KR102426788B1 - Pcr 전처리 방법 및 이를 위한 멀티플렉스 pcr 칩 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PCR 전처리 방법 및 이를 위한 멀티플렉스 PCR 칩에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 다수 개의 챔버가 마이크로 채널을 통해 서로 연결되어 상기 다수의 챔버가 직렬로 연결된 PCR 칩을 준비하는 단계와; 상기 다수 개의 챔버의 내부에 시약을 주입하는 단계와; 상기 다수 개의 챔버에 주입된 시약을 건조하여 각각의 챔버의 바닥에 시약을 고정하는 단계와; 상기 건조된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 도포하여 코팅하는 단계와; 상기 코팅된 시약이 있는 다수 개의 챔버 중 일측에 있는 챔버에 시료를 주입하여 상기 일측의 챔버와 상기 마이크로 채널을 통해 모든 챔버로 시료가 주입되는 단계와; 상기 시료가 주입된 PCR 칩을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하여 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 상기 시약의 표면에 있는 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합되도록 하는 단계를 포함하여, 전처리한 PCR 칩을 운반할 때 수분이나 이물질 등에 의해 시약이 오염되는 것을 방지하고, 한 번의 시료 주입으로 모든 챔버에 시료를 주입할 수 있어 사용이 편리한 PCR 전처리 방법 및 이를 위한 멀티플렉스 PCR 칩을 제공하는 것이다.

Description

PCR 전처리 방법 및 이를 위한 멀티플렉스 PCR 칩{PCR PRETREATMET METHOD AND MULTIPLEX PCR CHIP THEREOF}

본 발명은 PCR 전처리 방법 및 이를 위한 멀티플렉스 PCR 칩에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 PCR 칩의 챔버에 주입된 시약을 건조해서 챔버의 바닥에 고착시키고 방수성 코팅제로 건조된 시약을 코팅하여 시료를 채취하는 현장으로 운반하는 동안에 수분이나 이물질에 의해 시약이 오염되는 것을 방지하고, 한 번의 시료 주입으로 모든 챔버에 시료를 주입할 때, 서로 다른 챔버 사이에서 시약이 혼합되지 않도록 함으로써 사용이 편리하고 멀티플렉스가 가능한 PCR 전처리 방법 및 이를 위한 멀티플렉스 PCR 칩을 제공하는 것이다.

중합효소 연쇄 반응, 즉 PCR(Polymerase Chain Reaction)은 핵산을 포함하는 샘플 용액을 반복적으로 가열 및 냉각하여 핵산의 특정 염기 서열을 갖는 부위(타깃 핵산)를 연쇄적으로 복제하여 그 특정 염기 서열 부위를 갖는 핵산을 기하급수적으로 증폭하는 기술로서, 생명과학, 유전공학 및 의료 분야 등에서 분석 및 질병의 진단 목적으로 사용되고 있다.

일반적으로, PCR은 다음의 3단계를 반복적으로 수행하는데, 1) 이중 가닥의 DNA를 포함하는 샘플 용액을 특정 온도, 예를 들어 약 95℃로 가열하여 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 분리하는 변성 단계(denaturing step), 2) 변성 단계 이후 샘플 용액에 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머를 제공하고, 분리된 단일 가닥의 DNA와 함께 특정 온도, 예를 들어 55℃로 냉각하여 단일 가닥의 DNA의 특정 염기 서열에 프라이머를 결합시켜 부분적인 DNA-프라이머 복합체를 형성하는 어닐링 단계(annealing step), 및 3) 어닐링 단계 이후 샘플 용액을 DNA 중합효소의 활성온도, 예를 들어 72℃로 유지하여 DNA 중합효소(polymerase)에 의해 부분적인 DNA-프라이머 복합체의 프라이머를 기초로 이중 가닥의 DNA를 형성하는 연장(또는 증폭) 단계(extension step)를 수행하고, 이를 수차례 반복함으로써 특정 염기 서열을 갖는 타겟 핵산을 기하급수적으로 증폭할 수 있다.

이러한 PCR을 수행하기 위해서는 시약과 시료는 물론 샘플 용액을 수용할 수 있는 챔버가 구비된 PCR 칩과, 상기 PCR 칩을 가열 및 냉각하여 증폭 반응을 유도하고 그 결과를 측정하는 PCR 장치가 필요하다. PCR 장치는 타깃 핵산의 증폭을 구현하기 위한 구체적인 수단으로, 현재 다양한 장치가 개발되었다.

종래의 PCR은 반응이 끝나고서 별도의 전기영동을 이용하여 증폭된 타깃 핵산의 정성적인 분석만 가능했으나 최근에는 광학적 검출시스템을 이용해서 증폭된 유전물질의 농도에 비례하는 형광의 세기를 검출하여 타깃 핵산의 정량분석이 가능한 리얼타임(Real Time) PCR 장치(즉, qPCR 장치)도 개발되었다.

또한, 실험실에서 사용하는 대형 PCR 장치를 소형화하여 시료가 채취되는 현장에서 PCR을 할 수 있는 휴대용 실시간 PCR 장치도 개발되었다. 본 발명은 이러한 휴대용 실시간 PCR 장치에 관한 것이다. 휴대용 PCR 장치는, PCR 칩(또는 바이오 칩, 마이크로 칩)을 사용하고, 크고 복잡한 광 검출시스템 대신에 카메라나 디지털 카메라를 사용하는 특징이 있다. 그런데 종래의 휴대용 PCR은, PCR 칩에 형성된 하나의 챔버에서 하나의 타깃 핵산만을 증폭하고 진단할 수 있다는 점에서 한계가 있었다.

즉, 동일한 증상이라도 발병 원인이 여러 감염성 병원체에 의한 경우가 많은데 이러한 경우에는 여러 개의 병원체를 통시에 검출하여야만 정확한 진단이 가능하다. 그런데 종래의 휴대용 PCR 장치는 여러 개의 표적 유전자를 검출하기 위해서 여러 번의 증폭 과정을 반복해야 하기 때문에 번거로울 뿐만 아니라 적은 시료에서 추출할 수 있는 핵산의 양도 한정되기 때문에 증폭을 반복적으로 실시하는 것도 현실적으로 불가능한 경우가 많다.

한 번의 증폭 또는 하나의 챔버에서 여러 개의 타깃 핵산을 동시에 증폭하고 검출할 필요가 있는데 이것을 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)라 한다. 예를 들어, 종래의 멀티플렉스 PCR은, 하나의 반응 용기(또는 튜브(tube))에 여러 종류의 프라이머 세트를 주입한다. 그러면 다종의 프라이머 세트는 핵산 분자의 다양한 서열에 특이적으로 혼성화될 수 있다. 따라서 동시에 여러 개의 표적 유전자가 증폭될 수 있다. 즉, 멀티플렉스 PCR 장치는 한 번의 실험으로 복수의 유전자 및 질병의 진단이 가능하기 때문에 실험 횟수 및 노동력 감소시키고, 비용 절감의 효과를 제공할 수 있다.

이러한 PCR 장치를 이용하여 PCR을 하기 위해서는 먼저 PCR 칩에 시약과 시료를 주입하는 준비과정이 필요하다. 즉, 이러한 준비단계는, 도 10에서 보는 바와 같이, 다수의 챔버(12)가 구비된 PCR 칩(10)을 준비하는 단계(S10), 상기 PCR 칩(10)의 챔버(12) 내에 시약을 주입하는 단계(S10), 상기 시약이 주입된 PCR 칩(10)의 챔버(12)에 시료를 주입하는 단계(S30)와, 상기 시약과 시료가 주입된 PCR 칩(10)을 PCR 장치(1)에 장착하여 PCR을 진행하는 단계(S40)로 구성된다. 이때, 시약은 2x 마스터 믹스, Forward primer, Reverse primer, Probe, DW 을 각각 또는 혼합하여 주입한다. 그리고 시료는 현장에서 채취한 혈액 등에서 추출한 표적유전자가 포함된다. 물론 현장에서 채취된 혈액에서 표적유전자를 분리하기 위해서는 유전자 분리, 정제 등과 같은 별도의 절차가 요구된다.

다시 도 10을 참조하면, PCR 칩(10)의 챔버(12) 내에 시약을 주입하는 단계(S0)는 프라이머, 형광염료, 효소 등이 포함된 혼합액을 파이펫을 이용하여 챔버(12) 내에 주입한다. 그런데 하나의 PCR 칩(10)에는 보통 5~10개의 챔버(12)가 구비되기 때문에 적어도 5~10번 정도 파이펫팅이 요구된다. 또한, 시약을 몇 개로 분리하여 주입하는 경우에는 그 이상으로 파이펫팅이 요구된다. 또한, 시약이 주입된 PCR 칩(10)의 챔버(12)에 시료를 주입하는 단계(S30)에서도, 종래의 PCR 칩은 각각의 챔버(12)가 독립적으로 분리되어 있기 때문에 적어도 5~10번 정도 파이펫팅이 반복된다.

이와 같이, PCR의 준비과정에서 시약과 시료를 PCR 칩(10)의 챔버(12)에 주입하는 작업이 복잡하고 번거롭기 때문에 시약과 시료가 잘못 주입되거나 누락되는 경우가 발생할 수 있다. 특히, 휴대용 PCR을 이용하여 시료 채취 현장에서 PCR을 준비하는 경우에는 주위 환경이 어지럽고 혼잡하기 때문에 시약이나 시료를 잘못 주입하거나 주입과정에서 이물질이 유입되어 오염될 수 있다.

이러한 문제를 감안하여, 최근에는 PCR 칩의 챔버에 시약을 주입하는 단계(S20)를 환경이 깨끗한 실험실에서 수행하고, 현장에서는 챔버에 시료를 주입하는 단계(S30)를 실행하는 방식을 사용하고 있다. 특히, 실험실에서 PCR 칩(10)의 챔버(12) 내에 시약을 주입한 후 건조해서 시약을 챔버(12)의 바닥에 고정하면 시료 채취 현장까지 운반하면서 시약이 서로 섞이거나 누설되는 것을 방지할 수 있다.

그렇지만, 현장에서는 다수의 챔버(12)에 시료를 주입하기 위해 여러 번의 파이펫팅 작업을 반복해야 한다. 이에 따라 최근에는 한 번에 여러 개의 챔버(12)에 시료를 주입할 수 있는 PCR 칩이 개발되었다. 도 11에서 보는 바와 같이, 다수 개의 챔버(112)가 형성된 PCR 칩(110)의 한 부분에 시료를 주입할 수 있는 별도의 시료챔버(113)를 형성하고, 상기 시료챔버(113)와 다수의 챔버(112) 사이에 마이크로 채널(115)을 연결한 것이다. 따라서 상기 시료챔버(113)에 시료를 주입한 후, 일정한 압력을 가하면, 시료챔버(113) 내의 시료가 마이크로 채널(115)을 따라 다수의 챔버(112)로 주입되게 된다. 따라서잦은 파이펫을 생략할 수 있게 된다.

그러나 이러한 PCR 칩(110)은 한 번의 시료주입 후 시료챔버(113)에 압력을 가하는 별도의 작업이 필요하기 때문에 원심분리기 등을 현장까지 가지고 가야 하는 문제가 있었다. 아니면 PCR 칩(110) 자체에 압력발생 구조를 설치해야 하기 때문에 PCR 칩의 구조가 복잡하고 가격이 올라가는 문제가 있었다.

한편, 종래기술에는 도 12에서 보는 바와 같이, 하나의 챔버(224) 내에 다수 개의 시약(240)을 고착시키고, 상기 챔버(224)에 시료를 주입하여 각 위치에 고정된 시약과 반응하여 한 번에 다수의 목표유전자를 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR 칩이 개시되어 있다. 그러나 종래의 멀티플렉스 PCR 칩은 챔버(224) 내에 시료가 주입될 때 각 위치에 고정된 시약(240)이 녹거나 서로 혼합되지 않도록 하기 위해서 시약(240)을 보호하기 위한 별도의 고정구조물이나 특수한 접착제를 사용하기 때문에 PCR 칩의 구조가 복잡하고 가격이 비싸지는 문제가 있었다.

대한민국 특허등록번호 제10-1724281(등록일:2017.04.03)

본 발명은 이러한 문제를 해결하기 위해서, 시료 주입 후, 압력을 가하는 등의 별도의 과정 없이 한 번의 시료 주입으로 다수의 챔버에 시료를 채울 수 있는 PCR 칩과 이를 위한 PCR 전처리 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 복잡한 고정구조물이나 특수한 접착제를 사용하지 않고도 시료가 주입될 때 시약과 시료가 혼합되지 않도록 함으로써 PCR 전처리 공정이 간단하고 PCR 칩의 구조가 단순한 PCR 칩과 이를 위한 PCR 전처리 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 한 번의 시료 주입으로도 다수의 타깃 유전자를 검출할 수 있는 동시다중 검출이 가능한 멀티플렉스 PCR 칩을 제공하는 것이다.

이러한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법은,

적어도 하나의 챔버가 구비된 PCR 칩을 준비하는 단계와;

상기 챔버의 내부에 시약을 주입하는 단계와;

상기 시약이 주입된 시약을 건조하여 챔버의 바닥에 시약을 고정하는 단계와;

상기 건조된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 도포하여 코팅하는 단계와;

상기 코팅된 시약이 있는 챔버의 내부에 시료를 주입하는 단계와;

상기 시료가 주입된 PCR 칩을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하여 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 상기 시약의 표면에 있는 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합되도록 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 다른 실시 예는,

다수 개의 챔버가 마이크로 채널을 통해 서로 연결되어 상기 다수의 챔버가 직렬로 연결된 PCR 칩을 준비하는 단계와;

상기 다수 개의 챔버의 내부에 시약을 주입하는 단계와;

상기 다수 개의 챔버에 주입된 시약을 건조하여 각각의 챔버의 바닥에 시약을 고정하는 단계와;

상기 건조된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 도포하여 코팅하는 단계와;

상기 코팅된 시약이 있는 다수 개의 챔버 중 일측에 있는 챔버에 시료를 주입하여 상기 일측의 챔버와 상기 마이크로 채널을 통해 모든 챔버로 시료가 주입되는 단계와;

상기 시료가 주입된 PCR 칩을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하여 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 상기 시약의 표면에 있는 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합되도록 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 또 다른 실시 예는,

적어도 하나의 챔버가 구비된 PCR 칩을 준비하는 단계와;

상기 챔버의 내부에 시약과 방수성 코팅제를 일정 비율로 혼합하여 주입하는 단계와;

상기 코팅제가 혼합된 시약을 건조하여 챔버의 바닥에 시약을 고정하는 단계와;

상기 건조된 시약이 있는 챔버의 내부에 시료를 주입하는 단계와;

상기 시료가 주입된 PCR 칩을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하여 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 상기 시약에 혼합된 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합되도록 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 다른 실시 예는,

다수 개의 챔버가 마이크로 채널을 통해 서로 연결되어 상기 다수의 챔버가 직렬로 연결된 PCR 칩을 준비하는 단계와;

상기 다수 개의 챔버의 내부에 시약과 방수성 코팅제를 일정 비율로 혼합하여 주입하는 단계와;

상기 다수 개의 챔버에 주입된 시약을 건조하여 각각의 챔버의 바닥에 시약을 고정하는 단계와;

상기 코팅제가 혼합된 시약이 있는 다수 개의 챔버 중 어느 하나의 챔버에 시료를 주입하고 상기 마이크로 채널을 통해 모든 챔버로 시료가 주입되는 단계와;

상기 시료가 주입된 PCR 칩을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하여 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 상기 시약에 혼합된 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합되도록 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 코팅제는, 방수성과 접착성을 가지고 있을 뿐만 아니라 일정 온도 이상에서는 녹는 성질을 갖는다.

상기 코팅제는 45℃ 이상에서 녹는다.

상기 코팅제는 왁스, 아가로스, 파라핀 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합물로 이루어진다.

상기 코팅제는 PCR 단계 중 변성 단계에서 녹는다.

상기 코팅제의 혼합비율은 일정 비율로 시약 중량의 0.03중량%~0.3중량% 의 범위로 혼합한다.

본 발명에 있어서, 상기 PCR 칩은,

광 투과성 플라스틱으로 이루어진 기판과;

상기 기판의 일면에 일정 간격 이격되어 평행하게 설치되는 다수 개의 챔버와;

상기 다수 개의 챔버를 이루는 이웃하는 챔버들 사이에 설치되어 다수의 챔버가 직렬로 연결되게 하는 다수의 마이크로 채널과;

상기 다수 개의 챔버 중 어느 하나와 연결된 주입구;를 포함한다.

또한, 상기 기판의 일면에는 상기 다수의 챔버와 마이크로 채널의 개방부를 폐쇄하는 밀봉필름이 부착된다.

상기 마이크로 채널에는 다수의 굴곡부가 더 형성되어 상기 마이크로 채널의 길이를 연장하고 구조를 복잡하게 하여 이웃하는 챔버 사이에 샘플 용액의 흐름이 생기기 않도록 한다.

본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩은,

광 투과성 플라스틱으로 이루어진 기판과;

상기 기판의 일면에 일정 간격 이격되어 평행하게 설치되는 다수 개의 챔버와;

상기 다수 개의 챔버를 이루는 이웃하는 챔버들 사이에 설치되어 다수의 챔버가 직렬로 연결되게 하는 다수의 마이크로 채널과;

상기 다수 개의 챔버 중 어느 하나와 연결된 주입구와;

상기 기판의 일면에 부착되어 상기 다수 개의 챔버와 마이크로 채널의 개방부를 폐쇄하는 밀봉필름;을 포함하고,

상기 다수 개의 챔버에는 다수의 프라이머와 프로브를 포함하는 시약을 주입한 후 건조하여 상기 챔버의 바닥에 고정하고, 상기 챔버의 바닥에 고정된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 코팅한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 다른 실시 예는,

광 투과성 플라스틱으로 이루어진 기판과;

상기 기판의 일면에 일정 간격 이격되어 평행하게 설치되는 다수 개의 챔버와;

상기 다수 개의 챔버를 이루는 이웃하는 챔버들 사이에 설치되어 다수의 챔버가 직렬로 연결되게 하는 다수의 마이크로 채널과;

상기 다수 개의 챔버 중 어느 하나와 연결된 주입구와;

상기 기판의 일면에 부착되어 상기 다수 개의 챔버와 마이크로 채널의 개방부를 폐쇄하는 밀봉필름;을 포함하고,

상기 다수 개의 챔버에는 다수의 프라이머와 프로브를 포함하는 시약과 방수성 코팅제를 일정 비율로 혼합하여 주입한 후 건조하여 상기 챔버의 바닥에 고정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 코팅제는, 방수성과 접착성을 가지고 있을 뿐만 아니라 일정 온도 이상에서는 녹는 성질을 갖는다.

상기 코팅제는 왁스, 아가로스, 파라핀 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합물로 이루어진다.

상기 코팅제는 PCR 단계 중 변성 단계(denaturing step)에서 녹는다.

상기 건조되고 코팅된 시약이 있는 다수 개의 챔버 중 일측에 있는 챔버에 시료를 주입하면, 상기 마이크로 채널을 통해 모든 챔버로 시료가 주입된다.

상기 마이크로 채널에는 다수의 굴곡부가 더 형성된다.

도 1은 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 제1 실시 예를 보여주는 흐름도,
도 2는 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 제2 실시 예를 보여주는 흐름도,
도 3은 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 제3 실시 예를 보여주는 흐름도,
도 4는 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 제4 실시 예를 보여주는 흐름도
도 5는 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 일 예를 보여주는 평면도,
도 6은 도 5에 도시된 멀티플렉스 PCR 칩의 단면도,
도 7은 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 다른 실시 일 예를 보여주는 평면도,
도 8은 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 제4 실시 예를 보여주는 흐름도,
도 9는 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 제6 실시 예를 보여주는 흐름도,
도 10은 종래 기술에 따른 PCR 전처리 방법의 일 예를 보여주는 흐름도,
도 11은 종래 기술에 따른 PCR 칩이 일 예를 보여주는 평면도,
도 12는 종래 기술에 따른 멀티플렉스 PCR 칩을 보여주는 단면도이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술 되는 실시 예를 통해 설명될 것이다. 그러나 본 발명은 여기에서 설명되는 실시 예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 본 실시 예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세히 설명하기 위하여 제공되는 것이다. 또한, 본 발명의 실시 예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 실시 예에 대해 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.

도 1은 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 제1 실시 예를 보여주는 설명 및 흐름도이다.

도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법은, 적어도 하나의 챔버(12)가 구비된 PCR 칩(10)을 준비하는 단계(S110)와, 상기 챔버(12)의 내부에 시약을 주입하는 단계(S120)와, 상기 시약이 주입된 PCR 칩(10)을 건조시켜 챔버(12)의 바닥에 시약을 고정하는 단계(S130)와, 상기 건조된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 도포하여 코팅하는 단계(S140)와, 상기 코팅된 시약이 있는 챔버(10)의 내부에 시료를 주입하는 단계(S150)와, 상기 시료가 주입된 PCR 칩(10)을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하여 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 상기 시약의 표면에 있는 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합되도록 하는 단계(S160) 및 상기 시료와 시약이 혼합된 PCR 칩(10)을 반복적으로 가열 및 냉각하여 핵산의 특정 염기 서열을 갖는 타깃 핵산를 연쇄적으로 복제하여 그 특정 염기 서열 부위를 갖는 타킷 핵산을 증폭하는 단계(S170)을 포함한다.

즉, 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법은, 실험실 등에서 PCR 칩(10)의 챔버(12)의 내부에 시약을 주입(S120)하고, 주입된 시약을 건조시켜 챔버(12)의 바닥에 시약을 고정한 후(S130), 건조된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 도포하여 코팅(S140) 함으로써 시약이 흘러 서로 혼합되거나 누설되지 않도록 하고, 방수성 코팅제로 코팅하여 전처리 과정이나 운반 과정에서 수분을 흡수하거나 이물질이 혼합되지 않도록 함으로써 PCR의 신뢰성을 높일 수 있다.

본 발명의 PCR 전처리 방법에서 사용하는 시약은, 2x 마스터 믹스, 프라이머(Forward primer, Reverse primer), 프로브(Probe), 효소(enzume), 희석용액(증류수(DW)을 포함하고, 이들은 각각 챔버(12)에 주입되거나 전부 또는 일부를 혼합하여 챔버(12)에 주입할 수 있다. 본 발명은 어느 것이든 가능하고 특별히 한정하지 않는다.

본 발명의 PCR 전처리 방법에서 PCR 칩(10)을 건조하는 방법은, 자연건조, 진공건조, 냉동건조 등 어느 것이나 적용가능하다. 즉, PCR 칩(10)의 챔버(12)에 시약을 주입한 후, 일정 시간 건조하면, 시약이 그대로 굳어서 챔버(12) 바닥에 고착되게 된다.

그리고 본 발명이 PCR 전처리 방법에서 사용하는 코팅제는, 방수성과 접착성을 가지고 있을 뿐만 아니라 일정 온도 이상에서는 녹는 성질을 갖고, 실온에서는 굳는 특성을 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게, 본 발명의 코팅제는 45℃ 이상에서 녹는 성질을 갖는다. 즉, 건조된 시약에 코팅제를 도포하는 코팅 단계(S140)에서는 코팅제가 액체 상태를 유지해야 하고, 현장까지 이송할 때는 굳어 있는 상태를 유지해야 한다. 따라서 40℃ 이하에서는 굳은 상태를 유지하고 45℃ 이상에서는 녹는 것이 취급하기 용이하다. 바람직하게, 상기 코팅제는 왁스, 아가로스, 파라핀 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합물로 이루어질 수 있다.

한편, 본 발명의 시료 주입단계((S150)에서는 시약이 고착되어 있는 챔버(12)에 시료를 주입해도 시약이 방수성 코팅제로 덮혀 있기 때문에 시약이 녹지 않아서 시료와 혼합되지 않는다. 따라서 시약과 시료를 혼합하여 PCR을 수행하기 위해서는 먼저 방수성 코팅제를 제거해야 한다.

시약의 표면에 코팅된 코팅제를 녹여서 제거하는 방법으로는 크게 두 가지가 있다. 첫째는 시료가 주입된 PCR 칩(10)의 별도의 가열장치에 넣고 45℃ 이상으로 가열하여 녹이는 방법이다. 둘째는, 시료가 주입된 PCR 칩(10)을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행함으로써 PCR 과정에서 발생하는 열, 즉 변성 단계(denaturing step)에서 95℃로 PCR 칩(10)이 가열되는 열을 이용하여 시약의 표면에 있는 코팅제를 녹여서 제거하는 것이다. 어느 방법이든 코팅제가 녹아서 시약과 시료가 혼합되기 때문에 PCR이 가능하게 되지만, 특별한 경우가 아니라면 별도의 코팅제 용융단계를 생략하고 PCR 단계에서 코팅제가 자연스럽게 녹아서 제거되게 하는 것이 바람직하다.

이어, 도 2는 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 제2 실시 예를 보여주는 설명 및 흐름도이다.

도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 다른 실시 예는, 적어도 하나의 챔버(12)가 구비된 PCR 칩(10)을 준비하는 단계(S210)와, 상기 챔버(12)의 내부에 시약과 방수성 코팅제를 일정 비율로 혼합하여 주입하는 단계(S220)와, 상기 코팅제가 혼합된 시약을 건조시켜 챔버(12)의 바닥에 시약을 고정하는 단계(S230)와, 상기 건조된 시약이 고정되어 있는 챔버(12)의 내부에 시료를 주입하는 단계(S240)와, 상기 시료가 주입된 PCR 칩(10)을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하여 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 상기 시약에 혼합된 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합되도록 하는 단계(S250) 및, 상기 시료와 시약이 혼합된 PCR 칩(10)을 반복적으로 가열 및 냉각하여 핵산의 특정 염기 서열을 갖는 타깃 핵산를 연쇄적으로 복제하여 그 특정 염기 서열 부위를 갖는 타킷 핵산을 증폭하는 단계(S260)을 포함한다.

즉, 본 실시 예서는 건조된 시약의 표면에 코팅제를 도포하는 코팅하는 대신에 미리 시약과 코팅제를 일정한 비율로 혼합한 후 PCR 칩(10)의 챔버(12) 내에 주입하고 건조시켜서, 코팅제와 시약을 동시에 굳혀서 챔버(12)의 바닥에 고정하는 방법이다. 이와 같이, 코팅제가 혼합된 상태에서 시약을 건조시키면 수분이 시약에 흡수되지 못하게 된다.

이때, 코팅제는 시약에 큰 영향을 주지 않으면서도 시약과 원활하게 혼합될 수 있도록 일정한 온도 이상에서는 액체 상태를 유지해야 한다. 그리고 현장까지 이동하는 동안에 외부의 기온에 의해서 녹지 않게 하려면 30~40℃에서는 고체상태를 유지할 수 있어야 한다. 따라서 코팅제는 40℃ 이하에서는 고체 상태가 되고, 45℃ 이상에서는 액체 상태가 되는 것이 바람직하다. 상기 코팅제는 왁스, 아가로스, 파라핀 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합물로 이루어질 수 있다.

한편, 시약에 혼합되는 코팅제의 혼합 비율을 일정 범위 내에 있어야 한다. 즉, 코팅제의 혼합 비율이 너무 낮으면 방수성이 떨어지고 반대로 코팅제의 혼합 비율이 너무 높으면 코팅제가 시약과 시료간의 반응을 방해할 수 있다. 따라서 코팅제는 시약 중량의 0.03중량%~3중량% 의 범위로 혼합하는 것이 바람직하다. 즉, 코팅제의 혼합 비율이 0.03중량% 이하이면, 방수성이 떨어지고, 3중량% 이상이면 시약과 시료간의 결합이 억제되어 PCR이 원활하게 이루어지지 않을 수 있다.

이어서, 도 3은 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 제3 실시 예를 보여주는 설명 및 흐름도이다.

도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 또 다른 실시 예는, 다수 개의 챔버(12)가 형성된 PCR 칩(10)을 준비하는 단계(S310)와, 상기 다수 개의 챔버(12)의 내부에 각각 시약을 주입하는 단계(S320)와, 상기 다수 개의 챔버(12)에 주입된 시약을 건조시켜 각각의 챔버(12)의 바닥에 시약을 고정하는 단계(S330)와, 상기 건조된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 도포하여 코팅하는 단계(S340)와, 상기 코팅된 시약이 있는 다수 개의 챔버(12)에 각각 주입하는 단계(S350)와, 상기 시료가 주입된 PCR 칩(10)을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하여 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 상기 시약의 표면에 코팅된 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합되도록 하는 단계(S360) 및, 상기 시료와 시약이 혼합된 PCR 칩(10)을 반복적으로 가열 및 냉각하여 핵산의 특정 염기 서열을 갖는 타깃 핵산를 연쇄적으로 복제하여 그 특정 염기 서열 부위를 갖는 타킷 핵산을 증폭하는 단계(S260)을 포함한다.

도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법은, 파이펫을 반복적으로 사용해야 하는 PCR 칩(10)의 다수의 챔버(12)에 시약을 주입하는 단계(S320)와, 주입된 시약을 건조시켜 챔버(12)의 바닥에 고정하는 단계(S330)와, 건조된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 도포하여 코팅하는 단계(S340)를 실험실에서 먼저 수행한다. 즉, 실험실은 환경이 깨끗하고 차분한 분위기 이므로 시약을 잘못 넣거나 누락하는 것을 방지할 수 있다.

그리고 건조된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 코팅한 후 준비된 PCR 칩(10)을 현장으로 운반하여 운반 과정에서 시약이 흘러 서로 혼합되거나 누설되지 않도록 한다. 그리고 현장에서는 다수의 챔버(12)에 시료를 주입하는 단계(S350)만을 수행한다. 따라서 복잡한 현장에서는 챔버(12)에 시료를 주입하는 단계만 수행함으로써 시료를 잘못 주입하거나 누락하는 것을 방지한다

그리고 도 4는 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 제4 실시 예를 보여주는 설명 및 흐름도이다.

도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 또 다른 실시 예는, 다수의 챔버(12)가 마이크로 채널(15)를 통해 서로 연결되어 상기 다수의 챔버(12)들이 직렬로 연결된 PCR 칩을 준비하는 단계(S410)와, 상기 다수 개의 챔버(12)의 내부에 시약을 주입하는 단계(S420)와, 상기 다수 개의 챔버(12)에 주입된 시약을 건조시켜 각각의 챔버의 바닥에 시약을 고정하는 단계(S430)와, 상기 건조된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 도포하여 코팅하는 단계(S440)와, 상기 코팅된 시약이 있는 다수 개의 챔버(12) 중 어느 하나의 챔버(12)에 시료를 주입하여 상기 마이크로 채널(15)을 통해 모든 챔버(12) 내에 시료를 주입하는 단계(S450)와, 상기 시료가 주입된 PCR 칩(10)을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하여 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 상기 시약의 표면에 있는 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합되도록 하는 단계(S460) 및, 상기 시료와 시약이 혼합된 PCR 칩(10)을 반복적으로 가열 및 냉각하여 핵산의 특정 염기 서열을 갖는 타깃 핵산를 연쇄적으로 복제하여 그 특정 염기 서열 부위를 갖는 타킷 핵산을 증폭하는 단계(S460)을 포함한다.

도시된 바와 같이, 본 실시 예는, PCR 칩(10)의 다수의 챔버(12)에 시약을 주입하는 단계(S420)와, 주입된 시약을 건조시켜 챔버(12)의 바닥에 고정하는 단계(S430)와, 건조된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 도포하여 코팅하는 단계(S440)는 실험실에서 실시하고, 시약을 건조 및 코팅하여 안전하게 운반할 수 있게 함으로써, 다수의 챔버(12)에 시료를 주입하는 단계(S450)만 현장에서 수행하도록 하여 시약이나 시료를 잘못 주입하거나 누락하는 것을 방지할 수 있다.

그러나 현장에서 다수의 챔버(12)에 일일이 시료를 주입하는 작업을 수행하여야 하는 문제를 해결하기 위해서 본 실시 예서는 PCR 칩(10)의 일측에 구비된 주입구에 한 번 시료를 주입함으로써 모든 챔버에 자동으로 시료가 주입될 수 있게 함으로써 시료를 잘못 주입하거나 누락하는 것을 원천적으로 방지할 수 있도록 한다. 또한, 본 실시 예는 시약이 수분을 흡수하거나 이물질이 혼합되지 않도록 함으로써 PCR의 신뢰성을 높일 수 있도록 한다.

이를 위해서, 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩(10)은 다수 개의 챔버가 마이크로 채널(15)을 통해서 직렬로 연결된다. 즉, 도 5는 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩(10)의 일 예를 보여주는 평면도이고, 도 6은 도 5에 도시된 멀티플렉스 PCR 칩(10)의 단면도이다.

도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 멀티플렉스 PCR 칩(10)은, 광 투과성 플라스틱으로 이루어진 기판(11)과, 상기 기판(11)의 일면(11a)에 일정 간격 이격되어 평행하게 설치되는 다수 개의 챔버(12)와, 상기 이웃하는 챔버(12) 사이에 하나 씩 형성되어 다수 개의 챔버(12)를 직렬로 연결하는 다수의 마이크로 채널(15)과, 상기 다수 개의 챔버(12) 중 하나와 연결된 주입구(16)를 포함한다.

그리고 도 6에서 보는 바와 같이, 기판(11)의 일면에는 밀봉필름(19)을 부착한다. 밀봉필름(19)은 다수 개의 챔버(12)와 마이크로 채널(15)의 개방부를 폐쇄한다. 또한, 밀봉필름(19)이 히팅 블록(19)과 접촉하도록 상기 PCR 칩(10)을 뒤집은 후 주입구(16)를 이용하여 시료를 주입한다. 그러면 시료는 밀봉필름(19)의 상면과 마이크로 채널(15)을 통해서 모든 챔버(12)로 주입되게 된다.

즉, 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩(1)은, 상기 다수 개의 챔버(12)가 마이크로 채널(15)을 통해 직렬로 연결된다. 따라서 하나의 주입구(16)을 통해 시료를 주입하면, 마이크로 채널(15)을 통해 모든 챔버(12)에 시료를 주입할 수 있기 때문에 다수의 챔버(12)에 시료를 주입하기 위해 파이펫을 반복적으로 수행할 필요가 없게 된다.

이와 같이, 한 번의 시료 주입으로 모든 챔버(12)에 시료를 채울 수 있는 것은 각 챔버(12)에 주입된 시약이 건조된 후 코팅제로 코팅되었기 때문에 가능하다. 즉, 다수의 챔버(12)의 내부에 다른 프로브와 프라이머를 포함하는 시약을 주입한 후, 건조하여 챔버의 바닥에 고정한 후, 각 챔버(12)의 바닥에 고정된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 도포하여 코팅한다. 그런 다음 상기 PCR 칩(10)을 뒤집은 후 주입구(16)를 통해 시료를 주입하면, 마이크로 채널(15)을 따라 모든 챔버(12)에 채워진다. 이때, 각 챔버(12)의 바닥에 고정된 시약은 방수성 코팅제로 코팅되어 있기 때문에 시료와 접촉하여도 시약이 누출되거나 혼합되지 않게 된다.

따라서 시료를 주입한 후 시료가 주입된 PCR 칩(10)을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하면, PCR 과정에서 발생하는 열에 의해서 시약에 도포된 코팅제를 녹게 된다 그러면 시약과 시료가 혼합되어 PCR이 이루어져 타킷 핵산을 증폭하게 된다. 이때, 상기 이웃하는 챔버(12)를 연결하는 마이크로 채널(15)은 지름이 매우 작고 이웃하는 챔버(12) 사이의 압력이 균형을 이루고 있기 각 챔버(12)에 있는 샘플 용액은 상기 마이크로 채널(15)를 통해 흐르지 않게 된다.

이어, 도 7은 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 다른 실시 예를 보여주는 평면도이다. 도시된 바와 같이, 본 실시 예의 PCR 칩(10)은, 상기 다수의 챔버(12)를 사이를 연결하는 마이크로 채널(15)에 다수의 굴곡부(23)가 더 형성된다. 상기 굴곡부(23)는 S자 형상으로 이루어져 상기 마이크로 채널(15)의 길이를 연장하고 유체의 경로를 복잡하게 만들어서이웃하는 챔버(12) 사이에 샘플 용액이 이동하지 못하게 한다.

그리고 도 8은 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 제5 실시 예를 보여주는 설명 및 흐름도이다.

도시한 바와 같이, 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 다른 실시 예는, 도 2와 도 3의 실시 예를 혼합한 것으로, 다수 개의 챔버(12)가 마이크로 채널(15)을 통해 서로 연결되어 다수의 챔버(12)가 직렬로 연결된 PCR 칩(10)을 준비하는 단계(S510)와, 상기 다수 개의 챔버(12)의 내부에 시약과 방수성 코팅제를 일정 비율로 혼합하여 주입하는 단계(S520)와, 상기 다수 개의 챔버(12)에 주입된 시약을 건조시켜 각각의 챔버(12)의 바닥에 시약을 고정하는 단계(S530)와, 상기 코팅제가 혼합된 시약이 있는 다수 개의 챔버(12) 중 어느 하나의 챔버(12)에 시료를 주입하여 상기 마이크로 채널(15)을 통해 모든 챔버 내에 시료를 주입하는 단계(S540)와, 상기 시료가 주입된 PCR 칩(10)을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하여 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 시약에 혼합된 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합되도록 하는 단계(S550) 및, 상기 시료와 시약이 혼합된 PCR 칩(10)을 반복적으로 가열 및 냉각하여 핵산의 특정 염기 서열을 갖는 타깃 핵산를 연쇄적으로 복제하여 그 특정 염기 서열 부위를 갖는 타킷 핵산을 증폭하는 단계(S560)을 포함한다.

이어 도 9는 본 발명에 따른 PCR 전처리 방법의 제6 실시 예를 보여주는 설명 및 흐름도이다.

도시된 바와 같이, 다수의 챔버(12)가 마이크로 채널(15)를 통해 서로 연결되어 상기 다수의 챔버(12)들이 직렬로 연결된 PCR 칩을 준비하는 단계(S610)와, 상기 다수 개의 챔버(12)의 내부에 시약을 주입하는 단계(S620)와, 상기 다수 개의 챔버(12)에 주입된 시약을 건조시켜 각각의 챔버의 바닥에 시약을 고정하는 단계(S630)와, 상기 건조된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 도포하여 코팅하는 단계(S640)와, 상기 코팅된 시약이 들어 있는 PCR 칩(10)을 뒤집고 일면에 밀봉필름(19)을 부착하여 다수의 챔버(12)와 마이크로 채널(15)의 개방부를 폐쇄하는 밀봉단계(S650)는 실험실에서 수행한다.

그리고 밀봉된 PCR 칩(10)을 시료를 채취하는 현장으로 가지고 가서 상기 밀봉된 PCR 칩(10)의 주입구(16)에 시료를 주입하여 마이크로 채널(15)을 통해 모든 챔버(12) 내에 시료를 주입하는 단계(S660)와, 상기 시료가 주입된 PCR 칩(10)을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하여 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 상기 시약의 표면에 있는 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합되도록 하는 단계(S670) 및, 상기 시료와 시약이 혼합된 PCR 칩(10)을 반복적으로 가열 및 냉각하여 핵산의 특정 염기 서열을 갖는 타깃 핵산를 연쇄적으로 복제하여 그 특정 염기 서열 부위를 갖는 타킷 핵산을 증폭하는 단계(S680)은 현장에서 수행한다.

이와 같이, 본 발명의 PCR 전처리 방법 및 이를 위한 멀티플렉스 PCR 칩은, 하나의 주입구를 통해 시료를 주입하면, 다수의 채널 사이에 연결된 마이크로 채널을 통해서 시료가 모든 챔버로 이동하기 때문에 시료 주입 후, 별도로 압력을 가하는 과정 없이 한 번의 시료 주입으로 모든 챔버에 시료를 주입할 수 있기 때문에 현장에서 PCR 준비 과정을 쉽고 편리하게 수행할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 건조된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 코팅하거나 시약과 방수성 코팅제를 일정 비율로 혼합한 후 건조시켜 고정함으로써 시약이 고정되어 있는 각 챔버에 시료를 주입하여도 시료와 시약이 혼합되지 않기 때문에 시약에 다수의 프라이머와 프로브가 포함되면 별도의 고정구조물이나 특수한 접착제를 사용하지 않고도 동일한 시료를 여러 종류의 시약과 반응시켜서 한 번의 실험으로 다수의 타깃 핵산을 증폭하고 검출할 수 있는 멀티플렉스 기능을 달성할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 한 번의 시료 주입으로 모든 챔버에 시료를 주입할 수 있고 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 시약에 도포되거나 혼합되어 있는 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합할 수 있기 때문에 용이 편리하다.

이상의 본 명세서와 도면에는 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 개시하였으며, 비록 특정 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명의 기술 내용을 쉽게 설명하고 발명의 이해를 돕기 위한 일반적인 의미에서 사용된 것이지, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 이상에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있다. 단지 본 실시 예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 오로지 특허청구범위에 기재된 청구항의 범주에 의하여 정의될 뿐이다.

10: PCR 칩 11: 기판
12: 챔버 15: 마이크로 채널
16: 주입구 19: 밀봉필름
23: 굴곡부

Claims (19)

1. 광 투과성 플라스틱으로 이루어진 기판과, 상기 기판의 일면에 일정 간격 이격되어 평행하게 설치되는 다수 개의 챔버와, 상기 다수 개의 챔버를 이루는 이웃하는 챔버들 사이에 설치되어 다수의 챔버가 직렬로 연결되게 연결하는 다수의 마이크로 채널과, 상기 마이크로 채널에 S자 형상으로 이루어져 상기 마이크로 채널의 길이를 연장하고 유체의 경로를 복잡하게 만드는 다수의 굴곡부와, 상기 다수 개의 챔버 중 어느 하나와 연결된 주입구;를 포함하는 PCR 칩을 준비하는 단계와;
   상기 PCR 칩에 구비된 다수 개의 챔버에 다수의 프라이머와 프로브를 포함하는 시약을 주입한 후 건조하여 상기 챔버의 바닥에 고정하고 상기 챔버의 바닥에 고정된 시약의 표면에 방수성 코팅제를 코팅하거나, 상기 다수 개의 챔버에 다수의 프라이머와 프로브를 포함하는 시약과 방수성 코팅제를 일정 비율로 혼합하여 주입한 후 건조하여 상기 챔버의 바닥에 고정하는 시약 고정 및 코팅단계와;
   상기 PCR 칩의 일면에 밀봉필름을 부착하여 상기 시약이 고정된 다수 개의 챔버와 상기 마이크로 채널의 개방부를 폐쇄하는 밀봉 단계와;
   상기 밀봉필름을 벗긴 후, 상기 PCR 칩의 주입구에 시료를 주입하여 상기 마이크로 채널과 굴곡부를 통해 서로 연결되고 각각 서로 다른 시약이 고정되어 있는 다수 개의 챔버에 시료를 한 번에 주입하는 시료 주입 단계와;
   상기 시료가 주입된 PCR 칩을 PCR 장치에 넣고 PCR을 수행하여 PCR 과정에서 발생하는 열을 이용하여 상기 시약의 표면에 있거나 시약에 포함된 코팅제를 녹여서 시약과 시료가 혼합되도록 하는 시약과 시료 혼합단계를 포함하되,
   상기 시약 고정 및 코팅단계에서, 상기 코팅제는 PCR 단계 중 변성 단계에서 녹는 것으로 시약 중량의 0.03중량%~0.3중량%의 범위로 혼합되고;
   상기 시료 주입 단계에서, 상기 PCR 칩의 주입구로 주입된 시료는 상기 PCR 칩의 주입구와 가장 가까운 챔버부터 채워진 후 상기 마이크로 채널과 굴곡부를 통해 이웃하는 챔버로 유동하면서 모든 챔버에 순차적으로 채워지며;
   상기 시약과 시료 혼합단계에서, 모든 챔버로 주입된 동일 종류의 시료는 서로 다른 챔버에 고정된 서로 다른 시약과 혼합하여 반응하는 것을 특징으로 하는 PCR 전처리 방법.
   
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3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1 항에 있어서,
   상기 코팅제는 45℃ 이상에서 녹는 것을 특징으로 하는 PCR 전처리 방법.
   
7. 제1 항에 있어서,
   상기 코팅제는 왁스, 아가로스, 파라핀 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 PCR 전처리 방법.
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