KR20020082022A - 멀티채널 ｐｃｒ과 전기영동을 이용한 소형 유전자 분석장치 - Google Patents

멀티채널 ｐｃｒ과 전기영동을 이용한 소형 유전자 분석장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플 주입부, 복수의 마이크로채널을 갖는 멀티채널 PCR 수행부, 복수의 마이크로채널을 갖는 멀티채널 전기영동 수행부, 및 분리된 밴드를 확인하기 위한 밴드 분석장치를 하나의 칩 상에 유동적으로 연결하여 포함하는 소형 유전자 분석 장치에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 하나의 칩 상에서 멀티채널(multichannel) PCR과 전기영동을 이용하여 질병과 관련된 여러 유전자들의 발현을 정량적으로 동시에 검사할 수 있다.

Description

멀티채널 ＰＣＲ과 전기영동을 이용한 소형 유전자 분석 장치{Miniature gene analytical device using multichannel PCR and electrophoresis}
본 발명은 하나의 칩 상에서 유전자 증폭 및 전기영동을 연속적으로 수행할 수 있는 소형 유전자 분석 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 샘플 주입부, 복수의 마이크로채널을 갖는 멀티채널 PCR 수행부, 복수의 마이크로채널을 갖는 멀티채널 전기영동 수행부, 및 분리된 밴드를 확인하기 위한 밴드 분석장치를 유동적으로 연결하여(in fluid communication) 포함하는 소형 유전자 분석 장치에 관한 것이다.
사람의 유전정보를 가지고 있는 DNA는 mRNA로 전사된 후 단백질로 번역되어 생체에서 작용한다. 모든 유전자가 항상 mRNA로 전사되는 것은 아니며 항상 동일한 량으로 발현되지도 않는다. 또 어떤 질병에 노출되었을 때 특정유전자의 발현이 급속히 증가하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 유전자의 mRNA 발현량을 검사함으로 질병의 상태를 파악할 수 있다.
이러한 유전정보를 확인하기 위하여, 종래의 유전자 발현검사방법은 샘플에서 mRNA를 분리하여 역전사시킨 후 검사하고자 하는 유전자 각각의 프라이머(primer)들이 포함된 반응용액 및 효소들을 따로 분주한 후 PCR 기계를 이용하여 각각 증폭하고 증폭한 시료를 전기영동 kit에 걸어서 전압을 걸어주면 증폭된 시료가 gel상에서 이동하여 band를 이루면 이것을 detection하였다. 그러나, 이러한 방법은 핵산을 추출하고 PCR증폭하고 전기영동하는 복수의 공정들이 별개로 수행되어, 각 공정들의 에러율이 전체공정에 영향을 줄뿐만 아니라, 또한 화학, 분자생물학, 의약 등과 같은 다수의 서로 다른 분야들에 익숙해져야 한다는 문제점을 가지고 있었다.
따라서, 유전자 진단에 있어 다양한 프로세스들을 단일 공정내로 집적함으로써 비용을 최소화하고 작동을 용이하게 하기 위한 시도들이 있어왔다. 미국특허 6043080은 복수의 서로 다른 반응 챔버들을 채널을 이용하여 단일의 소형 몸체에 포함시킨 유전자 분석 장치를 개시하고 있으나, 단일채널과 단일 PCR 챔버만을 채택함으로써 여러 가지 유전자를 동시에 증폭 및 확인할 수 없다는 단점이 있다. 또한, 미국특허 5876978는 표적유전자, 하우스키핑 유전자 및 경쟁적 주형을 동시에 증폭하는 멀티플렉스 PCR 공정을 개시하고 있으나, 각 구획이 유리병(glass vial)으로 구성되고 연결만이 모세관(capillary)으로 이루어져서 시료의 량이 40 ul 이상이나 되며 시료의 손실이 발생되는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 칩(Chip)위에 멀티채널(multichannel)을 만들어 채널마다 서로 다른 프라이머(primer)를 고정시키고 각각 온도를 조절하면 멀티채널 상에서 한번에 다양한 유전자의 증폭이 가능하다는 점에 착안하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명에 의하면, 각 채널에서 증폭된 유전자가 자동으로 전기영동에 연결되므로 시료의 손실과 오염을 방지할 수 있으며 전기영동에서 얻어진 밴드(band)를 정량적으로 분석함으로써 질병에 관계한 여러 유전자의 발현을 시료주입 후 증폭과 전기영동과 분석까지 연속적으로 칩 상에서 수행이 가능하다. 즉, 종래에는 한 사람의 샘플에서 여러 유전자의 발현을 검사하려 할 때 각각의 프라이머에 대해 대량의 시료가 필요하며 각각 다른 사이클(cycle)를 통해 증폭을 해야하였지만, 본 발명의 장치는 마이크로채널 상에서 반응이 일어남으로 소량의 시료로도 검사가 가능하며 멀티채널로 구성되어 각 채널에 다른 프라이머를 고정시키고 독립적으로 온도를 조절하므로 여러 유전자를 동시에 증폭시킬 수도 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 종래기술의 문제점을 극복하기 위한 것으로, 멀티채널 상에서 한번에 다양한 유전자의 증폭이 가능하며 이것이 바로 전기영동으로 연결되어 실시간으로 여러가지 유전자를 동시에 확인할 수 있는 소형 유전자 분석 장치를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 소형 유전자 분석장치를 이용하여 복수의 유전자를 동시에 증폭하고 분석함으로써 유전자 질병을 효과적으로 진단할 수 있는 방법을 제공하는데 있다
도 1은 칩(chip) 위에 복수의 마이크로채널(microchannel)을 만들고, 각 마이크로채널내에 서로 다른 프라이머를 고정시키고 각각 온도를 조절하면, 멀티채널 상에서 한번에 다양한 유전자의 증폭이 가능하며, 이것이 바로 전기영동으로 연결되는 구조를 개략적으로 나타낸 상면도(top view)이다.
도 2는 본 발명의 기본 개념(역전사, 사용된 프라이머에 따른 다양한 유전자의 증폭, 전기영동에 의한 유전자의 분리 및 분리된 유전자의 검출)을 일련으로 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예로서 RT-PCR이 이루어지는 경우에서, 하나의 마이크로채널만을 확대하여 보다 구체적으로 나타낸 상면도이다.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
1. 샘플 주입부 2. 멀티채널 PCR 수행부
3. 멀티채널 전기영동 수행부 4. 전처리 수행부
5. 마이크로채널 6. 프라이머
7. 열순환기(히터/센서) 8. 전극
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 ① 샘플 주입부; ② 샘플 주입부에 연속적으로 연결된 복수의 마이크로채널을 갖는 멀티채널 PCR 수행부; ③ PCR 수행부에 연속적으로 연결된 복수의 마이크로채널을 갖는 멀티채널 전기영동 수행부를 유동적으로 연결하여(in fluid communication) 포함하며, 상기 멀티채널 PCR 수행부의 각 마이크로채널은 서로 다른 프라이머(primer)를 내포하고 독립적으로 온도 조절이 가능한 것을 특징으로 하는 소형 유전자 분석 장치를 제공한다.
본 발명은, 멀티채널 PCR 수행부에 서로 다른 프라이머를 내포하고 독립적으로 온도조절이 가능함으로써 복수의 유전자가 동시에 증폭되고, 증폭된 복수의 유전자가 멀티채널 전기영동 수행부로 이동되어 동시에 전기영동되는 것을 특징으로 한다. 이로써, 실시간으로 여러가지 유전자를 동시에 분리하고 확인할 수 있다.
본 발명의 분석 장치에 있어서, 샘플 주입부는 외부요소에 의한 샘플의 오염을 방지하면서 샘플을 분석 장치내로 주입하는 입구로서, 주입은 일반적으로 밀봉 밸브내로 샘플을 직접 주사함으로써 수행된다. 본 발명의 유전자 분석장치에 사용될 수 있는 샘플은 DNA 또는 RNA와 같은 핵산뿐만 아니라 핵산을 추출할 수 있는 혈액, 타액, 세포, 조직 등도 될 수 있다. 또한, 이러한 샘플 주입부는 감염성 물질의 중화, 샘플의 안정화, pH 조절 등을 위한 시약을 포함할 수도 있다.
본 발명의 분석 장치에 있어서, 샘플 주입부와 멀티채널 PCR 수행부 사이에는 PCR 수행을 위한 전처리 수행부가 추가로 포함될 수도 있다. 본 발명의 분석 장치에 포함될 수 있는 전처리 수행부로는 세포로부터의 핵산 추출, DNA 결합 단백질의 변성, 정제, 여과, 탈염 등을 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 분석장치의 전처리 수행부는 RT-PCR을 수행하기 위한 역전사(reverse transcription) 수행부인 것을 특징으로 한다. 이러한 RT-PCR은 mRNA로부터 유전자의 발현량을 직접 검사하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 역전사 수행부는 mRNA를 cDNA로 역전사시킬수 있는 역전사효소 및 4종류의 dNTPs(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)를 포함할 수 있다.
본 발명의 분석 장치에 있어서, 멀티채널 PCR 수행부는 복수의 마이크로채널로 이루어지며 각 마이크로채널은 서로 다른 프라이머를 내포하고 독립적으로 온도조절이 가능하여 복수의 유전자가 동시에 증폭될 수 있다. 본 발명의 멀티채널 PCR수행부에서 실시되는 PCR은 conventional PCR, RT-PCR, overlapping 프라이머들을 사용하여 비특이적 증폭을 배제하는 nested PCR, 아미노산 서열정보를 바탕으로 그 단백질을 코드하는 유전자의 DNA 단편을 얻을 수 있는 DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, 또는 주형(template)과 프라이머의 비특이적 결합에 의한 원하지 않는 증폭을 막기 위해 중합효소 첨가 전 PCR mixture를 고온으로 일단 가열하고 중합효소 첨가하여 PCR하는 hot-start PCR일 수 있다.
본 발명의 분석 장치에서, 멀티채널 전기영동 수행부는 복수의 마이크로채널로 이루어지며, 각 마이크로채널은 멀티채널 PCR 수행부의 각 마이크로채널과 직접 연결되어(multichannel mode), 증폭된 복수의 유전자가 겔상으로 이동하여 바로 전기영동이 될 수 있다. 본 발명의 전기영동 수행부에서 실시되는 전기영동은 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)인 것이 바람직하다. 모세관 전기영동은 25um - 75um 정도의 매우 작은 모세관이나 마이크로채널을 사용하며, 양 말단에 전압을 가함으로써 전기삼투적 흐름(electroosmotic flow)을 유발한다. 모세관 전기영동은 Joul 열 발생으로 인한 영향을 막을 수 있으며 최소한의 열을 발생시키면서 높은 전기장을 걸어줄 수 있어 신속한 분리를 가능하게 한다.
본 발명의 분석 장치에서, 각 반응부는 마이크로채널을 통해 유동적으로 연결되고(in fluid communication), 마이크로채널에 걸쳐 전압을 인가하기 위해 양 말단에 전극을 포함하고 있다. 멀티채널 양단에 전압을 걸면 용액의 흐름을 만드는 모세관 전기삼투현상(electroosmotic flow)에 의하여 별도의 펌프나 밸브 없이도 용액의 흐름을 제어할 수 있다.
본 발명의 분석 장치는 전기영동 수행부에서 분리된 밴드를 확인하기 위한 밴드 분석장치를 더 포함할 수 있다. 이러한 밴드 분석장치는 장치의 데이터를 스캐닝하여 수득하기 위한 판독 장치와 수득된 데이터를 해석하고 장치를 제어하기 위한 컴퓨터 기초된 인터페이스를 포함할 수 있다. 이 밴드 분석장치는 본 발명의 칩에 함께 장착되거나 또는 본 발명의 칩과 별도로 존재할 수도 있다.
또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ① 칩(chip)에 샘플 주입구 및 멀티채널을 만드는 단계; ② 멀티채널 내에 열 순환기(thermal cycler)를 장착하여 PCR 수행부를 만드는 단계; 및 ③ 멀티채널 내에 매트릭스를 채워 넣고 양 말단에 전극을 연결하여 전기영동 수행부를 만드는 단계를 포함하는 본 발명의 소형 유전자 분석장치의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 소형 유전자 분석 장치의 제조방법을 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
1. 칩상에 멀티채널의 제조
본 발명 장치의 몸체는 일반적으로 미세조립 기술(microfabrication techniques)에 적합한 방법 및 재료를 사용하여 조립될 수 있다. 예컨대, 본 발명 장치의 몸체는 다양한 폴리머 재료로 사출성형된 부분 또는 실리콘, 유리 등의 결정성 기질으로 된 다수의 평면 막을 포함할 수 있다. 실리카, 유리 또는 실리콘과 같은 결정성 기질의 경우에, 장치내의 웰과 다양한 채널을 생성하기 위해 에칭, 밀링, 드릴링 등을 사용할 수 있다. 반도체 산업분야에 사용되는 미세조립 기술이 이들 재료나 방법에 적용될 수 있다. 이들 기술은 예컨대,전기침착(electrodeposition), 저압증착(low-pressure vapor deposition), 광석판인쇄술(photolithography), 에칭, 레이저 드릴링 등을 포함한다.
광석판인쇄술을 이용한 기판의 에칭(식각)이 본 발명의 미세조립에 특히 적합하다. 예컨대, 제1 기판을 포토레지스트로 중첩시키고, 석판인쇄술 마스크를 통해 전자기 광선을 조사하여 포토레지스트를 장치의 챔버 및/또는 채널과 같은 패턴으로 노출시키고, 노출된 기판을 에칭하여 원하는 웰과 채널을 생성한 다음, 다른 평면 막을 제1 기판 위에 덮어 결합시킨다. 일반적으로 바람직한 포토레지스트는 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 및 그 유도체와, 폴리(올레핀 술폰)과 같은 전자빔 레지스트 등을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 몸체는 사출성형된 플라스틱 등의 부분과 에칭된 실리카 또는 실리콘 평면 막의 부분이 조합되어 이루어질 수도 있다. 예컨대, 본 발명의 샘플 주입구(1) 및 전처리 수행부(4)와 같은 구멍 또는 챔버는 사출성형기술에 의해 형성되는 반면, 멀티채널 PCR 수행부(2) 및 멀티채널 전기영동 수행부(3)를 이루는 각각의 마이크로채널(5)은 평면 유리, 실리카 또는 실리콘 칩 또는 기판상에서 에칭에 의해 미세조립될 수 있다.
2. 멀티채널 PCR 수행부의 제조
PCR(Polymerase chain reaction)이란 특정 DNA 영역을 사이에 둔 2종류의 프라이머와 DNA 합성효소에 의한 DNA 합성반응을 시험관내에서 반복하여, 특정 DNA 영역을 수십만배로 증폭하는 방법을 말한다. 일반적으로 PCR 공정의 한 사이클은 이중가닥 DNA를 단일가닥으로 분리하는 단계, 분리된 단일가닥 DNA에 표적 영역을사이에 둔 2종류의 프라이머를 어닐링시키는 단계, 프라이머를 연장하여 표적영역에 상보적인 서열을 합성하는 단계로 이루어지며, RT-PCR은 도 2에서 보는 바와 같이 상기 일반적인 PCR 공정 전에 mRNA를 cDNA로 역전사(reverse transcription)시키는 단계를 더 포함하고 있다.
PCR 방법에서, 이중가닥 분리는 고온(heating)(90℃ 이상)에서 이루어지고, 프라이머 결합(50~60℃) 및 DNA 합성(70~75℃)은 상대적으로 저온(cooling)에서 이루어지므로, PCR공정을 연속적으로 수행하기 위해서는 열 순환기(thermal cycler)가 필요하다.
본 발명에서는 멀티채널 PCR 수행부(2)을 만들기 위해 서로 다른 프라이머(6)를 포함하며 각각 온도조절이 가능한 복수개의 마이크로채널(5)을 제조한다. 여기서 각각의 마이크로채널은 독립적인 PCR 수행부를 구성하므로, 마이크로채널마다 열 순환기를 만들기 위해 채널의 내부에 온도를 올릴 수 있는 히터(7)와 그 온도를 제어할 수 있는 온도센서(7')를 내장시킨다.
히터(7)로는 당업계에 제조방법이 알려진 박막 저항성 히터(thin film resistive heater) 등을 사용할 수 있다. 이 히터는 PCR 수행부의 아래 또는 내부에 전원과 연결된 금속 필름을 도포함으로써 제조될 수 있다. 또한, 온도센서(7')로는 온도의존성 전동기력(EMF)을 생성하는 바이메탈 접합을 갖는 서모커플, 온도 비례의 전기 저항을 갖는 재료를 포함하는 저항성 서모미터, 서미스터(thermistors), IC 온도센서, 콰르츠(quartz) 서모미터 등을 사용할 수 있다. 이 온도센서는 미리 정해진 시간/온도 프로파일로 온도의 상승 및 저하를 지시하도록 프로그램화된 컴퓨터와 연결될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 열순환기(7)로는 상기 히터와 함께 펠티어 소자(Peltier Device)를 사용하는 것이 좋다. 여기서, 펠티어 소자는 기본 온도를 보정한 후 히터로 원하는 온도를 맞추는 기능을 한다. 이러한 펠티어 소자는 이종의 금속으로 루프를 형성하고 루프 중간에 전류를 흘리면 한쪽 접합부에서는 열이 발생하고 다른 한쪽에서는 열을 흡수하는 펠티어 현상(Peltier effect)을 이용한 것이다.
또한, PCR 수행부(2)는 합성 프라이머, 온도 의존성 DNA 합성효소, 및 충분한 양의 4종류의 dNTPs(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)와 같은 증폭 시약을 내포할 수 있다. 여기서, 합성 프라이머는 표적 유전자의 양 말단에 결합할 수 있는 서열을 가지도록 합성되며, 분석을 원하는 유전자에 따라 마이크로채널마다 서로 다른 프라이머를 제조하여 사용하는 것이 바람직하다. 온도 의존성 DNA 합성효소로는 taq 폴리머라제 등을 사용할 수 있다. PCR 수행부내에 고정시키기 위해 이들 프라이머와 DNA 합성효소는 버퍼와 함께 액상으로 채널내에 보관될 수 있으며, 바람직하게는 채널 내벽이나 적당한 고상 지지체에 커플링될 수도 있다.
바람직하게는 후속 분석단계에서 유전자의 검출을 용이하게 하기 위해 PCR 증폭 단계에서 핵산을 라벨링(labeling)할 수도 있으며, 이를 위해 표지된 프라이머나 표지된 dNTPs를 사용할 수도 있다.
3. 멀티채널 전기영동 수행부의 제조
전기영동이란 전기장내에서 서로 다른 시료 성분의 시차 이동(differentialmigration)에 의해 분리되는 것을 말한다. 본 발명에서는 멀티채널 전기영동 수행부(3)를 만들기 위해, PCR 수행부와 멀티채널모드로 연결되는 복수의 마이크로채널(5) 내에 겔(gel)을 채워넣고 멀티채널의 끝 부분에 전극(8)을 걸어준다. 이렇게 함으로써 PCR 후에 나온 샘플이 곧바로 분리될 수 있다.
바람직하게는, 전기영동 수행부는 모세관 전기영동장치(capillary electrophorosis)를 사용하는 것이 좋다. 모세관 전기영동은 특정 분리 배지(separation medium)로 채워지거나 채워지지 않은 내경 25um - 75um 정도의 모세관 또는 마이크로 채널을 사용한다. 모세관 전기영동을 이용한 핵산의 분리방법은 예컨대, Woolley and Mathies, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA(1994) 91:11348-11352 등에 기술되어 있으며, 이들의 내용은 본 명세서에 참고로 포함한다. 모세관 전기영동은 PCR 증폭 산물의 분석을 위한 신속한 방법을 제공한다. 이들 모세관의 높은 표면적 대 부피의 비율은 모세관에 걸쳐 실질적인 열 변화(thermal variation) 없이 높은 전기장의 인가를 허용하여, 결과적으로 더욱 신속한 분리를 허용한다. 더욱이, 공초점(confocal) 이미징 방법과 조합될 때, 이들 방법은 방사성 시퀀싱 방법의 감도에 견줄 수 있는 아토몰(attomoles)의 범위의 감도를 제공한다.
많은 모세관 전기영동법에서, 모세관은 당업계에 알려진 적당한 분리 매트릭스(separation matrix)로 채워지며, 그러한 매트릭스의 예로는 하이드록시에틸 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 등을 들 수 있다. 일반적으로 특정 겔(gel) 매트릭스, 러닝 버퍼 및 러닝 조건이 특정 용도의 분리 특성을 최대화하기 위해 선택된다. 예컨대, 러닝 버퍼는 샘플의 핵산을 변성시키기 위한 변성제(denaturants), 우레아와 같은 카오트로픽제(chaotropic agents) 등을 포함할 수 있다.
모세관 전기영동장치의 제조방법은 예컨대, Jacobsen, et al., Anal. Chem. (1994) 66:1114-1118, Effenhauser, et al., Anal. Chem. (1994) 66:2949-2953 등에 상세히 기술되어 있으며, 이들은 본 명세서에 참고자료로서 포함된다. 이들 방법은 실리카, 실리콘, 또는 기타 결정성 기판 또는 칩상에 미크론 규모의 채널을 광석판인쇄술(photolithographic) 에칭하는 것을 포함하며, 본 발명의 장치에도 쉽게 이용될 수 있다.
4. 밴드 분석장치의 제조
본 발명의 분석 장치는 전기영동 수행부에서 분리된 밴드를 스캐닝하여 데이터를 수득하기 위한 판독 장치와 수득된 데이터를 해석하고 장치를 제어하기 위한 컴퓨터 기초된 인터페이스를 포함할 수 있다.
여기서, 판독 장치는 본 발명의 전기영동 수행부에서 나온 크기별 밴드의 분리 정보를 검출한다. 판독장치로는 당업계에 알려진 일반적인 판독 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 형광 표지된 표적 유전자를 여기시키는 레이저를 사용하여 스캐닝한 후 어레이의 광범위한 스캐닝을 위한 전하 커플 장치(charged coupled device, "CCD")를 이용하여 이미징할 수 있으며, 자동화 공정의 용이성 및 신속성과 고 해상 검출도를 조합시킨 레이저 공초점(confocal) 현미경을 이용하여 어레이로부터 데이터를 수집할 수도 있다.
판독 장치에서 수집된 데이터는 데이터 분석을 위한 디지털 컴퓨터로 전송된다. 전형적으로, 그 컴퓨터는 판독장치로부터의 전송된 데이터를 저장, 분석 및 보고할 수 있도록 프로그램화되며, 예컨대 형광 데이터를 해석하여 유전자의 발현량을 정량적으로 분석하거나, 유전자서열을 결정할 수도 있다. 이러한 데이터의 해석은 유전자 질병의 진단뿐만 아니라 바이러스나 박테리아의 감염여부도 밝혀낼 수 있다.
또한, 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 ① 핵산(nucleic acid)이 포함된 샘플이 각 마이크로채널을 따라 특정의 primer가 고정된 멀티채널 PCR 수행부로 유입되는 단계; ② 유입된 핵산이 멀티채널 PCR 수행부에서 유전자 증폭되는 단계; ③ 증폭된 유전자가 각 마이크로채널을 따라 멀티채널 전기영동 수행부로 이동되는 단계; ④ 이동된 증폭된 유전자가 멀티채널 전기영동 수행부에서 분리되는 단계; ⑤ 분리된 유전자를 분석하는 단계를 포함하며, 하나의 칩 상에서 핵산의 증폭, 전기영동 및 분석이 연속적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 유전자 분석 방법을 제공한다.
도면 3에서 보는 바와 같이, 샘플 주입부(첫번째 주입구)에 mRNA를 주입하면 채널을 따라 이동하고 전처리 수행부(두 번째 주입구)에서 역전사효소가 주입되면 역전사가 이루어진다. 역전사된 상보적 DNA는 채널을 따라 이동한 후 멀티채널(multichannel) PCR 수행부내에 있는 프라이머와 반응하고 각 채널마다 온도가 독립적으로 조절되므로 각각 다른 유전자가 증폭된다. 증폭된 유전자는 다시 채널을 따라 이동하여 멀티채널 전기영동 수행부내의 겔 상에서 전기영동이 된다.전기영동되어 분리된 유전자의 밴드(band)를 밴드 분석장치에서 확인함으로써 유전자 발현량을 검사할 수 있다.
본 발명의 분석 방법에 있어서, 분리된 유전자를 분석하는 단계는 유전자의 종류를 크기별로 확인할 뿐만 아니라 동시에 특정 유전자의 발현을 정량적으로 분석하는 것도 가능하다. 즉, mRNA을 RT-PCR로 증폭시킨 것을 겔 상에서 전기영동 한 후 밴드를 정량적으로 분석하면 각각 유전자의 발현 양상을 볼 수 있다.
본 발명에 따른 소형 유전자 분석장치는 질병과 관련된 여러 유전자의 발현을 한꺼번에 검사함으로써 여러 유전자 질병을 동시에 진단하는 데 유용하게 이용될 수 있다. 예컨대, 혈액 샘플(Blood sample)에서 mRNA를 추출하여 칩에 주입하면 역전사되어 cDNA를 만들고 이것이 여러 유전자에 대한 프라이머가 고정되어있는 열 순환기를 통과하여 각각 증폭된다. 이 증폭된 유전자는 채널 상에서 바로 전기영동으로 연결되어 밴드를 확인함으로 질병에 관련된 유전자를 동시에, 정량적으로 확인할 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 종래에는 한 사람의 샘플에서 여러 유전자의 발현을 검사하려 할 때 각각의 프라이머에 대해 대량의 시료가 필요하며 각각 다른 사이클을 통해 증폭을 해야 했지만, 본 발명의 분석 장치는 마이크로채널(microchannel)상에서 반응이 일어남으로 소량의 시료로도 가능하며 멀티채널(multichannel)로 구성되어 각 채널마다 다른 프라이머를 고정시키고 독립적으로 온도를 조절하므로 여러 유전자를 동시에 증폭시킬 수 있다.
또한, 각 채널에서 증폭된 유전자가 자동으로 전기영동에 연결되므로 시료의 손실과 오염을 방지할 수 있으며 전기영동에서 얻어진 밴드를 정량적으로 분석함으로써 질병에 관계한 여러 유전자의 발현을 검사할 수 있을 뿐만 아니라, 시료주입 후 증폭과 전기영동과 분석까지 연속적으로 하나의 칩상에서 수행이 가능하다.
결국, 본 발명에 따르면, 하나의 샘플을 추출하여 여러 가지 프라이머를 고정시킨 독립된 열 순환기를 이용, 동시에 여러 유전자의 발현을 검사할 수 있으며, mRNA에서 cDNA로의 역전사 및 유전자 증폭과 전기영동 및 검출이 칩 상에서 연속적으로 일어날 수 있으며, 이동(Transfer)시에 일어나는 시료의 손실 및 오염을 방지할 수 있으며, 검출 기능을 활용하여 전기영동 각 밴드의 정량적인 분석이 가능하며, 칩 상에서 멀티채널(multichannel) RT-PCR과 전기영동을 이용하여 질병과 관련된 여러 유전자들의 발현을 정량적으로 동시에 검사할 수 있는 효과가 있다.

Claims (12)

  1. ① 샘플 주입부;
    ② 복수의 마이크로채널을 갖는 멀티채널 PCR 수행부;
    ③ 복수의 마이크로채널을 갖는 멀티채널 전기영동 수행부를 하나의 몸체에 유동적으로 연결하여(in fluid communication) 포함하며,
    상기 멀티채널 PCR 수행부는 각 마이크로채널 마다 서로 다른 프라이머를 내포하고 독립적으로 온도 조절이 가능한 것을 특징으로 하는 소형 유전자 분석 장치.
  2. 제 1항에 있어서, 샘플 주입부와 멀티채널 PCR 수행부 사이에 PCR 수행을 위한 전처리 수행부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 소형 유전자 분석 장치.
  3. 제 2항에 있어서, 전처리 수행부는 RT-PCR을 수행하기 위한 역전사(reverse transcription) 수행부인 것을 특징으로 소형 유전자 분석 장치.
  4. 제 1항에 있어서, 멀티채널 전기영동 수행부에서 실시되는 전기영동은 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)인 것을 특징으로 소형 유전자 분석 장치.
  5. 제 1항 내지 제 4항에 있어서, 전기영동 수행부에서 분리된 밴드를 확인하기 위한 밴드 분석장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 소형 유전자 분석 장치.
  6. ① 칩에 샘플 주입구 및 멀티채널을 만드는 단계;
    ② 멀티채널 내에 열 순환기(thermal cycler)를 장착하여 PCR 수행부를 만드는 단계; 및
    ③ 멀티채널 내에 매트릭스를 채워 넣고 양 말단에 전극을 연결하여 전기영동 수행부를 만드는 단계를 포함하는 제 1항 내지 제 4항의 소형 유전자 분석장치의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 광석판인쇄술(photolithography)을 이용하여 실리콘 웨이퍼에 식각(eching)으로 멀티채널을 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, PCR 수행부에 장착된 열순환기는 히터와 펠티어 소자를 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제 6항에 있어서, 전기영동 수행부내의 매트릭스는 겔(gel)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. ① 핵산(nucleic acid)이 포함된 샘플을 특정의 프라이머가 고정된 멀티채널 PCR 수행부로 유입시키는 단계;
    ② 유입된 핵산을 멀티채널 PCR 수행부에서 유전자 증폭시키는 단계;
    ③ 증폭된 유전자를 멀티채널 전기영동 수행부로 이동시키는 단계;
    ④ 이동된 유전자를 멀티채널 전기영동 수행부에서 분리시키는 단계;
    ⑤ 분리된 유전자를 분석하는 단계를 포함하며,
    하나의 칩 상에서 핵산의 증폭, 전기영동 및 분석이 연속적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 유전자 분석 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 멀티채널 PCR 수행부에서 복수의 유전자가 동시에 증폭되고, 증폭된 복수의 유전자가 마이크로 채널을 따라 멀티채널 전기영동 수행부로 이동되어 동시에 전기영동 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 유전자 질병을 진단하는 데 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
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