JP2007097492A - 融解曲線測定による遺伝子増幅産物の解析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】遺伝子増幅産物の定性解析と定量解析との両方を可能にする、遺伝子増幅産物の解析方法を提供する。
【解決手段】目的遺伝子を反応液中で増幅する遺伝子増幅反応を行うに際して、少なくとも前記反応の途中及び終了後においてそれぞれ融解曲線測定を行い、少なくとも反応途中の融解曲線及び反応終了後の融解曲線を得る、遺伝子増幅産物の解析方法。好ましくは、前記反応の途中に、融解曲線測定を２回以上行うことができる、前記の方法。前記得られた複数の融解曲線における前記目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークを互いに比較し、前記遺伝子増幅反応当初に前記反応液中に含まれていた前記目的遺伝子の量を推定することができる。
【選択図】図５
【解決手段】目的遺伝子を反応液中で増幅する遺伝子増幅反応を行うに際して、少なくとも前記反応の途中及び終了後においてそれぞれ融解曲線測定を行い、少なくとも反応途中の融解曲線及び反応終了後の融解曲線を得る、遺伝子増幅産物の解析方法。好ましくは、前記反応の途中に、融解曲線測定を２回以上行うことができる、前記の方法。前記得られた複数の融解曲線における前記目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークを互いに比較し、前記遺伝子増幅反応当初に前記反応液中に含まれていた前記目的遺伝子の量を推定することができる。
【選択図】図５
Description
本発明は、遺伝子及び核酸の定性解析方法、及び定量解析方法に関する。
遺伝子を担う物質である核酸を定量的に解析する方法として、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法が一般的である。また、特に遺伝子増幅反応においては、核酸の定性的な解析方法として、増幅反応の終了後に温度を変化させながら蛍光インターカレータの蛍光強度変化を測定する融解曲線測定法（例えば、特開平１０−３３２７０１号公報などに記載）などがあり、核酸の定量的な解析方法として、蛍光インターカレータあるいは蛍光プローブの蛍光強度を増幅反応の最中に連続的に測定するリアルタイム（real-time）法（例えば、特開２００３−１８０３７８号公報などに記載）などがある。
上記の電気泳動による方法は、時間と手間とがかかるという問題がある。また、遺伝子増幅産物の電気泳動を行うと、操作途中に飛散した増幅産物が増幅対象の試料に混入してしまう、いわゆるコンタミネーションの問題が深刻である。
一般的な融解曲線測定法は、定性的な解析を行うための方法として知られており、増幅反応の終了後に、曲線のピーク温度などで特異的な増幅産物の存在を判定する。しかし、増幅反応終了後に測定した融解曲線のピーク高さやピーク面積と、反応開始時の増幅目的の核酸量との間には明確な相関がないため、定量解析には用いられてこなかった。
リアルタイム法は、増幅反応の容器を開栓せずに増幅反応を行いながら同時に蛍光強度を測定するので、コンタミネーション、時間、手間の問題は極めて低く、優れた方法である。しかし、蛍光インターカレータを用いた場合には、非特異的な増幅産物も含めて核酸量が増せば蛍光強度が増大するので、蛍光強度の増大が、特異的な増幅産物の増加のみによるものかどうかは判断できないという問題点がある。標識プローブを用いた場合には、増幅産物の特異性を確保することが出来るが、増幅領域ごとにプローブを作製しなければならず、手間がかかるという問題がある。
そこで本発明の目的は、遺伝子増幅産物の定性解析と定量解析との両方を可能にする、遺伝子増幅産物の解析方法を提供することにある。
本発明は、以下の発明を含む。
下記（１）及び（２）は、操作工程について記載する。
（１）目的遺伝子を反応液中で増幅する遺伝子増幅反応を行うに際して、少なくとも前記反応の途中及び終了後においてそれぞれ融解曲線測定を行い、少なくとも反応途中の融解曲線及び反応終了後の融解曲線を得る、遺伝子増幅産物の解析方法。
（２）前記反応の途中に、融解曲線測定を２回以上行う、（１）に記載の解析方法。
下記（１）及び（２）は、操作工程について記載する。
（１）目的遺伝子を反応液中で増幅する遺伝子増幅反応を行うに際して、少なくとも前記反応の途中及び終了後においてそれぞれ融解曲線測定を行い、少なくとも反応途中の融解曲線及び反応終了後の融解曲線を得る、遺伝子増幅産物の解析方法。
（２）前記反応の途中に、融解曲線測定を２回以上行う、（１）に記載の解析方法。
下記（３）〜（５）は、定量の方法について記載する。
（３）前記得られた複数の融解曲線における前記目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークを互いに比較し、前記遺伝子増幅反応当初に前記反応液中に含まれていた前記目的遺伝子の量を推定する、（１）又は（２）に記載の解析方法。
（３）前記得られた複数の融解曲線における前記目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークを互いに比較し、前記遺伝子増幅反応当初に前記反応液中に含まれていた前記目的遺伝子の量を推定する、（１）又は（２）に記載の解析方法。
（４）前記複数の融解曲線において、
前記目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークに関し、前記遺伝子増幅反応開始から前記ピークが出現するまでの時間又は前記反応のサイクル数と、前記ピークの高さ又は面積とを比較し、前記反応当初に前記反応液中に含まれていた前記目的遺伝子の量を推定する、（１）又は（２）に記載の解析方法。
前記目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークに関し、前記遺伝子増幅反応開始から前記ピークが出現するまでの時間又は前記反応のサイクル数と、前記ピークの高さ又は面積とを比較し、前記反応当初に前記反応液中に含まれていた前記目的遺伝子の量を推定する、（１）又は（２）に記載の解析方法。
特に下記（５）は、目的遺伝子とは別の定量された遺伝子を反応液中に加える形態について記載する。
（５）前記目的遺伝子を含んでいる前記反応液中に、さらに前記目的遺伝子とは別の定量された遺伝子を加えて遺伝子増幅反応を行い、融解曲線を測定し、得られた複数の融解曲線において、前記目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークと、前記定量された別の遺伝子の増幅産物の特異的ピークとに関し、前記反応開始から前記ピークが出現するまでの時間又は前記増幅反応のサイクル数と、前記ピークの高さ又は面積とを比較し、前記遺伝子増幅反応当初に反応液中に含まれていた前記目的遺伝子の量を推定する、（１）又は（２）に記載の解析方法。
（５）前記目的遺伝子を含んでいる前記反応液中に、さらに前記目的遺伝子とは別の定量された遺伝子を加えて遺伝子増幅反応を行い、融解曲線を測定し、得られた複数の融解曲線において、前記目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークと、前記定量された別の遺伝子の増幅産物の特異的ピークとに関し、前記反応開始から前記ピークが出現するまでの時間又は前記増幅反応のサイクル数と、前記ピークの高さ又は面積とを比較し、前記遺伝子増幅反応当初に反応液中に含まれていた前記目的遺伝子の量を推定する、（１）又は（２）に記載の解析方法。
下記（６）及び（７）は、融解曲線測定について記載する。
（６）前記融解曲線測定の際、温度の測定値と、前記温度の測定値における蛍光強度の測定値とから前記融解曲線を得る、（１）〜（５）のいずれかに記載の解析方法。
（７）前記融解曲線測定の際、フィードバックによる温度制御を行わない、（６）に記載の解析方法。
上記（７）の場合、前記融解曲線測定の温度制御において、測定温度幅が等間隔ではない場合がある。
（６）前記融解曲線測定の際、温度の測定値と、前記温度の測定値における蛍光強度の測定値とから前記融解曲線を得る、（１）〜（５）のいずれかに記載の解析方法。
（７）前記融解曲線測定の際、フィードバックによる温度制御を行わない、（６）に記載の解析方法。
上記（７）の場合、前記融解曲線測定の温度制御において、測定温度幅が等間隔ではない場合がある。
本発明によると、遺伝子増幅産物の定性解析と定量解析との両方を可能にする、遺伝子増幅産物の解析方法を提供することができる。すなわち、遺伝子増幅反応において、反応産物中に目的遺伝子に由来する特異的な産物が含まれるかという定性解析と、その目的遺伝子がどの程度の量であったかという定量解析とを簡便に行うことができる。
本発明は、遺伝子増幅反応の途中及び反応終了後に融解曲線測定を行うことを特徴とする遺伝子増幅産物の解析方法である。
本発明における遺伝子増幅反応としては、特に制限は無く、あらゆる遺伝子増幅方法により行うことができる。例えば、ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction法）、ＬＡＭＰ法（loop-mediated isothermal amplification法）、ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids法）などを挙げることができる。本発明において、遺伝子とは、遺伝をつかさどる因子という概念であり、遺伝子が意味する具体的な物質としては核酸又は核酸配列である。さらに、本発明において、核酸とは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を意味する。
本発明においては、目的遺伝子を上記の遺伝子増幅反応のための反応液中で増幅し、少なくとも反応の途中及び反応終了後においてそれぞれ融解曲線測定を行う。このことによって、少なくとも反応途中の融解曲線及び反応終了後の融解曲線を得る。
融解曲線を測定するためには、反応液中に蛍光インターカレータを添加し、試料の温度を上昇（もしくは下降）させながら、同時に蛍光強度を測定する。蛍光インターカレータとしては特に制限はないが、サイバーグリーンＩ、エチジウムブロマイドなどが好ましく用いられる。測定された温度と蛍光強度とのデータから、温度に対する蛍光強度の負の微分数をプロットすると、特定の温度に特異的ピークを持つ曲線が得られる。このピークの温度は増幅産物の配列や長さよって異なるが、同一の増幅産物を同一条件で測定すれば、常に同じ曲線が得られる。
反応の途中に融解曲線測定を行うタイミングとしては特に限定されないが、融解曲線において目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークが現れる程度に遺伝子増幅反応が進んだタイミングを、当業者が適宜決定するとよい。例えば、５〜４０サイクル後に測定を行うことが好ましい。また、反応の途中に融解曲線測定を１回又は複数回行うことができる。測定を行う回数としては特に制限はないが、１回以上、例えば２〜１０回程度行うことが好ましい。これら測定を行う間隔としても特に制限はなく、例えば１〜２０サイクルごとに行うことができる。複数回測定を行うことにより、より正確に目的遺伝子の量を求めることが可能になる。
定性解析は、以下のようにして行うことができる。反応の途中の測定によって得られた融解曲線においては、通常、目的遺伝子の増幅産物以外の非特異的な増幅産物のピークが検出される。一方、反応後の測定によって得られた融解曲線においては、目的遺伝子の増幅産物のピークが主として検出される。すでに述べたように、同一の増幅産物を同一条件で測定すれば、常に同じ位置に特異的ピークを有する曲線が得られる。このことから、得られた融解曲線の特異的ピークを比較することによって、目的とする増幅産物の同定を行うことができる。
本発明は、このような定性的な解析に加え、定量的な解析を可能にする。定量的解析も、得られた融解曲線を互いに比較することによって行い、このことにより、反応当初に反応液中に含まれていた目的遺伝子の量を推定する。
遺伝子増幅反応が進んでいる間は、融解曲線を測定するまでの反応時間又は反応サイクル数と、測定した融解曲線における特異的なピークの高さ又は面積との間（複数回融解曲線測定を行う場合は、融解曲線の特異的なピークが確認されるまでに要した反応時間又は反応サイクル数、或いは特異的なピークが一定の値を超えるまでに要した反応時間又は反応サイクル数と、測定した融解曲線における特異的なピークの高さ又は面積との間）には、相関関係が認められる。目的遺伝子の量は、融解曲線の特異的ピークに関し、前記の反応時間又は反応サイクル数と、前記の高さ又は面積とを比較することにより、前記の相関関係に基づいて推定することができる。
ここで、反応サイクル数とは、遺伝子増幅反応において、変性工程、プライマーの結合工程、及び伸長反応工程からなる一連の反応工程を行った回数をいう。反応時間を用いて算定を行う場合は、このようなサイクルにかかった時間を元に算定を行うと良い。
より具体的には、以下の方法で目的遺伝子の絶対量を定量することができる。すなわち、目的遺伝子の絶対量（例えばコピー数）と、融解曲線の特異的ピークの高さ又は面積が一定の値に達するまでの反応サイクル数との間の関係を示す検量線を作成する方法を用いることができる。検量線は、次のように作成することができる。まず、目的遺伝子と同じ遺伝子であって精製濃縮により絶対量が既知の水溶液を、段階希釈などによりコピー数を異にして複数種類調製する。次に、それら水溶液のそれぞれについて、本発明の方法に従って融解曲線を測定する。そして、コピー数に対する、融解曲線の特異的ピークの高さ又は面積が一定の値に達するまでの反応サイクル数をプロットすることで、検量線を得る。定量すべき目的遺伝子の量は、定量すべき目的遺伝子の測定結果を、上記のようにして作成した検量線に当てはめて求めたコピー数より算出することができる。
また、遺伝子増幅反応の反応液中には、定量すべき目的遺伝子とは別に、定量された遺伝子を内部標準として一緒に加えておくと良い。内部標準として加える定量済遺伝子としては、どのようなものも使用可能であるため、特に限定されない。例えば、高度に濃縮精製されたプラスミド由来ＤＮＡやラムダファージ由来ＤＮＡなどは、高度に濃縮精製され吸光度測定されたものが市販されており、実用的観点からはこれらが好ましく用いられる。これら遺伝子は、必要に応じて希釈して用いる。
これら遺伝子を遺伝子増幅反応により増幅し、融解曲線測定を行うことによって、これらの遺伝子増幅物のピークを有する融解曲線を得ることができる。そして、このような融解曲線において、目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークと、定量された遺伝子の増幅産物の特異的ピークとに関し、融解曲線を測定するまでの反応時間又は反応サイクル数と、測定した融解曲線における特異的なピークの高さ又は面積と（複数回融解曲線測定を行う場合は、融解曲線の特異的なピークが確認されるまでに要した反応時間又は反応サイクル数、或いは、特異的なピークが一定の値を超えるまでに要した反応時間又は反応サイクル数と、測定した融解曲線における特異的なピークの高さ又は面積と）を比較する。そして、内部標準として加えられた定量済遺伝子の増幅物の量に対する相対値として、遺伝子増幅反応当初に反応液中に含まれていた前記目的遺伝子の量を推定することができる。
このように、定量すべき目的遺伝子とは別に、定量された遺伝子を加える場合、より具体的には、以下の方法で目的遺伝子の絶対量を定量することができる。まず、絶対量が既知の別の遺伝子を段階希釈などによりさまざまなコピー数に希釈し、絶対量が未知の定量すべき目的遺伝子に加えることにより、加えた別の遺伝子のコピー数において異なる水溶液を複数種調製する。次に、それら水溶液のそれぞれについて、本発明の方法に従って融解曲線を測定する。そして、目的遺伝子の増幅と加えた別の遺伝子の増幅とが拮抗する場合に、目的遺伝子の絶対量と加えた別の遺伝子の絶対量とが同程度であるとの推定に基づき、加えた別の遺伝子のコピー数から定量すべき目的の遺伝子の濃度を算出することができる。この方法は、目的遺伝子が希少である場合など、上述のような精製濃縮による検量線作成が困難である場合に有効に用いることができる。
融解曲線測定機能はＰＣＲ装置に組み込まれている場合がほとんどであるため、融解曲線測定には通常のＰＣＲ装置を用いることができる。
融解曲線を測定することができるＰＣＲ装置は、フィードバック制御による温度コントロールを行うものが多い。すなわち、このような装置を用いる場合、温度の測定値をフィードバックして、設定値の温度に到達させ、その時の蛍光強度を測定する。このため、温度の測定値と蛍光強度の測定値との関係からではなく、温度の設定値と蛍光強度の測定値との関係から融解曲線が得られることになる。
融解曲線を測定することができるＰＣＲ装置は、フィードバック制御による温度コントロールを行うものが多い。すなわち、このような装置を用いる場合、温度の測定値をフィードバックして、設定値の温度に到達させ、その時の蛍光強度を測定する。このため、温度の測定値と蛍光強度の測定値との関係からではなく、温度の設定値と蛍光強度の測定値との関係から融解曲線が得られることになる。
しかしながら、融解曲線においては、厳密には、温度も蛍光強度もともに測定値であることが好ましい。すなわち、厳密には、融解曲線は、温度の測定値と、前記温度の測定値における蛍光強度の測定値とから得られるものであることが好ましい。なぜなら、ＰＣＲ反応においてはフィードバックがかかるときの実際の温度と指定温度との誤差は反応の効率などに影響はないが、融解曲線測定においては、そのような誤差が、得られる融解曲線の再現性を低下させる場合があるためである。このような観点から、フィードバック制御による温度コントロールを行わずに融解曲線を得る事が好ましい。なおこの場合、温度の測定値に基づいて融解曲線を得るため、融解曲線の温度の軸は等間隔ではないこともある。
［実験例１］
本実験例では、遺伝子増幅反応の途中に融解曲線測定を行うときと同等の条件を３回挿入して遺伝子増幅反応を行った場合（反応系(I)）と、そのような条件を挿入しない通常の遺伝子増幅反応とを行った場合（反応系(II)）とについて、それぞれの反応後に得られる融解曲線を比較した。
本実験例では、遺伝子増幅反応の途中に融解曲線測定を行うときと同等の条件を３回挿入して遺伝子増幅反応を行った場合（反応系(I)）と、そのような条件を挿入しない通常の遺伝子増幅反応とを行った場合（反応系(II)）とについて、それぞれの反応後に得られる融解曲線を比較した。
反応系(I)及び反応系(II)ともに、遺伝子増幅反応として、ＰＣＲ法を用いた。鋳型としては、以下の配列のものを用いた。
GAGTTTGGTAGCCAGTAAGCAGGATGTACGGTCATCATCTGACACTACAGACTCTGGCATCGCTGTGAAGACGACGCGAAATTCAGCATTTTCACAAGCGTTATCTTTTACAAAACCGATCTCACTCTCCTTTGATGCGAATGCCAGCGTCAGACATCATATGCAGATACTCACCTGCATCCTGAACCCATTGACCTCCAACCCCGTAATAGCGATGCGTAATGATGTCGATAGTTACTAACGGGTCTTGTTCGATTAACTGCCGCAGAAACTCTTCCAGGTCACCAGTGCAGTGCTTGATAACAGGAGTCTTCCCAGGATGGCGAACAACAAGAAACTGGTTTCCGTCTTCACGTATAAAGCAGCCGCTGCCC（配列番号１）
GAGTTTGGTAGCCAGTAAGCAGGATGTACGGTCATCATCTGACACTACAGACTCTGGCATCGCTGTGAAGACGACGCGAAATTCAGCATTTTCACAAGCGTTATCTTTTACAAAACCGATCTCACTCTCCTTTGATGCGAATGCCAGCGTCAGACATCATATGCAGATACTCACCTGCATCCTGAACCCATTGACCTCCAACCCCGTAATAGCGATGCGTAATGATGTCGATAGTTACTAACGGGTCTTGTTCGATTAACTGCCGCAGAAACTCTTCCAGGTCACCAGTGCAGTGCTTGATAACAGGAGTCTTCCCAGGATGGCGAACAACAAGAAACTGGTTTCCGTCTTCACGTATAAAGCAGCCGCTGCCC（配列番号１）
反応系(I)及び反応系(II)ともに、プライマーとしては、以下の配列のものを用いた。
プライマー１：GGGCAGCGGCTGCTTTATA（配列番号２）
プライマー２：GAGTTTGGTAGCCAGTAAGCAGGAT（配列番号３）
プライマー１：GGGCAGCGGCTGCTTTATA（配列番号２）
プライマー２：GAGTTTGGTAGCCAGTAAGCAGGAT（配列番号３）
ＰＣＲ反応液としては、それぞれの反応系につき、以下の組成のもの６種（(a)〜(f)）ずつ調製した。
10X バッファー 5μL
dNTP 混合物(各2.5 mM) 4μL
プライマー１(100 μM) 0.25μL
プライマー１(100 μM) 0.25μL
taq(5 units/μL) 0.25μL
鋳型ＤＮＡ （※下に詳述）
蒸留水 （反応液全体が50μLとなるように加えた。）
10X バッファー 5μL
dNTP 混合物(各2.5 mM) 4μL
プライマー１(100 μM) 0.25μL
プライマー１(100 μM) 0.25μL
taq(5 units/μL) 0.25μL
鋳型ＤＮＡ （※下に詳述）
蒸留水 （反応液全体が50μLとなるように加えた。）
（※）ここで、鋳型ＤＮＡは、反応液それぞれに応じ、以下に示す量を用いた。
反応液(a) 5x107コピー
反応液(b) 5x105コピー
反応液(c) 5x103コピー
反応液(d) 5x10コピー
反応液(e) 5コピー
反応液(f) 0コピー（すなわち、鋳型ＤＮＡを加えなかった。）
反応液(a) 5x107コピー
反応液(b) 5x105コピー
反応液(c) 5x103コピー
反応液(d) 5x10コピー
反応液(e) 5コピー
反応液(f) 0コピー（すなわち、鋳型ＤＮＡを加えなかった。）
さらに、サイバーグリーンＩ(SYBR green I、モレキュラープローブ社)を、最終濃度が0.2xになるように希釈して用いた。
ＰＣＲ温度条件としては、以下に示す条件とした。
＜反応系(I)の条件＞
(1) 97℃, 2’ 30”
(2) 97℃, 0’ 30”
(3) 67℃, 1’ 00”
(4) 72℃, 1’ 00”
（(2)〜(4)を２０サイクル繰り返した。）
(5) 60℃, 1’ 00”
(6) 99℃, 0’ 10”
（つまり、２０分間で60℃から99℃へ加温した(融解曲線測定の条件に相当)。）
(7) 97℃, 0’ 30”
(8) 67℃, 1’ 00”
(9) 72℃, 1’ 00”
（(7)〜(9)を１０サイクル繰り返した。）
(10) 60℃, 1’ 00”
(11) 99℃, 0’ 10”
（つまり、２０分間で60℃から99℃へ加温した(融解曲線測定の条件に相当)。）
(12) 97℃, 0’ 30”
(13) 67℃, 1’ 00”
(14) 72℃, 1’ 00”
（(12)〜(14)を１０サイクル繰り返した。）
(15) 60℃, 1’ 00”
(16) 99℃, 0’ 10”
（つまり、２０分間で60℃から99℃へ加温した(融解曲線測定の条件に相当)。）
(17) 97℃, 0’ 30”
(18) 67℃, 1’ 00”
(19) 72℃, 1’ 00”
（(17)〜(19)を５サイクル繰り返した。）
(20) 25℃, 1’ 00”
＜反応系(I)の条件＞
(1) 97℃, 2’ 30”
(2) 97℃, 0’ 30”
(3) 67℃, 1’ 00”
(4) 72℃, 1’ 00”
（(2)〜(4)を２０サイクル繰り返した。）
(5) 60℃, 1’ 00”
(6) 99℃, 0’ 10”
（つまり、２０分間で60℃から99℃へ加温した(融解曲線測定の条件に相当)。）
(7) 97℃, 0’ 30”
(8) 67℃, 1’ 00”
(9) 72℃, 1’ 00”
（(7)〜(9)を１０サイクル繰り返した。）
(10) 60℃, 1’ 00”
(11) 99℃, 0’ 10”
（つまり、２０分間で60℃から99℃へ加温した(融解曲線測定の条件に相当)。）
(12) 97℃, 0’ 30”
(13) 67℃, 1’ 00”
(14) 72℃, 1’ 00”
（(12)〜(14)を１０サイクル繰り返した。）
(15) 60℃, 1’ 00”
(16) 99℃, 0’ 10”
（つまり、２０分間で60℃から99℃へ加温した(融解曲線測定の条件に相当)。）
(17) 97℃, 0’ 30”
(18) 67℃, 1’ 00”
(19) 72℃, 1’ 00”
（(17)〜(19)を５サイクル繰り返した。）
(20) 25℃, 1’ 00”
＜反応系(II)の条件＞
(1) 97℃, 2’ 30”
(2) 97℃, 0’ 30”
(3) 67℃, 1’ 00”
(4) 72℃, 1’ 00”
（(2)〜(4)を４５サイクル繰り返した。）
(5) 72℃, 7’ 00”
(6) 25℃, 1’ 00”
(1) 97℃, 2’ 30”
(2) 97℃, 0’ 30”
(3) 67℃, 1’ 00”
(4) 72℃, 1’ 00”
（(2)〜(4)を４５サイクル繰り返した。）
(5) 72℃, 7’ 00”
(6) 25℃, 1’ 00”
上記の条件により、反応系(I)及び反応系(II)について、iCycler IQ（バイオラッド社）を用いて遺伝子増幅反応を行った。反応終了後、60℃から99℃へ、0.5℃刻みで、10秒間保持して蛍光強度を測定することにより、融解曲線測定を行った。
このとき得られた融解曲線を図１〜図６に示す。図１〜６において、横軸は温度Ｔ（℃）、縦軸は温度Ｔに対する蛍光強度Ｆの負の微分数（−ｄＦ/ｄＴ）を示す。
図１〜図３は、反応系(I)についての融解曲線である。図１において、灰色の融解曲線は反応液(a)のもの、黒色の融解曲線は反応液(b)のものである。図２において、灰色の融解曲線は反応液(c)のもの、黒色の融解曲線は反応液(d)のものである。図３において、灰色の融解曲線は反応液(e)のもの、黒色の融解曲線は反応液(f)のものである。
図４〜図６は、反応系(II)についての融解曲線である。図４において、灰色の融解曲線は反応液(a)のもの、黒色の融解曲線は反応液(b)のものである。図５において、灰色の融解曲線は反応液(c)のもの、黒色の融解曲線は反応液(d)のものである。図６において、灰色の融解曲線は反応液(e)のもの、黒色の融解曲線は反応液(f)のものである。
図１〜図３は、反応系(I)についての融解曲線である。図１において、灰色の融解曲線は反応液(a)のもの、黒色の融解曲線は反応液(b)のものである。図２において、灰色の融解曲線は反応液(c)のもの、黒色の融解曲線は反応液(d)のものである。図３において、灰色の融解曲線は反応液(e)のもの、黒色の融解曲線は反応液(f)のものである。
図４〜図６は、反応系(II)についての融解曲線である。図４において、灰色の融解曲線は反応液(a)のもの、黒色の融解曲線は反応液(b)のものである。図５において、灰色の融解曲線は反応液(c)のもの、黒色の融解曲線は反応液(d)のものである。図６において、灰色の融解曲線は反応液(e)のもの、黒色の融解曲線は反応液(f)のものである。
これらの図から、それぞれの反応液の融解曲線は、反応系(I)と反応系(II)とでほとんど差異がないことがわかる。すなわち、融解曲線測定を遺伝子増幅反応の途中に挿入してもしなくても、最終的な増幅反応の結果は、ほとんど差異のないことがわかる。従って、融解曲線測定を遺伝子増幅反応の途中に行うという本発明の方法により、増幅反応が阻害されたり、通常とは違う生成物が得られたりするということはないことが示された。
また、本実験例１は、複数回再現されたが、それぞれの反応溶液についての複数の融解曲線から分かるように、本発明の方法によって、実験誤差が小さく且つ再現性が高い実験が可能であったことが示された。
［実験例２］
本実験例においては、ＰＣＲによる遺伝子増幅反応の途中に、３回融解曲線を測定し、得られた融解曲線を比較した。
本実験例においては、ＰＣＲによる遺伝子増幅反応の途中に、３回融解曲線を測定し、得られた融解曲線を比較した。
鋳型の配列、プライマーの配列、ＰＣＲ反応試薬の組成及び融解曲線測定の温度条件としては、実験例１と同じである。ＰＣＲ温度条件としては、実験例１の反応系(I)における条件と同じであり、２０サイクル後(A)、３０サイクル後(B)及び４０サイクル後(C)に、実際に融解曲線測定を行った。
得られた融解曲線を図７〜図１５に示す。図７〜１５において、横軸は温度Ｔ（℃）、縦軸は温度Ｔに対する蛍光強度Ｆの負の微分数（−ｄＦ/ｄＴ）を示す。
図７〜図９は、２０サイクル後(A)に得られた融解曲線である。図１０〜図１２は、３０サイクル後(B)に得られた融解曲線である。図１３〜図１５は、４０サイクル後(C)に得られた融解曲線である。
図７〜図９は、２０サイクル後(A)に得られた融解曲線である。図１０〜図１２は、３０サイクル後(B)に得られた融解曲線である。図１３〜図１５は、４０サイクル後(C)に得られた融解曲線である。
２０サイクル後(A)に得られた融解曲線図７〜図９のうち、図７において、灰色の融解曲線は反応液(a)のもの、黒色の融解曲線は反応液(b)のものである。図８において、灰色の融解曲線は反応液(c)のもの、黒色の融解曲線は反応液(d)のものである。図９において、灰色の融解曲線は反応液(e)のもの、黒色の融解曲線は反応液(f)のものである。
これらの図が示すように、5x107コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図７の(a)ではピークが明瞭に確認でき、5x105コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図７の(b)ではピークがわずかに確認できる程度である。5x105コピーより少ない鋳型ＤＮＡを用いた図８及び９では特異的なピークは全く確認できない。従って図７〜図９から、目的とする遺伝子増幅産物の量がもっとも多い(a)の反応液に、もっとも多くの鋳型ＤＮＡが含まれていたことが示された。
これらの図が示すように、5x107コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図７の(a)ではピークが明瞭に確認でき、5x105コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図７の(b)ではピークがわずかに確認できる程度である。5x105コピーより少ない鋳型ＤＮＡを用いた図８及び９では特異的なピークは全く確認できない。従って図７〜図９から、目的とする遺伝子増幅産物の量がもっとも多い(a)の反応液に、もっとも多くの鋳型ＤＮＡが含まれていたことが示された。
３０サイクル後(B)に得られた融解曲線図１０〜図１２のうち、図１０において、灰色の融解曲線は反応液(a)のもの、黒色の融解曲線は反応液(b)のものである。図１１において、灰色の融解曲線は反応液(c)のもの、黒色の融解曲線は反応液(d)のものである。図１２において、灰色の融解曲線は反応液(e)のもの、黒色の融解曲線は反応液(f)のものである。
これらの図が示すように、5x107コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１０の(a)、5x105コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１０の(b)、及び5x103コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１１の(c)ではピークが明瞭に確認でき、5x10コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１１の(d)ではピークがわずかに確認できる程度である。5x10コピーより少ない鋳型ＤＮＡを用いた図１２では特異的なピークは全く確認できない。従って、図１０〜図１２から、目的とする遺伝子増幅産物の量がより多い(a)、(b)及び(c)の反応液に、その他の反応液よりも多くの鋳型ＤＮＡが含まれていたことが示された。また、ピークの高さから、(b)の反応液に(c)の反応液よりも多くの鋳型ＤＮＡが含まれていたことが確定した。
これらの図が示すように、5x107コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１０の(a)、5x105コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１０の(b)、及び5x103コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１１の(c)ではピークが明瞭に確認でき、5x10コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１１の(d)ではピークがわずかに確認できる程度である。5x10コピーより少ない鋳型ＤＮＡを用いた図１２では特異的なピークは全く確認できない。従って、図１０〜図１２から、目的とする遺伝子増幅産物の量がより多い(a)、(b)及び(c)の反応液に、その他の反応液よりも多くの鋳型ＤＮＡが含まれていたことが示された。また、ピークの高さから、(b)の反応液に(c)の反応液よりも多くの鋳型ＤＮＡが含まれていたことが確定した。
４０サイクル後(C)に得られた融解曲線図１３〜図１５のうち、図１３において、灰色の融解曲線は反応液(a)のもの、黒色の融解曲線は反応液(b)のものである。図１４において、灰色の融解曲線は反応液(c)のもの、黒色の融解曲線は反応液(d)のものである。図１５において、灰色の融解曲線は反応液(e)のもの、黒色の融解曲線は反応液(f)のものである。
これらの図が示すように、5x107コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１３の(a)、5x105コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１３の(b)、5x103コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１４の(c)、5x10コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１４の(d)、及び5コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１５の(e)でピークが明瞭に確認できるが、鋳型ＤＮＡを用いなかった図１５の(f)ではピークは確認できない。よって、反応液(f)中の鋳型ＤＮＡの量が最も少ないことが示された。また、ピークの高さの比較から、反応液(a)に最も鋳型ＤＮＡの量が多く含まれ、 (b)、(c)、(d)、(e)の順に、含まれていた鋳型ＤＮＡの量が少なくなることが推定された。
これらの図が示すように、5x107コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１３の(a)、5x105コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１３の(b)、5x103コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１４の(c)、5x10コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１４の(d)、及び5コピーの鋳型ＤＮＡを用いた図１５の(e)でピークが明瞭に確認できるが、鋳型ＤＮＡを用いなかった図１５の(f)ではピークは確認できない。よって、反応液(f)中の鋳型ＤＮＡの量が最も少ないことが示された。また、ピークの高さの比較から、反応液(a)に最も鋳型ＤＮＡの量が多く含まれ、 (b)、(c)、(d)、(e)の順に、含まれていた鋳型ＤＮＡの量が少なくなることが推定された。
以上の結果を総合して判断すると、反応液(a)に最も鋳型ＤＮＡの量が多く含まれ、反応液 (b)、(c)、(d)、(e)、(f)の順に、含まれていた鋳型ＤＮＡの量が少なくなることが明確に判断できる。実際の鋳型ＤＮＡの量は、反応液(a)：5x107コピー、反応液(b)：5x105コピー、反応液(c)：5x103コピー、反応液(d)：5x10コピー、反応液(e)：5コピー、反応液(f)：0コピーであり、上記の判断結果とよく一致している。
従って、遺伝子増幅反応の途中に測定した融解曲線を比較することで、増幅の目的となる遺伝子の量（鋳型ＤＮＡの量）が詳細に判断できる。
従って、遺伝子増幅反応の途中に測定した融解曲線を比較することで、増幅の目的となる遺伝子の量（鋳型ＤＮＡの量）が詳細に判断できる。
また、本実験例２は、複数回再現されたが、それぞれの反応溶液についての複数の融解曲線から分かるように、本発明の方法によって、実験誤差が小さく且つ再現性が高い実験が可能であったことが示された。
配列番号２は、プライマーである。
配列番号３は、プライマーである。
配列番号３は、プライマーである。
Claims (7)
- 目的遺伝子を反応液中で増幅する遺伝子増幅反応を行うに際して、少なくとも前記反応の途中及び終了後においてそれぞれ融解曲線測定を行い、少なくとも反応途中の融解曲線及び反応終了後の融解曲線を得る、遺伝子増幅産物の解析方法。
- 前記反応の途中に、融解曲線測定を２回以上行う、請求項１に記載の解析方法。
- 前記得られた複数の融解曲線における前記目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークを互いに比較し、前記遺伝子増幅反応当初に前記反応液中に含まれていた前記目的遺伝子の量を推定する、請求項１又は２に記載の解析方法。
- 前記複数の融解曲線において、
前記目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークに関し、前記遺伝子増幅反応開始から前記ピークが出現するまでの時間又は前記反応のサイクル数と、前記ピークの高さ又は面積とを比較し、前記反応当初に前記反応液中に含まれていた前記目的遺伝子の量を推定する、請求項１又は２に記載の解析方法。 - 前記目的遺伝子を含んでいる前記反応液中に、さらに前記目的遺伝子とは別の定量された遺伝子を加えて遺伝子増幅反応を行い、融解曲線を測定し、
得られた複数の融解曲線において、
前記目的遺伝子の増幅産物の特異的ピークと、前記定量された別の遺伝子の増幅産物の特異的ピークとに関し、前記反応開始から前記ピークが出現するまでの時間又は前記増幅反応のサイクル数と、前記ピークの高さ又は面積とを比較し、前記遺伝子増幅反応当初に反応液中に含まれていた前記目的遺伝子の量を推定する、請求項１又は２に記載の解析方法。 - 前記融解曲線測定の際、温度の測定値と、前記温度の測定値における蛍光強度の測定値とから前記融解曲線を得る、請求項１〜５のいずれか１項に記載の解析方法。
- 前記融解曲線測定の際、フィードバックによる温度制御を行わない、請求項６に記載の解析方法。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| JP2010207220A (ja) * | 2009-03-10 | 2010-09-24 | F Hoffmann La Roche Ag | 多重定量的核酸増幅及び融解アッセイ |
| JP2015049803A (ja) * | 2013-09-03 | 2015-03-16 | 株式会社島津製作所 | 測定データのグラフ表示方法 |
| AU2013312191A1 (en) * | 2012-09-10 | 2015-03-26 | Biofire Diagnostics, Llc | Multiple amplification cycle detection |
| US9340833B2 (en) | 2010-04-30 | 2016-05-17 | Arkray, Inc. | Method for adjusting amplification efficiency of target polynucleotide |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10332701A (ja) * | 1997-06-05 | 1998-12-18 | Tosoh Corp | 核酸融解温度測定法 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10332701A (ja) * | 1997-06-05 | 1998-12-18 | Tosoh Corp | 核酸融解温度測定法 |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010207220A (ja) * | 2009-03-10 | 2010-09-24 | F Hoffmann La Roche Ag | 多重定量的核酸増幅及び融解アッセイ |
| US9340833B2 (en) | 2010-04-30 | 2016-05-17 | Arkray, Inc. | Method for adjusting amplification efficiency of target polynucleotide |
| AU2013312191A1 (en) * | 2012-09-10 | 2015-03-26 | Biofire Diagnostics, Llc | Multiple amplification cycle detection |
| EP2893062A4 (en) * | 2012-09-10 | 2016-08-17 | Biofire Diagnostics Llc | DETECTION OF MULTIPLE REINFORCEMENT CYCLES |
| AU2013312191B2 (en) * | 2012-09-10 | 2017-04-20 | Biofire Diagnostics, Llc | Multiple amplification cycle detection |
| AU2013312191C1 (en) * | 2012-09-10 | 2017-10-19 | Biofire Diagnostics, Llc | Multiple amplification cycle detection |
| US10053726B2 (en) | 2012-09-10 | 2018-08-21 | Biofire Diagnostics, Llc | Multiple amplification cycle detection |
| EP3401422A1 (en) * | 2012-09-10 | 2018-11-14 | BioFire Diagnostics, LLC | Multiple amplification cycle detection |
| JP2018183157A (ja) * | 2012-09-10 | 2018-11-22 | バイオファイア・ダイアグノスティクス，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | マルチプル増幅サイクル検出 |
| US11041193B2 (en) | 2012-09-10 | 2021-06-22 | Biofire Diagnostics, Llc | Multiple amplification cycle detection |
| US11959132B2 (en) | 2012-09-10 | 2024-04-16 | Biofire Diagnostics, Llc | Multiple amplification cycle detection |
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