CN102187215A - 基于回归的多级pcr分析系统 - Google Patents

Abstract

提供了用于分析数据以确定PCR过程或呈现扩增或生长的其它过程的性质的系统和方法。可将表示扩增的数据与表示突变或其它错误的数据区分开。在确定这些性质时可使用含漂移项的经修改S形函数。扩增数据的多级函数拟合能提供一个或多个性质的提高的准确度和一致性。可通过分析数据的一阶导数函数的积分面积来确定扩增数据的基线。还可根据扩增数据的不同导数函数的最大值的位置确定基准量化值，例如可使用二阶和三阶导数的最大值位置的加权平均值。

Description

基于回归的多级PCR分析系统

优先权要求

本申请要求2008年9月9日提交的题为“基于回归的多级PCR分析系统(MULTI-STAGE，REGRES SION-BASED PCR ANALYSIS SYSTEM)”的美国临时申请No.61/095,410(代理人案号No.002558-083200US)的优先权，并且是该临时申请的非临时申请，该申请No.61/095,410的全部内容通过引用通用地结合于此。

背景技术

本发明一般涉及分析数据处理系统和方法，其分析诸如聚合酶链反应(PCR)的呈现扩增的生物和/或化学反应所产生的数据。

许多实验过程呈现量的扩增。例如，在PCR中，该量可能对应于已被复制的DNA链的片段的数量，该数量在PCR数据曲线的扩增区中所呈现的扩增阶段期间急剧增加。PCR数据典型地是由显示出线性漂移基线的区域所描述的，该区域是扩增区中的指数生长的前兆。当消耗品耗尽时，该曲线翻转并渐近。呈现扩增的其它实验过程包括细菌生长过程。

实验过程的量经由数据信号从实验设备检测得到。例如，可通过对来自在各个孔或管中进行的一种或多种反应的不同激发波长和发射波长进行成像来收集该数据。该数据信号包含多个数据点，对这些数据点进行分析以确定与扩增有关的信息。所收集的数据然后典型地被存储以便将来使用。

可能利用PCR数据进行的分析的一个示例被称为基线测定。基线表示数据中的噪声或仪器专属电平，而非扩增。为了更好地分析数据的扩增区，通常需要从数据信号中去掉线性漂移基线。此类基线测定能有助于确定基线以上的实际扩增水平。对于某些类型的分析，由于基线基于每个曲线而不同，因此这样允许对不同曲线的扩增级之间的比较。基线测定的示例能在美国专利公开2006/0269947中找到，该专利公开通过引用结合在此用于所有目的。

通常利用PCR数据进行的另一分析是计算一些以绝对值或相对值表示的反应中的特定靶分子的定量。这能通过指定与基准阈值相对应的目标信号阈值来实现。达到该目标阈值所需的循环数量随后被称为Ct值。用于确定反应的Ct值的先前方法通常受例如对原始数据或原始数据中的噪声的建模准确度限制。

虽然存在用于这些和其它类型的分析的方法，但从放大系统收集的数据通常包括显著的噪声和其它不定方面，这些方面会妨碍对反应特性的高效和准确的确定。因此，需要用于分析扩增曲线的新方法。

发明内容

实施例提供用于分析数据以确定PCR过程或呈现扩增的其它过程的性质的系统、方法以及装置。在一个实施例中，可使用多级函数拟合来提高所确定性质的准确度。在一个方面中，这些性质包括基线、扩增过程(不管扩增是否存在)的基准定量值(例如，Ct值)以及扩增过程的效率。

根据一个实施例，提供了一种根据表示反应的扩增过程的数据集来确定生物和/或化学反应的一种或更多种性质的方法。接收表示一具有基线部分和生长部分的曲线的数据点集。每个数据点表示扩增过程期间的物质的物理量。处理器计算逼近该数据点集的第一函数。从该第一函数提取一个或更多个参数。处理器使用这一个或更多个参数来计算逼近该数据点集的第二函数。利用第二函数来确定生物和/或化学反应的一种或更多种性质。

根据另一实施例，提供了一种确定由生物和/或化学反应的扩增过程所产生的扩增曲线的基线区域的方法。接收表示一具有基线部分和生长部分的曲线的数据点集。处理器计算逼近该数据点集的函数。计算该函数的一阶导数以获得一阶导数函数。处理器通过从一阶导数函数的一对应点到一固定位置对一阶导数函数进行积分以获得对应的积分面积来确定基线区域的结尾。积分面积在特定范围内的点被选择作为基线区域的结尾。也确定基线区域的起点。

根据另一实施例，提供了一种根据表示反应的扩增过程的数据集来确定生物和/或化学反应的基准值的方法。接收表示一具有基线部分和生长部分的曲线的数据点集。处理器确定逼近该数据点集的函数。处理器确定逼近该数据点集的函数。处理器计算该函数的至少两个导数。确定扩增过程中每一个导数具有最大值时的对应时间。将该生物和/或化学反应的基准值计算为对应时间的加权平均值。

在一个实施例中，通过检查数据的斜率或逼近该数据的函数是否具有大于阈值的斜率来区分所收集的数据中表示扩增的数据与表示突变或其它错误的数据。在另一实施例中，使用包含漂移项的经修改S形函数(sigmoid function)来逼近表示扩增过程的数据。

本发明的其它实施例涉及与本文中所描述方法相关联的系统和计算机可读介质。

参照以下详细描述和附图，可获得对本发明的本质和优点的更好理解。

附图说明

图1示出PCR扩增曲线的示例。

图2示出从扩增过程测得的原始数据的示例。

图3是示出根据本发明一实施例的分析来自扩增反应的数据点的方法的流程图。

图4是表示突变而不是实际扩增的数据曲线的图示。

图5是示出根据本发明一实施例的确定数据曲线的一分段是否示出扩增的方法的流程图。

图6是示出根据本发明一实施例的确定扩增曲线的基线区域的方法的流程图。

图7是根据本发明一实施例的由基线测定法产生的扩增数据和曲线的曲线图。

图8是已利用本发明一实施例进行基线测定的许多PCR曲线的图示。

图9是示出根据本发明一实施例的通过执行多级函数拟合来分析扩增曲线以确定扩增反应的性质的方法的流程图。

图10是根据本发明一实施例的经修改S形函数与PCR数据之间的拟合的图示。

图11是根据本发明一实施例的PCR曲线的各个最大导数的计算的图示。

图12是示出根据本发明一实施例的通过执行多函数拟合来分析扩增曲线以确定Ct值的方法的流程图。

图13是根据本发明一实施例的处理实时PCR数据的系统。

具体实施方式

本发明提供用于处理和分析来自扩增反应的结果的技术，例如用于确定该反应的多种不同性质。各个实施例尤其可用于分析来自PCR扩增过程的数据，以根据该数据的函数形式来确定例如基线、定量值(例如Ct值)以及不同的特性区域。然而，应当理解，本发明的示教可适用于处理可包括噪声的任何数据集或曲线，尤其处理以其它方式呈现生长(扩增，诸如细菌生长过程)的曲线。

I.扩增曲线

扩增(生长)曲线显示出量何时随时间增加。此类曲线能由聚合酶链反应(PCR)产生。典型的PCR生长曲线的数据能以二维曲线图表示，例如其中循环数定义了x轴且累积生长指标定义了y轴。典型地，累积生长指标是由荧光标记物产生的荧光强度值。根据所使用的特定标记和/或检测方案，可使用其它指标。多个示例包括发光强度、生物发光强度、磷光强度、电荷转移、电压、电流、功率、能量、温度、黏度、光散射、辐射强度、反射率、透射率以及吸收率。循环的定义也能包括时间、处理循环、单位操作循环和生殖循环。

图1示出PCR曲线100的示例，其中绘制了典型PCR过程的强度值110与循环数120的关系。值110可以是任何感兴趣的物理量，而循环数可以是与过程中的时间或步骤数相关联的任何单元。此类扩增曲线典型地具有线性部分(区域)130、随后是生长(扩增)部分140、然后是渐近部分150，如图1所示。还可能存在附加类型的特性，诸如向下弯曲的数据。生长部分可能具有指数的、S形、高次多项式或对生长进行建模的其它类型的逻辑函数或逻辑曲线。

为了理解所涉及的实验过程，确定生长部分140的位置和形状是重要的。例如，在PCR过程中，可能需要确定扩增的起始处，该起始处出现在基线部分(线性部分130)的末端160处。此外，对生长部分140的形状的分析通常包括“基线测定”或从PCR曲线100减掉线性部分130。

图2示出呈现扩增的实时PCR曲线200。最开始，该数据在区域230呈现线性特性，而在稍后的循环中，在区域240中出现扩增。当将图2与图1进行对比时，清楚的是，实时PCR曲线中通常存在的噪声和其它不定性会使为了确定潜在的反应性质而进行的对数据的任何分析比图1中所示的较理想模型难得多。

可分析这些曲线以用于多种不同目的。在本文中描述了其中一些目的。

II.扩增曲线分析综述

图3是示出根据本发明一实施例的分析来自扩增反应的数据点的方法的流程图。取决于实施例的特定需求，图3中的许多步骤是可选的。此外，图3中概述的多个步骤中的许多步骤能与其它步骤无关地进行。例如，图12中所示的基线分析能与任何Ct确定无关地进行。执行图3中的一些步骤的特定方法在稍后参照其它附图进行描述。

在步骤310，接收从经历扩增的生物或化学反应获得的原始数据以供分析。在一些实施例中，该原始数据表示从该反应收集的各种光波长。在一个实施例中，该数据是在该反应的每个循环之后测得的光强。可将例如每个循环的荧光值集合形式的该原始数据装载到存储器中，以对其进行分析。

在步骤320，在进行进一步分析之前，可根据颜色来分离这些光波长。在一个实施例中，产生每孔标准化的颜色分离矩阵，该矩阵能从仪器校准数据导出。该矩阵可具体取决于装载到该孔中的染料。在一个方面中，使用诸如逆矩阵或奇异值分解的矩阵运算来根据原始数据计算颜色分离的数据。可将颜色分离的数据输出为一组曲线，每条曲线通过染料、步骤号以及孔序号来标识。对于每种颜色以及每个孔采样和步骤存在一扩增曲线。这些输出曲线在向用户显示之前已减掉了基线。

在步骤330，分析颜色分离的原始数据以确定该数据是否表明潜在的反应中已经发生扩增。可进行各种分析来确定是否已经发生扩增。确定无扩增的分析的示例包括，曲线太短、曲线中的数据值的标准差是否充分小、曲线中的数据点的函数拟合是否具有负斜率、以及数据与其线性拟合之差是否相对于数据点改变符号足够时间。通过为各种目的而引用结合的美国专利申请2006/0271308公开了一种确定数据是否呈现统计线性特性以区分线性数据与可能表示扩增的数据的方法。在一些实施例中，进行最大幅值斜率界限分析以确定该数据是否表明已经发生扩增，该分析将在稍后详细描述。

如果未发生扩增，则一些实施例将不对该数据进行任何进一步分析。如果已经发生扩增，则一些实施例将继续方法300。

在步骤340，进行基线分析。基线一般涉及与扩增过程无关的影响。例如，强度信号中可能存在偏置、漂移、噪声或其它伪像，且并非是潜在的扩增过程的结果。该基线分析可按照各种方式进行。在一些实施例中，通过从原始数据的函数逼近(拟合)来创建概率分布函数，从而确定基线的末端在特定置信水平内，来进行基线分析。稍后在本公开内容中更详细讨论该基线分析。在一个实施例中，可使用S形函数作为原始数据的函数逼近。

在步骤350，执行函数拟合以创建与原始数据紧密匹配的函数逼近。在一些实施例中，可使用来自步骤340的函数拟合作为用于步骤350的拟合。在其它实施例中，执行新的函数拟合，该新的函数拟合可基于前一函数拟合。以下更详细地描述这样的多级拟合。在一个实施例中，使用经修改的S形函数作为该函数逼近。

在步骤360，一些实施例使用来自步骤350的函数逼近来确定Ct值。如上所讨论，可使用扩增曲线的Ct值来计算反应中的特定靶分子的以绝对值或相对值表示的一些定量。在一些实施例中，利用函数逼近的两个导数的加权平均来确定Ct值。

在步骤330的结果表明无扩增的一些实施例中，方法300可将基线区域的末端设置到最后一个循环，和/或将Ct值设置于该曲线与其平均值的交点处。

III.确定是否存在扩增

如上关于步骤330所述，可对数据是否表示扩增反应进行分析。在一个实施例中，进行最大扩增斜率界限分析。

在多种情况下，存在由于仪器在运行期间受到撞击或干扰而引起的数据突变。在该情况下，该数据会显示看起来表示扩增的急剧突变，但它实际上是错误的伪像。显示该特性的曲线的极端示例在图4中示出。在图4中，RFU指的是相对荧光，而循环指的是PCR反应(或任何显示扩增型特性的过程)的扩增循环。实施例使用用于真实扩增的最大允许斜率来区分真实扩增与任何伪像(诸如由错误引起的数据突变)。

图5是示出根据本发明一实施例的确定数据曲线段是否显示扩增的方法500的流程图。在各个实施例中，可在基线测定之前、基线测定之后或作为基线测定过程的一部分来执行方法500。例如，可分析基线从起始到末尾的曲线部分以确定扩增特性，而且如果存在扩增特性，则可应用方法500。

在步骤510，接收来自经历扩增的生物或化学反应的数据以供分析。在一些实施例中，该数据可被颜色分离。所接收的数据典型地具有基线部分和生长部分。

在步骤520，利用该数据进行函数拟合以获得该数据的函数逼近。该函数逼近可由一些实施例用于确定潜在的反应的各种特性。在一些实施例中，将S形函数用于函数逼近。在其它实施例中，可仅对该数据的一部分执行函数拟合。

在步骤530，进行函数逼近分析以确定函数拟合的斜率是否超过最大扩增斜率界限(MASB)。可对该数据曲线的每个点进行对函数拟合的斜率分析。

在步骤540，对于斜率超过最大扩增斜率的那些位置(例如分段)，可将数据视为非扩增。在一个实施例中，如果方法500的分析移除了所有可能的扩增区域，则可将该数据曲线归类为非扩增。在扩增区域的确在突变之后存在的另一实施例中，则将基线区域的起始设置在紧接突变之后。

用于最大斜率推导的一个实施例如下。在一个方面中，以下方程示出实际扩增曲线的斜率的上界为恒定最大效率的理想纯指数扩增曲线的斜率。

考虑扩增，其中y_n表示经过基线测定的数据，而E_N表示循环N时的扩增效率。

y_N+1＝(1+E_N)y_N

由于该特性是指数的，所以导数可以通过ln空间(ln是自然对数)中的差来逼近。因此，该导数可以写成：

ln(y_N+1)-ln(y_N)＝ln(1+E_N)

利用中值定理，可以看出：

$\ln \left(y_{N+1}\right)-\ln \left(y_N\right)=\frac{d\ln \left(y\left(N\right)\right)}{\mathrm{dN}}$

其中N被估值为某个值N＝N*且N＜N*＜N+1。

由经过基线测定的数据的自然对数之差和中值定理导出的方程随后可被组合以获得：

$\frac{d\ln \left(y\left(N^{*}\right)\right)}{\mathrm{dN}}=\ln (1+E\left(N\right))$

其中在各个地方都可将y和E定义为连续函数。注意，该方程的左边和右边被估值于不同值，N和N^*。由于E(N)＜1，所以该方程的右边严格有上界ln(2)。

由于右边现在与N无关，所以可丢掉*号。其结果是：

$\frac{d\ln \left(y\left(N^{*}\right)\right)}{\mathrm{dN}}=\left(\frac{1}{Y\left(n\right)}\right)\left(\frac{\mathrm{dy}\left(N\right)}{\mathrm{dN}}\right)<\ln \left(2.0\right)$

这样又产生：

$\left(\frac{\mathrm{dy}\left(N\right)}{\mathrm{dN}}\right)<\ln \left(2.0\right)*y\left(N\right)$

可为到数据的函数拟合(例如回归函数拟合)来对该表达式估值，作为用于确定是否满足不等式的测试。如果满足该不等式，则该数据表示可能的扩增。如果不满足该不等式，则该数据包含伪像且可按照适当的方式来处理。例如，该测试可用作初始测试的一部分，该初始测试被用于确定所收集的PCR数据是否表示已经经历扩增的反应。其它实施例也可将该分析用于其它目的。

IV.基线测定

图6是示出根据本发明一实施例的确定扩增曲线的基线区域的方法的流程图。图7中示出了方法600的图形表示。

在步骤610，获得该数据的函数逼近(拟合)。在一些实施例中，将纯S形函数用于该函数拟合。该S形曲线提供了对所收集数据所定义的曲线的函数逼近。原始数据701及其函数逼近702的示例在图7中示出。

在步骤620，确定该函数拟合的一阶导数F’。该一阶导数可按照任意种方法来确定，其方法可取决于所执行的函数拟合的类型。

然后在步骤630，可从曲线本身减去曲线起始处的该导数值F’(0)，以对该导数函数进行基线测定。经基线测定的第一导数函数的示例在703处示出。

在步骤640，创建概率分布函数，例如定义了一点位于扩增(生长)区域内的概率的分布。以此方式，可确定扩增区域的起始，从而能计算基线区域的结尾。

在一个实施例中，该概率分布函数涉及无阴影区域708中位于一阶导数函数下方的面积。该导数函数的峰值之后的区域被截去，如区域705所示。因此，在基线分析的一个实施例中不使用区域705。从导数函数的起始到该导数函数的峰值704(在拐点处出现)的区域被用于进一步分析。然后将经基线测定的导数函数除以其曲线下方所定义的面积(例如，作为标准化)，从而产生可解释为给定点是否在扩增区域内的概率分布的新函数。该概率分布函数具有在原始曲线的拐点处的最大值(100％)，且在该曲线的起始处单调减小至0％。

在步骤650，选择用于扩增区域的起始的置信水平。在一些实施例中，该置信水平涉及在经基线测定的导数函数下方的面积的量(例如百分比)。例如，基线区域的起始可被解释为在积分面积相对小的点处出现。当该点具有小概率(例如3％-0％)处于扩增区域中从而再也不会处于基线区域中时，这样的点可能会出现。

在一个实施例中，点在扩增区域中的概率可被相反地解释(例如从100％减去)，以使扩增区域的起始的置信水平接近100％。在一个实施例中，在实践中，需要该置信水平的值在90％至97％之间。100％的值将实际上对扩增区域的起始提供过低的循环数，因为该点可能在整个曲线的起始附近。小于90％的值可能提供过高的值，因为该点很可能在扩增区域内。

在步骤660，基线终点的结尾由达到置信水平的点来确定。在一个实施例中，为了确定扩增区域的起始(基线区域的结尾)在所需置信水平内，对概率分布函数的面积从峰值704往回至该函数的起始进行积分，如706所示，直到该面积达到选定的置信水平(例如处于分数循环值x)。在图7中，该点被标记于707处。该概率分布函数下方的从峰值704到点707的面积等于选定的置信水平。

在另一实施例中，可从起始对该曲线积分直到达到该置信水平，该置信水平例如可被解释为在3％-10％之间。该值减去100％可被用于符合选择该置信水平的方式(例如接近100％)。

可使用该点707作为预期已发生扩增的区域的可靠界限。该循环值可被解释为基线的结尾。

在步骤670，一旦基线的结尾已确定，则可确定基线的起始。在一个实施例中，分析从曲线的起始到基线的结尾的曲线部分(提取部分)以确定基线的起始。如果所提取部分充分线性的，则将基线的起始设置于该曲线的起始。

在一个方面中，充分线性度被测量为数据点能拟合于直线的程度。例如，在最小二乘法拟合中，可使用来自经拟合直线的数据点的标准差作为线性度的度量。可将与线性特性的偏差与阈值进行比较以确定是否确实存在线性度。

可将该充分线性区域作为非扩增区域来对待。在一个实施例中，将第一循环从基线区域移除，以消除在仪器安装时启动PCR过程常见的问题。

如果该曲线的提取部分不是充分线性的，则可进行附加分析以确定基线的起始。在一个实施例中，附加分析包括重复移除或截去该曲线的提取部分的前沿点，直到该前沿区是非扩增的或达到某个最大截去数量。可额外地重复以上所公开的最大斜率分析，以确定在基线区域内是否存在突变，以使该基线的起始能紧邻地设置在突变位置之后。

以下是该基线测定方法的实施例的更详细数学描述。

第一步骤是对原始数据应用函数拟合。该函数拟合的第一步骤是选择用于对数据进行建模的函数逼近。在一个实施例中，为此目的而使用S形函数。

接着，需要定义用于该数据的选定函数逼近的初始回归(拟合)参数集。以下使用的这些回归参数为：a₀、a₁、a₂、a₃。下述的参数集是经验性地确定的适用于多种数据集的一个参数集示例。对于值的输入向量(x，y)，其中y＝RFU且x＝循环，这些参数的种子值可设定如下：a₀＝y[1]、a₁＝y.最大值-y.最小值、a₂＝x.长度/2、a₃＝1.0。

使用这些回归参数的S形回归函数的示例为：

其中

h(x)＝exp(E(x))且D(x)＝1+h(x)。

利用该回归函数，该函数的一阶导数可计算为：

$\frac{\mathrm{df}}{\mathrm{dx}}=\frac{a_1}{a_3}\frac{h}{D^2}$

且二阶导数可计算为：

$\frac{d^{2}f}{d{x}^2}=\left(\frac{a_1}{{a_3}^2}\right)\frac{h}{D^3}(h-1)$

最大一阶导数是由二阶微分方程的零点所定义的x值。

点在扩增区中的概率被计算为：

在无阴影区域中，我们从拐点I处向左积分以找出在扩增区的起始处的95％置信区域的边界μ。

$\frac{\underset{\mathrm{\&mu;}}{\overset{I}{\&Integral;}}P}{\underset{0}{\overset{I}{\&Integral;}}P}=c$

将P代入上述表达式中得到：

$f\left(I\right)-f\left(\mathrm{\&mu;}\right)-\frac{\mathrm{df}}{\mathrm{dx}}\left(0\right)[I-\mathrm{\&mu;}]=c[\left(\right(f\left(I\right)-f\left(0\right))-\frac{\mathrm{df}}{\mathrm{dx}}\left(0\right)I]$

将纯S形曲线代入该表达式得到：

其中

且 $\mathrm{\&Gamma;}=\frac{(1-c)}{2}+\frac{c}{D\left(0\right)}-(1-c)\mathrm{\&beta;}{a}_2.$

接着，迭代以下函数以确定基线的起始：

μ₀＝H(0)

μ_N+1＝H(μ_N)

迭代这些函数直到其收敛于基线区域的端点的所需值。

图8示出上述基线测定法的效果。在图8中，利用上述方法对包括许多有噪声数据集的许多不同数据集有效地进行了基线测定。如清楚可见，已识别了扩增之前的线性区域，以在从曲线减去时，线性区域相对于曲线图的x轴(循环)是平坦的。

V.多级函数拟合

如上所述，从扩增反应获得的数据值的函数逼近能用于多种目的，诸如基线测定和确定Ct值。已经使用的一种函数形式是具有形式1/(1+e^-t)的S形函数。然而，这样的函数形式会遗漏扩增反应的物理特性。因此，一些实施例使用利用漂移项的经修改S形函数(以下描述)，该漂移项能表示不定漂移的基线以及S形函数会遗漏的其它特性。

然而，如果与默认参数一起使用，则较高分辨率的函数在提供良好的函数拟合时不太稳定。例如，诸如上述经修改S形函数的较高分辨率函数相对于较低分辨率函数而言对于用来创建该函数的初始起始参数通常更为敏感。因此，将默认参数用于这些较高分辨率函数可能不会产生良好结果。换言之，当使用默认起始参数时，较高分辨率函数可能不能有效地减少数据的函数逼近与数据本身之间的误差。

利用例如Levenberg-Marquardt算法之类的算法能使任何回归函数中存在的误差最小化。它最小化了误差(即，拟合函数与实际数据之差)，如以下方程所测得：

$\mathrm{\&Delta;}=\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}{[y_i-f(x_i,\stackrel{\&OverBar;}{P})]}^2$

其中P是回归参数的向量，其将要被改变直到获得适当拟合。通常，它是高斯—牛顿和梯度下降方法的组合，由此该算法根据错误的本质来调节在计算期间使用哪种方法。

当使用经修改S形函数形式时，利用最小化算法获得收敛可能是困难的。因此，在一个实施例中，执行第一S形函数拟合以获得用于经修改S形函数形式的参数(种子值(seed value))。在另一实施例中，可在没有来自另一函数拟合的种子值的情况下计算该经修改S形函数拟合。

图9是示出根据本发明一实施例的通过执行多级函数拟合来分析扩增曲线以确定扩增反应的性质的方法的流程图。如图所示，方法900使用三级函数拟合，而其它实施例可使用更多或更少级分析。虽然提供了使用S形和经修改S形函数的示例，但该多级函数拟合可使用其它函数形式。

在以下描述中，术语“低分辨率”和“高分辨率”指的是函数拟合的阶数，其中较高分辨率拟合出现在较低分辨率拟合之后。这些术语还可对应于数据的函数逼近映射于潜在的原始数据的准确度。因此，该分析的每一级能建立在该分析的前一级上，从而创建该数据的更准确的函数逼近。

在步骤910，从扩增反应中接收数据。该数据可以是如本文中提及的任何适当形式。

在步骤920，确定扩增数据的第一函数拟合。该第一函数拟合是低分辨率的。例如，该数据曲线可由纯S形函数来拟合。诸如S形模型的低分辨率函数典型地相对于诸如经修改S形回归函数的高分辨率函数而言对种子参数较为不敏感。因此，纯S形函数适用于使用默认初始参数。

在一个方面中，能使用该函数进行不太受益于高分辨率函数的任何分析。能利用该第一函数拟合进行的示例性分析是基线分析。

在步骤930，使用该低分辨率函数来创建用于多级分析的下一级的种子参数。在一个实施例中，这些种子参数是用于较高分辨率函数的参数的初始值。

在步骤940，第二函数拟合使用这些种子参数来获得较高分辨率拟合(例如，回归函数)。在一个方面中，利用来自较低分辨率函数的种子参数能为较高分辨率拟合提供更好的初始值。利用更好的初始值，能更容易和更可靠地获得拟合方法的收敛(例如如上所述)。

执行多级函数拟合也能在所获得的最终函数拟合中提供强健性。强健性的关键度量是潜在的反应特性确定的重复性。可使用较高分辨率的函数来计算用于潜在的反应的诸如Ct值的参数。可利用重复实验的Ct标准差来测量该重复性。强健的回归引擎还能更可靠地收敛以提供较小的Ct标准差，其中可通过是否能使对实际数据的拟合的误差充分小来测量收敛。

在步骤950，使用第二函数拟合来确定用于扩增反应的Ct值。在一个实施例中，将Ct值确定为第二函数拟合(例如经修改S形函数)与阈值相交时的循环数。在另一实施例中，函数逼近(拟合)的导数的加权平均值被用作为Ct值。

在步骤960，在由步骤950中获得Ct值所定义的区域中执行第三函数拟合。例如，可使用从第二函数逼近计算得出的Ct值来定义包含扩增区域的区域的质心。然后可使第三函数拟合作为对该区域中的数据点的逼近。在一个实施例中，由质心所定义的区域的宽度是生长(扩增)区域的质心与起始之间的循环宽度的两倍。

在一个实施例中，由于扩增曲线的全局特性的不定性，仅在扩增区域上执行该第三函数拟合。该不定性反映了由于诸如空间对准问题的因素所引起的可能的仪器偏差。由于第二函数拟合可以是全局的且反映了整个扩增曲线的整体特性，所以该偏差能在从第二回归计算的Ct值中得到反映。为了减少该影响，可在仅包含该扩增区域的窗口上执行一非常高分辨率的回归。这样排除了曲线的前沿部分以及曲线的尾部中反映的不定性，在曲线的尾部处通常化学物质被耗尽从而对准问题产生。

在一些实施例中，第三函数拟合可以是多项式回归。在一个实施例中，对扩增区域应用六阶多项式函数拟合。多项式的阶数适用于该多项式的前沿项的指数值。

在步骤970，可随后使用第三函数拟合来确定诸如Ct值的特性至甚至更高的准确度。使用较低分辨率回归来给较高分辨率回归函数的起始参数设定种子值的该过程能按需重复许多次。在每次迭代中，使用前一个回归函数来确定用于甚至更高分辨率回归函数的种子值。如果由于某些原因不能利用来自第一回归函数的初始种子参数产生较高分辨率函数，则可替代地使用起始参数的先验估计值。

在一个实施例中，用于第二函数拟合的高分辨率函数逼近是如下定义的经修改S形函数：

$f=a_0+\frac{1}{D}[a_1+\left(\frac{a_4}{D}\right)\ln \left(\frac{D}{h}\right)],$ 其中

h＝exp(E)，D＝1+h，且

在该方程中，项

是内部线性漂移项，其表示可变的漂移基线，这是对标准S形函数的修改。该项通过更好地表示在扩增数据中可见的实际特性，改善了数据的函数逼近与数据本身的之间的通过多个标准差的拟合。

输入向量(x，y)的默认初始回归参数种子值可以是：a0＝参数[0]＝y[1]；a₁＝参数[1]＝y.最大值-y.最小值；a₂＝参数[2]＝x.长度/2；a₃＝参数[3]＝1.0；以及a₄＝参数[4]＝y.中值-y[1]。

然而，如上所述，这些默认值可能不产生准确的扩增数据模型。在该情况下，可从纯S形函数拟合来获得用于这些变量的值，该纯S形函数拟合可从步骤920来获得。例如，a₀-a₃的这些值可直接取自S形函数拟合的最终值。在一个方面中，由于类似的函数形式，可按照这种方式来确定种子值。

相对于x的一阶和二阶导数如下：

$\frac{\mathrm{df}}{\mathrm{dx}}=\left(\frac{a_1}{a_3{D}^2}\right)[h+\frac{\mathrm{\&alpha;}}{2D}+\mathrm{\&alpha;}\left(\frac{h}{D}\right)\ln \left(\frac{D}{h}\right)]$

$\frac{d^{2}f}{d{x}^2}=\left(\frac{a_{1}h}{{a_3}^2{D}^4}\right)[h^2-1+\frac{5\mathrm{\&alpha;}}{2}+\mathrm{\&alpha;}(2h-1)\ln \left(\frac{D}{h}\right)]$

最大一阶导数是由二阶导数的零点所定义的x值。

相对于x的三阶导数是：

$\frac{d^{3}f}{d{x}^3}=\left(\frac{a_{1}h}{{a_3}^3{D}^5}\right)\left\{\right[h^3-3h^2+(-3+\frac{19\mathrm{\&alpha;}}{2})h+(1-\frac{7\mathrm{\&alpha;}}{2})]+\mathrm{\&alpha;}\ln \left(\frac{D}{h}\right)[4h^2-7h+1\left]\right\}.$ 最大二阶导数位置是由三阶导数的适当零点所定义的x值。

相对于x的四阶导数是：

$\frac{d^{4}f}{d{x}^4}=\left(\frac{a_{1}h}{{a_3}^4{D}^6}\right)\left\{\right[h^4-10h^3+\left(\frac{65\mathrm{\&alpha;}}{2}\right)h^2+(10-40\mathrm{\&alpha;})h+(-1+\frac{9\mathrm{\&alpha;}}{2})]+\mathrm{\&alpha;}\ln \left(\frac{D}{h}\right)[8h^3-33h^2+18h-1\left]\right\}$

最大三阶导数位置是由四阶导数的适当零点所定义的x值。在一个实施例中，通过识别最大导数位置，可使用该信息来确定Ct值。

图10示出针对原始数据拟合的高分辨率经修改的S形回归函数的示例。注意，该拟合对于该示例是全局优异的，因为两条线几乎难以区分开。

VI.Ct值的计算——加权最大导数法

存在多种选择用于经历扩增的反应的Ct值的可能方法。每种方法具有特定优点和缺点。可在执行函数拟合的单级之后、在每个单级之后或在多级之后确定Ct值。

Ct值表示曲线上的点，即某些在性质上与另一曲线上的该点相似的分数循环数。在各个实施例中，Ct值可以是其中强度信号达到目标阈值的分数循环数、其中达到特定扩增值的分数循环数、其中达到一些浓度值的分数循环数、其中达到一些导数值或导数值组合的最大值的分数循环数、或表示该曲线的值或该曲线的形状的一些其它性质。

该Ct值可允许本领域技术人员比较表示不同未知起始量的不同曲线之间的相对扩增水平，或与已知的绝对起始量的标准的比较。前者称为相对量化，而后者称为绝对量化。

在本发明的一个实施例中，Ct值被选择为对扩增曲线的函数逼近的二阶导数的最大值处的循环数(可以是分数)。该值给予对Ct值的优异量化，但它会导致过高的Ct值。它还会导致过高的效率值。

在另一实施例中，Ct值被选择为对扩增曲线的函数逼近的最大三阶导数位置处的循环数(可以是分数)。该方法产生优异的Ct值，该Ct值约为最大二阶导数位置之前的两个循环。该方法还产生良好但非优异的效率值。然而，Ct值在三阶导数位置处的量化不如Ct值在二阶导数位置处的量化那样好，虽然也是可接受的。

图11示出其中通过被示出的经修改S形函数来建模的扩增曲线的最大一阶、二阶以及三阶导数的图示。导数的最大值在下一更高阶导数的零点处出现。使用零点1101和1103来找出最大一阶导数的位置；使用零点1102来找出最大二阶导数的位置；使用零点1104来找出最大三阶导数的位置。

一个目标是找出这两种情况之间的折衷，以产生这两种情况的最好结果。这可通过将Ct值计算为这两个导数的加权平均值来实现。在一个实施例中，在加权平均值中使用第n和n+1阶导数值。通过使用诸如迭代或Newton-Raphson算法的技术，可计算最大导数的值。

可调节用于加权平均的加权参数以满足多种标准。在一个实施例中，可设置加权参数以使标准曲线的效率对于已知良好的效率权重参数校准文件为100％。在该情况下，使用SYBR绿线性度作为基准文件，但是任何被认为具有足够优度的数据文件都能满足该需要。在另一实施例中，本领域技术人员可设置加权参数以使对曲线尾部的变化的灵敏度最低，在曲线尾部处扩增可能未由荧光忠实地表示，或者仪器不定性可能是问题。

在一些实施例中，使用最大二阶导数位置和最大三阶导数位置的加权平均值来确定Ct值，并相对于SYBR绿线性度基准文件选择加权因子。公式如下。

Ct选择值＝(1.0-p)*最大二阶导数X位置+p*最大三阶导数X位置。

在一个实施例中，权重值p可能典型地在0.3-0.7的范围内。例如，一个实施例使用0.65的权重值。

如果由于一些原因出现失败，从而无法计算第n和第n+1阶导数的加权平均值，则可利用另一方法来确定Ct值。例如，可在窗口内分析该曲线。还可截去该曲线直到获得结果。如果扩增较早，则可通过外推过起始点来进行分析。如果该数据显示较晚扩增，则可通过外推该曲线超过曲线结尾来进行该分析，然后可试图重新计算。

如果以上所有方法都不能产生有效的Ct值，则该系统能回到单阈值分析方法中使用的手段；参见专利申请US2006/0269947和US2006/0271308。这两篇参考文献结合于此用于所有目的。如果以上方法中的任一种方法都不能产生有效的Ct值，则可从较低分辨率方法计算准确度较低的Ct值。

如以上方法900中所讨论，一旦例如利用导数的平均值而确定初始Ct值，就可使用该Ct值来定义用于较高分辨率函数拟合的区域。然后可使用该较高函数拟合(例如高次多项式回归函数)以进一步利用导数的平均值来细化该Ct值。如上所述的该过程定义了扩增区域周围的窗口。通过将Ct确定限制于该扩增窗口，在该曲线起始和结尾所观测得的不定性会变得与分析更少相关。因此，可确定更准确的Ct值。调节这种情况下的权重值以使由仪器偏置引起的波动最小。

当使用该Ct值来比较扩增曲线时，如果存在已知标准，则可创建称为标准曲线的曲线图，该标准曲线将已知标准起始量与它们的Ct值相关。即使不存在标准，本领域技术人员也可使用多层稀释集来定义标准曲线。然后可使用对数—线性曲线图来投影未知样品的Ct值，以根据是使用绝对标准还是多层未知量来定义该曲线来确定Ct值的绝对或相对起始量。该对数—线性曲线图的斜率可被用来计算效率。该效率可以表示在PCR扩增期间，由熔解、粘着以及扩展所组成的全循环导致DNA颗粒数量倍增的平均概率。一般情况下，需要该效率小于1，因为在每个循环永远不存在完美的倍增，但不希望的附加产品的产生可能导致大于1的效率。

VII.组合方法

图12是示出根据本发明一实施例的通过执行多函数拟合来分析扩增曲线以确定Ct值的方法的流程图。之前在本公开内容中，已经更详细地描述了图12中的每个步骤。取决于实施例的特定需求，图12中的许多步骤是可选的。此外，图12中概述的多个步骤中的许多步骤能与其它步骤无关地进行。例如，图12中所示的基线分析能与任何Ct确定无关地进行。

在步骤1210，接收从经历扩增的生物或化学反应获得的原始数据以供分析。在一些实施例中，可对原始数据进行颜色分离。在一些实施例中，可分析原始数据以确定该数据是否表示倍增。在本发明的一些实施例中，进行最大扩增斜率界限分析以作出该确定。

在步骤1220，利用原始数据进行第一函数拟合以获得该数据的第一函数逼近。该函数逼近可由一些实施例用于确定潜在的反应的各种特性。在一个实施例中，使用S形函数作为该第一函数逼近。

在步骤1230，进行基线分析。在本发明的一些实施例中，可使用S形函数作为原始数据的函数逼近。在一个实施例中，基线分析使用方法600的实施例。

在步骤1240，可进行第二函数拟合来创建该数据的第二函数逼近。可使用第一函数逼近来创建第二函数逼近的一些参数。在一些实施例中，第二函数逼近使用经修改的S形函数，如上所述。

在步骤1250，使用第二函数逼近来确定Ct值。在一些实施例中，利用出现第二函数逼近的两个或更多个导数的最大值的循环数的加权平均值来确定Ct值。例如，可使用用于二阶导数的最大值的循环数和用于三阶导数的最大值的循环数的加权平均值。

在步骤1260，可进行第三函数拟合来创建该数据的第三函数逼近。在一个实施例中，使用在步骤1250所确定的Ct值来定义步骤1260的函数拟合所操作的值范围。

在步骤1270，使用第三函数逼近来确定新的Ct值。在一些实施例中，还利用出现第三函数逼近的两个或更多个导数的最大值的循环数的加权平均值来确定该新的Ct值。

在需要时，可重复如同步骤1220、1240和1260中的多级函数拟合许多次。

VIII.示例系统

图13是根据本发明的一个实施例的系统1300。所示系统包括在样品架1310内的诸如细菌或DNA的样品1305。来自样品的诸如荧光强度值的物理特性1315由检测器1320检测。包括噪声分量的信号1325从检测器1320被发送至逻辑系统1330。来自信号1325的数据可被存储于本地存储器1335或外部存储器1340或存储设备1345中。在一个实施例中，模数转换器将模拟信号转换成数字形式。

逻辑系统1330可以是或可包括计算机系统、ASIC、微处理器等。它还可包括显示器(例如监视器、LED显示器等)和用户输入设备(例如鼠标、键盘、按钮等)，或与显示器和用户输入设备耦合。逻辑系统1330和其它部件可以是独立或通过网络连接的计算机系统的一部分，或者它们可直接附连至或被包含在热循环仪设备中。逻辑系统1330还可包括在处理器1350中执行的优化软件。

本发明的特定方面的具体细节可按照任何适当方式组合，而不背离本发明的实施例的精神和范围。然而，本发明的其它实施例可涉及与每个独立方面有关的特定实施例，或这些独立方面的特定组合。

应当理解，如上所述的本发明能以模块化或集成方式使用硬件和/或使用计算机软件以控制逻辑的形式实现。基于此处所提供的公开和示教，本领域普通技术人员将知道并明白使用硬件以及硬件和软件的组合来实现本发明的其它方式和/或方法。

在本申请中描述的任何软件组件或功能可被实现为由处理器使用例如常规或面向对象技术、使用例如Java、C++、或Perl的任何适当计算机语言执行的软件代码。软件代码可作为一系列指令或命令存储在用于存储和/或传输的计算机可读介质上，合适的介质包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、诸如硬盘或软盘等磁性介质、或诸如紧致盘(CD)或DVD(数字多功能盘)等光学介质、闪存等。该计算机可读介质可以是此类存储或传输装置的任何组合。

此类程序也可利用适于经由符合包括因特网的各种协议的有线、光学和/或无线网络进行传输的载波信号来编码和传输。因此，根据本发明一实施例的计算机可读介质可利用通过此类程序编码的数据信号来创建。利用程序代码编码的计算机可读介质可与兼容设备封装在一起，或与其它设备独立地提供(例如经由因特网下载)。任何此类计算机可读介质可驻留在单个计算机程序产品(例如硬盘驱动器或整个计算机系统)之上或其中，且可存在于系统或网络中的不同计算机程序产品之上或其中。计算机系统可包括监视器、打印机，或用于向用户提供本文中提及的任一结果的其它合适的显示器。

已给出本发明的示例实施例的上述描述用于说明和描述的目的。不旨在穷举或将本发明限制于所描述的精确形式，而且鉴于以上示教，许多修改和变化是可能的。选择和描述了这些实施例以最清楚地说明本发明的原理及其实际应用，从而使本领域普通技术人员能按照各个实施例以及适合所构想的特定用途的各种修改来最好地利用本发明。

Claims (24)

1.一种根据表示生物和/或化学反应的扩增过程的数据集来确定所述反应的一种或更多种性质的方法，所述方法包括：

接收表示一具有基线部分和生长部分的曲线的数据点集，每个数据点表示物质在扩增过程期间的物理量；

利用处理器计算逼近所述数据点集的第一函数；

从所述第一函数提取一个或更多个参数；

利用所述处理器使用所述一个或更多个参数来计算逼近所述数据点集的第二函数；以及

利用所述第二函数确定所述生物和/或化学反应的一种或更多种性质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一种或更多种性质包括与所述扩增过程相关联的量化值。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一个或更多个参数被用作为用于所述第二函数的初始值，且其中计算所述第二函数包括改变一个或更多个所述初始值以减小所述第二函数与所述数据点集之间的误差。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二函数是包含漂移项的经修改S形函数。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述经修改S形函数被表示为：其中D＝1+h、h＝exp(E)、

且

其中a₀、a₁、a₂、a₃以及a₄是在所述经修改S形函数与所述数据点集的拟合过程期间确定的数字，且其中x是所述扩增过程的循环数。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述一个或多个参数包括a₀、a₁、a₂以及a₃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一个或多个参数包括所述扩增过程中的时间Ct，所述第一函数在所述时间Ct具有一指定值。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，使用所述时间Ct来计算逼近所述数据点集的第二函数包括：

定义以Ct为中心的时间窗口；

使用所述时间窗口内的所述数据点来确定所述第二函数，以使所述第二函数逼近所述时间窗口内的数据点。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第二函数是6阶或更高阶的多项式。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，确定第一时间和第二时间的加权平均值作为所述时间Ct，其中所述第一函数的二阶导数在所述第一时间具有最大值，且所述第一函数的三阶导数在所述第二时间具有最大值。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：

选择所述基线部分的结尾作为所述扩增过程的第一时间，其中所述第一函数的一阶导数函数从所述第一时间到所述一阶导数函数的峰值的积分面积在一指定值范围内。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：

分析所述第一函数以确定所述第一函数的斜率是否超过最大扩增斜率；以及

如果所述第一函数确定具有超过所述最大扩增斜率的位置，则将包含所述位置的分段视为所述扩增曲线的非扩增分段。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述最大扩增斜率是ln(2.0)乘以正被计算斜率的位置处的数据点的值。

14.一种确定由生物和/或化学反应的扩增过程所产生的扩增曲线的基线区域的方法，所述方法包括：

接收表示一具有基线部分和生长部分的曲线的数据点集，每个数据点表示物质在扩增过程期间的物理量；

利用处理器确定逼近所述数据点集的函数；

计算所述函数的一阶导数以获得一阶导数函数；

通过以下步骤确定基线区域的结尾：

对于多个点：

利用所述处理器从对应点到所述一阶导数函数的一固定位置对所述一阶导数函数积分，以获得对应积分面积；以及

选择积分面积在一指定范围内的点作为所述基线区域的结尾；以及确定所述基线区域的起始。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述一阶导数函数包括所述函数的一阶导数减去一初始数据点处的一阶导数。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述选定点的积分面积是所述一阶导数函数从所述初始点到所述固定位置的面积的预定百分比。

17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，还包括：

识别所述一阶导数函数的峰值，其中所述一阶导数函数上的所述固定位置是所述一阶导数函数的峰值。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述积分从所述一阶导数函数上的峰值进行到所述一阶导数函数的起始，以获得所述对应积分面积。

19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，确定所述基线区域的起始包括：

确定一个数据点到下一数据点的值的增加是否大于预定量；以及

如果超过所述预定量，则将所述基线的起始选择为在所述一个数据点之后。

20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，确定所述基线区域的起始包括，如果所述基线区域的一个或多个数据点未在阈值内逼近线性特性，则从所述基线区域截去所述一个或多个数据点，其中从所述基线区域截去一个或更多个数据点包括：

i)将所述基线区域定义为从所述数据点集的起始到所确定的基线区域的结尾的多个数据点；

ii)基于所述基线区域内的多个数据点的线性特性来分析所述基线区域以确定所述基线区域是否呈现非扩增特性；

iii)如果所述基线区域未在所述阈值内逼近线性特性，则从所述基线区域移除至少一个前沿数据点；

iv)重复步骤ii-iii直到：a)基线区域呈现非扩增特性；或b)步骤ii-iii已被重复预定次数。

21.一种根据表示生物和/或化学反应的扩增过程的数据集来确定所述反应的基准值的方法，所述方法包括：

接收表示一具有基线部分和生长部分的曲线的数据点集，每个数据点表示物质在扩增过程期间的物理量；

利用处理器确定逼近所述数据点集的函数；

利用所述处理器计算所述函数的至少两个导数；

确定所述扩增过程中每个导数具有最大值时的相应时间；

计算所述相应时间的加权平均值作为所述生物和/或化学反应的所述基准值。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述至少两个导数包括二阶导数和三阶导数。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述二阶导数由(1-p)加权，而所述三阶导数由p加权，且其中p具有在0.3-0.7的范围内的值。

24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，还包括：

设定用于所述加权平均值的权重，以使基准曲线的效率为100％。

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