JP2012502378A - 多段階回帰ベースpcr解析システム - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2008年9月9日に出願された(Attorney Docket No. 002558− 083200US)、米国仮出願第61/095,410号、表題「MULTI−STAGE, REGRESSION− BASED PCR ANALYSIS SYSTEM」の本出願(non−provisional application)に基づく優先権を主張し、その全ての内容は、本明細書中、全ての目的で、参照により援用される。
本発明の態様は、PCRプロセス又は他の増幅を呈するプロセスの特性を決定するためのデータ解析システム、方法、及び機材を提供する。一つの態様において、多段階の関数の適合(functional fit)を使用して、決定された特性の正確性を増大することが出来る。一つの側面において、当該特性として、ベースライン、増幅プロセスの基準定量値(例えばCt値)、増幅の存否、及び増幅プロセスの効率等が挙げられる。
本発明は、例えば増幅反応の異なる特性の数を決定するために、増幅反応の結果を処理及び解析する技術を提供する。PCR増幅プロセスで得たデータを解析するのに様々な態様が特に有用であって、当該データとして、ベースライン、定量値(例えばCt値)、及び異なる領域の当該データの関数形式に由来する挙動等が挙げられる。しかしながら、本発明の教示は、ノイズを含み得るデータセット又は曲線、そして特に細菌の増殖プロセス等の、増殖(増幅)を呈すると推定される他の特定の曲線の処理に適用することも当然に可能である。
増幅(増殖)曲線は、一定時間中でいずれの時に量が増大したかを示す。そのような曲線は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)から得られる。典型的なPCR増殖曲線のデータは、二次元的なプロットで表現でき、例えば、x軸にサイクル数をとり、y軸に累積の増殖の指標をとる。典型的には、前記累積の増殖の指標は、蛍光マーカーに由来する蛍光強度の数値である。使用される具体的なラベル及び/又は検出スキームに依存して、他の指標も使用され得る。例として、発光強度、生物発光強度、燐光強度、電荷移動、電圧、電流、力、エネルギー、温度、粘性、光散乱、放射線強度、反射率、透過率及び吸光度が挙げられる。サイクルの例として、時間、プロセスサイクル、単位操作サイクル(unit operation cycle)及び生殖サイクル等が挙げられる。
図3は、本発明の態様に係る増幅反応から得たデータポイントを解析する方法を描写するフロー図を示す。図3の工程の多くは、一つの態様の具体的な要請に依存して任意である。加えて、図3に示されている様々な工程の多くは、他の工程から独立して実施され得る。例えば、図12に記載のベースライン解析は、いずれかのCtの決定から独立して実施される。図3の工程の幾つかを実施する具体的な方法は、他の図に関連して後述する。
上記工程330において記載したように、データが増幅反応を表すか否かに関して、解析が行われ得る。一つの態様において、最大増幅勾配結合解析が実施される。
図6は、本発明の一つの態様に係る増幅曲線のベースライン領域を決定する方法を描写するフロー図である。方法600のグラフは、図7に示される。
上記に述べたように、増幅反応から得られるデータ値の関数の近似は、ベースライニング及びCt値の同定等の、複数のプロセスにおいて使用され得る。使用されていた一つの関数の式は、式1/(1+e4)のシグモイド関数である。しかしながら、そのような関数の式は、増幅反応の物理的特性を誤認する可能性がある。故に、態様によっては、ドリフト項を使用する変形シグモイド関数(下記)が使用され、これは、様々な浮動するベースラインや、シグモイド関数が誤認する可能性がある他の特性を考慮している。
aO=パラメーター[0]=y[1];a1=パラメーター[1]=y.Max−y.Min;a2=パラメーター[2]=x.Length/2;a3=パラメーター[3]=1.0;a4=パラメーター[4]=y.Mean−y[1]
増幅を行う反応のCt値を選択することが可能な方法は、数多く存在する。それぞれの方法は、何がしかの長所及び短所を有する。Ct値は、関数の適合を行う、各単一の段階の後に、又は複数の段階の後に、決定され得る。
CtSelectionValue = (1.0 − p) * Max2ndDerivativeXLocation + p * Max3rdDerivativeXLocation
一つの態様において、前記加重値pは、典型的には、0.3〜0.7の範囲内である。例えば、一つの態様では、加重値として0.65を使用する。
図12は、本発明の態様に係る、複数の関数の適合を実施することにより増幅曲線を解析してCt値を決定する方法を示すフロー図である。図12の各工程は、本開示で既にかなり詳細に記載したものである。図12の多くの工程は、一つの態様の具体的な要求に依存して選択的である。加えて、工程12に概観される様々な工程の多くは、他の工程から独立して実施され得る。例えば、図12に記載のベースライン解析は、Ct決定工程がいずれのものであるかに依存せずに実施され得る。
図13は、本発明の一つの態様に係るシステム1300を示す。このシステムは、見ての通り、サンプルホルダー1310に、最近又はDNA等のサンプル1305を含む。前記サンプルからの蛍光強度の数値等の物理特性1315は、デテクター1320により検出される。ノイズ成分を含むシグナル1325が、デテクター1320から論理システム1330に送られる。シグナル1325からのデータは、ローカルメモリー1335又は外部メモリー1340又は保存装置1345に保存され得る。一つの態様において、アナログ/デジタルコンバーターは、アナログシグナルをデジタル形態に変換する。
Claims (24)
- 生物学的及び/又は化学的反応の1つ以上の特性を、当該反応の増幅プロセスを表現するデータセットから決定する方法であって:
ベースライン部分及び増殖部分を有する曲線を形成するデータポイントのセットを取得する工程、ここで各データポイントが増幅プロセスの間の物質の物理量を表現する;
プロセッサーを使用して、前記データポイントのセットを近似する(approximate)第一の関数を演算する工程;
前記第一の関数から1つ以上のパラメーターを抽出する工程;
前記プロセッサーで、前記1つ以上のパラメーターを使用して前記データポイントのセットを近似する第二の関数を演算する工程;及び
前記第二の関数を使用して前記生物学的及び/又は化学的反応の1つ以上の特性を決定する工程;
を有する、前記方法。 - 前記1つ以上の特性が、前記増幅プロセスと関連する定量値を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上のパラメーターが前記第二の関数の初期値として使用され、且つ前記第二の関数の演算が1つ以上の前記初期値を変化させることにより、前記第二の関数と前記データポイントのセットとの間のエラーを減少させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第二の関数が、ドリフト項を含む変形シグモイド関数である、請求項3に記載の方法。
- 前記1つ以上のパラメーターが、a0、a1、a2及びa3を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記1つ以上のパラメーターが、前記増幅プロセス中に、その時点で前記第一の関数が特定の数値を有する時間Ctを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記データポイントのセットを近似する第二の関数を演算するための前記時間Ctの使用が:中心にCtが来る時間帯(window of time)を定める工程;
当該時間帯の中のデータポイントを使用して、前記第二の関数が当該時間帯の中のデータポイントを近似するように前記第二の関数を決定する工程;
を含む、請求項7に記載の方法。 - 前記第二の関数が六次以上の多項式である、請求項8に記載の方法。
- 前記時間Ctが、前記第一の関数の第二の微分(derivative)が最大値をとる第一の時間と、前記第一の関数の第三の微分が最大値をとる第二の時間との加重平均として決定される、請求項7に記載の方法。
- 更に:前記ベースライン部分の終点(end)を前記増幅プロセスの第一の時間として選択する工程を含み、ここで、前記第一の関数の第一の導関数(derivative function)の、当該第一の時間からピークまでの積分面積が、特定の数値の範囲内である、請求項1に記載の方法。
- 更に:
前記第一の関数を解析して、当該第一の関数の勾配が最大増幅勾配(maximum amplitude slope)を超えるか否かを決定する工程;及び
当該第一の関数に当該最大増幅勾配を超える場所がある場合、その後当該場所を含むセグメント(segment)を増幅曲線の非増幅セグメントとして扱う工程;
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記最大増幅勾配が、ln(2.0)に当該勾配が算出される場所のデータポイントの数値を乗じたものである、請求項12に記載の方法。
- 生物学的及び/又は化学的反応の増幅プロセスで得られた増幅曲線のベースライン領域を決定する方法であって:
ベースライン部分及び増殖部分を有する曲線を形成するデータポイントのセットを取得する工程、ここで各データポイントが増幅プロセスの間の物質の物理量を表現する;
プロセッサーを使用して、前記データポイントのセットを近似する関数を決定する工程;
前記関数の第一の微分を演算して第一の導関数を取得する工程;
ベースライン領域の終点を:
複数の点において:
プロセッサーを使用して、前記第一の導関数を、各点から前記第一の導関数の所定の場所まで積分して、各積分面積を取得することにより;及び
積分面積が前記ベースライン領域の終点として特定される範囲内にある点を選択することにより;
決定する工程;並びに
前記ベースライン領域の始点(beginning)を決定する工程;
を含む、前記方法。 - 前記第一の導関数が、前記関数の第一の微分から最初のデータポイントでの第一の微分を引いたものを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記選択された点の積分面積が、前記最初の点から所定の場所までの前記第一の導関数の既定のパーセントの面積である、請求項15に記載の方法。
- 更に:
前記第一の導関数のピークを同定する工程を含み、ここで当該第一の導関数上の所定の場所が当該第一の導関数のピークである;
請求項14に記載の方法。 - 前記積分が、前記第一の導関数上のピークから、前記第一の導関数の始点まで実施されることにより、前記各積分面積が得られる、請求項17に記載の方法。
- ベースライン領域の始点を決定する工程が:
1つのデータポイントが次のデータポイントに至るまでの数値の増大が所定の量を超えているか否かを判定すること;及び
所定の量を超えている場合に、当該1つのデータポイントの後にあるベースラインの始点を選択すること;
を含む、請求項14に記載の方法。 - 前記ベースライン領域の始点の決定が、当該ベースライン領域のデータポイントが閾値の中で線形の挙動を近似しない場合、当該ベースライン領域からの1つ以上のデータポイントを切り捨てる(truncating)ことを含み、ここで、当該ベースライン領域からの1つ以上のデータポイントの切り捨てが:
i)当該ベースライン領域を、データポイントのセットの始点から当該ベースライン領域の決定された終点までの複数のデータポイントとして定める工程;
ii)当該ベースライン領域を解析して、当該ベースライン領域が、当該ベースライン領域の中のデータポイントの線形の挙動に基づいて非増幅的な挙動を呈するか否かを判定する工程;
iii)当該ベースライン領域が前記閾値中で線形の挙動を近似しない場合、当該ベースライン領域から1つ以上の主要なデータポイントを除去する工程;
iv)工程ii〜iiiを、a)当該ベースライン非増幅的な挙動を示すまで、又はb)工程ii〜iiiが所定の回数反復されるまで反復する工程;
を含む、請求項14に記載の方法。 - 生物学的及び/又は化学的反応の基準値を、当該反応の増幅プロセスを表現するデータセットから決定する方法であって:
ベースライン部分及び増殖部分を有する曲線を形成するデータポイントのセットを取得する工程、ここで各データポイントが増幅プロセスの間の物質の物理量を表現する;
プロセッサーを使用して、前記データポイントのセットを近似する関数を演算する工程;
前記プロセッサーを使用して、前記関数の2つ以上の微分を演算する工程;
前記増幅プロセス中で各微分が最大値をとる時間を同定する工程;
前記生物学的及び/又は化学的反応の基準値を、前記各時間の加重平均として算出する工程;
を有する、前記方法。 - 前記2つ以上の微分が、第二の微分及び第三の微分を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記第二の微分が(1−p)により加重され、且つ前記第三の微分がpにより加重され、そしてpが0.3〜0.7の範囲の数値をとる、請求項22に記載の方法。
- 更に;
基準曲線の効率が100%となるように加重平均の加重を設定する工程;
を含む、請求項21に記載の方法。
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