CN105755159A - 自动快速判别荧光定量pcr结果的方法 - Google Patents

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马勇
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本案涉及自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，包括：提取荧光定量PCR的数据曲线；对数据曲线进行基线设置；设立荧光强度的标准阈值，其所对应的循环数为Ct1，标准阈值设置在数据曲线的指数上升期；设立荧光强度的辅助阈值，其所对应的循环数为Ct2，辅助阈值设置在数据曲线的指数上升期且标准阈值≠辅助阈值；建立评分公式z，z＝(Ct1?Ct2)/(log(标准阈值，2)?log(辅助阈值，2))；若0＜z＜(1/E)+1；则判定数据曲线为正常曲线，否则为异常曲线；E为荧光定量PCR效率值。本案通过设计了一种全新的识别方法，使得可以快速、准确地判别荧光定量PCR测试数据，提高对检测数据的判断速度和准确率。

Description

自动快速判别荧光定量PCR结果的方法
技术领域
本发明属于生物学分析领域，特别涉及一种自动快速判别荧光定量PCR结果的方法。
背景技术
荧光定量PCR(PCR：聚合酶链式反应)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程的定量实验技术。荧光定量PCR的数据分析流程一般为：
(1)基线的设置:通常情况下，选择自动化分析，此时机器会针对每条曲线进行优化分析，因此效果通常比较好。在基线自动分析的基础上如出现某些形状异常的曲线，则需要手动调整基线分析。
(2)阈值设置：阈值也可以自动设置或人工设置，扩增曲线与阈值的交点，对应的就是阈值循环数，亦被称为Ct值(Cycle threshold)，通过对Ct值分析即可得到样本的浓度信息。
然而在实际的数据分析过程中，因为边缘效应、样本处理不干净等因素，一些扩增曲线的形状异常，所得到的Ct值不可信，无法进行后续的分析。在需要使用同一PCR反应体系(包括反应混合物配方、热循环条件、仪器设备和数据分析条件，如基线设置和Ct阈值等)对大量同类实验对象进行检测的情况下，通过手动去逐个确认曲线是否正常会耗费大量的时间而大大降低实验效率。特别是将荧光定量PCR应用于临床分子诊断时，一般是直接通过Ct值给出临床报告，如果不通过直接观察扩增曲线去剔除异常曲线，可能存在的异常曲线将会造成临床检验结果的不可信，甚至造成误诊或漏诊的严重后果。因此，开发一种可以快速自动识别荧光定量PCR异常扩增曲线的方法在荧光定量PCR实际应用中具有很好的实际意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本案的目的是提出一种自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，来提高荧光定量PCR数据分析效率和数据准确性。
为实现上述目的，本案通过以下技术方案实现：
一种自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，其包括：
提取荧光定量PCR的数据曲线；
对数据曲线进行基线设置；
设立一个荧光强度的标准阈值，其所对应的循环数为Ct1，所述标准阈值设置在数据曲线的指数上升期；
设立一个荧光强度的辅助阈值，其所对应的循环数为Ct2，所述辅助阈值设置在数据曲线的指数上升期，且所述标准阈值≠所述辅助阈值；
建立一个评分公式z进行分值计算，所述评分公式z＝(Ct1-Ct2)/(log(标准阈值，2)-log(辅助阈值，2))；
当0＜z＜(1/E)+1时，则判定数据曲线为正常曲线，否则为异常曲线；
其中，E为荧光定量PCR效率值。
优选的是，所述的自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，其中，还包括：
设立一个临界Ct值；
若0＜z＜(1/E)+1，且临界Ct值＞Ct1，则判定数据曲线为阳性曲线；
若0＜z＜(1/E)+1，且临界Ct值≤Ct1，则判定数据曲线为阴性曲线。
优选的是，所述的自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，其中，所述标准阈值是所述辅助阈值的不等于1的任何倍数。
优选的是，所述的自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，其中，所述标准阈值是所述辅助阈值的2-10倍。
优选的是，所述的自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，其中，E＝101/k-1，其中，k为荧光定量PCR标准曲线的斜率。
本发明的有益效果是：本案通过设计了一种全新的识别方法，使得可以快速、准确地判别荧光定量PCR测试数据，提高对检测数据的判断速度和准确率，相较于传统的只读取Ct值的方法，此法能够极大地提高对数据的识别能力，有效甄选出异常曲线，显著降低了荧光定量PCR数据的假阳性率。(见表2)
附图说明
图1为荧光定量PCR测试数据的曲线图。其中，纵坐标为荧光强度，横坐标为循环数。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本案列出一实施例的自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，其包括：
提取荧光定量PCR的数据曲线；
对数据曲线进行基线设置；
设立一个荧光强度的标准阈值，其所对应的循环数为Ct1，标准阈值设置在数据曲线的指数上升期；
设立一个荧光强度的辅助阈值，其所对应的循环数为Ct2，辅助阈值设置在数据曲线的指数上升期，且标准阈值≠辅助阈值；
建立一个评分公式z进行分值计算，评分公式z＝(Ct1-Ct2)/(log(标准阈值，2)-log(辅助阈值，2))；
根据相应反应的荧光定量PCR效率值E确定z值的可接受区间，若0＜z＜(1/E)+1，则判定数据曲线为正常曲线，否则为异常曲线。
作为更优选的方案，标准阈值优选是辅助阈值的不等于1的任何倍数，以进一步获得更高的判别准确率。一般情况下可以选择标准阈值是辅助阈值的2-10倍最为适宜。
作为本案另一实施例，其中，在上述方案的基础上还可包括：
设立一个临界Ct值；
若0＜z＜(1/E)+1，且临界Ct值＞Ct1，则判定数据曲线为阳性曲线；
若0＜z＜(1/E)+1，且临界Ct值≤Ct1，则判定数据曲线为阴性曲线。
临界Ct值指的是具体荧光定量PCR应用所要求的临界Ct值，其具体数值要根据具体应用目的而定。在某些情况下，如某一荧光定量PCR方法的目的是对比不同样品中特定靶序列的相对浓度或通过以标准曲线为参照测定样品中靶序列的绝对浓度等，实验结果的数据分析可以不使用临界Ct值。在其它情况下，如荧光定量PCR方法在临床分子诊断、食品卫生检疫、生物安全监控等的应用中，相关专业领域针对样品中所含有害微生物是否能够造成特定危害的量通常存在一个判定标准，即阴阳性临界值，该临界值所对应的荧光定量PCR反应的Ct值即为相应检测方法的临界Ct值。
在上述实施例中，基线的设置标准为：起始点为循环数＝3，终点为实验信号脱离噪音信号上升前。
图1列出了荧光定量PCR测试数据的几种情况：异常曲线、正常曲线(包括阳性曲线和阴性曲线)。表1列出了使用本方案的判别结果。
表1：图1中对应曲线的判别结果(注：临界Ct值为40)
Ct1 Ct2 z值 判别结果
33.1 23.1 10.0 异常曲线
32.2 31.0 1.2 阳性曲线
41.5 40.4 1.1 阴性曲线
注：以上数据基线设置为3-15，荧光强度的标准阈值为100000，荧光强度的辅助阈值为50000，相应反应的E＝85％，所对应的z值范围为0＜z＜(1/0.85)+1，即0＜z＜2.18。
表2：384例数据采用本案校正前后的假阳性率对比结果
假阳性率
校正前 5.47％
校正后 0.26％
本案不限定实现本技术方案的具体方式，它可以通过包括诸如excel、SPSS、origin等一切可以进行数据处理的软件来实现，或者根据此原理所编写的软件及代码。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (5)

1.一种自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，其特征在于，包括：
提取荧光定量PCR的数据曲线；
对数据曲线进行基线设置；
设立一个荧光强度的标准阈值，其所对应的循环数为Ct1，所述标准阈值设置在数据曲线的指数上升期；
设立一个荧光强度的辅助阈值，其所对应的循环数为Ct2，所述辅助阈值设置在数据曲线的指数上升期，且所述标准阈值≠所述辅助阈值；
建立一个评分公式z进行分值计算，所述评分公式z＝(Ct1-Ct2)/(log(标准阈值，2)-log(辅助阈值，2))；
当0＜z＜(1/E)+1时，则判定数据曲线为正常曲线，否则为异常曲线；
其中，E为荧光定量PCR效率值。
2.如权利要求1所述的自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，其特征在于，还包括：
设立一个临界Ct值；
若0＜z＜(1/E)+1，且临界Ct值＞Ct1，则判定数据曲线为阳性曲线；
若0＜z＜(1/E)+1，且临界Ct值≤Ct1，则判定数据曲线为阴性曲线。
3.如权利要求1所述的自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，其特征在于，所述标准阈值是所述辅助阈值的不等于1的任何倍数。
4.如权利要求3所述的自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，其特征在于，所述标准阈值是所述辅助阈值的2-10倍。
5.如权利要求1所述的自动快速判别荧光定量PCR结果的方法，其特征在于，E＝101/k-1，其中，k为荧光定量PCR标准曲线的斜率。
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