JP2010162034A - 二本鎖核酸−特異的色素を使用する二次構造の融解分析による一本鎖核酸の特徴付け - Google Patents
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Abstract
【解決手段】核酸を、二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせて、色素および核酸内の1つ以上の二本鎖構造の間に、検出可能な複合体を形成する。次いで、組合せを可変温度に暴露し、色素の蛍光発光を測定して、二本鎖構造の融解温度を決定する。次いで、いくつかの具体例において、融解温度プロファイルを、他の核酸につき発生させた融解温度プロファイルと比較して、比較された核酸間の差異を識別する。
【選択図】なし
Description
部位Yは、所望により置換された縮合単環式または多環式芳香環または窒素含有芳香族複素環を形成し;
Xは酸素、硫黄、セレン、テルル、またはC(CH3)2、およびNR1よりなる群から選択され、ここにR1は水素またはC1−6アルキルである;
R2は所望により置換されたC1−6アルキル、または環式または非環式ヘテロ原子含有部位である]
として一般に記載されるピリジニウム核構造との非対称性シアニンのモノマーまたはダイマーである。例示的なヘテロ原子含有部位は、所望により置換されたヘテロアルキル、ヘテロシクリル、スルホネート、アミノ、カルボキシ、ヘテロアルケニル、ヘテロアリール、エステル、アミン、アミド、リン−酸素、およびリン−硫黄結合を含む。例示的なヘテロ原子含有部位は、米国特許第5,658,751号およびWO00/66664で論議され、これらは引用によって本明細書中に組み込まれる。
t=0または1であり;
zは0または1から選択される電荷であり、但し、z=tであり;
R3、R9、およびR10は、独立して、水素およびC1−6アルキルから選択され;
n=0、1、または2であり;
Qは:
よりなる構造の群から選択される芳香環である。BRIDGEは、WO00/66664で定義され、既に引用によって組み込まれている。DYEは、式Iの化合物である。立体異性体は、特記しない限り、シアニン色素構造の記載に含まれる。
好ましくは、Qは:
R4は水素、アルコキシ(例えばOMe)、アルキルチオ(例えばSMe)、またはヘテロシクロアルキル(例えばピペラジニル)、または荷電基(例えば4,4−ジメチルピペラジニウム−1−イル)を含むヘテロシクロアルキルであり;
R5はC1−6アルキル、(例えばMe)、またはフェニル、(CH2)3N+(Me)3、または(CH2)3N+Me2(CH2)3N+Me2(CH2)3であり、加えて、これは第2の4−ピリジニウムの窒素に結合しており、それにより、ダイマーを形成し、ここに第2のピリミジニウムは式Iの第2の化合物の部分であり;R6、R7、およびR8は水素である]
である。
部位Yは、所望により置換された縮合単式または多環式芳香環または窒素含有芳香族複素環を形成し;
Xは酸素、硫黄、セレン、テルル、またはC(CH3)2、およびNR1から選択される基であり、ここにR1は水素またはC1−6アルキルである;
R2は所望により置換されたC1−6アルキルであり、あるいは環式または非環式ヘテロ原子含有部位である]
t=0または1であり;
zは0または1から選択される電荷であり、但し、z=tであり;
R3、R9、およびR10は、独立して、水素およびC1−6アルキルから選択され;
n=0、1、または2であり;
R4、R5、R8、R11、R12、R13、およびR14は、独立して、水素;ハロゲン;アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニル、ポリアルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル(これら全ては所望により置換される);他のヘテロ原子含有部位;および反応性基、(もしR4は115未満、より好ましくは105未満の分子量であるならば、これらは各々所望により第四級アンモニウムといった荷電基を含む)である。代わりに、R4、R8、R11、R12、R13、およびR14は上記定義通りであり、式IIの2つの化合物は一緒になって、ダイマーを形成し、ここに、もし色素がキノリニウムシアニンn=1または2のダイマーであるならば、式IIの各々の基R5は一緒になって、二価部位を形成する。
R4は水素、(Meといった)C1−6アルキル、または所望により置換されたフェニル、好ましくはフェニルであり;
R5は、(メチルのような)C1−6アルキル、または所望により置換されたフェニル、好ましくはフェニルであり;次いで
R8は水素であり、R11、R12、R13、およびR14は水素または(メトキシといった)アルコキシである。
また、本発明における使用のための例示的な色素は、例示的に、式IIのシアニン色素を含み、ここに部位Yは、所望により置換された(1−メチルピリジニウムまたは3−ブロモ−1−メチルピリジニウムといった)複素環を形成し;Xは酸素または硫黄であり;n=0または1であり;t=z=0であり;
R4は水素、または(Meといった)C1−6アルキルであり;
R5は、(Meのような)C1−6アルキル、所望により置換されたフェニル、好ましくはフェニルまたは(基−(CH2)3N(Me)3)といった)荷電基を含むヘテロアルキルであり;次いで
R8は水素であり、R11、R12、R13、およびR14は水素、(メチルのような)アルキル、または(メトキシのごとき)アルコキシである。
その蛍光モニタリング能力および小試料容量のため、本明細書中に記載する実験用の選択器具として、LightCyclerTM(Idaho Technologies, Idaho Falls, ID)を選択した。しかしながら、核酸の融解温度に関する文献の概説は、LightCyclerTMの標準の範囲である40℃ないし100℃よりも広い範囲の温度が必要であろうことを示唆している。例えば、リボソーム遺伝子内の二重−らせん領域の標準の長さは、約3bpないし20bpの範囲であると知られていた((De Rijkら, 前掲; Gutellら, Nucleic Acids Res. 21 (13) :3055-3074 (1993); Spechtら, Nucleic Acids Res. 25(1) :96-97(1997) ; Szymanskiら, Nucleic Acids Res. 28(1) :166-167 (2000))。Kulinksiら(1991)は、麦芽およびルピナス種子の両方からの5S rRNA試料は300および340K(27°および67℃)間の観察可能な転移を有し、非常に特徴的な融解転移プロファイルが、2つの検体につき観察されることを発見した。Panerらは、4bpループを持つ6bpステムを含有するヘアピンにつき、55℃中心の転移を報告している(1990)。VamosiおよびCleggは、8bpないし20bpのステムサイズの範囲にあるヘアピンにつき、20°ないし71℃の融解範囲を記録している(1998)。Volkerおよび同僚らによって行われた研究は、200bpプラスミドの活性をモニターし、短い内部セグメントは、75℃および95℃の間で融解することが判明している(1999)。これらの研究群によって使用された温度転移速度は、通常、60℃/時間(<0.017℃/秒)未満であった。この情報に基づき、LightCyclerTMの温度調節を修飾して、3℃ほどの低温度を達成し、0.01℃/秒に近い転移速度を達成した。
高速熱移動率を持つ現在のチャンバーデザインを、ガラスキャピラリーに利用するために、小さな修飾のみが、反応チャンバーに行われた。上記のごとく、さらなる絶縁体をチャンバーの内部および外部に加えた。最も重要なことには、新たな絶縁体を、試料カルーセルの上部に配置して、真鍮差込を介するチャンバーへの熱の高速移動を減少させた。また、さらなる絶縁体を、試料チャンバーの側面に付けた。標準の放射状のチャンバーファンを、軸ファンで置き換えて、ファンモーターへの力を半分に減少させた。図2は、標準加熱コイルの取出および他のチャンバー調整を示す。
変化を最小化するために、標準LightCyclerTMの加熱体として、冷却/加熱源を同一の位置に置いた。システムモデリングから得られる推定されるチャンバー性質を使用して、ワット数出力および寸法に基づいて、ペルチエ冷却/加熱モジュールを選択した(Melcor Materials Electronic Products Corporation, Trenton, New Jersey, Part #CP 1.0-127-05L-1)。2つのヒートシンク(Wakefield Engineering, Wakefield, MA, Part#698-100AB)を入手し、ペルチエモジュールと組合せて使用するために修飾した;モジュールの温かい側および冷たい側の両方につき、1つのヒートシンク。「熱い」ヒートシンクの連続的冷却との最適なペルチエ作動のため、連続した冷却流能力を持つアルミニウムの水浴または冷却浴も構築し、機械化した(図3参照)。上部ヒートシンクを、冷却チャンバー内に置き、下部ヒートシンクを、ペルチエモジュールから反応チャンバーへ延長した。冷却チャンバーに配置された上部ヒートシンクの最終的な形は、1.75インチ(4.4cm)の底部直径および1.2インチ(3.0cm)の高さを持つ円柱状であった。底部ヒートシンクを同じ寸法に切ったが、フィンを修飾して、チャンバーへのヒートシンク浸透を最大化し、ファン回転させた。
試料カルーセルへの熱入力を、60W(3.9A15ボルト)ペルチエモジュール(Melcor Corp. Part # CP 1.0-127-051-1)、2つの修飾されたヒートシンク(上記で言及)およびカスタムデザインされた/カスタム形成されたアルミニウムの冷却浴で達成した。3cm平方ペルチエモジュールを、下部ヒートシンクおよび冷却浴の下面双方を通って、上部ヒートシンク中の4つの6−40テーパー付きの穴へ延びる4つのネジで冷却浴の下面に締め付けた。ネジの締めが、下部ヒートシンクおよび冷却浴の下面の間にモジュールを拘束するような配置とした。熱ペースト(Melcor Corp. Part #TCE-001)を、各界面にて使用して、モジュールから下部ヒートシンクおよび冷却浴への熱移動を促進させた。上部ヒートシンクを、冷却浴に含めて、液体冷却剤に暴露される表面領域を拡大した。デジタル温度計(Physitemp Instruments, Inc.Clifton, NJ)によって読み取られる2つのさらなる熱電対を使用して、ペルチエモジュール性能をモニターした。1つを下部ヒートシンクに置き、他方を上部ヒートシンクの冷却浴内に置いた。両方の熱電対を、熱エポキシ(Melcor Corp. part#TCE-001)で、それぞれのヒートシンクに固定した。
LightCyclerTMによって使用される高ワット数パルス幅変調制御スキームは、ペルチエモジュールと不適合であるため、新たなペルチエモジュール加熱/冷却システムもまた、新たな調節システムを必要とした。結果的に、別々の電力供給およびリニアーコントローラーを構築し、システムに組み込んだ。図5は、修飾されたシステム内の各構成要素の関係を示す。Lab Viewを動かしているコンピューターを使用して、ポンプ活動、圧縮機活動、100W電力供給からの電力出力およびLightCyclerTM用の標準実行ソフトウェアを含む修飾されたシステムの全側面を制御した。図5に示されるごとく、Power Boxは、各構成要素からコンピューターへの入力および出力を流すジャンパーステーションとして作動する。また、Power Boxは、システムの各構成要素の活動を媒介する電力供給および制御エレクトロニクスを収容する。具体的な制御構成要素は、ペルチエモジュールへの電力を調節するカスタム形成リニアーコントローラーおよび圧縮機および冷却剤ポンプの活動を制御する2つのソリッドステートリレー(Crydom Corp., San Diego,Cal., Part #DID07)を含む。リニアーコントローラーは、電流極性制御および電力制御セグメントよりなる。温度フィードバックは、LightCyclerTM標準熱電対を介して起こる。
性能評価を、標準の24試料LightCyclerTM(LC24)、32試料LightCyclerTM(LC32)、および修飾されたLightCyclerTM(modLC24)について、設定温度ランプを実施し、結果を比較することによって達成した。器具は、0.1℃/秒(0.05℃/秒の速度を、modLC24につき使用した)の温度転移速度にて、40℃ないし90℃まで、チャンバー温度を上昇させるものであった。記録された温度追跡を、誤差シグナルに変換し、グラフ化して、標的温度ランプについての温度変動を示した。いずれの時間間隔での標的温度も、0.1℃/秒または0.05℃/秒の勾配を持つ開始および終了温度(それぞれ40°および90℃)を通る線によって表される。いずれかの所与の時間の標的温度を、実際のチャンバー温度から差し引くことにより、誤差シグナルを読み取ることができる。この誤差シグナルを記して、各機械の性能を実施した。最大および最小の誤差読み取りの間の差異を計算することによって決定された全体的な変動(ランの全時間スケールにわたる)、および局所的な最大および最小によって決定される局所的変動(小さな時間スケール、〜10秒)を比較して、温度制御性能を決定した。
ファンの稼働あるなしで、同等の回路モデルのMatLab計算を行った。チャンバーの熱負荷は、(それぞれ、ファンあるなしで)6.1ワットおよび4.8ワットであることがわかった。システムの全熱負荷計算を、さらなる内部および外部絶縁体で反復した(上部および側面のみ)。さらなる絶縁体を計算して、システムの損失を、ファン作動あるなしで、それぞれ3.6および3.1ワットまで減少させた。
試料チャンバーを閉鎖システムに変換することにより、修飾されたLC24の温度制御性能が4倍増加する。標準LightCyclerTM配置において、チャンバー内からの空気は、チャンバーファンの作用によって、連続して、上部空気弁から押し出され、新たな空気は連続して、注入管からチャンバーへ入る。すなわち、適切なチャンバー温度制御は、それが丁度チャンバーよりも優れた加熱体を素速く通るにつれて入ってくる空気の加熱、およびチャンバーファンによるチャンバー空気の適切な混合に依存する。入ってくる空気は迅速に加熱コイルを通過し、入ってくる空気の非−均質の温度に至るため、混合は必要である。すなわち、高速ファン速度は、入ってくる空気を適切に混合するのに必要である。また、熱移動速度は、空気の速度によって決まるため(Hagen, Heat Transfer with Applications, 第一版, Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ (1999))、高速ファン速度は、熱移動速度を試料キャピラリへと上昇させる。すなわち、高速温度循環は可能であり、結果的に、PCR反応の多くの循環は、比較的短い時間間隔で起こり得る。しかしながら、ファン速度および空気流が増加するにつれ、対照表面(加熱体)上の空気暴露時間は減少し、入ってくる空気量のより大きい温度差が存在するだろう。加熱された、入ってくる空気は、より少なく、より均質性に乏しいため、より多くの混合およびより高速のファン速度が必要になる。また、より短い加熱体暴露時間は、小さい時間間隔で適切な電力調整を行うためにより精密なコントローラー精度を必要とする。LightCyclerTMの製造者らは、高速ファン速度に対する最適な調節スキームを発見することに大きな関心を寄せてきた。また、器具のLightCyclerTMラインは、特に、迅速な温度循環のために構築されたものであり、温度移動を遅くするためのものではないことは記されるべきである。
モデルオリゴヌクレオチドシステムは、(1)二本鎖DNA特異的核酸色素SYBR Green Iの蛍光強度をモニタリングすることによって、二次構造融解曲線を実証し、(2)経験的に、二次構造融解温度範囲を決定し、(3)SYBR Green I蛍光を用いて、複数ドメイン融解を実証し、(4)SYBR Green Iを用いて、二次構造の配列特異的融解を実証するように設計された。核酸の複数ドメイン融解は、示差走査熱分析(Kulinski, 1991; Panerら, 1990)を使用し、光学吸収度(Volkerら, 1999)を使用し、ならびに共有結合したフルオロフォア(Vamosi and Clegg, 1998; Volkerら, 1999)をモニタリングすることによって先に報告されているが、複数ドメイン融解決定は、SYBR Green Iといった二本鎖核酸−特異的色素を用いては示されていない。
13の特異的に設計されたモデル核酸オリゴヌクレオチドを、IT Biochem(Salt Lake City, UT)による標準高速促進ホスホルアミダイト化学を用いて、Perceptive BioSystems 8909 MOSS合成器(Framingham, MA)で合成した。合成後、各オリゴヌクレオチドを、標準脱保護および脱塩条件で、C18逆相HPLCを用いて精製した。13のオリゴヌクレオチドの各々は、3塩基対(bp)ないし18bpの可変長のループおよびステム中に4つのヌクレオチドを有する少なくとも1つのヘアピンを含有した(図8参照)。ステム長が9の塩基対およびそれより短いものに対するループ配列は、全て同一であった(−AAAA−)。9を超えるステム長に対するループ配列は、全て−TCCT−であった。全てのステムにおいて、一定のGC含有量を維持しようと努力したが、ステム配列は完全には同一ではなかった。全てのオリゴヌクレオチドの平均的なGC含有量は、約48%であった。図8は、各オリゴヌクレオチドおよびそれらの提唱された二次構造に対する特異的な配列を示す。13の配列から、2つのオリゴヌクレオチドは、ステム配列内にミスマッチを含有し、2つは二次構造(テール)内に組み込まれていないさらなる塩基を有し、1つは異なるステム長(9bpおよび12bp)を持つ複数のヘアピンを含有する。合成に引き続いて、全てのオリゴヌクレオチドを、1xTE’(0.01M EDTAによる1M TRIS−HCLの1:100希釈)中に再懸濁し、Ultraspec2000分光光度計(Pharmacia Biotech, Cambridge, England)を用いて、260/280の割合を取った。配列は既知であったため、核酸濃度を、まず、核酸の公開された光学性質(Borer,"Nucleic Acids", In Handbook of biochemistry and Molecular Biology, 第三版, (Fasman, ed.) CRC Press, Boca Raton, FL (1975) p.589)およびカスタム設計されたソフトウェア(CTWTool-2-18-00, Carl T. Wittwer, University of Utah, SLC, UT)を用いて、各オリゴヌクレオチドにつき、吸光係数を計算することによって、決定した。二次構造立体配座を、20℃および1M NaClの2つのヌクレオチド構造−予測ソフトウェアパッケージ、Prime Designer(Sci-ed Software, Durham, NC)およびMfold(Dr. M. Zuker, Washington University Medical School, St. Louis, MO)を用いて確認した。Prime Designerは、Mfoldが同定した2つのヘアピン構造を同定することができなかった。図9は、Mfoldによって計算されたように、2つのヘアピンを含有するオリゴヌクレオチドの得られた構造を示す。
将来のPCR後反応状態を見越して、各反応は、PCR緩衝液(IT Biochem: 50mM「透明」緩衝液)内に、DNAおよびSYBR Green Iを含有した。3つの構成成分に対して最適化ランを実施した。まず、SYBR Green IおよびDNA濃度の範囲を調べ、引き続いて、緩衝液濃度の範囲を調べた。融解ピークおよびピークの相対的なシグナル対ノイズ比(またはピークの標準偏差)両方の存在を、最適濃度を決定する基準として使用した。標準LightCyclerTMデータ分析ソフトウェア(LCDA 3.0, Idaho Technology Inc, SLC, UT)を用いて、観察された融解ピークの標準偏差を計算した。
平均Tm、標準偏差、およびデルタTm値(ステム配列変動またはオリゴヌクレオチドデザイン差異により、Tmはシフトする)を含む13のオリゴヌクレオチドの各々からの結果は、表2の通りである。特定のオリゴヌクレオチドおよびステムサイズは、2つの左の欄で確認される。Tm1欄の値は、平均Tm値であり、各オリゴに対するnは、右に示されている。融解温度に対する標準偏差は、標準偏差下で示される。2つのヘアピンを含有するオリゴは、両方のヘアピンに対するデータを有する。LC32で得られた9ないし12のヘアピンを除く全てのデータは、修飾されたLC24を用いて入手した。
**は、ヘアピンステム内の1つのミスマッチの存在を示す。
表2.モデルオリゴシステムからの結果の表化。特定のオリゴヌクレオチドおよびステムサイズは、2つの左欄で確認される。Tm1欄の値は、平均Tm値であり、各オリゴに対するnは、右に示されている。融解温度の標準偏差は、標準偏差下で示される.2つのヘアピンを含有するオリゴは、両方のヘアピンに対するデータを有する。LC32で得られた9ないし12のヘアピンを除く全てのデータは、修飾されたLC24を用いて入手した。
y=32.287ln(x)−9.0318
[式中、yは℃で生成物Tmを表し、xは塩基対(bp)のステムサイズである]によって(R2=0.914)で最も適切に示される。最も適合した対数式は、マイクロソフトのExcelによって実行された最小二乗計算によって決定された。図11は、計算された傾向ラインおよびR2値を含む生成物Tmおよびステムサイズ間の関係を示す。
モデルシステムを設計して、下記の目的を各々達成した。
1.二本鎖特異的核酸色素の蛍光活性をモニタリングすることによって、二次構造融解曲線を示す。
2.経験的に、二次構造融解温度範囲を決定する。
3.二本鎖特異的核酸色素蛍光を用いて、複数ドメイン融解を示す。
4.二次構造の配列特異的融解を示す。
これらの目的の各々は、モデルシステムから得られた結果を用いて取り組むことができる。1つのDNA分子内に存在している二次構造は、二本鎖−特異的核酸色素蛍光をモニタリングすることによって検出可能であることを、モデルオリゴヌクレオチドシステムからの結果は示した。また、3bpないし18bpのステム長範囲のヘアピンが融解した温度に関して、60℃の温度範囲を決定した(18°および78℃の間)。ミスマッチまたはテールを含有するオリゴヌクレオチドに対して観察されたTmシフトによって明白になったように、Tm値は配列特有の形で変動した。最終的に、2つのヘアピンドメインを含有する合成オリゴヌクレオチドの融解は、2つの融解ピークを得、すなわち、二本鎖−特異的核酸色素蛍光を用いて、複数ドメイン融解を示した。生成物Tmの配列依存性ならびにTmのステムサイズへの依存性を示すこれらの結果は、Tmの配列依存性に対する先に公開された結果と一致する(Kulinskiら 1991; Panerら, 1990; Ririeら, 1997; Vamosi and Clegg, 1998)。
5S rRNAの複数の融解構成成分を識別する能力は、商業的に入手可能なrRNAを用いて示された。E. Coli MRE600 5S rRNAを、Roche Molecular Diagnostics(Boehringer Mannheim, GmbH, Germany, Part#206911)から入手した。5S rRNA試料を選択して、SYBR Green Iを用いる天然システムの複数ドメイン融解を同定する可能性を実証した。濃度最適化を、モデルオリゴヌクレオチドシステムと同様に行った。最終的な最適化された濃度は、1.0mM RNAおよび1.0mM Mg+2PCR緩衝液(5mMトリス,5mg/ml BSA, および1.OmM Mg2+)中のSYBR Greenの1:15,000原液希釈液であった。(IT Biochem, SLC, UT)。
図12は、SYBR Green Iの存在下で、5S rRNA試料を、0.05℃/秒温度ランプに付すことによって得られた結果を示す。二つ組のラン(n=8)は、融解プロファイルの8つの特徴が反復可能であることを示唆する。融解プロファイルは、81℃および82℃間の低蛍光(−dF/dT)「谷」、および82℃ないし95℃の温度範囲のいくつかの異なる融解構成成分を含有する広い融解転移よりなる。低蛍光「谷」内に、小さなピークが、一般に、81.7℃の平均Tmと共に存在していた。蛍光谷下では、一貫した融解転移は観察されなかった。各ランに対応するTm値は、表3に作表した。1つのケースで、8つのピークのうち2つは同定されなかった。ピーク2、5および6は、最も変動を示した。各ピークに対する平均Tm値および標準偏差は含まれる。ピーク5は、標準偏差0.67℃と共に、Tm値で最高の変動を示した。平均ΔTm値、または1つのピークおよび次のピーク間の温度差は、3.1°、1.1°、1.3°、1.2°、1.2°、1.5°、および1.4°であった。
5S rRNA試料の分析からの予備結果は、8つの同定可能な構成成分または転移を持つ融解曲線プロファイルを得た。どのような可能な説明が存在するにしても、5S rRNA立体配座の特定の構成成分は、未だ、経験的または理論的に、個々の融解転移にリンクされていない。
2 空気注入口
3 円試料カルーセル
4 ステッパーモーター
5 チャンバーファン
6 オプティクス/フィルターアセンブリ
7 試料
8 反応チャンバー
9 24ブラスオフセットガイド
10 励起および収集オプティクス
11 高ワット数加熱コイル
12 青LED
13 フォトダイオード
30 軸ファン
31 絶縁体
40 アルミニウム冷却浴
41 ブラスコネクター
42 ブラスコネクター
43 ゴム管
44 ペルチエモジュール
45 ヒートシンク
46 支柱
47 ゴム吐出口管
48 標準蛍光モニタリング経路
60 コンピューター
62 ポンプ
63 圧縮機
64 ペルチエモジュール
65 冷却管
66 冷却管
67 冷却管
68 アルミニウム冷却浴
69 一方向チェック弁
70 一方向チェック弁
71 100W電力供給
90 モジュール
91 モジュール
93 12ボルト6−リード機械的リレー
94 低電力NPNトランジスタ
95 トランジスタ
93 リレーコイル
97 底部末端
98 電力供給
99 地面
100 ダイオード
101 コンピューター
104 高ワット数NPNトランジスタ
105 作業増幅器
106 0.1オームレジスタ
108 リレー制御
109 リレー制御
110 冷却剤ポンプ
111 空気圧縮機
Claims (30)
- a)一本鎖核酸を、少なくとも50%のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせて、該一本鎖核酸内に、該色素および1つ以上の二本鎖二次構造の間に検出可能な複合体を形成し;次いで
b)該一本鎖核酸の温度を変動させて、該検出可能な複合体中の各該二次構造に対する融解温度(Tm)を決定し、ここに該融解温度は、該一本鎖核酸を特徴付けるTmプロファイルを定義することを特徴とする一本鎖核酸を特徴付ける方法。 - a)少なくとも50%のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素を用いて、第1の一本鎖核酸のTmプロファイルを決定し;次いで
b)第1の一本鎖核酸のTmプロファイルを、第2の一本鎖核酸のTmプロファイルと比較し;ここに該第1および第2の一本鎖核酸間のTmプロファイルの差異は、該第1および第2核酸間の配列の差異を示すことを特徴とする第1および第2の一本鎖核酸の配列間の差を検出する方法。 - 既知の配列を有する核酸と比較した、試料核酸の配列の変化を検出する方法であって、少なくとも50%のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素を用いて、一本鎖核酸のTmプロファイルを決定し、ここに該核酸試料のTmプロファイルおよび既知の配列を有する該核酸のTmプロファイル間の差は、該既知の配列と比較した、該試料核酸の配列の改変を示すことを特徴とする該方法。
- 細胞の種型を同定する方法であって、少なくとも50%のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素を用いて、細胞からの試料rRNAまたはその断片のTmプロファイルを決定し、ここに、該決定されたTmプロファイルおよび既知の種型からの細胞の対応するrRNAまたはその断片のTmプロファイルの間のマッチングが、試料rRNAは既知のrRNA細胞型からのものであることを示すことを特徴とする該方法。
- 該変化が突然変異である請求項3記載の方法。
- 該試料rRNAまたはその断片が、増幅されたrRNA遺伝子またはその断片である請求項4記載の方法。
- 該一本鎖核酸が、増幅された核酸産物である請求項1ないし3のいずれか1記載の方法。
- 該一本鎖核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅産物である請求項7記載の方法。
- 該PCRが非対称的PCRである請求項8記載の方法。
- 該一本鎖核酸が、鎖置換増幅(SDA)、ローリングサークル増幅(RCA)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、転写媒介増幅(TMA)およびリガーゼ連鎖反応(LCR)よりなる群から選択される増幅反応の産物である請求項7記載の方法。
- 該二本鎖核酸−特異的色素が、YO−PRO−1およびYO−YO−1よりなる群から選択される請求項1ないし4のいずれか1記載の方法。
- さらに、該方法が:該Tmプロファイルの該決定前あるいはそれと同時に、該一本鎖核酸を増幅することを特徴とする請求項1ないし3のいずれか1記載の方法。
- 該決定が、核酸の温度を変化させつつ、該二本鎖核酸−特異的色素の蛍光発光を測定することによるものである請求項1ないし4のいずれか1記載の方法。
- 該温度が、0.01℃ないし0.1℃/秒の速度にて変化する請求項13記載の方法。
- 蛍光の変化が、該一本鎖核酸の二次構造の変化を示す請求項13記載の方法。
- 該決定が、該第1の一本鎖核酸を少なくとも50%のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせて、該第1の一本鎖核酸内で該色素および1つ以上の二本鎖二次構造の間の検出可能な複合体を形成し、該組合せの温度を変化させつつ、該二本鎖核酸−特異的色素の蛍光発光を測定することによるものである請求項2ないし4のいずれか1記載の方法。
- 該温度が、0.01℃ないし0.1℃/秒の速度にて変化する請求項16記載の方法。
- 蛍光の変化が、該一本鎖核酸の二次構造の変化を示す請求項16記載の方法。
- 該増幅で使用されるプライマーが、既知の配列を有する該核酸の配列から由来する請求項7記載の方法。
- 該細胞が細菌細胞である請求項4記載の方法。
- 該細胞が植物細胞である請求項4記載の方法。
- 該増幅rRNA遺伝子またはその断片が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって生成される請求項6記載の方法。
- 該PCRが非対称的PCRである請求項22記載の方法。
- 該rRNA遺伝子またはその断片が、鎖置換増幅(SDA)、ローリングサークル増幅(RCA)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、転写媒介増幅(TMA)およびリガーゼ連鎖反応(LCR)よりなる群から選択される増幅反応によって生成される請求項6記載の方法。
- 該決定が、該rRNA遺伝子またはその断片を少なくとも50%のパーセント飽和を有する二本鎖核酸−特異的色素と組み合わせて、該増幅rRNA遺伝子またはその断片内で、該色素および1つ以上の二本鎖二次構造の間に検出可能な複合体を形成し、該組合せの温度を変化させつつ、該二本鎖核酸−特異的色素の蛍光発光を測定することによるものである請求項4記載の方法。
- 該Tmプロファイルの温度範囲が、20℃および100℃の間である請求項1ないし4のいずれか1記載の方法。
- 該温度範囲の該下限が、40℃未満である請求項26記載の方法。
- 該温度範囲の該下限が、35℃未満である請求項27記載の方法。
- 該色素が、少なくとも80%のパーセント飽和を有する請求項1ないし4のいずれか1記載の方法。
- 該色素が、少なくとも90%のパーセント飽和を有する請求項1ないし4のいずれか1記載の方法。
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