荷タグの電荷は、そのような部分の荷電官能基、例えば
、ホスホジエステル結合、アミド基、カルボン酸基、またはそのような化合物に追加し得
る他の荷電官能基、例えば、1つ以上のスルホン酸、ホスホン酸、または第4級アンモニ
ウム基によって運ばれ得る。本明細書に開示されるように、電荷タグは、その要素によっ
て運ばれる電荷が一緒に保持され、伝導性チャネルから広がり、離れるのを防ぐように、
特定の三次元方向をとり得る。電荷タグの電荷密度を高めることによるこのような電荷の
凝縮は、伝導性チャネルによって検出される電荷を増加させ得る。
した反応基を有するように合成され得る。例えば、電荷タグは、アジド基またはアルキン
基(例えば、アジド−アルキン銅アシストクリック反応による電荷タグとしてのヌクレオ
チドアナログへの共有結合および包含のため)、またはテトラジン(TET)基またはト
ランス−シクロオクテン基(例えば、テトラジン(TET)−トランス−シクロオクテン
(TCO)ライゲーションによる電荷タグとしてのヌクレオチドアナログへの共有結合お
よび包含のため)、またはアジド基またはDBCO基(例えば、アジド−DBCO基銅フ
リークリック反応による電荷タグとしてのヌクレオチドアナログへの共有結合および包含
のため)、またはチオール基(システイン残基など)またはマレイミド基(例えば、チオ
ール−マレイミドコンジュゲーションによる電荷タグとしてのヌクレオチドアナログへの
共有結合および包含のため)を有し得る。他の既知のライゲーション、クリックケミスト
リー、または他の共有結合ケミストリー(covalent attachment c
hemistries)も使用し得、対応する反応基が電荷タグに付着され、ヌクレオチ
ドアナログへの共有結合が可能になる。
得る。他の例では、式Iに示されるペプチド結合の代わりに、C1〜C20の炭化水素が
存在してもよく、または直接結合が存在してもよい。
当該改変または変形は、テザーのアクセプター領域(これによりポリメラーゼが伝導性チ
ャネルにつながれる)がどのようにヌクレオチドアナログの特異性領域とハイブリダイズ
するか、またはそうでなければ非共有結合を形成するかに関連する上記の特徴を取り込む
。例えば、3’ヌクレオチドと5’電荷タグの間のアナログヌクレオチドの一部は、テザ
ーと非共有結合を形成可能なヌクレオチド、PNA残基、またはアミノ酸を取り込むこと
ができ、当該テザーによってポリメラーゼは伝導性チャネル、またはそれ自体はそのよう
なテザーの一部でなくてもよく、ヌクレオチド、PNA残基、またはアミノ酸、またはそ
れらの組み合わせを含み得る伝導性チャネルから伸びてそれに付着するアクセプター領域
で機能化された部分に接続される。上記のものは、本明細書に開示されている式Iの化合
物の5’電荷タグと3’ヌクレオチドの間の領域に置換または付加され得る。そのような
置換または付加は、ポリメラーゼおよびテザー(または、そのような置換または付加に結
合する目的のための、テザーとは別の伝導性チャネルの機能化された部分)へのアナログ
ヌクレオチドの相乗的結合に寄与し得、本明細書に開示されるように、電荷タグの検出が
記録され、そのような電荷を有するヌクレオチドアナログの取り込みを示すことを可能に
するために、電荷検出器の検出領域と電荷タグとの適切に長い持続時間の結合(asso
ciation)を促進する。
空間的に異なる要素を集めることで特定領域が形成され得、そのように集められた特異性
領域のアクセプター領域への結合が可能になる。そのような特異性領域の形成およびアク
セプター領域の結合は、電荷タグの特定の三次元構造の形成の非存在下では、発生しない
か、発生する可能性が非常に低いか、または非常に一時的にのみ発生する可能性がある。
他の例では、アクセプター領域への結合時に特異性領域の別の異なる要素を集めることは
、電荷タグの所定の三次元コンホメーションの形成を誘導または促進する可能性がある。
いくつかの例では、電荷タグの三次元コンホメーションの形成と、特異性領域の空間的に
遠位の要素の集合が相乗効果をもたらし、各々が他方を促進する場合がある。いくつかの
場合では、電荷タグによってそのようにとられた三次元コンホメーションは、そうでない
場合に発生する可能性がある電荷密度よりも高い電荷密度をもたらし、伝導性チャネルに
よる電荷タグの検出を増加させ得る。
すると、21個のアミノ酸のいずれかを電荷タグに含めることができる。さらに、修飾ア
ミノ酸も市販されており、ペプチド電荷タグに付加してその特性をさらに調節することが
できる。アルギニン、ヒスチジンおよびリジン(正)、ならびにアスパラギン酸およびグ
ルタミン酸(負)などの電気的に荷電した側鎖を有するアミノ酸を使用するほか、他のア
ミノ酸をペプチド荷電タグにを組み込んで、その親水性、長さおよびサイズを微調整する
ことができる。
鎖(図12Bおよび図12C参照)または環状鎖(図12D参照)の形態で提示され得る
。
の非荷電アミノ酸の有無にかかわらず、荷電アミノ酸のその他の組み合わせ)を使用する
ことにより、4つの異なるヌクレオチドアナログをシーケンシングのために区別すること
ができ、あるいは様々なヌクレオチドアナログを各ペプチド電荷タグからの特徴的な電流
シグネチャに基づいて区別することができる。他のより複雑な三次元コンホメーションも
可能である。例えば、ペプチド電荷タグは、α−ヘリックスなどのコイル構造をとり得る
。そのような構造は、正および負のアミノ酸を含むが、全体的に正または負の電荷を含む
。例えば、反対に帯電したアミノ酸の配置は、それらの間の結合と、α−ヘリックスまた
は他の構造の形成とを誘導し得、過剰な正電荷または過剰な負電荷が近接して一緒に保持
され、電荷密度が増加する。他の例では、同様の結合は、正味の正または負の電荷密度を
含むコイルドコイル構造の形成を促進し得る。
プチド電荷タグをヌクレオチドアナログに付着させるための上記のクリックケミストリー
およびライゲーション化学反応を使用して、ヌクレオチドアナログに付着させ得る。
な三次元の向きをとり得る。例えば、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間のホスホジエ
ステル結合は負電荷を有し得る。凝縮した三次元構造をとることにより、オリゴヌクレオ
チドの負電荷は互いに近接して保持され得、伝導性チャネルによるそのような電荷タグの
検出を増加させる。例えば、オリゴヌクレオチドは、ステップアンドループ構造(ste
p−and−loop structure)、クローバーリーフ構造、または十字形構
造(例えば、ホリデイジャンクション)などの周知の構造をとり得る。ポリヌクレオチド
オリガミ技術を使用して、電荷密度を増加させる他のコンホメーションをとるポリヌクレ
オチド電荷タグを設計することもできる。ポリヌクレオチド電荷タグは、管状形状、環状
形状、直方体形状、または球形状をとり得る。そのような形状は、同じヌクレオチド組成
を有するが三次元コンホメーションをとらないオリゴヌクレオチド、例えば線形コンホメ
ーションに引き伸ばされた場合よりも、高い電荷密度を有するオリゴヌクレオチド電荷タ
グをもたらし得る。
る特定の用語をここで説明する。
の組み合わせを含むことを意図している。アルキルは、1〜20の炭素原子(例えば、1
〜6の炭素原子などの1〜10の炭素原子)のアルキル基を指す。アルキル基の例は、メ
チル、エチル、プロピル、イソプロピル、n−ブチル、s−ブチル、t−ブチルなどを含
む。
含む。シクロアルキル基の例は、c−プロピル、c−ブチル、c−ペンチル、ノルボルニ
ルなどを含む。
ル、アルキニル、アリールおよびそれらの組み合わせを含む。例は、ベンジル、フェネチ
ル、プロパルギル、アリル、シクロヘキシルメチル、アダマンチル、カンホリルおよびナ
フチルエチルを含む。炭化水素は、唯一の元素成分として水素および炭素で構成される任
意の置換基を指す。
酸化状態のものである環系を含むことを意図している。したがって、(C3−C12)炭
素環は、シクロプロパン、ベンゼン、シクロヘキセンなどの系を含む、非芳香族系および
芳香族系の双方を指す。炭素環は、別段の制限がない限り、単環、二環、「および」多環
を指す。(C8−C12)炭素多環は、ノルボルナン、デカリン、インダン、ナフタレン
などの系を指す。
岐構造の1〜20の炭素原子(例えば、1〜6の炭素原子などの1〜10の炭素原子)の
基を指す。例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシなどを含む。
たアルキル残基を指す。例は、メトキシプロポキシ、3,6,9−トリオキサデシルなど
を含む。用語オキサアルキルは、当該技術分野で理解されているように意図されている(
American Chemical Society、2002 edition、1
96で発行された「Naming and Indexing of Chemical
Substances for Chemical Abstracts」を参照。た
だし、127(a)の制限なく、当該文献は参照によりその全体が援用される。)―用語
オキサアルキルは、酸素が単結合を介してその隣接原子に結合している(エーテル結合を
形成している)化合物を指す;カルボニル基に見られるような二重結合酸素は指さない。
同様に、チアアルキルおよびアザアルキルは、それぞれ1つ以上の炭素が硫黄または窒素
で置換されたアルキル残基を指す。アザアルキルの例は、エチルアミノエチルおよびアミ
ノヘキシルを含む。
されたシクロアルキルまたはアリール炭素環残基を意味する。ヘテロアリールは複素環の
サブセットで、当該複素環が芳香族である。複素芳香環の例は以下を含む:フラン、ベン
ゾフラン、イソベンゾフラン、ピロール、インドール、イソインドール、チオフェン、ベ
ンゾチオフェン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、プリン、ピラゾール、インダゾー
ル、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、イソオキサゾール、ベンズイソオキサゾール、
チアゾール、ベンゾチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピリジン、キノリン、イ
ソキノリン、ピラジン、キノキサリン、アクリジン、ピリミジン、キナゾリン、ピリダジ
ン、シンノリン、フタラジン、およびトリアジン。
された」と交換可能に使用され得る。「置換」という用語は、指定された基内の1つ以上
の水素原子を指定されたラジカルで置換することを指す。例えば、置換アルキル、置換ア
リール、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクリルなどは、各残基中の1つ以上のH原子
がハロゲン、ハロアルキル、アルキル、アシル、アルコキシアルキル、ヒドロキシ低級ア
ルキル、カルボニル、フェニル、ヘテロアリール、ベンゼンスルホニル、ヒドロキシ、低
級アルコキシ、ハロアルコキシ、オキサアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル[
−C(=O)O−アルキル]、アルコキシカルボニルアミノ[HNC(=O)O−アルキ
ル]、カルボキサミド[−C(=O)NH2]、アルキルアミノカルボニル[−C(=O
)NH−アルキル]、シアノ、アセトキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキ
ルアミノ、(アルキル)(アリール)アミノアルキル、アルキルアミノアルキル(シクロ
アルキルアミノアルキルを含む)、ジアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルコ
キシ、ヘテロシクリルアルコキシ、メルカプト、アルキルチオ、スルホキシド、スルホン
、スルホニルアミノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニル
アミノ、アリールスルホニル、アリールスルホニルアミノ、アシルアミノアルキル、アシ
ルアミノアルコキシ、アシルアミノ、アミジノ、アリール、ベンジル、ヘテロシクリル、
ヘテロシクリルアルキル、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヒドロ
キシイミノ、アルコキシイミノ、オキサアルキル、アミノスルホニル、トリチル、アミジ
ノ、グアニジノ、ウレイド、ベンジルオキシフェニル、およびベンジルオキシで置換され
ているアルキル、アリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリルを指す。「オキソ」
も「任意に置換された」で言及された置換基に含まれる;オキソは二価のラジカルである
ため、オキソが置換基として適切ではない状況(例えば、フェニル上)が存在することは
当業者には理解されよう。一例では、1、2、または3個の水素原子が特定のラジカルで
置換され得る。アルキルおよびシクロアルキルの場合、3個超の水素原子がフッ素で置換
され得る;実際、利用可能なすべての水素原子をフッ素で置換することができる。そのよ
うな化合物(例えば、ペルフルオロアルキル)は「フルオロ炭化水素」のクラスに含まれ
る。明確にするために、総称(generic term)は複数の置換基を包含し得、
すなわち、例えば「ハロアルキル」または「ハロフェニル」とは、少なくとも1つ、だが
おそらくは2つ以上の水素がハロゲンで置換されているアルキルまたはフェニルを指す。
いくつかの例では、置換基はハロゲン、ハロアルキル、アルキル、アシル、ヒドロキシア
ルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、オキサアルキル、カルボキシ、シア
ノ、アセトキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、
アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノアリールスルホ
ニル、アリールスルホニルアミノ、およびベンジルオキシである。
されている」が使用される。酸素化された置換基は、炭素および水素に加えて酸素を含む
置換基である;酸素化された置換基は、窒素などの追加のヘテロ原子も含み得る(例えば
、カルボキサミドまたはメタンスルホニル)。酸素化された置換基の典型的な例は、アル
コキシ、ヒドロキシ、フルオロアルコキシ、ホルミル、アセチル、および他のC1〜C6
アシル鎖を含む。
〔実施例〕
非限定的な実施例
ことを決して意図していない。
例は、以下を含む:
5、20、25、30、35、40、またはそれらの間の任意の数もしくは範囲に)変更
することにより変化させ得る。最大40、または1〜40の任意の数が含まれ得る。40
超が含まれ得る。本開示に従って、これらの実施例に示されるトランスシクロオクテン基
以外の適切な反応基を使用してもよい。
リゴヌクレオチド配列を、電荷タグとして使用することができる。さらに、dスペーサー
(dSpacer)およびC3スペーサー(C3 Spacer)ヌクレオチドなどの修
飾オリゴヌクレオチドを使用して、異なる親水度およびサイズの電荷タグを作製すること
もできる。配列特異性を調節し、ポリメラーゼへの阻害を最小限に抑え、表面およびリン
カーとの相互作用を最適化するために、異なる塩基および疎水性修飾を使用してオリゴヌ
クレオチド配列を修飾することができる。
れ得る。鋳型鎖に対する相補鎖の合成中にポリメラーゼによって伸長中の鎖に各ヌクレオ
チドが取り込まれると、電荷標識がピロホスフェート副産物の一部として放出される場合
がある。標識上の電荷は、伝導性チャネル上の検出システムによって検出される。各タグ
からの特徴的な電流シグネチャ(例えば、電荷の大きさ)に基づいて、合成鎖に取り込ま
れた塩基は、タグによって付与された電荷の差次的な大きさ(differential
magnitude of charge)を使用して区別され得る。
オリゴヌクレオチド合成を使用して合成された。それらは合成後に精製され、オルソゴナ
ルケミストリー法(orthogonal chemistry methods)によ
り特定のヌクレオチドに付着された。オルソゴナルケミストリー法は、銅触媒アルキン−
アジド(copper catalyzed alkyne−azide)、DBCOお
よびアジドを使用した銅フリークリック化学(copper free click c
hemistry with DBCO and azide)、TCO−テトラジンラ
イゲーション、またはチオール−マレイミドライゲーションが含むが、これらに限定され
ない。
を可能にする、様々なリンカーによる5’アミノヌクレオチドヘキサホスフェートの修飾
を示す。5’−アミンデオキシ−チミンヘキサホスフェート(dT6P)(または他のN
PP)(1)は、アジド−酪酸N−ヒドロキシスクシンイミド(azido−butyr
ic N−hydroxysuccinimide、NHS)エステル(2a)またはメ
チルテトラジンNHSエステル(2b)で官能化され得、それぞれアジドdT6P(3a
)またはメチルテトラジンdT6P(3b)を形成し得る(スキーム1)。
ルアミン(THPTA)リガンドおよびアスコルビン酸ナトリウムの存在下における銅(
I)アシストアジド−アルキン環化付加(copper(I)−assisted az
ide−alkyne cycloaddition、CuAAC)を介して、5’−ヘ
キシニル基を有するポリ−Tオリゴヌクレオチド(4)の直鎖にコンジュゲートされ得、
オリゴヌクレオチドコンジュゲート(5a)を形成することができる。精製はC18逆相
高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)で行い、50mM TEAA(pH7.5)
およびアセトニトリルで溶出した。ポリ−TオリゴヌクレオチドとのCuAAC反応の代
表的な例をスキーム2に示す。
で、5’−トランスシクロオクテン(TCO)基を有するポリ−Tオリゴヌクレオチド(
6)の直鎖にコンジュゲートされ、オリゴヌクレオチドコンジュゲート(5b)を形成し
た。精製はC18逆相HPLCで行い、50mM TEAA(pH7.5)およびアセト
ニトリルで溶出した。メチルテトラジン−TCOライゲーションの代表的な例をスキーム
3に示す。
フリーひずみ促進アジド−アルキン環化付加(copper−free strain
promoted azide−alkyne cycloaddition、SPAA
C)を介して、5’−ジベンゾシクロオクチル(DBCO)基を有するポリ−Tオリゴヌ
クレオチド(7)の直鎖にコンジュゲートされ、オリゴヌクレオチドコンジュゲート(5
c)を形成した。精製はC18逆相HPLCで行い、50mM TEAA(pH7.5)
およびアセトニトリルで溶出した。ポリ−TオリゴヌクレオチドとのSPAAC反応の代
表的な例をスキーム4に示す。
各反応基の配置を逆にするなど、前述の例は変更され得、前述の結合であるがアナログヌ
クレオチドの5’および3’末端に関して反対方向に配向した結合が生成される。
従って、ヌクレオチドおよび電荷タグに付加され得る。いくつかの非限定的な例では、ア
ジドまたはメチルテトラジンテールは、適切なNHS残基との反応によってアミノ化NP
Pに付加され得、それは様々な長さのリンカー部分、例えばPEG4リンカーや様々な長
さのPEGリンカーを含み得る。そのような合成スキームの非限定的な例は、以下および
そのバリエーションを含む:
ション化学反応のための異なる反応基を用いて形成された。いくつかの非限定的な例は、
オチド上のチオール基とそれぞれ反応させて、マレイミド−チオール反応を介して当該2
つを連結することができる。
含有基を含む電荷タグまたはNPPとそれぞれ反応し、例えば当該2つの間の共有結合
が、異なる銅アシストクリックケミストリーのために使用され得る。
行し得るが、収率は低い。対照的に、低Cuローディングでは、反応が完全に完了するま
で進行しない可能性があるが、収率はより高くなり得る。中間のCuローディングでは、
反応は完了するまで進行し得、反応生成物はHPLCによって86%の収率で単離され得
る。
り込みは、phi29(およびそのバリアント)およびKlenowフラグメントなどの
異なるポリメラーゼ、または合成によるシークエンシングプロセスで使用されるその他の
ものを用いて実施され得る。両方のポリメラーゼは、電荷タグを正常に(success
fully)取り込むことができる。この例についてのphi29による取り込みを図1
1に示す。この例では、鋳型に基づくプライマーへの単一ヌクレオチドの取り込みのため
に、一本鎖DNA鋳型ポリヌクレオチド配列を重合基板に固定し、そのような鋳型配列の
一部に相補的な100nMの5’−Cy5標識化DNAプライマー(22mer)、1μ
Mのphi29、および10μMの所定のヌクレオチドを含む緩衝溶液(50mM Tr
is pH7.5、5mM MnCl2、4mM DTT)とインキュベートした。(プ
ライマーに相補的な部分のすぐ5’側(immediately 5’)の鋳型鎖上のア
デノシン残基に相補的な)電荷タグ付きチミジンの5’取り込みを可能にするために、3
0℃で様々な期間インキュベーションした後、ポリメラーゼ反応はクエンチされ、プライ
マーは脱ハイブリダイズされて単一ヌクレオチドの取り込みの検出のためにゲル上で分離
された。デオキシリボ−チミジン5’−ヘキサホスフェート(dT6P)間の結合は、T
5、T10、およびT15を含んでおり、T5、T10、およびT15は、電荷タグとし
て示されたリピートのチミジンヌクレオチドを有していた;T5、T10、およびT15
はクリックケミストリーを介して付着され、T5−Tetはテトラジン−TCOライゲー
ションを介して付着される。C3スペーサー(C3)およびdスペーサー(d)オリゴは
、TCO−テトラジンライゲーションを介して付着される電荷タグとしても用いられた。
TMRは、以下の式を有するテトラメチルローダミン標識化dT6Pであり、
ホスフェートである。
T10、またはT5の取り込み割合(%)を個別に表し(図11では、それらのプロット
は互いにオーバーラップしているため、互いにほとんど区別できない)、1140はT1
5による取り込みを表し、1150はT5−Tetによる取り込みを表し、1160、1
170、および1180は、それぞれ、TMR、d、およびC3の取り込み割合(%)を
個別に表す(図11では、それらのプロットは互いにオーバーラップしているため、互い
にほとんど区別できない)。
示に沿って可能である。例えば、上記の荷電アミノ酸または非荷電アミノ酸のいずれかを
含む、リジン以外のアミノ酸が使用され得、それらはこの例に示されるペプチド荷電タグ
の長さよりも多くても少なくてもよい。したがって、異なる価数および大きさの電荷を有
するペプチド電荷タグが使用され得る。
加された。次に、対応する反応基をペプチド電荷タグに追加して、上記のクリックケミス
トリーもしくはライゲーションケミストリー、または当業者に知られている他のものによ
って、当該2つを結合することができる。ペプチドベースの電荷タグは、固相ペプチド合
成用のフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)およびtert−ブチルオキシ
カルボニル(Boc)保護基ケミストリーを使用して合成することができる。オルソゴナ
ル(orthogonal)な「ハンドル」反応基を末端で(at the termi
nal end)ペプチド合成に導入して、ヌクレオチドまたは核酸への結合を可能にす
ることができる。オルソゴナルケミストリー法は、アジド−アルキン銅アシストクリック
反応、DBCOおよびアジドを用いた銅フリークリックケミストリー、およびTCO−テ
トラジンライゲーションを含む。システインのチオールなどのアミノ酸の反応性側鎖も、
チオール−マレイミドケミストリーにおいて使用することができる。
ペプチド電荷タグも可能になる。例えば、ヒスチジンはpKa=6.04を有し、リジン
はpKa=10.54の側鎖を有する。したがって、中性のpHでは、リジンのみが荷電
している。これにより、バッファー環境のpHを変更することで、電荷数および電荷密度
の更なる調製も可能になる。
、ペプチド電荷タグをペプチド核酸(PNA)オリゴマーに容易に付加することができる
。これは、ペプチド電荷タグの特性をさらに変更するため、または電荷タグのアソシエー
ション特性(association properties)を核酸ベースリンカーな
どのリンカーに追加するために使用される。
テム長と同様に、異なる反応基がデンドロンの自由原子価末端に示されるが、これらは単
なる非限定的な例である。
ドロン;ポリ(プロピレンイミン)(PPI)結合と(C)末端カルボン酸または(D)
末端アミノ基とを有するデンドロン;および、エステル結合と(E)末端カルボン酸また
は(F)末端アミノ基とを有するデンドロンが示されている。
から外向きに拡張する反応により組み立てられる。収束的合成(B)では、デンドロンは
一連の周辺から内向きの構築反応によって構築され、最終的にコアに付着される。
、その後、アセチル基の脱保護によりカルボン酸基が形成されるか、またはエチレンジア
ミンの付加によりアミノ基が形成された。マイケル付加の繰り返しサイクルにより、前世
代と比較して2倍の数の末端官能基を有するデンドロンの連続的生成がもたらされた。追
加の世代が付加され得、別の反応基がステム/自由原子価末端に使用され得る。いくつか
の例では、タグによって運ばれる電荷を増やすために、前述の合成スキームに従って追加
の1世代以上が繰り返し追加され得る。電荷の価数は、正または負に帯電したアミノ酸を
末端基に取り込むことにより変更され得る。図18Aおよび図18Bに例が示されている
。両方の非限定的な例において、末端がシステイン残基の(terminating i
n cysteine)電荷タグが示されており、本明細書に開示されるような他のケミ
ストリーも例として意図されているが、当該電荷タグは本明細書に開示されるようなヌク
レオチドを帯電させるためにリンカー部分に連結され得る。図18Aでは、2、3、また
は4の分岐に続く末端基のための正に帯電したリジン残基は、異なる末端電荷の大きさを
もたらす。あるいは、図18Bに示すように、グルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸
は、様々な世代の分岐後に末端基を形成することができ、ここでも異なる大きさの末端電
荷を生成する。
されていてもよい。非メチル化リジンとは異なり、トリメチル化リジンの電荷はpH依存
性ではない。
pHの影響を受けないかもしれず、金属を配位しないかもしれず、合成中およびハンドリ
ング中にポリ(ビニルホスホン酸)(PVPA)に付着する可能性がより低いかもしれな
いことである。
、分岐的合成(divergent synthesis)ではなく、収束的合成(co
nvergent synthesis)が使用され得る。3度の分岐を有する単位を使
用する利点は、2度の分岐しか有さない単位を備えるデンドロンと比較して、世代ごとに
より多くの電荷を付加し得、所定の有利な電荷を達成するために必要とされる世代数が少
なくなることである。一例は以下の通りであった:
官能化されている。その後、
た化合物は、この場合、−3の電荷を有する。その次の反応で、以下のように、9の電荷
を与えるために、上記の化合物Aが第2世代のデンドロン中に加えられた:
3つの第2度デンドロン(second degree dendrons)を組み合わ
せて、−27の電荷を有する第3世代デンドロンを作製することができる:
ンの自由原子価末端の反応基に応じて、電荷タグデンドロンのヌクレオチドアナログへの
ライゲーションを可能にするために、対応する対の反応基をヌクレオチドアナログに付加
し得る。上記によれば、−32、−27、−16、−9、−8、−4、−3、−2、+2
、+3、+4、+8、+9、+16、+27、および+32を含む広範囲の電荷がヌクレ
オチドアナログに含まれ得る。前述の非限定的な例示的合成スキームに例示されたもの以
外の荷電官能基も使用され得る。
電荷を電荷タグに付加することができる。例えば、ポリヌクレオチドの一本直鎖または本
明細書に開示される他のホスホジエステル含有電荷ではなく、例えば本明細書に示される
デンドロン構造による分岐構造は、末端基としてヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを
含み得る。本明細書に開示されるデンドロン構造に従ってそのようなホスホジエステル含
有タグの連続した世代での分岐を基にすることにより、複数のポリヌクレオチドまたは他
のホスホジエステルベースの電荷を組み合わせて、単一の電荷タグにすることができる。
例えば、図17Aおよび図17Bに示すようなデンドロンベースの構造。図17Aは、3
つのポリT配列を組み合わせて単一のタグにしたタグの一例を示し、本明細書に開示され
る方法に従って式Iの化合物に取り込むことができる。この例では、タグは−30の電荷
を有する。図17Bは、ホスホジエステル含有タグを組み合わせて所定の電荷(この例で
は−30)を生成するいくつかの方法を示す:30のホスホジエステル電荷の線形配列、
3つの10のホスホジエステル配列を末端に有する(terminating)三重分岐
構造、または三重に2回分岐し6つの5のホスホジエステル配列を末端に有する(ter
minating)構造。最初の例と比較して最後の例のように分岐が増加する利点は、
伝導性チャネルから離れて延びる単一の引き延ばされた(extended)配列とは対
照的に、互いに近接した短い荷電配列の濃度が高くなり、電荷密度が高くなり得ることで
ある。
コンポーネントによって提供され得る。例えば、スペルミンベースのオリゴカチオン性電
荷がヌクレオチドに付加され、本開示による電荷タグとして正電荷を提供し得る。オリゴ
−スペルミンコンジュゲートは、pH7で約2.5のプロトン化アミンを有する。そのよ
うな電荷タグ付きヌクレオチドの例は、図19Aおよび図19Bに示されている。図19
Aは、本開示の一態様によるオリゴ−スペルミンコンジュゲートの例を示し、図19Bは
、電荷タグの末端に置くことができる電荷の量を大きくするためのスペルミン由来(sp
ermine−derived)末端基を有するデンドロン構造化タグを示す。両方の例
において、電荷タグをヌクレオチドに付着させるための本明細書に開示のケミストリーは
、本開示の態様に従って、そのようなスペルミン由来電荷タグをヌクレオチドに付着させ
るために当業者によって適合され得る。
thogonal attachment chemistry)を可能にするための、
様々なリンカーによる5’アミノヌクレオチドヘキサホスフェートの修飾を示す。5’−
アミンデオキシ−チミンヘキサホスフェート(dT6P)(または他のNPP)(1)は
、アジド−酪酸N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル(2a)またはメチル
テトラジンNHSエステル(2b)で官能化され、アジドdT6P(3a)またはメチル
テトラジンdT6P(3b)をそれぞれ形成し得る(スキーム6)。
ルアミン(THPTA)リガンドおよびアスコルビン酸ナトリウムの存在下で、銅(I)
アシストアジド−アルキン環化付加(copper(I)−assisted azid
e−alkyne cycloaddition、CuAAC)を介して、5’−ヘキシ
ニル基を有するポリ−Tオリゴヌクレオチド(4)の直鎖にコンジュゲートされ、オリゴ
ヌクレオチドコンジュゲート(5a)を形成し得る。C18逆相HPLCで精製を行い、
50mM TEAA(pH7.5)およびアセトニトリルで溶出した。次に、メチルテト
ラジンdT6P(3b)は、50mMホスフェート緩衝液(pH7.4)中で、トランス
シクロオクテン(TCO)基を有するデンドロンにコンジュゲートされ、デンドロン電荷
タグを有するヌクレオチドアナログを形成し得る。
中における銅フリーひずみ促進アジド−アルキン環化付加(copper−free s
train promoted azide−alkyne cycloadditio
n、SPAAC)を介して、ジベンゾシクロオクチル(DBCO)基を有するデンドロン
電荷タグにコンジュゲートされ、デンドロン電荷タグを有するヌクレオチドアナログを形
成し得る。
応の各反応基の配置を逆にすることなどにより、前述の例は変更され得、前述の結合を生
じるが、アナログヌクレオチドの5’および3’末端に関して逆向きに配向されている。
開示による様々な適用可能なケミストリーに従って、ヌクレオチドおよび電荷タグに付加
され得る。いくつかの非限定的な例では、アジドまたはメチルテトラジンテール(tai
l)は、適切なNHS残基との反応によってアミノ化NPPに付加され得、当該NHS残
基はPEG4リンカーなどの様々な長さのリンカー部分、または様々な長さのPEGリン
カーを含み得る。そのような合成スキームの非限定的な例は、以下およびそのバリエーシ
ョンを含む:
し、それらを電荷タグと共有結合させることができる。いくつかの非限定的な例は、以下
を含み、それらはアルキン含有電荷タグ、例えばその自由原子価末端にアルキン基を有す
るデンドロン電荷タグと反応させることができる:
ー(DBCO−azide click chemistry)が使用され得る。他の例
では、以下のようなヌクレオチドまたはデンドロン電荷タグ上のマレイミド基を、それぞ
れ電荷タグまたはヌクレオチド上のチオール基と反応させ、マレイミド−チオール反応を
介して当該2つを連結し得る:
有基を含む電荷タグまたはNPPとそれぞれ反応した、マレイミド基を含むNPPまたは
電荷タグは、例えば、当該2つの間の共有結合を生成し得る:
限定的で例示的な例が、図13A〜図13C、図14A、図14B、図15、および図1
6に示されている。図13A〜図13Cは、オリゴヌクレオチド電荷タグを有するヌクレ
オチドアナログの3つの例を示す。例えば、オリゴヌクレオチド電荷タグは、5、10、
15、20、25、30、35、40、またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含み得る
。また、伝導性チャネル、この場合はナノワイヤ、および当該伝導性チャネルへの機能化
された付着(attachment)、具体的にはアクセプター領域も示されている。ア
クセプター領域は「Glue」として示されている。オリゴヌクレオチド電荷タグは、修
飾ヌクレオチドの5’末端から伸びる破線として示されている。電荷タグがとり得る3つ
の異なるコンホメーションが示されている。例えば、図13Aは、認識可能なステムルー
プ構造を示している。そのような構造では、ステム部分に沿ったヌクレオチドは互いに塩
基対を形成し、その間にループ部分を残し、この例ではアクセプター領域から離れる方向
に配向するように示されている。それにより、オリゴヌクレオチド電荷タグのヌクレオチ
ド間のホスホジエステル結合由来の負電荷が互いに近接して維持され得、それらが線形の
伸長されたコンホメーションをとる場合に得られるよりも高い電荷密度が維持される。
を示している。この場合、図13Aのように、電荷タグは、アクセプター領域への結合が
示された特異性領域を含む。ここで、特異性領域は、オリゴヌクレオチドが直線的に引き
伸ばされる状況下で空間的に互いに異なる(disparate from each
other spatially)オリゴヌクレオチドのセグメントを含む。しかし、静
電引力によって誘導されてアクセプター領域と結合すると、特異性領域の当該部分は互い
に接近する。このコンホメーションは、ステムループコンホメーション(図13A)また
はバルジコンホメーション(図13B)の採用(adoption)と一致しており、何
れの場合も電荷タグの電荷密度の増加をもたらす。
ンホメーションと同様に、中央のハブから伸びるステムは、ワトソン−クリック対結合ル
ールによって互いに引き付けられたヌクレオチド鎖によって形成され、その間のループに
よって互いに保持される。中央のハブから放射状に伸びるステムの間に、オリゴヌクレオ
チドの鎖が接続している。他の例と同様に、電荷タグ内のヌクレオチドの塩基の対結合は
、タグが、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の負電荷を一緒に凝縮させるコンホメ
ーションをとるように誘導し、その結果、オリゴヌクレオチドが直線的に引き伸ばされた
場合の電荷密度と比較して、電荷密度が増加する。
ド間のホスホジエステル結合の負電荷は、ワトソン−クリック塩基対形成のために、高い
電荷密度で集合するように誘導され得る。例えば、DNAオリガミ方法論を使用して、管
状、円形、直方体、らせん、凝縮らせん、球状もしくは回転楕円体、または高い電荷密度
を生成する他のコンホメーションのオリゴヌクレオチド電荷タグを作製し、様々な3次元
形状を採用することができる。
A、左側)、他方はペプチド核酸配列およびポリペプチドに加えてそのような配列を含む
(図14B、右側)。これらの電荷タグとヌクレオチドアナログとの間の接続は示されて
いないが、そのような付着(attachment)は、例えば、本明細書に開示されて
いるまたは他の既知のケミカルリンキング(chemical linking)技術に
よって実行され得る。左側の図14Aのコンホメーションは十字形である。4つのオリゴ
ヌクレオチド配列は、(DNA組換えイベント中に生じ得るような)Holiday構造
に似たコンホメーションで一緒に結合している。図14Aに示すように、4つのポリヌク
レオチドの部分は、ワトソン−クリック塩基対形成に従って互いに結合している。各オリ
ゴヌクレオチドはまた、対結合した中央部分から一本鎖オーバーハングに伸びている。対
結合は、オリゴヌクレオチド内のホスホジエステル結合の負電荷を互いに近接して保持し
、電荷密度を増加させる。
タグに付加され、電荷タグの別の非限定的な例をもたらす。この例では、ペプチド核酸の
4つの配列はそれぞれ、その末端でポリペプチド配列を接続する。ポリペプチド配列は、
当該ポリペプチド内の一部のアミノ酸間の静電引力のためにらせん構造(helical
structure)を形成する。しかしながら、これらの例では、(らせん構造の形
成をアシストするいくつかの負に帯電したアミノ酸が含まれているにもかかわらず)ポリ
ペプチドは正味の正電荷を有する。ポリペプチドのペアを接続するペプチド核酸配列の部
分も、塩基対コアから伸びるポリヌクレオチドの一本鎖部分にハイブリダイズする。ペプ
チド核酸と正に帯電したポリペプチドの巻き締められた(tightened)コイルコ
ンホメーションとの間の強い結合は、高い電荷密度を有する電荷タグの正味の正電荷を可
能にする。同様のアーキテクチャをとる電荷タグの他の例は、正味の負電荷を有し得る。
をもたらす異なる三次元アーキテクチャをとる。ポリペプチドのコイル部分(coile
d portions)は、リンカー配列によって接続され得る。リンカー配列がかなり
短い場合、コイル構造はほぼ全体的に線形のアレイ(roughly overall
linear array)で互いに結合し得る。そのようなコンホメーションは、ポリ
ペプチド内の正に帯電したアミノ酸と負に帯電したアミノ酸の間の静電引力のために可能
である。しかしながら、全体として、ポリペプチド電荷タグは正味の正電荷または正味の
負電荷を有し得る。しかしながら、電荷タグのポリペプチドのコイル部分間のリンカーが
長くなると、低減された立体障害により、隣接するコイル部分間のより大きなベンド(b
ending)が可能になり、例えば図15の下部に示すようなより複雑なアーキテクチ
ャの採用が可能になる。これらの可能性は、さらに高い電荷密度をもたらし得る。図14
Aおよび図14Bに示される例と同様に、これらの例示的な電荷タグは、ヌクレオチドア
ナログ(示されていない)に付着させることができる。
リックス内のアミノ酸間および異なるヘリックスのアミノ酸間の静電引力は、ポリペプチ
ドが凝縮構造を形成するように誘導することができる。その結果、コイルドコイルは正味
の負電荷または正味の正電荷を有し得、当該正味の電荷は、(ポリペプチド配列が直線的
に引き伸ばされた場合の電荷密度と比較して)高い電荷密度で一緒に保持される。
くはライゲーションケミストリーのいずれか、または共有結合を形成するための他のケミ
ストリーを使用して、前述の電荷タグのいずれかをヌクレオチドアナログに付着させるこ
とができる。
ペプチド核酸の有無にかかわらず、直線的に引き伸ばされた線形電荷タグと比較して、よ
り高い電荷密度を有する異なる三次元アーキテクチャをとるように作製され得る。電荷タ
グは、正電荷に比べて過剰のホスホジエステルまたは負のアミノ酸を含む場合などに正味
の負電荷を有し得、または負に帯電した基よりも多くの正に帯電したアミノ酸を有する場
合などに正味の正電荷を有し得る。コイルドコイルは、アミノ酸成分間の十分に特徴付け
られた分子相互作用に基づいて、特定のコンパクト構造をとるように計算的に設計するこ
とができる。使用し得るコイルドコイルの例は、ロイシンジッパーを含み、当該ロイシン
ジッパーは、例えば、長さおよび直径が制御された二量体または三量体の形態であり得る
。更に、コイルドコイルのコンパクト構造を支配する相互作用が内部に局在化するため、
その表面は、広範囲の電荷を担持するように独立して設計され得る。
00e、または−40e〜+40e、または−20e〜+20e、またはそれらの中の任
意の範囲内の電荷を有し得る。いくつかの例では、電荷タグの正味電荷または部分正味電
荷は、−200e/nm3〜+200e/nm3、または−100e/nm3〜+100
e/nm3、または−40e/nm3〜+40e/nm3、または−20e/nm3〜+
20e/nm3、またはそれらの中の任意の範囲内の密度にパックされ得る。
以上のコンピュータ可読記憶装置またはメモリであって、当該コンピュータ可読命令はコ
ンピュータによって実行されると、当該コンピュータに本明細書に開示された方法の少な
くともいずれか1つを実行させる。いくつかの例では、システムは、本明細書に開示され
る方法のいずれか1つの少なくとも一部を実行するように構成される。いくつかの例では
、システムは、コンピュータ可読命令を格納するコンピュータ可読記憶装置またはメモリ
に結合され、当該コンピュータ可読命令は、実行されると、当該システムに本明細書に開
示される方法の少なくともいずれか1つを実行させる。
い、本出願で引用されたすべての文献および類似資料は、そのような文献および類似資料
の形式に関係なく、参照によりその全体が明示的に援用される。援用された文献および類
似の資料の1つ以上が、定義された用語、用語の使用法、記載された技術などを含むがこ
れらに限定されない点で、本出願と異なるかまたは矛盾する場合、本出願が支配する(c
ontorl)。
そのような概念が相互に矛盾しないという条件で)本明細書に開示される発明の主題の一
部として企図されることを理解されたい。特に、本開示の最後に現れる特許請求の範囲に
記載される主題(claimed subject matter)のすべての組み合わ
せは、本明細書に開示される本発明の主題の一部として企図される。また、参照により援
用される任意の開示にも現れ得る、本明細書で明示的に使用される用語は、本明細書で開
示される特定の概念と最も一致する意味を与えられるべきであることも理解されたい。
て説明される特定の要素(例えば、機能、構造、および/または特性)が本明細書で説明
される少なくとも1つの例に含まれ、かつ他の例に存在する場合も存在しない場合もある
ことを意味する。加えて、文脈がそうではないことを明確に指示しない限り、任意の例に
ついて説明した要素は、様々な例において任意の適切な方法で組み合わせれ得ることを理
解されたい。いくつかの例を詳細に説明してきたが、開示された例は修正され得ることを
理解されたい。したがって、前述の説明は非限定的であると見なされるべきである。いく
つかの例が本明細書中で詳細に図示および説明されてきたが、本開示の精神から逸脱する
ことなく、様々な修正、追加、置換などを行うことができ、したがって、これらは、添付
の特許請求の範囲で定義される本開示の範囲内にあるとみなされることが当業者には明ら
かであろう。
Claims (70)
- ポリメラーゼによる鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的な新生ポリヌクレオチド鎖への標
識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、
前記ポリメラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、
前記標識ヌクレオチドは下記式Iの化合物であって、
nは、3〜10の整数であって、
mは、1〜10の整数であって、
tは、0〜50の整数であって、
X1は、直接結合、C1−C10アルキル、C1−C10オキサアルキル、C1−C1
0チアアルキル、またはC1−C10アザアルキルであって、
X2は、1つ以上の個々のCH2残基がペプチド結合および(−O−CH2−CH2−
)aの1つ以上で任意に置換されたC1−C20アルキルであり、ここで、aは、1〜2
4の整数であって、
X3は直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャネルに近
接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域にハイブリ
ダイズし、
F1はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつF2は非存在であるかまたはフ
ルオロホアであって、
Aは、
Yは、以下から選択され:
qは、1〜100の整数であり、
Bは、以下から選択され:
Bがデンドロンである場合、qは1に等しく、
前記q個のBは、電荷および電荷密度を有し、
前記伝導性チャネルは、前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出する、方法。 - 前記電荷は、約−100e〜約+100eである、請求項1に記載の方法。
- 前記電荷密度は、約−100e/nm3〜約+100e/nm3である、請求項2に記
載の方法。 - 前記電荷は、約−200e〜約+200eである、請求項1に記載の方法。
- 前記電荷密度は、約−200e/nm3〜約+200e/nm3である、請求項2に記
載の方法。 - 前記q個のBは、ポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドは、分岐ポリヌクレオチドおよび1つ以上のヘアピンループから
選択される、請求項6に記載の方法。 - 前記ポリヌクレオチドは、2〜5つのヘアピンループを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記q個のBは、ポリペプチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリペプチドは、分岐ポリペプチド、コイルドポリペプチド、およびコイルドコイ
ルポリペプチドから選択される、請求項8に記載の方法。 - Bはアミノ酸を含み、かつ前記q個のBのうちの1つ以上はメチルリジン、ジメチルリ
ジン、またはトリメチルリジンを含む、請求項1に記載の方法。 - Aは、連結反応を含む反応によって形成され、前記連結反応は、アジド−アルキン銅ア
シストクリック反応、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲーション、アジド−
ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応、およびチオール−マレイミドコンジュ
ゲーションから選択される、請求項1〜12の何れかに記載の方法。 - 複数の標識ヌクレオチドを連続的に取り込むことを更に含み、前記複数の標識ヌクレオ
チドの各々の前記Yと、前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記Yとが互いに異なる
場合、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記電荷は、前記複数の標識ヌクレオチドの
その他の前記電荷と異なる、請求項1〜12の何れかに記載の方法。 - 前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチ
ド鎖に取り込まれた1つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Yを識別することを更に含む
、請求項14に記載の方法。 - X2は、(−O−CH2−CH2−)aであり、ここで、aは1〜24の整数である、
請求項1〜12の何れかに記載の方法。 - aは24である、請求項16に記載の方法。
- aは16である、請求項16に記載の方法。
- aは12である、請求項16に記載の方法。
- aは8である、請求項16に記載の方法。
- aは4である、請求項16に記載の方法。
- ポリメラーゼによる鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的な新生ポリヌクレオチド鎖への標
識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、
前記ポリメラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、
前記標識ヌクレオチドは下記式Iの化合物であって、
nは、3〜10の整数であって、
mは、1〜10の整数であって、
tは、0〜50の整数であって、
X1は、直接結合、C1−C10アルキル、C1−C10オキサアルキル、C1−C1
0チアアルキル、またはC1−C10アザアルキルであって、
X2は、1つ以上の個々のCH2残基がペプチド結合および(−O−CH2−CH2−
)aの1つ以上で任意に置換されたC1−C20アルキルであり、ここで、aは、1〜2
4の整数であって、
X3は、直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャネルに
近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域にハイブ
リダイズし、
F1はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつF2は非存在であるかまたはフ
ルオロホアであって、
Aは、
Yは、以下から選択され:
qは、1〜100の整数であり、
Bは、アミノ酸を含み、
前記伝導性チャネルは、前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出する、方法。 - 前記電荷は、約−100e〜約+100eである、請求項22に記載の方法。
- 前記電荷密度は、約−100e/nm3〜約+100e/nm3である、請求項23に
記載の方法。 - 前記電荷は、約−200e〜約+200eである、請求項22に記載の方法。
- 前記電荷密度は、約−200e/nm3〜約+200e/nm3である、請求項23に
記載の方法。 - 前記q個のBは、ポリペプチドを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記ポリペプチドは、分岐ポリペプチド、コイルドポリペプチド、およびコイルドコイ
ルポリペプチドから選択される、請求項27に記載の方法。 - 前記q個のBのうちの1つ以上はメチルリジン、ジメチルリジン、またはトリメチルリ
ジンを含む、請求項27に記載の方法。 - Aは、連結反応を含む反応によって形成され、前記連結反応は、アジド−アルキン銅ア
シストクリック反応、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲーション、アジド−
ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応、およびチオール−マレイミドコンジュ
ゲーションから選択される、請求項22〜29の何れかに記載の方法。 - 複数の標識ヌクレオチドを連続的に取り込むことを更に含み、前記複数の標識ヌクレオ
チドの各々の前記Yと、前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記Yとが互いに異なる
場合、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記電荷は、前記複数の標識ヌクレオチドの
その他の前記電荷と異なる、請求項22〜29の何れかに記載の方法。 - 前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチ
ド鎖に取り込まれた1つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Yを識別することを更に含む
、請求項31に記載の方法。 - X2は、(−O−CH2−CH2−)aであり、ここで、aは1〜24の整数である、
請求項22〜29の何れかに記載の方法。 - aは24である、請求項33に記載の方法。
- aは16である、請求項33に記載の方法。
- aは12である、請求項33に記載の方法。
- aは8である、請求項33に記載の方法。
- aは4である、請求項33に記載の方法。
- ポリメラーゼによる鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的な新生ポリヌクレオチド鎖への標
識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、
前記ポリメラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、
前記標識ヌクレオチドは下記式Iの化合物であって、
nは、3〜10の整数であって、
mは、1〜10の整数であって、
tは、0〜50の整数であって、
X1は、直接結合、C1−C10アルキル、C1−C10オキサアルキル、C1−C1
0チアアルキル、またはC1−C10アザアルキルであって、
X2は、1つ以上の個々のCH2残基がペプチド結合および(−O−CH2−CH2−
)aの1つ以上で任意に置換されたC1−C20アルキルであり、ここで、aは、1〜2
4の整数であって、
X3は、直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャネルに
近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域にハイブ
リダイズし、
F1はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつF2は非存在であるかまたはフ
ルオロホアであって、
Aは、
Yは、以下から選択され:
qは、1〜100の整数であり、
Bは、以下から選択され:
式中、各Rは、Yおよび水素から独立して選択され、
前記伝導性チャネルは、前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出する、方法。 - 前記電荷は、約−100e〜約+100eである、請求項39に記載の方法。
- 前記電荷密度は、約−100e/nm3〜約+100e/nm3である、請求項40に
記載の方法。 - 前記電荷は、約−200e〜約+200eである、請求項39に記載の方法。
- 前記電荷密度は、約−200e/nm3〜約+200e/nm3である、請求項40に
記載の方法。 - 前記q個のBは、ポリヌクレオチドを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドは、分岐ポリヌクレオチドおよび1つ以上のヘアピンループから
選択される、請求項44に記載の方法。 - 前記ポリヌクレオチドは、2〜5つのヘアピンループを含む、請求項44に記載の方法
。 - Aは、連結反応を含む反応によって形成され、前記連結反応は、アジド−アルキン銅ア
シストクリック反応、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲーション、アジド−
ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応、およびチオール−マレイミドコンジュ
ゲーションから選択される、請求項39〜46の何れかに記載の方法。 - 複数の標識ヌクレオチドを連続的に取り込むことを更に含み、前記複数の標識ヌクレオ
チドの各々の前記Yと、前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記Yとが互いに異なる
場合、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記電荷は、前記複数の標識ヌクレオチドの
その他の前記電荷と異なる、請求項39〜46の何れかに記載の方法。 - 前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチ
ド鎖に取り込まれた1つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Yを識別することを更に含む
、請求項48に記載の方法。 - X2は、(−O−CH2−CH2−)aであり、ここで、aは1〜24の整数である、
請求項39〜46の何れかに記載の方法。 - aは24である、請求項50に記載の方法。
- aは16である、請求項50に記載の方法。
- aは12である、請求項50に記載の方法。
- aは8である、請求項50に記載の方法。
- aは4である、請求項50に記載の方法。
- ポリメラーゼによる鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的な新生ポリヌクレオチド鎖への標
識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、
前記ポリメラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、
前記標識ヌクレオチドは下記式Iの化合物であって、
nは、3〜10の整数であって、
mは、1〜10の整数であって、
tは、0〜50の整数であって、
X1は、直接結合、C1−C10アルキル、C1−C10オキサアルキル、C1−C1
0チアアルキル、またはC1−C10アザアルキルであって、
X2は、1つ以上の個々のCH2残基がペプチド結合および(−O−CH2−CH2−
)aの1つ以上で任意に置換されたC1−C20アルキルであり、ここで、aは、1〜2
4の整数であって、
X3は、直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャネルに
近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域にハイブ
リダイズし、
F1はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつF2は非存在であるかまたはフ
ルオロホアであって、
Aは、
Yは、以下から選択され:
qは1であり、
Bは、デンドロンを含み、
Bは、電荷および電荷密度を有し、
前記電荷センサーは、前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出する、方法。 - 前記電荷は、約−100e〜約+100eである、請求項56に記載の方法。
- 前記電荷密度は、約−100e/nm3〜約+100e/nm3である、請求項57に
記載の方法。 - 前記電荷は、約−200e〜約+200eである、請求項56に記載の方法。
- 前記電荷密度は、約−200e/nm3〜約+200e/nm3である、請求項57に
記載の方法。 - Aは、連結反応を含む反応によって形成され、前記連結反応は、アジド−アルキン銅ア
シストクリック反応、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲーション、アジド−
ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応、およびチオール−マレイミドコンジュ
ゲーションから選択される、請求項56〜61の何れかに記載の方法。 - 複数の標識ヌクレオチドを連続的に取り込むことを更に含み、前記複数の標識ヌクレオ
チドの各々の前記Yと、前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記Yとが互いに異なる
場合、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記電荷は、前記複数の標識ヌクレオチドの
その他の前記電荷と異なる、請求項56〜61の何れかに記載の方法。 - 前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチ
ド鎖に取り込まれた1つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Yを識別することを更に含む
、請求項63に記載の方法。 - X2は、(−O−CH2−CH2−)aであり、ここで、aは1〜24の整数である、
請求項56〜61の何れかに記載の方法。 - aは24である、請求項65に記載の方法。
- aは16である、請求項65に記載の方法。
- aは12である、請求項65に記載の方法。
- aは8である、請求項65に記載の方法。
- aは4である、請求項65に記載の方法。
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