JPH10332701A - 核酸融解温度測定法 - Google Patents

核酸融解温度測定法

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JPH10332701A
JPH10332701A JP9147825A JP14782597A JPH10332701A JP H10332701 A JPH10332701 A JP H10332701A JP 9147825 A JP9147825 A JP 9147825A JP 14782597 A JP14782597 A JP 14782597A JP H10332701 A JPH10332701 A JP H10332701A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】核酸の融解温度（Ｔｍ）を簡便かつ高精度に決
定することを可能とする均一系での一段階の方法を提供
する。 【解決手段】試料中の特定核酸の配列に相補的な配列を
含むインターカレーター性蛍光色素で標識されたプロー
ブを用い、該標識インターカレーター性蛍光色素が標的
核酸と相補結合を形成するとその二本鎖オリゴヌクレオ
チドにインターカレーションし、さらにその蛍光特性が
変化することから、試料にプローブを添加しその反応液
の蛍光強度を温度を変化させながら測定することを特徴
とする簡便で高感度な均一系での融解温度の分析方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等
の遺伝子混合中に含まれると予想される特定核酸配列の
分析方法に関し、遺伝子診断等の臨床診断分野での利
用、並びに未知遺伝子の探索等の分野での利用に有用で
あり、特に未知遺伝子の対照遺伝子配列に対する相同性
を評価する方法、並びに遺伝子の変異を検出する方法と
して有用である。
【０００２】
【従来の技術】核酸は、特定の塩基間で相補結合を形成
し安定化する性質を有し、その安定性は温度に鋭敏に依
存することが知られている。そこで、核酸の融解温度
（Ｔｍ）の測定から、未知遺伝子の対照遺伝子に対する
核酸配列上の類似性を評価することが可能となる。例え
ば、遺伝子の同定を行う必要のある分子進化学や細菌学
の領域では、生物試料から得られた長い核酸配列を対象
にするが、その核酸配列を決定することは実際上容易で
はないことから、未知核酸と既知核酸の混合溶液におい
て形成された相補結合複合体の融解温度を測定すること
によって既知の核酸配列に対する相同性を明らかにする
ことが行われる。また、遺伝病には特定の核酸配列の一
部に変異が生じたことに起因する場合が知られている
が、試料中の核酸のその注目する核酸配列に相補的な配
列からなるオリゴマー（核酸プローブ）を用い、これと
試料中の標的核酸との複合体の融解温度を測定し、その
値を対象とする変異のない核酸の場合のそれと比較する
ことによって標的核酸配列中の変異の有無を判定するこ
とも行われてきた。
【０００３】Ｔｍの測定には、核酸の濃色効果（ｈｙｐ
ｅｒｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ）を用いる方法が従来から一
般的に行われてきた。核酸は波長２６０ｎｍに分光学的
な吸収を有するが、１本鎖核酸から２本鎖核酸を形成す
るとその割合に応じて吸光度が顕著に減少することか
ら、試料温度を変化させながら吸光度を測定し、得られ
た吸光度の温度に対するＳ字型の曲線からその中点をＴ
ｍとする。
【０００４】Ｔｍは、核酸の相補結合を形成する配列の
長さ（ｎ）、それに占めるＧ及びＣの割合（％ＧＣ）、
溶液中の塩（μ）及び変成剤の濃度（％ＦＡ）に依存し
ていることが知られ、より一般的には、Ｔｍ＝８１．５
＋１６．６ｌｏｇ（μ）＋０．４１（％ＧＣ）−５００
／ｎ−０．６１（％ＦＡ）なる経験式が得られている。
【０００５】しかしながら、吸光度の測定からＴｍを求
める上記の方法は、試料中の比較的微量の核酸に対して
は、有効な手段とは言えない。ひとつには、吸光度測定
は、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｒｒの法則から一般的に２．
０ＯＤ以下で測定すべきであるとされ、一方一般的な測
定器の性能上の制約から０．１ＯＤ付近が感度の限界と
されているからである。これは、核酸の濃度にして、お
よそ３―１００μｇ／ｍｌの範囲に限定されることを意
味する。
【０００６】近年、ポリメレースチェインリアクション
（ＰＣＲ）法が開発されたことにより、試験管内条件下
で試料中の特定核酸の特定領域を増幅することが可能と
なった。そこで、ＰＣＲ法を用いて試料中の特定核酸の
特定領域を増幅した後、その反応液を試料として用いる
ことが可能であるが、その場合でも数１０コピーの核酸
からはng程度の増幅産物で吸光度を用いた上記の方法を
適用するには十分とはいえない。
【０００７】さらに詳細な熱力学的な検討からは、Ｔｍ
が核酸の濃度自身にも依存していることも明らかにされ
ている（Breslauer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 8
3, 3746-50, 1986 ）。Breslauer らの研究成果によれ
ば、例えば配列atgcatgcatgcatgcatgcの場合、塩濃度５
０ｍＭの条件下で、核酸濃度が５０ｎＭ、５ｎＭ、０．
５ｎＭ及び０．０５ｎＭのそれぞれに対して融解温度６
７．５、６３．５度Ｃ、５９．５度Ｃ及び５５．６度Ｃ
を与える。
【０００８】そこで、より感度の良好なＴｍの測定方式
が求められる。
【０００９】例えば従来より、インターカレーター性蛍
光色素が２本鎖核酸に配位して蛍光を増感する性質を用
いて試料中に低濃度で存在する標的核酸に対しても高感
度にＴｍを求める方法が知られている。この方法では、
試料溶液にプローブとともにインターカレーター性色素
を加え、溶液の温度を変化させながら蛍光強度を測定す
る。高温では核酸は相互に遊離しているが、溶液の温度
を下げるに従い標的核酸とプローブとの複合体が形成さ
れ、これに伴い蛍光強度が増大が観測される。しかしな
がら、この方式では、たとえば試料溶液を降温させなが
ら蛍光を測定する場合、試料中には標的核酸以外の核酸
が含まれていること、また本来室温では２本鎖として存
在する相補鎖どうしが再会合することや、標的核酸が１
本鎖の場合であっても内部に２次構造を形成して安定化
することから、それらの相補結合領域にもインターカレ
ーターが配位し、これらに由来するバックグラウウンド
蛍光が対象とする核酸とプローブとの複合体の融解温度
の正確な決定を阻害することとなる。
【００１０】そこで、核酸吸着膜を用いたドットハイブ
リダイゼーション法による融解温度の測定も試みられて
いる。すなわち、核酸を容易に吸着固定することが可能
な膜が商業的に流通しているが、この表面に予め蛍光色
素やアイソトープを標識したプローブと標的核酸との複
合体を含む溶液をスポットし、乾燥した後、膜を所定の
塩濃度のバッファーに浸し、温度を変化させては膜を取
り出し膜表面に残った標識の蛍光強度あるいは放射活性
を測定する。
【００１１】しかしながら、前記の方法は、操作が煩雑
で信頼できる結果を得るには熟練を要する。例えば、よ
り信頼性の高い結果を得る目的では、複合体をスポット
した複数の膜を用意し所定温度に恒温したバッファーに
所定時間膜を浸した後膜を取り出し蛍光強度あるいは放
射活性の測定を行うことが行われるが、これによって操
作がさらに煩雑となり労力も伴うことから、特に多数の
検体を処理する必要のある臨床検査の現場では新たな課
題を生じる。
【００１２】また、プローブと標的核酸との相補結合を
形成させるには、反応液へプローブを添加後、二本鎖Ｄ
ＮＡを一旦融解し一本鎖とするための加温操作（デネー
チャーリング／denaturing）と、その後冷却してプロー
ブＤＮＡに標的ＤＮＡとの二本鎖ＤＮＡを形成させるた
めの操作( アニーリング／annealing ）も、実際上は不
可欠である。さらに、条件の決定や結果の解析におい
て、膜のインキュベーションの過程で複合体そのものの
膜からの剥離の可能性にも十分留意する必要もある。
【００１３】一方、発明者らによって、標的核酸の特定
配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオ
チドにインターカレーター性蛍光色素を標識し、特定核
酸と相補結合すると形成された二本鎖オリゴヌクレオチ
ドにインターカレーションしその蛍光特性を変化するよ
うに設計した、特定の核酸配列の認識機能を具備するイ
ンターカレーター性蛍光色素標識プローブが開発された
（特願平７−１８５５９９号公報／ＥＰ公開第７１４９
８６号公報／Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９
６））参照）。このインターカレーター性蛍光色素標識
を既知配列のプローブとして用いれば、プローブが特定
核酸と相補結合を形成すると標識されているインターカ
レーター性蛍光色素の蛍光特性が変化することから、相
補結合を形成していないプローブを分離することなく、
その相補結合の形成の有無及び形成された相補結合体の
定量が可能となる。そこで、該プローブを試料中の特定
核酸配列の分析を目的とする融解温度の測定に対して用
いる方法が考案されることとなる。
【００１４】本発明は、以上の観点からなされたもので
あり、その目的はＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合中に含
まれる特定核酸配列の分析方法に関し、核酸の融解温度
（Ｔｍ）を簡便かつ高精度に決定することを可能とする
均一系での一段階の方法であって、遺伝子診断等の臨床
診断分野での利用、並びに未知遺伝子の探索等の分野で
の利用に有用で、未知遺伝子の対照遺伝子配列に対する
相同性を評価する方法、並びに遺伝子の変異を検出する
方法を提供するところにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】而して、かかる目的の実
現のためになされた本発明よりなる核酸の融解温度測定
法の特徴は、試料中の特定核酸の配列に相補的な配列を
含むインターカレーター性蛍光色素で標識されたプロー
ブを試料に添加し、該標識インターカレーター性蛍光色
素が標的核酸と相補結合を形成するとその二本鎖オリゴ
ヌクレオチドにインターカレーションし、その蛍光特性
が変化することから、その反応液の蛍光強度を温度を変
化させながら測定することによって融解温度を決定する
ところにある。
【００１６】本発明によれば、プローブが標的核酸と相
補結合を形成するとプローブに標識されているインター
カレーター性蛍光色素の蛍光強度が増加することから、
相補結合に寄与しなかった余剰プローブを分離する工程
を必要とせずに、その相補結合の形成の有無の検出及び
形成された相補結合体の定量が可能となり、反応液の温
度を変えながらその蛍光強度を測定することによって特
定の核酸の融解温度を決定することを可能とする均一系
での簡便な一段階の分析方法が提供される。
【００１７】従って、本発明によれば、試料中の標的核
酸以外の２本鎖核酸や、本来室温では２本鎖として存在
する相補鎖どうしの再会合、ならびに標的核酸が１本鎖
の場合でもみられる内部が２次構造が形成される場合に
おいても、インターカレーター標識プローブが標的核酸
を配列特異的に識別し標的核酸と複合体を形成すること
によって蛍光強度を増大することから、試料溶液にプロ
ーブとともに単にインターカレーター性色素を添加して
溶液の蛍光強度の温度変化を測定する融解温度測定方式
におけるバックグラウウンド蛍光に由来する課題を回避
することが可能となる。
【００１８】そこで、試料中の核酸のその注目する核酸
配列に相補的な配列からなるインターカレーター標識プ
ローブを用いて試料中の標的核酸との複合体の融解温度
を測定すれば、その値を変異のない核酸との複合体の融
解温度と比較することによって標的核酸配列中の変異の
有無を判定することが可能となる。また、このようにし
て融解温度が得られれば、これとは逆に、インターカレ
ーター標識プローブを含む試料溶液の蛍光を融解温度近
傍で測定しその値を変異のない核酸試料の測定値と比較
することによる変異の検出を目的とする簡便な一段階の
分析方法も提供される。例えば、Ｃ型肝炎ウイルスには
そのＲＮＡの配列によって複数のタイプがあり、インタ
ーフェロンの治療効果がそれらのタイプに依存している
ことが知られている。このような場合には、特に、その
治療計画を立案する上で臨床的に有効な手段を提供する
こととなる。
【００１９】また、本発明によれば、複合体の存在を蛍
光で検出することから、一般的に、吸光度の測定からＴ
ｍを求める方法に比べて、試料中の比較的微量の核酸に
対しても有効な手段を提供することになり、ＰＣＲ法に
よっても数ng程度の増幅産物しか期待できない標的核酸
を数１０コピーしか含まない臨床試料も分析の対象とす
ることが可能である。
【００２０】一方、本発明によれば、均一系での分析が
可能で相補結合に寄与しなかった余剰プローブを分離す
る工程を必要としないことから、核酸吸着膜を用いたド
ットハイブリダイゼーション法による融解温度の測定に
おける、複合体を保持した膜の調製、バッファー中での
インキュベーション、またその後の膜の洗浄等の操作が
不要で、操作がより簡便で労力も軽減され、特に短時間
に多数の検体の処理が要求される臨床検査の現場での適
応も可能となる。
【００２１】以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】本発明で使用するプローブは、標的核酸に
相補的な核酸配列を含むオリゴヌクレオチドに、二本鎖
ＤＮＡにインターカレーションすることによって蛍光特
性が変化するインターカレーター性蛍光色素で標識した
ものである（特願平７−１８５５９９号公報／ＥＰ公開
第７１４９８６号公報／Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＲｅ
ｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１
９９６）参照）。ここで、インターカレーター性蛍光色
素としては、二本鎖ＤＮＡにインターカレーションし蛍
光特性が変化するものであれば特に制限はないが、イン
ターカレーションにより蛍光強度が増加する性質を有す
るものが測定の容易性等の点から好ましく、特に蛍光強
度の変化の著しいチアゾールオレンジ、オキサゾールイ
エロー又はそれらの誘導体が好ましい。
【００２３】インターカレーター性蛍光色素は、共有結
合等によってオリゴヌクレオチドへ標識されるが、適当
な分子長のリンカーを介して標識されてもよい。リンカ
ーとしては、インターカレーター性蛍光色素が二本鎖Ｄ
ＮＡにインターカレーションすることを妨げない分子で
あれば特に制限はないが、両末端に官能基を有する二官
能性炭化水素から選択されるリンカー分子は、オリゴヌ
クレオチドへの修飾を行う上で簡便で好ましい。また例
えば、市販の試薬セット（Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆ
ｉｅｒ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用することもでき
る。インターカレーター性蛍光色素のオリゴヌクレオチ
ドへの標識部位は、オリゴヌクレオチドの５’末端、
３’末端又は中央部分等、インターカレーター性蛍光色
素の二本鎖ＤＮＡへのインターカレーションが妨げられ
ず、かつ、オリゴヌクレオチドの標的核酸との相補結合
を阻害しない限り、いずれの部位であっても良い。な
お、プローブの標的核酸に相補的な塩基配列部分の長さ
は、標的核酸に対する特異性を担保するため、６―１０
０ヌクレオチド、特に１０―３０ヌクレオチドとするこ
とが好ましい。
【００２４】本発明における反応液の蛍光測定には、市
販の蛍光分光光度計を用いればよく、反応液にインター
カレーターの吸収波長で励起光を照射しその蛍光波長で
蛍光強度の測定が可能であれば特に制限はない。反応液
の温度を連続的に変えながら蛍光を測定するには、例え
ば、一旦反応液を完全融解温度に維持した後、反応液を
室温に維持された蛍光分光高度計に移し、反応液が室温
に向かって徐冷されていく過程にてその温度と蛍光強度
を同時に測定すればよい。反応液の温度のモニターに
は、蛍光測定装置内部に保持された反応液の温度の測定
が可能な手段であれば特に制限はない。この目的に、微
少な感温端子を有し温度変化を電気信号として遠隔にて
記録することが可能な例えば熱伝対等の手段が利用でき
る。当然のことながら、反応液の温度を希望の温度に維
持可能な恒温そうを具備した蛍光光度計を用いることも
可能である。
【００２５】前記した試料は、目的とする特定核酸を含
むと予想される試料を意味するが、本発明の実施に先立
ち、試料について特定核酸の増幅等を実施することがで
きる。かかる増幅は、特定核酸をとする増幅であれば特
に制限はないが、例えば、ポリメレースチェインリアク
ション（ＰＣＲ）法やＮＡＳＢＡ法（例えばJournalof
Virological Methods, 43, 177-188 頁、1993年参
照）、特願平９−１０９９６号に示した増幅が特に好ま
しい。ＮＡＳＢＡ法による増幅を簡単に述べれば、図７
に概略を示した通り、試料に２本の標的核酸特異的なプ
ライマーとＡＭＶ逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮＡポ
リメレースからなる３種の酵素を含む溶液を添加し、一
定温度でインキュベーションを行うことで、それらの酵
素の協奏的な作用によって標的核酸配列に相補的な配列
からなるＲＮＡを指数関数的に増幅するのである。ここ
で、用いる２本の標的核酸特異的なプライマーの一方
は、その上流側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配
列を、下流側には前記特定核酸に相補的な配列を隣接し
て有する。このようにして生成されたＲＮＡについて本
発明の測定を実施することが例示できる。なお、ポリメ
レースチェインリアクション（ＰＣＲ）法によって特定
核酸を増幅する際に使用するＤＮＡポリメレース等の試
薬も、一般に使用される試薬で良い。
【００２６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例により更に
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定
されるものではない。
【００２７】実施例１ 本発明の分析法により、標的核酸がDNA とRNA の場合の
それぞれについて融解温度Ｔｍを求めた。
【００２８】1)(1) インターカレーター性蛍光色素標識
プローブ（YO-271）のみ、(2)YO-271 および標的DNA
（TEMP271 ）、(3)YO-271 および標的RNA （TEMP271-RN
A ）を含む反応液１４０μｌを蛍光測定用セルに分注し
た。ここで、用いた物質及び試薬組成は以下の通りであ
る。
【００２９】（インターカレーター性蛍光色素標識プロ
ーブ） YO-271：5'-CTCGC＊GGGGGCTG-3' ； ＊はオキサゾールイエロー（YO）の標識位置 （標的DNA ） TEMP271 ：5'-GTGCCCCCGCGAG-3' ； HCV cDNA塩基配列番号２２１〜２３３（塩基番号は加藤
ら（Kato, N., Hijikata, M., Ootsuyama, Y., et al.
(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528）
による）を含む。YO-271と３〜１３番目が相補的であ
る。
【００３０】（標的RNA ） TEMP271-RNA ：5'-GUGCCCCCGCGAG-3' （反応液組成） ×１ SSC 1mM EDTA 50nM YO-271 50nM TEMP271あるいはTEMP271-RNA 2)反応液にミネラルオイル１５０μｌを添加した。
【００３１】3)蛍光測定用セル内の反応液温度をモニタ
ーしながら、約８４℃から約２６℃まで序冷した。同時
に励起波長４９０nm, 蛍光波長５１０nmで蛍光強度を測
定した。
【００３２】(1)(2)(3) のそれぞれの場合において、８
０℃における蛍光強度を１としたときの相対蛍光強度の
変化を図１に示した。特定の温度における相対蛍光強度
からYO-271のみの相対蛍光強度を差し引いた結果を図２
に示した。図２からTm値を読みとった結果( 蛍光による
Tm測定結果) を表１に示した。
【００３３】
【表１】
【００３４】以上の通り、DNA-DNA ２本鎖よりDNA-RNA
２本鎖の方がTm値が高くなるという報告と一致する結果
が得られた。５０nMという低濃度（２６０nmにおける吸
光度測定の場合の１／３０程度）のプローブ・標的核酸
を用いて、Tm値を測定することが可能となった。
【００３５】以上から、本発明によって特定核酸を配列
特異的に高感度に検出できることが確認できた。
【００３６】実施例２ 本発明の分析法により、インターカレーター性蛍光色素
標識プローブを用いた蛍光測定により、点変異の存在す
る標的RNA のＴｍ値を調べた。
【００３７】1)(1) プローブ（YO-271）のみ、(2)YO-27
1 及び標的核酸RNA （TypeII-RNA）、(3)YO-271 および
標的核酸RNA （ Type III -RNA）を含む反応液１４０μ
ｌを蛍光測定用セルに分注した。ここで、用いた物質及
び試薬組成は以下の通りである。 （標的核酸DNA ）Ty
peII-RNA：5'-GUGCCCCCGCGAG-3' 、HCV 塩基配列番号２
２１〜２３３（加藤ら）を含む。YO-271と３〜１３番目
が相補的 （標的核酸RNA ） TypeIII -RNA：5'-GUGCCCCCGCAAG-3' 、 Type II-RNAの
配列の１１番目のGが A に変異 （反応液組成） 40mM Tris ・HCl,pH8.0 25mM KCl 4mM MgCl2 50nM YO-271 50nM Type II-RNAあるいはTypeIII -RNA 2)蛍光測定用セルにミネラルオイル１５０μｌを添加し
た。
【００３８】3)蛍光測定用セル内の反応液温度をモニタ
ーしながら、約８５℃から約２６℃まで徐冷した。同時
に励起波長４９０nm, 蛍光波長５１０nmで蛍光強度を測
定した。
【００３９】(1)(2)(3) のそれぞれの場合において、８
０℃における蛍光強度を差し引いた蛍光強度の変化を図
３に示した。特定の温度における蛍光強度からYO-271の
みの蛍光強度を差し引いた結果を図４に示した。図４か
らTm値を読みとった結果( 蛍光によるTm測定結果) を表
２に示した。
【００４０】
【表２】
【００４１】以上の通り、TypeII-RNAとTypeIII -RNAで
Tm値に１０℃の差が認められた。以上から、本発明によ
って、特定核酸配列の一塩基の変異をホモジニアス系で
高感度に検出できることが確認できた。
【００４２】実施例３ 本発明のの分析法により、一塩基の変異の有無の判定を
行った。
【００４３】1)(1) プローブ（YO-271）のみ(2) YO-271
と標的DNA （TEMP271 及び標的DNA３〜１３のそれぞ
れ）を含む反応液１４０μｌを蛍光測定用キュベットに
分注した。ここで、用いた物質及び試薬組成は以下の通
りである。
【００４４】（標的DNA ）HCV cDNA塩基配列番号２２１
〜２３３（加藤ら）を含み、YO-271と３〜１３番目が相
補的である。 TEMP271 ：5'-GTGCCCCCGCGAG-3' DNA ３：5'-GTACCCCCGCGAG-3' DNA ４：5'-GTGACCCCGCGAG-3' DNA ５：5'-GTGCACCCGCGAG-3' DNA ６：5'-GTGCCACCGCGAG-3' DNA ７：5'-GTGCCCACGCGAG-3' DNA ８：5'-GTGCCCCAGCGAG-3' DNA ９：5'-GTGCCCCCACGAG-3' DNA １０：5'-GTGCCCCCGAGAG-3' DNA １１：5'-GTGCCCCCGCAAG-3' DNA １２：5'-GTGCCCCCGCGTG-3' DNA １３：5'-GTGCCCCCGCGAA-3' （反応液組成） 10mM Tris ・HCl ，pH8.3 50mM KCl 50nM YO-271 50nM TEMP271あるいは標的核酸DNA ３〜１３ 2)セル温度３７℃および５１℃において、励起波長４９
０nm, 蛍光波長５１０nmの蛍光強度を測定した。
【００４５】３７℃および５１℃で(1)(2)のそれぞれの
場合について蛍光強度を測定し、YO-271のみの蛍光強度
を差し引いた値を図５に示した。３７℃での蛍光強度
は、変異の位置によって差がみられ、DNA １１では最も
低い値を示した。一方、５１℃では、相補的なTEMP271
の場合を除き、蛍光の増加は認められなかった。
【００４６】本発明によって、位置特異的に一塩基の変
異の有無のみならずその位置に関する情報も得られるこ
とが確認された。
【００４７】実施例４ 試料中の核酸のその注目する核酸配列に相補的な配列か
らなるインターカレーター標識プローブを用いて試料中
の標的核酸との複合体の融解温度を測定すれば、その値
を変異のない核酸との複合体の融解温度と比較すること
によって標的核酸配列中の変異の有無を判定することが
可能となる。また、このようにして融解温度が得られれ
ば、これとは逆に、インターカレーター標識プローブを
含む試料溶液の蛍光を融解温度近傍で測定しその値を変
異のない核酸試料の測定値と比較することによる変異の
検出を目的とする簡便な一段階の分析方法も提供され
る。
【００４８】そこで、本願請求項７の分析法を用いて、
慢性C 型肝炎患者血清でTypeIII （岡本ら）血清5 検
体、TypeII・TypeIII 重感染血清３検体およびTypeII血
清３検体について、 Type IIに相補的な配列を含むプロ
ーブを用いて融解温度近傍での蛍光強度の測定からHCV
RNA の点変異のホモジニアス検出が可能か調べた。
【００４９】1)有機溶媒及び蛋白質変性剤を用いる市販
の核酸抽出キット（東ソー（株）製）を用いて、血清検
体のそれぞれ２００μl より核酸抽出を行った。
【００５０】2)抽出したRNA 沈殿をサンプル希釈液４０
μl に溶解し、このうち１０μl をサンプルとして測定
に用いた。
【００５１】（サンプル希釈液の組成） 10mM Tris ・HCl(pH8.0) 0.1mM EDTA 100 μg/ml酵母RNA 1mM DTT 2U/ μl RNase Inhibitor 3)RTカクテル、5 μl をPCR 用チューブに分注し、調製
したサンプルおよび陰性コントロールとして注射用蒸留
水10μl を添加した。
【００５２】（RTカクテルの組成） 30mM Tris ・HCl(pH8.3) 150mM KCl 13.6mM MgCl2 4.3mM dNTPs 3mM DTT 3U/ μl RNase inhibitor 6U/ μl MMLV逆転写酵素 3.6 μM プライマーＲ： 5'-GCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' 4)サーマルサイクラーにて逆転写反応を行った。
【００５３】（逆転写反応条件） 42℃、10分間 99℃、6 分間 5)PCR カクテル、60μl を添加した。
【００５４】（PCR カクテルの組成） 10mM Tris ・HCl(pH8.3) 50mM KCl 1.6mM MgCl2 0.025 ％ノニデットP-40 37.5U/mlホット・スタート専用Taq DNA ポリメラーゼ 0.3 μM プロモーター・プライマー： 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACAACACTCCACCATAGATCACTCCCCTG-3' 6)サーマルサイクラーにてPCR を行った。
【００５５】（PCR 条件） 1) 95 ℃、9 分間 引き続き、以下の2)〜4)より成るサイクルを40サイクル
行った。 2) 95 ℃、30秒間 3) 67 ℃、30秒間 4) 72 ℃、1 分間 7)PCR 反応液70μl と転写反応液65.3μl を混合した。
【００５６】（転写反応液の組成） 75.3mM Tris ・HCl(pH8.0) 15.1mM MgCl2 10.7mM DTT 0.86mM NTPs 4.3mM スペルミジン 2.2U/ μl RNase Inhibitor 53.6nM YO-271 8)３０U ／μｌのSP6 RNA ポリメラーゼを４．７μｌ添
加する。
【００５７】9)37℃にて、30分間反応させた。
【００５８】10) 転写反応液に２．８μｌの０．５M ED
TAを添加した。
【００５９】11) 転写反応液を蛍光分光光度計内で６５
℃に保温した蛍光測定用セルにうつし、励起波長490nm
、蛍光波長510nm において蛍光強度を測定した。
【００６０】65℃で測定した蛍光強度から陰性コントロ
ールの蛍光強度を差し引いた結果を図６に示した。 Typ
e III に比べ、TypeIIは有意に高い蛍光強度を示した。
Type II・TypeIII 重感染についても、血清中のTypeII
HCV RNA 量が微量であると考えられる１検体を除き高い
蛍光強度を示した。
【００６１】以上の通り、TypeIIに相補的な配列からな
る発蛍光プローブによって、TypeIIのHCV RNA のみをホ
モジニアスに検出することが可能であると結論できた。
【００６２】インターカレーター標識プローブを含む試
料溶液の蛍光を融解温度近傍で測定し、その値を変異の
ない核酸試料の測定値と比較することによって変異の検
出が可能であることが確認できた。
【００６３】
【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、プローブが標的核酸と相補結合を形成すると
プローブに標識されているインターカレーター性蛍光色
素の蛍光強度が増加することから、相補結合に寄与しな
かった余剰プローブを分離する工程を必要とせずに、そ
の相補結合の形成の有無の検出及び形成された相補結合
体の定量が可能となり、反応液の温度を変えながらその
蛍光強度を測定することによって特定の核酸の融解温度
を決定することを可能とする均一系での簡便な一段階の
分析方法が提供される。
【００６４】従って、本発明によれば、インターカレー
ター標識プローブが標的核酸を配列特異的に識別し標的
核酸と複合体を形成することによってその蛍光強度が変
化することから、試料中に標的核酸以外の２本鎖核酸
や、２次構造を内部に持つ１本鎖の標的核酸が共存する
場合においても、これらに由来するバックグラウウンド
蛍光に妨害されることなく標的核酸とプローブとの複合
体の融解温度の測定が可能となる。
【００６５】また、試料中の核酸のその注目する核酸配
列に相補的な配列からなるインターカレーター標識プロ
ーブを用いて試料中の標的核酸との複合体の融解温度を
測定すれば、その値を変異のない核酸との複合体の測定
結果と比較することによって標的核酸配列中の変異の有
無の判定が可能となる。このようにして融解温度が得ら
れれば、これとは逆に、インターカレーター標識プロー
ブを含む試料溶液の蛍光を融解温度近傍で測定しその値
を変異のない核酸試料の測定値と比較することによる変
異の検出を目的とする簡便な一段階の分析方法も提供さ
れる。例えば、Ｃ型肝炎ウイルスにはそのＲＮＡの配列
によって複数のタイプがあり、インターフェロンの治療
効果がそれらのタイプに依存していることが知られてい
る。このような場合には、特に、その治療計画を立案す
る上で臨床的に有効な手段を提供することとなる。
【００６６】また、本発明によれば、複合体の存在を蛍
光で検出することから、一般的に、吸光度の測定からＴ
ｍを求める方法に比べて、試料中の比較的微量の核酸に
対しても有効な手段を提供することになり、特にＰＣＲ
法によっても数ng程度の増幅産物しか期待できない微量
の標的核酸しか含まない臨床試料も分析対象とすること
が可能である。
【００６７】一方、本発明によれば、均一系での分析が
可能で相補結合に寄与しなかった余剰プローブを分離す
る工程を必要としないことから、操作がより簡便で労力
も軽減され、特に短時間に多数の検体の処理が要求され
る臨床検査の現場での適応も可能で、さらに自動化も容
易である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プローブのみ及びプローブと標的核酸
の混合液の温度変化に対する蛍光の変化を示す図であ
る。
【図２】図２は、図１に示したプローブと標的核酸の複
合体の融解曲線からプローブのみの結果を差し引いた複
合体の融解曲線を示す図である。
【図３】図３は、プローブのみ及びプローブと標的核酸
の混合液の温度変化に対する蛍光の変化を示す図であ
る。
【図４】図４は、図３に示したプローブと標的核酸の複
合体の融解曲線からプローブのみの結果を差し引いた複
合体の融解曲線を示す図である。
【図５】図５は、３７℃及び５１℃に蛍光強度と変異の
位置との関係を示す図である。
【図６】図６は、臨床サンプルでの６５℃での蛍光強度
の測定結果を示す図である。
【図７】図７は、ＮＡＳＢＡ法による核酸増幅を行う場
合についてその概略を示すものである。

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料中の特定核酸の配列に相補的な配列を
    含むインターカレーター性蛍光色素で標識されたプロー
    ブを用い、該プローブを試料に添加しその反応液の蛍光
    強度を温度を変化させながら測定する工程からなること
    を特徴とする核酸融解温度測定法。
  2. 【請求項２】前記インターカレーター性蛍光色素で標識
    されたプローブが、試料中の標的核酸とが結合し複合体
    を形成し、複合体を形成していない場合と比較して蛍光
    特性が変化することを特徴とする請求項１に記載の分析
    方法。
  3. 【請求項３】前記インターカレーター性蛍光色素が、試
    料中の標的核酸とが結合し複合体を形成した場合、該イ
    ンターカレーター性蛍光色素が生成した該複合体にイン
    ターカレーションする性質を有することを特徴とする請
    求項１に記載の分析方法。
  4. 【請求項４】前記複合体が、試料中の標的核酸との前記
    プローブとの相補結合によって形成されたものであるこ
    とを特徴とする請求項２及び３に記載の分析方法。
  5. 【請求項５】前記試料の特定核酸を測定行程に先立って
    ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法によっ
    て増幅する工程を含む請求項１に記載の分析方法。
  6. 【請求項６】前記試料の特定核酸を測定行程に先立って
    ＮＡＳＢＡ法によって増幅する工程を含む請求項１に記
    載の分析方法。
  7. 【請求項７】前記測定工程に先立って、前記試料の特定
    核酸を鋳型として、ＲＮＡポリメレースのプロモーター
    配列及びその下流域に前記特定核酸の核酸配列（特定核
    酸配列）を有する二本鎖ＤＮＡを生成するＤＮＡ生成工
    程を含む請求項１に記載の分析方法。
  8. 【請求項８】前記ＤＮＡ生成工程に引き続き、該反応液
    に少なくともＲＮＡポリメレース、リボヌクレオシド三
    燐酸及び生成されるＲＮＡに相補的な配列を含むインタ
    ーカレーター性蛍光色素で標識されたプローブを添加
    し、一定温度において特定核酸配列を有する一本鎖ＲＮ
    Ａを生成するＲＮＡ生成工程を含む請求項５、６又は７
    に記載の分析方法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007097492A (ja) * 2005-10-05 2007-04-19 Shimadzu Corp 融解曲線測定による遺伝子増幅産物の解析方法
WO2008084672A1 (ja) * 2007-01-10 2008-07-17 Arkray, Inc. 光学検出装置の性能確認方法およびそれに用いる標準試薬
JP2009189296A (ja) * 2008-02-14 2009-08-27 Sony Corp 核酸検出用蛍光標識オリゴヌクレオチド、及び該核酸検出用蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた二本鎖形成に関わる情報を得る方法
JP2010162034A (ja) * 2002-04-26 2010-07-29 Univ Of Utah Research Foundation 二本鎖核酸−特異的色素を使用する二次構造の融解分析による一本鎖核酸の特徴付け
JP2010162042A (ja) * 2001-03-02 2010-07-29 Univ Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Ｐｃｒ法

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6699661B1 (en) 1999-04-20 2004-03-02 Kankyo Engineering Co., Ltd. Method for determining a concentration of target nucleic acid molecules, nucleic acid probes for the method, and method for analyzing data obtained by the method
GB2360087A (en) * 2000-03-07 2001-09-12 Secr Defence Analytical method
US20010021504A1 (en) * 2000-03-08 2001-09-13 Yoshihiko Makino Method for testing complementation of nucleic acid
JP2002142765A (ja) * 2000-07-14 2002-05-21 Tosoh Corp 新規ゲノム解析法
DE60236068D1 (de) * 2001-01-31 2010-06-02 Mayo Foundation Nachweis von herpex-simplex-virus
US20040234992A1 (en) * 2001-09-13 2004-11-25 Cotton Richard G Method of detection of conformational change in a nucleic acid duplex by treatment with oxidising or reactive agent as a result of exposure to environmental or chemical conditions
JP2003116543A (ja) * 2001-10-10 2003-04-22 Tosoh Corp 薬効と毒性の評価法
JP2004024035A (ja) * 2002-06-21 2004-01-29 Tosoh Corp 核酸の検出方法
US6889143B2 (en) * 2002-09-12 2005-05-03 Intergrated Dna Technologies, Inc. Methods and systems for estimating the melting temperature (TM) for polynucleotide molecules
JP4534627B2 (ja) * 2004-06-30 2010-09-01 東ソー株式会社 サイトメガロウイルスの検出および定量方法
JP2007010413A (ja) * 2005-06-29 2007-01-18 Canon Inc 核酸ハイブリッドの融点測定方法及びそのための装置
US7785786B2 (en) * 2006-01-23 2010-08-31 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting nucleic acids using multiple signals
ES2547053T3 (es) * 2007-08-01 2015-10-01 Dana Farber Cancer Institute Enriquecimiento de una secuencia diana
EP2252702B1 (en) 2008-02-08 2014-01-29 Mayo Foundation for Medical Education and Research Detection of clostridium difficile
US9393566B2 (en) 2008-06-23 2016-07-19 Canon U.S. Life Sciences, Inc. System and method for temperature referencing for melt curve data collection
WO2013154750A1 (en) 2012-04-10 2013-10-17 The Trustees Of Columbia Unversity In The City Of New York Systems and methods for biological ion channel interfaces
WO2011112534A1 (en) 2010-03-08 2011-09-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Full cold-pcr enrichment with reference blocking sequence
CN103620403B (zh) 2011-01-11 2016-08-10 纽约市哥伦比亚大学理事会 使用纳米管监测单分子的系统和方法
CN103380369B (zh) 2011-02-23 2016-12-28 纽约市哥伦比亚大学理事会 使用纳米孔进行单分子检测的系统和方法
EP3333269B1 (en) 2011-03-31 2021-05-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods to enable multiplex cold-pcr
US9194801B2 (en) 2011-08-26 2015-11-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for a DNA-based thermometer
WO2013158280A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for single-molecule nucleic-acid assay platforms
US9133490B2 (en) 2012-05-16 2015-09-15 Transgenomic, Inc. Step-up method for COLD-PCR enrichment
EP3551756A4 (en) 2016-12-12 2020-07-15 Dana Farber Cancer Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR MOLECULAR BARCODING OF DNA MOLECULES BEFORE MUTATION ENRICHMENT AND / OR MUTATION DETECTION
WO2019023243A1 (en) 2017-07-24 2019-01-31 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING AND AMPLIFYING DNA TARGETS IN A SINGLE REACTION MIXTURE

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4544546A (en) * 1980-04-21 1985-10-01 Abbott Laboratories Fluorescent nucleic acid stains
JP3123249B2 (ja) * 1991-09-10 2001-01-09 株式会社日立製作所 Ｄｎａ分子の長さ計測方法および計測装置
ZA929351B (en) * 1991-12-11 1993-06-04 Igen Inc Electrochemiluminescent label for DNA assays.
DE4234086A1 (de) * 1992-02-05 1993-08-12 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur bestimmung von in vitro amplifizierten nukleinsaeuresequenzen
KR970702375A (ko) * 1994-03-24 1997-05-13 알렉미안 Dna 멜토메터 및 이것의 사용방법(a dna meltometer and methods of use thereof)
JP3189000B2 (ja) * 1994-12-01 2001-07-16 東ソー株式会社 特定核酸配列の検出方法

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010162042A (ja) * 2001-03-02 2010-07-29 Univ Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Ｐｃｒ法
JP2010162034A (ja) * 2002-04-26 2010-07-29 Univ Of Utah Research Foundation 二本鎖核酸−特異的色素を使用する二次構造の融解分析による一本鎖核酸の特徴付け
JP2007097492A (ja) * 2005-10-05 2007-04-19 Shimadzu Corp 融解曲線測定による遺伝子増幅産物の解析方法
WO2008084672A1 (ja) * 2007-01-10 2008-07-17 Arkray, Inc. 光学検出装置の性能確認方法およびそれに用いる標準試薬
JP5255439B2 (ja) * 2007-01-10 2013-08-07 アークレイ株式会社 光学検出装置の性能確認方法およびそれに用いる標準試薬
US8637238B2 (en) 2007-01-10 2014-01-28 Arkray, Inc. Method of verifying performance of optical detection apparatus and standard reagent used therefor
JP2009189296A (ja) * 2008-02-14 2009-08-27 Sony Corp 核酸検出用蛍光標識オリゴヌクレオチド、及び該核酸検出用蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた二本鎖形成に関わる情報を得る方法
JP4557014B2 (ja) * 2008-02-14 2010-10-06 ソニー株式会社 核酸検出用蛍光標識オリゴヌクレオチド、及び該核酸検出用蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた二本鎖形成に関わる情報を得る方法

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